JPH08506728A

JPH08506728A - 新規なレセプター型ホスホチロシンホスファターゼ‐ガンマ

Info

Publication number: JPH08506728A
Application number: JP6518365A
Authority: JP
Inventors: シュレシンガー，ジョセフ
Original assignee: ニューヨークユニバーシティー
Priority date: 1993-02-10
Filing date: 1994-02-09
Publication date: 1996-07-23
Also published as: US5532123A; EP0684990A1; EP0684990A4; US5891700A; CA2155725A1; AU6238994A; WO1994018309A1

Abstract

(57)【要約】新規なレセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−γ（ＲＰＴＰγ）タンパク質または糖タンパク質、およびこれをコードするＤＮＡは多種類の哺乳動物組織で発現する。ＲＰＴＰγタンパク質または糖タンパク質は組換え法で産生できる。該タンパク質に対する抗体、該タンパク質の定量法、ならびに該タンパク質と結合してその酵素活性を阻害または剌激することのできる医薬などの化合物のスクリーニング法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】新規なレセプター型ホスホチロシンホスファターゼ−ガンマ本発明は１９９０年７月１１日出願で現在放棄されている米国特許出願第０７／５５１，２７０号の一部継続出願である１９９１年２月２６日出願の米国特許出願第０７／６５４，１８８号の一部継続出願である。上記２つの特許出願の全内容を参照としてここに包含する。１．序生化学、細胞および分子生物学の分野における本発明は、ＲＰＴＰγと呼ばれる（ＲＰＴＰアーゼ−γとも呼ばれる）新規なレセプター型タンパク質チロシンホスファターゼタンパク質または糖タンパク質、これをコードするＤＮＡ、該タンパク質の生産および同定法、ならびにＰＴＰアーゼ酵素活性と結合してこれを阻害または剌激することのできる化合物のスクリーニング法に関する。２．発明の背景チロシン特異的タンパク質キナーゼとしていくつかの成長因子レセプターおよびレトロウイルス癌遺伝子が同定されたことにより、チロシン残基上のタンパク質リン酸化が細胞の増殖制御に重要な役割を果たすことが示唆された。この考えは最近になって、シグナル変換に重要な役割を果たすと考えられる酵素（ホスホリパーゼＣなど）のチロシンリン酸化レベルが成長因子剌激の活性増強と相関するという観察によって支持され、チロシンリン酸化の機能的役割が確立した（Ullrich，A．ら、Cell61:203-212，1990）。細胞タンパク質におけるチロシン残基のリン酸化の程度とパターンは、タンパク質−チロシンキナーゼ（ＰＴＫアーゼ；ＡＴＰ：タンパク質−チロシンＯ−ホスホトランスフェラーゼ、ＥＣ２．７．１．１１２）およびタンパク質−チロシン−ホスファターゼ（ＰＴＰアーゼ；タンパク質−チロシン−ホスフェートホスホヒドロラーゼ、ＥＣ３．１．３．４８）の反対の活性によって制御されている。ＰＴＫアーゼの構造特性および進化ならびに細胞増殖におけるその役割に関する総説がある（Hunter，T．ら、Annu．Rev．Biochem．54:897-930，1985；Ullri ch，A．ら、前出）。２．１．ＰＴＫアーゼチロシンキナーゼはセリン／スレオニン特異的タンパク質キナーゼと共通の先祖をもつが、これとは大きく異なる別個のファミリーからなる（Hanks，S.K．ら、Science 241:42-52，1988）。チロシンキナーゼの活性変化を導くメカニズムは、膜貫通トポロジーをもつレセプター型チロシンキナーゼについてよく理解されている（Ullrich，A．ら、前出）。このようなキナーゼでは、これらの酵素の細胞外ドメインへの特異的リガンドの結合がそのオリゴマー化を誘導し、チロシンキナーゼの活性を増強し、シグナル変換経路を活性化すると考えられている（Ullrich，A．ら、前出）。この活性の重要性は、突然変異や過発現によるキナーゼ活性の制御障害が癌遺伝子による転換のメカニズムであるという知見によって支持されている（Hunter，T．ら、前出；Ullrich，A．ら、1990，前出）。２．２．ＰＴＰアーゼタンパク質ホスファターゼは少なくとも２つの別個で異なるファミリーからなる（Hunter，T．Cell，58:1013-1016，1989）。すなわち、タンパク質セリン／スレオニンホスファターゼ、およびタンパク質チロシンホスファターゼである。セリン／スレオニン特異的酵素とチロシン特異的酵素との間にはっきりした配列類似性が見られるタンパク質キナーゼとこの点において対照的である。ＰＴＰアーゼ分子には２種類あると思われる。第１の群は１つの保存されたホスファターゼ触媒ドメインを含む小さい可溶性酵素からなり、（１）胎盤ＰＴＰアーゼＩＢ（Charbonneau，H．ら、Proc．Natl．Acad．Sci．86:5252-5256，198 9；Chernoff，J．ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:2735-2789，1990）、（２）Ｔ細胞ＰＴＰアーゼ（Cool，D.E．ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86:52 57-5261，1989）、および（３）ラット脳ＰＴＰアーゼ（Guan，K．ら、Proc．Na tl．Acad．Sci．USA 87:1501-1505，1990）を含む。第２の群はＲ−ＰＴＰアーゼまたはＲＰＴＰと呼ばれる、より複雑なレセプター結合ＰＴＰアーゼからなり、これらは高分子量であって５６〜５７アミノ酸で隔てられたタンデムに繰り返される２つの保存ドメインを含む。ＲＰＴＰの１例としては、白血球共通抗原（ＬＣＡ）（Ralph，S.J.，EMBO J．6:1251-1257，19 87；Charbonneau，H．ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85:7182-7186，1988）が挙げられる。ＣＤ４５、Ｔ２００およびＬｙ− ５としても知られるＬＣＡ（Thomas，M.L..，Ann．Rev．Immunol．7:339-369，1 989に総説されている）は、造血細胞（後期赤血球を除く）においてのみ発現する１群の膜糖タンパク質からなり、これらは共通の遺伝子がタンパク質のアミノ末端を巻き込む選択的スプライシングによって生じたものである。ＣＤ４５の正確な機能は未知であるが、この抗原が細胞毒性Ｔリンパ球とナチュラルキラー細胞の活性、ＩＬ−２レセプター発現、Ｂ細胞分化、ならびにＴリンパ球増殖を含む多くのプロセスに関与することが多数の研究により示された（Pingel，J.T．ら、Cell 58:1055-1065，1989）。ＲＰＴＰの他の例としては、ＬＣＡ関連タンパク質、ＬＡＲ（Streuli，M．ら、J．Exp．Med.，168:1523-1530，1988）、およびＬＡＲ関連ショウジョウバエタンパク質ＤＬＡＲおよびＤＰＴＰ（Streuli，M．ら、Proc．Natl．Acad．Sci ．USA，86:8698-8702，1989）が挙げられる。Ｊｉｒｉｋらはヒト肝芽腫細胞系ＨｅｐＧ２由来のｃＤＮＡライブラリーをＬＣＡの２つのＰＴＰアーゼドメインをコードするプローブでスクリーニングし（FASEBJ．4:A2082，1990，abstr．22 53）、Ｈｅ−ＰＴＰと呼ばれる新規ＲＰＴＰをコードするｃＤＮＡクローンを見いだした。Ｈｅ−ＰＴＰ遺伝子は各種のヒトおよびマウス細胞系と組織において発現するように思われる。我々はＰＴＰアーゼの構造と多様性について理解し始めてはいるが、その細胞機能については未だ未知のことが多い。小さい可溶性ＰＴＰアーゼ酵素は“ハウスキーピング”機能をもつことが示唆されている（Tonks，N.K．ら、Biochemist ry，27:8695-8701， 1988）。他方、ＲＰＴＰは細胞膜に位置しており細胞外リガンドによる制御を受ける可能性があるため、より限定された活性をもつことが予想される。Ｔ細胞におけるＬＣＡ（ＣＤ４５）の役割に関して、ＬＣＡの発現が不十分なＴ細胞クローンは、特定抗原またはＣＤ３の架橋によって剌激されたときに増殖できないことが見いだされた（Pingel，J.T．ら、前出）。ＰＴＰアーゼ架橋は、ヒトＴ細胞におけるＴ細胞レセプターＣＤ３に媒介される活性化を阻害する（Kiener，P. A．ら、J．Immunol．143:23-28，1989）。ＬＣＡのＰＴＰアーゼ活性はリンパ球特異的ＰＴＫアーゼであるｐｐ５６^lckの活性化に関与する（Mustelin，T.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86:6302-63 06，1989；Ostergaard，H.L．ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86:8959-8963 ，1989）。これらの著者は、ＬＣＡのホスファターゼ活性がＣ末端チロシン残基の脱リン酸化によってｐｐ５６^lckを活性化し、これが次にＴ細胞活性化に関与するとの仮説を提唱した。人工基質に対する酵素活性にＬＣＡ中の４つの保存システイン（ホスファターゼドメイン１個当たり２つ）のうちのどれが必要なのかを決定するために、部位特異的突然変異誘発を用いてＳｔｒｅｕｌｉら（1989、前出）はＬＣＡの１つのシステイン残基（ＬＣＡホスファターゼドメイン１の残基１７７）のみが活性に必須であることを見いだし、最初のホスファターゼドメインのみが酵素活性をもつ可能性が大きいと示唆した。しかしながら、第２のドメインが異なる基質を脱リン酸化できるという可能性は排除されなかった。さらに最近になって、Ｓｔｒｅｕｌｉら（EMBOJ.，9:2399-2407，1990）はＬＣＡ（およびＬＡＲ）の第２の保存ドメインは検出しうるホスファターゼ活性を欠いているが、該ドメイン内の配列が基質特異性に影響しうることを確認した。したがって、ホスホチロシン代謝をよりよく理解し、制御するためには、ＰＴＫアーゼ活性の役割のみでなく、ＰＴＰアーゼの作用も理解しなければならない。細胞性ホスホチロシンの上昇は、チロシンキナーゼ自体の活性化以外のメカニズムによって起こるのかも知れない。例えば、チロシンキナーゼではなく、ｖ− ｃｒｋ癌遺伝子の発現が、ほとんど理解されていないメカニズムによってチロシン残基のリン酸化を誘導する（Mayer，B.J．ら、Nature 332:272-275，1988）。このような結果は基質の突然変異または細胞性ホスファターゼ活性の全般的低下、特に細胞性チロシンホスフェートの通常は高い代謝回転速度の低下によるものである可能性がある（Sefton，B.M．ら、Cell 20:807-816，1980）。チロシンホスファターゼ阻害剤が細胞を“可逆的にトランスフォーム”できることが立証された（Klarlund，J.K.，Cell 41:707-717，1985）ことによって後者の可能性が示唆される。したがって、ＰＴＰアーゼは劣性発癌遺伝子として働きうる。チロシンの脱リン酸化がそれ自体重要な制御メカニズムとして機能しうることが明らかとなりつつある。Ｃ末端チロシン残基の脱リン酸化はｓｒｃファミリーのチロシンキナーゼにおけるチロシンキナーゼ活性を剌激する（Hunter，T.，Ce ll49:1-4，1987）。チロシン脱リン酸化がＭＰＦ（成熟促進因子）キナーゼの分裂活性化に必須のステップであることが示唆されてきた（Morla，A.O．ら、Cell 58:193-203，1989）。最後に、下等真核生物の遺伝分析により、細胞生理学におけるセリンホスファターゼの極めて重大な役割が確認された（Cyert，M.S．ら、Cell 57:891-893，1989）。これらの観察はＰＴＰアーゼ活性を制御するメカニズムの理解を深める必要性を指摘する。細胞増殖、分化および発癌のメカニズムを十分理解するために、これらのＰＴＰアーゼおよびＲＰＴＰ膜レセプターの間の構造と機能の相関をさらに描写する必要のあることは明瞭である。３．発明の概略本発明者は、抗発癌遺伝子の可能性としての、また膜貫通シグナリングの新しく発見されたメカニズムにおける作動体（effector）としての、細胞制御メカニズムにおけるＲＰＴＰの役割を考え、このようなプロセスに関与すると思われる個々のＲＰＴＰ遺伝子およびタンパク質を研究し、ここに膜貫通トポロジーを有する、ＲＰＴＰファミリーメンバーの１つである新規な、広範に発現されるＲＰＴＰγの同定を記述する。このＲＰＴＰファミリーメンバーの細胞外ドメインはＲＰＴＰβには関係があるが、従来報告されている他のいずれのＲＰＴＰとも無関係である。レセプターチロシンキナーゼとある程度類似する新規ＲＰＴＰγは、細胞外部分に結合する細胞外リガンドによって直接制御される。したがって本発明は、ヒトレセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ− γ（ＲＰＴＰγ）タンパク質または糖タンパク質分子、ヒトＲＰＴＰγの機能的誘導体、または他の哺乳動物種におけるヒトＲＰＴＰγの相同体を提供する。ＲＰＴＰγ分子が天然由来のものである場合には、それが生来関連するその他のタンパク質または糖タンパク質を実質的に含まない。ＲＰＴＰγは哺乳動物の脳で天然に発現し、発生学的かつ解剖学的に制御されている。ＲＰＴＰγは肺、腎臓、心臓、骨格筋、肝臓、脾臓および精巣でも発現する。本発明のＲＰＴＰγ分子は天然由来でなくともよく、化学的方法または組換え法などで製造できる。したがって、本発明の実質的に純粋なＲＰＴＰγタンパク質または糖タンパク質は天然由来のタンパク質または糖タンパク質の生化学的精製によって製造することができるし、または化学合成によっても、あるいは原核または真核生物宿主中で組換え法によって発現させることによっても製造できる。特に、本発明は図４に示すヒトＲＰＴＰγのアミノ酸配列（配列番号２）を有するＲＰＴＰγタンパク質または糖タンパク質に関する。別の態様において、その機能的誘導体が提供される。本発明はさらに，ＲＰＴＰγをコードするヌクレオチド配列から実質的になる核酸分子、好ましくはＤＮＡに関する。この核酸分子は、好ましくはヒトＲＰＴＰγまたはその機能的誘導体をコードする。上記ＤＮＡ分子は好ましくは配列番号１からなる。このＤＮＡ分子は好ましくはｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡである。本発明はさらに、発現ベクターの形における該ＤＮＡ分子、ならびに該ＤＮＡ分子で形質転換またはトランスフェクションされた原核および真核生物宿主に関する。また、本発明はＲＰＴＰγタンパク質または糖タンパク質、あるいはその機能的誘導体の製造法を含み、該方法は、（ａ）上記タンパク質、糖タンパク質または機能的誘導体を培養条件下で発現することができる宿主を培養し；（ｂ）上記タンパク質、糖タンパク質または機能的誘導体を発現させ；そして（ｃ）培養物から上記タンパク質、糖タンパク質または機能的誘導体を回収する、ことを含む。本発明はまた、ＲＰＴＰγタンパク質または糖タンパク質に特異的なポリクローナル、モノクローナルまたはキメラの抗体に関する。本発明はまた、細胞中または被験者中の正常または突然変異ＲＰＴＰγをコードする核酸の存在を検出する方法に関し、該方法は、（ａ）被験者由来の細胞またはその抽出物を、正常または突然変異ＲＰＴＰγの少なくとも一部をコードするオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーション条件下に接触させ；そして（ｂ）細胞中の核酸へのプローブのハイブリダイゼーションを測定し、これによって核酸、好ましくはＤＮＡの存在を検出する、ことを含む。アッセイ前にポリメラーゼチェインリアクションによってＤＮＡを選択的に増幅することができる。本発明はさらに、１または複数の細胞中のＲＰＴＰγの存在を検出し、あるいはこれを定量する方法に関し、該方法は、（ａ）細胞またはその抽出物をＲＰＴＰγのエピトープに特異的な抗体と接触させ；そして（ｂ）上記抗体の細胞またはその抽出物への結合を検出し、あるいは結合抗体を定量し、これによってＲＰＴＰγの存在を検出し、あるいはこれを定量する、ことを含む。本発明はまた、化学的または生物学的調製物からＲＰＴＰγと結合しうる化合物を同定および単離する方法に関し、該方法は、（ａ）ＲＰＴＰγまたはそのリガンド結合部分を固相マトリックスに結合させ；（ｂ）化学的または生物学的調製物を固相マトリックスと接触させて化合物を結合させ、次いで未結合物質を洗い流し；（ｃ）固相マトリックスに結合した化合物の存在を検出し；そして単離を目的として（ｄ）結合化合物を溶出して化合物を単離する、ことを含む。最後に、本発明はＲＰＴＰγのホスファターゼ酵素活性を剌激または阻害することのできる薬剤を同定する方法を含み、該方法は、（ａ）純粋形態、膜調製物形態、または全生細胞または固定細胞の形態のＲＰＴＰγと薬剤とを接触させ；（ｂ）工程（ａ）の混合物を十分な時間インキュベートし；（ｃ）ＲＰＴＰγの酵素活性を測定し；（ｄ）該酵素活性を上記薬剤なしでインキュベートしたＲＰＴＰγの酵素活性と比較し、これによって上記薬剤が酵素活性を剌激または阻害するかどうかを決定する、ことを含む。４．図面の説明図１は、ポリ−Ａ⁺ＲＮＡのノーザンブロット分析による異なるマウス組織におけるＲＰＴＰγの発現を示す。図１Ａでは、第１の触媒性ドメイン、膜近傍ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインの最初の部分を包含するＲＰＴＰγプローブを用いてブロットを釣り上げた。図１Ｂは、β−アクチンプローブを用いて釣り上げた同一のブロットを示す。図２は、新生児および成体ラット脳中におけるＲＰＴＰγのin situハイブリダイゼーション分析の結果を示す。図２Ａは新生児ラット脳の縦断面であり、海馬体（Ｈ）、皮質（Ｃ）、中隔核（Ｓ）および正中線視床核（Ｔ）において最高レベルの発現を示している。図２Ｂは、成体ラット脳の矢状切開図であり、海馬体（Ｈ）において最高レベルの発現を示している。図３は、ヒトＲＰＴＰγのヌクレオチド配列（配列番号１）および推定されるアミノ酸配列（配列番号２）を示す。図４は、ヒトおよびマウスのＲＰＴＰγのアミノ酸配列を示す。マウス配列で異なっているアミノ酸を表示してある。ダッシュ（−）は一方の配列に無いアミノ酸を示す。Ｎ末端疎水性シグナルペプチド（von Heijne，G．Nuc．Acids Res ．14:4683-4690，1986）および膜貫通ドメインを下線で示す。Ｎ−グリコシル化の可能性のある部位を矢印で示す。推定上のタンパク質分解開裂部位を白抜き三角で示す。ＣＡＨに似たドメインおよびホスファターゼドメインＤＩおよびＤＩＩは箱で囲んで示す。図５は、ＲＰＴＰγにおけるフィブロネクチン（ＦＮ）III型繰り返し配列を示す。ヒトＲＰＴＰγのＦＮIII型繰り返し配列を、ヒトチロシンホスファターゼＬＡＲ（ＨＬＡＲ；Streuliら、J．Exp．Med．168:1523-1530，1988）およびＨＰＴＰδ（Kreugerら、EMBO J．9:3241-3252，1990）の典型的フィブロネクチンIII 型繰り返し配列、ヒトＦＮのドメインIII-7（Ｆｂｎ II-7；Kornblihttら、EMBO J．4:1755-1759，1985）およびチキンコンタクチン（contactin）のＦＮドメイン（”contac”:Ranschtら、J．Cell Biol．107:1561-1573，1988）と並べて示す。４個またはそれ以上の繰り返し配列によって共有されるアミノ酸残基は太字で印字し、一番下の列に共通配列として示す。図６は、ＲＰＴＰγにおけるＣＡＨに似たドメインの配列を異なる形のＣＡＨと共に示すものである。図６Ａは、ヒトおよびマウスＲＰＴＰγのＣＡＨに似たドメインの配列をＣＡＨファミリーの代表的配列、すなわちヒトＣＡＨ１，２，３（配列はSwissprot受託番号P00915，P00918およびP07451によりそれぞれ見いだされる）、ヒツジＣＡＨ−６およびワクシニアウイルスのＣＡＨに似たドメイン（それぞれSwissprot受託番号P0860およびP04195）およびマウスＣＡＨ関連タンパク質（Genebank受託番号X6197）と並べて示す。８個の配列のうち少なくとも５個において保存されている残基を箱で囲んで示す。ヒトＲＰＴＰγの最初および最後のアミノ酸の位置番号を各列について示す。ＣＡＨにおいてＺｎ結合に関与する３個のＨｉｓ残基を矢印で示す。図６Ｂは、ヒトおよびマウスＲＰＴＰ γのＣＡＨに似たドメインと上記６個のＣＡＨ配列の間の同一性パーセントを示すマトリックスである。これは図６Ａに示す配列から引き出したものである。図７は、ＣＡＨの亜鉛結合部位とＲＰＴＰγモデルの推定上の金属結合部位との比較を示す。上段は、ヒトカルボニックアンヒドラーゼにおける亜鉛結合部位の立体図で、この酵素の第４亜鉛リガンドである水分子の方向から大まかに描いたものである（OH H263；Ericksson，A.E．ら、Proteins 4:274-282，1988参照）。亜鉛の四面体配位に留意されたい。亜鉛からリガンド原子への結合を細い線で示す。下段は、Ｈｉｓ９４をＧｌｕに、またＨｉｓ１１９にＧｌｎに置換し、エネルギー最小限化を適用した後のＲＰＴＰγドメインにおける推定上の金属結合部位の立体図（上段の図と同じ図）を示す。ヒトカルボニックアンヒドラーゼIIの活性部位の一部であるＧｌｕ１０６を、潜在的リガンドの１つとなるように回転させた。推定上の金属の周囲の原子の平面的配置に留意されたい。Ｇｌｕ９４とＧｌｕ１０６について二座配位が示されている。残基の番号はすべてカルボニックアンヒドラーゼIIによるものである。図８は、ＲＰＴＰγおよびＲＰＴＰβがレセプターチロシンホスファターゼの新規なサブファミリーを形成することを示す。図８Ａは、ＲＰＴＰγおよびＲＰＴＰβのカルボニックアンヒドラーゼに似たドメインおよびＦＮIII型繰り返し配列の配列を示す。並べられたＣＡＨドメインおよびＦＮIII型繰り返し配列を箱で囲んで示す。同一のアミノ酸を線で結んで示す。図８Ｂは、ＲＰＴＰγおよびＲＰＴＰβのサブファミリーを明確にする、保存された特徴を要約した概略図である。ＲＰＴＰγの細胞外領域および２つの形のＲＰＴＰβ（ＲＰＴＰβおよびｄｖＲＰＴＰβ）は、ＣＡＨに似たドメイン（ＣＡＨと表示）、ＦＮIII型繰り返し配列（ＦＮと表示）および非常に低いシステインの含有量によって特徴づけられる可変的な長さのスペーサー（太線で示す）を含有する。ＦＮIII型繰り返し配列に隣接する保存されたシステイン残基をマークしてある。ＲＰＴＰγおよびＲＰＴＰβの細胞質領域は２つの典型的なホスファターゼドメイン（Ｄ１およびＤ２と表示）を含有する。第１ホスファターゼドメインの保存Ｃｙｓ残基、および第２ホスファターゼドメインのＣｙｓ残基を置換するＡｓｐ残基が図示されている。ＲＰＴＰγの潜在的開裂部位およびＲＰＴＰβの８６アミノ酸挿入配列（これは欠失変異体であるｄｖＲＰＴＰβには存在しない）が示されている。５．発明の詳細な説明組換えＤＮＡ法を用いることにより、本発明者らは新規な哺乳動物レセプター型（膜貫通）タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰアーゼ；ＥＣ３．１．３．４８）を同定した。ヒトＲＰＴＰγは１４４５アミノ酸を有する。そのレセプターに似た構造、ならびにこれが１つのファミリーの一部であるらしいことから、本発明者らはこのタンパク質をＲＰＴＰγ（レセプタータンパク質チロシンホスフアターゼγ：ｒｅｃｅｐｔｏｒｐｒｏｔｅｉｎｔｙｒｏｓｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−γ）と命名した。このファミリーをここでは“ＲＰＴＰ類”と呼ぶ。ＲＰＴＰγは推定上の細胞外ドメイン、１つの膜貫通ドメイン、および２つのタンデムな触媒性チロシンホスファターゼドメインを有する細胞質部分をもつ。細胞外ドメインは、亜鉛含有酵素であるカルボニックアンヒドラーゼ（ＣＡＨ）と高い相同性をもつ２６６アミノ酸を含み、ＲＰＴＰγがＲＰＴＰβ（ＨＰＴＰ ζ）とともにＲＰＴＰのサブファミリーであることを示唆する。本発明者らは、さらにＣＡＨの結晶構造に基づいて、ＲＰＴＰγのＣＡＨに似たドメインのモデルを構築した。ＣＡＨの活性部位を形成する１９残基のうち１１個がＲＰＴＰγで保存されているように思われる。しかしながら、亜鉛原子と結合する、触媒的活性に必要とされる３個のＨｉｓ残基のうち保存されているのは１個のみである。したがって、ＲＰＴＰγのＣＡＨに似たドメインは、代謝ＣＯ₂の水和の触媒作用以外の機能をもつのかもしれない。ＲＰＴＰγをコードする遺伝子はヒト染色体３_p１４．２−_p２１にマップされ、これはある型の腎臓癌および肺癌においては欠失していることが判明した領域である。このことは、本発明者らを以下の結論に導いた。すなわち、ＲＰＴＰγ はそれらの癌において腫瘍抑制遺伝子として機能する可能性があるという結論である（LaForgiaら、Proc．Natl．Acad．Sci．885036-5040，1991も参照されたい）。ヒトＲＰＴＰγのｃＤＮＡクローニング、ならびにヒトＲＰＴＰγおよびそのマウス相同体の完全ＤＮＡおよびアミノ酸配列をここに記載する。各種細胞および組織におけるタンパク質の天然の発現を同定するためにノーザン分析を用いた。ＲＰＴＰγ／ＨＰＴＰγの触媒性ドメインの部分的ｃＤＮＡクローンは、以前に記述されている（本願と同一出願人による米国特許出願第０７／６５４，１８８、本願はこれに基づいて優先権主張している；Kaplanら、Proc．Natl．Acad． Sci．87:7000-7004，1990；Kruegerら、EMBO J．9:3241-3252，1990）。ＲＰＴＰγはラット脳の解剖学的に異なる複数の領域で発現しており、この発現は発生学的に制御されていることが見いだされた。驚くべきことに、酵素活性をもつ細胞内ドメインを含むことに加えて、ＲＰＴＰ類が属するレセプターファミリーは、チロシンキナーゼ酵素ファミリーと同様にＮ末端細胞外ドメインをもつ膜貫通タンパク質を含む（Tonks ，N.K．ら、Biochemistry 27:8695-8701，1988；Charbonneau，H．ら、Proc．Na tl．Acad．Sci．USA 85:7182-7186，1988；Streuli，M．ら、J．Exp．Med．168: 1523-2530，1988；Streuli，M．ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:8698-8702 ，1989）。したがって本発明者らは、細胞外環境におけるリガンドがこのＰＴＰアーゼの膜関連サブクラスの活性を制御しうると結論した。ＲＰＴＰγは、ＰＴＰアーゼ酵素活性を活性化または阻害することができ、このため細胞代謝の主要経路に影響を及ぼす医薬およびその他の薬剤をスクリーニングするのに有用である。完全なＲＰＴＰγまたはそのリガンド結合部分を固相マトリックスに結合させることによりアフィニティープローブを作り出し、これをその結合活性に基づいて生物学的産物または化学薬剤を、レセプターと相互作用する能力についてスクリーニングするのに用いることができる。次いで結合物質をアフィニティープローブから精製された形で溶出することができる。固相マトリックスまたは担体へのタンパク質およびペプチドの結合法、これらの方法に使用できる固相マトリックス材料、ならびに溶出法は当業者に周知である。ＲＰＴＰγタンパク質または酵素活性をもつその誘導体を、ホスファターゼ活性を増強または阻害できる薬剤または化合物の試験に使用することができる。試験される化合物のホスファターゼ活性を修飾する能力は、精製ＲＰＴＰγタンパク質、または酵素的に活性なその誘導体に試験化合物を添加するインビトロ系で試験することができ、酵素活性に及ぼす影響を当業者に公知の酵素学的標準法を用いて測定できる。あるいは、ＲＰＴＰγの酵素活性に及ぼす化合物の作用は、生細胞または固定細胞を用いる全細胞調製物中で、あるいは生細胞または固定細胞由来の膜画分中で測定することができる。この方法は、タンパク質の細胞外レセプター部分を介して作用する化合物およびタンパク質の酵素部分に直接作用する化合物をスクリーニングするのに有用である。試験化合物を、大量のＲＰＴＰγを発現する細胞、例えばトランスフェクションしたＣＯＳまたはＮＩＨ−３Ｔ３細胞、またはそれに由来する膜調製物、とともにインキュベートする。次に当分野で公知の方法（Honegger，A.M．ら、Cell 51:199-209，1987；Margolis，B．ら、Cell 57:110 1-1107，1989）を用いて細胞性ホスホチロシンの量を測定する。結果を試験化合物不在下で得られる結果、あるいは既知のＲＰＴＰγ酵素活性の活性剤の不在または存在下で得られる結果と比較する。このような研究において、チロシンキナーゼ活性剤の存在下における試験化合物の作用を測定することもできる。ＲＰＴＰγ酵素活性を剌激する化合物はホスホチロシン量を正味で減少させ、他方ＲＰＴＰγ酵素活性を阻害する化合物はホスホチロシン量を正味で増加させる。上皮増殖因子（ＥＧＦ）や血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のレセプター等のチロシンキナーゼである成長因子レセプターの場合には、チロシンリン酸化が細胞増殖や癌遺伝子による転換と関連する。脱リン酸化を導くＰＴＰアーゼの活性化は増殖を防止または阻害する逆制御メカニズムとして作用し、癌に対する内因性制御メカニズムとして作用するかも知れない。したがって、このレセプター／酵素系の突然変異または制御障害は癌への感受性（susceptibility）を促進する可能性がある。インスリンレセプターもチロシンキナーゼであり、インスリンレセプターをもつ細胞におけるチロシンリン酸化は正常な生理学的機能と関連している。細胞増殖や癌の場合とは対照的に、ＲＰＴＰ活性化はインスリン効果を妨害する。正常以下のＲＰＴＰレベルまたは酵素活性は正常な逆制御メカニズムを除去する作用を及ぼす。しかし、さらに重要なことは、ＲＰＴＰγなどのＲＰＴＰの過剰活性または不適当な活性化は、細胞へのインスリンの作用を部分的または全体的に阻害し（インスリン耐性種）糖尿病に至らせることが予期されることである。したがって、糖尿病への感受性はＲＰＴＰγの制御障害と関連するのかも知れない。よって、本発明の正常または突然変異ＲＰＴＰγ遺伝子を同定する方法、あるいは細胞または組織と関連するＲＰＴＰγの量または活性を測定する方法は、癌、糖尿病、または細胞性ホスホチロシン代謝の変化と関連する他の疾患への感受性を同定する方法として用いることができる。本発明は、細胞または被験者中の正常または突然変異ＲＰＴＰγの存在またはレベルを評価する方法を提供する。個体中におけるＲＰＴＰγの不在、またはより典型的にはＲＰＴＰγの低発現、あるいは突然変異ＲＰＴＰγの存在は、癌遺伝子による転換への感受性および癌発生の重要な予告として用いることができる。あるいは、おそらくは負の制御に鈍感な突然変異レセプター／酵素系によるか、または体内の剌激性リガンドの過剰によるＲＰＴＰγの過剰発現は、糖尿病への感受性の重要な予告として用いることができる。ＲＰＴＰγ配列の一部（以下参照）をコードするＤＮＡ配列に対応するオリゴヌクレオチドプローブが、被験者の細胞中におけるＲＰＴＰγをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列の存在を試験するのに使用される。好ましいプローブはＲＰＴＰγの少なくとも４個のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも５個のアミノ酸残基をコードする核酸配列に向けられたものである。このようなプローブを用いて定性または定量アッセイを実施できる。例えば、細胞または組織調製物中におけるＲＰＴＰγ ｍＲＮＡの発現を測定するためにノーザン分析を用いる（下記の第７節参照）。個体からごく少量のＤＮＡしか得られない場合でも、選択的増幅法を用いた後で上記方法を使用できる。精製核酸断片を増幅することのできる組換えＤＮＡ法が古くから公知である。典型的には、このような方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターへの核酸断片の導入、ベクターのクローン増幅、および増幅された核酸断片の回収を含む。このような方法の例は、Ｃｏｈｅｎら（米国特許第４，２３７，２２４号）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Molecular Cloning：A Laboratory Manual ，Second Edition，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1989 ）に開示されており、これら文献をここに参照として包含する。上記のような所望の核酸分子の濃度を増加することのできるインビトロの酵素的方法は“ポリメラーゼチェインリアクション”または“ＰＣＲ”と呼ばれる（ Mullis，K．ら、Cold Spring Harb or Symp．Quant．Biol．51:263-273，1986；Erlich，H．ら、欧州特許第５０，４２４号；欧州特許第８４，７９６号；欧州特許第２５８，０１７号；欧州特許第２３７，３６２号；Mullis，K.，欧州特許第２０１，１８４号；Mullis，K．ら、米国特許第４，６８３，２０２号；Erlich，H.，米国特許第４，５８２，７８８号；およびSaiki，R．ら、米国特許第４，６８３，１９４号）。ＰＣＲは、特定核酸配列が以前に精製されていなくても、また特定試料中に１コピーしか存在しなくても、該特定配列の濃度を選択的に増加する方法を提供する。この方法は１本鎖または２本鎖ＤＮＡを増幅するのに使用できる。この方法は、所望の核酸分子の鋳型依存的ポリメラーゼ媒介性複製に２つのオリゴヌクレオチドプローブをプライマーとして用いる。この方法を成功させるには、ＰＣＲ法の２つのオリゴヌクレオチドプローブの厳密な性質が非常に重要である。核酸分子の５’ヌクレオチド３リン酸から３’ ヒドロキシ末端までを添加することによって核酸分子のポリメラーゼ依存的増幅が進行する。したがって、ポリメラーゼの作用は核酸分子の３’末端を伸長させる。これらの固有の性質をＰＣＲのオリゴヌクレオチドプローブの選択に利用する。プローブのオリゴヌクレオチド配列は、増幅しようとする特定核酸配列に隣接する配列と同一またはこれと相補的な配列を含むように選択する。より具体的には、“第１”プローブのオリゴヌクレオチド配列は、所望配列の３’に位置するオリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズできるように選択し、また“第２” プローブのオリゴヌクレオチド配列は所望領域の５’に存在する配列と同一のオリゴヌクレオチド配列を含むように選択する。どちらのプローブも３’水酸基をもっており、核酸合成のプライマーとして使用できる。ＰＣＲ反応条件は（ａ）ハイブリダイゼーションと核酸ポリメライゼーションを促進する条件、と（ｂ）２本鎖分子の変性を起こす条件とを繰り返す。反応の第１段階では、存在するすべての２本鎖分子を変性するために試料の核酸を短時間加熱し、次いで冷却する。次いで所望する核酸分子の濃度よりも大過剰濃度の “第１”および“第２”プローブを加える。ハイブリダイゼーションとポリメライゼーションを促進する条件下で試料をインキュベートすると、増幅すべき配列の３’位で、“第１”プローブが試料の核酸分子とハイブリダイズする。もしも試料の核酸分子が最初２本鎖であるときには、増幅しようとする配列と相補的な配列の３’位で、“第２”プローブが核酸分子の相補鎖とハイブリダイズする。ポリメラーゼを添加すると、“第１”プローブと（もしも核酸分子が２本鎖であるならば）“第２”プローブの３’末端が伸長される。“第１”プローブの伸長は所望核酸と同一の配列をもつオリゴヌクレオチドの合成をもたらす。“第２” プローブの伸長は所望核酸と相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドの合成をもたらす。ＰＣＲ反応では、“第１”プローブの伸長産物が必然的に“第２”プローブの配列と相補的な配列を含み、したがって“第２”プローブの伸長産物のための鋳型として作用しうるので、特定核酸配列の指数関数的増幅が可能である。同様に、“第２”プローブの伸長産物は必然的に“第１”プローブの配列と相補的な配列を含み、したがって“第１”プローブの伸長産物のための鋳型として作用しうる。よって、ポリメライゼーションと変性の繰り返しを実施することにより所望の核酸分子濃度が幾何学的に増加する。ＰＣＲの総説はMullis，K. B.，Cold Spring Harbor Symp．Quant．Biol．51:263-273，1986；Saiki，R.K．ら、BioTechnology 3:1008-1012，1985;および Mullis，K.B．ら、Meth．Enzymo l．155:335-350，1987を参照されたい。ある態様においては、本発明は天然由来の哺乳動物ＲＰＴＰγに関する。別の態様においては、本発明は組換え哺乳動物ＲＰＴＰγに関する。本発明の好ましい哺乳動物ＲＰＴＰγはヒト由来である。本発明は、それが生来関連するその他のタンパク質を実質的に含まない天然由来の分子を提供する。“他のタンパク質または糖タンパク質を実質的に含まない”とは、それが生来関連するその他のタンパク質または糖タンパク質を含まないように、少なくとも９０％（重量基準で）、そして所望であれば少なくとも９９％までタンパク質が精製されており、したがって実質的にこれらを含まないということを意味する。これはＲＰＴＰγを含む細胞、組織または液体を該タンパク質に特異的な抗体を担持する免疫吸着カラムなどの標準的タンパク質精製法に付すことによって達成できる。別のアフィニティー精製ではＲＰＴＰの酵素ドメインと結合できる固相基質またはレセプタードメインと結合するリガンドを使用する。あるいは、硫酸アンモニウム沈殿、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーなどの標準法を組み合わせて精製できる。本発明のＲＰＴＰγは種々の細胞または組織源から生化学的に精製しうることが理解できよう。天然由来のＲＰＴＰγを調製するには哺乳動物の脳などの組織、特にヒト由来のものが好ましい。あるいは、ＲＰＴＰγ遺伝子は単離または合成しうるので、原核生物中または所望であれば非哺乳動物真核生物中で、他の哺乳動物タンパク質または糖タンパク質を実質的に含まないポリペプチドを合成できる。本発明が意図するように、例えばトランスフェクションされたＣＯＳ、ＮＩＨ−３Ｔ３、またはＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞中で産生される組換えＲＰＴＰγ分子は天然のアミノ酸配列をもつタンパク質であるか、あるいはその機能的誘導体である。天然のタンパク質または糖タンパク質を組換え法で生産する場合には、それが生来関連する他のタンパク質および糖タンパク質を実質的に含まない形で提供される。あるいは、固相支持体上で所望の配列をもつポリペプチドを合成し、次いで支持体から分離する方法が公知である。本発明はＲＰＴＰγの多数の“機能的誘導体”の任意のものを提供する。“機能的誘導体”とはＲＰＴＰγの“断片”、“変種”、“類似体”、または“化学誘導体”を意味し、これらの用語は以下に定義する。機能的誘導体は（ａ）特定抗体への結合、（ｂ）ホスファターゼ酵素活性、または（ｃ）細胞外“レセプター”ドメインのリガンドへの結合などのＲＰＴＰγの機能の少なくとも一部を保持しており、本発明で使用しうる。ＲＰＴＰγの“断片”とは分子の任意のサブセット、すなわちより短いペプチドをいう。ＲＰＴＰγの“変種”とは全ペプチドまたはその断片のいずれかと実質的に類似の分子をいう。変種ペプチドは当分野で公知の方法を用いて変種ペプチドの直接的化学合成により簡便に調製できる。あるいは、ペプチドのアミノ酸配列変種は合成ペプチドをコードするＤＮＡの突然変異によって調製できる。このような変種は例えばアミノ酸配列中の残基の欠失、挿入または置換を含む。最終構築物が所望の活性を有する限り、欠失、挿入および置換のいかなる組み合わせも最終構築物の達成に用い得る。変種ペプチドをコードするＤＮＡ中に引き起こされる突然変異はリーディングフレームを変更してはならず、また好ましくは第２のｍＲＮＡ構造をもたらす相補的領域を作り出さないものであることは自明である（欧州特許出願公開ＥＰ７５，４４４参照のこと）。遺伝子レベルでは、これらの変種は通常タンパク質またはペプチド分子をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発（例えばAdelmanら、D NA 2:183，1983参照）を行い、これによって変種をコードするＤＮＡを作り出し、その後該ＤＮＡを組換え細胞培養で発現させることにより調製できる。変種は典型的には非変種ペプチドと同じ性質の生物学的活性を示す。ＲＰＴＰγの“類似体”とはＲＰＴＰγの全分子またはその断片のいずれかと実質的に類似の非天然分子をいう。ＲＰＴＰγの“化学誘導体”は、通常ペプチドの一部ではない付加的化学部分を含む。ＲＰＴＰγタンパク質またはそこから誘導されたペプチドの共有結合修飾が本発明の範囲に含まれる。ペプチド中の標的とするアミノ酸残基と、選択された側鎖または末端残基と反応できる有機誘導体化剤とを反応させることによってこのような修飾を分子中に導入できる。システイン残基は最も普通にはクロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのα −ハロ酢酸（および対応するアミン）と反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイン残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀安息香酸、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ −１，３−ジアゾールと反応させて誘導体とすることもできる。ヒスチジン残基はジエチルピロカルボネートがヒスチジン側鎖に比較的特異的であるので、これとｐＨ５．５−７．０で反応させることによって誘導体とすることができる。ｐ−ブロモフェナチルブロミドも有用であり、反応は好ましくはｐＨ６．０で０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で実施する。リシンおよびアミノ末端残基はコハク酸またはその他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの薬剤を用いる誘導体化はリシン残基の電荷を逆にする効果をもつ。α−アミノ含有残基の誘導体化に用いるその他の適当な試薬には、メチルピコリンイミデートなどのイミドエステル；ピリドキサールホスフェート；ピリドキサール；クロロボロハイドライド；トリニトロベンゼンスルホン酸；ｏ−メチルイソウレア；２，４−ペンタンジオン；およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼに触媒される反応を含む。アルギニン残基は１または複数の慣用試薬との反応により修飾でき、これにはフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンが含まれる。グアニジン官能基の高いｐＫ_aのために、アルギニン残基の誘導体化はアルカリ条件下で実施することが必要である。さらに、これらの試薬はアルギニンのε−アミノ基と同様にリシンの基とも反応する。チロシン残基自体の特異的修飾、特に芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によるチロシン残基へのスペクトル標識の導入はよく研究されている。最も普通には、Ｎ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンがＯ−アセチルチロシン種および３−ニトロ誘導体の作製にそれぞれ用いられる。カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）は１−シクロヘキシル −３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３ −（４−アゾニア−４，４−ジメチルフェニル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’）との反応により選択的に修飾される。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応によりアスパラギンおよびグルタミン残基に変換される。グルタミンおよびアスパラギン残基は温和な酸性条件下で対応するグルタミルおよびアスパルチル残基にアミド分解される。これら残基のいずれの形も本発明の範囲に包含される。タンパク質またはペプチドを水不溶性支持体マトリックスまたはその他の高分子担体へ架橋させるには、二官能性薬剤による誘導体化が有用である。通常用いられる架橋剤には例えば１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３−ジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）などのジスクシニミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドが含まれる。メチル−３ −［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導化剤は光の存在下に架橋を形成しうる光活性化中間体を生成する。あるいは、臭化シアン− 活性化炭水化物などの反応性水不溶性マトリックスや米国特許第３，９６９，２８７号；３，６９１，０１６号；４，１９５，１２８号；４，２４７，６４２号；４，２２９，５３７号；および４，３３０，４４０号に記載の反応基質をタンパク質の固定化に使用できる。その他の修飾にはプロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリンまたはスレオニン残基の水酸基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のＸ−アミノ基のメチル化（T.E．Creighton，Proteins：Structure and Molecule Properties，M.H．Freemem & Co.，San Francisco，pp．79-86，1983）、Ｎ末端アミンのアセチル化、および時にはＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。このような誘導化部分は溶解度、吸収、生物学的半減期などを改善できる。あるいはこのような部分はタンパク質等の好ましくない副作用を排除または軽減する。このような効果をもたらすことのできる部分については、例えばRemington' s Pharmaceutical Sciences，16th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，19 80に開示されている。本発明はまた、ＲＰＴＰγ、好ましくはヒトＲＰＴＰγのエピトープに特異的な抗体に関し、さらに細胞、細胞または組織抽出物、あるいは生物学的液体中におけるＲＰＴＰγの存在を検出し、あるいはその量または濃度を測定するために該抗体を使用することに関する。 “抗体”という用語はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、および抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体を含む。ポリクローナル抗体は抗原で免疫感作した動物の血清由来の抗体分子の異種集団である。上記抗原は、好ましくはＲＰＴＰγタンパク質または糖タンパク質、それらから誘導したペプチド、またはそれらのエピトープである。モノクローナル抗体は特異的抗原に対する抗体の実質的に同種集団である。当分野で公知の方法によりｍＡｂが得られる。例えばKohlerおよびMilstein，Natu re 256:495-497，1975および米国特許第４，３７６，１１０号を参照されたい。このような抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびそのサブクラスを含む免疫グロブリンクラスのいずれかである。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマはインビトロまたはインビボで培養できる。高力価のｍＡｂをインビボ生産することが本発明の好ましい生産法である。簡単に述べると、個々のハイブリドーマから得た細胞をプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射して所望のｍＡｂを高濃度で含む腹水を産生させる。当業者に公知のカラムクロマトグラフィー法を用いて、イソタイプＩｇＭやＩｇＧのｍＡｂを腹水または培養上澄みから精製できる。キメラ抗体とは、分子中の異なる部分が異なる動物種由来である分子をいい、例えばマウスｍＡｂ由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とをもつ分子である。キメラ抗体およびその生産法は当分野で公知である（Cabillyら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 81:3273-3277，1984；Morrisonら、Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 81:6851-6855，1984；Boulianneら、Nature 312:643-646，1984；Ne ubergerら、Nature 314:268-270，1985；Taniguchiら、欧州特許出願第１７１４９６号（１９８５年２月１９日公開）；Morrisonら、欧州特許出願第１７３４９４号（１９８６年３月５日公開）；Neubergerら、ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０１５３３（１９８６年３月１３日公開）；Kudoら、欧州特許出願第１８４１８７号（１９８６年６月１１日公開）；Morrisonら、欧州特許出願第１７３４９４号（１９８６年３月５日公開）；Sahaganら、J．Immunol．137:1066-1074，1986；Robi nsonら、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９（１９８７年５月７日公開）；Liuら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:3439-3443，1987；Sunら、Proc．N atl．Acad．Sci．USA 84:214-218，1987；Betterら、Science 240:1041-1043，1 988）。これらの文献は参照としてここに包含される。抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原結合部位と一般に関連する特有の抗原決定基を認識する抗体である。抗−Ｉｄ抗体は、それに対して抗−Ｉｄを調製しようとするｍＡｂで、ｍＡｂを得たのと同じ種かつ遺伝子型（例えばマウス株）の動物を免疫感作すすることによって調製できる。免疫感作した動物は、イディオタイプ抗原決定基に対する抗体（抗−Ｉｄ抗体）を産生することによって、免疫抗体のイディオタイプ抗原決定基を認識し応答する。抗 −Ｉｄ抗体はさらに別の動物における免疫応答を誘導していわゆる抗−抗−Ｉｄ抗体を産生するための“免疫原”として使用できる。抗−抗−Ｉｄ抗体は抗−Ｉｄを誘導したもとのｍＡｂとエピトープ的に同じである。したがって、ｍＡｂのイディオタイプ抗原決定基に対する抗体を用いることにより、同じ特異性を有する抗体を発現する他のハイブリッドクローンを同定することが可能である。したがって、ＲＰＴＰγに対して作成されたｍＡｂはＢＡＬＢ／ｃマウスなどの適当な動物中に抗−Ｉｄ抗体を誘導するのに使用できる。このような免疫マウスからの脾臓細胞を用いて、抗−ＩｄｍＡｂを分泌する抗−Ｉｄハイブリドーマを作製する。さらに、抗−ＩｄｍＡｂはスカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）などの担体と結合させて別のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫するのに使用できる。これらのマウスから得た血清は、ＲＰＴＰγエピトープに特異的な、もとのｍＡｂの結合性をもつ抗−抗−Ｉｄ抗体を含む。したがって、抗−ＩｄｍＡｂはそれ自体のイディオタイプエピトープ、あるいはＲＰＴＰγのエピトープなどの評価すべきエピトープと構造的に類似の“イディオトープ”をもつ。 “抗体”という用語は完全な分子ならびに抗原と結合しうるＦａｂやＦ（ａｂ ’）₂などのその断片を含む。ＦａｂやＦ（ａｂ’）₂断片は完全な抗体のＦｃ断片を欠いており、循環系から迅速に浄化され、完全な抗体よりも少ない非特異的組織結合性をもつ（Wahlら、，J．Nucl．Med．24:316-325，1983）。ＦａｂやＦ（ａｂ’）₂ならびに本発明で有用な抗体の他の断片は、完全な抗体分子について開示した方法によるＲＰＴＰγの検出および定量に使用できる。このような断片は、パパイン（Ｆａｂ断片の生産に）またはペプシン（Ｆ（ａｂ ’）₂断片の生産に）などの酵素を用いるタンパク質分解開裂によって典型的に生産される。抗体がある分子と特異的に反応して該分子を抗体に結合させることができるならば、抗体は該分子と“結合しうる”という。“エピトープ”という用語は、ある抗体によって結合され、かつ該抗体によって認識されうる分子の一部をいう。エピトープまたは“抗原決定基”は、通常アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面群からなり、特異的三次元構造と特異的電荷をもつ。“抗原” とは、抗体によって結合されうる分子または分子の一部であって、さらに該抗原のエピトープと結合しうる抗体産生を動物に誘導できるものをいう。抗原は１または２以上のエピトープをもつ。抗体は抗原と極めて選択的に反応し、構造が異なる多数の他の抗原とは反応しないので、抗原特異的であると言われている。本発明の抗体または抗体断片は、ＲＰＴＰγタンパク質を発現する細胞の存在を定量的または定性的に検出するのに使用しうる。蛍光標識抗体（下記参照）および光学顕微鏡、フローサイトメーター、または蛍光光度計による検出を用いる免疫蛍光法によってこれを実施できる。このような方法では、抗体は好ましくはＲＰＴＰγの細胞外エピトープに特異的である。本発明で使用する抗体（またはその断片）は、ＲＰＴＰをインサイチュ検出するために免疫蛍光または免疫電子顕微鏡で組織学的に使用できる。インサイチュ検出は組織学的試料を被験者から除去し、本発明の標識抗体または抗体断片をこのような試料に供給することにより実施できる。好ましくは、抗体を試料に適用または重ねて供給する。このような方法を用いると、ＲＰＴＰγ の存在のみでなく、試験組織中におけるその分布も決定できる。本発明を用いて、当業者はインサイチュ検出の達成のために、実施に種々の多様な組織学的方法（染色法など）に変更を加えられることが容易に分かるであろう。ＲＰＴＰγのためのかかるアッセイは典型的には、生物学的液体、組織抽出物、新たに採取した細胞、または組織培養でインキュベートした細胞、等の生物学的試料を、検出しうるように標識したＲＰＴＰγに特異的な抗体の存在下にインキュベートし、当分野で公知の多数の方法のうち任意のものによって抗体を検出することからなる。生物学的試料は固相支持体またはニトロセルロースなどの担体、あるいは細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定できる他の固体支持体と共にインキュベートできる。次いで支持体を適当な緩衝液で洗浄し、検出しうるように標識したＲＰＴＰγ特異的抗体で処理する。次いで固相支持体を緩衝液で２度目に洗浄して未結合抗体を除去する。固相支持体上の結合標識量を慣用法で検出する。 “固相支持体”は抗原または抗体を結合しうるいかなる支持体でもよい。公知の支持体または担体にはガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、および磁鉄鉱を含む。好ましい担体は、本発明のアッセイが行なわれる溶液に完全に不溶性のものである。当分野で周知のいくらか可溶性の担体も使用可能である。支持体材料は支持体結合分子が抗原または抗体と結合しうる限り実際にどのような構造形態をとってもよい。したがって、支持体の形態はビーズのような球状、試験管の内側表面、またはロッドの外側表面のような円筒形でありうる。あるいは、表面はシート、試験片などのような平面であってもよい。好ましい支持体はポリスチレンビーズを含む。当業者には抗体または抗原結合のためのその他多くの適当な担体が公知であり、また日常の実験によりこれを確認できる。一定ロットの抗−ＲＰＴＰγ抗体の結合活性は公知の方法により決定できる。当業者であれば日常の実験により各測定のための実施可能なまた最適のアッセイ条件を決定できる。ＲＰＴＰγ特異的抗体を検出しうるように標識する方法の１つは、抗体、あるいは抗−ＲＰＴＰγ抗体と結合する第２抗体を酵素と結合させて、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）に用いることである。この酵素は後に適当な基質にさらすと基質と反応して、例えば分光光学的、蛍光光学的または目視手段で検出しうる化学的部分を生成する。抗体を検出しうるように標識するのに用いられる酵素には、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、イーストアルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、これらだけに限定されない。検出は酵素の色原体基質を用いる比色法で実施できる。検出は基質の酵素反応の程度を、同様に調製した標準品と比較する目視比較によっても実施できる。その他の各種イムノアッセイによっても検出は実施できる。例えば、抗体または抗体断片を放射性標識することにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によってＲＰＴＰγを検出できる（例えば、Work，T.S．ら、Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology，North Holland Publishing Company ，New York，1978参照：その内容をここに参照として包含する）。放射性同位元素はガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーなどの手段で検出できる。抗体を蛍光化合物で標識することもできる。蛍光標識した抗体を適当な波長の光にあるとその存在を蛍光により検出できる。最もよく用いられる蛍光標識化合物にはフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオレスカミンがある。抗体は、¹⁵²Ｅｕやその他ランタノイド系列などの蛍光発光金属を用いて検出しうるように標識することもできる。これらの金属はジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）やエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート剤を用いて抗体に結合できる。抗体は化学発光化合物と結合させることにより検出しうるように標識することもできる。次いで化学発光標識抗体の存在を化学反応の過程で生じる発光の存在を検出することにより決定する。特に有用な化学発光標識化合物の例としてはルミノール、イソルミノール、テロマティック（theromatic）アクリジウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびオキサレートエステルが挙げられる。同様に、生物発光化合物を用いて本発明の抗体を標識することもできる。生物発光とは、生物系に見いだされる化学発光の１種であり、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増加させる。生物発光タンパク質の存在は発光の存在を検出することにより決定される。標識目的用の重要な生物発光化合物はルシフェラーゼおよびエクオリンである。本発明の抗体分子は、“２部位”または“サンドイッチ”アッセイとしても知られる免疫測定アッセイに使用できる。典型的な免疫測定アッセイでは、一定量の非標識抗体（または抗体断片）を固体支持体に結合させ、一定量の検出しうるように標識された可溶性抗体を加えて、固相抗体、抗原、および標識抗体の間に形成される三元複合体を検出および／または定量する。典型的かつ好ましい免疫測定アッセイは“フォワード”アッセイを含み、これは固相と結合した抗体をまず試験すべき試料と接触させて、二元の固相抗体−抗原複合体を形成することにより試料から抗原を抽出する。適当なインキュベーション期間の後、固体支持体を洗浄して未反応抗原があればこれを含む液体試料の残りを除去し、次いで標識された第２抗体（これは“レポーター分子”として機能する）を含む溶液と接触させる。２度目のインキュベーションにより非標識抗体を介して固体支持体に結合した抗原と標識抗体との複合体を形成させた後、固体支持体を２度目に洗浄して未反応標識抗体を除去する。本発明の抗原を使用しうる別の型の“サンドイッチ”アッセイでは、いわゆる “同時”および“逆”アッセイを用いる。同時アッセイでは、固体支持体に結合した抗体と標識抗体とを試験すべき試料に同時に添加するので、インキュベーションは１回のみ行なわれる。インキュベーション終了後、固体支持体を洗浄して液体試料の残りおよび複合体を形成しなかった標識抗体を除去する。次いで固体支持体と結合した標識抗体の存在を慣用の“フォワード”サンドイッチアッセイと同様に測定する。 “逆”アッセイでは、液体試料に標識抗体溶液をまず添加し、次いで適当なインキュベーション期間の後に固体支持体に結合した非標識抗体を添加するという段階的添加を用いる。２度目のインキュベーションの後、慣用法で固相を洗浄して試験すべき試料残渣および未反応標識抗体溶液を除去する。固相支持体に結合した標識抗体の測定を“同時”および“フォワード”アッセイで測定したように実施する。被験者中における正常に機能するＲＰＴＰγの存在も、チロシンホスファターゼ活性を調べるための直接酵素アッセイによって試験できる。このような生物学的測定は、正確な酵素活性を測定できる精製酵素を用いるか、あるいは膜調製物、または全細胞を用いて正味のホスホチロシンレベルを測定することによりインビトロで実施できる。本発明の別の態様においては、RPTPγタンパク質をコードする配列を含む核酸分子、好ましくはDNA、及び該DNA分子を発現する方法が提供される。当業者であれば、過度の実験をすることなく本発明の遺伝子配列とオリゴヌクレオチドを使用して、本明細書中に記載したRPTPγ分子と配列相同性を有する、ヒトあるいはその他の哺乳動物種の追加的なRPTP分子をどのようにして同定しクローン化するか理解するであろう。さらに、本発明の遺伝子構築物を操作することにより、特定のリガンド結合レセプタードメインを、RPTPγのトランスメンブラン部分及び触媒部分にグラフトすることによりキメラ分子を生じることができる。そのようなキメラ分子の非限定的な例としては、レセプター部分が表皮成長因子レセプター、繊維芽細胞成長因子レセプター等であるRPTPγが挙げられる。遺伝子工学的に製造されたキメラレセプターは当分野において知られている（例えば、Riedel ，H．et al.，Nature 324:628-670（1986）参照）。 RPTPγをコードする遺伝子構築物、その機能的誘導体、及び上記したもののようなキメラ分子は遺伝子治療に使用することができる。疾患を引き起こす異常あるいは機能不全RPTPγを、正常なRPTPγをコードするDNAでトランスフェクトした所望の系統の細胞（例えば造血細胞、ニューロン等）の注入あるいは移植により置換することができる。あるいは、もしくは追加的に、選択されたリガンド（例えばEGF）を結合するレセプター部分を有するキメラRPTPγを含む細胞をそのような遺伝子治療に使用することもできる。本発明の組換えDNA分子は種々の手段の任意のもので製造することができ、例えばDNAもしくはRNA合成、あるいはより好ましくは組換えDNA技術を使用することにより製造できる。そのような分子を合成する技術は、例えば、Wu，R.，et al（Prog．Nucl．Acid．Res．Molec．Biol．21:101-141（1978））により開示されており、組換え体分子を構築するための手順はSambrook et al ．（上出）に見られる。 RPTPγの部分を示すオリゴヌクレオチドは、そのようなタンパク質をコードする遺伝子の存在についてのスクリーニング及びRPTPγ遺伝子のクローニングに有用である。そのようなオリゴヌクレオチドの合成のための技術は、例えばWu，R ．et al．（上出）により開示されている。タンパク質分子はシアノゲンブロミド、あるいは例えばパパイン、キモトリプシン、トリプシン等のプロテアーゼによりフラグメント化することができる（Oi ke，Y.，et al.，J．Biol．Chem．257:9751-9758（1982）；Liu，C.，et al.，I nt．J．Pept．Protein Res．21:209-215（1983））。遺伝子コードは縮退しているので、特定のアミノ酸をコードするのに１より多いコドンが使用され得る（Wa tson，J.D.，In：Molecular Biology of the Gene，4th Ed.，Benjamin/Cumming s Publishing Co.，Inc.，Menlo Park，CA（1987））。遺伝子コードを使用して１以上の異なるオリゴヌクレオチドを特定することができ、これらのそれぞれはアミノ酸をコードできる。実際、特定のオリゴヌクレオチドが実際のXXX-コード配列を構成する可能性は、異常塩基対の関係及び特定のコドンが真核生物細胞中において（特定のアミノ酸をコードするのに）実際に使用される頻度を考慮することにより見積もることができる。そのような「コドン使用のルール」はLathe，R.，et al.，J．Molec．Biol ．183:1-12（1985）により開示されている。そのような「コドン使用のルール」を用いて、RPTPγをコードすることができる理論的に「最も可能性のある」ヌクレオチド配列を含む単一のオリゴヌクレオチド、あるいはオリゴヌクレオチドのセットが同定される。アミノ酸配列がただ１つのオリゴヌクレオチドによりコードされる場合もあるが、多くの場合アミノ酸配列は類似のオリゴヌクレオチドの任意のセットによってコードされ得る。重要なことは、このセットのメンバーの全てはペプチドフラグメントをコードすることができるオリゴヌクレオチドを含んでおり、従ってそのペプチドフラグメントをコードする遺伝子と同じオリゴヌクレオチド配列を含む可能性があるが、そのセットの１つのメンバーのみが当該遺伝子のヌクレオチド配列に同一のヌクレオチド配列を含むことである。このメンバーはセット中に存在し、セットのその他のメンバーの存在下においてもDNAにハイブリダイズすることができるので、RPTPγをコードする遺伝子をクローン化するのに単一のオリゴヌクレオチドを使用する、同じ方法でオリゴヌクレオチドの分画化されていないセットを使用することができる。 RPTPγフラグメントをコードできる理論的に「最も可能性のある」配列を含むオリゴヌクレオチド、あるいはオリゴヌクレオチドのセットを使用して、「最も可能性のある」配列または配列のセットにハイブリダイズすることができる相補的なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットの配列が同定される。そのような相補的配列を含むオリゴヌクレオチドをプローブとして使用してRPTPγ遺伝子を同定し単離することができる（Sambrook et al.、上出）。 RPTPγ遺伝子のフラグメントをコードすることができるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセット（あるいはそのようなオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド）は、当分野において周知の方法を使用して上記のように同定され、合成される（Belagaje，R.，et al.，J．Biol．Chem．254:5765- 5780（1979）；Maniatis，T.，et al.，In：Molecular Mechanism in the Contr ol of Gene Expression，Nierlich，D.P.，et al.，Eds.，Acad．Press，NY（19 76）；Wu，R.，et al.，Prog．Nucl．Acid Res．Molec．Biol．21:101-141（197 8）；Khorana，R.G.，Science 203:614-625（1979））。DNA合成は自動化された合成機を使用して行うことができる。オリゴヌクレオチドプローブあるいはセットは、RPTPγ遺伝子を発現することができる細胞から誘導されたDNA、あるいはより好ましくはcDNA調製物に対して当分野で周知の手段によりハイブリダイズされる。核酸ハイブリダイゼーションの技術はSambrook et al．（上出）及びHaym es，B.D.，et al．（In：Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach ，IRL Press，Washington，DC（1985））により開示されており、これらの引用文献は引用により本明細書の一部とする。上記のような技術あるいはそれらに類似のものは、ヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼの遺伝子（Hsu，L.C.，et al.，P roc．Natl．Acad．Sci．USA 82:3771-3775（1985））、フィブロネクチンの遺伝子（Suzuki，S.，et al.，EMBO J．4:2519-2524（1985））、ヒトエストロゲンレセプター遺伝子（Walter，P.，et al.，Proc．Natl．Acad．S ci．USA 82:7889-7893（1985））、組織型プラスミノーゲンアクチベータ（Penn ica，D.，et al.，Nature 301:214-221（1983））及びヒト分娩日胎盤アルカリホスファターゼ相補的DNA（Kam，W.，etal.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82: （715-8719（1985））のクローニングを成功裏に可能としている。 RPTPγ遺伝子をクローニングする別の方法においては、（RPTPγを発現できる細胞からの）DNA、あるいはより好ましくはcDNAを発現ベクター中にクローン化することにより、発現ベクターのライブラリーを作製する。次にそのライブラリーを、抗RPTPγ抗体に結合するタンパク質を発現することができ、RPTPγの全体あるいは部分と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができるヌクレオチド配列を有するメンバーについてスクリーニングする。この態様においては、DNA、あるいはより好ましくはcDNAをRPTPγタンパク質を発現できる細胞から抽出し精製する。精製されたcDNAをフラグメント化し（剪断、エンドヌクレアーゼ消化等により）、DNAまたはcDNAフラグメントのプールを生成する。このプールからのDNAまたはcDNAフラグメントを次に発現ベクター中にクローン化し、そのメンバーのそれぞれがユニークなクローン化DNAまたはcDNAフラグメントを含む発現ベクターのゲノムまたはcDNAライブラリーを生成する。「発現ベクター」は、（適当な転写及び／または翻訳制御配列の存在により）ベクター中にクローン化されたDNA分子を発現することができ、それによりペプチドまたはタンパク質を生成できるベクターである。クローン化された配列の発現は、発現ベクターが適当な宿主細胞中に導入されたときに起こる。原核生物発現ベクターを使用した場合には、適当な宿主細胞はクローン化された配列を発現できる任意の原核生物細胞である。真核生物発現ベクターを使用した場合には、適当な宿主細胞はクローン化された配列を発現できる任意の真核生物細胞である。重要なこととして、真核生物DNAは介在配列を含み得、そのような配列は原核生物細胞中で正確にプロセシングされ得ないので、RPTPγを発現し得る細胞からの cDNAを使用して原核生物ゲノム発現ベクターライブラリーを生成することが好ましい。cDNAの調製方法及びゲノムライブラリーを生成するため方法はSambrook e t al．（上出）により開示されている。本発明のRPTPγまたはその機能的誘導体をコードするDNA配列は、結合のための平滑末端化あるいは付着末端化された末端、適当な末端を与えるための制限酵素消化、適当な接着末端の充填、望ましくない結合を防止するためのアルカリホスファターゼ処理及び適当なリガーゼによる結合を含む慣用の技術によりベクターDNAと組換えることができる。そのような操作のための技術はSambrook et al ．（上出）により開示されており、当分野で周知のものである。例えばDNAのような核酸分子は、転写及び翻訳制御情報を含むヌクレオチド配列を含み、そのような配列がポリペプチドコード配列に「作用可能なように結合されている」ときに、ポリペプチドを「発現することができる」。作用可能な結合とは、制御DNA配列及びコード配列が遺伝子発現を可能とするような形で連結されている結合である。遺伝子発現に必要とされる制御領域の正確な性質は生物によって異なるが、一般的にはプロモーター領域を含み、これは原核生物においてはプロモーター（これはRNA転写の開始の指示を出す）と、RNAに転写されたときにタンパク質合成開始のシグナルを発するDNA配列の両方を含んでいる。そのような領域は通常、転写と翻訳の開始に関与する５ '-非コード配列、例えばTATAボックス、キャップ配列、CAAT配列等を含んでいる。所望の場合には、非コード領域３'からコード配列は上記の方法により得られる。この領域はその転写終結制御配列のために保持され得、例えば終結及びポリアデニル化のために保持され得る。即ち、DNAコード配列に通常隣接する３'-領域を保持することにより、転写終結シグナルを与えることができる。タンパク質の発現に使用した宿主細胞中で転写終結シグナルが十分に機能的でない場合は、宿主細胞中の３'領域機能を置き換えることができる。２つのDNA配列（例えばプロモーター領域配列及びRPTPγコード配列）は、これらの２つのDNA配列の間の結合の性質が、（1）フレームシフト変異の導入を起こさず、（2）RPTPγコード配列の転写を制御するプロモーターの能力を妨害しない場合に、作用可能なように結合されているといわれる。プロモーター領域は、プロモーターがコード配列の転写を行うことができるならばDNAコード配列に作用可能なように結合されている。即ち、タンパク質を発現するためには、適当な宿主により認識される転写及び翻訳シグナルが必要である。「作用可能なように結合する」ためには、２つの配列が互いに直接隣接している必要はない。プロモーターは、RNAポリメラーゼに結合し、「作用可能なように結合した」核酸コード配列の転写を促進することができる２本鎖DNA（またはRNA）分子である。本明細書で使用するように、「プロモーター配列」は、RNAポリメラーゼにより転写されたDNA（またはRNA）のその鎖に見られるプロモーターの配列である。「プロモーター配列相補物」は、「プロモーター配列」の相補物である配列を有する。従って、１本鎖「プロモーター配列相補物」に隣接したプライマーDNAもしくはRNA、または「プロモーター配列」の延長時に、その延長が「プロモーター配列」または「プロモーター配列相補物」に向かって進行する場合、機能的なプロモーターを含むことになる２本鎖分子が形成される。この機能的なプロモーターは、「プロモーター配列」を含む２本鎖分子のその鎖（「プロモーター配列相補物」を含む分子のその鎖ではなく）に作用可能なように結合した核酸分子の転写の指示を与える。ある種のRNAポリメラーゼはそのようなプロモーターについて高い特異性を示す。バクテリオファージT7、T3及びSP-6のRNAポリメラーゼは特によく特性化されており、高いプロモーター特異性を示す。これらのRNAポリメラーゼのそれぞれについて特異的なプロモーター配列はまたポリメラーゼに２重DNA鋳型の１つの鎖だけから転写を行うように指示を出す。鎖の選択はプロモーター配列の向きによって決定され、転写の向きを決定するものであり、これはRNAは３'ヒドロキシル末端へのヌクレオチド５'リン酸の付加によってのみ酵素的に重合されるからである。本発明のプロモーター配列は、原核生物のもの、真核生物のもの、あるいはウィルスのものであってもよい。適するプロモーターは抑制可能なものであり、あるいはより好ましくは構造的なものである。適する原核生物プロモーターの例としては、T4ポリメラーゼを認識できるプロモーター（Malik，S．et al.，J．Biol．Chem．263:117 4-1181（1984）；Rosenberg，A.H．et al.，Gene 59:191-200（1987）；Shinedl ing，S．et al.，J．Molec．Biol．195:471-480（1987）；Hu，M．et al.，Gene 42:21-30（1986））、T3、Sp6及びT7ポリメラーゼを認識するプロモーター（Ch amberlin，M．et al.，Nature 228:227-231（1970）；Bailey，J.N．et al.，Pr oc．Natl．Acad．Sci．（USA）80:2814-2818（1983）；Davanloo，P．et al.，P roc．Natl．Acad．Sci．（USA）81:2035-2039（1984））；バクテリオファージ λのP_R及びP_Lプロモーター（The Bacteriophage Lambda，Hershey，A.D.，Ed.， Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY（1973）；Lambda II，Hen drix，R.W.，Ed，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY（1980））；大腸菌のtrp、recA、熱ショック及びlacZプロモーター；バチラスズブチリスのα−アミラーゼ（Ulmanen，I.，et al.，J．Bacteriol．162:176-182（1985 ））及びσ-28-特異的プロモーター（Gilman，M.Z.，et al.，Gene 32:11-20（1 984））；バチラスのバクテリオファージのプロモーター（Gryczan，T.J.，In： The Molecular Biology of the Bacilli，Academic Press，Inc.，NY（1982））；ストレプトマイセスプロモーター（Ward，J.M.，et al.，Mol．Gen．Genet．2 03:468-478（1986））；バクテリオファージλのintプロモーター；pBR322のβ- ラクタマーゼ遺伝子のblaプロモーター及びpPR325のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のCATプロモーター等が挙げられる。原核生物プロモーターは、Glick B.R．（J．Ind．Microbiol．1:277-282（1987））；Cenat iempo，Y．（Biochimie 68:505-516（198 6））；Watson，J.D．et al．（In：Molecular Biology of the Gene，Fourth E dition，Benjamin Cummings，Menlo Park，CA（1987）及びGottesman，S．（Ann ．Rev．Genet．18:415-442（1984））により記載されている。好ましい真核生物プロモーターとしては、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Hamer，D.，et al.，J．Mol．Appl.Gen．1:273-288（1982））；ヘルペスウィルスのTKプロモーター（McKnight，S.，Cell 31:355-365（1982））；SV40初期プロモーター（Benoist，C.，et al.，Nature（London）290:304-3 10（1981））及び酵母gal4遺伝子プロモーター（Johnston，S.A.，et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．（USA）79:6971-6975（1982）；Silver，P.A．et al.，Pro c．Natl．Acad．Sci．（USA）81:5951-5955（1984））等が挙げられる。上記に挙げた引用文献の全ては引用により本明細書の一部とする。強力なプロモーターが好ましい。そのような好ましいプロモーターの例は、T3 、SP6及びT7ポリメラーゼを認識するもの、バクテリオファージλのP_Lプロモーター、recAプロモーター及びマウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーターである。RPTPγの真核生物発現に最も好ましいプロモーターは、pLSVベクター中の転写を誘導するようなSV40プロモーターである（Livneh，E.，etal.，（1986）J ．Biol．Chem．261，12490-12497）。そのようなポリメラーゼ認識部位の配列は、Watson J.D．et al．（In：Molecular Biology of the Gene，Fourth Edition ，Benjamin/Cummings Publishing Co.，Inc.，Menlo Park，CA（1987））により開示されている。本発明を一般的に記載してきたが、以下の実施例を参照することにより本発明をより容易に理解することができるであろう。以下の実施例は説明のために示すものであり、特に記載しない限り本発明を限定することを意図するものではない。６．実施例：RPTPγcDNAのクローンの単離及び分析 RPTPγが腫瘍抑制遺伝子として機能し得るかどうかということに関する問題を解決するためには、ゲノム再配列及び点変異及び腫瘍細胞への野性型RPTPγの再導入についての腫瘍の詳細なスクリーニングが必要である。これまで、RPTPγのゲノム分析は部分配列によってしか行われていなかった（Kaplan et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．87:7000-7004（1990））ので、本発明者らは完全長のヒトR PTPγcDNAをクローン化し、配列決定した。さらに、本発明者らは、RPTPγのマウス相同体をクローン化し、その組織発現、並びにその正常なインビボ機能の分析を容易化した。６.１ライブラリースクリーニングヒトRPTPγ 最初のクローンは１日齢のヒト脳幹のλgtllcDNAライブラリー（the American Type Culture Collectionから得た-No．37432）から、約300,000プラークを、両方の保存ホスファターゼホスファターゼドメインにわたるものである、ニックトランスレーションしたLCAプローブにより、緩やかなハイブリダイゼーション条件下にスクリーニングすることにより単離した。残りのcDNAクローンは、ヒト脳幹ライブラリーを、先に単離されたRPTPγのクローンからのランダムにプライムされたプローブで高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下にスクリーニングすることにより単離した。マウスRPTPγ 最初のクローンはλgtllマウス脳cDNAライブラリー（Clontech，Palo Alto，C Aから購入した）から、約百万プラークを、最初の触媒ドメインの全てにわたるヒトRPTPγからの、ランダムにプライムされたプローブで高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下にスクリーニングすることにより単離した。残りのcDNAクローンは、マウス脳ライブラリーを、先に単離されたマウスRPTPγ のクローンからのプローブで高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下にスクリーニングすることにより単離した。６.２ヌクレオチド配列決定 λgtllRPTPγクローンのDNA調製物をEcoRIで消化し、BlueScript SK-プラスミド（Stratagene，La Jolla CAより購入）中にサブクローン化した。特異的合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Sequenase，United States Biochemical，Cleveland，OH）によりヌクレオチド配列を決定した。クローンの全ては両方の鎖について配列決定した。６.３配列の整列全てのDNA及びタンパク質データベースサーチはGenetic Comp uter Group配列分析ソフトウェアパッケージ（Devereux et al.，Nucleic Acid Res．12:387-396（1989））により行った。SwissProt and Gene Bank/European Molecular Biology LaboratoryデータベースをFASTA及びTFASTAのそれぞれによりサーチした（Pearson and Lipman，Proc．Natl．Acad．Sci．85:2444-2448（1 988））。Genetics Computer Groupプログラム、LINEUP、PILEUP、PRETTY及びBE STFITによりタンパク質を整列させた。６.４．結果及び考察ヒトRPTPγのヌクレオチド配列（配列番号１）を図３に示す。ヒトRPTPγの完全アミノ酸配列（配列番号２）は図３及び４に示す。マウスRPTPγのアミノ酸配列（配列番号３）は図４に示す。cDNA配列の翻訳により、ヒトRPTPγについて14 45アミノ酸、マウス相同体について1442アミノ酸のオープンリーディングフレームの存在が明らかになった。ヒトRPTPγ及びマウス相同体の両方における開始Me tがフレーム内で停止コドンの後にある。両方のタンパク質はシグナル配列（図４で下線を付した）を含み、ヒトRPTPγについては736アミノ酸、マウス遺伝子については733アミノ酸の推定細胞外ドメインを含む。ヒトRPTPγの細胞外ドメインは、８つの推定N-結合グリコシル化部位を含み、その６つはマウス相同体に保存されている（図４において矢印の頭部で示した）。 RPTPγの細胞外ドメインのアミノ末端領域（残基56〜322）は、酵素カルボニックアンヒドラーゼ（CAH）に対する顕著な配列類似性を有している。このCAH様ドメインの前には、α及びβサブユニットを分離するインシュリンレセプターの細胞外ドメイン中の開裂部位（Ullrich et al.，Nature．313:756-761 （1985））に似た４つの塩基性アミノ酸（Arg Arg Arg Lys）がある。この配列モチーフはタンパク質分解酵素の開裂部位として機能し得（Barr，P.J.，Cell．66:1-3（1991））、同様な開裂部位がもう１つのRPTP、LARの細胞外ドメインに同定されている（Streuli et al.，EMBOJ．11:897-907（1992）；Yu et al.，Oncogene．7:1051-1057（1992））。前記CAH様ドメインの後には、多くの細胞表面タンパク質に見出されるモチーフである、１つのフィブロネクチン（FN）タイプIII反復が続く。RPTPγのFNタイプIII配列と、他のタンパク質の典型的なFNタイプIII反復の整列を図５に示す。細胞外ドメインの残りの293アミノ酸はCys残基を全く欠いており、３つの領域、（1）そのアミノ酸の32%がSer及びThrであるSer/Thrリッチ領域（残基442〜560 ）、その後の（2）90%の荷電及び極性アミノ酸からなる領域（残基561〜662）、及び（3）いかなる公知の配列モチーフにも類似性を示さない領域にさらに分けられる。従って、FN反復から下流の領域は、CAH様ドメインとFNタイプIII反復とをトランスメンブラン領域から分離するスペーサーとして機能するのかもしれない。 RPTPγの細胞外ドメインの後には23アミノ酸残基からなる典型的なトランスメンブランドメインが続く。殆どの公知のRPTPと同様に、RPTPγの細胞内ドメインは２つのタンデムなホスファターゼドメインを含む（Fischer et al.，Science ．253:401-406（1991））。RPTPγの第２のホスファターゼドメインが位置1351 に、保存Cys残基の代わりにであるが触媒活性に必須のAsp残基を有することは注目すべきことである（Guan et al.，J．Biol．Chem．266:17026-17030（1991）；Pot e t al.，J．Biol．Chem．267:140-143（1992））。興味深いことに、Asp残基がRP TPβ（Kaplan et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．87:7000-7004（1990））及びショウジョウバエホスファターゼ99A（Yang et al.，Cell 67:661-673（1991）；T ian et al.，Cell．67:675-685（1991）；Hariharan etal.，Proc．Natl．Acad ．Sci．88:11266-11270（1991））の同様な位置にも見出されている。さらに、R PTPγの第２の触媒ドメインは、RPTPβの対応する位置に見られるインサートと同一の、15アミノ酸（残基1299〜1313）のインサートを含み（Kaplan et al.，P roc．Natl．Acad．Sci．87:7000-7004（1990））、これまでのところこれらの２つのホスファターゼにユニークなものであるようである。このインサートは、位置1308にTyr残基を含み、この前には２つのAsp残基があり、またVal残基が続いており、これがチロシンキナーゼのリン酸化部位として機能し得ることを示唆している。ヒトRPTPγ及びそのマウス相同体はヌクレオチドレベルでは90%同一で、アミノ酸レベルでは95%同一であり、差異の殆どは保存的な置換である（図４）。細胞質及び細胞外ドメインの両方に顕著に高度な保存が見られる。このヒト及びマウスRPTPγの間の保存の程度はいくつかの他のホスファターゼ、例えばRPTPαの細胞外部分におけるものよりも高い（Sapp et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．87 :6112-6116（1990）；Kaplan et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．87:7000-7004（ 1990）；Krueger et al.，EMBO J．9:3 241-3252（1990）；Matthews et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．87:4444-4448（ 1990））。最も保存された部分は、FN反復（100%同一性）、CAH様ドメイン（97% 同一性）及びSer/Thrリッチドメイン（97%同一性）である。細胞外ドメインの残りは殆ど保存されていない（70%同一性）。Ser/Thrリッチドメインに続く荷電及び極性アミノ酸のクラスターが、配列保存の程度は低いとはいえ、ヒト及びマウスRPTPγの両方に見られることは注目すべきである。CAH様ドメイン、FNタイプI II反復及びSer/Thrリッチドメインにおけるヒト及びマウス配列の同一性の高い程度は、これらの領域が保存された生物学的機能に必要なものであることを示唆している。７．実施例：マウスRPTPγの発現７.１.組織発現及びノーザン分析これまでに記載されたようにして（Vennstrom et al.，Cell．28:135-143（19 82））、オリゴdT選択によりポリA ⁺ RNAを成体マウス組織から調製し、通常の方法を用いてホルムアルデヒド含有ゲル上で分画化し（レーンあたり５μｇ）、 Nytran（Schleicher and Schuell）に移し、マウスRPTPγの第１のホスファターゼドメイン、メンブラン隣接ドメイン、トランスメンブランドメイン及び細胞外部分の最初の部分の全てを包含するマウスクローンMB-8及びMB-122でプロービングした。７.２. インサイチュハイブリダイゼーション新鮮な凍結ラット組織をクリオスタット上で20μmの厚さの切片に切断し、ゼラチン被覆スライド上に溶解載置した。0.1Ｍリン酸ナトリウム（pH 7.4）中の4%パラホルムアルデヒド中で30分間切片を固定し、0.1Ｍリン酸ナトリウム（pH 7.4）で５分間３回30分間、0.1Ｍリン酸ナトリウムで５分間３回、2xSSC中で10分間２回洗浄した。２種の異なるオリゴヌクレオチドプローブ、（1）細胞質ドメインの部分に相補的な51塩基オリゴヌクレオチド、及び（2）細胞外ドメインの部分に相補的な52塩基オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション分析において使用した。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Boehringer Mannheim）を使用して［³⁵S］-dATP（NEN，DuPont）でオリゴヌクレオチド m）を使用して精製した。標識プローブの比活性は５ｘ10⁸〜１ｘ10⁹cpm/μｇであった。50%脱イオンホルムアミド、4xSSC、１xデンハート溶液、500 μg/ml変性サケ精液DNA、250 μg/ml酵母tRNA及び10%硫酸デキストランを含むバッファー中でプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを行った。標識プローブ（１ｘ10⁶cpm/切片）及び10 mMジチオトレイトール（DTT）を含むハイブリダイゼーション溶液中で、45℃において12時間組織をインキュベートした。特異性についてのコントロールは、30倍濃度の非標識オリゴヌクレオチドを加えるか、センスプローブとのハイブリダイゼーションにより、隣接する切片上で行った。ハイブリダイゼーションの後、切片を2xSCCを２回交換して室温で１時間、1 xSCCにより55℃で30分、0.5xSSCにより55℃で30分、0.5xSSCにより室温で15分洗浄し、60%、80%及び100% エタノール中で脱水した。風乾した後、切片を５〜10日間、X-線フィルムに露出した。７.３. 結果及び考察ノーザンブロット分析により、RPTPγは異なるマウス組織中で広く発現されることが示された（図１）。5.5及び8.5kbの２つの主要なRPTPγ転写物は、脳、肺、腎臓、心臓、骨格筋、肝臓、脾臓、及び精巣において検出された。約3.0kbの別のより短い転写物が精巣において検出された。 RPTPγに構造的に関連する２つのRPTPは、RPTPβ／HPTPζ（Krueger et al.， Proc．Natl．Acad．Sci．89:7417-7421（1992））及びショウジョウバエホスファターゼDPTP99A（Tian et al.，Cell 67:675-685（1991）；Yang et al.，Cell ．67:661-673（1991），Hariharan et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．88:11266- 11270（1991））である。これらのホスファターゼは中枢神経系で特異的に発現されるので、新生児及び成体ラットの脳におけるRPTPγの発現パターンをインサイチュハイブリダイゼーションにより分析した。新生児ラットにおいては、発現の最高のレベルは、海馬構成体（hippocampal formation）、中隔及び正中視床核（septal and midline thalamic nuclei）、及び皮質（cortex）において検出された（図2A）。しかし、成体ラット脳においては、RPTPγは海馬構成体において高度に発現されたが（図2B）、中隔及び正中視床核及び皮質においては発現されなかった。細胞質または細胞外ドメインから誘導されたプローブとのハイブリダイゼーションは同様の結果を与えた。30倍濃度の非標識オリゴヌクレオチドの添加により、全ての領域における標識化が完全にブロックされた。さらに、センスプローブとハイブリダイズした隣接する切片においてはシグナルは観察されなかった。これらの結果は２つのプローブが配列特異的な形でmRNAにハイブリダイズすることを示している。新生児ラット脳の中隔及び正中視床核及び皮質における一時的な発現は、RPTP γの発現は発生に関連して制御されており、これらの領域の発生において役割を果たしていることを示している。 RPTPγ及び密接に関連しているRPTPβの発現のパターンが全く異なることは注目すべきである。胎児においては、RPTPβは脳の脳室及び脳室下領域及び脊髄において発現される。成体の脳においては、RPTPβは小脳のプルキンエ細胞層、歯状回、及び側脳室の前角の上衣下層において発現される。８．実施例：マウスRPTPγ遺伝子のクロモソーム位置決定マウスRPTPγをコードする遺伝子座を確定するために、マウスRPTPγの第１の触媒ドメインを含むプローブを使用してマウスの同系交配系中の制限フラグメント長変異体を検索した。TaqI消化DNAのサザンブロット分析により、調べた全ての系統に保有される2.9及び1.8kbの２つのDNAフラグメント、及び2.7kb（C3H/He J，DBA/2J）または2.0kb（調べたその他の全ての系統）のフラグメントが明らかにされた。このDNA変異体の、マウスのAKXD、BXD及びBXH組換え体同系交配系統における遺伝により、クロモソーム14の結合マップの動原体末端に近いOdc-9（6 1系統中８組換え体）及びPlau（49系統中11組換え体）に結合する遺伝子座が確定された（表１）。本発明者らは、前記遺伝子座の記号としてptpg（ホスホチロシンホスファターゼγ）を提案するものであり、これは以前にマウスRPTPαについて割り当てられた記号Ptpaと一貫するものである（Sapp et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．87 :6112-6116（1990））。 10μｇ量の肝臓または脾臓ゲノムDNAをTaqI酵素で消化し、マウスRPTPγの第１触媒ドメインからのプローブを使用してサザンブロッティングにより分析した。９．実施例：RPTPγ構造の分析及びカルボニックアンヒドラーゼドメインのモデル化９.１. カルボニックアンヒドラーゼドメインのモデル化及びエネルギー最小化 RPTPγのカルボニックアンヒドラーゼ（CAH）ドメインを可溶性CAHの配列と整列させた後、Evans＆Sutherland and Silicon Graphicインタラクティブディスプレイで、プログラム“O”に与えられている「突然変異」オプションを使用して、置換、欠失及び挿入の対応を見た（Jones et al.，Acta．Crystallogr．A47 :110-119（1991））。挿入ペプチド及び欠失セグメントに隣接するペプチドに、公知の３次元構造を有するタンパク質から把握される同様のペプチドに最も適合するもので、コンホメーションの情報のデータバンクとして前記プログラム内に記憶されている当初コンホメーションを与えた。挿入あるいは置換された残基の当初側鎖コンホメーションを、Ponder＆Richardsの回転異性体ライブラリーに従って選択した（Ponder et al.，J．Mol．Biol．193:775-791（1987））。この再構築モデルを、プログラム“X-Plor”（Brunger，A.T.，“X-Plor（Version 3.0 ），Manual,”Yale University，New Haven，CT．（1992））及びプログラムCHA RMのエネルギーパラメーターセット、param10.pro及びtoph19.pro（Brooks et a l.，J．Comput．Chem．4:187-217（1983））を使用してエネルギー最小化のサイクルに数回かけた。Cα原子は、CAH構造中のその当初位置の近くに残存するように拘束された。このように誘導されたモデル中の主鎖原子と最初のカルボニックアンヒドラーゼ構造との間のrms偏差は0.7Åである。得られたモデルの全てのPh i/ Psi角はラマチャンドランプロットの許容される領域内のものである。９.２結果及び考察上記したように、RPTPγの細胞外ドメインのアミノ末端領域は前記酵素（CAH ）に対する顕著な配列類似性を有する266アミノ酸領域を含む。CAH酵素は、以下の式に従い、代謝CO₂の水和またはHCO₃の脱水を触媒する。 CO₂＋H₂O ←→ H⁺＋HCO₃ ^- CAHは、CO₂水和について10⁶/秒の極めて効率的なターンオーバー速度を有する遍在的に発現される酵素である。これはある種のエステルを加水分解し、特異的なアルデヒドを水和する。全てのCAHは亜鉛金属結合酵素であり、触媒活性には亜鉛原子が必要である。これまでに７種のCAHが同定されている（Tashian，R.E．B ioEssays 10:186-192（1989）に記載されている）。これらには、（a）細胞質酵素、CAH-１，２及び３、（b）細胞外糖タンパク質CAH-４、（c）ミトコンドリア酵素CAH-５、（d）分泌酵素CAH-６、及び（e）膜結合酵素CAH-７が含まれる。（f）さらに、ワクシニアウィルスもその細胞外部分にCAH様ドメインを有するトランスメンブランタンパク質を含む。ヒト及びマウスRPTPγ中のCAH様ドメインをCAHの別の形態のアミノ酸配列と整列させた（図6A）。配列の比較により、CAHの異なる形態の間の配列の高度な保存の領域に通常マッチする同一のアミノ酸のクラスターが明らかになった。RPTPγのCAHドメインを異なるCAHのそれに整列させるためには挿入及び欠失は殆ど必要なかった。CAHの活性部位を形成する19の残基（Ericksson et al.，Proteins．4:274-282（1988））の11がR PTPγにもみられることは注目に値する。CAHにおいて亜鉛原子を結合する３つの HiS残基（図6Aにおいて矢印の頭部で示した）のうち、位置151の１つのHisのみがRPTPγに保存されており、他の２つはGlu及びGln残基（それぞれ位置149及び1 75）により置き換えられている。RPTPγのCAHドメインは全ての公知のCAHと35〜 40%の配列同一性を共有する（図6B）。この領域のCAHとの顕著な配列類似性に基づき、本発明者らは、公知のCAHの３次元結晶構造中の等価な位置にRPTPγ配列からのアミノ酸を置換することにより、RPTPγ中のこの領域の構造についてモデルを構築した（Ericksson et al.，Pr oteins．4:274-282（1988）；Brookhaven Protein Data Bank中のlca2をエントリー）。この後にエネルギー最小化を行ったところ、Cα原子は最初のCAH構造のその位置に拘束された。直接の構造的な証拠なしには得られるモデルの詳細を評価することは困難であるが、３つの点が、RPTPγドメインの実際の折り畳みに対するその関連性を強く示している。第１に、CAH配列に対するRPTPγ中の全ての欠失及び挿入は、表面領域に位置するものである。１つを除いて全てが明確に規定された２次構造を欠くポリペプチド鎖の範囲にあるものである。即ち、これらの相違の全ては最初のモデルを変形させることなく収容され得る。第２に、RPTPγドメイン中の内部残基の置換は、相同タンパク質のファミリーにおいてよく見られるように（Bordo et al.，J．Mol．Biol．211:975-988（199 0））、CAH中の２つの疎水性コアのきっちりとしたパッキングを維持するパターンに従う（Ericksson et al.，Proteins．4:274-282（1988））。CAH中のいくつかの芳香族残基のRPTPγドメイン中における脂肪族のものによる置換（Phe 66からVal 124へ、Phe 70からLeu 128へ、Phe 93からVal 148へ、及びPhe 176からLe u 233へ）は、亜鉛結合部位に隣接する疎水性コアの芳香族特性をいくらか減じる（Ericksson et al.，Proteins．4:274-282（1988））。これらの相違にもかかわらず、置換（CAHからRPTPγへ）：Ile 59からTrp 116、Val 160からIle 217 及びSer 56からAsnによりきっちりとしたパッキングが維持される。第３に、マウスRPTPγのCAHドメインの配列の観察により、ヒト遺伝子に対する置換もきっちりとパッキングされた疎水性コアの保存のパターンに従うことが判明し、例えば、ヒトRPTPγのIle 165のマウスRPTPγのValへの、ヒトRPTPγの Val 237のマウスRPTPγのIleへの置換である。特に興味をそそられるのは亜鉛結合部位及びRPTPγドメイン中のCAHの活性部位の運命である。配列の整列により、全ての公知のCAHにおいて亜鉛を結合している２つの保存されたHis残基はRPTPγにおいては置換されていることが示される（His 94はGlu 149へ、His 119はGln 175へ）。公知の３次元構造を有するタンパク質における亜鉛結合部位の観察（Vallee et al.，Biochemistry 29:5647- 5659（1990））では、Glnを含むものがないことが判明している。さらに、HisのGlnへの変異の結果としての亜鉛結合能の喪失が成長ホルモンのファミリーにおいて報告されている（Cunningham et al.，Science ．250:1709-1712（1990））。その上、RPTPγのCAHドメインのエネルギー最小化モデルの観察は、残基Glu 149、His 151、Glu 162及びGln 175が、マンガンのような八面体配位遷移金属の結合部位によく見られる（Hardman，K.D．et al.，J ．Molec．Biol．157:69-86（1982））、原子の平面的配列を形成し得ることを示唆している（図７）。。 CAH様ドメインはRPTPβ／HPTPζ（同じ譲受人に譲渡された同時に係属中の米国特許出願第07/654,188号、1991年２月26日出願、本願はこの出願に基づいて優先権を主張している；同じ譲受人に譲渡された同時に係属中の米国特許出願第号、1993年５月10日出願、「新規なレセプタータイプホスホチロシンホスファターゼβ」と題する）のアミノ末端ドメインにも見出されているKrueger et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:7417-7421（1992）。RPTPγ中のCAH様ドメインの顕著な特徴、例えば、きっちりとパックされた疎水性コア及び３つの保存されたHis残基のうちの２つの置換は、RPTPβのCAHドメインにも見られるようである。この類似性はこれらの２つのドメインの間の機能的相似を反映するものであり得る。RPTPγ及びRPTPβのCAHドメインの生物学的役割は知られていない。亜鉛を結合し、CAH活性に重要な３つのHis残基のうち１つしか保存されていないという事実からみて、RPTPγ及びRPTPβのCAHドメインは亜鉛を結合する能力を有していないかもしれないと考えられる。しかし、CAHにおいて亜鉛により占められていた部位が他の遷移金属を結合できるようになり、従って代謝CO₂の水和以外の機能を有することがあり得る。興味深いことに、RPTPγ及びRPTPβの間の相同性は、両方のタンパク質において２つの保存されたCys残基に隣接するFNタイプIII反復の下流中に伸びている。 RPTPγ及びRPTPβ中のこれらの２つのドメインの配列を整列させると（図8A）、約37%の配列同一性が示される。RPTPγ中のFNタイプIII反復の後には、Cys残基を欠き、従ってCAH様ドメインとFN反復をトランスメンブランドメインから分離するスペーサーとなり得ることを特徴とする293アミノ酸の範囲が続く。 RPTPβの２つの形態は両方ともそのままのCAH様ドメイン、及びフィブロネクチンタイプIII反復、そしてその後に続くCysを含まない領域を含むことが同定されている。RPTPβの２つの形態はCysを含まないスペーサーの長さにおいて異なっており、これは長い形態において1048アミノ酸を含み、欠失変異体（dvRPTPβ ）において384アミノ酸を含む。先に指摘した通り、RPTPγとRPTPβとの間の類似性はRPTPγ及びRPTPβの細胞質領域まで伸びている（1993年５月10日出願された、「新規なレセプタータイプホスホチロシンホスファターゼβ」と題する、同じ譲受人に譲渡された同時に係属中の米国特許出願第号を参照）。これらの類似性に基くと、これらの２つのホスファターゼはRPTPの新しいサブファミリーを規定するものであることが示唆される（図8B）。RPTPγ及びRPTPβ の生物学的機能及びこれらのタンパク質におけるCAH様ドメインの役割の解明には、それらの推定の天然リガンド及びこれらのまれなレセプターの結合部位を同定することが必要となり得るであろう。上記に引用した引用文献は、具体的に本明細書の一部とするとしたかどうかにかかわらず、すべて引用により本明細書の一部とする。これまで本発明を充分に説明したが、当業者によれば、本発明の概念及び範囲を逸脱することなく、また過度の実験をすることもなく、等価のパラメーター、濃度及び条件の広い範囲内で本発明を実施できることが理解されるであろう。本発明をその特異的な態様について説明したが、さらに改変できることは理解されるであろう。本願は、一般的に本発明の原理に従い、本明細書の開示から出発して本発明が属する分野において知られこれまで実施されている範囲で到達され、添付の請求の範囲に以下のように記載される本明細書中の必須の特徴に適用し得る、本発明のあらゆる変形、使用及び適合を包含することを意図するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 1/19 8828−4Ｂ 1/21 8828−4Ｂ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｐ 21/08 9358−4ＢＣ１２Ｑ 1/42 6807−4Ｂ 1/68 Ａ 9453−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2ＪＶ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 9284−4ＣＰ 9284−4Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトレセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−γタンパク質または糖タンパク質分子であって、該分子が天然由来のものである場合には、該分子が生来関連するその他のタンパク質または糖タンパク質を実質的に含まない上記分子。２．天然由来でない請求項１に記載の分子。３．天然由来であって、該分子が生来関連するその他のタンパク質または糖タンパク質を実質的に含まない請求項１に記載の分子。４．ヒト由来である請求項１に記載の分子。５．図３および図４に記載の配列番号２のアミノ酸配列をもつ請求項４に記載の分子またはその機能的誘導体。６．請求項１に記載のレセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−γタンパク質をコードするか、あるいはその機能的誘導体をコードする核酸分子であって、該タンパク質または機能的誘導体が天然由来のものである場合には、該核酸分子は該タンパク質または機能性誘導体が生来関連するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を実質的に含まない上記核酸分子。７．ｃＤＮＡである請求項６に記載の核酸分子。８．ゲノムＤＮＡである請求項６に記載の核酸分子。９．図３に記載の配列番号１のヌクレオチド配列をもつ請求項７に記載のＤＮＡ分子。１０．発現ベクターである請求項６に記載の核酸分子。１１．発現ベクターがプラスミドである請求項１０に記載の核酸分子。１２．請求項１１のプラスミドで形質転換された原核宿主。１３．請求項１１のプラスミドで形質転換またはトランスフェクトされた真核宿主。１４．請求項１に記載のレセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−γタンパク質または糖タンパク質、あるいはその機能的誘導体の製造法であって、（ａ）該タンパク質、糖タンパク質または機能的誘導体を培養条件下で発現することができる宿主を培養し；（ｂ）該タンパク質、糖タンパク質または機能的誘導体を発現させ；そして（ｃ）培養物から該タンパク質、糖タンパク質または機能的誘導体を回収する、ことを含む該方法。１５．宿主が原核生物である請求項１４に記載の方法。１６．宿主が真核生物である請求項１５に記載の方法。１７．請求項１に記載のタンパク質または糖タンパク質に特異的な抗体。１８．モノクローナルである請求項１７に記載の抗体。１９．被験者中における請求項６に記載の核酸分子またはその突然変異体の存在を検出する方法であって、（ａ）該被験者からの細胞またはその抽出物を、該正常または該突然変異レセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−γの少なくとも一部をコードするオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーション条件下に接触させ；そして（ｂ）該細胞中の核酸への該プローブのハイブリダイゼーションを測定し、これによって該核酸配列の存在を検出する、ことを含む該方法。２０．工程（ａ）の前に以下の工程：（ｃ）該レセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−γをコードする細胞中のＤＮＡの量を選択的に増幅する、ことをさらに含む請求項１９に記載の方法。２１．レセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−γタンパク質または糖タンパク質の存在を細胞中で検出し、あるいはこれを定量する方法であって、（ａ）該細胞またはその抽出物を請求項１７に記載の抗体と接触させ；そして（ｂ）該抗体の該細胞またはその抽出物との結合を検出し、あるいは結合抗体を定量し、これによってレセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−γタンパク質または糖タンパク質の存在を検出し、あるいはこれを定量する、ことを含む該方法。２２．化学的または生物学的調製物中における請求項１に記載のレセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−γタンパク質、糖タンパク質または誘導体と結合しうる化合物を同定する方法であって、（ａ）該レセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−γタンパク質、糖タンパク質または誘導体、あるいはそのリガンド結合部分を固相マトリックスに結合させ；（ｂ）該化学的または生物学的調製物を固相マトリックスと接触させて化合物を結合させ、次いで未結合物質を洗い流し；そして（ｃ）該固相に結合した該化合物の存在を検出する、ことを含む該方法。２３．請求項１に記載のレセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−γタンパク質、糖タンパク質または機能的誘導体と結合しうる化合物を複合混合物から単離する方法であって、（ａ）該レセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−γまたは機能的誘導体、あるいはそのリガンド結合部分を固相マトリックスに結合させ；（ｂ）複合混合物を該固相マトリックスと接触させて該化合物を結合させ、次いで未結合物質を洗い流し；そして（ｃ）該結合化合物を溶出し、これによって該化合物を単離する、ことを含む該方法。２４．レセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−γの酵素活性を剌激または阻害することのできる薬剤を同定する方法であって、（ａ）該薬剤を、純粋形態、膜調製物形態、または全細胞形態の該レセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−γと接触させ；（ｂ）工程（ａ）の該混合物を十分な時間インキュベートし；（ｃ）該レセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−γの酵素活性を測定し；（ｄ）該酵素活性を該薬剤なしでインキュベートした該レセプター型タンパク質チロシンホスファターゼ−γの酵素活性と比較し、これによって該薬剤が該活性を剌激または阻害するか否かを決定する、ことを含む該方法。