JPH08504188A

JPH08504188A - Trachoma chlamydia synthetic peptide vaccine

Info

Publication number: JPH08504188A
Application number: JP6508299A
Authority: JP
Inventors: デイー．コールドウェル，ハーラン; スー，フア
Original assignee: US Government
Current assignee: US Government
Priority date: 1992-09-18
Filing date: 1993-09-14
Publication date: 1996-05-07
Also published as: EP0662083A1; AU669000B2; AU4925093A; CA2144882A1; WO1994006827A1

Abstract

(57)【要約】脊椎動物中でC．trachomatisに対する免疫学的応答を生成することのできる合成ペプチドを開示する。この合成ペプチドは、ペプチド配列ＡＬＮＩＷＤＲＦＤＶＦＣＴＬＧＡＴＴＧＹＬＫＧＮＳ内に位置する少なくとも１つの保存されたＴヘルパー細胞刺激性エピトープと、ペプチド配列ＦＤＶＴＴＬＮＰＴＩＡＧＡＧＤＶＫ内に位置する少なくとも１つのＢ細胞中和抗体刺激性エピトープとを含む。好適な具体例では、ペプチドは相互に線状に並んだものとし、特に好適な具体例では、Ｔヘルパー細胞刺激性エピトープが、Ｂ細胞中和抗体刺激性エピトープよりペプチドのＮ末端に近いよう配置する。 (57) [Summary] C. in vertebrates Disclosed are synthetic peptides capable of generating an immunological response to trachomatis. This synthetic peptide comprises at least one conserved T helper cell stimulating epitope located within the peptide sequence ALNIWDRFDVFCTLGATTGYLKGNS and at least one B cell neutralizing antibody stimulating epitope located within the peptide sequence FDVTTLNPTIAGAGDVK. In a preferred embodiment, the peptides are linearly aligned with each other, and in a particularly preferred embodiment the T helper cell stimulating epitope is located closer to the N-terminus of the peptide than the B cell neutralizing antibody stimulating epitope. To do.

Description

【発明の詳細な説明】トラコーマクラミジアの合成ペプチドワクチン発明の分野この発明は、Chlamydia trachomatis（トラコーマクラミジア）のワクチンの開発および試験に関する。更に詳しくは、この発明は、その蛋白質から誘導された、保存されたＢ細胞およびＴ細胞エピトープ（抗原決定基）を含む、C．trach omatisに対する合成ペプチドワクチンに向けられたものである。発明の背景 C．trachomatisは、米国だけでも推定３百万人の人々を毎年苦しめている、性的に伝播する疾患（sexually transmitted diseases、ＳＴＤｓ）の原因となる病原体である（Washingtonら、JAMA 257:2070，1987）。女性の場合、下部性器管におけるC．trachomatisの感染は、ファロピオ管へと昇って行き、卵管炎を引起し得る。クラミジア性の卵管炎は卵管の閉塞に至り、不妊症または子宮外妊娠を引起し得る。米国では、クラミジア性の卵管炎の結果、毎年200,000人の女性が不妊症となると見積られている。クラミジアによるＳＴＤｓの制御または予防までも行う方策が大いに必要とされている。 C．trachomatisの単離物の血清型分類により、これらは１５の別個の血清型変種（serovar）と３つの血清型群（serogroup）とに分けられるが（Wangら、Infe ct．Immun．7：356（1973）、およびWangら、J．Infect．Dis．152：791，1985 ）、Ｂ血清型群は、血清型変種Ｂ、Ｂａ、Ｄ、Ｅ、Ｌ１およびＬ２から構成され、中間血清型群は、血清型変種Ｆ、Ｇ、ＫおよびＬ３から構成され、Ｃ血清型群は、血清型変種Ａ、Ｃ、Ｈ、ＩおよびＪから構成される。血清型変種Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、ＪおよびＫは、クラミジアによるＳＴＤｓに最も普通に随伴するものである。ＳＴＤｓを引起したC．trachomatisの８０％以上は、血清型変種Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧにより生じた感染によるものである。（Kuoら、Infect．Immun ．41：865，1983）。１９６５〜１９８２年の間にシアトルの都市部で単離されたC．trachomatis血清型変種の割合は、４６．５％（血清型変種ＤおよびＥ）、２４．６％（血清型変種ＧおよびＦ）、および５〜７％（血清型変種Ｈ、Ｉ、ＪおよびＫ）（４）であった。この血清型変種の分布は過去１０年間に渡って変化しておらず、米国の他の都市部で得られた単離物をも表わしている（Batteiger ら、J．Infect．Dis 159:661，1989）。よって、クラミジアによるＳＴＤｓに対して成功を収めるワクチンは、多重のC．trachomatis血清型変種に対して防御するものでなければならず、血清型変種Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧに対する保証が非常に重要である。クラミジアによるＳＴＤｓに対するワクチンの開発のための最も有望な抗原は、C．trachomatisの約４０ｋＤａの主要外膜蛋白質（major outer membrane pro tein、ＭＯＭＰ）である。これは主たるC．trachomatis血清型分類抗原であり（ Caldwell．H．D．およびR．C．Judd.，Infect．Immun．38：960（1982）、Caldw ell，H．D．ら、Infect．Immun．31：1161（1981）、Caldwell，H．D．とJ．Sch achter，Infect．Immun．35：1024（1982））、クラミジアの中和抗体が記載されている唯一の表面成分である（Zhangら、J．Immunol．138：575（1987）、およびZhangら、Infect．Immun．57：636（1989））。幾つかのC．trachomatis血清型変種のＭＯＭＰ遺伝子が配列決定されており（Pickettら、FEMS Microbial ．Lett．42：185（1987）、Zhang，Y.X.ら、Nucleic Acids Res．18：1061（199 0）、およびHamiltonら、Nucleic Acids Res．17：8366（1989））、アミノ酸の相同性の領域が隣接した対称的に離間した４つの超可変ドメイン（hypervariabl e domains、ＶＤｓ）によって特徴付けられている。ＭＯＭＰのＶＤｓは、種特異的なクラミジアの中和モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の標的であり、中和ｍＡｂｓから調製されたＦａｂ断片は、宿主細胞に対するその付着をブロックすることにより、クラミジアの感染性を阻害する（Su， H.とH．D．Caldwell，Infect．Immun．59（8）：2843，1991）。更に、トリプシンを用いたクラミジアの蛋白質分解は、宿主細胞に付着するその能力の喪失を招き、ＭＯＭＰの表面に露呈されたＶＤｓ内における開裂を伴う。これらの知見は、宿主細胞に対するクラミジアの結合に重要な表面構造としてのＭＯＭＰのＶＤｓの役割を強く支持する。よって、表面に露呈したＭＯＭＰのＶＤｓ内に位置するエピトープは、合成クラミジアワクチンの開発のための合理的な標的である。合成ペプチドワクチンには、ハプテン性の中和Ｂ細胞エピトープの免疫原性を増強すると共に特異的なＴ細胞の免疫学的記憶を惹起させるために、Ｔヘルパー（Ｔ_H）細胞エピトープが組込まれている。既往のＩｇＧ抗体応答の生成のための生体内初回免疫の免疫原として、Ｔ細胞増殖検定において全ＭＯＭＰ配列に対応する重複する合成ペプチドを使用することにより、本発明者らはＡ８と命名した１つのペプチドが、機能性のＴ_H活性を有していることを示した。本発明者らは、Ｂ細胞エピトープを含む血清型変種ＡのＶＤＩ配列と共に相互に線状に並ぶよう（colinearly）合成することにより、ペプチドＡ８が機能性のＴ_H細胞活性を有することを直接示すと共に、ＶＤＩ配列内のＢ細胞エピトープに特異的なＩｇＧ抗体の生産は、キメラ免疫原のＡ８部分に依存することを示した（Suら、JE xp．Med．172：203，1990）。ペプチドＡ８は、ＭＯＭＰのアミノ酸残基１０６〜１３０に対応する。ＭＯＭＰのこの領域は、異なるC．trachomatisのＭＯＭＰｓの間で大部分は配列が変動しない部分であり、その配列内に含まれるＴ_H細胞エピトープは、血清型変種に渡って抗原的に保存されていることを示唆する。この合成ペプチドは血清型変種Ａに対する応答を生成するのに有用であるが、これは他の血清型変種に対しては防御応答を生成しない。したがって、この発明の目的は、ヒトにおいて防御免疫応答を生成するのに適切な、多様なC．trachomatis血清型変種に対する合成ペプチドワクチンを調製することにある。発明の要旨本発明によれば、C．trachomatisの主要外膜蛋白質に由来する保存されたＴヘルパー刺激性エピトープと、C．trachomatisの主要外膜蛋白質に由来する血清型変種の保存されたＢ細胞中和抗体刺激性エピトープとを含む、脊椎動物において C．trachomatisに対する免疫学的応答を生成することのできる合成ペプチドが提供される。この発明の好適な具体例では、Ｔヘルパー細胞刺激性エピトープと、Ｂ細胞中和抗体刺激性エピトープとを相互に線状に並ぶよう配置する。好ましくは、このペプチドは配列番号：３として同定される配列を含む。１つの具体例では、合成ペプチドのＴヘルパー細胞剌激性エピトープは配列番号：１内に位置するものとし、他の具体例では、合成ペプチドは配列番号：２内に位置するものとする。この発明の更に他の好適な具体例では、Ｔヘルパー刺激性エピトープは配列番号：１内に位置するものとし、Ｂ細胞中和抗体刺激性エピトープは配列番号：２内に位置するものとする。好ましくは、配列番号：１内に位置するＴヘルパー刺激性エピトープは、配列番号：２内に位置するＢ細胞中和抗体刺激性エピトープのペプチドＮ末端側にあるものとする。この発明の他の好適な具体例では、ペプチドは、少なくとも１つの種特異的Ｂ細胞中和抗体刺激性エピトープを更に含む。この発明の合成ペプチドが、C．trachomatisの主要外膜蛋白質以外の蛋白質に由来する公知のＴヘルパー刺激性エピトープを更に含むことも企図する。またこの発明によれば、薬学的に許容し得る緩衝液中の配列番号：１内に位置する少なくとも１つの保存されたＴヘルパー刺激性エピトープと、配列番号：２内に位置する少なくとも１つのＢ細胞中和抗体剌激性エピトープとを含む合成ペプチドを脊椎動物に投与し、かつ脊椎動物中でC．trachomatisに対する中和抗体を試験することを含む、脊椎動物においてC．trachomatisに対する防御免疫応答を誘導する方法が提供される。この発明の好適な具体例では、投与工程は、合成ペプチドを筋肉内に注射することを含む。更に加えて、この発明は、配列番号：１内に位置する少なくとも１つの保存されたＴヘルパー細胞刺激性エピトープと、配列番号：２内に位置する少なくとも１つのＢ細胞中和抗体刺激性エピトープとを含む、C．trachomatisに対するワクチンの調製で使用するためのペプチドに関し、ここで前記ペプチドは、ワクチンとして使用するのに薬学的に許容し得る緩衝液中で処方する。最後にこの発明は、合成ペプチドと前記ペプチドに結合した抗体を検出する手段とを含む、サンプル中のC．trachomatisに対する抗体の存在を検出する免疫検定にも関し、ここで前記ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：１に位置する保存されたＴヘルパー細胞剌激性エピトープと、配列番号：２に位置するＢ細胞中和抗体剌激性エピトープとを含む。図面の簡単な説明図１は、Ｂ１０Ｈ−２類遺伝子性マウス株においてペプチドＡ８−ＶＤＩＶの免疫原性を評価する検討をグラフ的にまとめたものである。グラフ（Ａ）は、ペプチドＡ８−ＶＤＩＶにより免疫化したマウスの血清ＩｇＧ抗体応答の詳細を示す。グラフ（Ｂ）は、ペプチドＶＤＩＶ単独で免疫化したマウスの血清ＩｇＧ抗体応答の詳細を示す。ペプチドＡ８−ＶＤＩＶ（黒いブロック）、血清型変種ＤのＭＯＭＰ（斜線のブロック）、およびペプチドＡ８（白いブロック）に対してマウス血清を試験した。図２は、ペプチドＡ８−ＶＤＩＶにより免疫化したＨ−２類遺伝子性マウス株のＩｇＧ抗体応答のペプスキャン（Pepscan）ＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。６匹の全てのマウス株が、Ａ８−ＶＤＩＶ配列内に含まれるセプトマー、種に共通のＬＮＰＴＩＡＧの中和Ｂ細胞エピトープ（点彩したパターンにより示す）を含むオクタペプチドと反応性のＩｇＧ抗体を生産した。図３は、ペプチドＡ８−ＶＤＩＶにより免疫化した異なるＨ−２類遺伝子性マウス株の抗体応答のC．trachomatis血清型変種特異性の比較である。５匹のマウスからの血清をプールし、１：１００に希釈し、ホルマリンで固定した基本小体（elementary bodies、ＥＢｓ）に対するＥＬＩＳＡによって試験した。Ａ₄₀₅における光学密度の値として結果を示す。図４は、３つの代表的なC．trachomatis血清型変種についての、ペプチドＡ８ −ＶＤＩＶにより免疫化したＨ−２類遺伝子性マウス株の血清中和活性の比較である。血清希釈物をクラミジアと共にインキュベートし、クラミジアの感染性を検定するためにＨａＫ細胞のモノレイヤー上に接種した。クラミジアの感染性の％低減として結果を示す。図５は、ペプチドＡ８−ＶＤＩＶにより免疫化したサルのＩｇＧ抗体応答のペプスキャンＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。図６は、図４について記載した手順に従い、３つの代表的なC．trachomatis血清型変種についての、ペプチドＡ８−ＶＤＩＶにより免疫化した３匹の類遺伝子性サルの血清中和活性の比較である。図７は、霊長類における合成ペプチドＡ８−ＶＩおよびＡ８−ＶＤＩＶの免疫原性の比較である。塗漬したバーは、免疫前の血清の吸光度値（Ａ₄₀₅）を示す。点彩したバーは、合成ペプチドによる免疫化の後の血清の吸光度値である。発明の詳細な説明ここで使用するように、「合成ペプチド」という用語は、実験室的な化学合成の図式によって製造されるアミノ酸の線状配列を記載するために使用するものとし、これは好ましくは長さにして１００アミノ酸未満であるが、これらのペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって同様に作製し得るものであることを更に企図する。本発明者らは、先にＤＩＩＩ−Ａ３と命名した中和ｍＡＢを記載したが、これはウエスタンブロットによって、血清型変種Ｋ以外の全てのC．trachomatis血清型変種のＭＯＭＰｓと反応する。エピトープマッピングの検討により、ＤＩＩＩ −Ａ３エピトープはＶＤＩＶに位置決定され（Baehrら、Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 85：4000，1988）、ｍＡｂの精密マッピングにより、ＶＤＩＶ内のセプタペプチド配列²⁹⁸ＬＮＰＴＩＡＧ³⁰⁴としてエピトープが同定された（Morrisonら、1992、「Chlamidia trachomats感染の免疫学：免疫抑制および免疫病原性応答」、「性的に伝播される疾患」中、T．C．Quinn編、レベン・プレス社、ニューヨーク、第５７頁）。ＬＮＰＴＩＡＧの配列は、位置３０３でスレオニンがアラニンを置換した血清型変種Ｋを除いて、C．trachomatis血清型変種の間で変化しない。ウエスタンブロットによれば、ｍＡｂＤＩＩＩ−Ａ３は変性したＭＯＭＰと広く交差反応性であるが、無傷のC．trachomatis基本小体（ＥＢｓ）に対するその免疫反応性はドット免疫ブロットによるものであり、その試験官内中和活性はＢおよび中間血清型群内の血清型変種に制限されており、この高度に保存されたエピトープは、全てのC．trachomatis血清型変種について均一な表面接近性を示さないことを表している。ＬＮＰＴＩＡＧ中和部位は、Ｂおよび中間複合体血清型変種の表面上では接近可能であるが、全ての血清型変種の表面上で接近可能ではないと考えられ、このため広範に防御性のC．trachomatis合成ペプチドワクチンについての適切なエピトープであるとは期待できないであろう。以下に開示するように、本発明者らは、この発明のキメラペプチドが、（i）ＬＮＰＴＩＡＧのＢ細胞エピトープに対する中和抗体の生産を標的とし、（ii）Ｈ− ２において異なるものの多くのマウス株で免疫原性であり、かつ（iii）C．trac homatis生体全体を用いた２回目の抗原投与の後の増大させたＩｇＧ中和応答の生成のために極めて有効な初回免疫の（priming）免疫原である点で、マウスおよび霊長類の両者において良好な免疫原であることを突き止めた。合成ペプチドワクチンの構成この発明の好適な具体例では、Ａ８配列と、抗原的に共通のＬＮＰＴＩＡＧ中和エピトープを含むＭＯＭＰのＶＤＩＶとを互いに連結し、Ａ８−ＶＤＩＶと命名し、マウスおよび霊長類の両者におけるその免疫原的性質を検討した。合成ペプチドを調製する方法を実施例１に示す。ペプチドＡ８−ＶＤＩＶは、ＭＯＭＰのアミノ酸１０６〜１３０（Ａ８）および２９３〜３０９（ＶＤＩＶ）に対応する。残基１０６〜１３０（ＡＬＮＩＷＤＲＦＤＶＦＣＴＬＧＡＴＴＧＹＬＫＧＮＳ）は、機能性のＴ_H細胞エピトープを含む。ペプチドＶＤＩＶは、ＭＯＭＰの残基２９３〜３０９（ＦＤＶＴＴＬＮＰＴＩＡＧＡＧＤＶＫ）に対応し、C．tra chomatisの下位種特異的中和モノクローナル抗体ＤＩＩＩ−Ａ３により認識される配列不変部分、ＬＮＰＴＩＡＧセプタマ−Ｂ細胞エピトープを含む。キメラペプチドＡ８−ＶＤＩＶは、そのＮ末端でＡ８（Ｔ細胞部位）配列を用い、かつそのカルボキシル末端でＶＤＩＶ配列（Ｂ細胞部位）を用い、相互に線状に並ぶよう合成した。Ａ８−ＶＤＩＶペプチドは、両者の種において良好な免疫原であることが認められ、ＬＮＰＴＩＡＧのＢ細胞エピトープに対する抗体の生産を標的とするものであった。重要なことには、抗ペプチド抗体は、クラミジアによるＳＴＤｓの原因となる病原体として疫学的に重要なC．trachomatis血清型変種の試験官内感染性を中和し、このオリゴペプチドが相当なワクチンの潜在能力を有し得ることが示唆された。ここに記載する結果は、実施例１で与えられるＢ細胞とＴ細胞との組合せに随伴するものであるが、ＴヘルパーエピトープおよびＢ細胞エピトープを、Ｂ細胞中和エピトープの前後いずれかに配置したＴヘルパーエピトープに、いずれかの順序で組合せ得ることを企図する。よって、この発明の好適な具体例では、合成ワクチンは、ペプチドのアミノ末端から開始してＴヘルパーエピトープを含み、これがＢ細胞中和エピトープに連結されたものであり、またこの発明の他の好適な具体例では、合成ワクチンは、ペプチドのアミノ末端から開始してＢ細胞中和エピトープを含み、その後にＴヘルパーエピトープが続くものである。加えて、この発明の範囲内において、ＴヘルパーエピトープとＢ細胞中和エピトープとの間を架橋する連結領域は、その分野で公知のいずれかの数の修飾体を組込むことができる。よって、ワクチンのエピトープの間の連結配列として組込まれたペプチド配列は、可撓性の連結領域、剛性の領域、疎水性の領域、親水性の領域等を生成することができよう。保存されたＴヘルパー細胞エピトープと保存されたＢ細胞中和エピトープとの間の連結領域におけるこの種の修飾体は、以下に概説する試験戦略を使用し、C．trachomatisに対する改良されたペプチドワクチンとして試験するのに適切な修飾ペプチドを生成するのに使用できよう。更に、他のＴヘルパーエピトープとＢ細胞中和エピトープとを組合せて、合成ペプチドワクチンの効力を更に進展させることができる。例えば、血清型変種特異的中和エピトープをワクチンに組込み得ることを企図する。この特定のＴヘルパー細胞とＢ細胞中和エピトープとの組合せに対して第２のC．trachomatisの中和エピトープを付加すると、多数の機能を作用させることができよう。１つの例として、付加的な中和エピトープをワクチンに組込んで、特定の血清型変種に対するワクチンの効力を増強することができよう。この発明の範囲内において、この発明のＴヘルパーおよびＢ細胞中和エピトープの好適な組合せに、他のＴヘルパーエピトープを同様に組込み得ることも企図する。他の偶発的な病原体に対する他の合成ワクチンでは、関連しない病原体に由来する蛋白質からのＴヘルパーエピトープが組込まれている。例えば、Thornt onらに対する米国特許第4,882,145号は、ポリペプチド免疫原の免疫原性を増強する方法として、Ｂ型肝炎ウイルスのヌクレオカプシド蛋白質のＴ細胞剌激性領域を組込むことを開示している。 Eldridgeら（Mol．Immunol．28：287，1991およびInfect．Immun．59：2978， 1991）により記載されたもののような生分解性の微小球体に、この発明の好適な合成ワクチン、ペプチドＡ８−ＶＤＩＶを組込み得ることを更に企図する。代替的に、この発明の範囲内において、Sanchezら、Schodelら、またはLipscomb eらの方法を使用し（それぞれProc．Natl．Acad．Sci．USA 86：481，1989、Gen e，99：255，1991およびMol．Microbial．5：1385，1991）、組換えコレラ毒素ＢサブユニットとＡ８−ＶＤＩＶとの遺伝子融合体を構成することにより、Ａ８ −ＶＤＩＶワクチンの防御免疫性を支援し得ることを更に企図する。生体内でのＡ８−ＶＤＩＶ含有ペプチドの免疫学的活性の試験合成ペプチドの調製物を一旦作製したならば、これをマウス、霊長類等の試験動物に投与し、ワクチンの防御免疫応答の効力を検討する。マウスおよび霊長類についてのワクチン接種の様式を、実施例２および実施例３に示す。好ましくは、ペプチドは粘膜性の免疫性を誘導することができ、したがって、その分野で公知の何らかの経口または非経口的な経路を介してペプチドを投与し得ることを企図する。マウスおよび霊長類のような実験動物でのワクチンの試験の後に、このワクチンをヒトに投与し、C．trachomatis関連のＳＴＤｓに対する防御についての効力試験を開始することが予期される。ワクチン開発の当業者であれば、霊長類のワクチン戦略を、ヒトのワクチン接種に適切な戦略に容易に適用することができよう。試験官内での試験を使用し、Ｂ細胞中和活性、およびＴヘルパー細胞に誘導される抗体応答を検討するために、その分野で公知の種々の方法がある。ペプチドＡ８−ＶＤＩＶのＡ８部分のヘルパー機能を検討すると共に、Ａ８配列内に含まれるＴ_H細胞エピトープ（１または複数）の認識におけるＭＨＣクラスＩＩの制限を確認する方法の１つの例として、Ｂ１０Ｈ−２類遺伝子性マウス株におけるペプチドのＢ細胞ＶＤＩＶ部分に応答するＩｇＧ抗体を誘発するその能力について、ペプチドＡ８−ＶＤＩＶを評価した。Ｈ−２において異なる８匹のマウスのＢ１０類遺伝子性株を、ペプチドＡ８−ＶＤＩＶまたはペプチドＶＤＩＶ単独を用いて免疫化した。２回目の免疫化の後に、遊離のペプチドＡ８、ＶＤＩＶおよびＭＯＭＰ全体に対して反応性のＩｇＧ抗体について、ＥＬＩＳＡ（実施例４に示す）によってマウス血清を試験した（図１）。ペプチドＡ８−ＶＤＩＶにより免疫化した８つのマウス株の内の６つ（Ｃ５７ＢＬ／１０（Ｈ−２^b）、Ｂ１０．Ａ（Ｈ−２^a）、Ｂ１０．Ｍ（Ｈ−２^f）、Ｂ１０．ＷＢ（Ｈ−２^ja）、Ｂ１０．ＢＲ（Ｈ−２^k）およびＢ１０．ＳＭ（Ｈ−２^u）は、ＶＤＩＶペプチドおよびＭＯＭＰ全体と反応性の高い力価のＩｇＧ抗体を生産した（図ＩＡ）。オリゴペプチド免疫原のＴ_H細胞部位を含むペプチドＡ８に対するＩｇＧ抗体を生産するマウスはなかった。２つの株、Ｂ１０．Ｄ２（Ｈ−２^d）およびＢ１０．ＰＬ（Ｈ−２ⁿ）は、ペプチドＡ８−ＶＤＩＶによる免疫化の後にペプチドＶＤＩＶまたはＭＯＭＰと反応性のＩｇＧ抗体を生産せず、これらのＨ−２ハプロタイプを有するマウスは、オリゴペプチドのＡ８部分に含まれるＴ_H細胞エピトープを認識できないことが示された。８つのマウス株の内２つ（Ｃ５７ＢＬ／１０およびＢ１０．Ｍ）は、ペプチドＶＤＩＶ単独による免疫化の後に、ペプチドＶＤＩＶおよびＭＯＭＰと反応性のＩｇＧ抗体を生産し（図１Ｂ）、Ｂ細胞エピトープに加えて、ＶＤＩＶ配列も機能性のＴ_H細胞エピトープ（１または複数）を含み、その認識はＨ−２^b−およびＨ−２^fハプロタイプに制限されることが示された。結果を以下の表１にまとめる。概して、これらの知見により、Ａ８−ＶＤＩＶペプチド内に含まれるＴ_H細胞エピトープは、多数のＭＨＣクラス１１ハプロタイプによって認識され、これらのＴ細胞決定基は、ＶＤＩＶ配列内に位置するＢ細胞エピトープに対する抗体生産のために、同じ性質の補助を与えることが示された。マウスの６つの応答する株の血清をペプスキャンＥＬＩＳＡにより試験し（実施例５参照）、生産された抗ＶＤＩＶ抗体が、ＶＤＩＶ配列に含まれる標的とするＬＮＰＴＩＡＧのＢ細胞エピトープと反応性であるか否かを決定した。ＭＯＭＰのＶＤＩＶ配列に対応する一連の重複するオクタペプチド（残基２８８〜３１４）を予め誘導したポリプロピレンピンにより合成し、ＩｇＧ抗体反応性について、プールしたマウス血清の１：２００希釈物に対して個々に試験した。試験したオクタペプチドを図２の底部に示す。それぞれのマウス株は、ＬＮＰＴＩＡＧのＢ細胞エピトープを含むＶＤＩＶオクタペプチドと反応性のＩｇＧ抗体を生産した。興味深いことには、ペプチドＡ８−ＶＤＩＶにより免疫化した６つの株の内の５つが、主として標的とするＬＮＰＴＩＡＧのＢ細胞エピトープを含むＶＤＩＶオクタペプチドに対する増強された免疫反応性を有する抗体を生産した。マウスにおけるペプチドＡ８−ＶＤＩＶの免疫原的性質は極めて勇気付けられるものであり、本発明者らは、準ヒト霊長類におけるペプチドの免疫原性を更に評価することとした。表２は、ペプチドＡ８−ＶＤＩＶによる３回目の免疫の後の３匹のカニクイザル（７０５、７５２および９０７）、およびアジュバントのみを受容した２匹の対照サル（８４２および８８０）の血清ＩｇＧ抗体応答を示す。３匹の免疫化したサルの全てが、ペプチドＶＤＩＶおよびC．trachomatis血清型変種Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＫに対する有意なＩｇＧを生産した。サルの血清は、Ｃ複合体血清型変種Ｈ、ＩまたはＪとは反応性がないか、または弱く反応した。免疫化したサルの血清には、ペプチドＡ−８と反応性のＩｇＧ抗体を生産したものはなかった。アジュバントのみで免疫化した２匹の対照サルは、ペプチドＶＤＩＶまたは試験した異なるC．trachomatis血清型変種のＥＢｓと反応性のＩｇＧを生産しなかった。ＶＤＩＶ配列に対応する一連の重複するオクタペプチドに対するペプスキャンＥＬＩＳＡにより、サルの血清を更に分析した（図５）。３匹の免疫化したサルの全てが、標的とするＬＮＰＴＩＡＧのＢ細胞エピトープを含むＶＤＩＶオクタペプチドに対して強い免疫反応性を示した。これらの知見は、Ａ８−ＶＤＩＶペプチドによる免疫化は、オリゴペプチド免疫原のＶＤＩＶ部分に含まれるＬＮＰＴＩＡＧエピトープに対して抗体応答を優先的に指向させることができ、この標的としたＢ細胞応答性は、マウスおよび霊長類の両者において一貫して観察されることを明確に示した。血清型変種特異性および交差反応性の決定マウスの抗ペプチド抗体が無傷のクラミジアと反応するか否かを確認すると共に、抗ペプチド応答の血清型変種特異性を決定するために、ホルマリンで固定したC．trachomatis血清型変種Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、ＪおよびＫのＥＢｓに対するＥＬＩＳＡによって、マウス血清を試験した（図４）。それぞれのマウス株によって生産された抗ペプチド抗体を、ＥＬＩＳＡによりＢ複合体（血清型変種ＤおよびＥ）、および中間複合体（血清型変種Ｆ、ＧおよびＫ）のＥＢｓと反応させた。同血清は、Ｃ複合体血清型変種Ｈ、ＩおよびＪとは弱く反応するか、または反応性がなかった。結果を以下の表３にまとめる。よって、ペプチドＡ８− ＶＤＩＶにより免疫化した後に生産されたポリクローナル抗体のC．trachomatis 血清型変種特異性は、ｍＡｂＤＩＩＩ−Ａ３の場合と極めて類似していた。例外は、血清がｍＡｂＤＩＩＩ−Ａ３と反応性ではない血清型変種Ｋと反応した点である。抗Ａ８−ＶＤＩＶ抗体の中和活性の試験合成ペプチドに応答して試験動物またはヒト患者において生成した抗ペプチド抗体が機能性の中和抗体であるか否かを確認するために、クラミジアの封入体形成単位（inclusion forming unit、ＩＦＵ）低減検定を使用し、中和活性について血清を試験した。この例では、中和活性について、ワクチン接種したマウスからの血清を試験した（実施例６参照）。中和検定は、C．trachomatisの血清型変種Ｄ、ＧおよびＨを用いて行った。これらの３つの血清型変種は、３つのクラミジアの血清型群を代表するものであるからである。６匹の応答性のマウス株の全てが、C．trachomatis血清型変種ＤおよびＧに対する有意な血清中和活性を有していたが、ＨａＫ細胞については血清型変種Ｈの感染性を中和しなかった（図４）。例外は株Ｂ１０．Ａであり、これは血清型変種Ｈに対して低い中和力価（１：１６）を与えた。よって、無傷のC．trachomatisの２つのＥＢｓを使用するＥＬＩＳＡにより認められた結果と類似して、マウス抗Ａ８−ＶＤＩＶの血清中和活性も下位種特異的であり、Ｂおよび中間完全血清型変種（それぞれＤおよびＧ）のみが中和された。したがって、この発明の好適なペプチドワクチンは、株Ｂ１０．Ａのような低い中和活性を有する株のＢ細胞中和エピトープを更に組込み得ることを企図する。ペプチドＡ８−ＶＤＩＶにより免疫化したサル由来の血清（７０５、７５２および９０７）を、C．trachomatisの感染性を試験官内で中和するその能力について検定した。それぞれの免疫化したサル由来の血清は、C．trachomatis血清型変種ＤおよびＧに対して有意な中和活性を有していたが、血清型変種Ｈの感染性を中和することはできなかった（図６）。よって、ペプチドＡ８−ＶＤＩＶにより免疫化した霊長類は、C．trachomatisの下位種特異性を有する中和抗体を生産した。これらの知見は、マウスにおいて認められたものと一貫するものであり、マウスおよび霊長類の両者において広い交差反応性の中和抗体を惹起するペプチドＡ８−ＶＤＩＶの能力が明らかに示された。中和の検討のまとめを、マウスおよびサルについてそれぞれ表１および２に示す。これらの知見は、全体として、マウスおよびサルの抗Ａ８−ＶＤＩＶ抗体は、試験官内でクラミジアの感染性を中和することができることを示す。Ａ８−ＶＤＩＶペプチドワクチンとＡ８−ＶＤＩ（Ａ）ワクチンとの比較先にペプチドワクチンＡ８−ＶＤＩ（Ａ）が調製されているが、これはこの発明の保存されたＴヘルパー細胞エピトープと、他のＢ細胞中和エピトープとを組合せたものである。以下の検討では、霊長類において多数のC．trachomatis血清型変種に対する防御応答を誘導するその能力について、２つのワクチンを比較した。有利なことに、保存されたＴヘルパーエピトープとＶＤＩＶ誘導中和エピトープとの組合せが、Ａ８−ＶＤＩ（Ａ）と比較して、かつ他のエピトープの組合せと比較して多数の血清型変種に対する広い防御応答を与えた。１ｍｇのペプチドを用い、筋肉内で３下位サルを免疫化した。３回目の免疫化の後１４日目に動物から採血し、多数のC．trachomatis血清型変種に対して反応性のＩｇＧ抗体についてＩＬＩＳＡによりその血清を試験した。結果を図７に示す。塗潰したバーは、免疫前の血清の吸光度値（Ａ₄₀₅）を示す。点彩したバーは、合成ペプチドにより免疫化した後の血清の吸光度値である。ペプチドＡ８− ＶＤＩにより免疫化したサルは、血清型変種Ａに対する抗体のみを生産した。これに対して、ペプチドＡ８−ＶＤＩＶにより免疫化したサルは、多数の血清型変種と反応性のＩｇＧ抗体を生産した。最も有意なことには、サルの抗Ａ８−ＶＤＩＶ抗体は、C．trachomatisが引起す性的に伝播される疾患（ＳＴＤ）に関して最も重要な血清型変種であるC．trachomatis血清型変種Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧに対して強く反応した。抗Ａ８−ＶＤＩＶ血清は、ＥＬＩＳＡにより示されたものと同様の特異性で、クラミジアの感染性を試験官内で中和した。よって、Ａ８−ＶＤＩＶペプチドは、多数の血清型変種に対する広い交差反応性の中和抗体を惹起することができるため、ヒトにおけるC．trachomatisの感染を予防するためのワクチンとして相当な可能性を有する。前記開示したこの発明で提供されるように、この発明は、本国におけるＳＴＤｓに随伴する主要な血清型変種に対して特に有用性を有する。有利には、かつ従来開示された他のC．trachomatisのワクチンと異なり、この発明の合成ペプチドワクチンは、マウスおよび霊長類におけるC．trachomatisの攻撃に対して証明された有用性を有する。このワクチンを用いた検討の結果、このペプチドを用いた免疫化は、ペプチドのＢ細胞部分に対する高い力価の抗体の生産を有効に標的とすることが示された。これらの抗ペプチド抗体は、ＶＤＩＶ配列内の抗原的に共通のＢ細胞エピトープＬＮＰＴＩＡＧに優先的に指向され、その本来の形状でこのエピトープを認識し、かつクラミジアのＳＴＤｓの原因となる病原体として疫学的に重要なC．trachomatis血清型変種の感染性を中和することのできる機能性の抗体であった。合成ペプチドおよび組換えサブユニットの免疫原は、免疫原性が乏しい傾向があり、これらに対して生成した抗体は、ペプチドの一次配列内の標的とするＢ細胞エピトープを認識しない可能性があり、かつ抗ペプチド抗体は、病原体の表面でその本来の形状で標的とするＢ細胞エピトープと反応しない可能性がある。加えて、合成ペプチド免疫原に組込むことのできるＴヘルパー細胞エピトープの数は制限されている。このことも、一般的な集団内でペプチドの免疫原性を低下させ得る。ＨＬＡクラスＩＩの多様性は、Ｔ細胞抗原の認識に影響を与えることが知られているからである（Schwartz，R．H．Curr．Top．Microbial Immunol．13 0：79，1986）。マウスにおけるこれらの検討の結果、ペプチドＡ８−ＶＤＩＶにより免疫化した８匹のＨ−２類遺伝子性マウス株の内６匹が、ペプチドのＢ細胞部分と反応性のＩｇＧ抗体を生産したことが示され、またこれらの知見は、Ａ８配列に含まれるＴ_H細胞エピトープ（１または複数）が、多数のＭＨＣクラスＩＩハプロタイプによって認識されるという仮説と一貫する。マウスの応答性株の内の２匹、Ｃ５７ＢＬ／１０およびＢ１０．Ｍも、ペプチドＶＤＩＶ単独による免疫化の後に抗体を生産したが、これはＢ細胞エピトープに加えて、ＶＤＩＶ配列がＨ−２^b−およびＨ−２^fハプロタイプによってその認識が制限されるＴ_H 細胞エピトープも含むことを示す。よって、ペプチドＡ８−ＶＤＩＶは、機能性のＴ_H活性を誘発する少なくとも２つの別個のエピトープを含む。これらの２つの部位の組合せにより、ペプチドが異種起源のヒトの集団において一般的に認識される可能性が増強される。この仮説と一貫するのは、ペプチドＡ８−ＶＤＩＶにより免疫化した３匹のカニクイザルの全てが、標的とするＬＮＰＴＩＡＧのＢ細胞エピトープに対するＩｇＧ抗体を生産したという知見である。本発明者らは先に、ペプチド免疫原の防御効力を評価するための別の検討の一部として、ペプチドＡ８−ＶＤＩＶを用いて４匹の他のカニクイザルを免疫化した。ワクチン接種した４匹のサルの全てが、ＬＮＰＴＩＡＧ中和エピトープに対するＩｇＧ抗体を生産し、このペプチド免疫原が一般的に認識される可能性が更に支持された。驚くべきことに、本発明者らの知見は、ペプチドＡ８−ＶＤＩＶが、合成ペプチド免疫原に普通に随伴する好ましくない免疫原的特性を共有しないことを示唆している。ペプチドＡ８−ＶＤＩＶによる免疫化が、ＶＤＩＶ配列内のＬＮＰＴＩＡＧエピトープに対する抗体応答を惹起するのに何故これ程有効なのかは理解されていない。Ａ８−ＶＤＩＶペプチドに組込まれたＶＤＩＶ配列の大きさ（１７アミノ酸）のために、このペプチドは、その免疫原性を決定するのに重要な構造要素を維持した可能性がある。本発明者らの知見は、Ａ８−ＶＤＩＶペプチドは、ＶＤＩＶ配列内に含まれる抗原的に共通のＬＮＰＴＩＡＧ中和エピトープに対する抗体応答性を優先的に惹起することのできる極めて有効な免疫原であることを納得のいくように示している。この研究の予期しない知見は、マウスおよびサルの抗Ａ８−ＶＤＩＶ抗血清の両者が、血清型変種Ｋに対して反応性であったことである（図３および表１）。これらのデータは、ウエスタンブロットによっては血清型変種ＫのＭＯＭＰと反応しないｍＡｂＤＩＩＩ−Ａ３の免疫反応性と一貫していない（Zhangら、Infec t．Immun.，（1989）前記参照）。血清型変種Ｋに対するｍＡｂＤＩＩＩ−Ａ３の免疫反応性の欠如は、ＬＮＰＴＩＡ（Ｔ）Ｇ配列の位置３０３におけるアラニン置換のためのスレオニンによって説明することができる。単一のエピトープと反応するｍＡｂＤＩ１１−Ａ３と異なり、ポリクローナル抗Ａ８−ＶＤＩＶ抗体は、ＶＤＩＶ配列に含まれる多数のＢ細胞エピトープと反応した。これは、ＬＮＰＴＩＡＧエピトープを含むオクタペプチドに加えて、マウスおよびサルの両者がＶＤＩＶ配列に対応する他のオクタペプチドと反応性の抗体を生産したことを示す、ポリクローナル抗Ａ８−ＶＤＩＶ応答のペプスキャン分析から明らかである（図２および５）。血清型変種Ｋに対する抗ペプチド抗体の反応性について、どのエピトープ（１または複数）が重要であるかを決定するのは困難であるが、²⁹⁶ ＴＴＬＮＰＴＩ³⁰²配列内に含まれるエピトープ（１または複数）が恐らく可能性のあるものである。この配列は血清型変種ＫのＶＤＩＶに存在し、ペプスキャン分析によれば、抗ペプチド抗体はＴＴＬＮＰＴＩ配列を含むオクタペプチドと免疫反応性であった。このＴＴＬＮＰＴＩ配列もＣ複合体血清型変種Ｈ、ＩおよびＪに共通するが、ＬＮＰＴＩＡＧエピトープと同様に、これはこれらの血清型変種の本来のＥＢ表面上で抗体に接近可能ではないのは明らかである。それにも拘らず、ペプチドによる免疫化により、血清型変種Ｋと反応性の抗体が生産されるという事実は明らかに有利なものである。ペプチドＡ８−ＶＤＩＶが中和抗体を惹起することのできるC．trachomatis血清型変種の数が増加するからである。ペプチドワクチンの可能性のより正確な評価には、その免疫原性および毒性を特定するために、ヒトでのフェース１のワクチンの検討が必要であろう。これに関連して、本発明者らは、オリゴペプチドにより免疫化した霊長類には、アレルギー性または毒性の反応性の臨床徴候を呈したものはないことを観察しており、ペプチドをヒトに安全に投与できることが示唆される。この発明の特定の具体例を詳細に説明すると共に、この発明の範囲内での可能な変形に言及することとする。意図する発明を成功裡に実施するのを同様に可能とする、当業者に利用可能な種々の代替技術および手順がある。実施例１保存されたＢ細胞中和エピトープと保存されたＴ細胞エピトープとを含む合成ワクチンの構成先にSuら、前記により記載されたようにして、自動ペプチド合成装置（モデル４３１Ａ合成装置、アプライド・バイオシステムズ社、フォスター・シティ、ＣＡ）を使用し、ペプチドＶＤＩＶおよびＡ８−ＶＤＩＶを合成した。Ｃ１８カラム（ベックマン・インストルメンツ社、フレルトン、ＣＡ）上で逆相ＨＰＬＣによりペプチドを精製した。合成反応の正確性は、アミノ酸配列決定によって特定した。ペプチドＶＤＩＶは、血清型変種ＢのＭＯＭＰ残基２９３〜３０９（ＦＤＶＴＴＬＮＰＴＩＡＧＡＧＤＶＫ）に対応し、中和ｍＡｂＤＩＩＩ−Ａ３によって認識される配列不変のＬＮＰＴＩＡＧセプタマーエピトープを含む。ペプチドＡ８は、血清型変種ＡのＭＰＭＰ残基１０６〜１３０（ＡＬＮＩＷＤＲＦＤＶＦＣＴＬＧＡＴＴＧＹＬＫＧＮＳ）に対応し、これはマウスを有効に初回免疫して本来の蛋白質を用いた２回目の免疫の後のＭＯＭＰに特異的な既往のＩｇＧ応答を生成するＭＯＭＰのＴ_H細胞エピトープを含む。ペプチドＡ８−ＶＤＩＶは、ペプチドＡ８およびＶＤＩＶのみを含み、そのＮ末端のＡ８配列およびそのカルボキシ末端のＶＤＩＶ配列を用いて相互に線状に並ぶよう合成した。実施例２合成ペプチドによるマウスのワクチン接種Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｎＪ（Ｈ−２^b）、Ｂ１０．Ａ／ＳｇＳｎＪ（Ｈ−２^a）、Ｂ１０．Ｄ２／ｏＳｎＪ（Ｈ−２^d）、Ｂ１０．Ｍ／Ｓｎ（Ｈ−２^f）、Ｂ１０．ＷＢ／Ｓｎ（Ｈ−２^ja）、Ｂ１０．Ｂｒ／ＳｇＳｎＪ（Ｈ−２^k）、Ｂ１０．ＰＬ（７３ＮＳ）／Ｓｎ（Ｈ−２^u）、およびＢ１０．ＳＭ（７０ＮＳ）／Ｓｎ（Ｈ−２^v）マウスは、ジャクソン・ラボラトリイ（バー・ハーバー、ＭＥ）から購入した。８〜１２週齢の両者の性のマウスを実験のために使用した。完全フロインドのアジュバント（ＣＦＡ）中で乳化した５０μｇのペプチドＡ８−ＶＤＩＶまたはペプチドＶＤＩＶ単独の腹膜内注射によって、５匹のマウスの群を免疫化し、不完全フロインドのアジュバント（ＩＦＡ）中の同じ投与量のペプチドを用いて３週間後に追加免疫した。２回目の免疫化の後の２週間目にマウスから採血した。実施例３合成ペプチドによる霊長類の免疫化モーリシャス島を起源とするカニクイザル（Macaca fasicularis）を、これらの検討で使用した。サルは、２年間に渡って安定であった十分な条件の集団の一部のものとした。実験用サルに関する全ての実験は、塩酸ケタミンによる鎮静下で行った。この研究は、「生命科学国立研究協議会の実験動物資源委員会機関による実験動物の事例と使用のための指針」、並びに全ての関連する連邦法規および規制を十分に遵守して行われたものである。関連設備は、実験動物取扱いの許可のための全米協会（ＡＡＡＬＡＣ）により、十分に認定されたものである。リビ（Ribi）アジュバント（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳエマルジョン、リビ免疫科学研究所、ハミルトン、ＭＴ）を用いて乳化した１ｍｇのペプチドＡ８−ＶＤＩＶを用いて、３匹のカニクイザル（７０５、７５２および９０７）を筋肉内注射で免疫化した。２匹の対照サル（８４２および８８０）をアジュバント単独で免疫化した。４週間の間隔で５００μｇのペプチドおよびアジュバントを用いて免疫化を２回繰返した。３回目の免疫化の後にサルから採血した。実施例４抗体応答の血清学的評価 C．trachomatis血清型変種Ｄ（ＵＷ−３／Ｃｘ）、Ｅ（Bour）、Ｆ（ＩＣ−Ｃａｌ−１３）、Ｇ（ＵＷ−５７／Ｃｘ）、Ｈ（ＵＷ−４／Ｃｘ）、Ｉ（ＵＷ−１２／Ｕｒ）、Ｊ（ＷＵ−３６／Ｃｘ）、およびＫ（ＵＷ−３１／Ｃｘ）をＨｅＬａ２２９細胞上で生育させ、Caldwellら、前記によって先に記載されたようにして、密度勾配遠心分離によって感染細胞からクラミジアの基本小体（ＥＢｓ）を精製した。先に記載された方法（Suら、（1990）前記）に従い、酵素共役特異的抗体吸着検定（enzyme linked immunoabsorbent assay、ＥＬＩＳＡ）によって、血清の抗体応答を検定した。簡略に説明すると、０．１５ＭのＮａＣｌを含有する０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）中の１００μｌの合成ペプチド（５μｇ／ｍｌ）、精製したＭＯＭＰ（０．５μｇ／ｍｌ）またはホルマリンで殺したC．tra chomatisのＥＢｓ（１０μｇ／ｍｌ）を用いて、ミクロ滴定プレート（イムノロン２、ダイナテック・ラボラトリイズ社、アレキサンドリア、ＶＡ）を４℃で一夜被覆した。連続的な２倍に希釈したマウスまたはサル血清を二連で試験した。抗マウスおよび抗ヒトＩｇＧアルカリ性ホスファターゼ接合体（γ鎖特異的、ジメド・ラボラトリイズ社、サンフランシスコ、ＣＡ）を使用し、その後に基質（０．１Ｍの２，２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、ｐＨ１０．３（１０ｍｌ）中の５ｍｇのｐ−ニトロフェニルリン酸）を用いて、マウスおよびサルのＩｇＧをそれぞれ検出した。ＥＬＩＳＡリーダー（バイオ・ラド・ラボラトリイズ、リッチモンド、ＣＡ）を用いて、４０５ｎｍの吸光度を測定した。プールした免疫前の血清を陰性対照として使用し、０．３ＯＤ単位の吸光度を与える最も高い血清の希釈率としてＥＬＩＳＡ力価を表現した。実施例５免疫応答に随伴する線状エピトープの特定ワクチン接種したマウスおよびサル由来の血清抗体に結合したＭＯＭＰからの線状エピトープを、Geysenら（J．Immunol．Methods 102：259，1989）により記載されたように、ペプスキャン検定によって同定した。市販のキット（エピトープスキャニングキット、ケンブリッジ・リサーチ・バイオケミカルズ社、ウイルミントン、ＤＥ）を使用し、製造業者の指示に従って、血清型変種ＢのＭＯＭＰのＶＤＩＶ（残基２８８〜３１４）に対応する一連の重複するオクタペプチドを予め誘導したピンにより合成した。ＥＬＩＳＡ検定について前記したのと同一の抗マウスまたはヒトＩｇＧアルカリ性ホスファターゼ接合体を使用するＥＬＩＳＡにより、固相オクタペプチドに対するマウスおよびサルＩｇＧ抗体の反応性を決定した。実施例６ C．trachomatisの感染性の試験官内での中和先に記載されたようにして（Su，H．とH．D．Caldwell，J．Exp．Med．175：2 27 (1992)）、９６穴のミクロ滴定プレート（リンブロ、９６平坦底ウェル、フロー・ラボラトリイズ社、マクリーン、ＶＡ）内で生育させたシリアンハムスター（Syrian hamster）腎臓（ＨａＫ）細胞により、マウスまたはサル抗ペプチド抗体によるC．trachomatisの感染性の試験官内中和を検定した。簡略に説明すると、中和検定の２４時間前に、１０⁵のＨａＫ細胞を９６穴プレートに接種した。２５０ｍＭショ糖、１０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭＬ−グルタミン酸、ｐＨ７．２（ＳＰＧ）中で、C．trachomatis血清型変種Ｄ、ＧおよびＨを希釈し、３×１０⁵〜３×１０⁶の封入体形成単位（ＩＦＵｓ）／ｍｌの最終濃度とした。プールしたマウス血清または個々のサル血清の２倍希釈物を等量のクラミジアと混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。混合物（５０μｌ／穴）を三連でＨａＫ細胞モノレイヤーに接種した。３７℃で２時間インキュベートした後、接種物を除去し、モノレーヤーを洗浄し、再度培地で満たした。３７℃で４８時間インキュベートした後にメタノールを用いてモノレイヤーを固定し、間接蛍光抗体染色によってＩＦＵｓを同定した。血清の中和力価は、クラミジアのＩＦＵｓの％低減として表し、次のように計算した：［（ＩＦＵｓ対照血清−ＩＦＵｓ供試血清）／ＩＦＵｓ対照血清］×１００この発明の特定の具体例を詳細に説明したが、これらの具体例は限定するものではなく例示的なものであり、この発明の真の範囲は添付する請求の範囲によって特定されることは当業者に明らかであろう。配列表１）一般情報：（i）出願人：厚生省長官によって代表される米国政府（ii）発明の名称：トラコーマクラミジアの合成ペプチドワクチン（iii）配列の数：３（v）コンピューター読取り形式：（A）媒体の型：フロッピーディスク（B）コンピューター：IBM PC互換性（C）オペレーティングシステム：PC-DOS/MS-DOS （D）ソフトウエア：PatentIn Release #1.0，Version #1.25 （vii）先行出願データ（A）出願番号：07/947,671 US （B）出願日：1993年９月18日２）配列番号：１についての情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：２５アミノ酸（B）配列の型：アミノ酸（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ペプチド（iii）仮定部分：なし（iv）アンチセンス：なし（v）断片の型：内部（xi）配列の記述：配列番号：１２）配列番号：２についての情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：１７アミノ酸（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ペプチド（iii）仮定部分：なし（iv）アンチセンス：なし（v）断片の型：内部（xi）配列の記述：配列番号：２３）配列番号：３についての情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：４２アミノ酸（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ペプチド（iii）仮定部分：なし（iv）アンチセンス：なし（v）断片の型：Ｎ末端（xi）配列の記述：配列番号：３ Detailed Description of the Invention Trachoma chlamydia synthetic peptide vaccine Field of the invention This invention is a vaccine of Chlamydia trachomatis Regarding development and testing. More specifically, this invention is derived from the protein. And containing conserved B cell and T cell epitopes (antigenic determinants). trach It is directed to a synthetic peptide vaccine against omatis. Background of the Invention C. trachomatis afflicts an estimated 3 million people each year in the United States alone, sex Cause sexually transmitted diseases (STDs) It is a pathogen (Washington et al., JAMA 257: 2070, 1987). For women, lower genitals C. in the tube The trachomatis infection rises to the fallopian tubes and causes salpingitis. Can occur. Chlamydial salpingitis leads to obstruction of the fallopian tubes, resulting in infertility or ectopic pregnancy Can be caused. 200,000 women each year in the United States as a result of chlamydial salpingitis Is estimated to be infertile. Control or prevention of STDs by Chlamydia There is a great need for measures to be taken. C. By serotyping the isolates of trachomatis, these resulted in 15 distinct serotypes. It can be divided into species (serovar) and three serogroups (Wang et al., Infe. ct. Immun. 7: 356 (1973), and Wang et al. Infect. Dis. 152: 791, 1985 ), The B serogroup consists of serovars B, Ba, D, E, L1 and L2. , The intermediate serotype group is composed of serotype variants F, G, K and L3, and the C serotype group Is composed of serovars A, C, H, I and J. Serovars D, E, F , G, H, I, J and K are most commonly associated with STDs by Chlamydia Things. C. causing STDs Over 80% of trachomatis is serovar D , E, F or G caused by the infection. (Kuo et al., Infect. Immun ． 41: 865, 1983). Isolated in urban areas of Seattle between 1965 and 1982 C. The percentage of trachomatis serovars was 46.5% (serovars D and E), 24.6% (serovars G and F), and 5-7% (serovars H, I, J) And K) (4). The distribution of this serovar has changed over the last decade And also represents isolates obtained in other urban areas of the United States (Batteiger Et al., J. Infect. Dis 159: 661, 1989). Therefore, against STDs by Chlamydia The successful vaccine is a multiple C. Protects against trachomatis serovars Must be one, and the guarantee against serovars D, E, F and G is very high is important. The most promising antigen for the development of a vaccine against STDs by Chlamydia is , C. A major outer membrane protein of trachomatis of about 40 kDa (major outer membrane pro tein, MOMP). This is the main C. trachomatis serotyping antigen ( Caldwell. H. D. And R. C. Judd., Infect. Immun. 38: 960 (1982), Caldw ell, H. D. Infect. Immun. 31: 1161 (1981), Caldwell, H .; D. And J. Sch achter, Infect. Immun. 35: 1024 (1982)), a neutralizing antibody of Chlamydia is described. (Zhang et al., J. Immunol. 138: 575 (1987), And Zhang et al., Infect. Immun. 57: 636 (1989)). Some C. trachomatis blood The MOMP gene of a clear variety has been sequenced (Pickett et al., FEMS Microbial ． Lett. 42: 185 (1987), Zhang, Y.X. et al., Nucleic Acids Res. 18: 1061 (199 0), and Hamilton et al., Nucleic Acids Res. 17: 8366 (1989)) of amino acids Four symmetrically spaced hypervariable domains with adjacent regions of homology (hypervariabl e domains, VDs). MOMP VDs are species-specific chlamydia neutralizing monoclonal antibodies (mA Fab fragment prepared from neutralizing mAbs, which is the target of Block the attachment of Chlamydia by blocking its attachment (Su, H. and H. D. Caldwell, Infect. Immun. 59 (8): 2843, 1991). In addition, trypsi Proteolysis of Chlamydia using a protein results in the loss of its ability to attach to host cells. Associated with cleavage within VDs exposed on the surface of MOMP. These findings , VD of MOMP as a surface structure important for chlamydia binding to host cells strongly support the role of s. Therefore, it is located within the VDs of MOMP exposed on the surface. Ru Epitopes are rational targets for the development of synthetic Chlamydia vaccines. Synthetic peptide vaccines have the immunogenicity of haptenizing neutralizing B cell epitopes. T helper to enhance and elicit specific T cell immunological memory (T_H) Cellular epitopes are incorporated. For the generation of previous IgG antibody responses As an immunogen for in vivo primary immunization of By using the corresponding overlapping synthetic peptides, we named A8. Only one peptide has a functional T_HIt was shown to have activity. The inventors Are aligned with each other along with the VDI sequence of serovar A containing the B cell epitope. Peptide (A8) has a functional T_HCell activity And I specific for B cell epitopes within the VDI sequence. Production of the gG antibody was shown to be dependent on the A8 portion of the chimeric immunogen (Su et al., JE. xp. Med. 172: 203, 1990). Peptide A8 has amino acid residue 106 of MOMP Corresponding to ~ 130. This region of MOMP has different C.I. MOMP of trachomatis Most of s is the part where the sequence does not change, and T contained in the sequence._Hcell Epitopes suggest that they are antigenically conserved across serovars. This , Which is useful in generating a response to serovar A, Does not produce a protective response against other serovars. Therefore, the object of this invention is suitable for generating a protective immune response in humans. Pitiful and diverse C. Preparing a synthetic peptide vaccine against trachomatis serovars There is something to do. Summary of the invention According to the invention, C.I. Conserved T derived from the major outer membrane protein of trachomatis A luper-stimulating epitope and C.I. Serotypes derived from major outer membrane proteins of trachomatis In a vertebrate, comprising a variant conserved B cell neutralizing antibody stimulating epitope C. Proposed synthetic peptides capable of generating an immunological response to trachomatis Provided. In a preferred embodiment of the present invention, a T helper cell stimulating epitope, The B cell neutralizing antibody stimulating epitopes are arranged so as to be linearly aligned with each other. Preferably Includes the sequence identified as SEQ ID NO: 3. In one concrete example Is a synthetic peptide T-helper cell stimulatory epitope located within SEQ ID NO: 1. In other embodiments, the synthetic peptide is located within SEQ ID NO: 2. To do. In yet another preferred embodiment of the invention, the T helper stimulating epitope is It should be located within column number 1 and the B cell neutralizing antibody stimulating epitope is SEQ ID NO: : It shall be located within 2. Preferably, the T helper located within SEQ ID NO: 1 -The stimulatory epitope is a B cell neutralizing antibody stimulating epitope located within SEQ ID NO: 2. Of the peptide at the N-terminal side of the peptide. In another preferred embodiment of the present invention, The peptide further comprises at least one species-specific B cell neutralizing antibody stimulating epitope. Including. The synthetic peptides of this invention are C.I. Proteins other than major outer membrane proteins of trachomatis It is also contemplated to further include known T helper stimulating epitopes of quality origin. Also according to the invention, the position within SEQ ID NO: 1 in a pharmaceutically acceptable buffer is At least one conserved T helper stimulating epitope, SEQ ID NO: 2 A synthetic peptide comprising at least one B cell neutralizing antibody stimulatory epitope located within The peptide was administered to a vertebrate and C. Neutralizing antibody against trachomatis C. in vertebrates, including testing C. Protective immune response against trachomatis A method of inducing is provided. In a preferred embodiment of this invention, the step of administering is synthetic. Injecting the peptide intramuscularly. In addition, the invention provides at least one conserved sequence located within SEQ ID NO: 1. Selected T helper cell stimulating epitope and at least located within SEQ ID NO: 2 C. containing one B cell neutralizing antibody stimulating epitope. Waku against trachomatis A peptide for use in the preparation of tin, wherein said peptide is a vaccine Formulated in a pharmaceutically acceptable buffer for use as. Finally, the present invention provides a method for detecting synthetic peptides and antibodies bound to the peptides. C. in the sample, including steps and. Immunoassay to detect the presence of antibodies to trachomatis Also in which the amino acid sequence of said peptide is located in SEQ ID NO: 1. Existing T helper cell stimulatory epitopes and in B cells located in SEQ ID NO: 2 Japanese antibody provocative epitopes are included. Brief description of the drawings FIG. 1 shows the peptide A8-VDIV in the B10H-2 genetic mouse strain. It is a graphical summary of studies for evaluating immunogenicity. Graph (A) shows Details of serum IgG antibody response of mice immunized with peptide A8-VDIV. You Graph (B) shows serum IgG anti-antibody in mice immunized with peptide VDIV alone. Details of body response are shown. Peptide A8-VDIV (black block), serovar D Against MOMP (shaded block) and peptide A8 (white block) Mouse sera were tested. FIG. 2 shows the H-2 family genetic mouse strain immunized with the peptide A8-VDIV. The result of the Pepscan ELISA analysis of the IgG antibody response of is shown. 6 All mouse strains are common to the septomers, species contained within the A8-VDIV sequence LNPTIAG neutralizing B cell epitopes (indicated by a stippled pattern) of An IgG antibody reactive with the murine octapeptide was produced. FIG. 3 shows the different H-2 gene genotypes immunized with the peptide A8-VDIV. C. of the antibody response of the Us strain. Comparison of trachomatis serovar variants specificity. Five mau Sera from sera were pooled, diluted 1: 100 and fixed with formalin. (Elementary bodies, EBs) by ELISA. A₄₀₅To The results are shown as the value of the optical density. Figure 4 shows three representative C.I. Peptide A8 for trachomatis serovar -Comparing the serum neutralizing activity of H-2 family mouse strains immunized with VDIV is there. Incubate serum dilutions with Chlamydia to prevent Chlamydia infectivity HaK cells were seeded on monolayers for assay. Chlamydia infectious Results are shown as% reduction. FIG. 5 shows the IgG antibody response pattern of monkeys immunized with the peptide A8-VDIV. The result of a push scan ELISA analysis is shown. FIG. 6 follows the procedure described for FIG. trachomatis blood Three isogenes immunized with the peptide A8-VDIV for the clear variety It is a comparison of the serum neutralizing activity of sex monkeys. Figure 7: Immunization of synthetic peptides A8-VI and A8-VDIV in primates. It is a comparison of the originality. The bar soaked is the absorbance value (A₄₀₅) Indicates . The stippled bar is the absorbance value of serum after immunization with synthetic peptides. Detailed Description of the Invention As used herein, the term "synthetic peptide" refers to laboratory chemical synthesis. Used to describe the linear sequence of amino acids produced by the scheme of However, it is preferably less than 100 amino acids in length, but these peptides Further contemplate that the same may be produced by recombinant DNA technology. It We have previously described a neutralizing mAb named DIII-A3. By Western blot for all C. trachomatis serum Reacts with type variants of MOMPs. By studying epitope mapping, DIII The A3 epitope has been localized to VDIV (Baehr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. ． USA 85: 4000, 1988), by precise mapping of mAb, septa in VDIV Peptide sequence²⁹⁸LNPTIAG³⁰⁴Epitope was identified as (Morrison et al. , 1992, "Immunology of Chlamydia trachomats Infection: Immunosuppression and Immunopathogenic Responses" , "Sexually Transmitted Diseases", T.W. C. Quinn, Leven Press, New York, page 57). The sequence of LNPTIAG is threonine at position 303 With the exception of serovar K which replaced nin. Varying among trachomatis serovars Absent. According to Western blot, mAb DIII-A3 was denatured MOMP. Broadly cross-reactive with C. for trachomatis elementary bodies (EBs) Its immunoreactivity is due to dot immunoblot and its neutralizing activity in the test Is restricted to serovars within the B and intermediate serogroups and is highly conserved The epitopes for all C. Uniform surface accessibility for trachomatis serovars It means that it is not shown. LNPTIAG Neutralization Site is B and Intermediate Complex Blood Accessible on the surface of the clear varieties, but accessible on the surface of all serovars It is believed that this is not the case, and for this reason it has broadly protective C. trachomatis synthetic peptide One would not expect to be a suitable epitope for tin. As disclosed below, the present inventors have found that the chimeric peptide of the present invention comprises (i) Targeting the production of neutralizing antibodies against the B cell epitope of LNPTIAG, (ii) H- 2 are immunogenic in many mouse strains but differ in 2 and (iii) C. trac homatis of increased IgG neutralizing response after second challenge with whole organism It is a highly effective priming immunogen for generation, and therefore mouse and mouse And found to be a good immunogen in both primates. Composition of synthetic peptide vaccine In a preferred embodiment of the invention, the A8 sequence and LNPTIAG in an antigenically common The VDIV of MOMP containing the sum epitope is linked to each other, and A8-VDIV and And examined its immunogenic properties in both mice and primates. Synthetic A method for preparing a peptide is shown in Example 1. Peptide A8-VDIV is MOMP Corresponding to amino acids 106-130 (A8) and 293-309 (VDIV) of It Residues 106-130 (ALNIWDRFDVFCTLGATTGYLKGN S) is T of functionality_HContains cellular epitopes. The peptide VDIV Corresponding to residues 293-309 (FDVTTLNPTIAGAGDVK), C.I. tra Recognized by subspecies-specific neutralizing monoclonal antibody DIII-A3 of chomatis Sequence invariant, LNPTIAG septum-B cell epitope. Chimerape Peptide A8-VDIV uses the A8 (T cell site) sequence at its N-terminus and Use the VDIV sequence (B cell site) at the carboxyl terminus of Synthesized. A8-VDIV peptide is a good immunogen in both species Targeting the production of antibodies against the BNP epitope of LNPTIAG Was to be. Importantly, the anti-peptide antibody is S C. which is epidemiologically important as a causative agent of TDs. Trials of trachomatis serovars Neutralizing in-vitro infectivity, this oligopeptide has considerable vaccine potential It was suggested to get. The results described here are consistent with the combination of B and T cells given in Example 1. With a T helper epitope and a B cell epitope. Either of the T helper epitopes placed before or after the neutralizing epitope It is contemplated that they may be combined in order. Thus, in a preferred embodiment of the present invention, synthetic The vaccine contains a T helper epitope starting from the amino terminus of the peptide, This is linked to a B cell neutralizing epitope and is also another preferred embodiment of this invention. In certain embodiments, the synthetic vaccine starts with the amino terminus of the peptide and neutralizes B cells. An epitope, followed by a T helper epitope. in addition, Within the scope of this invention, a T helper epitope and a B cell neutralizing epitope The linking region bridging between should incorporate any number of modifications known in the art. Can be. Therefore, the pep The tide array has flexible connecting regions, rigid regions, hydrophobic regions, hydrophilic regions, etc. Could be generated. Conserved T helper cell epitope and conserved B Modifications of this kind in the junction region with the cell neutralizing epitope are outlined below. C. using a test strategy As an improved peptide vaccine against trachomatis Can be used to generate modified peptides suitable for testing. Furthermore, by combining other T helper epitopes with B cell neutralizing epitopes, synthesis The efficacy of peptide vaccines can be further developed. For example, serovar It is contemplated that foreign neutralizing epitopes may be incorporated into the vaccine. This particular T-hell For the combination of the Per cell and B cell neutralizing epitope a second C. in trachomatis The addition of sum epitopes could serve multiple functions. One example As an alternative, additional neutralizing epitopes could be incorporated into the vaccine to target specific serovars. Could enhance the efficacy of the vaccine. Within the scope of this invention, the T helper and B cell neutralizing epitopes of this invention are It is also contemplated that other T helper epitopes may be similarly incorporated into suitable combinations of groups. To do. Other synthetic vaccines against other accidental pathogens have The T helper epitope from the derived protein has been incorporated. For example, Thornt US Pat. No. 4,882,145 to On et al. enhances immunogenicity of polypeptide immunogens. As a method of controlling the T cell stimulant region of the nucleocapsid protein of hepatitis B virus, It discloses that the area is incorporated. Eldridge et al. (Mol. Immunol. 28: 287, 1991 and Infect. Immun. 59: 2978, 1991) to biodegradable microspheres such as those described in 1991). It is further contemplated that the synthetic vaccine, peptide A8-VDIV, may be incorporated. Alternative Within the scope of this invention, Sanchez et al., Schodel et al., Or Lipscomb Using the method of e et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 481, 1989, Gen, respectively. e, 99: 255, 1991 and Mol. Microbial. 5: 1385, 1991), recombinant cholera toxin By constructing a gene fusion between the B subunit and A8-VDIV, A8 -It is further contemplated that the protective immunity of the VDIV vaccine may be supported. Examination of immunological activity of A8-VDIV-containing peptide in vivo Once a synthetic peptide preparation is prepared, it can be tested in mice, primates, etc. It is administered to animals and the efficacy of the vaccine's protective immune response is examined. Mouse and primate The mode of vaccination for is shown in Examples 2 and 3. Preferably , Peptides can induce mucosal immunity and are therefore publicly known in the field. It is contemplated that the peptide may be administered via any of the known oral or parenteral routes. Figure. After testing the vaccine in laboratory animals such as mice and primates The vaccine is administered to humans and C.I. About protection against trachomatis-related STDs It is expected to start the efficacy test of. If you are a person skilled in vaccine development, Vaccination strategies can be easily applied to the appropriate strategies for human vaccination I can do it. Using an in-laboratory test, B cell neutralizing activity, and T helper cell induced There are various methods known in the art for investigating antibody responses that are generated. peptide The helper function of the A8 portion of A8-VDIV was examined and included in the A8 sequence. T_HControl of MHC class II in recognition of cellular epitope (s) As one example of the method for confirming the restriction, in the B10H-2 genetic mouse strain Its ability to elicit IgG antibodies in response to the B cell VDIV portion of the peptide The peptide A8-VDIV was evaluated. Of 8 mice that differ in H-2 B10 type genetic strain, peptide A8-VDIV or peptide VDIV alone Used to immunize. After the second immunization, free peptide A8, VDIV and And an IgG antibody reactive against whole MOMP by ELISA (see Example 4). Mouse sera were tested by (as shown) (FIG. 1). By the peptide A8-VDIV 6 out of 8 immunized mouse strains (C57BL / 10 (H-2^b), B10 ． A (H-2^a), B10. M (H-2^f), B10. WB (H-2^ja), B1 0. BR (H-2^k) And B10. SM (H-2^u) Is a VDIV peptide and And a titered IgG antibody that was highly reactive with whole MOMP (Fig. IA). Oligo Peptide immunogen T_HProduces IgG antibody against peptide A8 containing cell site There was no mouse. Two strains, B10. D2 (H-2^d) And B10. PL (H-2ⁿ) Is the peptide VDIV after immunization with the peptide A8-VDIV Alternatively, these H-2 haplotypes were not produced without producing IgG antibodies reactive with MOMP. Mice with T have a T contained in the A8 portion of the oligopeptide._HCellular epitope It was shown to be unrecognizable. 2 out of 8 mouse strains (C57BL / 10 and And B10. M) is the peptide VDI after immunization with peptide VDIV alone. Produces IgG antibodies reactive with V and MOMP (FIG. 1B) and B cell epitopes In addition to the VDIV sequence, the functional T_HContains cellular epitope (s) , Its recognition is H-2^b-And H-2^fShown to be restricted to haplotypes . The results are summarized in Table 1 below. Overall, these findings indicate that A8-VDIV T contained in the peptide_HCellular epitopes are associated with a large number of MHC class 11 haplota These T cell determinants are recognized by Ip and are located in the VDIV sequence B Shown to provide assistance of the same nature for the production of antibodies to cellular epitopes It was The sera of 6 responding strains of mice were tested by Pepscan ELISA (actual (See Example 5), the produced anti-VDIV antibody is the target contained in the VDIV sequence. Was determined to be reactive with the B cell epitope of LNPTIAG. MOM A series of overlapping octapeptides (residues 288-31 corresponding to the VDIV sequence of P. 4) was synthesized with a pre-derived polypropylene pin to determine IgG antibody reactivity. And were individually tested against a 1: 200 dilution of pooled mouse serum. Tested The octapeptides are shown at the bottom of FIG. Each mouse strain is LNPTIAG Of IgG antibody reactive with VDIV octapeptide containing B cell epitope did. Interestingly, the six strains immunized with the peptide A8-VDIV 5 of which are VDs that contain primarily targeted B cell epitopes of LNPTIAG Antibodies with enhanced immunoreactivity to IV octapeptide were produced. The immunogenic properties of peptide A8-VDIV in mice are highly encouraging The present inventors have further investigated the immunogenicity of peptides in quasi-human primates. It was decided to evaluate. Table 2 shows after the third immunization with the peptide A8-VDIV. Of three cynomolgus monkeys (705, 752 and 907) and adjuvant 2 shows serum IgG antibody response of two control monkeys (842 and 880) You All three immunized monkeys received the peptides VDIV and C.I. trachomatis blood Produced significant IgG against the clear variants D, E, F, G and K. Monkey serum Are not reactive or weakly reactive with C-complex serovars H, I or J. It was The immunized monkey serum produced IgG antibody reactive with peptide A-8. There was nothing. Two control monkeys immunized with adjuvant alone received the peptide VDIV or different C. Reactivity of trachomatis serovar EBs with I Did not produce gG. Pepscan for a series of overlapping octapeptides corresponding to VDIV sequences The sera of monkeys were further analyzed by ELISA (Figure 5). 3 immunized monkeys All contain VDIV octa containing the targeted B cell epitope of LNPTIAG. It showed strong immunoreactivity to the peptide. These findings are based on the A8-VDIV Immunization with Ptide was carried out using LNP contained in the VDIV portion of the oligopeptide immunogen. It is possible to preferentially direct the antibody response to the TIAG epitope and Targeted B cell responsiveness was consistently observed in both mice and primates It was clearly shown. bloodDetermination of clear-type variant specificity and cross-reactivity Confirming whether mouse anti-peptide antibodies react with intact Chlamydia , Fixed with formalin to determine the serovar-specificity of the anti-peptide response. C. Paired with EBs of trachomatis serovars D, E, F, G, H, I, J and K Mouse sera were tested by an ELISA (Fig. 4). Each mouse strain The anti-peptide antibody produced by B-complex (serotype variant D and E), and with EBs of the intermediate complex (serovars F, G and K) Let The sera react weakly with C-complex serovars H, I and J, or Or was not reactive. The results are summarized in Table 3 below. Therefore, the peptide A8- C. of the polyclonal antibody produced after immunization with VDIV. trachomatis Serovar variant specificity was very similar to that of mAb DIII-A3. exception In that serum reacted with serovar K that was not reactive with mAb DIII-A3. is there. Test for neutralizing activity of anti-A8-VDIV antibody Anti-peptides produced in test animals or human patients in response to synthetic peptides To determine if the antibody is a functional neutralizing antibody, the inclusion body form of Chlamydia Neutralization activity was assessed using an inclusion forming unit (IFU) reduction assay. The serum was tested. In this example, is the vaccinated mouse for neutralizing activity? These sera were tested (see Example 6). The neutralization test is C.I. Serotyping of trachomatis Performed with species D, G and H. These three serovars have three chlamydia This is because it represents the serotype group of Zia. All 6 responsive mouse strains C. Has significant serum neutralizing activity against trachomatis serovars D and G However, it did not neutralize the infectivity of serovar H for HaK cells (FIG. 4). ). The exception is stock B10. A, which has a low neutralization titer against serovar H (1 : 16) was given. Therefore, the intact C.I. E using two EBs of trachomatis Serum neutralization of mouse anti-A8-VDIV, similar to the results seen by LISA. The activity is also subspecies-specific, with B and intermediate complete serotype variants (D and G, respectively). ) Only was neutralized. Therefore, a preferred peptide vaccine of this invention is strain B 10. Further incorporating a B cell neutralizing epitope of a strain having low neutralizing activity such as A Intended to get. Sera from monkeys immunized with peptide A8-VDIV (705, 752 and And 907) to C. For its ability to neutralize trachomatis infectivity in the laboratory Was tested. The sera from each immunized monkey were C.I. trachomatis serovar Although it had significant neutralizing activity against species D and G, It could not be neutralized (Fig. 6). Therefore, with the peptide A8-VDIV The immunized primates are C. Producing neutralizing antibody with subspecies specificity of trachomatis It was These findings are consistent with those found in mice. Peptides that elicit broad cross-reactive neutralizing antibodies in both mouse and primate The ability of A8-VDIV was clearly demonstrated. A summary of neutralization studies is shown in Tables 1 and 2 for mice and monkeys, respectively. You Overall, these findings indicate that mouse and monkey anti-A8-VDIV antibodies , Show that it is possible to neutralize the infectivity of Chlamydia in the laboratory. Comparison of A8-VDIV peptide vaccine and A8-VDI (A) vaccine The peptide vaccine A8-VDI (A) was prepared earlier, but this A clear conserved T helper cell epitope and other B cell neutralizing epitopes are combined. It is a combination. The study below shows that a large number of C. trachomatis serum Comparing the two vaccines for their ability to induce a protective response against type variants It was Advantageously, conserved T helper epitopes and VDIV-induced neutralizing epitopes Combination with other epitopes compared to A8-VDI (A) and with other epitopes It gave a broad protective response against a large number of serotype variants compared to vase. 1 mg of peptide was used to immunize the 3 sub monkeys intramuscularly. Third immunization Animals were bled 14 days after and a large number of C. Response to trachomatis serovar The sera were tested by ILISA for sex IgG antibodies. The results are shown in Figure 7. You The filled bar indicates the absorbance value (A of the serum before immunization).₄₀₅). Bar painted Is the absorbance value of serum after immunization with synthetic peptide. Peptide A8- Monkeys immunized with VDI produced only antibodies to serovar A. This In contrast, monkeys immunized with the peptide A8-VDIV showed a large number of serotype changes. An IgG antibody reactive with the species was produced. Most significantly, monkey anti-A8-VD The IV antibody is C.I. Regarding sexually transmitted disease (STD) caused by trachomatis The most important serovar, C. Paired with trachomatis serovars D, E, F and G And reacted strongly. Anti-A8-VDIV sera were identified as those shown by ELISA. Chlamydia infectivity was neutralized in-house with similar specificity. Therefore, A8-V DIV peptide elicits broad cross-reactive neutralizing antibodies against multiple serovars C. in humans because it can Ways to prevent trachomatis infection It has considerable potential as a cutin. As provided in the above-disclosed invention, the present invention provides an STD It has particular utility against the major serotype variants associated with s. Advantageous and compliant Other C. Unlike the trachomatis vaccine, the synthetic peptide of this invention The vaccine was used for C. elegans in mice and primates. Proved against trachomatis attacks Have useful utility. As a result of examination using this vaccine, this peptide was used Immunization effectively targets the production of high titer antibodies to the B cell portion of the peptide. Was shown to do. These anti-peptide antibodies are antigenically covalent within the VDIV sequence. It is preferentially directed to the common B cell epitope LNPTIAG and Is recognized as a pathogen that recognizes the E. coli epitope and causes STDs in Chlamydia C. Functionality capable of neutralizing infectivity of trachomatis serovar Antibody. Immunogens of synthetic peptides and recombinant subunits tend to be poorly immunogenic. And antibodies raised against these target B-cells within the primary sequence of the peptide. Cell peptide may not recognize the cytoplasmic epitope, and the anti-peptide antibody Therefore, it may not react with the target B cell epitope in its original shape. Addition Therefore, the number of T helper cell epitopes that can be incorporated into the synthetic peptide immunogen Is restricted. This also reduces the immunogenicity of the peptide within the general population. You can HLA class II diversity may affect T cell antigen recognition It is known (Schwartz, RH Curr. Top. Microbial Immunol. 13). 0:79, 1986). As a result of these studies in mice, the peptide A8-VDIV 6 of the 8 H-2 family mouse strains immunized with It was shown that it produced an IgG antibody reactive with the vesicle part, and these findings also indicate that T contained in 8 sequences_HCellular epitope (s) can have multiple MHC classes It is consistent with the hypothesis that it is recognized by the II haplotype. Mouse responsive strain Two of them, C57BL / 10 and B10. M is also the peptide VDIV alone Produced antibodies after immunization with VDIV, which, in addition to the B cell epitope, Sequence is H-2^b-And H-2^fT whose recognition is limited by the haplotype_H It is shown that the cell epitope is also included. Thus, the peptide A8-VDIV is functional Of T_HIt contains at least two distinct epitopes that induce activity. These two Peptides are commonly recognized in heterogeneous human populations by combinations of sites The likelihood of being done is increased. Consistent with this hypothesis is that the peptide A8-VDIV Of all 3 cynomolgus monkeys immunized with L targeting B of LNPTIAG It is a finding that an IgG antibody against a cell epitope was produced. We have Previously, as part of another study to assess the protective efficacy of peptide immunogens, pep Four other cynomolgus monkeys were immunized with Tide A8-VDIV. Vaccine contact All four seeded monkeys were IgG antibodies against the LNPTIAG neutralizing epitope It was further supported that this peptide immunogen could be commonly recognized. Surprisingly, our finding was that the peptide A8-VDIV was found to be a synthetic peptide. Suggested not sharing the unfavorable immunogenic properties normally associated with the Tide immunogen are doing. Immunization with peptide A8-VDIV resulted in LNPT within the VDIV sequence. Understand why it is so effective in eliciting antibody responses to IAG epitopes It has not been. The size of the VDIV sequence incorporated into the A8-VDIV peptide (1 (7 amino acids), this peptide is a key component in determining its immunogenicity. It is possible that the building elements were maintained. The present inventors have found that the A8-VDIV peptide Is an antigenically common LNPTIAG neutralizing epitope contained within the VDIV sequence. It is an extremely effective immunogen capable of preferentially inducing antibody responsiveness to And are shown in a convincing way. An unexpected finding of this study was that of mouse and monkey anti-A8-VDIV antisera. Both were reactive against serovar K (FIG. 3 and Table 1). These data were compared to MOMP of serovar K by some Western blots. Inconsistency with unresponsive mAb DIII-A3 immunoreactivity (Zhang et al., Infec t. Immun., (1989) supra). MAb DIII-A3 against serovar K The lack of immunoreactivity of L. It can be explained by threonine for substitution. With a single epitope Polyclonal anti-A8-VDIV antibody, unlike mAb DI11-A3, which reacts Reacted with multiple B cell epitopes contained in the VDIV sequence. This is LN In addition to octapeptides containing PTIAG epitopes, both mouse and monkey Produced an antibody reactive with another octapeptide corresponding to the VDIV sequence. Shown from Pepscan analysis of the polyclonal anti-A8-VDIV response shown. (FIGS. 2 and 5). Regarding the reactivity of anti-peptide antibodies against serovar K, Although it is difficult to determine which epitope (s) are important,²⁹⁶ TTLNPTI³⁰²Possibly epitope (s) contained within the sequence It is capable. This sequence is present in serovar K VDIV and The anti-peptide antibody showed octapeptide containing TTLNPTI sequence according to And was immunoreactive. This TTLNPTI sequence is also a C complex serotype variant H, I and And J, but like the LNPTIAG epitope, this Clearly, the antibody is not accessible on the native EB surface of the type variant. in addition Nevertheless, immunization with peptides produced antibodies reactive with serovar K. The fact that it is done is a clear advantage. Peptide A8-VDIV is anti-neutralizing C. capable of inducing the body because the number of trachomatis serovars increases . For a more accurate assessment of the potential of a peptide vaccine, its immunogenicity and toxicity Face 1 vaccine studies in humans may be needed to identify. to this Relatedly, we found that in primates immunized with oligopeptides, alleles Observing that none of the clinical signs of ghee or toxic reactivity were present, It is suggested that the peptide can be safely administered to humans. Specific embodiments of the invention are described in detail and are possible within the scope of the invention. We will refer to such variations. It is likewise possible to successfully carry out the intended invention There are various alternative techniques and procedures available to those skilled in the art. Example 1 Includes a conserved B cell neutralizing epitope and a conserved T cell epitope Composition of synthetic vaccines An automated peptide synthesizer (model) as previously described by Su et al., Supra. 431A Synthesizer, Applied Biosystems, Foster City, C A) was used to synthesize peptides VDIV and A8-VDIV. C18 color Reversed-phase HPLC on a column (Beckman Instruments, Frelton, CA) The peptide was purified from The accuracy of the synthetic reaction was determined by amino acid sequencing. did. Peptide VDIV binds to MOMP residues 293-309 (FD VTTLNPTIAGAGGDVK) and by neutralizing mAb DIII-A3 Sequence-recognized LNPTIAG septamer epitope. peptide A8 is MPMP residues 106-130 (ALNIWDRFDVF of serovar A). CTLGATTGGYLKGNS), which effectively immunizes mice Previous IgG response specific for MOMP after the second immunization with the original protein MOMP T to generate_HContains cellular epitopes. The peptide A8-VDIV is It contains only the peptides A8 and VDIV, its N-terminal A8 sequence and its cal The VDIV sequences at the voxy end were used to synthesize them in a linear arrangement. Example 2 Vaccination of mice with synthetic peptides C57BL / 10SnJ (H-2^b), B10. A / SgSnJ (H-2^a), B10. D2 / oSnJ (H-2^d), B10. M / Sn (H-2^f), B10. WB / Sn (H-2^ja), B10. Br / SgSnJ (H-2^k), B10. P L (73NS) / Sn (H-2^u), And B10. SM (70NS) / Sn ( H-2^v) Mice are from the Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) I bought it. Mice of both sexes, 8-12 weeks of age, were used for the experiments. Complete flow 50 μg of peptide A8-VDI emulsified in Indian adjuvant (CFA) Immunize groups of 5 mice by intraperitoneal injection of V or peptide VDIV alone The same dose of peptide in incomplete Freund's adjuvant (IFA) It was used and boosted 3 weeks later. Collected from mice two weeks after the second immunization I got blood. Example 3 Immunization of primates with synthetic peptides The cynomolgus monkey (Macaca fasicularis) originating from Mauritius Island Used in the examination. A monkey is one of a well-conditioned group that has been stable for two years. Part of it. All experiments on laboratory monkeys were under sedation with ketamine hydrochloride I went there. This research was conducted by the Institute for Experimental Animal Resources of the National Council for Life Sciences. Guidelines for the Use and Experimental Use of Laboratory Animals, as well as all relevant federal legislation and And the regulations were fully complied with. Related equipment is only available for handling experimental animals. It is fully accredited by the American Association for Goodness (AAALAC). Re Ribi adjuvant (MPL + TDM + CWS emulsion, Lib immunoscience Laboratory, Hamilton, MT) 1 mg peptide A8-VDIV emulsified using With three cynomolgus monkeys (705, 752 and 907) by intramuscular injection Immunized. Two control monkeys (842 and 880) were immunized with adjuvant alone Turned into Immunize with 500 μg peptide and adjuvant at 4 week intervals Was repeated twice. Blood was collected from monkeys after the third immunization. Example 4 Serological evaluation of antibody response C. trachomatis serovar D (UW-3 / Cx), E (Bour), F (IC-C al-13), G (UW-57 / Cx), H (UW-4 / Cx), I (UW-1) 2 / Ur), J (WU-36 / Cx), and K (UW-31 / Cx) to HeL grown on a229 cells and as previously described by Caldwell et al., supra. Chlamydia elementary bodies (EBs) from infected cells by density gradient centrifugation. Purified. Enzyme-conjugated specific antibody adsorption according to the method previously described (Su et al., (1990) supra). By the assay (enzyme linked immunoabsorbent assay, ELISA) The antibody response was assayed. Briefly, a 0.1% M. 100 μl of synthetic peptide (5 μg / m in 05M Tris buffer, pH 7.5) l), purified MOMP (0.5 μg / ml) or formalin killed C. tra Using chomatis EBs (10 μg / ml), a microtitration plate (immunoro , 2, Dynatec Laboratories, Alexandria, VA) at 4 ° C Covered at night. Mice or monkey sera serially diluted 2-fold were tested in duplicate. Anti-mouse and anti-human IgG alkaline phosphatase conjugates (γ chain specific, di- Med Laboratories, San Francisco, CA) followed by substrate ( 0.1M 2,2-amino-2-methyl-1,3-propanediol, pH 10 ． 5 mg p-nitrophenyl phosphate in 3 (10 ml)). And monkey IgG were detected respectively. ELISA leader (Bio-Rad-La VOLATORIZE, Richmond, CA) was used to measure the absorbance at 405 nm. . Pooled preimmune serum was used as a negative control and the absorbance of 0.3 OD units was used. ELISA titers were expressed as the highest dilution of serum given. Example 5 Identification of linear epitopes associated with immune response From MOMP bound to serum antibodies from vaccinated mice and monkeys The linear epitope was described by Geysen et al. (J. Immunol. Methods 102: 259, 1989). Identified by pepscan assay as listed. Commercially available kit (Epitoh Scanning Kit, Cambridge Research Biochemicals, Will MOMP of serovar B using Minton, DE) according to the manufacturer's instructions A series of overlapping octapeptides corresponding to VDIV (residues 288-314) of Synthesized with pre-derived pins. The same as described above for the ELISA assay ELIS using anti-mouse or human IgG alkaline phosphatase conjugate A shows the reactivity of mouse and monkey IgG antibodies to solid-phase octapeptide. Decided. Example 6 C. Intra-patient neutralization of trachomatis infectivity As previously described (Su, H. and HD Caldwell, J. Exp. Med. 175: 2. 27 (1992)), a 96-well microtitration plate (Limbro, 96 flat bottom well, Syrian hamsters grown in Rho Laboratories, McLean, VA) -(Syrian hamster) kidney (HaK) cells, mouse or monkey anti-peptide C. with antibody The intestinal neutralization of trachomatis infectivity was tested. Briefly explain And 10 hours 24 hours before the neutralization test^FiveHaK cells were inoculated into a 96-well plate . 250 mM sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM L-glutamic acid, p C. in H7.2 (SPG). dilute trachomatis serovars D, G and H, 3 x 10^Five~ 3 x 10⁶To a final concentration of inclusion body forming units (IFUs) / ml. Pooled mouse sera or 2-fold dilutions of individual monkey sera were treated with an equal volume of Chlamydia. Mix and incubate at 37 ° C for 30 minutes. Triple mix (50 μl / well) To inoculate HaK cell monolayers. After incubating at 37 ° C for 2 hours, The inoculum was removed, the monolayer was washed and refilled with medium. 48 hours at 37 ° C After incubating for a while, immobilize the monolayer with methanol and indirect fluorescence IFUs were identified by antibody staining. Neutralization titer of serum is IFU of Chlamydia Expressed as% reduction in s and calculated as follows: [(IFUs control serum-IFUs test serum) / IFUs control serum] × 100 Although specific embodiments of the invention have been described in detail, these embodiments are not limiting. It is exemplary rather than the true scope of the invention may be determined by the appended claims. It will be apparent to those skilled in the art. Sequence listing 1) General information: (I) Applicant: US Government represented by the Secretary of Health and Welfare (Ii) Title of the invention: Synthetic peptide vaccine of Chlamydia trachomatis (Iii) Number of sequences: 3 (V) Computer readable format: (A) Media type: floppy disk (B) Computer: IBM PC compatible (C) Operating system: PC-DOS / MS-DOS (D) Software: PatentIn Release # 1.0, Version # 1.25 (Vii) Prior application data (A) Application number: 07 / 947,671 US (B) Application date: September 18, 1993 2) Information about SEQ ID NO: 1: (I) Sequence features: (A) Sequence length: 25 amino acids (B) Sequence type: amino acid (D) Topology: linear (Ii) Type of molecule: peptide (Iii) Assumed part: None (Iv) Antisense: None (V) Fragment type: internal (Xi) Sequence description: SEQ ID NO: 1 2) Information about SEQ ID NO: 2: (I) Sequence features: (A) Sequence length: 17 amino acids (B) Sequence type: amino acid (C) Number of chains: single chain (D) Topology: linear (Ii) Type of molecule: peptide (Iii) Assumed part: None (Iv) Antisense: None (V) Fragment type: internal (Xi) Sequence description: SEQ ID NO: 2 3) Information about SEQ ID NO: 3: (I) Sequence features: (A) Sequence length: 42 amino acids (B) Sequence type: amino acid (C) Number of chains: single chain (D) Topology: linear (Ii) Type of molecule: peptide (Iii) Assumed part: None (Iv) Antisense: None (V) Fragment type: N-terminal (Xi) Sequence description: SEQ ID NO: 3

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/569 Ｂ 8310−2Ｊ ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI G01N 33/53 D 8310-2J 33/569 B 8310-2J

Claims

[Claims] 1. C. in vertebrates of generating an immunological response to trachomatis A synthetic peptide that can be C. Conserved T helper cell-stimulating activity derived from the major outer membrane protein of trachomatis An epitope, C. Conserved B cells of serovars derived from major outer membrane proteins of trachomatis A synthetic peptide containing a Japanese antibody stimulating epitope. 2. The T helper cell stimulating epitope and the B cell neutralizing antibody stimulatory epitome The synthetic peptide according to claim 1, wherein the group and the group are linearly aligned with each other. 3. The synthetic peptide comprises the sequence identified as SEQ ID NO: 3. The synthetic peptide described. 4. The sequence in which the T helper cell stimulating epitope is located within SEQ ID NO: 1. The synthetic peptide according to claim 1, which comprises: 5. The B cell-neutralizing antibody-stimulating epitope is located within SEQ ID NO: 2. The synthetic peptide according to claim 1, which comprises: 6. The T helper stimulating epitope has a sequence located within SEQ ID NO: 1. And the B cell neutralizing antibody stimulating epitope is located within SEQ ID NO: 2. The synthetic peptide according to claim 4 or 5, which has a row. 7. The T helper stimulating epitope is the B cell neutralizing antibody stimulating epitope. 7. The synthetic peptide according to claim 6, which is on the N-terminal side of the peptide. 8. A linker peptide that separates the sequence of SEQ ID NO: 1 and the sequence of SEQ ID NO: 2 The synthetic peptide of claim 6, further comprising a sequence. 9. The peptide comprises at least one species-specific B cell neutralizing antibody stimulant epitome 7. The synthetic peptide according to claim 6, further comprising a loop. 10. The synthetic peptide is C.I. For proteins other than the major outer membrane protein of trachomatis The synthetic pep according to claim 7, further comprising a known T helper stimulating epitope derived from Chid. 11. C. The synthetic peptide according to claim 1 in the preparation of a trachomatis vaccine. How to use. 12. The conserved T helper cell stimulating epitope is within SEQ ID NO: 1. Is an epitope having a located sequence and is a conserved B domain of the serotype variant. Cell-neutralizing antibody stimulating epitope having a sequence located within SEQ ID NO: 2 The method of use according to claim 11, wherein the method is a group. 13. The synthetic peptide according to claim 1 and an antibody bound to the peptide are detected. C. in the sample, including To detect the presence of antibodies against trachomatis Immunoassay. 14. C. in vertebrates To induce protective immune response against trachomatis A method comprising administering the synthetic peptide of claim 1 to said vertebrate. Inducing a protective immune response by administering the peptide with a pharmaceutically acceptable buffer. Guide method. 15. After the administration step, C. in said vertebrate. of neutralizing antibodies against trachomatis 15. The method of claim 14, further comprising the step of determining the presence. 16. The administering step comprises injecting the synthetic peptide intramuscularly into the vertebrate. 15. The method of claim 14 including.