JPH08507442A

JPH08507442A - Recombinant Epstein-Barr virus protein and use for vaccines

Info

Publication number: JPH08507442A
Application number: JP6520327A
Authority: JP
Inventors: プラカッシュ，ラメッシュ
Original assignee: CERATECH Inc
Current assignee: CERATECH Inc
Priority date: 1993-03-12
Filing date: 1994-03-11
Publication date: 1996-08-13
Also published as: AU6404594A; CA2156719A1; EP0690917A1; EP0690917A4; WO1994020138A1; KR960700749A; AU681131B2

Abstract

(57)【要約】本願発明はEBVのgp350/220の66kdのセリン−およびスレオニン−リッチな部分に基づく組換えポリペプチド、および組換えポリペプチドgp350/220を提供する。このようなポリペプチドはエプスタイン−バーウイルス（EBV）感染に対して有効なワクチンとして有用である。 (57) [Summary] The present invention provides recombinant polypeptides based on the 66 kd serine- and threonine-rich portion of EBV gp350 / 220, and recombinant polypeptides gp350 / 220. Such polypeptides are useful as effective vaccines against Epstein-Barr virus (EBV) infection.

Description

【発明の詳細な説明】組換えエプスタイン−バーウイルスタンパク質およびワクチンへの使用技術分野本願発明は一般にワクチンの生産、特にエプスタイン−バーウイルス（EBV）感染に対して有効であり、EBVgp350/220およびEBVgp350/220の66kdのセリンおよびスレオニンリッチな部分に基づいたワクチンに関する。背景技術エプスタイン−バーウイルス（EBV）はほとんどのヒトに感染するヘルペスウイルスファミリーの一員である。正常なヒトでの初期感染の症状は、極めて軽い病気から伝染性単球増加症まで及ぶ（Roberts，G.B.，Diagnosis and Clinical Testing 27，16-21，1989）。持続性のまたは潜伏性のEBVの感染は、バーキットリンパ腫および鼻咽頭腫における重要な因果関係のファクターである。EBVは、日和見病原体であり、同種移植片を有する免疫抑制患者または後天性免疫不全症候群（AIDS）の患者で通常発現する。EBVはまた、慢性関節リウマチおよび慢性疲労症候群に関係している。罹病率および死亡率と関連して、EBV感染予防が要望される。 EBVは、インビトロではそれほど複製しないので、予防免疫化のための無毒化ウイルスを選択し、生産する系統的なアプローチは実現性がない。EBVはリンパ球増加をひきおこしヒト悪性腫瘍の病原体ではないかと推測されているので、免疫化のために用いるウイルスの調製物は、潜在的なトランスフォーミング遺伝子を含まないことが非常に重要である。この理由のために、EBVウイルスおよび／またはEBV感染細胞の外表面上に示される単離したタンパク質に基づく有効なワクチンが要望される。組換えタンパク質は、このウイルスに感染した哺乳動物の組織から精製したタンパク質よりもいくつかの利点を提供する。例えば、それらは、大量におよび高純度で容易に生産され得る。特に、感染後にEBVウイルスを中和するだけでなく、Ｂ細胞へのウイルスの結合および侵入を予防し得るワクチンであることに価値がある。背景技術の簡単な説明 EBVの外表面の主な構成成分は350、220、および85キロダルトンの糖タンパク質である（Pearson，G.R.およびLuka，J．In：M．A．EpsteinおよびB.G．Achong （編），The Epstein-Barr Virus．Recent Advances，pp.48-73．William Heine mannMedical Books，London.）。これらの糖タンパク質はまたこのウイルスが複製している感染細胞の外表面上に存在する。これらのタンパク質に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、増殖中の感染細胞の表面と反応し、そしてウイルスを中和する（同上）。しかし、抗体依存性細胞毒性（A DCC）に対する標的膜抗原は、gp350およびgp220と関連するがgp85とは関連しないようであった（同上）。EBVgp350/220はまたヒトＢリンパ球のCR2レセプターへのウイルス付着を仲介するリガンドととして同定された（Nemerow，G.R.ら、J ．Virol.61 ，1416-1420，1987）。配列Glu-Asp-Pro-Gly-Phe-Phe-Asn-Val-Gluは、gp350/220のＮ末端領域に相当し、付着に関与するエピトープであることが見出された（Nemerow，G.R.ら、Cell 56，369-377,1989）。 gp350およびgp220タンパク質は同一DNAフラグメントに位置する3.2kbおよび2. 5kbのRNAによってコードされる（Beisel，C．ら、J．Virol．54，665-674，1985 ）。E．coliで発現したgp350/220タンパク質に対してウサギで生じた抗血清は、特異的にgp350およびgp220を免疫沈降し、感染細胞の原形質膜と反応し、そして特に補体の添加後にウイルスを中和する。しかし、十分な量のタンパク質の複数回の注射が、効果的な応答を引き出すのに必要である。E．coliで発現したgp350 /220の免疫原性が低いのは、グリコシル化の欠損および適切な折りたたみの欠損によると考えられる。哺乳動物細胞で発現した場合には、gp350/220は免疫原性が高く、そしてウイルス中和抗体を誘導し得（Whang，Y.ら、J．Virol．61，179 6-1807，1987）、グリコシル化が糖タンパク質の免疫原性に重要な役割を果たすことを示す。しかし、組換えgp350/220の哺乳動物細胞での発現は一般には、非常に不安定である。タンパク質のいくつかの特徴は、DNAおよびmRNAヌクレオチド配列から予測される（Beisel，C.ら、J.Virol. 54，665）。gp350の一次翻訳産物は、907個のアミノ酸からなるポリペプチドであり、他方、gp220の一次翻訳産物は、710個のアミノ酸からなるポリペプチドである。両タンパク質のアミノ末端には18個のアミノ酸からなる領域があるが、これは、開裂可能なシグナルペプチドのようである。単一の疎水性ドメインは、トランスメンブランアンカーとして機能するらしく、両タンパク質のカルボキシ末端から26アミノ酸に位置する。推定のシグナル配列とアンカー配列との間のgp350の850個のアミノ酸およびgp 220の652個のアミノ酸は、セリンリッチおよびスレオニンリッチてあり、そして 35（gp350）または24（gp220）のアスパラギン-Ｘ-セリンまたは-Ｃ-スレオニン配列をそれぞれ包含する。これらの配列はＮ-結合グリコシル化のための潜在的なシグナルとして働く。従って、これらの領域は膜の外表面上に存在するようである。発明の簡単な要旨本願発明は、gp350/220の66kdのセリンおよびスレオニンリッチな部分に基づいた組換えポリペブチドおよびその断片を提供する。これらは哺乳動物体でEBV 中和抗体を誘導し得るワクチンとして有用である。好ましくは、これらのポリペプチドが９つのアミノ酸ペプチド配列Glu-Asp-Pro-Gly-Phe-Phe-Asn-Val-Gluをコードする配列をさらに有している。この配列は、ヒトＢ細胞へのEBV付着の仲介に関与している。66kdのポリペプチドおよびこの九量体ペプチドの両方を包含するポリペプチドに基づいたワクチンはまたＢ細胞へのウイルス結合および侵入を阻害し得る。従って、本願発明の１つの態様は、本質的に哺乳動物でEBV中和抗体を誘導し得るエプスタイン-バーウイルスのgp350/220の66kdのセリンおよびスレオニンリッチな部分またはその断片からなる実質的に純粋なポリペプチドである。本願発明の他の態様は、哺乳動物でEBV中和抗体を誘導し得るエプスタイン-バーウイルスのgp350/220の66kdのセリンおよびスレオニンリッチな部分またはその断片およびペプチド配列Glu-Asp-Pro-Gly-Phe-Phe-Asn-Val-Gluを包含する実質的に純粋なポリペプチドである。このようなポリペプチドは優先的にグリコシル化される。本願発明はまた、これらのポリペプチドをコードする核酸配列、およびこのような核酸および発現制御配列を含有する発現ベクターに関し、この発現制御配列は作動可能に核酸に結合し、そして細胞内で上記核酸を効果的に発現させる。本願発明のさらなる態様は、このような発現ベクターを含有する細胞に関し、さらにポリペプチドの生産を可能にする条件下で、このような細胞を培養することを包含する本願発明のポリペプチドを生産する方法に関する。本願発明の他の態様は、薬学的に受容可能なキャリアと混合された本発明のポリペプチドの免疫原量を含有するワクチン組成物である。本願発明は、このようなワクチン組成物の免疫学的に有効な量を哺乳動物に投与することを含む、EBV感染から前記哺乳動物を保護する方法をさらに包含する。本願発明のさらに他の態様は、実質的に純粋なEBVgp350/220タンパク質を生産する方法であり、完全なEBVgp350/220遺伝子をバキュロウイルス発現ベクターpB lueBacHisCにサブクローニングし、EBVgp350/220遺伝子および6-ヒスチジンペプチド遺伝子を包含するプラスミドpBac-TTI350を形成する方法である。このプラスミドを用いて、EBVgp350/220および6-ヒスチジンポリペプチドをコードするウイルスの遺伝子を置換する。そして昆虫細胞をこれらの遺伝子を有するウイルスでトランスフェクトする。後にトランスフェクトした昆虫細胞を回収し、そして組換えEBVgp350/220タンパク質をトランスフェクトした昆虫細胞から分離する。そしてEBVgp350/220タンパク質を、6-ヒスチジンペプチドに親和性を有する樹脂のカラムで精製する。本発明の他の態様は、この方法で生産されたタンパク質である。発明の詳細な説明本願発明は、EBVgp350/220タンパク質およびgp350/220の66kdセリンおよびスレオニンリッチな部分に基づく組換えポリペプチドを提供する。このポリペプチドはEBV免疫ヒト血清およびEBVウイルスを中和するモノクローナル抗体の両方と免疫反応性である。ヒトＢ細胞へのEBV付着の仲介に関与するペプチド配列をコードする配列をさらに組み込んだポリペプチドもまた提供される。このようなポリペプチドに基づくワクチンは、EBVに対する中和抗体の生産を誘導するだけでなくウイルスのＢ細胞への結合および侵入を阻害する能力を有する。ポリペブチド用語「gp350/220」は、エプスタイン-バーウイルス（EBV）の350kdおよび220k dの外膜の糖タンパク質を意味し、EBVが複製している感染細胞の外表面上にもまた存在する。この用語はまた、gp350/220の変異体または断片をも包含する。用語「66kdタンパク質」は、gp350/220のセリンおよびスレオニンリッチな部分を意味し、EBVgp350/220のDNAをコードするドメインの開始コドンから数えて1 361〜2292の塩基対により示される、完全なEBVgp350/220をコードするドメインを含むDNA断片のNcoI断片にコードされる（Beisel，C.ら、J．Virol．54，665）。用語はまた、66kdタンパク質の変異体または断片を包含する。好ましくは、このようなポリペプチドはまたペプチド配列Glu-Asp-Pro-Gly-Phe-Phe-Asn-Val-Gl uを包含し、ヒトＢ細胞のCR2レセプターへのEBV付着の仲介に関与する。この９個のアミノ酸からなる配列は、一般に66kdタンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端に導入され、最も好ましくは、アミノ末端である。便宜のために、本明細書中で用いた用語「66kdタンパク質」はまた、66kdポリペプチドおよびこの９個のアミノ酸からなるペプチドを包含するポリペプチドを意味する。ヒト被験体中でEBV中和抗体を誘導する能力のあるこのようなポリペプチドだけが、本発明の範囲にあると考えられる。このようなポリペプチドの「免疫学的に効果的な量」は、ヒト被験体中でEBV 中和抗体を誘導することが可能な量である。通常、本願発明のタンパク質は、66kdタンパク質配列と少なくとも約50％相同であり、好ましくは約90％より多く、そしてさらに好ましくは、少なくとも約95 ％相同である。高いまたは低い緊縮条件下で、66kdタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズするDNAにコードされたタンパク質もまた含まれ、66kdタンパク質に対する抗血清から回収された密接な関係のあるポリペプチドまたはタンパク質もまた含まれる。相同性を比較するポリペプチド配列の長さは、一般に少なくとも約16個のアミノ酸であり、通常少なくとも約20残基、さらに通常には少なくとも約24残基、典型的には少なくとも約28残基、そして好ましくは約35残基以上である。実質的な相同性または同一性用語「実質的な相同性」または「実質的な同一性」は、ポリペプチドについて意味する場合、問題のポリペプチドまたはタンパク質が、天然に発生したタンパク質全体またはその部分と少なくとも約30％同一性、通常少なくとも約70％同一性、そして好ましくは少なくとも約95％同一性を示すことを意味する。ポリペプチドに対する相同性は、代表的には配列分析ソフトウエアを用いて決定する。例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Compu ter Group、Univers ity of Wisconsin Biotechnology Center、1701 University Avenue、Madison、 Wisconsin 53705を参照のこと。タンパク質分析ソフトウエアは、種々の置換、欠失、および他の改変に割り当てられた相同性を測定して類似配列をマッチさせる。同類置換は、典型的には以下の群の中での置換を包含する；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。ポリペプチド「断片」、「部分」または「セグメント」は、少なくとも約５個のアミノ酸、通常少なくとも約７個のアミノ酸、代表的には少なくとも約９〜13 個のアミノ酸であり、そして種々の実施態様では、少なくとも約17またはそれ以上のアミノ酸の長さのアミノ酸の残基である。本願発明のポリペプチドは一般に可溶性であるが、ポリペプチドはまた、固相支持体に連結され得る。多くのこのような支持体は、当該分野で周知である。「単離した」用語「単離した」、「実質的に純粋な」、および「実質的に同質」は、それが本来伴う成分から分離されたタンパク質またはポリペプチドを記述するときに互換的に用いられる。単量体タンパク質は、試料の少なくとも約60 〜75％が単一ポリペプチド配列を示す場合、実質的に純粋である。実質的に純粋なタンパク質は、典型的にタンパク質試料約60〜90％W/W、より通常では約95％を有し、そして好ましくは、約 99％の純度を超え得る。タンパク質の純度または同質性は、当該分野で周知の多くの方法により決定され得る。例えはタンパク質試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ついでゲルを染色して単一のポリペプチドバンドを可視化する。ある目的のためには、HPLCまたは当該分野で周知の他の方法を用いてより高度な解析が提供され得る。タンパク質は、天然の状態で付随する不純物から分離された場合、単離されたと考えられる。従って、化学的に合成したポリペプチド、または天然に由来する細胞とは異なった細胞系で合成されるポリペプチドは、本来それが伴う成分を実質的に含まない。タンパク質精製本願発明は、これらのタンパク質をコードする組換え核酸で形質転換した細胞から典型的に精製されたポリペプチドを提供する。このタンパク質精製は、当該分野で周知な種々の方法により行われ得る。６つの連続するヒスチジン残基をＮ末端に有するタンパク質は、下記の実施例２に記載のように、 ProBond樹脂（Invitrogen，San Diego，CA）への結合によって精製され得る。タンパク質精製の他の有用な方法は、当該技術分野で周知であり、そして、例えば、Methods in EnzymologyのGuide to Protein Purification，M．Deutscher編， vol.182（Academic Press，Inc.：San Diego，1990）およびR．Scopes，Protein Purification：Principlesand Practice ，Springer-Verlag：New York，1982に記載された方法を含む。必要であれば、本願発明のタンパク質のアミノ酸配列は、当該分野で周知のタンパク質配列決定方法により決定され得る。タンパク質の改変；断片；融合タンパク質本願発明はまた66kdタンパク質の一次構造配列と実質的に相同なポリペプチドまたはその断片を提供する。本願発明はまた、インビボまたはインビトロでの化学的および生化学的な改変および通常用いないアミノ酸を取り込む改変を包含する。このような改変は、例えばアセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、標識、例えば、放射性核種による標識化、種々の酵素的修飾を包含し、当業者には容易に理解される。ポリペプチドを標識する種々の方法、およびこのような目的に使用され得る種々の置換基または標識は、当該分野で周知であり、そして³²Ｐのような放射性アイソトープ、標識した抗リガンド（例えば、抗体）と結合するリガンド、蛍光物質、化学発光剤、酵素、および標識したリガンドに対して特異的な結合ペアーメンバーとして働き得る抗リガンドを包含する。標識の選択は、必要な感度、プライマーとの結合の容易さ、必要な安定性、および使用可能な装置に依存する。ポリペプチドの標識方法は、当該分野で周知である。例えば、Molecular Clonin：A Laboratory Manual ，第２版、1-3巻、Sambrookら編、Cold Spring Ha rbor Laboratory Press（1989）またはCurrent Protocols in Molecular Biolog y ，F．Ausubelら編、Greene Publishing and Wiley-Interscience：Ne w York（1987および改訂版）を参照のこと。実質的に完全長のポリペプチドの他に、本願発明はEBV中和抗体を誘導する能力のあるポリペプチドの断片を提供する。本明細書中で用いられているように、断片またはセグメントという用語は、ポリペプチドに適用される場合と同様に通常少なくとも約５〜７の連続するアミノ酸、代表的には少なくとも約９〜13の連続するアミノ酸、および最も好ましくは少なくとも約20〜30またはそれ以上の連続するアミノ酸を意味する。免疫学的な目的のために、本願発明のポリペプチドまたはポリペプチド断片のタンデムリピートは、免疫原として用いられ得、それにより、より高い抗原性のタンパク質を生産する。本願発明はまた、66kdポリペプチドまたはその断片を包含するポリペプチドを提供する。相同なポリペプチドは、66kdタンパク質に由来する２またはそれ以上の配列の間で融合し、または66kdタンパク質配列と関連タンパク質配列との間での融合物であり得る。同様に異種の融合物は、誘導タンパク質の特性または活性の組み合わせを示すように構築され得る。Godowskiら（1988）Science 241：812 -816を参照のこと。融合タンパク質は代表的には、組換え核酸方法により作られ得るが、化学的にも合成され得る。ポリペプチドの合技術は、例えば、Merrifield（1963）J．Ame r．Chem．Soc. 85 ：2149-2156に記載されている。核酸本願発明でいう核酸という用語は、66kdのポリペプチド、その断片、相同物あるいはタンパク質の融合または欠失を包含するその改変をコードする核酸を表している。本願発明の核酸はこのようなタンパク質をコードする天然のEBV核酸配列に誘導するかあるいは実質的に類似しているかのいずれかである配列、またはこの配列と実質的に相同性を有する配列、またはその一部を有し得る。本願発明の核酸組成物は、RNA、cDNA、ゲノムDNA、合成形態、および混合ポリマー、センスおよびアンチセンス鎖の両方を包含し、そして化学的若しくは生化学的に改変され得、または非天然若しくは誘導されたヌクレオチド塩基を含み得るがこれは、当業者に容易に理解され得る。天然に生じるのではない配列を包含する組換え核酸がまた本願発明により提供される。野生型の配列も使用し得るが、野生型の配列は、例えば、欠失、置換または挿入により、しばしば変化し得る。本願発明で用いられる核酸配列は、通常少なくとも約５コドン（１５ヌクレオチド）包含し、さらに通常は少なくとも約７〜15コドン、およびさらに好ましくは、少なくとも約35コドンを包含し得る。１つまたはそれ以上のイントロンもまた存在し得る。このヌクレオチドの数は、通常このような配列と特異的なハイブリダイズに成功するために必要なプローブの最小の長さである。核酸操作の技術は一般的に、例えば、Sambrookら、（同上）、またはAusubel ら、（同上）に記載されている。制限酵素などのような、このような技術を適応するのに役立つ試薬は、当該分野で広く知られており、そしてNew England BioL abs、Boehringer Mannheim、Amersham、Promega Biotec、U．S．Biochemicals、 New England Nuclearなどの販売店およびその他の多数の供給源から購入可能である。本願発明の融合タンパク質を生産するために用いる組換え核酸配列は、天然または合成の配列から誘導され得る。多くの天然の遺伝子配列は、適切なプローブを用いて種々のcDNAまたはゲノムライブラリーから得られ得る。GenBank、N ational Institutes of Healthを参照のこと。「実質的な相同性」または「類似性」核酸またはその断片は、ある配列を（適切なヌクレオチドの挿入または欠失とともに）他の核酸（またはその相補鎖）と最適に並べた場合、少なくとも約60％のヌクレオチド塩基、通常少なくとも約 70％、さらに通常には少なくとも約80％、好ましくは少なくとも約90％、およびさらに好ましくは約95％〜98％のヌクレオチド塩基中にヌクレオチド配列の同一性があるときに「実質的に相同」（または「実質的に類似」）である。あるいは、核酸または断片（またはその相補鎖）が、66kdポリペプチドをコードする核酸と選択的にハイブリダイズする条件下で、核酸または断片がハイブリダイズし得る場合、実質的に相同（または類似）である。ハイブリダイズにおける選択性とは、ハイブリダイズが起きる場合に現れるものであり、全く選択性がない場合よりも、実質的により選択的である場合をいう。代表的には、選択的なハイブリダイズは、少なくとも約14のヌクレオチドの長さにわたって少なくとも約55 ％相同、好ましくは少なくとも約65％、さらに好ましくは少なくとも約75％、および最も好ましくは少なくとも約90％相同である場合に起こり得る。Kenehisa（ 1984）Nuc．Acids Res.12：203-213を参照。上記のように、相同性を比較する長さはさらに長い長さであり、そしてある実施態様では、しばしば少なくとも約17 ヌクレオチド、通常少なくとも約20ヌクレオチド、さらに通常では少なくとも約 24のヌクレオチド、代表的には少なくとも約28ヌクレオチド、さらに代表的には少なくとも約32ヌクレオチド、および好ましくは少なくとも約36またはそれ以上のヌクレオチドの長さを超え得る。核酸のハイブリダイズは、例えば、塩濃度（例えば、NaCl）、温度、または有機溶媒、さらに塩基組成物、相補鎖の長さ、およびハイブリダイズしている核酸間のヌクレオチド塩基のミスマッチの数、のような条件により影響され得るが、これらは当業者には容易に理解され得る。緊縮性の温度条件は、一般に30℃より高い、代表的には37℃より高い、および好ましくは45℃より高い温度を包含し得る。緊縮性の塩濃度は、通常1000mMより低く、代表的には500mMより低く、および好ましくは200mMより低い。しかし、パラメーターの組み合わせは、単一のパラメーターの測定よりもさらに重要である。例えば、 Wetmur and Davidson（1968）J．Mol．Biol. 31：349-370を参昭「単離した」または「実質的に純粋な」または「精製した」「単離した」または「実質的に純粋な」または「精製した」核酸は、例えば、RNA、DNAまたは混合ポリマーといった核酸である。それは、天然のヒト配列に天然に付随する他のDN A配列（例えば、リボゾーム、ポリメラーゼ、および多くの他のヒトゲノム配列）から実質的に分離されている。用語は天然に生じる環境から取り出された核酸配列を包含し、そして組換えまたはクローニングされたDNA単離物および化学的に合成されたアナログまたは異種のシステムで生物学的に合成されたアナログを含む。「コードする」核酸の天然の状態または当業者に周知の方法により操作され、それが転写されおよび／または翻訳され、ポリペプチドまたはその断片を生産し得る場合に、核酸はポリペプチドをコードすると言う。このような核酸のアンチセンス鎖もまた配列をコードすると言う。「作動可能な結合」核酸配列が他の核酸配列と機能的な関係に置かれる場合、核酸配列は作動可能な結合をしている。例えば、プロモーターがコードしている配列の転写または発現に影響する場合、プロモーターはコードしている配列に作動可能に結合している。一般に、作動可能な結合は、結合されたDNA配列が連続し、２つのタンパク質コード領域を連結する必要があるときには、連続し読みとり枠にあることを意味する。「組換え」用語「組換え」核酸は天然に生じない核酸であり、または他の２つの分離した配列のセグメントの人工的な結合により作られる核酸である。この人工的な結合は、化学的合成手法または核酸の単離したセグメントへの人工的な操作（例えば、遺伝子工学技術）のいずれかによりしばしば成し遂げられる。このようなことは、コドンを、同一または同類アミノ酸をコードする重複コドンで置換し、一方で、代表的には、配列認識部位を導入または除去することにより行われる。あるいは、望ましい機能を有する核酸セグメントを互いに結合して、望ましい機能の組み合わせを生じ得る。組換えまたは化学的に合成した核酸の調製；ベクター、形転換、宿主細胞本願発明の大量の核酸は、適切な宿主細胞での複製により生産され得る。所望の断片をコードする天然または合成DNA断片は、原核または真核細胞に導入および複製可能な組換え核酸構成物に組み込まれ得、代表的にはDNA構成物に組み込まれ得る。通常、DNA構成物は、酵母または細菌のような単細胞宿主での自律的な複製に適し得るが、しかし昆虫、哺乳動物、植物または他の真核細胞株のゲノム中への導入および組み込みもまた意図する。本願発明の方法により生産された核酸の精製は、例えば、Sambrookら（1989）またはAusubelら（1987および改訂版）に記載されている。本願発明の核酸はまた化学的な合成、例えば、BeaucageおよびCarruthers（19 81）Tetra．Letts. 22：1859-1862に記載のホスホルアミダイト方法またはMatteucciら（1981）J．Am．Chem．Soc．103： 3185によるトリエステル法により生産され得、そして市販の自動オリゴヌクレオチド合成機で行われ得る。２本鎖の断片は、相補鎖を合成し適切な条件下でこの鎖とともにアニールすることによるか、またはDNAポリメラーゼを適切なプライマー配列とともに用いて相補鎖を添加することのいずれかにより化学合成の一本鎖生産物から得られ得る。原核宿主または真核宿主への導入のために調製したDNA構成物は、典型的には宿主により認識される複製システムを有しており、所望のポリペプチドをコードする目的のDNA断片を包含する。そして好ましくはポリペプチドをコードするセグメントに作動可能に結合した転写および翻訳開始調節配列が包含される。発現ベクターは、例えば、複製または自動複製配列（ARS）の起点および発現制御配列、プロモーター、エンハンサー、および必要なプロセッシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写ターミネーター配列、およびmRNA安定化配列を包含し得る。選択した宿主によって分泌されるポリペプチドの分泌シグナルはまた、適切な場所に包含され得、従って、細胞膜にタンパク質が交差および/または突き剌さることを可能にし、そして従ってその機能的なトポロジーを達成し、または細胞から分泌され得る。このようなベクターは、当該分野で周知の標準的な組換え技術の手法により調製され得、そして例えば、Sambrookら（1989）またはAusubelら（1987）で議論されている。適切なプロモーターおよびその他の必要なベクターの配列の選択は、宿主内で機能的であるように選択され、そしてそれが適正な場合には、本来EBV遺伝子に関係のある配列を含み得る。細胞系と発現ベクターとの機能し得る組み合わせの例は、Sambrookら、1989、またはAusubelら、1987、に記載されており、またMet zgerら、1988、Nature 334：31-36も参照されたい。多くの有用なベクターが当該分野で公知であり、そしてそのようなベクターはStratagene、New England Bi olabs、 Promega Biotech、およびその他から入手し得る。trp、lacおよびファージプロモーター、tRNAプロモーターおよび解糖系酵素プロモーターのようなプロモーターが、原核生物宿主に用いられ得る。有用な酵母プロモーターは、メタロチオネイン、3-ホスホグリセリン酸キナーゼまたはエノラーゼあるいはグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼのような他の解糖系酵素、またはマルトースおよびガラクトースの利用に関する酵素などのプロモーター領域を含む。酵母の発現に用いるのに適したベクターおよびプロモーターは、Hitzemanら、EP 73,657Aにさらに記載されている。適切な非天然の哺乳動物プロモーターとしては、SV40由来の初期および後期のプロモーター（Fiersら、（1978）Nature 273 ：113）またはネズミモロニー白血病ウイルス、マウス乳腫瘍ウイルス、トリ肉腫ウイルス、アデノウイルスII、ウシパピローマウイルスあるいはポリオーマウイルス由来のプロモーターを含み得る。さらに、構成物は増幅可能な遺伝子（例えばDHFR）に連結させ得、その結果、その遺伝子の多くのコピーが作成され得る。適切なエンハンサーおよび他の発現制御配列については、Enhancers and Eukarvotic Gene Expression、Cold S pring Harbor Press、N.Y．（1983）を参照されたい。このような発現ベクターは自律的に複製し得るが、それらが、当該分野で周知の方法によって宿主細胞のゲノムに挿入されて複製されるのはあまり好ましくない。発現およびクローニングベクターは、選択マーカー、即ちベクターで形質転換された宿主細胞の生存あるいは成長に必須のタンパク質をコードしている遺伝子を含み得る。この遺伝子の存在は、挿入物を発現するそれらの宿主細胞のみの成長を確実にする。代表的な選択遺伝子は（a）抗生物質または他の毒性物質（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートなど）への耐性を付与し；（b）栄養要求性欠失を補い；または（c）複合培地から得られない必須栄養分を供給するタンパク質をコードする。例えばBacilliのD-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。適切な選択マーカーの選択は宿主細胞に依存し、そして異なる宿主に対する適切なマーカーは当該分野では周知である。目的の核酸を含むベクターは、インビトロで転写され得、そして得られたRNA は、周知の方法（例えば、注射。T．Kuboら、FEBS Lett．241：119（1988）を参照）によって宿主に導入され得る。ベクターは当該分野に周知の方法によって直接宿主細胞に導入され得るが、その方法は細胞宿主のタイプに応じて変化し、エレクトロポレーション法；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、DE AEデキストラン、または他の物質を用いるトランスフェクション；マイクロプロジェクターを用いるボンバード；リポフェクション；感染（ここでベクターはレトロウイルスゲノムのような感染性物質である）、およびその他の方法を含む。一般にはSambrookら（1989）、およびAusubelら（1987）、を参照されたい。核酸が導入された上記の細胞は、そのような細胞の子孫の細胞をもまた含むことを意味する。本願発明の核酸およびポリペプチドは、ベクターあるいは他の発現手段に含まれる核酸またはその一部を和合性のある原核性または真核性宿主細胞内で大量に発現させることにより調製され得る。最も一般的に用いられる原核生物宿主は、Escherichia coli の株であるが、Bacillus subtilisまたはPseudomonasのような他の原核生物もまた用いられ得る。哺乳動物あるいは他の真核生物宿主細胞、例えば酵母、糸状菌、植物、昆虫、両生類、または鳥類のような細胞もまた本発明のタンパク質の生成に有用であり得る。培養による哺乳動物細胞の増殖は、それ自体周知である。Tissue Culture 、KruseおよびPatterson編、Academic Press（1973）を参照されたい。一般に用いられている哺乳動物宿主細胞系の例は、VEROおよびHeLa細胞、チャイニーズハムスターの卵巣（CHO）細胞、およびWI38、BHKおよびCOS細胞系であるが、他の細胞系も、例えば高い発現性、所望のグリコシル化様式、または他の特性を提供するのに適切であり得るということは、当業者によって理解され得る。クローンは、マーカーを用いて、ベクター構築様式に依存して選択される。このマーカーは、同一または異なるDNA分子上にあるが、好ましくは同一DNA分子上にある。形質転換細胞はスクリーニングされ得るか、または好ましくは当業者に周知のいずれかの手段、例えばアンピシリン、テトラサイクリンのような抗生物質に耐性であること、によって選択され得る。ワクチン本願発明は、本願発明のポリペプチドの免疫原量を包含するワクチン調製物を提供する。これらのワクチンのそれぞれは、１個より多い本願発明のタンパク質、他のタンパク質または免疫原と組み合わせた本願発明のタンパク質を包含し得る。「免疫原量」は、ワクチンが投与された個体中でポリペプチドに対する抗体の生成を導き得る量を意味する。免疫原のキャリアは、本願発明のポリペプチドの免疫原性を高めるために用いられ得る。このようなキャリアは、可溶性の分子、例えば、タンパク質およびポリサッカライド、あるいは粒子、例えばリポソーム、および細菌の細胞および膜である。タンパク質キャリアは本願発明の66kdのタンパク質に連結されて組み換え手段または化学的結合によって融合タンパク質を形成し得る。有用なキャリアおよびそのようなキャリアをポリペプチド抗原に結合する手段は、当該分野で周知である。本願発明のワクチンは、当業者に周知のいずれかの手段によって処方され得る。このようなワクチンは代表的には注射可能なように、液状の溶液または懸濁物のどちらかに調製され得；注射前に液体に溶解し、または懸濁物となるのに適する固形物もまた調製され得る。この調製物は乳化され得、またはこのタンパク質はリポソームでカプセル化され得る。活性な免疫原性成分は、薬学的に受容可能で、活性成分と適合性のある賦形剤またはキャリアとしばしば混合され得る。適切な賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせがある。注射可能な処方物中の免疫原性ポリペプチド濃度は、通常0. 2mg/ml〜5mg/mlの範囲である。さらに、所望ならば、ワクチンは、湿潤剤、乳化剤、pH緩衝剤、および／またはワクチンの効果を高めるアジュバントのような補助物質を少量含有し得る。効果的であり得るアジュバントの例は、水酸化アルミニウム、N-アセチル-ムラミル-L-スレオニール-D-イソグルタミン（thr-MDP）、N-アセチル-nor-ムラミル-L -アラニル-D-イソグルタミン（CGP 11637、nor-MDPという）、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-（1'-2'-ジパルミトイル-sn- グリセロ-3-ヒドロキシホスホリロキシ）-エチルアミン（CGP 19835A、 MTP-PEという）、および２％スクアレン／Tween 80エマルジョン中に細菌から抽出された３つの成分、即ちモノホスホリルリピッドA、トレハロースジミコール酸、および細胞壁骨格（MPL＋TDM＋CWS）を含むRIBI、を包含する。アジュバントの効果は、種々のアジュバントを含むワクチン中の免疫原を投与することにより得られた免疫原に対する抗体の量を測定することにより決定され得る。ワクチンは、一般的には、静脈、皮下、または筋肉注射によって非経口的に投与され得る。他の投与形態または投与方法もまた用いられ得、坐薬、ある場合には経口処方物およびリポソーム、またはその他を包含し、当該分野では周知である。坐薬に関しては、一般的な結合物質（binder）およびキャリアとしては、例えば、ポリアルカリグリコールまたはトリグリセリドを含む。このような坐薬は、アナログを0.5重量％、好ましくは１％〜２％の範囲で含む混合物から形成され得る。経口処方物は、代表的には、薬学的な等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウムのような賦形剤を含む。これらの組成物は溶液、懸濁物、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性処方物、または粉末という形を採り、本願発明のポリペプチドを10％〜95％、好ましくは25％〜70％含む。本願発明のポリペプチドは、中性または塩の形としてワクチンに処方され得る。薬学的に受容可能な塩は、酸付加塩（ペプチドの遊離のアミノ基で形成される）を含み、これは例えば塩酸、またはリン酸のような無機酸、または例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、またはマレイン酸のような有機酸、によって形成される。遊離のカルボキシル基で形成される塩もまた、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄のような無機塩基、および例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノ-エタノール、ヒスチジン、およびプロカインのような有機塩基に由来する。ワクチンは、投与形態と適合する形式で投与され、そしてそのような量は予防上、および／または治療上効果的である。投与量は一般に１用量当たり５〜250 μgのタンパク質の範囲であり、それは治療されるもの、個人の免疫系の抗体合成能力、および所望の保護の程度に依存する。投与に必要な活性成分の正確な量は、医師の判断に依存し、そして各個人に特有で有り得るが、そのような決定はそのような医師の仕事である。ワクチンは、一回の服用または複数回の服用計画によって与えられる。複数回の服用計画は、ワクチン化の最初のコースは１〜10回の別々の服用で、次いで免疫反応を維持、および補強するために必要とされるその後の時間間隔、例えば第２回目の服用に関しては１〜４ヶ月、そして必要ならば数カ月後に次の服用というように異なる用量が投与される。本発明は、以下の実施例を参考にすることにより、一層よく理解されるが、それらは発明を実施するための現時点で最良の態様を示すことを意図するのみである。しかし、本願発明はこれらに限定されない。実施例実施例１：EBV中和抗体に対するエピトープの同定 EBV中和抗体に対するエピトープを同定するために、次の組換えプラスミドを構築した。プラスミドpMA102の全EBV gp350/220コーディングドメインを含む4.3Xho II-BGLII DNAフラグメントをバキュロウイルス発現ベクターpBlueBacHisC（I nvitrogen）にサブクローニングして、プラスミドpBac-TTI350を得た。このフラグメントは、EBV感染細胞の外表面上に存在するタンパク質であるgp350/220の全領域を含む。セリン、スレオニン−リッチな配列をコードしているNcoIフラグメントを、pBac-TTI350から除去し、プラスミドpBac-TTI300を生成した。NcoIフラグメントを、プラスミドpBlueBacHisCのNcoI部位に再びクローニングし、pBac-T TI250を生成した。これらの操作には、E.coliの株Top 10（Invitrogen）を用いた。９個のアミノ酸Glu-Asp-Pro-Gly-Phe-Phe-Asn-Val-Gluをコードしている合成DNAもまた66kdタンパク質をコードしている配列の上流に導入された。このペプチドはEBVのヒトＢ細胞レセプターCR2への接着の仲介に関与することが示されている。このようなタンパク質の構築は中和抗体を生成するだけでなく、Ｂ細胞へのウイルスの結合および侵入を阻害する。バキュロウイルス転移ベクターを用い、相同組換えによって、ウイルス性ポリヘドリン遺伝子を目的遺伝子と置換する。野生型ゲノム内てポリヘドリン遺伝子をはさむ配列は、転移ベクター上の発現カセットの５’から３’方向に位置している。コトランスフェクションに続いて、これらの配列間で相同組換えが起こり、ウイルス性ポリヘドリンエンハンサー／プロモーター要素による制御下で目的遺伝子が発現される組換えウイルスが得られる。ここで用いたベクターpBlueBacHisCはまた、ガラクトシダーゼを発現して、青いリポーターを提供し、青い組換え体プラークが視覚的に同定され得る。Invitrogenのマニュアルに記載の方法により組換えウイルスを作製し、精製した。 gp350/220配列の、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞（Sf9細胞、Invitrogen ）由来の昆虫細胞における発現を、以下の方法でウエスタンブロット分析により確認した。昆虫細胞を、組換えプラスミドpBac-TTI350、pBac-TTI300、およびpB ac-TTI250を含むウイルスでそれぞれ感染させた。３日後、各培養から1mlの細胞サンプルを取り出した。分子量350kdおよび220kdのポジティブコントロールとしてEBV感染したRaji細胞サンプル1mlもまた以下のテストで用いた。細胞をペレットにし、100μlのLaemmli緩衝液に溶解した。２分間煮沸した後、サンプルを10 ％ SDS-ポリアクリルアミドゲルにのせ、70ボルトで１晩電気泳動した。タンパク質を電気泳動的にニトロセルロース膜に移した。タンパク質の非特異的結合をブロックするために、５％脱脂粉乳を含むTBST（10mM Tris）pH8.0／1mM E DTA／0.05% Tween-20）で膜を処理した。高力価のEBV免疫ヒト血清およびgp350/ 220に対するEBV中和モノクローナル抗体（DuPont、Boston、MA）をそれぞれブロットに添加し、１時間インキュベートし、それぞれTBSTで５分間、３回洗浄し、次いで抗ヒトIgGアルカリフォスファターゼ複合体と30分間インキュベートした。TBSTで３回洗浄した後、発色させた。組換えウイルスpBac-TTI350に感染した細胞は、EBV免疫ヒト血清およびEBV中和モノクローナル抗体の両方に結合した、分子量350kdおよび220kdの２つのバンドを示した。組換えタンパク質のバンドは、EBVに感染したRaji細胞のタンパク質のバンドと同じ位置に現れた。gp350/220のセリン、スレオニン−リッチな配列を除去した組換えウイルスpBac-TTI300に感染した細胞との反応は見られなかった。TTI300プラスミドが反応しなかったので、セリン−、スレオニン−リッチ配列が中和抗体のエピトープのように思われる。この結果は、pBac-TTI300から除去されたセリン−、スレオニン−リッチ配列を含む組換えウイルスpBac-TTI25 0に感染した細胞とヒト血清およびモノクローナル抗体との免疫反応によりさらに確証された。pBac-TTI250の反応性タンパク質のサイズは66kdであった。実施例２：組換えタンパク質の精製 pBlueBacHisCベクターは、転写開始コドンの下流に発現されるタンパク質のＮ末端領域に6-ヒスチジンペプチドを生成するDNA配列を含む。このペプチドはPro Bond樹脂（Invitroge n）に親和性があり、従って１段階の精製を可能にする。２つのタンパク質のそれぞれについて、約500mlのSf9昆虫細胞を500mlのスピンナーフラスコ中で密度２×10⁶細胞／mlで培養した。細胞を、高力価のウイルスストックのpBac-TTI250 感染ウイルス（66kdタンパク質）またはpBac-TTI350感染ウイルス（350/220kdタンパク質）のいずれかに感染させた。次いで、細胞を３日間培養した。細胞を遠心分離によりペレットにし、そして20mMリン酸ナトリウムおよび500mM NaClに懸濁し、超音波により破砕して遠心分離により細胞破片を除去した。上清をInvitr ogenによって記載された方法でProBond樹脂に通して組換えタンパク質を精製した。始めに、組換えタンパク質の６-ヒスチジン末端をProBond樹脂に結合させる。次いで、カラムにエンテロキナーゼをかけて組換えタンパク質を切り出す。この分離方法により、SDS-ポリアクリルアミドゲル上で１本のタンパク質バンドが提供される（66kdまたは350/220kdタンパク質）。350kdおよび220kdのバンドは、組換えタンパク質およびRaji細胞由来タンパク質で同じ位置にあった。それぞれ500mlの培養から約５mgの精製タンパク質が得られた。 gp350/220由来の66kd組換えタンパク質が、EBV免疫ヒト血清およびEBVウイルスを中和するモノクローナル抗体の両方と免疫反応性であるので、このタンパク質を用いてEBVに対するワクチンを生産し得る。さらに、66kdタンパク質はまた、EBVのＢ細胞への接着に関する９個のアミノ酸配列をも有するので、このタンパク質で生産されるワクチンもまたＢ細胞へのウイルスの結合および侵入を阻害する。バキュロウイルスでの発現は、いくつかの利点を提供する。E.coliがグリコシル化されていないタンパク質を合成し、そして酵母が異なるグリコシル化を有するタンパク質を生成するのに対し、バキュロウイルスで生産されるタンパク質はグリコシル化され、哺乳動物細胞における発現によって生じるグリコシル化様式と同様の様式を有している。さらなる利点は、バキュロウイルスから得られる精製タンパク質の量は、哺乳動物から得られる量よりはるかに多いということである。さらに、哺乳動物細胞における組換えgp350/220の発現は一般に非常に不安定である。従って、昆虫細胞で生成される66kdまたは350/220kdタンパク質のいずれかは、精製ワクチンタンパク質を作る、より安定で効率的な方法を提供する。より小さいタンパク質は、ワクチン生産に関しては大きなタンパク質よりいくつかの有利な点を提供する。小さいタンパク質は重量当たり、より多くのモル数のエピトープまたはワクチンの注射容量の注射を可能にする。小さいタンパク質はより十分に組み換え的に、そして免疫学的に加工され得る。小さいタンパク質はプロテアーゼの攻撃を受けにくいが、それはそれらがプロテアーゼが特異的であるアミノ酸の組み合わせを持ちにくいからである。小さいタンパク質は、エピトープが少なく、より集中した反応を導き出す。上記の引用した文献および特許のそれぞれを参考文献として援用する。本願発明を特定の実施態様と関連させて記載するが、当業者には明らかな種々の改変も添付の請求項によって規定されるような本願発明の範囲に入る。従って、本願発明の範囲は上記の記載を参照して決定されるのではなく、添付の請求項、およびそのような請求項が有する同等の全ての範囲を参照して決定される。Detailed Description of the Invention Recombinant Epstein-Barr virus protein And use for vaccines Technical field The present invention relates generally to the production of vaccines, especially Epstein-Barr virus (EBV). It is effective against infection and has a 66kd serine and EBV gp350 / 220 and EBV gp350 / 220 serine level. And a threonine-rich portion-based vaccine.Background technology Epstein-Barr virus (EBV) is a herpes virus that infects most humans. It is a member of the Ils family. The symptoms of early infection in normal humans are extremely mild From disease to contagious monocytosis (Roberts, G.B.,Diagnosis and Clinical Testing 27, 16-21, 1989). Persistent or latent EBV infection is Burkitt It is an important causal factor in lymphomas and nasopharyngeal tumors. EBV is An opportunistic pathogen and immunosuppressed patient with acquired allograft or acquired immunodeficiency It is usually expressed in patients with syndrome (AIDS). EBV also affects rheumatoid arthritis and chronic It is related to fatigue syndrome. EBV infection prevention is needed in association with morbidity and mortality Desired EBV does not replicate much in vitro, so prophylactic immunity A systematic approach to select and produce detoxified viruses for immunization is not feasible Yes. EBV is suspected to be a pathogen of human malignant tumors causing lymphocyte proliferation Therefore, the viral preparation used for immunization is It is very important not to include the warming gene. For this reason, it is shown on the outer surface of EBV virus and / or EBV infected cells. There is a need for effective vaccines based on isolated proteins. Recombinant protein Quality is better than protein purified from mammalian tissues infected with this virus Provides some benefits. For example, they are easily produced in large quantities and in high purity. Can be done. In particular, it not only neutralizes EBV virus after infection, but also It is valuable to be a vaccine that can prevent the binding and invasion of ruth.Brief description of background art The major components of the outer surface of EBV are glycoproteins of 350, 220, and 85 kilodaltons Quality (Pearson, G.R. and Luka, J. In: M.A. Epstein and B.G. Achong. (Ed),The Epstein-Barr Virus. Recent Advances, Pp.48-73. William Heine mannMedical Books, London.). These glycoproteins are also associated with this virus It is present on the outer surface of the infected cells being made. Polysaccharides for these proteins Ronal and monoclonal antibodies react with the surface of proliferating infected cells, And neutralize the virus (same as above). However, antibody-dependent cytotoxicity (A Target membrane antigens against DCC) are associated with gp350 and gp220 but not gp85 It seemed to be the same (same as above). EBV gp350 / 220 is also a CR2 receptor on human B lymphocytes Was identified as a ligand that mediates viral attachment to E. coli (Nemerow, GR, et al.,J . Virol.61 , 1416-1420, 1987). The sequence Glu-Asp-Pro-Gly-Phe-Phe-Asn-Val-Glu is , An epitope corresponding to the N-terminal region of gp350 / 220 and involved in adhesion. Issued (Nemerow, G.R. et al.,Cell 56, 369-377, 1989). The gp350 and gp220 proteins are located in the same DNA fragment 3.2 kb and 2. Encoded by a 5 kb RNA (Beisel, C. et al.,J. Virol．54665-674 1985 ). E. Antisera raised in rabbits against the gp350 / 220 protein expressed in E. coli Specifically immunoprecipitates gp350 and gp220, reacts with the plasma membrane of infected cells, and In particular, the virus is neutralized after the addition of complement. However, multiple of sufficient protein Multiple injections are required to elicit an effective response. E. gp350 expressed in E. coli Poor immunogenicity of / 220 is due to defective glycosylation and lack of proper folding It is believed that Gp350 / 220 is immunogenic when expressed in mammalian cells And can induce virus neutralizing antibodies (Whang, Y. et al.J. Virol．61179 6-1807, 1987), glycosylation plays an important role in the immunogenicity of glycoproteins. Indicates that. However, expression of recombinant gp350 / 220 in mammalian cells is generally non- It is always unstable. Some features of proteins are DNA and mRNA nucleotidies. Predicted from the sequence (Beisel, C. et al.,J.Virol.54, 665). primary translation of gp350 The product is a polypeptide of 907 amino acids, while the primary translation of gp220 The product is a polypeptide of 710 amino acids. Amino of both proteins At the end is a region of 18 amino acids, which is a cleavable signal sequence. It's like Petit. A single hydrophobic domain acts as a transmembrane anchor It seems to function and is located at 26 amino acids from the carboxy terminus of both proteins . 850 amino acids of gp350 between the putative signal sequence and the anchor sequence and gp The 652 amino acids of 220 are serine-rich and threonine-rich, and 35 (gp350) or 24 (gp220) asparagine-X-serine or -C-threonine Includes each sequence. These sequences have potential for N-linked glycosylation. Working as a signal. Therefore, these regions appear to be on the outer surface of the membrane. is there.Brief summary of the invention The present invention is based on the 66kd serine and threonine rich portion of gp350 / 220. And recombinant fragments and fragments thereof. These are mammalian bodies and EBV It is useful as a vaccine that can induce neutralizing antibodies. Preferably, these polype The peptide has 9 amino acid peptide sequence Glu-Asp-Pro-Gly-Phe-Phe-Asn-Val-Glu It further has a coding sequence. This sequence is a marker of EBV attachment to human B cells. Are involved in 66kd po Based on a polypeptide that includes both a lipopeptide and this nonameric peptide The vaccine may also inhibit viral binding and entry into B cells. Accordingly, one aspect of the present invention is that it essentially induces EBV neutralizing antibodies in mammals. Getting Epstein-Barr virus gp350 / 220 66kd serine and threonine It is a substantially pure polypeptide consisting of a fragment or a fragment thereof. Another aspect of the present invention is Epstein-Barr that can induce EBV neutralizing antibodies in mammals. -66kd serine- and threonine-rich portion of virus gp350 / 220 or its And a fragment containing the peptide sequence Glu-Asp-Pro-Gly-Phe-Phe-Asn-Val-Glu. It is a qualitatively pure polypeptide. Such polypeptides are preferentially glycosylated. The present invention also includes nucleic acid sequences encoding these polypeptides, and An expression vector containing such a nucleic acid and an expression control sequence, Operably binds to the nucleic acid and effectively expresses the nucleic acid in the cell. Book A further aspect of the claimed invention relates to cells containing such an expression vector, Culturing such cells under conditions that allow the production of the polypeptide A method of producing a polypeptide of the present invention is included. Another aspect of the present invention is the po of the present invention mixed with a pharmaceutically acceptable carrier. A vaccine composition containing an immunogenic amount of a polypeptide. The present invention is thus Of various vaccine compositions Administration of an immunologically effective amount to a mammal, the method comprising: Further included are methods of protecting things. Yet another embodiment of the present invention produces a substantially pure EBV gp350 / 220 protein. The complete EBV gp350 / 220 gene is baculovirus expression vector pB Subcloned into lueBacHisC, EBV gp350 / 220 gene and 6-histidine pep This is a method of forming a plasmid pBac-TTI350 containing a tide gene. This plastic Sumid was used to encode the EBV gp350 / 220 and 6-histidine polypeptides. Replace the Ils gene. And insect cells with viruses carrying these genes Transfect with. Later harvested the transfected insect cells, and Isolate from insect cells transfected with recombinant EBV gp350 / 220 protein. The EBV gp350 / 220 protein is a resin that has an affinity for the 6-histidine peptide. Purify with the column. Another aspect of the invention is the protein produced by this method. is there.Detailed Description of the Invention The present invention is based on the EBV gp350 / 220 protein and gp350 / 220 66kd serine and sp Recombinant polypeptides based on the leonine rich portion are provided. This polypepti DO has both EBV-immunized human serum and monoclonal antibodies that neutralize EBV virus. It is immunoreactive. The peptide sequences involved in mediating EBV attachment to human B cells Polypeptide further incorporating a coding sequence Is also provided. Vaccines based on such polypeptides are directed against EBV It not only induces the production of neutralizing antibodies, but also blocks the binding and entry of virus into B cells. Has the ability to harm.Polypeptide The term "gp350 / 220" refers to the Epstein-Barr virus (EBV) 350kd and 220k Meaning the outer membrane glycoprotein of d, it is also present on the outer surface of infected cells in which EBV is replicating. Existed. The term also includes variants or fragments of gp350 / 220. The term "66kd protein" refers to the serine and threonine rich part of gp350 / 220. Means 1 minute, counting from the start codon of the EBV gp350 / 220 DNA-encoding domain 1 The complete EBV gp350 / 220 coding domain represented by base pairs 361 to 2292. DNA fragment containingNcoEncoded by the I fragment (Beisel, C. et al.,J. Virol. 54, 665) . The term also includes variants or fragments of the 66kd protein. Preferably this Polypeptides such as also have the peptide sequence Glu-Asp-Pro-Gly-Phe-Phe-Asn-Val-Gl. Includes u and is involved in mediating EBV attachment to human B cell CR2 receptors. This 9 Sequences of amino acids are commonly found at the amino terminus or carbon of the 66kd protein. It is introduced at the xy terminus and is most preferably the amino terminus. For convenience, the term "66kd protein" as used herein also refers to 66kd poly A peptide and a polypeptide including this 9 amino acid peptide means. Human subject Only such polypeptides capable of inducing EBV neutralizing antibodies in It is considered to be in the range of. An "immunologically effective amount" of such a polypeptide is EBV in human subjects. It is an amount capable of inducing a neutralizing antibody. Generally, a protein of the invention will be at least about 50% homologous to a 66kd protein sequence. Preferably more than about 90%, and more preferably at least about 95% % Homology. Nucleic acid encoding a 66kd protein under high or low stringency conditions It also contains a protein encoded by DNA that hybridizes to Closely related polypeptides or tampers recovered from antisera to the cytoplasm Quality is also included. The length of the polypeptide sequences for homology comparison is generally at least about 16 nucleotides. A mino acid, usually at least about 20 residues, more usually at least about 24 residues, It is typically at least about 28 residues, and preferably about 35 residues or more. Substantial homology or identity The terms "substantial homology" or "substantial identity" "Sex", when referring to a polypeptide, refers to the polypeptide or tamper protein in question. Protein is at least about 30% identical to the whole naturally occurring protein or part thereof Sex, usually at least about 70% identical, and preferably at least about 95% identical. Means to show. Homology to polypeptides is typically determined using sequence analysis software. Set. For example, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Compu ter Group, Univers ity of Wisconsin Biotechnology Center, 1701 University Avenue, Madison, See Wisconsin 53705. Protein analysis software uses various substitutions, Match homologous sequences by measuring the homology assigned to deletions and other modifications. It Conservative substitutions typically include substitutions within the following groups; glycine, ara Nin; valine, isoleucine, leucine; aspartic acid, glutamic acid; as Paragine, glutamine; serine, threonine; lysine, arginine; and fe Nylalanine, tyrosine. At least about 5 polypeptides "fragments," "portions," or "segments" Amino acids, usually at least about 7 amino acids, typically at least about 9-13 Amino acids, and in various embodiments at least about 17 or more amino acids. It is an amino acid residue of the above amino acid length. Although the polypeptides of the present invention are generally soluble, the polypeptides can also be solid phase. It can be connected to a support. Many such supports are well known in the art. "IsolatedThe terms "isolated", "substantially pure", and "substantially the same" “Quality” describes a protein or polypeptide that has been separated from the components that it naturally accompanies. Used interchangeably when describing. Monomeric protein is present in at least about 60 of the sample. Substantially pure when ~ 75% represents a single polypeptide sequence. Practically pure A typical protein is about 60-90% W / W of the protein sample, more usually about 95%. And preferably about It can exceed 99% purity. The purity or homogeneity of a protein is determined by Can be determined by various methods. For example, protein sample is polyacrylamide gel Visualize a single polypeptide band by electrophoresis and then staining the gel . For some purposes, more advanced using HPLC or other methods well known in the art. Analysis can be provided. A protein was isolated when it was separated from the impurities that naturally accompany it. it is conceivable that. Therefore, a chemically synthesized polypeptide, or naturally derived A polypeptide that is synthesized in a cell line different from the cell actually carries the component that accompanies it. Not qualitatively included. Protein purification The present invention provides recombinant nucleic acids encoding these proteins. Polypeptides typically purified from transformed cells are provided. This tampa Protein purification can be performed by various methods well known in the art. 6 consecutive hi A protein having a stidine residue at the N-terminus is prepared as described in Example 2 below. It can be purified by conjugation to ProBond resin (Invitrogen, San Diego, CA). Ta Other useful methods of protein purification are well known in the art and include, for example: ,Methods in EnzymologyofGuide to Protein Purification, M. Edited by Deutscher, vol.182(Academic Press, Inc .: San Diego, 1990) and R.M. Scopes,Protein Purification: Principles and Practice , Springer-Verlag: New York, 1982 Including the methods described. If necessary, the amino acid sequence of the protein of the present invention may be the amino acid sequence well known in the art. Protein sequencing methods. Modification of protein; fragment; fusion protein The present invention also relates to the 66kd protein A polypeptide or fragment thereof that is substantially homologous to the primary structural sequence is provided. From this application Ming also has chemical and biochemical modifications and variables in vivo or in vitro. Modifications that incorporate unusual amino acids are included. Such modifications are, for example, Cylation, carboxylation, phosphorylation, glycosylation, ubiquitination, labeling, etc. For example, it includes labeling with a radionuclide and various enzymatic modifications, which are easily understood by those skilled in the art. Be understood. Various methods of labeling polypeptides, and used for such purposes. Various substituents or labels that are possible are well known in the art, and³²Like P Radioisotopes, ligands that bind labeled anti-ligands (eg, antibodies) Specific binding to fluorescers, fluorophores, chemiluminescent agents, enzymes, and labeled ligands Includes anti-ligands that can act as pair members. Choosing a sign is a necessary feeling Degree, ease of binding to the primer, required stability, and available equipment To do. Methods for labeling polypeptides are well known in the art. For example,Molecular Clonin: A Laboratory Manual , 2nd edition, volumes 1-3, edited by Sambrook et al., Cold Spring Ha rbor Laboratory Press (1989) orCurrent Protocols in Molecular Biolog y , F. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience: Ne See w York (1987 and revised). In addition to the substantially full-length polypeptide, the present invention has the ability to induce EBV neutralizing antibodies. A fragment of a potent polypeptide is provided. As used herein, The term fragment or segment has the same general meaning as when applied to a polypeptide. Usually at least about 5 to 7 consecutive amino acids, typically at least about 9 to 13 consecutive amino acids. Consecutive amino acids, and most preferably at least about 20-30 or more consecutive amino acids. Means the following amino acids. For immunological purposes, the polypeptide or polypeptide fragment of the invention is Tandem repeats can be used as an immunogen, which allows for higher antigenicity. Produce protein. The present invention also provides polypeptides, including 66kd polypeptides or fragments thereof. provide. Homologous polypeptides are 2 or more derived from 66kd proteins Between the sequences of, or between the 66kd protein sequence and related protein sequences Can be a fusion of Similarly, a heterologous fusion may be a property or activity of an induced protein. Can be constructed to exhibit the combination of Godowski et al. (1988)Science 241: 812 See -816. Fusion proteins typically can be made by recombinant nucleic acid methods, but chemically Can also be synthesized. Polypeptide synthesis techniques are described, for example, in Merrifield (1963).J. Ame r. Chem. Soc. 85 : 2149-2156.Nucleic acid The term nucleic acid as used in the present invention refers to a 66 kd polypeptide, a fragment thereof, a homologue thereof. Or refers to a nucleic acid encoding a fusion or deletion of a protein, including modifications thereof. ing. The nucleic acid of the present invention is a natural EBV nucleic acid sequence encoding such a protein. Sequences that are either row-directed or substantially similar, or It may have a sequence with substantial homology to this sequence, or a portion thereof. The nucleic acid compositions of the present invention include RNA, cDNA, genomic DNA, synthetic forms, and mixed poly. Mers, including both sense and antisense strands, and chemically or biochemically May be biologically modified or may contain non-natural or derived nucleotide bases However, this can be easily understood by those skilled in the art. Includes non-naturally occurring sequences Recombinant nucleic acids are also provided by the present invention. Wild-type sequences could also be used, , The wild-type sequence can often be altered by, for example, deletions, substitutions or insertions . Nucleic acid sequences used in the present invention usually have at least about 5 codons (15 nucleosides). Tide), more usually at least about 7-15 codons, and more preferably May include at least about 35 codons. One or more introns Can exist. This number of nucleotides is usually a hive specific to such sequences. It is the minimum length of probe required for successful lysis. Techniques for manipulating nucleic acids are generally described, for example, in Sambrook et al., (Supra), or Ausubel. Et al. (Id.). Adapting such techniques, such as restriction enzymes Reagents to help do so are widely known in the art, and New England BioL abs, Boehringer Mannheim, Amersham, Promega Biotec, U.S.A. S. Biochemicals, Available from resellers such as New England Nuclear and many other sources is there. The recombinant nucleic acid sequence used to produce the fusion protein of the invention is It may be derived from natural or synthetic sequences. Many natural gene sequences are Probe to obtain a variety of cDNA or genomic libraries. GenBank, N See ational Institutes of Health. “Substantial homology” or “similarity” A nucleic acid or fragment thereof may have a sequence ( Other nucleic acids (or their complementary strands) with appropriate nucleotide insertions or deletions Optimally aligned with at least about 60% nucleotide bases, usually at least about 70%, more usually at least about 80%, preferably at least about 90%, and More preferably about 95% to 98% nucleotide sequence identity in the nucleotide bases. "Substantially homologous" (or "substantially similar") when sexually relevant. Alternatively, the nucleic acid or fragment (or its complementary strand) encodes a 66kd polypeptide. Nucleic acid or fragment hybridizes under conditions that selectively hybridize Where soybeans are available, they are substantially homologous (or similar). In hybridizing Select Selectivity is what appears when hybridization occurs and has no selectivity at all. It is the case where it is substantially more selective than the case. Typically, selective high Bridging has at least about 55 nucleotides over a length of at least about 14 nucleotides. % Homology, preferably at least about 65%, more preferably at least about 75%, And most preferably at least about 90% homology. Kenehisa ( 1984)Nuc. Acids Res.12: 203-213. As described above, long comparing homology The length is even longer, and in certain embodiments, is often at least about 17 Nucleotides, usually at least about 20 nucleotides, more usually at least about 24 nucleotides, typically at least about 28 nucleotides, and more typically At least about 32 nucleotides, and preferably at least about 36 or more Can exceed the length of the nucleotide. Hybridization of nucleic acids can be performed, for example, by salt concentration (eg, NaCl), temperature, or Organic solvent, base composition, complementary strand length, and hybridizing nucleic acid Can be affected by conditions such as the number of nucleotide base mismatches between, These can be easily understood by those skilled in the art. Stringent temperature conditions are generally above 30 ° C Can include temperatures higher, typically greater than 37 ° C, and preferably greater than 45 ° C. It Stringent salt concentrations are usually below 1000 mM, typically below 500 mM, and And preferably lower than 200 mM. However, the combination of parameters is It is even more important than the parameter measurement. For example, Wetmur and Davidson (1968)J. Mol. Biol. 31: Visit 349-370 "Isolated" or "substantially pure" or "purified""Isolated" again “Substantially pure” or “purified” nucleic acid refers to, for example, RNA, DNA or mixed A nucleic acid such as a polymer. It is another DN naturally associated with the native human sequence. A sequences (eg, ribosomes, polymerases, and many other human genomic sequences ) Is substantially separated from. The term is a nucleic acid removed from its naturally occurring environment Recombinant or cloned DNA isolates containing sequences and chemical Analogs that have been synthesized in or biologically synthesized in a heterogeneous system. Including. Manipulated by the natural state of the "encoding" nucleic acid or by methods well known to those of skill in the art, It is transcribed and / or translated to produce the polypeptide or fragment thereof The nucleic acid, when obtained, is said to encode a polypeptide. Such nucleic acid anti The sense strand is also said to encode the sequence. "Operable bond" When a nucleic acid sequence is placed in a functional relationship with another nucleic acid sequence , The nucleic acid sequence is operably linked. For example, coded by the promoter Promoter affects the transcription or expression of the sequence Operably coupled. Generally, operable linkage is defined by the joined DNA sequences. If you need to connect two protein coding regions, Means being in a frame To do. "Recombinant" The term "recombinant" nucleic acid is a non-naturally occurring nucleic acid, or other 2 It is a nucleic acid made by artificially joining two separate sequence segments. this Artificial ligation is a method of chemical synthesis or artificial attachment to an isolated segment of nucleic acid. Often accomplished by any of the manipulations (eg, genetic engineering techniques). This Is a duplication of codons that encode the same or similar amino acids. Substitution, while typically by introducing or removing a sequence recognition site. Will be Alternatively, the nucleic acid segments having the desired function may be linked together to form the desired A combination of poor functions can occur.Preparation of recombinantly or chemically synthesized nucleic acids; vectors, transformations, host cells Application Large quantities of the nucleic acid of the invention can be produced by replication in a suitable host cell. The desired fragment A natural or synthetic DNA fragment encoding Escherichia coli is introduced and replicated in prokaryotic or eukaryotic cells. Can be incorporated into possible recombinant nucleic acid constructs, typically into DNA constructs It Generally, DNA constructs are capable of autonomous replication in unicellular hosts such as yeast or bacteria. Into the genome of insects, mammals, plants or other eukaryotic cell lines. The introduction and incorporation of is also contemplated. Of the nucleic acid produced by the method of the present invention Purification was performed, for example, by Sambrook et al. (1989) or Ausubel et al. (1987 and revised). Has been described. Nucleic acids of the invention may also be chemically synthesized, eg, Beaucage and Carruthers (19 81)Tetra. Letts. 22: Described in 1859-1862 Phosphoramidite Method or Matteucci et al. (1981)J. Am. Chem. Soc．103: Commercially available automated oligonucleosides that can be produced by the triester method according to 3185 It can be done on a Cido synthesizer. The double-stranded fragment synthesizes the complementary strand and Either anneal with the strands, or allow the DNA polymerase to Single strand of chemical synthesis either by adding complementary strands with the mer sequence It can be obtained from chain products. DNA constructs prepared for introduction into prokaryotic or eukaryotic hosts typically It has a replication system recognized by the host and encodes the desired polypeptide. The DNA fragment of interest is included. And preferably a polypeptide encoding polypeptide Included are transcriptional and translational initiation regulatory sequences operably linked to the fragment. Manifestation Vectors include, for example, origins of replication or automated replication sequences (ARS) and expression control sequences. Columns, promoters, enhancers, and required processing information sites, eg For example, ribosome binding site, RNA splice site, polyadenylation site, transcription target It may include a minator sequence, and an mRNA stabilizing sequence. Depending on the host selected The secretory signal of the secreted polypeptide may also be included in the appropriate place, thus Allows proteins to cross and / or push into the cell membrane, and Thus it may achieve its functional topology or be secreted from the cell. This Such vectors may be prepared by standard recombinant techniques well known in the art. , And, for example, in Sambrook et al. (1989) or Ausubel et al. (1987). It Selection of the appropriate promoter and other necessary vector sequences may be When selected to be functional, and when appropriate, the EBV gene It may include related sequences. Of functional combinations of cell lines and expression vectors Examples are described in Sambrook et al., 1989, or Ausubel et al., 1987, see Met. zger et al., 1988,Nature 334See also: 31-36. Many useful vectors are Known in the art, and such vectors are known in Stratagene, New England Bi Available from olabs, Promega Biotech, and others. trp, lac and fa Gene promoters, tRNA promoters and glycolytic enzyme promoters. A lomomotor can be used for the prokaryotic host. A useful yeast promoter is the meta Rothionein, 3-phosphoglycerate kinase or enolase or glycerine Other glycolytic enzymes, such as lualdehyde-3-phosphate dehydrogenase, or It contains promoter regions such as enzymes for utilization of tose and galactose. Suitable vectors and promoters for use in yeast expression are described in Hitzeman et al., EP. 73,657A. As a suitable non-natural mammalian promoter Is an early and late promoter from SV40 (Fiers et al., (1978)Nature 273 : 113) or murine Moloney leukemia virus, mouse mammary tumor virus, avian meat Tumor virus, adenovirus II, bovine papilloma virus or polyomau Including a promoter derived from Ils obtain. In addition, the construct can be linked to an amplifiable gene (eg DHFR), As a result, many copies of the gene can be made. Appropriate enhancer and other For expression control sequences,Enhancers and Eukarvotic Gene Expression, Cold S pring Harbor Press, N.Y. (1983). Although such expression vectors are capable of autonomous replication, they are well known in the art. Is less preferred to be inserted and replicated in the host cell genome by Yes. Expression and cloning vectors transformed with a selectable marker, ie vector Gene encoding a protein essential for the survival or growth of the isolated host cell Can be included. The presence of this gene only affects those host cells that express the insert. Make sure the length. Typical selection genes are (a) antibiotics or other toxic substances (eg Confers resistance to ampicillin, neomycin, methotrexate, etc.) (B) supplementing auxotrophy, or (c) essential nutrients not available from complex medium Encodes a protein that supplies For example, Bacilli's D-alanine racemase It is the gene that encodes. The selection of the appropriate selectable marker depends on the host cell and is Suitable markers for different hosts are well known in the art. The vector containing the nucleic acid of interest can be transcribed in vitro and the resulting RNA Are well known methods (eg injection. T. Kubo et al.FEBS Lett．241: Visit 119 (1988) Can be introduced into the host. Vectors can be directly constructed by methods well known in the art. Lodging It can be introduced into the host cell, but the method varies depending on the type of cell host and Troporation method; calcium chloride, rubidium chloride, calcium phosphate, DE Transfection with AE dextran or other substances; Micropro Bombard using Jector; Lipofection; Infection (where vector is Infectious agents such as the Torovirus genome), and others. See generally Sambrook et al. (1989), and Ausubel et al. (1987). Nuclear The cells into which the acid has been introduced also include cells of the progeny of such cells. means. Nucleic acids and polypeptides of the present invention may be included in vectors or other expression means. Nucleic acid or a portion thereof in a compatible prokaryotic or eukaryotic host cell in large amounts It can be prepared by expressing. The most commonly used prokaryotic hosts areEscherichia coli Is a stock ofBacillus subtilisOrPseudomonaslike Other prokaryotes may also be used. Mammalian or other eukaryotic host cells such as yeast, filamentous fungi, plants, insects, Cells such as amphibians, or birds are also useful for producing the proteins of the invention obtain. Propagation of mammalian cells in culture is known per se.Tissue Culture See Kruse and Patterson, Academic Press (1973). Generally for Examples of existing mammalian host cell lines include VERO and HeLa cells, Chinese Muster ovary (CHO) cells, and WI38, BHK and COS cell lines, but other Cell lines Suitable for providing, for example, high expression, desired glycosylation pattern, or other properties. It can be appreciated by those skilled in the art that it can be off. Clones are selected with a marker depending on the vector construction mode. This The markers are on the same or different DNA molecules, but are preferably on the same DNA molecule. It is in. Transformed cells can be screened, or preferably by one of ordinary skill in the art. Any known means, eg antibiotics such as ampicillin, tetracycline Being resistant to quality can be selected.vaccine The present invention provides a vaccine preparation containing an immunogenic amount of the polypeptide of the present invention. provide. Each of these vaccines contains more than one protein of the invention. , May include proteins of the invention in combination with other proteins or immunogens It "Immunogenic dose" is the antibody to a polypeptide in a vaccine-administered individual. Means an amount that can lead to the production of The immunogen carrier is used to enhance the immunogenicity of the polypeptide of the present invention. Can be done. Such carriers include soluble molecules such as proteins and proteins. Resaccharides, or particles, such as liposomes, and bacterial cells and membranes Is. The protein carrier is linked to the 66 kd protein of the present invention and recombined. Fusion means by means of It can form a protein. Useful carriers and polypeptic such carriers Means for binding antigens are well known in the art. The vaccine of the present invention may be formulated by any means known to those of skill in the art. . Such vaccines are typically injectable, liquid solutions or suspensions. Suitable to be dissolved in a liquid or to be a suspension before injection Solids can also be prepared. The preparation may be emulsified or the protein Can be encapsulated in liposomes. The active immunogenic ingredient is a pharmaceutically acceptable excipient that is compatible with the active ingredient. Or it can often be mixed with a carrier. Suitable excipients include, for example, water, Saline, dextrose, glycerol, ethanol, etc., and their There are combinations. The concentration of immunogenic polypeptide in an injectable formulation is usually 0. It is in the range of 2 mg / ml to 5 mg / ml. In addition, if desired, the vaccine may contain wetting agents, emulsifying agents, pH buffering agents, and / or May contain minor amounts of auxiliary substances such as adjuvants which enhance the effectiveness of the vaccine. Effect Examples of adjuvants which may be fruitful are aluminum hydroxide, N-acetyl-muramii. Le-L-threonyl-D-isoglutamine (thr-MDP), N-acetyl-nor-muramyl-L -Alanyl-D-isoglutamine (CGP 11637, called nor-MDP), N-acetylmurami Le-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2- (1'-2'-dipalmitoyl-sn- Glycero-3-hydroxyphosphoryloxy) -ethylamine (CGP 19835A, MTP-PE) and 2% squalene / Tween 80 emulsion from bacteria. Three components released: monophosphoryl lipid A, trehalose dimicol Acid and RIBI containing cell wall skeleton (MPL + TDM + CWS). Ajuban The efficacy of the immunotherapy is dependent on the administration of immunogens in vaccines containing various adjuvants. It can be determined by measuring the amount of antibody against the immunogen obtained. Vaccines are generally given parenterally by intravenous, subcutaneous, or intramuscular injection. Can be given. Other dosage forms or methods of administration may also be used, including suppositories, and in some cases Includes oral formulations and liposomes, or others, and are well known in the art. It For suppositories, examples of common binders and carriers include For example, it includes polyalkali glycol or triglyceride. Such suppositories , A mixture containing 0.5% by weight of the analogue, preferably in the range of 1% to 2%. Can be Oral formulations typically include pharmaceutical grades of mannitol, lactose. , Starch, magnesium stearate, sodium saccharin, cellulose, and And excipients such as magnesium carbonate. These compositions are solutions, suspensions, tablets In the form of a drug, pill, capsule, sustained release formulation, or powder, It contains 10% to 95%, preferably 25% to 70% of a lipid peptide. The polypeptides of the invention may be formulated into the vaccine as neutral or salt forms. . Pharmaceutically acceptable salts include acid addition salts (formed with the free amino group of the peptide. ), Which is Inorganic acids such as hydrochloric acid, or phosphoric acid, or for example acetic acid, oxalic acid, tartar It is formed by an acid or an organic acid such as maleic acid. Free carboxy The salts formed with the group also include, for example, sodium hydroxide, potassium hydroxide, An inorganic base such as ammonium, calcium hydroxide, or ferric hydroxide, and And for example isopropylamine, trimethylamine, 2-ethylamino-ethanol , Derived from organic bases such as histidine, and procaine. The vaccine is administered in a form compatible with the dosage form, and such amount is prophylactic. On and / or therapeutically effective. Dosage is generally 5-250 per dose The range of μg of protein is that of what is being treated, the antibody content of the individual's immune system. It depends on the performance and the degree of protection desired. Exact amount of active ingredient required for administration Depends on the judgment of the physician and may be unique to each individual, but such decisions are It is the job of such a doctor. The vaccine may be given in a single dose or a multiple dose regimen. More than once The regimen is that the first course of vaccination is 1-10 separate doses, then Subsequent time intervals required to maintain and reinforce the epidemiological response, eg 1 to 4 months for the second dose, and if necessary, the next dose after a few months Different doses are administered as described above. The invention will be better understood by reference to the following examples, which These are the best at the moment to carry out the invention. It is only intended to show good aspects. However, the present invention is not limited to these. Not. Example Example 1: Identification of epitope for EBV neutralizing antibody To identify the epitope for the EBV neutralizing antibody, the following recombinant plasmid was It was constructed. 4.3 containing the entire EBV gp350 / 220 coding domain of plasmid pMA102Xho II-BGLII DNA fragment was baculovirus expression vector pBlueBacHisC (I nvitrogen) to obtain the plasmid pBac-TTI350. This hula Is a protein present on the outer surface of EBV-infected cells that contains all of the proteins gp350 / 220. Including the area. Serine, threonine-encodes a rich sequenceNcoI Fragment Was removed from pBac-TTI350 to generate plasmid pBac-TTI300.NcoI hula Of the plasmid pBlueBacHisCNcoRe-cloned into the I site, pBac-T Produced TI250. E. coli strain Top 10 (Invitrogen) was used for these operations. It was If it encodes the 9 amino acids Glu-Asp-Pro-Gly-Phe-Phe-Asn-Val-Glu Adult DNA was also introduced upstream of the sequence encoding the 66kd protein. This page Was shown to be involved in mediating EBV adhesion to the human B cell receptor CR2. ing. Construction of such proteins not only produces neutralizing antibodies, but also B cells Inhibits the binding and entry of virus into. Using a baculovirus transfer vector, homologous recombination And replace the viral polyhedrin gene with the gene of interest. Within the wild-type genome The sequence sandwiching the polyhedrin gene is from the 5'of the expression cassette on the transfer vector. It is located in the 3'direction. Between these sequences following co-transfection Upon homologous recombination, viral polyhedrin enhancer / promoter element A recombinant virus in which the target gene is expressed under the control of Used here The vector pBlueBacHisC also expresses galactosidase and produces a blue reporter. And blue recombinant plaques can be visually identified. Invitrogen manu Recombinant virus was prepared and purified by the method described in Al. Ovarian cells of Spodoptera frugiperda (Sf9 cells, Invitrogen, gp350 / 220 sequence) ) -Derived insect cells by Western blot analysis by the following method. confirmed. Insect cells were transformed with recombinant plasmids pBac-TTI350, pBac-TTI300, and pB Each was infected with a virus containing ac-TTI250. After 3 days, 1 ml of cells from each culture A sample was removed. As a positive control with a molecular weight of 350 kd and 220 kd A 1 ml sample of Raji cells infected with EBV was also used in the following test. Pellet cells And dissolved in 100 μl Laemmli buffer. After boiling for 2 minutes, sample 10 % SDS-polyacrylamide gel was loaded and electrophoresed at 70 volts overnight. Tampa The proteins were electrophoretically transferred to nitrocellulose membranes. Non-specific binding of proteins TBST (10mM Tris) pH8.0 / 1mM E containing 5% nonfat dry milk for blocking Membranes were treated with DTA / 0.05% Tween-20). High titer EBV immune human serum and gp350 / EBV-neutralizing monoclonal antibody against 220 (DuPont, Boston, MA) respectively And incubate for 1 hour, wash with TBST for 5 minutes, 3 times, Then incubated for 30 minutes with anti-human IgG alkaline phosphatase complex . After washing 3 times with TBST, color was developed. Cells infected with the recombinant virus pBac-TTI350 were in EBV-immunized human serum and EBV. Two vanes with molecular weights of 350kd and 220kd bound to both Japanese monoclonal antibodies Indicated. The recombinant protein band is the protein of Raji cells infected with EBV. Appeared in the same position as the quality band. Serine and threonine in gp350 / 220-rich distribution No reaction was observed with cells infected with the recombinant virus pBac-TTI300 with row depletion. It was. Since TTI300 plasmid did not react, serine-, threonine-rich The sequence appears to be an epitope of a neutralizing antibody. This result is from pBac-TTI300 Recombinant virus pBac-TTI25 containing deleted serine- and threonine-rich sequences Furthermore, the immunoreactivity of 0-infected cells with human serum and monoclonal antibodies Was confirmed. The size of the reactive protein of pBac-TTI250 was 66 kd.Example 2: Purification of recombinant protein The pBlueBacHisC vector is an N-type protein expressed downstream of the transcription initiation codon. The terminal region contains a DNA sequence that produces a 6-histidine peptide. This peptide is Pro Bond resin (Invitroge n) has an affinity, thus allowing a one-step purification. Two protein sleeves For each, approximately 500 ml of Sf9 insect cells were densified in a 500 ml spinner flask. 2 x 10⁶Cultured at cells / ml. Cells were treated with high titer virus stock pBac-TTI250 Infectious virus (66kd protein) or pBac-TTI350 infectious virus (350 / 220kd Infection). The cells were then cultured for 3 days. Distant cells Pellet by heart separation and suspend in 20 mM sodium phosphate and 500 mM NaCl. It became turbid, disrupted by ultrasound and centrifuged to remove cell debris. Invitr the supernatant The recombinant protein was purified by passing through ProBond resin as described by ogen. It was First, attach the 6-histidine end of the recombinant protein to the ProBond resin . Next, enterokinase is applied to the column to cut out the recombinant protein. This One protein band on SDS-polyacrylamide gel Provided (66kd or 350 / 220kd protein). The 350kd and 220kd bands are , Recombinant protein and Raji cell-derived protein were in the same position. Each About 500 mg of purified protein was obtained from 500 ml of culture. 66kd recombinant protein derived from gp350 / 220 is used in EBV immune human serum and EBV virus This protein is immunoreactive with both monoclonal antibodies that neutralize Quality can be used to produce a vaccine against EBV. In addition, the 66kd protein also , Which also has a 9-amino acid sequence for EBV adhesion to B cells, Vaccines produced in the parasite also target B cells Inhibits virus binding and entry. Expression in baculovirus offers several advantages. E.coli is glycosi Synthesizes unglycated protein, and yeast has different glycosylation The protein produced by baculovirus is Glycosylation and glycosylation patterns caused by expression in mammalian cells It has the same style as. A further advantage is the purification obtained from baculovirus. It means that the amount of protein produced is much higher than that obtained from mammals. It Moreover, expression of recombinant gp350 / 220 in mammalian cells is generally highly disturbing. It is fixed. Therefore, the 66kd or 350 / 220kd protein produced in insect cells Gap provides a more stable and efficient way to make purified vaccine proteins . Smaller proteins go better than large proteins for vaccine production It offers some advantages. Smaller proteins are more moles per weight It allows injection of an injection volume of an epitope or vaccine. Small protein Can be more recombinantly and immunologically processed. Small protein Are less susceptible to protease attack, because they are protease specific This is because it is difficult to have a certain combination of amino acids. Small protein epi There are few topes, and a more focused reaction is elicited. Each of the documents and patents cited above is incorporated by reference. The present invention will be described in connection with particular embodiments, but will be apparent to those skilled in the art. Modifications of the are also within the scope of the invention as defined by the appended claims. Therefore The scope of the invention is not determined by reference to the above description, but rather the appended claims. , And all equivalents of such claims.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＺＮＡＣ 9452−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＣ１２Ｒ 1:92） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification number Internal reference number FI C12N 5/10 C12P 21/02 ZNA C 9452-4B // (C12N 15/09 C12R 1:92) (C12P 21 / 02 C12R 1:91) (C12N 15/00 A C12R 1:92)

Claims

[Claims] 1. A substantially pure polypeptide, essentially 66 kd of EBV gp350 / 220 Of the serine- and threonine-rich portion of A polypeptide capable of inducing an EBV neutralizing antibody in a mammal. 2. The polypeptide of claim 1 which is glycosylated. 3. A vaccine composition, which is mixed with a pharmaceutically acceptable carrier. A composition comprising an immunogenic amount of the polypeptide of claim 2. 4. A method of protecting a mammal from EBV infection, wherein the mammal is immunologically protected. Administering a vaccine composition in an effective dose to An immunogenic amount of the polypeptide of claim 2 mixed with a pharmaceutically acceptable carrier A method comprising: 5. A nucleic acid sequence encoding the polypeptide of claim 1. 6. An expression vector, which is a nucleic acid sequence encoding the polypeptide of claim 1. And an expression control sequence, the expression control sequence being operably linked to the nucleic acid, An expression vector that effectively expresses the nucleic acid in cells. 7. A cell containing the expression vector of claim 6. 8. A method for producing a polypeptide, which enables production of the polypeptide A method comprising culturing the cells of claim 7 under conditions that 9. A vaccine composition, wherein the vaccine composition is pharmaceutically acceptable A composition comprising an immunogenic amount of the polypeptide of claim 1 admixed with L. 10. A method of protecting a mammal from EBV infection, the method comprising: Comprising administering a therapeutically effective dose of the vaccine composition, the vaccine composition comprising: Is an immunogen of the polypeptide of claim 1 admixed with a pharmaceutically acceptable carrier. A method of containing an amount. 11. Induces EBV neutralizing antibodies in mammals and binds EBV to B cells and And a substantially pure polypeptide that blocks invasion, wherein the polypeptide is essentially Wise; the 66 kd serine- and threonine-rich portion of EBV gp350 / 220 or The fragment; and the sequence Glu-Asp-Pro-Gl adjacent to the amino terminus of the 66kd part. A polypeptide consisting of y-Phe-Phe-Asn-Val-Glu. 12. A method of protecting a mammal from EBV infection, the method comprising: Comprising administering a therapeutically effective dose of the vaccine composition, the vaccine composition comprising: The immunization of the polypeptide of claim 11 mixed with a pharmaceutically acceptable carrier. A method of containing the original amount. 13. The glycosylated polypeptide of claim 11. 14. A method of protecting a mammal from EBV infection, the method comprising: Comprising administering a therapeutically effective dose of the vaccine composition, the vaccine composition comprising: The immunization of the polypeptide of claim 13 mixed with a pharmaceutically acceptable carrier. original A method of containing an amount. 15. A vaccine composition, mixed with a pharmaceutically acceptable carrier A composition comprising an immunogenic amount of the polypeptide of claim 13. 16. A nucleic acid sequence encoding the polypeptide of claim 11. 17． An expression vector, which is a nucleic acid encoding the polypeptide of claim 11. A sequence, and an expression control sequence, the expression control sequence being operably linked to the nucleic acid. And an expression vector that effectively expresses the nucleic acid in a cell. 18. A cell containing the expression vector of claim 17. 19. A method for producing a polypeptide, capable of producing the polypeptide 19. A method comprising culturing the cells of claim 18 under the conditions described below. 20. A vaccine composition, mixed with a pharmaceutically acceptable carrier A composition comprising an immunogenic amount of the polypeptide of claim 11. 21. A method of producing a substantially pure EBV gp350 / 220 protein comprising: The method is; Complete EBV gp350 / 220 gene into baculovirus expression vector pBlueBacHisC Subcloned and included EBV gp350 / 220 gene and 6-histidine peptide Forming a plasmid containing pBac-TTI350, The plasmid pBac-TTI350 was used to target the gene in the virus to at least the EBV gp350 / 220 protein and 6-histidine pep Substituting with DNA encoding tide, Transfecting a virus containing the EBV gp350 / 220 gene into insect cells Process, Collecting the transfected insect cells, Isolation of EBV gp350 / 220 Protein from Transfected Insect Cells 、、 Resin having affinity for EBV gp350 / 220 protein to 6-histidine peptide Column purification step, and Separating the EBV gp350 / 220 protein from the 6-histidine peptide. Method to include. 22. A protein produced by the method of claim 21. 23. The EBV gp350 / 220 gene encodes a signal protein 22. The method of claim 21, lacking the amino terminal sequence. 24. A protein produced by the method of claim 23. 25. A method of producing a substantially pure EBV gp350 / 220 protein comprising: The method encodes EBV gp350 / 220 and 6-histidine polypeptides. Using a baculovirus containing a gene, the following steps: Transfecting the baculovirus into insect cells, Collecting the transfected insect cells, Transfection with EBV gp350 / 220 protein and 6-histidine polypeptide Separating from the isolated insect cells, EBV gp350 / 220 protein and 6-histidine polypeptide Purification with a column of resin having affinity for the peptide. 26. An EBV gp350 / 220 protein produced by the method of claim 25. 27. A method of protecting a mammal from EBV infection, the method comprising: Comprising administering a therapeutically effective dose of the vaccine composition, the vaccine composition comprising: 27. The po of claim 22, 24 or 26 is mixed with a pharmaceutically acceptable carrier. A method comprising an immunogenic amount of a polypeptide.