JPH08504085A

JPH08504085A - Mammalian cationic protein with lipopolysaccharide binding and anti-pseudoblood activity

Info

Publication number: JPH08504085A
Application number: JP6504605A
Authority: JP
Inventors: ダブリュ．ラーリック，ジェームス; シー．ライト，スーザン; 陸正平田
Original assignee: パノラマリサーチ，インコーポレイティド
Priority date: 1992-07-17
Filing date: 1993-07-15
Publication date: 1996-05-07
Also published as: WO1994002589A1; EP0746605A1; EP0746605A4; AU4682593A

Abstract

(57)【要約】リポ多糖体に関係する状態及び凝血に関係する疾患の治療及び診断のための組成物及び方法が提供されている。組成物には、特にCAP18のカルボキシ末端で発見された反応性窒素阻害ペプチド（RNIP）フラグメントを含む哺乳動物の顆粒球から得られたいくつかのカチオン性タンパク質（CAP18）と同一又は相同であるポリペプチドが含まれている。ポリペプチドは、LPSに結合し、マクロファージのLPSを媒介とする活性化を阻害すること、ならびに播種性血管内凝固といった状態において凝血を阻害するべく凝固カスケードを妨害することができる。適切な薬学的担体内にポリペプチドを含む組成物も同様に提供される。 (57) [Summary] Compositions and methods are provided for the treatment and diagnosis of conditions related to lipopolysaccharide and diseases related to blood clotting. The compositions include polycations that are identical or homologous to several cationic proteins (CAP18) obtained from mammalian granulocytes, including a reactive nitrogen-inhibiting peptide (RNIP) fragment found specifically at the carboxy terminus of CAP18. Contains peptides. Polypeptides can bind to LPS, inhibit LPS-mediated activation of macrophages, and interfere with the coagulation cascade to inhibit coagulation in conditions such as disseminated intravascular coagulation. Compositions containing the polypeptides in a suitable pharmaceutical carrier are also provided.

Description

【発明の詳細な説明】リポ多糖体結合及び抗擬血活性をもつ哺乳動物のカチオン性タンパク質本研究の一部は、NIH助成金により支援された。米国政府は、本発明に対し一定の権利を有し得る者である。発明の背景１．発明の分野本発明は、一般に、グラム陰性セプシスといったリポ多糖体（LPS）関連疾病の治療及び診断のための組成物及び方法に関する。より特定的には、本発明は、このような治療及び診断のための或る種の哺乳動物カチオン性タンパク質の調製及び使用に関する。グラム陰性敗血症の抑制のための合理的なアプローチは、基礎をなす細菌感染の治療中に放出されるリポ多糖体の有毒効果を中和することにある。ポリミキシンＢといったカチオン性抗生物質は、いくつかのタイプのリポ多糖体に結合しこれを中和するが、その使用は毒性のため制限されている。或る種のLPS中和性モノクローナル抗体は、一般的タイプのLPSを認識するが、グラム陰性菌の全ての種に対して有効でない。リピドＡコアといった多くの種の中で保存されたリポ多糖体の領域に対して作られた抗体は、一定のタイプのLPSに対して有効でないように思われる。LPSに結合する或る種の哺乳動物のポリペプチドが同定されてきた。これらの中には、LPS結合タンパク質（LBP）及び殺菌性透過性増強タンパク質（BPI）が含まれる。BPIは、LPSの有毒効果を中和することができる。本発明にとって特に有利なことに、ウサギ顆粒球の中に、約16.6 kDの分子量をもつカチオン性タンパク質が同定された。CAP18として知られているこのタンパク質は、いくつかのインビトロ検定においてLPSに結合しその活性を減衰させることがわかった。しかしながらヒトの治療及び診断を目的する場合、往々にして、哺乳動物の相同物よりもむしろヒト形態のタンパク質を利用することが好ましい。このことは特に、タンパク質のヒト形態が相同タンパク質のその他の哺乳動物形態と著しく異なっている場合に言えることである。しかしながら、その他の哺乳動物内でタンパク質が同定されクローニングされる場合でも、特にヒト相同物のアミノ酸配列が哺乳動物の始原型と著しく異なる場合、ヒト形態のタンパク質の同定は、困難でありうる。往々にして、タンパク質の天然形態に対し何らかの形で改善されたヒトの又はヒト化されたタンパク質を提供することが望ましい。例えば、治療及び診断にとって有効なタンパク質及びポリペプチドは、天然のヒト又はその他の哺乳動物のタンパク質の切形又は短縮形態でありうる。タンパク質及びポリペプチドの治療用形態は又、何らかの望ましい要領でタンパク質の活性を増強するべく一定の残基において修正することもできる。グラム陰性敗血症といったリポ多糖体関連疾患の治療のための改良型方法を提供することが望まれる。特に、このような疾患において起こるリポ多糖体関連障害を阻害するか又は中和することのできる組成物及び方法を同定することが望まれる。さらに、リポ多糖体に結合しその活性を阻害又は中和することのできる分離され精製された哺乳動物のカチオン性タンパク質を提供することが望まれる。特に、哺乳動物のCAP18といった合成的に又は組換え型により産生された哺乳動物カチオン性タンパク質を提供することが望ましい。さらに又、リポ多糖体に結合しその活性を阻害又は中和することのできる分離され精製されたヒトカチオン性タンパク質を提供することが望ましい。さらに又、抗凝血活性といったその他の望ましい活性と組合わせた形でリポ多糖体結合活性を有するヒト及びその他の哺乳動物のカチオン性タンパク質の修正形態を提供することも望まれている。２．背景技術の説明エンドトキシン：宿主応答の構造的様相及び免疫生物学の中のHirata et al著 .，「ウサギの顆粒球からのカチオン性タンパク質により惹起されたRE-LPSでの感作を受けた赤血球の凝集」；会議抄録Riva del Sols, Giovinazzo（BARI），I taly，1986年5月29日〜6月1日、は、リポ多糖体で感作された赤血球を凝集させることのできるウサギの腹膜顆粒球からのカチオン性タンパク質の抽出について記述している。5月22日〜23日オランダ，アムステルダムでのエンドトキシンII に関する国際会議のTsunoda et al.（1987）の抄録、79頁、では、抗凝血活性を含むウサギの顆粒球からのカチオン性タンパク質の活性について記述されている。日本の大阪で5月16日〜19日まで開かれたエンドトキシンに関する国際シンポジウムのYoshidaet al.，（1988）の抄録、SII-3頁では、2kD〜70kDの分子量をもつ顆粒球カチオン性タンパク質について記述されている。日本の東京で8月19 日〜25日に開かれた血栓症及びうっ血に関する国際学会の第ＸII回大会のShimom ura et al.（1989）の抄録1228、389頁、では、ウサギの顆粒球カチオン性タンパク質の抗凝血及び抗菌活性について記述されている。9月16〜22日に日本の大阪で開かれたIUMS大会：細菌学及び菌学のHirata et al（1990）の抄録S33-3、1 9頁では、18kDの見積り分子量をもつウサギの顆粒球からのカチオン性タンパク質について記述されている。5月10−12日のカリフォルニア州，サンディエゴでの国際エンドトキシン学会の第１回大会のHirata et al.（1990）の抄録II−Ｐ−87でも又、ウサギの顆粒球からの18kDのカチオン性タンパク質について記述されている。Hirata et al.（1990）、エンドトキシン、Friendman et al.，eds.，PlenumPublishing Co.，287〜299頁では、ウサギの顆粒球からのカチオン性タンパク質（ウサギCAP18）の部分的精製について記述されている。ウサギのCAP18のクローニング及び発現については、Larricket a l.，（1991），Biochem.Biophys.Res.Comm．179；170〜175で記述されている。哺乳動物のCAP18のクローニング及び発現については、同時係属出願第07／916,7 61号及び第07／916,765号に記述されており、その開示全体が本書に参考として内含されている。これらの出願は同時に、反応性窒素阻害タンパク質（RNIP）と呼ばれるCAP18の活性カルボキシ末端フラグメントについても記述している。Sab a et al.（1967）J.Clin.Invest．46：580-589及び（1968）血液31：369〜380では、顆粒球中の抗凝血活性をもつカチオン性タンパク質の存在について記述されていた。発明の要約本発明は、グラム陰性セプシスといった或る種のリポ多糖体関連条件の治療及び診断及び／又は播種性血管内凝固（DIC）といった凝固関係の障害の治療にとって有効な組成物及び方法を提供する。この組成物は、リポ多糖体に結合してそのインビトロ及びインビボ活性を阻害することができる2kD〜80kDの分子量をもつ或る種の分離され精製された哺乳動物カチオン性タンパク質及びポリペプチドを含んで成る。本発明のタンパク質及びポリペプチドのうち少なくともいくつかは、ヘパリンに対する高親和性結合部位をも有し、抗凝血活性を示すことになる。この組成物にはさらに、細胞培養中で遺伝子を発現するのに適した哺乳動物のカチオン性タンパク質ならびにDNA構成体をコードする分離されたポリヌクレオチド及び遺伝子が含まれている。このようにして、分離され精製されたポリペプチドを細胞培養内で組換え型により産生することができる。次に、分離され精製されたポリペプチドは、リポ多糖体関連状態及び／又は凝血関連障害の危険性があるか又はそれを患っている宿主に投与することにより、治療に用いられる。さらに、このようなリポ多糖体関連状態を患う患者を診断するためにポリペプチド組成物を使用することもできる。かかる診断方法には、標準的には血液である患者の試料をカチオン性タンパク質に露呈し、試料中に存在する可能性のあるリポ多糖体と前記タンパク質の間の結合を検出する段階が含まれる。図面の簡単な説明図１は、実験の項で記述されるとおりの、好中球由来のヘパリン結合したカチオン性タンパク質から生成された逆相HPLCである。図２は、DNA配列１から誘導されたアミノ酸配列に基づくCAP18の水治療法プロフィールである。29アミノ酸アミノ末端シグナル配列と37アミノ酸カルボキシ末端反応性窒素阻害タンパク質（RNIP）が示されている。図３は、実験の項で記述されている通り、リポ多糖体（LPS）誘発された反応性窒素中間体（RNI）の産生の用量応答を示すグラフである。図４は、実験の項で記述されている通り、ポリミキシンＢによるLPS誘発されたRNIの産生の阻害を示すグラフである。図５は、実験の項で記述されている通り、LPS誘発されたRNIの産生の阻害におけるいくつかのその他の哺乳動物のカチオン性タンパク質に関するRNIPの活性を示すグラフである。図６Ａは、LPS濃度の関数としてのRAW264.7中のRNIの産生を示すグラフである。図６Ｂは、2.5ng／mlのLPSで誘発されたRAW264.7細胞中のRNIの産生に対するペプチド#197（RNIP）及び#187のさまざまな濃度の阻害効果を示すグラフである。図６Ｃ−６Ｅは、さまざまな細菌株に対する４つの合成RNIPペプチドの抗菌活性を示す。図６Ｆは、LPS結合活性を示さない合成RNIPペプチドの抗菌活性を示す。図６Ｇは、LPSと結合せず、RNIPペプチド197の活性も阻害しないペプチド32− 1を示す。図６Ｈは、E．coli（エシェリキア・コリ：大腸菌）のＫ⁺及びＫ^-菌株に対するRNIPの抗菌活性を示す。図６Ｉは、グラム陰性及びグラム陽性の両方の菌に対するRNIPペプチド197の抗菌用量応答を示す。図７は、RAW264.7マウスマクロファージ細胞に対するビオチンで標識づけされたRNIPの結合を示すグラフである。図８は、RAW264.7細胞の増殖のLPS誘発された阻害に対するRNIPの効果を示すグラフである。図９は、ヒト及びウサギにおけるCAP18のcDNA配列の比較である。配列番号１はヒトのcDNA配列を示し、配列番号３はウサギのcDNA配列を示している。図10は、図１のcDNA配列によりコードされるタンパク質ならびにブタのカテリンののアミノ酸配列相同性の比較である。ヒトアミノ酸配列は、配列番号２に示され、ウサギアミノ酸配列は配列番号４に示され、ブタのカテリン配列は配列番号５に示されている。図11は、以下の実験の項で詳述する通り、RAW細胞のRNI産生に対するヒトのRNIP及びウサギのRNIPの阻害効果の比較である。図12は、以下の実験の項でより詳細に記述する通りサルモネラ・ミネソタ（Sa lmonella minnesota）の平滑LPSを５分間ペプチド197（RNIP），36−1，32−1、及び50−2（１μｇ／ml）を用いてインキュベートさせ、次に混合物をチオグリコレートで刺激されたマウスのマクロファージに付加し６時間培養してから凝固検定により組織因子を検定する、組織因子のLPS誘発された生成を阻害する上での２つの活性及び２つの不活性RNIPペプチドの効果を比較した図表である。図13は、LPSから０時間、１時間及び３時間後の異なる濃度でのRNIP（ペプチド197）によるLPS誘発された組織因子の生成を比較している。図14Ａ−14Ｃは、それぞれプロトロンビン時間（PT）、部分トロンボプラスチン時間（PTT）及び活性化部分トロンボプラスチン時間（aPTT）についての用量の関数としての図12の４つのペプチドの抗凝血活性を示している。図15Ａ及び15Ｂは、それぞれＸａ因子誘発凝固及びＸ因子活性化酵素に対する、活性合成ペプチド197及び36−1の効果を表わしている。図16Ａ及び16Ｂは、それぞれ、Ｘ因子活性化酵素に対する効果及びＸａ因子の生成の阻害に関して、ペプチド197（RNIP）と36−1を比較している。図17Ａ及び17Ｂは、それぞれ、Echis carinadusの毒液によるプロトロンビン活性化及びＸａ因子によるプロトロンビン活性化に対する４つの試験用ペプチドの効果を比較している。特定の実施態様についての記述本発明は、播種性血管内凝固（DIC）といったような凝血関係の障害及び／又はグラム陰性敗血症といった或る種のリポ多糖体（LPS）関連状態を治療し診断するための組成物及び方法を提供する。グラム陰性敗血症は、抗生物質での治療が往々にして、炎症プロセスを加速し著しい組織損傷をひき起こす可能性のある LPSの多大な放出により状態を悪化させる、グラム陰性菌による宿主の感染の結果として起こる。播種性血管内凝固は、小さい血管全体を通しての患者の凝固因子及び／又は線維素溶解酵素の無制御の活性化の結果起こる出血性症候群である。その結果、線維素は沈積され、血小板及び凝固因子は消費される。線維素分解産物は、線維素の重合を阻害し、その結果、組織の壊死及び出血が起こる。現在のところ、LPSにより開始される免疫炎症性カスケードのいくつかの様相が或る程度詳しくわかっている。LPSは、血漿内に存在し肝細胞から10倍誘発されるものとして知られている少なくとも１つのLPS結合タンパク質（LBP）に結合することがわかっている。このタンパク質に対して結合したLPSは、インターロイキン１（IL1）、腫瘍壊死因子（TNF）、組織因子及び酸化窒素シンセターゼといった数多くの重要な酵素及び媒介物質の合成を増大させるべく単球に対する第２の伝令シグナルを送る白血球分化抗原であるCD14に結合する。これらの分子は、毛細管漏洩症候群及び内毒素血症に付随する組織の損傷に寄与する。本発明の治療及び診断上の態様のいくつかは、例えば以下の実験の項で記述されているような、哺乳動物の白血球特に顆粒球により産生される特定の天然カチオン性タンパク質（及びその誘導体）とのLPSの結合に依存している。これらのカチオン性タンパク質は一般に２キロダルトン（kD）から80kD、通常は10kD〜20 kDの範囲内の分子量及び、8〜11通常は9〜10の範囲内のPIを有することになる。ウサギの顆粒球から得られるカチオン性タンパク質は、16.6kDの計算上の分子量（そのアミノ酸配列に基づく）及び10というPIを有する。このウサギの顆粒球のカチオン性タンパク質は、以前のその見積り分子量に基づきCAP18と呼ばれてきた。ヒトを含むその他の種からの相同な哺乳動物のカチオン性タンパク質を、総じて、以下の記述及び請求の範囲においてCAP18と呼ぶことにする。 CAP18は、従来のタンパク質の分離及び精製技術と、LPS感作されたヒツジ赤血球（SRBC）を結合及び凝集させるその能力を同定するインビトロ検定とを組合わせたものによって同定することができる。特定の精製手順の詳細については、以下の実験の項で示されている。 CAP18は、以下の実験の項で報告されている通り、まず最初にウサギにおいてクローニングされた。驚くべきことに、本書でクローニングされ配列決定されたヒト形態は、ウサギ形態とわずか約70％というアミノ酸配列相同性しか示さず、 RNIP領域（以下で記述する）内のアミノ酸配列の相同性は、38％未満である。このように配列の相同性が低いことにより、以下で実験の項においてさらに詳しく説明するように、ヒトの類似体のクローニングはむずかしいものとなった。 CAP18及びCAP18RNIPのヒト形態は、同様に、グラム陰性菌の細菌増殖を阻害し、それより程度は低いもののグラム陽性菌の細菌増殖も阻害することがわかっている。これとは対照的に、ウサギRNIPは、ヒトRNIPが示す活性に比べ一般に大きい活性で、グラム陰性及びグラム陽性菌の両方の成長を阻害することができる。ヒトRNIPは、抗凝血活性をもたないということも発見されてきた。これとは対照的に、ウサギRNIPは、Ｘａ因子に対する結合を通して凝血カスケードを阻害することがわかった。 CAP18は、脊椎動物の炎症反応において役割を果たすと思われ、大部分のLPS形態を結合し、単球のLPS媒介活性化を中和することができる。CAP18は、それ自体マクロファージの活性化を阻害することのできる反応性窒素阻害ペプチド（RNIP ）と呼ばれる、通常そのカルボキシ末端に存在する短かいペプチドを含んでいる。グラム陰性菌により放出されたLPSは、LPS結合タンパク質（LBP）と組合わさって、マクロファージ上のCD14と結合することにより活性化シグナルを提供すると現在考えられている。マクロファージのこのような活性化は、敗血症といったさまざまなLPS関連状態を悪化する効力がある。 CAP18及びその活性フラグメントは、マクロファージの活性化を阻害し減衰させることができ、かくしてこのようなLPS関連状態の治療において有効でありうる。現在、LPSへのCAP18の結合によって、RNIPフラグメントを介してマクロファージに阻害シグナルが提供されると考えられている。しかしながらこのメカニズムの正しさは、特定の活性メカニズムに依存しているものでない本発明にとっては、中心的なことではない。特にウサギといったいくつかの種からのCAP18のRNIPフラグメントは同様に、プロトロンビン時間（PT）検定、部分トロンボプラスチン時間（PTT）検定及び活性化部分トロンボプラスチン時間（aPTT）検定を含む標準的なインビトロ凝固検定において抗凝血活性を示す。RNIPフラグメントは又、ヘパリンに対し高い結合親和力を有する。RNIPペプチドの抗凝血活性は、プロトロンビンの活性化（II 因子からIIａ因子）において起こると思われる。RNIPは、以下の実験の項で実証されるとおり、精製されたII因子からIIａ因子のEchis carinatusの毒液による活性化、ならびに組織因子、VII因子及びＸ因子のインキュベーションにより形成されたＸａ因子によるII因子活性化の両方を阻害することが立証されている。かくして、抗凝血活性は、凝固カスケード内の少なくとも２つの部位すなわちＸ因子の活性化とプロトロンビンの活性化の阻害により誘導されると思われる。阻害の精確なメカニズムは明らかでないが、これらの凝血段階の両方がリン脂質の結合を必要としていることから、RNIPペプチドがかかる結合と干渉する可能性がある。しかしながらRussell Viperの毒液によるＸ因子の活性化及びEchis carinatusの毒液によるプロトロンビンの活性化がリン脂質結合を必要としないという事実は、凝固カスケードのRNIPペプチドによる阻害がかなり複雑なものでありうるということを示唆している。本発明の第１の実施態様においては、診断及び治療手順において使用するため、分離され精製されたCAP18ポリペプチドが提供されている。「分離され精製された」というのは、以下で詳述するとおりポリペプチドがその細胞供給源から分離され、望ましい純度まで精製されていることを意味する。かかる分離され精製されたポリペプチドは、少なくとも約９個、通常は25〜175個、さらに通常は25 〜150個のアミノ酸を含むことになる。このポリペプチドは、配列番号２に示されているヒトCAP18の配列、及び配列番号４に示されているウサギCAP18の配列といった、哺乳動物のCAP18分子の中の天然の配列と同一又は相同となる。本発明において特に有効であるのは、CAP18分子のRNIPフラグメントの少なくとも活性な部分を含むポリペプチド、及び、実質的にCAP18分子全体を含むポリペプチドである。本発明のポリペプチドは、一般に、配列番号２及び／又は配列番号４において提供されているもののような天然の哺乳動物のCAP18配列と少なくとも約60％の配列相同性をもち、通常は少なくとも約 80％の配列相同性、より通常には少なくとも約90％の配列相同性、又頻繁には95 ％以上の配列相同性を有する。しかしながらここで配列相同性は必ずしも本発明に従ったポリペプチドを提供するのに充分なものである必要はない。又、このポリペプチドは大部分又は全ての形態のLPSと結合する能力を有し、通常は上述の通りマクロファージの活性化を阻害することができる。多くの場合において、以下の実験の項でより詳しく記述するように、このポリペプチドが、例えばPT検定、PTT検定及びaPTT検定といった従来の検定により測定される抗凝血活性を有していることも望まれる。場合によっては、本発明に基づくポリペプチドが、天然の哺乳動物のCAP18又はRNIPポリペプチドと実質的に同一であることが好ましい。「実質的に同一である」というのは、アミノ酸配列が残基毎のペースで配列２に示されているものと同一の配列を有するか或いは又、制限された数のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有ししかもこのようなアミノ酸配列内の変更がタンパク質の活性を著しく変えることがないことを意味している。通常は、配列番号２の37アミノ酸RNIP領域内に５つ未満の挿入、欠失及び／又は置換が存在することになり、好ましくは３つ未満、さらに好ましくは２つ未満の挿入、欠失及び／又は置換が存在する。ポリペプチドは同様にその「ヒト」性をも保持することになる。すなわち一般にヒト宿主に投与されたときヒトのものとして認識されることになる。場合によっては、ヒトRNIP（配列番号２中のアミノ酸134〜170）内の単数又は複数のアミノ酸をウサギRNIP（配列番号４中のアミノ酸135−171）内の非相同アミノ酸と置換することが望ましい可能性がある。ヒトRNIPは一般に、特にグラム陽性菌に対する抗菌活性において、ウサギRNIPよりも活性が低い、ということが発見されてきた。GLY，ASP，PHE及びLYSといったヒトRNIP内の非塩基性アミノ酸に対してLYS 及びARGといったウサギRNIPからの塩基性アミノ酸を置換することにより、ペプチドのヒト性を失なうことなくヒトペプチドの活性が増強されることになる、と考えられている。特に、ウサギRNIPのアミノ末端近くの塩基性アミノ酸は、ヒトRNIPと比較した場合のウサギRNIPの抗凝血活性の存在及びより大きいLPS結合活性の両方の原因となるものである、と考えられている。この考え方は、さまざまな修正済みウサギRNIPペプチドがテストされ、アミノ末端における塩基性アミノ酸の欠失の結果 LPS結合活性及び抗凝血活性の両方が失なわれることになる。以下の実験の項で記されている証拠事実に基づくものである。さらに、ウサギRNIPの少なくとも５つのカルボキシ末端アミノ酸を含むカルボキシ末端アミノ酸の少なくとも一部分の切形の結果、わずかな活性喪失しかもたらされないことが示されている。これらの理由から、本発明に従った好ましいRNIPペプチドは、ヒトRNIPの位置 136〜138におけるGLY-ASP-PHE配列の少なくとも１つに対してウサギRNIPのARG-L YS-ARG配列（配列番号４のアミノ酸137〜139）の少なくとも１つが置換され、かかる置換がヒトRNIPのLPS結合活性及び／又は抗凝血活性を増強させるものと期待されるヒトRNIP配列（配列番号２のアミノ酸134〜170を含む）に基づくものである。好ましくは２つ、より好ましくは３つ全ての置換が行なわれることになる。好ましいポリペプチドは、好ましいARG-LYG-ARG置換を伴うヒトRNIPを表わす配列番号６に記されている配列の少なくとも25のアミノ末端アミノ酸を含むことになる。好ましくは、ポリペプチドは少なくとも30のアミノ末端アミノ酸を含み、より好ましくは少なくとも32のアミノ末端アミノ酸を含み、又37のアミノ酸の配列全体を含んでいてもよい。第２の態様においては、本発明は、さまざまな有用な形態で哺乳動物のCAP18 遺伝子の全て又は一部分に対応する分離されたポリヌクレオチドを提供している。かかるポリヌクレオチドは、CAP18遺伝子の少なくとも一部分に対応するDNA及びRNA配列の両方（コーディング又は非コーディング配列）を含み、通常はこの遺伝子内の少なくとも約10個の連続する塩基の配列そして頻繁には最高でこの遺伝子の全長さを含んでいる。特定の一例として、ポリヌクレオチド配列は、CAP1 8分子のRNIPフラグメント又はCAP18分子全体又は無傷の分子の有用な活性を保持するCAP18分子のあらゆるフラグメントのアミノ酸をコードすることができる（か又はこのアミノ酸をコードするストランドに対し相補的であることができる）。本発明のポリヌクレオチドは同様に、例えば、それが組換え型遺伝子産物を産生するのに用いられようとしている場合には制御領域、リンカーなど、そしてポリヌクレオチドの操作及び／又は発現を容易にする可能性のあるその他の領域を含め、CAP18遺伝子の構造的領域に対応しない塩基をも含みうる。このポリヌクレオチドは又、特に融合された遺伝子産物を産生することが望まれる場合、その他の無関係な遺伝子の構造的領域を含むこともできる。ポリヌクレオチドとCAP18遺伝子の間の対応は、一般に、このポリヌクレオチドが天然に発生する哺乳動物の遺伝子と高度の配列相同性を有し、通常は少なくとも約40％の相同性、さらに通常は少なくとも約65％の配列相同性、又好ましくは少なくとも約90％の配列相同性を有することを意味する。しかしながら、このような高度の配列相同性は、特に天然のCAP18遺伝子産物に対応するポリペプチドを産生するため組換え型DNA構成体の一部分としてポリヌクレオチドが使用されているとき、つねに必要であるわけではないということがわかるであろう。遺伝子コードが冗長性のあるものであることから、産生されつつあるポリペプチドのアミノ酸構成を著しく変更することなく、実質的なヌクレオチド置換を行なうことが可能である。ポリヌクレオチドが望ましいポリペプチドすなわち上述のように天然に発生する遺伝子の産物と特定の相同性をもつものをコードすることが唯一不可欠なことである。多くの場合において、ポリヌクレオチドの中に置換を提供することが好ましい可能性さえあり、例えば組換え型DNA構成体が原核システム内で発現されなくてはならない場合、往々にして発現宿主により優先的に認識されるコドンを利用することが望まれる。さらに、対応は、一本鎖ポリヌクレオチドが、変動する緊縮性レベルの下で、天然に発生する遺伝子のDNA鎖と、或いはこの遺伝子により産生されるmRNAの写しに対してハイブリッド形成することができる、ということを意図している。ウサギCAP18及びヒトCAP18のためのcDNA配列は、以下の実験の項で詳述される通りに得られたものである。これらの配列は、配列番号１（ヒトCAP18）及び配列番号３（ウサギCAP18）の中に記されている。その他の種からの相同なCAP18遺伝子は、ウサギ及び／又はCAP18遺伝子に基づくプローブを用いて、同定及びクローニングすることができる。プローブはウサギ又はヒトのCAP18cDNAから直接誘導することもできるし、或いは配列番号１，２，３及び４に与えられているヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列に基づいて変性したプローブを合成的に調製することができる。このとき、プローブを使用して適当な遺伝子ライブラリー、特に哺乳動物の骨髄細胞から誘導されたライブラリをスクリーニングすることができる。代替的には、まず第１に適当な細胞供給源から相同なポリペプチドを分離し、このポリペプチドを少なくとも部分的に配列決定し、演繹されたアミノ酸配列に基づき変性プローブを調製することによって、その他の哺乳動物のCAP18遺伝子を得ることができる。このようなスクリーニング技術は、以下の実験の項で記述されている通りウサギの顆粒球CAP18を同定するために使用されるものと類似のものである。上述のとおり、骨髄細胞からその他の適当な哺乳動物の遺伝子ライブラリを得ることが可能である。哺乳動物のCAP18遺伝子の望ましい部分をコードする組換え型DNA分子の培養細胞中での発現により本発明のCAP18ポリペプチドを合成するためにCAP18ポリペプチドを利用することが可能である。哺乳動物のCAP18遺伝子はそれ自体天然のものでも合成のものでもよく、天然の遺伝子は上述のとおりの変性プローブを用いてcDNA又はゲノミックライブラリから得られる。以下の実験の項では、特異的なウサギのcDNA及びヒトcDNAクローンについて記述されている。代替的には、周知の技術によりポリヌクレオチドを合成することができる。例えば、最初にBeaucagen Carruthers（1981）Tett.Letters 22；1859-1862によって記述されたホスホルアマダイト方法により、一本鎖DNAフラグメントを調製することができる。次に、相補的ストランドを合成し適切な条件下でストランドを合わせてアニールするか、又は適切なプライマー配列を伴うDNAポリメラーゼを用いて相補的ストランドを付加することによって、２本鎖フラグメントを得ることができる。合成DNA 配列の調製は、Applied Biosystems，Inc.，Foster City，Californiaといった供給業者から入手可能な自動化された装置を用いて、便利に達成される。望まれるCAP18フラグメントに対してコードする天然又は合成DNAフラグメントは次に、インビトロ細胞培養内での発現へと導くことのできるDNA構成体の中にとり込まれることになる。通常DNA構成体は、酵母又は細菌といった単細胞宿主の中での複製に適したものとなる。代替的には、培養された哺乳動物又はその他の真核細胞系統のゲノムの中にDNA構成体を導入し組込むことが望ましい可能性もある。細菌又は酵母内へ導入するように調製されたDNA構成体は、宿主により認識される複製システム、望ましいポリペプチド産物をコードするCAP18DNAフラグメント、CAP18DNA配列の５′末端に接合された転写及び翻訳開始調節配列及びC AP18配列の３′末端に接合された転写及び翻訳終了調節配列を含むことになる。転写調節配列は、宿主により認識される非相同プロモータを含むことになる。有利には、CAP18DNA配列のための挿入部位と合わせて複製システム及び転写及び翻訳調節配列を含む入手可能な発現ベクターを、利用することができる。哺乳動物及びその他の真核細胞系統の形質転換のためには、DHFR遺伝子といった適切な標識の存在下での細胞系統の同時トランスフェクションを利用することができる。トランスフェクションは、化学的技法、弾道技法又は電気穿孔法を用いて達成できる。本発明の方法において有効であるためには、このCAP18ポリペプチドは一般に、実質的に純粋な形態すなわち標準的に少なくとも約50重量％（ｗ／ｗ）の純度で得られ、実質的に干渉するタンパク質及び汚染物質を含まない。好ましくは、 CAP18ポリペプチドは、少なくとも約80重量％、より好ましくは少なくとも約95 重量％の純度で分離されるか又は合成される。従来のタンパク質精製技術を用いて、少なくとも99重量％の純度の相同なポリペプチド組成物を得ることができる。例えば、CA P18タンパク質を、CAP18タンパク質に対して生じさせた抗体を用いてアフィニティクロマトグラフィにより精製することができる。本発明の分離され精製されたポリペプチドは、グラム陰性敗血症、自己免疫障害、炎症などといったLPS−関連状態を減衰、阻害又は防止するのに有効な薬学組成物の成分として取込むことができる。この組成物は、薬学的に受容できる担体の中に存在する本発明に従った少なくとも１つのポリペプチドを治療又は予防量だけ含んでいなくてはならない。薬学的に受容可能な担体は、ポリペプチドを患者に送り込むのに適した相容性ある無毒なあらゆる物質であってよい。無菌水、アルコール、脂肪、ワックス及び不活性固体を担体として使用することができる。薬学的に受容可能なアジュバント、緩衝剤、分散剤などを薬学組成物の中に取込むこともできる。このような組成物は、単一のポリペプチドを含むこともできるし、或いは又本発明に従ったポリペプチドを２つ以上含んで「カクテル」を形成することもできる。上述の薬学組成物は、経口又は非経口投与のために有効である。好ましくは、これらの組成物は非経口で、すなわち皮下、脈管内又は静脈内で投与される。代替的な投与様式、例えば鼻からの送り込み、呼吸による送り込み、経皮的送り込みなども利用できる。適切な組成物の形でのCAP18ポリペプチドの濃度は、大幅に、すなわち約0.1重量％未満、通常は少なくとも約１重量％から、20重量％以上に至るまで広く変動しうる。薬学組成物を調製するための特異的方法は、当該技術分野において周知のものであり、さまざまな出版物、例えば本書に参考として内含されているRemi ngtonの Pharmaceutical Science、第15版、Mack Publishing Company，Easton，Pennsyl vania（1980年）の中で、より詳細に記述されている。本発明の薬学的CAP18ポリペプチド組成物は、グラム陰性セプシス、自己免疫障害及びその他のLPS関係状態の予防的及び／又は治療的処置のために投与することができる。治療的応用分野のためには、この薬学組成物は敗血症性ショックといった状態の徴候をすでに示している患者に投与されることになる。予防的応用分野のためにはポリペプチドは、標準的にはグラム陰性菌感染の一次的抗生物質処置と組合わせて敗血症性ショックの徴候を示す前に患者に投与されることになる。本発明に従ったCAP18ポリペプチド組成物は同様に、グラム陰性敗血症の診断における患者の試料といった生物学的試料の中のLPSの存在を検出するためにも有用である。分離され精製されたCAP18ポリペプチドは、競合的及び非競合的（サンドイッチ）検定フォーマット；ラジオメーター、酵素、比色計、発光及び螢光フォーマット；相同性及び非相同性フォーマットなどを含むさまざまな従来の検定フォーマットにおいて、LPSのレセプターとして利用することができる。一般に、このような検定フォーマットは、試料中の未変性LPSの結合が検出されることになる、試料中に存在しうるLPSに対するCAP18分子の競合的又は直接的結合に依存するものである。医療、科学及び特許文献の中に数多くの適切なフォーマットが記述されている。以下の例は、制限的な意味の無い説明を目的として提供されるものである。実験１．ウサギCAP18のクローニング CAP18のタンパク質配列−0.25％のカゼイン化ナトリウムを500m1IP（腹腔内）注射することによって惹起させたウサギの腹膜滲出物細胞からウサギのCAP18を精製した。0.1Ｍのクエン酸を用いて、細胞を洗浄し抽出した。80％のエタノールで酸可溶性分画を沈降させ、ヘパリン−セファロースCL-6Bカラムに適用した。２ＭのNaClで溶出する密に結合したカチオン性タンパク質を、さらなる研究のために使用した。ヘパリン結合材料のCS逆相HPLCは、２つの主要ピークを生み出した。最初のピーク（926.1分）は、マウスのマクロファージからのLPS誘発された組織因子の生成を活発に阻害した（Hirata M．et al.，未公表データ）。活性ピークは、オンラインのApplied Biosystems 120A PTH−アミノ酸分析装置と共にAppliedBiosystemsの477A型タンパク質／ペプチドシーケンサーを用いて配列決定した。CAP18の推定上のＮ末端の最初の28個のアミノ酸は、次のとおりであった：GLY-LEU-ARG-LYS-ARG-LEU-ARG-LYS-PHE-ARG-ASN-LYS-ILE-LYS-GLU-LYS-LE U-LYS-LYS-ILE-GLY-GLN-（ASP又はLYS）-ILE-GLN-（GLN又はILE）−（GLY又はGL N）-LEU-LEU（配列番号７）。 Gen Bank及びNational Proteinのデータベースを検索することにより、この配列が唯一のものであることが判明した。なおこの配列が後にウサギCAP18のＣ末端RNIPフラグメントのＮ末端（配列番号４、アミノ酸135〜162）に対応することがわかった、ということに留意されたい。 cDNAライブラリの構築−ウサギの骨髄細胞を収穫し、チオシアン酸グアニジウムで溶菌させ、Maniatis T.，et al.，「分子クローニング；実験室マニュアル」（1982），Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York の通り、塩化セシウム勾配上で回転させた。オリギdT−セルロースカラム（Pharmacia）上で、Poly（A）＋mRNAを選択させた。cDNA合成システムプラスキット（Amersham）を用いて、cDNAライブラリを構築するために５μｇのmRNAを使用した。EcoRＩ制限部位をメチル化し、T4 DNAリガーゼ（New EnglandBiolabs）を用いて室温で一晩EcoRＩリンカーを連結させた。EcoRＩを用いて、余剰のリンカーを消化した。セファロースS-400カラムの上でcDNAをサイズ分画し、ラムダgt10ベクター（ラムダベクターキット、St ratagene）に連結させた。C600Hf1細胞を包装されたラムダで感染させ、NZYDTプレート上で成長させた。インサート部位に隣接するラムダのアームに対して作られたプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（Perkin Elmer Cetus ）を介してランダムプラークを増幅させた。 cDNAクローンの分離−CAP18フラグメントの配列のアミノ酸#11〜17から、20のヌクレオチドの変性プローブを設計した：５′−AA（CT）AA（GA）AT（CTA）AA （GA）GA（GA）AA（GA）CT（配列番号８）。プローブを、インサート部位と隣接するベクター誘導されたプライマーと対にした。増幅されたPCRフラグメントを、ジデオキシ鎖終結方法Sanger，F.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）（19 77），74：5463〜5467，Messing，J.Methods Enzymol，（1933），101：20〜78 による配列決定のため、m13mp18ファージ及びpcDNAIプラスミド内にサブクローニングさせた。200bPのPCRフラグメントが、既知のCAP18アミノ酸配列、いくつかの付加的な３′情報及びポリＡテイルをコードすることがわかった。このフラグメントは、メーカーの指示事項（Boehringer Mannheim）のとおりにランダムプライミングされたプローブを生成するために使用され、又、全長cDNAのためのライブラリをスクリーニングするために使用された。それぞれアミノ酸#11〜17及び#5〜21に対応する２対のオリゴヌクレオチドプローブが設計された。従来のスクリーニングを用いた最初の試みは、陽性クローンを同定できなかった。RCRを用いた代替的なアプローチを利用した。CAP18オリゴヌクレオチド#11〜17を、ラムダファージアームから設計したプライマと整合させた。 CAP18に対応する200bpのフラグメントを増幅し、精製し、cDNAライブラリをスクリーニングするために使用した。400,000のプラークのライブラリー内で、100 以上のクローンがプローブに対しハイブリッド形成した。これらの一次陽性のうちの20を再度平板固定させ、４つを配列分析のためプラスミドにサブクローニングさせた。ウサギCAP18のcDNA及び予想アミノ酸配列は、それぞれ配列番号３及び配列番号４の中に示されている。ウサギCAP18のcDNAは、29アミノ酸シグナルペプチドとそれに続く142のアミノ酸の成熟タンパク質をコードする。タンパク質は、16. 6kDaであり10というpIを有するものと予想される。Ｎ結合したグリコシル化部位は全く予想されていない。４つのシステインが存在する。エドマン分解から誘導された配列は、アミノ酸位置135で始まるタンパク質のカルボキシ末端に見い出される。 cDNAライブラリースクリーニング−集密的平板をニトロセルロースフィルターに移送させた。フィルターをUV架橋させ（Stratagene，UV Stratalinker）、50 ％のホルムアミド、50％PAM内で２時間インキュベートした。フィルターを、ランダムプライミングさせたプローブを含む新鮮な溶液を用いて42℃で一晩ハイブリッド形成させた。フィルターを室温で15分間２×SSC、0.1％のSDSの中で１回；次に１×SSC、0.1％SDSの中で：又３番目に0.5×SSC、0.1％のSDS内で洗浄した。陽性のものをm13mp18及び／又はpcDNA（Invitrogen）の中にサブクローニングさせ、配列決定した。 DNA及びタンパク質配列のコンピュータ解析−DNAマトリックスプログラムを用いて、予想アミノ酸配列の生成を行なった。PCGENEプログラムを用いてDNA配列に基づくタンパク質の一次及び二次構造の解析を実行した。プログラムFASTA及びTFASTA，Lipman，D.J.及びPearson，W.R.Science（1985），227 ；1435〜1441を用いて、ヌクレオチド及びアミノ酸レベルでの遺伝子バンク検索を行なった。２．ウサギのRNIPの同定 CAP18cDNAの配列から、CAP18の推定上のＮ末端ペプチドが実際にはCAP18タンパク質の内部フラグメントであることは明らかであった。従って我々はもとのタンパク質配列を再確認することを試みた。上述のとおり、好中球誘導されたヘパリンが結合したカチオン性タンパク質を調製し、C18逆相HPLCに適用した（図１）。我々は、主要ピークを配列決定した。分画14.5及び15.2でのピークはデフェンシンMCPI及びMCP2（Territo et al.（1989）J.Clin.Invest．84；2017〜2019 ）にそれぞれ対応する。分画25.8は、マクロファージに関係するタンパク質14（ MRP14）である（Odink et al，（1987）Nature 330；80-82）。20.3分での分画は約４〜５kDのCAP18のフラグメントに対応する。このフラグメントは、LPS誘発された反応性窒素中間体（RNI）の産生を阻害することが示されており、反応性窒素阻害タンパク質（RNIP）と命名された（図２）。図３は、培養されたマウスのマクロファージ細胞系統（RAW264.7）によるLPS誘発されたRNI産生の用量応答を立証している。マウスマクロファージ細胞系統RAW264.7（ATCCより入手）及びチオグリコレート惹起されたマウスの腹膜滲出物細胞を、RNIの産生のために使用した。細胞は、異なる濃度のLPS又はマウスr1FNγの存在下又は不在下で24ウエルの平板内で、RPMI-1640＋2.5％FCS中で1×10⁶／mlの割合で培養した。37℃ で24時間インキュベートした後、細胞を含まない上清を収集し、RNIの存在についてテストした。培地内の亜硝酸塩の蓄積は、標準として亜硝酸ナトリウムを用いてGriessの反応（Green etal.（1982）A nal.Biochem．126；11）に基づく比色計検定により測定される。試料（50μｌ）を50μｌのGriess試薬（１％のスルファニルアミド、0.1％ナフタレンジアミンジヒドロクロリド、2.5％のH₃PO₄）と混合させ、10分後、室温での吸光度を570n mで読み取る。図４は、LPSの化学量論的阻害物質であるポリミキシンＢによるRAW264.7細胞中のLPS〔５ng／ml誘発されたRNI産生の阻害を立証している。このような阻害は、以下でRNI活性の誘発に関する正の対照として用いられる。我々は図１においてピークとして示されているHPLC−精製されたウサギのペプチドの抗LPS活性をテストした。我々は、マクロファージからのLPS刺激された窒素ラジカルの放出を阻害するそれらの能力を測定した。図５は、RNIPに対応するピークのみが活性であったことを示している。RNIPは、IFNγ単独で又はIFNγと LPSの相乗的組合せによって刺激された、チオグリコレート惹起を受けたマウスのPECからのRNIの放出を阻害する（表１）。それに続いて、我々は、RNIPによるガンマインターフェロンの刺激を受けた窒素ラジカルの放出の阻害のためのIC50 が50nMよりも低いことを示した（表２）。さらに、RNIPは、ヒトマクロファージからのLPS及びIFNγの両方に誘発された TNFの放出を阻害する（表３）。従って、RNIPは、さまざまな刺激による活性化を減衰させるべくマクロファージに対し直接作用するLPS結合タンパク質から誘導された新しいペプチドである。要約すると、我々は、CAP18と呼称されたウサギの抗LPSタンパク質の一部分を精製し、タンパク質配列決定をした。この配列から、我々は、CAP18に対応するc DNAをクローニングした。外見上では、精製プロセス中、一片のCAP18をタンパク質分解により分割させる。RNIPと呼称されたこのフラグメントは、LPS及びIFNγ で活性化されたマクロファージによる窒素ラジカル及びサイトカインの放出を阻害することができる。３．合成ウサギRNIPペプチド上述のデータは全て、ウサギの顆粒球から精製されたRNIPを用いて得られたものである。従って、合成RNIPが類似の又は同一の活性を保持していたか否かを見極めることが有利であった。さらに、RNIPの小さなフラグメントがLPSに結合しマクロファージのLPS活性化を阻害するか否かを見極めることが有利であった。配列番号４の配列に基づいて、合成ウサギRNIP及び一連のウサギRNIP誘導されたフラグメントを生成した。これらのフラグメントは、標準的な手順に従って自動化された固相合成（Merrifield合成）を用いて作られた。各フラグメントはHP LCにより精製させた。表４は、ペプチドフラグメント及びLPS赤血球凝集検定におけるその活性、及び反応性窒素中間体（RNI）ラジカルのLPS誘発された放出の阻害をリストアップしている。赤血球凝集検定のためには、赤血球を以下のとおりLPSで感作させた。１％の赤血球懸濁液（ヒトＯ型、C3H／HeNマウス又はヒツジ）１mlを、0.2mlのLPS溶液と混合し、30分間37℃でインキュベートし、その後リン酸緩衝溶液（PBS）で洗浄し、その後懸濁液の濃度を1.0％に調整した。S-LPSの場合、溶液を１時間100 ℃で加熱してから赤血球の感作を行なった。LPSで感作した1.0％の赤血球懸濁液 50μｌをマイクロタイタ−Ｕ−平板内のCAPの２倍の階段希釈液50μｌと混合した。CAPの活性は、CAPの最小凝集濃度（MAC）として表わされた。Kirikae et al .（1986）Microbiol.Immunol．30；269〜274の方法に従って、50μｌのRe-LPSの２倍の階段希釈液を、50μｌの1.0％のウサギ赤血球懸濁液に付加し、３時間37 ℃でインキュベートした。Re-LPSの最小凝集濃度は1HA単位として表わされた。これらの実験の結果は、ペプチドフラグメント#36−1及び未変性RNIPフラグメント（#197）が活性であることを実証している。その他のフラグメントは、はるかに低い活性を有している。生物学的検定には、幾分か日によっての変動があるものの、これらのペプチドは10〜50nMの濃度で活性である。図６Ａ及び６Ｂは、 RAW264.7細胞内でのLPSで誘発された反応性窒素中間体（RNI）の産生の阻害に関して、活性合成RNIP（#197）と不活性フラグメント（#187）の用量応答を比較している。図６Ａは、阻害が無い場合のRNI産生を示し、一方図６Ｂはペプチド#19 7（RNIP）と#187の阻害効果を比較している。この検定におけるRNIPの50％の阻害濃度（IC50）は、約0.2μｇ／ml（約30nM）であることがわかる。 #36−1及び#197（RNIP）ペプチドがさまざまな種のグラム陰性菌からのLPSに結合することができるか否かを決定するため、もう１つの一連の実験を行なった。表５を参照のこと。これらの実験のためには、ヒツジ赤血球をサルモネラ・ミネソタ（Salmonella minnesota）Re-LPSで感作させた。ペプチド#36−1及び#197 （RNIP）をさまざまなLPS調製物で予めインキュベートした。両方のペプチド共さまざまな一群のリポ多糖体に結合する。以下の細菌性に対して、さらに抗菌検定を行なった：サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）LT2（S）、サルモネラ・ミネソタ（S．minneso ta）R595（Re）、エシェリキア・コリ（E．coli）09；K39（K⁺，K^-）、エシェリキア・コリ（E．coli）0111；B4、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、スタヒロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）（メチシリン感受性＝MSS A、及び耐性＝MRSA）及びカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）を用いた。最後の５つの菌株は、臨床的分離株であった。全ての菌株をトリプトソイ肉汁（EikenCo.，東京、日本）の中で成長させた。サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）LT2（S）、サルモネラ・ミネソタ（S. minnesota）R595（Re）、E．coli 09：K39（K⁺，K^- ）、エンシェリキア・コリ（E．coli）0111；B4及びクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）は、栄養寒天（Eiken Co．）上で平板固定した。シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）及びカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）は、NAC寒天及びGS（Guanofracin-Sabouraud）寒天平板上でそれぞれ平板固定した。対数期で細菌培養を収集し、pH 7.2のリン酸緩衝液で２回洗浄し、5×10³−1×10⁴細胞／mlという最終濃度になるまで調整した。450μｌの細菌懸濁液に対し50μｌのペプチドを付加し、１時間37℃でインキュベートし、寒天平板上で100μｌの反応混合物を平板固定した。37℃で24時間のインキュベーションの後、コロニー形成単位（CFU）を計数した。対照実験として、PBSを細菌懸濁液に付加し、１時間インキュベートし、寒天上で平板固定し、培養した。いくつかの実験については、対照CFUの百分率を測定した。トリプチカーゼ肉汁の中で一晩細菌を成長させた。翌日、10％のウシ胎児血清を用いてRPMI内で10⁵／mlの割合で細菌を懸濁させた。50μｌの細菌と50μｌのペプチドを含む96ウエルの平板の中で検定を設定し、37℃で一時間インキュベートし、次に各ウエルに１μCiの³Ｈ−チミジン（Amersham）を付加し、一晩細菌と共にインキュベートする。10％のTCAの付加により検定を終了させ、収穫してからM atrix96 Packardベーター計数器で計数する。ラフ型変異体菌株サルモネラミネソタRe（Salmonella minnesotaRe）について、ペプチド197（ウサギRNIP）、36−1，32−1、及び50−2の抗菌活性を測定した。図６Ｃは、サルモネラミネソタRe（Salmonella minnesota Re）CFU上の４つのペプチドの用量応答を示している。非LPL結合ペプチド32−1及び50−2は、活性でないが、一方LPS結合ペプチド197及び36−1は著しい抗菌活性（IC₅₀＜100ng／ml；40nM）をもつ。次に、スムーズ型腸内細菌株サルモネラチフムリウム（Salmonella typhimu rium）に対する活性をテストした（図６Ｄ）。LPS結合ペプチド197及び36−1が著しい抗菌活性（IC₅₀＝220−280nM）を有しているのに対し、非LPS結合ペプチド32−1及び50−2は活性でなかった。図６Ｅは、ペプチド197がその他２つの細菌臨床菌株すなわちシュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）（IC₅₀＜250μｇ／ml；40nM）及びクレブシエラニューモニエ（Klebsiella pn eumoniae）（IC₅₀＜440ng／ml；70nM）に対し著しい活性を有することを実証している。ペプチド36−1をシュードモナス・エルジノーサ（IC₅₀＜250ng／ml；50 nM）及びクレブシエラ・ニューモニエ（IC₅₀＜540ng／ml；100nM）に対してテストした場合にも類似の結果が得られた（グラフ示さず）。その他２つの対照実験を、非LPS結合ペプチドを用いて行なった。第１の場合（図６Ｆ）、ペプチド32−1及び50−2を高い濃度で単独で及びさまざまな組合せの形で付加し、S. チフィムリウム（S．typhimurium）のCFUに対するその効果を決定した。いかなる効果も観察されなかった。第２の場合では、S. チフィムリウム（S．typhimurium）をペプチド32−1で予め処理し、その後ペプチド197に露呈した（図６Ｇ）。この場合、ペプチド197による殺菌の阻害又は増大は全く観察されなかった。上で行なわれたものと組合わせた形でのこれらの実験は、ペプチド197（RNIP）の阻害効果が特定な構造的必要条件を有することを実証している。 CFU検定において示された抗菌活性を確証するため、細菌の増殖阻害を、³Ｈ− チミジン取込み検定を用いて直接テストした。この検定は同様に、CFUタイプの検定を偽性阻害するRNIPペプチドにより媒介された試験用菌株の集塊の結果もたらされるあらゆる人工産物をも対象としている。表５Ａに示されている結果は、RNIPが、E．coli（エシェリキア、コリ（E．coli）、クレブシエラ・ニューニモエ（Klebsiella pneumoniae）及び２つのシュードモナス（Pseudomonas）菌亜種の増殖を阻害することを実証している。要約すると、IC₅₀には菌株毎に幾分かの変動があるものの、２つの異なるタイプの検定においてテストされたグラム陰性菌株は全てこれらの抗微生物ペプチドに対し敏感であった。さらなる研究では、被包された菌株が検査された。図６Ｈは、被包されたエシェリキア・コリ（E．Coli）0.9：K39と被包されていないE．Coli 09：K39に対するペプチド197の活性を比較している。Ｋ^-菌株は、Ｋ⁺菌株（IC₅₀＝140ng／ml； 20nM）に比べて、ペプチドに対する感受性が低い（IC₅₀＝680ng／ml：110nM）。最後に、その他の抗微生物ペプチドが活性を示すのに非生理学的条件（例えば低張性緩衝液及び酸性pH5.0〜5.5）を必要とすることから、殺菌に対する血清の効果を研究した。表５Ｂは、RPMI-1640内で行なわれた増殖検定に対するウシ胎児血清の付加が抗菌活性における穏やかな減少しか結果としてもたらさないことを実証している。表５Ａは、ペプチド36−1がストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococc us pneumoniae）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes ）及びコアグラーゼ陽性のスタヒロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aur eus）を含むいくつかのグラム陽性菌株の増殖を阻害することを実証している。増殖検定を確証するため、次にペプチド36−1がメチシリン感受性（IC₅₀＝580ng ／ml；110nM）及びメチシリン耐性（IC₅₀＝720ng／ml；130nM）スタヒロコッカス・アウレウスの両方のCFUを阻害することを立証した（データ示さず）。図６１は、メチシリン感受性（IC₅₀＝940ng／ml；150nM）及びメチシリン耐性（IC₅₀ ＝1000ng／ml；160nM）スタヒロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus ）の両方に対するペプチド197の活性と、E．コリ（Coli）に対するその活性（IC₅₀ ＝500ng／ml；80nM）を比較して、抗グラム陽性活性を確認している。きわめて活性の高い抗菌ペプチド197及び36−1はカンジダ・アルビカンス（Ca ndida albicans）（データ示さず）及び多重薬物耐性マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）及び２つのマイコバクテリウム・アビウム菌株（データ示さず）に対し、０〜２０μｇ／mlの範囲全体にわたり不活性であった。これらのデータは、ウサギCAP18タンパク質のＣ末端が活性損失なく切形されうるものの、Ｎ末端はそれができないということを示してきた。２つの最高のLP S結合ペプチド197（RNIP）及び36−1は、テストされた全てのグラム陰性菌株に対して及び多くのグラム陽性菌株に対して、効力ある（サブミクロンモルの）抗菌活性を有する。さらに、生理学的培地内で中性pHにて血清の存在下で活性を実証した。カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）又は２つのマイコバクテリウム（Mycobacterial）菌株についてはいかなる活性も実証されなかった。 CAP18の活性は、グラム陽性又は真菌生体に対する活性が全くないもののさまざまなグラム陰性菌に対して抗菌活性を有することが当初立証されたBPIの活性と対照的である。アミノ末端フラグメント（rBPI₂₃）及びハロタンパク質(BPI₅₅ ）は両方共、被包されたE．コリ（Coli）に対して成長阻害活性（対照に比べ約1 00分の１の減少）を示した。BPI₅₅及びrBPI₂₃は両方共プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）のラフ型変異株の成長を阻害したものの、rBPI₂₃のみが野生型スムーズ型生体の成長を阻害した。rBPI₂₃もハロタンパク質BPI₅₅も、グラム陽性スタヒロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）の阻害を立証しなかＺた（Weiss et al．（1992）J.Clin.Invest．90：1122-1130）。顆粒球タンパク質のその他３つの族は、LPS結合及び抗微生物活性を示す。これに含まれるのは、ウシインドリシジンの13アミノ酸Ｃ末端ペプチド、デフェンシン及びアズロシジン（CAP37）の30−35アミノ酸族、である。インドリシジンペプチド及びデフェンシンは、低張性培地内でのグラム陽性及びグラム陰性菌の成長を阻害するだけであり、かくしてRNIPと区別される。最近の出版物は、CAP1 8から誘導されたものよりもおよそ２−３ログだけ高い濃度で活性であるCAP37から誘導されたペプチドについて記述している。４．ウサギRNIPに対する細胞レセプターリジン残基に付着されたビオチン基を用いてRNIPを調製した。このビオチン− RNIPは、RNI検定において生物学的活性をもつことが示された（すなわち、ビオチニル化は分子の活性を変更しなかった）。RAW264.7細胞を、培地の無い状態に洗浄し、１％のウシ胎児血清で補足したIscoveのDMEMの中で４℃にてビオチニル化したRNIPの結合を行なった。その後、細胞を余剰ビオチン−RNIPの無い状態に洗浄し、ストレプタビジン−フィコエリトリン（PE）を加えた。細胞に対するビオチン−RNIPの結合を、フローサイトメトリーを用いて評価した。結果は図７に示されている。５．RNIPは、RAW264.7細胞増殖のLPS誘発された阻害を逆転させる。 LPSをRAW264.7細胞に付加すると、これは、マクロファージ表現型への細胞の分化を伴って増殖の用量依存型阻害をひき起こす。図８は、LPSを５ng／ml含む培養に対してRNIPを付加した場合、これはRAW264.7マクロファージ細胞系統の増殖及び活性化の阻害を逆転させる。表６は、RNIP，CAP18及びデフェンシンHP−１及びHP−２（Territo et al．（ 1989）J.Clin.Invest．84：2017-2019）の、LPS誘発組織因子生成に対する効果の比較を示している。組織因子検定は、以下の通り行なわれた。マウスの腹膜細胞をチオグリコレート培地の腹腔内注入で惹起させ、５日後にピロゲンを含まない食塩水での灌注により収穫した。細胞をRPMI1640培地で洗浄し、計数し、グルタミン（0.29mg／ml）、ペニシリン（50単位／ml）及びストレプトマイシン（50／ml）を含む血清の無いRPMI培地内で1.5〜2.0×10⁶／mlの濃度で再懸濁させた。５％のCO₂雰囲気内で37℃で60分間、無菌培養びん（Nunclon，50ml，Inter Med）の中で、RPMI1640培地中の細胞懸濁液10mlをインキュベートすることにより、粘着細胞を調製した。無菌ゴムポリスマンでのびんの剥ぎとりにより可塑性の粘着細胞を回収した。次に粘着細胞を RPMI培地で２度洗浄し、培養管（Nunc cryotube，Inter Med）内で血清を含まない培地（1×10⁶／ml）中に再懸濁させ、５％のCO₂内で37℃で６時間、段階的用量のLPSで刺激した。細胞懸濁液を遠心分離させ、凝固検定が実行されるまで−8 0℃にて細胞ペレットを凍結させた。ヒト単核細胞を、ナトリウム−メトリゾエートーフィコール（リンパ球分離培地、日本抗体研究所、群馬）上での遠心分離により、クエン酸塩添加末梢血から分離させた。結果として得られる混合単核細胞懸濁液をRPMI1640培地で３回洗浄させた。細胞懸濁液（1×10⁶／ml）を16〜18時間LPSで剌激した。細胞ペレットに対してベロナール緩衝溶液（VBS）を付加し、凍結／解凍３サイクルで溶菌させ、手持ち式ソニケーターミクローブ（Handy Sonic，UR-20P型、トミー精工（株）、東京）で10秒間音波処理した。修正不活性化部分トロンポプラスチン時間（７）で組織因子活性をテストした（７）。マウスの血漿を用いて３分間37℃で10分の１mlの細胞リゼイト（1×10⁶／ml）を予めインキュベートした。次に、リン脂質を含む0.1mlの25mM−CaCl₂を混合物に付加し、フィブロメーター（Bio Quest部門、Becton Dickinson， Cokeysville，USA）を用いて凝固時間を測定した。組織因子活性を任意の組織因子単位（１μｇ／ml）に転位させるため、ウサギの脳の血液凝固促進剤（Simpla stin、小野薬品工業）の２倍の段階希釈液から得た標準曲線を使用した。ウサギの脳の懸濁液には1000単位の値が割合てられた。統計的分析：３〜４の試料から平均組織因子単位＋標準誤差を決定した。統計的に有意な差異を決定するため、対になっていないデータのためのスチューデントのｔ試験を利用した。0.05未満のテイル２つをもつＰ値が有意とみなされた。表７は、もう１つのカチオン性ペプチドCAP37（Morgan et al．（1991）J.Imm unol.147：3210-3214）が組織因子の生成を阻害することができない、ということを示す。この結果は、もう１つのカチオン性タンパク質がLPS活性を阻害しないことを立証している。デフェンシン及びヒストンを用いた類似の結果（表６）は、RNIP がLPSの特異的阻害物質であることを示唆している。６．RNIPのインビボ活性ガラクトサミンは、マウスを、1000以上の率でLPSの致死効果に対してマウスを感作させる。CAP18及びLPSを混合し、感作させたマウスの体内に腹腔内注入した。CAP18は、この型の内毒素血症においてLPSの致死効果を中和することができる。（表８参照）。７．ヒトCAP13のクローニングウサギRNIP（ウサギCAP18のＣ末端37アミノ酸）から設計されたPCRプライマーを用いて、ヒトCAP18を同定するべく（原文to不要）数多くの試みが行なわれた。このアプローチは成功しなかった。次に、ラムダgt11ヒト骨髄cDNAライブラリ（Clontech Laboratories，Palo Alto，CA）の百万個のプラーク及び対照から重複フィルターを調製した。１組のフィルターをウサギのCAP18cDNAでスクリーニングし、もう１組をウサギのRNIPプローブでスクリーニングした。両方のプローブを、PCRを用いて³²Ｐで標識付けした。その他のプローブを用いて標準緊縮性でスクリーニングされた合計50万個のプラークから、いかなる陽性も同定されなかった。しかしながら、CAP18プローブを用いて、減少させた緊縮性の下でスクリーニングされた合計50万個のプラークから、14の推定上の陽性を同定した。この場合、温度及び塩分は一定に保ち、予備ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション中ホルムアミドを50％から30％に低減させ、洗浄は65℃ではなく 50℃で行なった。最も強い陽性のうち６つを二次スクリーニングのために選び、そのうち４つが明確な個別の陽性プラークを生み出した。ラムダDNAを精製し、インサートをTA配列決定ベクターにクローニングした。これらのうちの１つは偽陽性であり、一方３つは、わずかに異なる長さのCAP18のcDNAとして確認された。ヒトCAP18のcDNA配列は、配列番号１に示され、対応するアミノ酸配列は、配列番号２に示されている。 cDNAは、アミノ末端システインプロテアーゼ阻害物質ドメインとカルボキシ末端エンドトキシン結合ドメインという２つのドメインをもつタンパク質を明らかにした。図９は、ヒト及びウサギのCAP18のcDNAを比較している。図10は、ウサギのCAP18、ヒトCAP18タンパク質及びブタシステインプロテアーゼ阻害物質であるカテリン、を比較している。以下の表９は、Ｎ末端システインプロテアーゼドメインとRNIPドメインの両方におけるウサギ及びヒトのCAP18タンパク質の核酸及びアミノ酸組成物相同体を比較している。カルボキシ末端RNIPドメインに比べてＮ末端システインプロテアーゼ阻害物質ドメインにははるかに高いレベルのアミノ酸保存が存在する。８．ヒトRNIPの生物学的活性配列番号２のアミノ酸134〜170を含むヒトRNIPポリペプチドを、メリーフィールド固相合成方法により合成させた。ヒトRNIPのLPS阻害活性を、配列番号４内のウサギ配列のアミノ酸135〜171を含むウサギRNIPのものと比較した。LPS（2.5 ng／ml）の存在下で反応性窒素中間体（酸化窒素）を産生するRAW264.7の刺激された培養に対して、等モル濃度のヒト及びウサギの両方のRNIP（１μＭ，0.25 μＭ及び0.03μＭ）を導入した。結果は図11に示されている。９．RNIPの抗凝血活性凝血及びうっ血は、外傷性傷害及び微生物の侵入に対する宿主の防御システムの重要な構成要素である。感染特にエンドトキシンの放出に付随する感染は、播種性血管内凝固（DIC）と呼ばれる状態である凝血カスケードの過度の活性化をひき起こすことができる。従来、凝血カスケードは２つの部分すなわち内因性経路と外因性経路に分けられてきた。内因性経路は、損傷を受けた血管内皮細胞からのコラーゲンの露呈に対し二次的なＸII因子からＸIIａ因子の変換によって活性化される。外因性経路は、活性化された単球及びマクロファージにより発現される組織因子（血液凝固剤前駆体、組織トロンボプラスチン）により開始されている。組織因子は、VII因子をVIIａ因子に変換させ、組織因子−VIIａ複合体はＸ因子をＸａ因子に及びIX因子をIXａ因子に変換する。両方の経路は、Ｘａ因子、Ｖ因子、リン脂質及びカルシウムイオンの複合体から成るプロトロンビナーゼの生成時点で収束する。プロトロンビナーゼは、プロトロンビン（II因子）をトロンビン（IIａ）に変換する。トロンビンは、フィブリノーゲンからフィブリン単量体を生成する。単球及びマクロファージの両方ならびに内皮細胞は、LPSにより組織因子を合成するべく誘発されることから、外因性経路はLPS誘発されたD ICにおいて重要な役割を果たすものと思われる。25年前に報告された研究は、顆粒球が、ヘパリン（Saba et al．1968，Blood 31：369-380）に結合した抗凝血カチオン性タンパク質（Saba et al.（1967）J.Clin.Invest.46：580-589）を含んでいることを示した。多形核好中球（PMN）は、抗微生物活性をもつことが示された数多くのカチオン性タンパク質及びペプチドを含んでいる。最も良く特徴づけられたものとしては、殺菌性／透過性増強タンパク質（BPI）、デフェンシン及びアズロシジン（CAP37）がある。ここで、LPS結合RNIPペプチドが、マウスマクロファージからの組織因子のLPS 誘発された生成を阻害するということを立証する。さらに、RNIPペプチドが、２つの部位すなわちＸ因子の活性化及びプロトロンビンからトロンビン（II因子からIIａ因子への）変換において凝血カスケードを阻害することをも実証する。RN IPの推定上のヘパリン結合ドメインは、次の３つの観察事実の強い相関関係のため、凝血阻害に関与している：（ａ）LPS結合ペプチドは凝血を阻害するが、非結合ペプチドはこれを阻害しない；ｂ）LPS結合ペプチドはRNIPのＮ末端でコンセンサスヘパリン結合ドメインを含むもののLPS非結合ペプチドはこれを含まない；ｃ）ヘパリン結合ドメインを含むペプチドは、凝血を阻害するが、一方このドメインを含まないものは凝血を阻害しない。凝血検定は、次のとおりに行なわれた：凝固方法：ヒト血清（Ortho血漿管理、Ortho Diagnostic Co.）。ATPP試薬（オルガノ−テクニカ、東京、日本）。標準組織因子、ウサギ脳トロンボプラスチン（Simplastin、小野薬品工業、東京、日本）。精製ヒトVII因子、Ｘ因子、Ｘａ因子（Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO）。Russel Viper毒液（RVV）及びE chis Carinatus毒液（ECV，SigmaCo.）。合成色素産生基質方法：Ｘａ因子、S2222のための基質（Kabi，Bz-Ile-Glu-Ar g-pNA）を使用した。II因子（プロトロンビン）のための基質、Boc-Val-Pro-Arg -pNA（Sigma Chemical Co.）を使用した。装置：凝固検定は、フィブロメーター（BioQuest部門、Becton Dickinson：Co keysville，NC，USA）を用いて行なわれた。組織因子検定。サルモネラミネソタスムーズ型LPSを５分間、各ペプチド（１ μｇ／ml）でインキュベートし、次にチオグリコレート刺激から４日後に得られた腹膜マウスマクロファージに対し混合物を付加した。凝固検査による組織因子の検定に先立ち６時間、細胞を培養した。プロトロンビン時間（PT）。３分間37℃で各ペプチドを100μｌずつ用いてヒト血漿（100μｌ）をインキュベートし、次に100μｌの組織因子（250μｇ／ml ）CaCl₂を付加し、凝固時間を測定した。部分トロンボプラスチン時間（PTT）。ヒト血漿（100μｌ）を３分間37℃で各ペプチド（100μｌ）とインキュベートし、次にリン脂質を含む100μｌのCaCl₂ を付加し、凝固時間を測定した。活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）。ヒト血漿（100μｌ）、100μｌのAPTT試薬及び100μｌのペプチドを５分間37℃でインキュベートし、その後CaC l₂を加え、凝固時間を測定した。Ｘａ因子誘発された凝固検定。100μｌのヒト血漿、50μｌのＸａ（0.2単位／ ml）及び50μｌの各ペプチド（0〜40μｇ／ml）を３分間37℃でインキュベートし、次に、混合物に対して100μｌの25mM−CaCl₂を付加し、凝固時間を測定した。合成基質を用いたＸａ因子活性。37℃で10分間、VII因子（１単位／ml、200μ ｌ）、Ｘ因子（１単位／ml、200μｌ）、組織因子（2.5mg／ml、50μｌ）、25mM −CaCl₂（50μｌ）及び50μｌのいくつかの濃度のペプチドの反応混合物をインキュベートした。200μｌの反応混合物に対して、60μｌの４mMのＳ−2222、Ｘａ因子のための合成基質及び340μｌのトリス−HCl緩衝液、pH 8.2を付加し、15 分間さらにインキュベートした。50％の酢酸60μｌを付加することにより反応を停止させ、Ｐ−ニトロアニリンについてのODを405nmで読み取った。 Echis Carinatus毒液（ECV）によるプロトロンビンの活性化、プロトロンビン（II因子）（0.1単位／ml、200μｌ）、ECV（１単位／ ml、200μｌ）、さまざまな濃度のペプチド（70μｌ）、50μｌの25mM−CaCl₂及び180μｌのトリス緩衝液の反応混合物を、37℃で10分間インキュベートした。3 00μｌの反応混合物に対して、60μｌの４mMトロンビン基質及び240μｌの緩衝液を付加し、さらに15分間インキュベートした。Ｘａ因子によるプロトロンビン活性化（３段階に分割）。ａ）Ｘ因子の活性化。因子VII（１単位／ml、400μｌ）、組織因子（５mg／ml ）、100μｌ）及びCaCl₂の反応混合物を37℃で10分間インキュベートすることにより、Ｘ因子（１単位／ml、400μｌ）を活性化した。ｂ）プロトロンビン（II因子）の活性化。250μｌの反応混合物に対して、II因子（１単位／ml、50μｌ）、複数の濃度のペプチド（25μｌ）及びリン脂質（50 μｇ／ml、25μｌ）を付加し、37℃で10分間インキュベートした。ｃ）トロンビン基質の加水分解。300μｌの反応混合物（段階ｂ）に対して、トロンビン60μｌの基質及び240μｌのトリス緩衝液を付加し、さらに15分間インキュベートした。修正PTシステムにおけるヘパリン及び合成ペプチドの相互作用。各々の反応混合物は以下のものを含んでいた：100μｌのヒト血漿；50μｌの緩衝液又はペプチド；100μｌの組織因子（250μｇ／ml）。組織因子致死量モデル。基準の組織因子（Simplastin，１mg／マウス）は、ペプチドと共に又はペプチド無しでインキュベートされたddyマウス（雄、生後２週間、38〜45g）の体内に注入されたIVであった。 10．RNIPペプチドは、マクロファージによるLPS誘発された組織因子の生成を阻止する。チオグリコレートで刺激されたマウスの腹膜マクロファージとの混合に先立って37℃で５分間、さまざまな濃度のサルモネラ・ミネソタ（Salmon ella minnesota）スムーズ型LPSを各ペプチド（197（RNIP），36−1，32−1、及び50−2）とインキュベートした。凝固検定により、６時間後の組織因子の産生を測定した。図12には、LPSに応答して誘発された組織因子及びRNIPペプチド（1 μｇ／ml）、197及び36−1によるこの応答の阻害を示す。非LPS結合ペプチド32 −1及び50−2は、LPS誘発された組織因子を阻害できない。LPSが不在の場合、これらの細胞によっていかなる組織因子も合成されない。次に、LPS剌激を加えた後のさまざまな時点で、LPS刺激されたマクロファージに対して合成RNIPペプチド（197）を付加した。LPS刺激から３時間も経過した時点でペプチド197を付加した時点でさえ、LPS誘発された組織因子の生成の著しい阻害が見られた（図13）。要約すると、LPS結合活性を有するRNIP誘発されたペプチドは、組織因子のLPS誘発を阻害し、一方、LPS結合活性の無い関係するカチオン性ペプチドは、組織因子のLPS誘発を阻害しない。 11．RNIPペプチドはインビトロ凝固検定を阻止する。前述の研究は、組織因子活性が顆粒球の表面膜と関連していることを示していた。しかしながらこれらの細胞の均質化又は音波分析は、組織因子活性を低減させるものであるということが観察され、この阻害はカチオン性タンパク質の放出のせいであるとされた。組織因子のための検定が凝固カスケードを利用することから、顆粒球誘導されたカチオン性タンパク質が凝固カスケードのその他の部位を直接阻害する可能性があると推論された。従って、一連のインビトロ凝固検定においてRNIPペプチドがテストされた。活性ペプチド、197（RNIP）及び36−1は、プロトロンビン時間（PT）を阻害したが、不活性ペプチド32−1及び50−2は阻害しなかった（図14Ａ）。付加的な研究は、活性ペプチドに焦点をあてていた。両方のペプチド共、部分トロンボプラスチン時間（PTT）（図14Ｂ）及び活性化部分トロンボプラスチン時間（aPTT）（図14Ｃ）を、全て用量依存的に阻害した。最後に、いずれのペプチドも、最高10μｇ／mlのペプチド濃度でさえ、トロンビン誘発された凝固を阻害できなかった（データ示さず）。これらの従来のインビトロ凝固検定の結果は、内因性及び外因性の両方の経路に共通の段階をペプチドが阻害している可能性があるということを示唆した。従って、Ｘ因子を研究するために２つの検定が行なわれた。第１のケースでは、活性ペプチド197及び36−1がＸａ因子誘発凝固を阻害することが示され（図15Ａ）、第２のケースでは、Russell Viper毒液（RVV）活性化凝固を阻害することが示された（図15Ｂ）。初期凝固研究についてのIS50は、表10に要約されている。 12．RNIPペプチドによるＸ因子の活性化〔Ｘ──Ｘａ〕の阻害初期研究では、Ｘａ因子により誘発された凝固のペプチド阻害が立証されたため、Ｘａ基質S2222を用いて、ペプチドによるＸａの直接的阻害が測定された。1 0μｇ／ml以上の濃度でRNIPペプチド197 又は36−1を用いた場合、直接的Ｘａ阻害の証拠は全く見い出せなかった（表11 ）。次に、２つの方法によってＸ因子からＸａ因子への変換に対するRNIPペプチドの効果を研究した。最初のケースでは、ペプチド197及び36−1は、それぞれ6. 7μｇ／ml（1.1μＭ）及び10.0μｇ／ml（1.9μＭ）のIC50で、Ｘ因子からＸａ因子の直接的RVV活性化を阻害した（図16Ａ；表11）。第２のケースでは、Ｘ因子が組織因子及び精製されたVII因子により活性化された場合、両方のペプチド共、0.3〜0.7μｇ／ml（40〜100μＭ）のIC50で、用量依存性阻害を示した（図６Ｂ；表11）。要約すると、これらの研究は、Ｘ因子からＸａ因子への変換を阻害することによりペプチドが凝固カスケードを阻害することを確認した。 13．RNIPペプチドによるプロトロンビン活性化（II因子──IIa因子）の阻害ペプチドは、Ｘａ誘発された凝固を阻害したことから、我々はこれらのペプチドが付加的な部位において作用するという仮説を設けた。色素産生検定を用いて、トロンビンの直接阻害は全く見られなかった（データ示さず）。従って、プロトロンビンの活性化（II因子からIIａ因子）の研究は、２つの方法によって行なわれた。第１のケースでは、活性RNIPペプチド197及び36−1が、精製されたII因子からIIａ因子のEchis carinatus毒液による活性化を阻害したものの、不活性ペプチド32−1及び50−2はこれを阻害しなかった（図17Ａ；表11参照）。第２のケースでは、II因子が、組織因子、VII因子及びＸ因子のインキュベーションにより形成されたＸａによって活性化された時点で（上述のとおり）、両方の活性ペプチドが用量依存性阻害を示した（197に対するIC₅₀ 2.8μｇ／ml）50nM；36 −1に対するIC₅₀＜1.8μｇ／ml）＜30nM〕（図17Ｂ：表11）。要約すると、これらの研究は、RNIPペプチドがプロトロンビンの活性化（II因子からIIａ因子への変換）を阻害することを立証した。 14．RNIPは、組織因子致死率からマウスを防御する。 RNIPペプチドの抗凝血活性を、急性の動物モデルで研究した。組織因子IV（Si mplastin，１mg／マウス）の直接注射は、急性血管内凝固及び死を、３分以内でひき起こす。RNIPペプチド197は、表12に示されているように、組織因子で処置されたマウスの死亡率を57％減少させ生存時間を延ばした。 15．検討結果は、ウサギ顆粒球タンパク質CAP18から誘導されたペプチドの効力ある抗凝血活性を実証している。ウサギCAP18のクローニングは、この分子が２つのドメインで構成されていることを明らかにした。Ｎ末端ドメインは、当初システインプロテアーゼ阻害物質として精製されたブタのカテリンに対し高い相同性を有する。精製されたヒトCAP18は同様に、多大なシステインプロテアーゼ活性を立証している。CAP18のＣ末端37アミノ酸ドメイン（RNIP）は、LPS誘発された窒素ラジカルの産生を阻害するその能力についてHPLC分画をテストしたとき、LPS結合ドメインとして同定された。マウスのマクロファージからのLPS誘発された酸化窒素の放出のLPS結合及び中和について、大量の一連のRNIP誘導ペプチドを研究した。これらの結果は、RNIPタンパク質のＣ末端を活性損失なく切形できるもののそのＮ末端はそれができない、ということを立証した。ウサギRNIPペプチドは、プロトロンビン時間、部分トロンボプラスチン時間及び活性化部分トロンボプラスチン時間を含む一連の標準的なインビトロ凝固検定において、阻害活性を実証したが、トロンビンに対する直接的作用については全く証拠がなかった。Ｘａ因子の活性に対する直接的効果について、いかなる証拠も見い出せなかった。しかしながら、Ｘａ因子誘発された凝固（図15Ａ）及びRu ssell Viper毒（RVV）で活性化された凝固の両方共が、ウサギのRNIPペプチドにより阻害された。これらの結果は、色素産生検定を用いて確認された。かくして、活性ウサギRNIPペプチドの１つの活性は、Ｘａ因子の活性化を阻害することにある。ペプチドは、Ｘａ因子誘発凝固を阻害したため、我々は、これらのペプチドが付加的な部位、つまり考えられるものとしてはプロトロンビンの活性化（II因子からIIａ因子）で作用するか否かを調査した。ウサギRNIPペプチドは、精製されたII因子からIIａ因子のEchis carinatus毒液による活性化及び、組織因子、VII 因子及びＸ因子のインキュベーションにより形成されたＸａによるII因子の活性化の両方を阻害した。かくして、これらの研究は、凝固カスケードの少なくとも２つの阻害部位すなわちＸ因子の活性化及びプロトロンビンの活性化を同定する。精確な阻害のメカニズムは明らかでない。しかしながら、これらの凝血段階は両方共リン脂質を必要とすることから、ペプチドが、活性に必要とされるリン脂質に結合することによってこれらの酵素の活性と干渉する可能性がある。このタイプの活性をもついくつかの分子が、これまでに記述されてきた。例えば、Maki et al．（1984）Europ.J.Obsted.Gynec.Reprod.Biol.17：149-154は、カルシウム及びリン脂質に結合したヒトの胎盤からの抗凝血タンパク質を分離した。このタンパク質は、アネクシン族のタンパク質（greisow）に属する。しかしながら、Russell Viper 毒液によるＸ因子の及びEchis carinatus毒液によるプロトロンビンの活性化がリン脂質を必要としないという観察事項は、ペプチドによる凝固カスケードにおけるこれらの段階の阻害が単純なリン脂質結合よりも複雑なものでありうる、ということを示唆している。我々は、ウサギCAP18が、高いNaCl濃度（2.0Ｍ）でヘパリンーセファロースから溶離されたため、ヘパリンに対する高い親和力の結合部位を有する、ということを推論する。この推論と一貫しているのは、特にＣ末端RNIPドメインにおける塩基性アミノ酸の高い含有量という発見事実である。表13は、一連の既知のヘパリン結合タンパク質とのRNIPの配列比較を示している。これらのタンパク質の多くがコンセンサスペプチド配列、X-B-B-X-X-B-B-B-X-X-B-B-X-X（配列番号９）を含んでいる。なおここでＢは塩基性アミノ酸、又Ｘはあらゆるアミノ酸である（Sobet et al,（1992）J.Biol.Chem.267:8857-8862）。この配列は、RNIPのＮ末端に現われる。我々は、RNIPのこのドメインがヘパリン結合にとって重要であるばかりでなく、LPS結合にも参加するという仮説を設ける。RNIPの活性及び不活性フラグメントの配列を比較すると、不活性フラグメントにこの無傷のヘパリン結合ドメインが欠如していることが明らかとなる。ヒトRNIPペプチドには、活性の高いウサギRNIP内に存在するコンセンサスヘパリン結合ドメインが欠如している。ヒトRNIPはウサギRNIPの抗LPS活性を幾分か維持しているものの、予備研究は、ヒトRNIPに有意な抗凝血活性が欠如していることを示している。これらの発見事実は、ヘパリン結合仮説の確証となる。無傷ヘパリン結合ドメインと抗凝血活性の相関関係が発見された。ヘパリン及びヘパリノイドが、近年抗凝血剤として集中的に研究されてきている。ヘパリンは、抗トロンビンIIIと結合してそのトロンビン親和力を増大させることによって、その活性を媒介すると考えられている。 VIIａ因子及びＸａ因子の阻害物質であるプロテアーゼ阻害物質組織因子経路阻害物質（TFPI）の活性も又、ヘパリンにより増強される。RNIPは、その高い塩基性電荷のため、標的タンパク質、細胞表面ヘパラン又はその他の負に帯電した炭水化物の上の陰イオンドメインと相互作用することができる。標的分子は未知であるが、制限ある構造研究から、RNIPの活性における高度の特異性が明らかになっており、これは、反対に帯電したヘパリノイドについても共通する発見事実である。上述の発明は、明白に理解できるようにすることを目的として、図や例を用いて或る程度詳しく記述されてきたが、添付のクレームの範囲内でいくつかの変更及び修正を行なうことができるということも明らかである。配列表（１）一般情報：（ｉ）出願人：ラリック，ジェイムスＷ．ライト，スーザンＣ．平田ミシマサ（ii）発明の名称：リポ多糖体結合及び抗凝固血活性を有するヒトカチオン性タンパク質（iii）配列数：30 （iv）文書通信用住所：（Ａ）：名宛人：タウンゼント・アンド・タウンゼント・クーリー・アンド・クルー（Ｂ）：街路名：１，マーケットプラザ，スチュアートタワー，スィート2000 （Ｃ）：都市名：サンフランシスコ（Ｄ）：州名：カリフォルニア（Ｅ）：国名：アメリカ合衆国（Ｆ）：郵便番号：94105 （ｖ）コンピュータ読み取り形式（Ａ）媒体のタイプ：フロッピーディスク（Ｂ）コンピュータ：IBM PCコンパチブル（Ｃ）オペレーションシステム：PC-DOS／MS-DOS （Ｄ）ソフトウエア：パテントイン、リリース#1.0、ヴァージョン#1.25 （vi）現行出願データ：（Ａ）出願番号：PCT （Ｂ）申請日：（Ｃ）分類：（Viii）弁理士／代理人情報：（Ａ）氏名：ヘースリン，ジェームスＭ．（Ｂ）登録番号：29,541 （Ｃ）参照／事件整理番号：15325-9PC （ix）電気通信情報：（Ａ）電話番号：415-326-2400 （Ｂ）ファックス番号：416-326-2422 （２）配列番号１に関する情報（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：584塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖構造：１本（Ｄ）トポロジー：直線（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノミック）（xi）配列の内容：配列番号１（２）配列番号２に関する情報（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：170アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ）鎖構造：１本（Ｄ）トポロジー：直線（ii）分子のタイプ：タンパク質（xi）配列の内容：配列番号２（２）配列番号３に関する情報（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：587塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖構造：１本（Ｄ）トポロジー：直線（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノミック）（xi）配列の内容：配列番号３（２）配列番号４に関する情報（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：171アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ）鎖構造：１本（Ｄ）トポロジー：直線（ii）分子のタイプ：タンパク質（xi）配列の内容：配列番号４（２）配列番号５に関する情報（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：96アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ）鎖構造：１本（Ｄ）トポロジー：直線（ii）分子のタイプ：タンパク質（xi）配列の内容：配列番号５（２）配列番号６に関する情報（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：37アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ）鎖構造：１本（Ｄ）トポロジー：直線（ii）分子のタイプ：ペプチド（xi）配列の内容：配列番号６（２）配列番号７に関する情報（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：29アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ）鎖構造：１本（Ｄ）トポロジー：直線（ii）分子のタイプ：ペプチド（ix）特徴：（Ａ）名称／キー：部位（Ｂ）位置：23 （Ｃ）その他の情報：／註＝”XaaはAsp又はLysである” （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：部位（Ｂ）位置：26 （Ｃ）その他の情報：／註＝”XaaはGln又はIleである” （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：部位（Ｂ）位置：27 （Ｃ）その他の情報：／註＝”XaaはGly又はGlnである” 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Detailed Description of the InventionMammalian cationic protein with lipopolysaccharide binding and anti-pseudoblood activity Part of this study was funded by the NIH grant. The US Government A person who may have certain rights. Background of the Invention 1.Field of the invention The present invention generally relates to lipopolysaccharide (LPS) related diseases such as Gram-negative sepsis. Compositions and methods for the treatment and diagnosis of More specifically, the present invention provides Preparation of certain mammalian cationic proteins for such treatment and diagnosis And regarding use. A rational approach to control Gram-negative sepsis is based on the underlying bacterial infection. To neutralize the toxic effects of lipopolysaccharide released during the treatment of. Polymix Cationic antibiotics, such as protein B, can bind to several types of lipopolysaccharide. It neutralizes it, but its use is limited due to toxicity. Some LPS neutralizing compounds Noclonal antibodies recognize a common type of LPS, but all Gram-negative bacteria Not effective against seeds. Many lipo-conserved species in many species such as Lipid A core Antibodies raised against glycosides are not effective against certain types of LPS Seems to be. Certain mammalian polypeptides that bind LPS have been identified. It was Among these are LPS binding protein (LBP) and bactericidal permeability enhancing protein. Quality (BPI) is included. BPI can neutralize the toxic effects of LPS. Particularly advantageously for the present invention, in rabbit granulocytes, about 16.6 A cationic protein with a molecular weight of kD was identified. Known as CAP18 This protein binds to LPS and binds its activity in several in vitro assays. Was found to attenuate. However, for the purpose of treating and diagnosing humans, it is often the mammalian phase. It is preferred to utilize the human form of the protein rather than the same. This is In particular, the human form of the protein is significantly different from other mammalian forms of homologous proteins. This is true when they are different. However, in other mammals Even when a protein is identified and cloned, the amino acid sequence of the human homologue Identification of a human form of a protein is difficult when the sequence is significantly different from the mammalian prototype. It can be difficult. Often, there is some improvement over the native form of the protein It is desirable to provide human or humanized proteins. For example, treatment And diagnostically effective proteins and polypeptides are naturally occurring in humans or other Can be a truncated or truncated form of the mammalian protein of. Protein and polype Therapeutic forms of peptide also enhance the activity of proteins in some desirable way It is also possible to make corrections at certain residues. Providing improved methods for the treatment of lipopolysaccharide-related diseases such as Gram-negative sepsis It is desirable to offer. In particular, lipopolysaccharide-related disorders that occur in such diseases It is desirable to identify compositions and methods that can inhibit or neutralize harm Be done. Furthermore, it is possible to bind to lipopolysaccharide and inhibit or neutralize its activity. It would be desirable to provide isolated and purified mammalian cationic proteins. In particular, mammals produced synthetically or recombinantly, such as mammalian CAP18. It is desirable to provide a cationic protein. Furthermore, it binds to lipopolysaccharide Isolated and purified human cation capable of inhibiting or neutralizing its activity To provide sex protein Is desirable. Furthermore, in combination with other desirable activities such as anticoagulant activity Human and other mammalian cationic tans with lipopolysaccharide binding activity in different forms It is also desirable to provide a quality modification. 2.Description of background art Endotoxin: by Hirata et al in Structural Aspects of Host Responses and Immunobiology ., “In RE-LPS induced by cationic proteins from rabbit granulocytes Sensitized erythrocyte agglutination ”; conference abstract Riva del Sols, Giovinazzo (BARI), I taly, May 29-June 1, 1986, aggregated red blood cells sensitized with lipopolysaccharide The Extraction of Cationic Proteins from Capable Rabbit Peritoneal Granulocytes Has been described. May 22-23 Endotoxin II in Amsterdam, The Netherlands Abstracts of the International Conference on Tsunoda et al. (1987), page 79, describes anticoagulant activity. Described for the activity of cationic proteins from rabbit granulocytes containing . An international symposium on endotoxin held in Osaka, Japan from May 16 to 19. In the abstract of Z. Yoshida et al., (1988), page SII-3, the molecular weight of 2 kD to 70 kD is shown. The granulocyte cationic protein has been described. August 19 in Tokyo, Japan Shimom at the XII Annual Meeting of the International Society for Thrombosis and Congestion, held from 25th to 25th ura et al. (1989) abstract 1228, 389, describes rabbit granulocyte cationic tan. The anticoagulant and antibacterial activity of the protein is described. September 16-22, Japan large IUMS conference held in Osaka: Hirata et al (1990) abstract of bacteriology and myciology S33-3, 1 On page 9, a cationic protein from rabbit granulocytes with an estimated molecular weight of 18 kD. Describes quality. May 10-12 in San Diego, California Hirata at the first conference of the International Endotoxin Society of Japan et al. (1990) Abstract II-P-87 also shows 18 kD cations from rabbit granulocytes. Sexual proteins are described. Hirata et al. (1990), endotox , Friendman et al., Eds., Plenum Publishing Co., pp. 287-299, rabbits. Partial purification of cationic protein (rabbit CAP18) from granulocytes Has been described. For cloning and expression of rabbit CAP18, see Larricket a l., (1991), Biochem.Biophys.Res.Comm. 179; 170-175. For cloning and expression of mammalian CAP18, see copending application Ser. No. 07 / 916,7. 61 and 07 / 916,765, the entire disclosures of which are hereby incorporated by reference. It is included. These applications were filed at the same time with Reactive Nitrogen Inhibitory Protein (RNIP) It also describes the so-called active carboxy-terminal fragment of CAP18. Sab a et al. (1967) J. Clin. Invest. 46: 580-589 and (1968) Blood 31: 369-380 Describes the presence of a cationic protein with anticoagulant activity in granulocytes. I was Summary of the Invention The present invention provides for the treatment and treatment of certain lipopolysaccharide-related conditions such as Gram-negative sepsis. And / or diagnosis and / or treatment of coagulation-related disorders such as disseminated intravascular coagulation (DIC). Thus, an effective composition and method are provided. This composition binds to lipopolysaccharide and It also has a molecular weight of 2 to 80 kD, which can inhibit the in vitro and in vivo activity of Certain isolated and purified mammalian cationic proteins and polypeptides Comprising. At least some of the proteins and polypeptides of the invention Will also have a high affinity binding site for heparin and will exhibit anticoagulant activity . The composition further comprises a mammalian cell suitable for expressing the gene in cell culture. Cationic protein Contains isolated polynucleotides and genes encoding DNA constructs It In this way, the isolated and purified polypeptide can be used in recombinant form in cell culture. Can be produced by The separated and purified polypeptide is then labeled with lipoproteins. At risk for or suffering from a polysaccharide-related condition and / or a coagulation-related disorder When administered to a host, it is used for treatment. Furthermore, such lipopolysaccharide The polypeptide composition may also be used to diagnose patients suffering from a related condition. It For such diagnostic methods, a patient sample, typically blood, is treated with a cationic Between the lipopolysaccharide and the protein that may be present in the sample and may be present in the sample Detecting the binding of Brief description of the drawings FIG. 1 shows neutrophil-derived heparin-bound cuts as described in the experimental section. Reversed phase HPLC generated from on-protein. FIG. 2 is a hydrotherapy procedure for CAP18 based on the amino acid sequence derived from DNA sequence 1. Feel. 29 amino acid amino terminal signal sequence and 37 amino acid carboxy terminal The edge-reactive nitrogen inhibitory protein (RNIP) is shown. Figure 3 shows the lipopolysaccharide (LPS) -induced response as described in the experimental section. FIG. 3 is a graph showing a dose response of production of a reactive nitrogen intermediate (RNI). FIG. 4 shows LPS induction by polymyxin B as described in the experimental section. 2 is a graph showing inhibition of RNI production. Figure 5 shows the inhibition of LPS-induced RNI production as described in the experimental section. The activity of RNIP on several other mammalian cationic proteins It is a graph shown. FIG. 6A is a graph showing the production of RNI in RAW264.7 as a function of LPS concentration. . Figure 6B shows the production of RNI in RAW264.7 cells induced by 2.5 ng / ml LPS. FIG. 6 is a graph showing the inhibitory effects of various concentrations of peptides # 197 (RNIP) and # 187. . 6C-6E show the antibacterial activity of four synthetic RNIP peptides against various bacterial strains. Shows sex. FIG. 6F shows the antibacterial activity of synthetic RNIP peptides that do not show LPS binding activity. FIG. 6G shows that peptide 32− does not bind to LPS and does not inhibit the activity of RNIP peptide 197. Indicates 1. FIG. 6H shows that E. K of coli (Escherichia coli)⁺And K^-Against the strain Shows the antibacterial activity of RNIP. Figure 6I shows RNIP peptide 197 against both Gram-negative and Gram-positive bacteria. Shows antimicrobial dose response. Figure 7: Labeled with biotin for RAW264.7 mouse macrophage cells 7 is a graph showing the binding of different RNIPs. FIG. 8 shows the effect of RNIP on LPS-induced inhibition of RAW264.7 cell proliferation. It is a graph. FIG. 9 is a comparison of CAP18 cDNA sequences in human and rabbit. SEQ ID NO: 1 shows the human cDNA sequence, and SEQ ID NO: 3 shows the rabbit cDNA sequence. It FIG. 10 shows the protein encoded by the cDNA sequence of FIG. Is a comparison of amino acid sequence homology of amino acids. The human amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2. The rabbit amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4, and the porcine cathelin sequence is SEQ ID NO: 4. No. 5 is shown. Figure 11 shows the RNI production of RAW cells as detailed in the experimental section below. It is a comparison of the inhibitory effects of human RNIP and rabbit RNIP. Figure 12 shows Salmonella minnesta (Sa) as described in more detail in the experimental section below. lmonella minnesota) for 5 minutes with peptide 197 (RNIP), 36-1, 32-1, And 50-2 (1 μg / ml) and then the mixture was mixed with thioglycol. Add to mouse macrophages stimulated with cholate and incubate for 6 hours before coagulation Assaying tissue factor by assay, in inhibiting LPS-induced production of tissue factor 2 is a chart comparing the effects of two active and two inactive RNIP peptides of. Figure 13 shows RNIP (peptidic) at different concentrations 0, 1 and 3 hours after LPS. 197) comparing the production of LPS-induced tissue factor. 14A-14C show prothrombin time (PT), partial thromboplasti, respectively. Dose (PTT) and activated partial thromboplastin time (aPTT) 12 shows the anticoagulant activity of the four peptides of FIG. 12 as a function of Figures 15A and 15B show Factor Xa-induced coagulation and Factor X activating enzyme, respectively. , Shows the effects of active synthetic peptides 197 and 36-1. 16A and 16B show the effects on factor X activating enzyme and factor Xa, respectively. Peptide 197 (RNIP) and 36-1 are compared for inhibition of production. Figures 17A and 17B show prothrombin activity by Echis carinadus venom, respectively. Of four test peptides for sexual activation and prothrombin activation by factor Xa Comparing the effects. Description of specific embodiments The present invention is directed to coagulation-related disorders such as disseminated intravascular coagulation (DIC) and / or Treats and diagnoses certain lipopolysaccharide (LPS) related conditions such as Gram-negative sepsis Compositions and methods for doing so are provided. Gram-negative sepsis treated with antibiotics Can often accelerate the inflammatory process and cause significant tissue damage The consequences of host infection by Gram-negative bacteria are exacerbated by the large release of LPS. It happens as a result. Disseminated intravascular coagulation is the cause of coagulation in patients throughout small blood vessels Childhood and / or hemorrhagic syndrome resulting from uncontrolled activation of fibrinolytic enzymes . As a result, fibrin is deposited and platelets and coagulation factors are consumed. Fibrinolysis The product inhibits fibrin polymerization resulting in tissue necrosis and hemorrhage. Currently, some aspects of the LPS-initiated immunoinflammatory cascade Is known to some extent. LPS is present in plasma and is induced 10 times by hepatocytes Binds to at least one LPS-binding protein (LBP) known to I know I will. LPS bound to this protein With Ikin 1 (IL1), tumor necrosis factor (TNF), tissue factor and nitric oxide synthetase To increase the synthesis of many important enzymes and mediators such as It binds to CD14, a leukocyte differentiation antigen that sends a messenger signal of 2. These molecules are , Contributes to tissue damage associated with capillary leak syndrome and endotoxemia. Some of the therapeutic and diagnostic aspects of the invention are described, for example, in the experimental section below. Certain natural cuts produced by mammalian white blood cells, especially granulocytes, such as It relies on the binding of LPS to onic proteins (and their derivatives). these Cationic proteins are generally 2 kilodaltons (kD) to 80 kD, usually 10 kD to 20 within kD It will have a molecular weight and a PI within the range of 8-11, usually 9-10. Rabbit granules The cationic protein obtained from the sphere has a calculated molecular weight of 16.6 kD (its amino Acid sequence) and a PI of 10. The cationic tag of this rabbit granulocyte The protein has been called CAP18 based on its previously estimated molecular weight. Including human The homologous mammalian cationic proteins from other species are generally: It will be referred to as CAP18 in the description and claims. CAP18 is an LPS-sensitized sheep erythrocyte blood cell, combined with conventional protein separation and purification techniques. Combined with an in vitro assay that identifies its ability to bind and aggregate spheres (SRBCs). It can be identified by the set. For more information on specific purification procedures, see It is shown in the experimental section below. CAP18 was first tested in rabbits as reported in the experimental section below. It was cloned. Surprisingly, cloned and sequenced here The human form shows only about 70% amino acid sequence homology with the rabbit form, Amino acid sequence homology within the RNIP region (described below) is less than 38%. This Due to the low sequence homology, such as As explained, cloning of human analogs has become difficult. The human forms of CAP18 and CAP18RNIP also inhibit bacterial growth of Gram-negative bacteria. , But to a lesser extent, also found to inhibit bacterial growth of Gram-positive bacteria There is. In contrast, rabbit RNIPs generally show greater activity than human RNIPs. It is capable of inhibiting the growth of both Gram-negative and Gram-positive bacteria. It has also been discovered that human RNIP has no anticoagulant activity. In contrast to this Rabbit RNIP, by contrast, binds to factor Xa through coagulation cascades. It was found to inhibit CAP18 appears to play a role in the vertebrate inflammatory response, with most LPS forms Conditions and can neutralize LPS-mediated activation of monocytes. CAP18 itself Reactive Nitrogen Inhibitory Peptide (RNIP) capable of inhibiting macrophage activation ) Containing a short peptide normally present at its carboxy terminus . LPS released by Gram-negative bacteria is combined with LPS binding protein (LBP) Thus providing an activation signal by binding to CD14 on macrophages Is currently considered. Such activation of macrophages causes sepsis It is effective in exacerbating various LPS-related conditions. CAP18 and its active fragments inhibit and attenuate macrophage activation. And thus be effective in treating such LPS-related conditions It Currently, binding of CAP18 to LPS allows macrophages via RNIP fragments. Is believed to provide an inhibitory signal. However, this mechanism Correctness is not dependent on a particular activation mechanism for the present invention. Is not central. Similarly, RNIP fragments of CAP18 from several species, especially rabbits, Prothrombin time (PT) test, partial thromboplastin time (PTT) test and Standard in vitro coagulation with activated partial thromboplastin time (aPTT) assay Shows anticoagulant activity in the assay. The RNIP fragment also has high binding to heparin. It has a synergy. The anticoagulant activity of the RNIP peptide depends on the activation of prothrombin (II Factor to factor IIa). RNIP demonstrated in experimental section below As shown, purified factor II to factor IIa by Echis carinatus venom Activation, and tissue factor, factor VII and X Both Factor II activation by Factor Xa formed by factor incubation It has been proved to inhibit. Thus, the anticoagulant activity is within the coagulation cascade. Of activation of at least two sites in the body, namely factor X and prothrombin. It seems to be induced by harm. The exact mechanism of inhibition is not clear, but Since both of these coagulation stages require phospholipid binding, the RNIP peptide Can interfere with such binding. However, with the venom of Russell Viper Factor X Activation by Echis carinatus and Prothrombin Activation by Venom of Echis carinatus Does not require phospholipid binding in the RNIP peptide of the coagulation cascade It suggests that the inhibition by can be quite complex. In a first embodiment of the invention for use in diagnostic and therapeutic procedures , Isolated and purified CAP18 polypeptide is provided. "Separated and refined "Done" means that the polypeptide is separated from its cellular source as detailed below. Separated and purified to the desired purity. Such separated and purified The polypeptide is at least about 9, usually 25-175, and more usually 25. It will contain ~ 150 amino acids. This polypeptide is shown in SEQ ID NO: 2. And the sequence of rabbit CAP18 shown in SEQ ID NO: 4. Such is identical or homologous to the native sequence in the mammalian CAP18 molecule. Particularly effective in the present invention is the small number of RNIP fragments of the CAP18 molecule. And a polypeptide comprising substantially active portion, and a polypeptide comprising substantially the entire CAP18 molecule. It is a peptide. Polypeptides of the invention are generally represented in SEQ ID NO: 2 and / or SEQ ID NO: 4. At least about 60% of the native mammalian CAP18 sequence, such as that provided. Has sequence homology, usually at least about 80% sequence homology, more usually at least about 90% sequence homology, and often 95 It has a sequence homology of not less than%. However, here sequence homology is not always It need not be sufficient to provide a polypeptide according to. Also, this port Lipeptides have the ability to bind most or all forms of LPS and are usually Can inhibit the activation of macrophages. In many cases, this poly is described in more detail in the experimental section below. Peptides are measured by conventional assays such as PT, PTT and aPTT assays. It is also desired to have a defined anticoagulant activity. In some cases, a polypeptide according to the present invention may be used in native mammalian CAP18 or Is preferably substantially identical to the RNIP polypeptide. "Substantially the same Means that the amino acid sequence is shown in Sequence 2 on a residue-by-residue basis. It has the same sequence or, alternatively, a limited number of amino acid insertions, deletions or substitutions. In addition, such alterations in the amino acid sequence significantly change the activity of the protein It means nothing. Usually within the 37 amino acid RNIP region of SEQ ID NO: 2 There will be less than 5 insertions, deletions and / or substitutions, preferably 3 missing. There are, and more preferably less than two insertions, deletions and / or substitutions. Polype Ptide will retain its "human" character as well. That is, in general It will be primarily recognized as human when administered. Depending on the case, the singular number in human RNIP (amino acids 134 to 170 in SEQ ID NO: 2) or Multiple amino acids can be assigned to heterologous amino acids in rabbit RNIP (amino acids 135-171 in SEQ ID NO: 4). It may be desirable to replace it with a mino acid. Human RNIP is generally, especially gram The antibacterial activity against positive bacteria is lower than that of rabbit RNIP. Have been discovered It was LYS for non-basic amino acids in human RNIP such as GLY, ASP, PHE and LYS And ARG by replacing basic amino acids from rabbit RNIP. The activity of human peptide will be enhanced without losing the humanity of tide. It is considered. In particular, basic amino acids near the amino terminus of rabbit RNIP were compared to human RNIP. Cause of both the presence of anticoagulant activity and greater LPS binding activity of rabbit RNIP in the case It is believed that This idea is based on various modified Gui RNIP peptide tested and results in deletion of basic amino acids at the amino terminus Both LPS binding activity and anticoagulant activity will be lost. In the experimental section below It is based on the evidence provided. In addition, at least 5 of rabbit RNIPs At least a portion of carboxy-terminal amino acids, including two carboxy-terminal amino acids It has been shown that the truncation results in only a slight loss of activity. For these reasons, the preferred RNIP peptides according to the present invention have the position of human RNIP. Rabbit RNIP ARG-L against at least one of the GLY-ASP-PHE sequences in 136-138 At least one of the YS-ARG sequences (amino acids 137 to 139 of SEQ ID NO: 4) has been replaced, or It is expected that such replacement will enhance the LPS binding activity and / or anticoagulant activity of human RNIP. Based on the awaited human RNIP sequence (comprising amino acids 134-170 of SEQ ID NO: 2) is there. Preferably two, and more preferably all three substitutions will be made . Preferred polypeptides represent human RNIP with preferred ARG-LYG-ARG substitutions Contain at least 25 amino terminal amino acids of the sequence set forth in SEQ ID NO: 6 become. Preferably, the polypeptide comprises at least 30 amino terminal amino acids , More preferably containing at least 32 amino-terminal amino acids and also containing 37 amino acids It may include the entire array. In a second aspect, the invention provides mammalian CAP18 in various useful forms. Provides an isolated polynucleotide corresponding to all or part of a gene . Such polynucleotides include DNA and DNA corresponding to at least a portion of the CAP18 gene. And RNA sequences (coding or non-coding sequences), usually A sequence of at least about 10 consecutive bases within a gene and often at most this Includes the full length of the gene. As a specific example, the polynucleotide sequence is CAP1 Retains useful activity of 8 RNIP fragments or whole CAP18 molecule or intact molecule Can encode amino acids in any fragment of the CAP18 molecule ( Or it may be complementary to the strand encoding this amino acid) . The polynucleotide of the invention may also be used, for example, to produce a recombinant gene product. Control regions, linkers, etc., if Other regions that may facilitate the manipulation and / or expression of the Including, it may also include bases that do not correspond to the structural region of the CAP18 gene. This porinuk Reotide may also be conjugated to a gene product, especially if it is desired to produce a fused gene product. It may also include structural regions of other unrelated genes. The correspondence between a polynucleotide and the CAP18 gene is generally that of this polynucleotide. Naturally occurring mammalian genes and high degree of sequence Have homology, usually at least about 40% homology, more usually at least about 65% Having a sequence homology of, and preferably at least about 90% sequence homology To do. However, such a high degree of sequence homology is especially associated with the native CAP18 gene. As part of a recombinant DNA construct to produce a polypeptide corresponding to the product That it is not always necessary when polynucleotides are used You can see that. Produced because the genetic code is redundant Substantially unchanged without significantly changing the amino acid composition of the polypeptide being developed. It is possible to make nucleotide substitutions. Preferred Polynucleotide It also has a certain homology with the product of the peptide or naturally occurring gene as described above. Coding one is the only thing essential. In many cases, poly It may even be preferable to provide a substitution in the nucleotide, eg a recombination Often, when a recombinant DNA construct must be expressed in the prokaryotic system, It is desirable to utilize codons that are preferentially recognized by the expression host. further, The correspondence is that single-stranded polynucleotides naturally occur under varying stringency levels. To the DNA strand of the gene to be processed, or the copy of the mRNA produced by this gene It is intended to be capable of hybridizing. The cDNA sequences for rabbit CAP18 and human CAP18 are detailed in the experimental section below. It was obtained on the street. These sequences are SEQ ID NO: 1 (human CAP18) and sequence It is written in column number 3 (rabbit CAP18). Homologous CAP18 genes from other species are based on rabbit and / or CAP18 genes. The probe can be used to identify and clone. The probe is a rabbit Can be derived directly from human or human CAP18 cDNA, or is SEQ ID NO: 1. Given to 2, 3 and 4 Probe that has been denatured based on the nucleotide sequence and / or amino acid sequence It can be prepared synthetically. At this time, use a probe to Screening libraries derived from burreries, especially mammalian bone marrow cells can do. Alternatively, first of all, the homologous polypeptide may be isolated from a suitable cell source, The polypeptide was at least partially sequenced into the deduced amino acid sequence. By preparing a denaturing probe based on other mammalian CAP18 gene Can be obtained. Such screening techniques are described in the experimental section below. Similar to that used to identify rabbit granulocyte CAP18 as described Things. As described above, other suitable mammalian gene libraries were obtained from bone marrow cells. It is possible to Recombination Encoding a Desirable Portion of the Mammalian CAP18 Gene Synthesis of CAP18 Polypeptides of the Present Invention by Expression of Large DNA Molecules in Cultured Cells It is possible to utilize a CAP18 polypeptide for this purpose. Mammalian CAP18 gene May be natural or synthetic in their own right, and natural genes are Obtained from cDNA or genomic libraries using denatured probes. The following experiment Section describes specific rabbit and human cDNA clones. . Alternatively, the polynucleotide may be synthesized by well known techniques. An example For example, first Beaucagen Carruthers (1981) Tett.Letterstwenty twoBy 1859-1862 Prepare single-stranded DNA fragments by the phosphoramadite method described in Can be Next, synthesize complementary strands and prepare the strands under appropriate conditions. Anneal together or with a DNA polymerase with appropriate primer sequences Can be used to obtain a double-stranded fragment by adding complementary strands. You can Synthetic DNA Sequence preparations include Applied Biosystems, Inc., Foster City, California It is conveniently accomplished using automated equipment available from suppliers. Natural or synthetic DNA fragment coding for the desired CAP18 fragment Into a DNA construct that can lead to expression in in vitro cell culture. Will be captured. Usually the DNA construct is a unicellular host such as yeast or bacteria. It is suitable for duplication in. Alternatively, a cultured mammal or other Possibility of Introducing and Incorporating DNA Constructs into the Genome of Eukaryotic Cell Lines There is also. DNA constructs prepared for introduction into bacteria or yeast are Recognized replication system, CAP18 DNA fragment encoding the desired polypeptide product Segment, transcriptional and translational initiation regulatory sequences and C joined to the 5'end of the CAP18 DNA sequence. It will include transcriptional and translational termination regulatory sequences joined to the 3'end of the AP18 sequence. Transcriptional control sequences will include a heterologous promoter recognized by the host. Existence Advantageously, the replication system and transcription and transcription are combined with the insertion site for the CAP18 DNA sequence. Available expression vectors containing translational control sequences are available. Mammal And for transformation of other eukaryotic cell lines, a suitable marker such as the DHFR gene. Co-transfection of cell lines in the presence of knowledge can be utilized. Transfection can be accomplished using chemical, ballistic or electroporation techniques. Wear. To be effective in the methods of the invention, the CAP18 polypeptide generally , In a substantially pure form, ie typically at least about 50% by weight (w / w) purity And substantially free of interfering proteins and contaminants. Preferably, The CAP18 polypeptide is at least about 80% by weight, more preferably at least about 95%. Wt% purity Separated or synthesized. At least using conventional protein purification techniques It is also possible to obtain homologous polypeptide compositions with a purity of 99% by weight. For example, CA The P18 protein was affinitized using an antibody raised against the CAP18 protein. It can be purified by chromatography. The isolated and purified polypeptide of the present invention is useful for Gram-negative sepsis, autoimmune disorders. Effective pharmaceuticals to attenuate, inhibit or prevent LPS-related conditions such as harm, inflammation, etc. It can be incorporated as a component of the composition. This composition has a pharmaceutically acceptable carrier. Treating or preventing at least one polypeptide according to the invention present in the body It must contain only quantity. A pharmaceutically acceptable carrier is a polypeptide. It may be any compatible, non-toxic substance suitable for delivery to the patient. Sterile water , Alcohols, fats, waxes and inert solids can be used as carriers It Pharmaceutically acceptable adjuvants, buffers, dispersants and the like in the pharmaceutical composition. You can also import. Such compositions may also include a single polypeptide. Alternatively, a “cocktail” comprising two or more polypeptides according to the invention It can also be formed. The above-mentioned pharmaceutical composition is effective for oral or parenteral administration Is. Preferably, these compositions are parenterally, i.e. subcutaneously, intravascularly or intravenously. Administered intravascularly. Alternative modes of administration, such as nasal delivery, respiratory delivery It is also possible to use ingestion and percutaneous delivery. The concentration of CAP18 polypeptide in the form of a suitable composition is significantly, i.e. about 0.1 times higher. Widely varies from less than% by weight, usually at least about 1% by weight to over 20% by weight You can. Specific methods for preparing pharmaceutical compositions are well known in the art. Various publications, such as Remi, which is included herein by reference. ngton Pharmaceutical Science, 15th Edition, Mack Publishing Company, Easton, Pennsyl It is described in more detail in vania (1980). The pharmaceutical CAP18 polypeptide composition of the present invention may be used for gram negative sepsis, autoimmunity. Administered for prophylactic and / or therapeutic treatment of disorders and other LPS-related conditions be able to. For therapeutic applications, this pharmaceutical composition is suitable for septic shock. Will be administered to patients who are already showing signs of such a condition. Preventive response For applications, polypeptides are typically the primary antibiotic for Gram-negative bacterial infections. To be administered to patients before they show signs of septic shock in combination with quality treatment Become. The CAP18 polypeptide composition according to the present invention also provides a diagnosis of Gram-negative sepsis. To detect the presence of LPS in biological samples such as patient samples in It is useful. The isolated and purified CAP18 polypeptide is competitive and non-competitive ( Sandwich) assay format; radiometer, enzyme, colorimeter, luminescence and fluor Optical formats; various conventional formats including homologous and heterologous formats, etc. It can be used as a receptor for LPS in an assay format. one Generally, such assay formats detect binding of native LPS in a sample. Competitive or direct binding of the CAP18 molecule to LPS that may be present in the sample Depends on. Numerous suitable formats in the medical, scientific and patent literature Is described. The following examples are provided for purposes of non-limiting explanation. Practical experiment 1.Cloning of rabbit CAP18 CAP18 protein sequence−0.25% sodium caseinate 500m1 IP (intraperitoneal) Rabbit CAP18 was isolated from rabbit peritoneal exudate cells induced by injection. Purified. The cells were washed and extracted with 0.1 M citric acid. 80% ethanol The acid-soluble fraction was sedimented with a gel and applied to a heparin-Sepharose CL-6B column. . Tightly bound cationic proteins eluting with 2M NaCl were used for further study. Used for. CS reverse-phase HPLC of heparin-bound material yields two major peaks did. The first peak (926.1 min) is induced by LPS from mouse macrophages Actively inhibited the production of tissue factor (Hirata M. et al., Unpublished data). Activity Peaks are compatible with the online Applied Biosystems 120A PTH-Amino Acid Analyzer. Sequenced using Applied Biosystems' 477A protein / peptide sequencer Decided. The first 28 amino acids at the putative N-terminus of CAP18 are: Got: GLY-LEU-ARG-LYS-ARG-LEU-ARG-LYS-PHE-ARG-ASN-LYS-ILE-LYS-GLU-LYS-LE U-LYS-LYS-ILE-GLY-GLN- (ASP or LYS) -ILE-GLN- (GLN or ILE)-(GLY or GL N) -LEU-LEU (SEQ ID NO: 7). This database is searched by searching the databases of Gen Bank and National Protein. The row turned out to be the only one. This sequence will be used later for the C-terminal of rabbit CAP18. Corresponding to the N-terminal of the terminal RNIP fragment (SEQ ID NO: 4, amino acids 135 to 162) Note that Construction of cDNA library-Harvest rabbit bone marrow cells and extract guanidinium thiocyanate. Maniatis T., et al., “Molecular Cloning; Laboratory Manual (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York Rotate on a cesium chloride gradient, as Let Select Poly (A) + mRNA on the Origi dT-cellulose column (Pharmacia). I made a choice. Using the cDNA synthesis system plus kit (Amersham), cDNA library 5 μg of mRNA was used to construct the plasmid. Methylation of EcoRI restriction site, T4 Ligation of EcoRI linkers at room temperature overnight using DNA ligase (New England Biolabs) Let Excess linker was digested with EcoRI. Sepharose S-400 Color The cDNA was size-fractionated on the membrane and the lambda gt10 vector (lambda vector kit, St ratagene). C600Hf1 cells were infected with packaged lambda and NZYDT Grow on rate. Made for the lambda arm adjacent to the insert site Polymerase chain reaction (PCR) (Perkin Elmer Cetus ) Was used to amplify random plaques. Isolation of cDNA clonesFrom the amino acids # 11-17 of the sequence of the CAP18 fragment, A modified nucleotide probe was designed: 5'-AA (CT) AA (GA) AT (CTA) AA. (GA) GA (GA) AA (GA) CT (SEQ ID NO: 8). Place the probe adjacent to the insert site Was paired with the vector-derived primers. The amplified PCR fragment , Dideoxy chain termination method Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (19) 77),74: 5463-5467, Messing, J.Methods Enzymol, (1933),101: 20-78 Subcloning into the m13mp18 phage and pcDNAI plasmid for sequencing by I was trained. A 200bP PCR fragment containing the known CAP18 amino acid sequence It has been found to encode additional 3'information and a poly A tail. This hula Gumento is random according to the manufacturer's instructions (Boehringer Mannheim) Used to generate primed probes and also for full-length cDNA It was used to screen the library. Two pairs of oligonucleotides corresponding to amino acids # 11 to 17 and # 5 to 21, respectively A cleotide probe was designed. The first attempt using traditional screening is No positive clone could be identified. Using an alternative approach using RCR It was The CAP18 oligonucleotides # 11 to 17 were designed using the lambda phage arm. Aligned with Lima. A 200 bp fragment corresponding to CAP18 was amplified, purified, and the cDNA library was screened. Used for cleaning. 100 in a library of 400,000 plaques The above clones hybridized to the probe. These primary positives 20 of them were re-plated and 4 were subcloned into plasmids for sequence analysis. I let you go. The cDNA and predicted amino acid sequence of rabbit CAP18 is SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: respectively. It is shown in No. 4. Rabbit CAP18 cDNA is a 29 amino acid signal peptide Followed by a mature protein of 142 amino acids. The protein is 16. It is expected to be 6 kDa with a pI of 10. N-linked glycosylation site Is not expected at all. There are four cysteines. Derived from Edman decomposition The sequence identified is found at the carboxy terminus of the protein beginning at amino acid position 135. Is done. cDNA library screening-A nitrocellulose filter on the confluent plate Transferred to. UV-crosslink the filter (Stratagene, UV Stratalinker), 50 % Formamide, incubated in 50% PAM for 2 hours. Filter Hive overnight at 42 ° C with fresh solution containing randomly primed probe. Lid formed. Filter once in 2x SSC, 0.1% SDS for 15 minutes at room temperature Then in 1x SSC, 0.1% SDS: and third in 0.5x SSC, 0.1% SDS It was Substituting the positive one into m13mp18 and / or pcDNA (Invitrogen) And sequenced. Computer analysis of DNA and protein sequences-DNA matrix The program was used to generate the predicted amino acid sequence. PCGENE program The analysis of the primary and secondary structure of the protein was carried out using the DNA sequence. Professional Gram FASTA and TFASTA, Lipman, D.J. and Pearson, W.R. Science (1985),227 Genebank search at nucleotide and amino acid levels using 1435-1441 Was done. 2.Identification of rabbit RNIP From the sequence of CAP18 cDNA, the putative N-terminal peptide of CAP18 is actually the CAP18 protein. It was clear that it was an internal fragment of the protein. Therefore, we An attempt was made to reconfirm the protein sequence. As mentioned above, neutrophil-induced hepa A phosphorus-bound cationic protein was prepared and applied to C18 reverse phase HPLC (Figure 1). ). We sequenced the major peaks. The peaks in fractions 14.5 and 15.2 are def NMCMCPI and MCP2 (Territo et al. (1989) J. Clin. Invest. 84; 2017-2019 ) Respectively. Fraction 25.8 is associated with macrophage-related protein 14 ( MRP14) (Odink et al, (1987) Nature 330; 80-82). Fractionation at 20.3 minutes Corresponds to a fragment of CAP18 of approximately 4-5 kD. This fragment induces LPS Has been shown to inhibit the production of reactive nitrogen intermediates (RNI) It was named Nitrogen Inhibitory Protein (RNIP) (Fig. 2). Figure 3 shows cultured mice Response of LPS-induced RNI production by a macrophage cell line (RAW264.7) in Escherichia coli Is proved. Mouse macrophage cell line RAW264.7 (obtained from ATCC) and Thioglycollate-induced mouse peritoneal exudate cells were used for RNI production. I used it. Cells were cultured in the presence or absence of different concentrations of LPS or mouse r1FNγ for 24 hours. 1 x 10 in RPMI-1640 + 2.5% FCS in the ell plate⁶The culture was performed at a ratio of / ml. 37 ° C After incubating for 24 h at 37 ° C., the cell-free supernatant was collected for the presence of RNI. I tested it. Accumulation of nitrite in the medium Reacts with Griess using sodium nitrite as a standard (Green et al. (1982) A nal.Biochem. It is measured by a colorimetric test based on 126; 11). Sample (50 μl) 50 μl of Griess reagent (1% sulfanilamide, 0.1% naphthalenediamine Dihydrochloride, 2.5% H₃PO_Four), And after 10 minutes, the absorbance at room temperature is 570n. Read with m. Figure 4 shows RAW264.7 cells with polymyxin B, a stoichiometric inhibitor of LPS. Demonstrating inhibition of LPS [5 ng / ml-induced RNI production in. Such inhibition Used below as a positive control for the induction of RNI activity. We show the HPLC-purified rabbit pep that is shown as the peak in FIG. Tide was tested for anti-LPS activity. We found that LPS-stimulated nitrification from macrophages Their ability to inhibit the release of elementary radicals was measured. Figure 5 corresponds to RNIP Only the peak was shown to be active. RNIP is IFNγ alone or with IFNγ Thioglycollate-induced mice stimulated by a synergistic combination of LPS Inhibits the release of RNI from PEC (Table 1). Following that, we are by RNIP IC50 for inhibition of gamma interferon-stimulated release of nitrogen radicals Was lower than 50 nM (Table 2). Furthermore, RNIP was induced by both LPS and IFNγ from human macrophages Inhibits TNF release (Table 3). Therefore, RNIP is activated by various stimuli. Induced by LPS-binding proteins that act directly on macrophages to attenuate It is a new peptide that has been introduced. In summary, we have a portion of a rabbit anti-LPS protein called CAP18. Purified and protein sequenced. From this sequence we find that c corresponds to CAP18 The DNA was cloned. Apparently, a piece of CAP18 was added to the protein during the purification process. Split by qualitative decomposition. This fragment, designated RNIP, contains LPS and IFNγ Block the release of nitrogen radicals and cytokines by activated macrophages. Can harm 3.Synthetic rabbit RNIP peptide All of the above data were also obtained using RNIP purified from rabbit granulocytes. Of. Therefore, it was determined whether the synthetic RNIPs retained similar or identical activity. It was advantageous to master it. In addition, a small fragment of RNIP bound to LPS It was advantageous to determine whether or not to inhibit macrophage LPS activation. Based on the sequence of SEQ ID NO: 4, a synthetic rabbit RNIP and a series of rabbit RNIP derived Generated fragments. These fragments are self-assembled according to standard procedures. Made using mobilized solid phase synthesis (Merrifield synthesis). Each fragment is HP Purified by LC. Table 4 is for peptide fragments and LPS hemagglutination assay. Its activity in And inhibition of LPS-induced release of reactive nitrogen intermediate (RNI) radicals. I am For the hemagglutination assay, red blood cells were sensitized with LPS as follows. 1% Red blood cell suspension (human O type, C3H / HeN mouse or sheep) 1 ml, 0.2 ml LPS solution Incubate for 30 minutes at 37 ° C, then wash with phosphate buffered saline (PBS). After cleaning, the concentration of the suspension was adjusted to 1.0%. For S-LPS, the solution is 100 for 1 hour. Red blood cells were sensitized after heating at ° C. 1.0% red blood cell suspension sensitized with LPS Mix 50 μl with 50 μl of 2x serial dilution of CAP in a Microtiter-U-plate. It was CAP activity was expressed as the minimum aggregate concentration of CAP (MAC). Kirikae et al (1986) Microbiol. Immunol. 30; 269-274, 50 μl of Re-LPS Add 2x serial dilutions to 50 μl of 1.0% rabbit red blood cell suspension for 3 hours 37 Incubated at ° C. The minimum aggregation concentration of Re-LPS was expressed as 1 HA unit. The results of these experiments show that peptide fragment # 36-1 and the native RNIP fragment. (# 197) has been demonstrated to be active. Other fragments are Haru It has a very low activity. Biological assays have some day-to-day variability However, these peptides are active at concentrations of 10-50 nM. 6A and 6B show Inhibition of LPS-induced production of reactive nitrogen intermediate (RNI) in RAW264.7 cells To compare the dose response of active synthetic RNIP (# 197) and inactive fragment (# 187). ing. Figure 6A shows RNI production in the absence of inhibition, while Figure 6B shows peptide # 19. Comparing the inhibitory effects of 7 (RNIP) and # 187. 50% of the RNIPs in this assay are blocked It can be seen that the harmful concentration (IC50) is about 0.2 μg / ml (about 30 nM). # 36-1 and # 197 (RNIP) peptides in LPS from various species of Gram-negative bacteria Another series of experiments was performed to determine if they could bind . See Table 5. For these experiments, sheep red blood cells were treated with Salmonella mimics. Sensitization was performed with Nesota (Salmonella minnesota) Re-LPS. Peptides # 36-1 and # 197 (RNIP) Were pre-incubated with various LPS preparations. Both peptides are different It binds to a group of lipopolysaccharides. Further antibacterial assays were performed against the following bacterial: Salmonella typhimurium. Um (Salmonella typhimurium) LT2 (S), Salmonella minneso (S. minneso) ta) R595 (Re), Escherichia coli 09; K39 (K⁺， K^-), Escheri E. coli 0111; B4, Pseudomonas aeruginosa), Klebsiella pneumoniae, Star Staphylococcus aureus (methicillin sensitivity = MSS A, and resistance = MRSA) and Candida albicans It was The last 5 strains were clinical isolates. All strains in tryptosoy gravy (Eiken Co., Tokyo, Japan) I grew it. Salmonella typhimurium LT2 (S) , Salmonella Minnesota R595 (Re), E. coli 09: K39 (K⁺， K^- ), Escherichia coli 0111; B4 and Klebsiella pneumoniae Dye (Klebsiella pneumoniae) was plate-fixed on nutrient agar (Eiken Co.). Pseudomonas aeruginosa and Candida al Vicance (Candida albicans) is NAC agar and GS (Guanofracin-Sabouraud) agar. Each plate was fixed on a top plate. Bacterial cultures were collected in the log phase and phosphated at pH 7.2. Wash twice with buffer, 5 x 10³-1 x 10^FourAdjust to final concentration of cells / ml It was Add 50 μl of peptide to 450 μl of bacterial suspension and incubate at 37 ° C for 1 hour. Cavate and plate 100 μl of reaction mixture on agar plates. 24 hours at 37 ℃ After incubation for between, colony forming units (CFU) were counted. Control experiment PBS was added to the bacterial suspension, incubated for 1 hour, and plated on agar. And cultured. For some experiments, the percentage of control CFU was measured. To Bacteria were grown overnight in lipticase broth. Next day, use 10% fetal bovine serum 10 in RPMI^FiveBacteria were suspended at a rate of / ml. 50 μl bacteria and 50 μl pep Set up the assay in a 96-well plate containing Tide and incubate at 37 ° C for 1 hour. , Then 1 μCi in each well³H-thymidine (Amersham) was added and co-cultured with bacteria overnight. Incubate. The assay is terminated by the addition of 10% TCA, and after harvesting M Count on atrix96 Packard beta counter. About rough type mutant strain Salmonella minnesotaRe (Salmonella minnesotaRe) To determine the antibacterial activity of peptide 197 (rabbit RNIP), 36-1, 32-1, and 50-2. It was Figure 6C shows 4 on Salmonella minnesota Re CFU. Dose response of two peptides Is shown. Non-LPL binding peptides 32-1 and 50-2 are not active, while LPS binding peptides are Synthetic peptides 197 and 36-1 show remarkable antibacterial activity (IC₅₀<100 ng / ml; 40 nM). Next, the smooth intestinal bacterial strain Salmonella typhimu rium) was tested (FIG. 6D). LPS-binding peptides 197 and 36-1 Remarkable antibacterial activity (IC₅₀= 220-280 nM), while non-LPS bound peptides Codes 32-1 and 50-2 were not active. In FIG. 6E, peptide 197 has two other subtypes. Clinical strain, Pseudomonas aeruginosa (I C₅₀<250 μg / ml; 40 nM) and Klebsiella pneumoniae (Klebsiella pn) eumoniae) (IC₅₀<440ng / ml; 70nM) ing. Pseudomonas aeruginosa (IC₅₀<250ng / ml; 50 nM) and Klebsiella pneumoniae (IC₅₀<540ng / ml; 100nM) Similar results were obtained when the tomato was added (graph not shown). Two other control experiments were performed with non-LPS binding peptides. In the first case (FIG. 6F), peptides 32-1 and 50-2 at high concentrations alone and in various combinations. And its effect on the CFU of S. typhimurium. Decided. No effect was observed. In the second case, S. chifimuri S. typhimurium was pre-treated with peptide 32-1 and then exposed to peptide 197. (Fig. 6G). In this case, no inhibition or increase of bactericidal effect by peptide 197 was observed. I couldn't guess. These experiments, combined with those done above, Demonstrating that the inhibitory effect of tide 197 (RNIP) has specific structural requirements It To confirm the antibacterial activity shown in the CFU assay, bacterial growth inhibition³H- Directly tested using the thymidine incorporation assay. this The assay was also mediated by RNIP peptides that pseudoinhibit the CFU-type assay It also covers any artifacts resulting from the agglomeration of the test strain. table The results shown in Figure 5A show that RNIP was coli (Escherichia, E. coli) , Klebsiella pneumoniae and two pseudo It has been demonstrated to inhibit the growth of Pseudomonas subspecies. To summarize And IC₅₀Although there is some variability in each strain, there are two different types of assays All Gram-negative strains tested in vitro are sensitive to these antimicrobial peptides Met. Further studies examined encapsulated strains. FIG. 6H shows the encapsulated food E. Coli 0.9: K39 and unencapsulated E. Coli. For Coli 09: K39 The activity of peptide 197 is compared. K^-The strain is K⁺Strain (IC₅₀= 140ng / ml; 20 nM) compared to Pep Low sensitivity to tide (IC₅₀= 680 ng / ml: 110 nM). Finally, other antimicrobial peptides may be active under non-physiological conditions (eg It requires hypotonic buffer and acidic pH 5.0-5.5) Studied the effect. Table 5B shows fetal bovine for proliferation assay performed in RPMI-1640. Addition of baby serum results in only a modest reduction in antibacterial activity Has demonstrated. In Table 5A, peptide 36-1 was found to be Streptococcus pneumoniae (Streptococc us pneumoniae), Streptococcus pyogenes ) And coagulase positive Staphylococcus aur (Staphylococcus aur eus) has been demonstrated to inhibit the growth of several Gram-positive strains. To confirm the proliferation assay, peptide 36-1 was then tested for methicillin sensitivity (IC₅₀= 580ng / Ml; 110 nM) and methicillin resistance (IC₅₀= 720ng / ml; 130nM) Stahirococca It was demonstrated to inhibit both CFU of S. aureus (data not shown). Figure 6 1 is methicillin sensitivity (IC₅₀= 940ng / ml; 150nM) and methicillin resistance (IC₅₀ = 1000ng / ml; 160nM) Staphylococcus aureus ) Activity of peptide 197 against both E. Its activity against Coli (IC₅₀ = 500 ng / ml; 80 nM) to confirm anti-gram positive activity. The highly active antibacterial peptides 197 and 36-1 are the Candida albicans (Ca ndida albicans) (data not shown) and multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium tuberculosis and two mycobacterium For the abium strain (data not shown), the entire range of 0-20 μg / ml It was active. These data show that the C-terminus of the rabbit CAP18 protein was truncated without loss of activity. Although possible, the N-terminus has shown that it cannot. 2 best LPs S-Linked Peptides 197 (RNIP) and 36-1 were detected in all Gram-negative strains tested. Against and against many Gram-positive strains Has fungal activity. Furthermore, it is active in the presence of serum at neutral pH in physiological medium. I witnessed. Candida albicans or two mycobacte No activity was demonstrated for the Mycobacterial strain. The activity of CAP18 is gram-positive or has no activity against fungal organisms. Activity of BPI initially demonstrated to have antibacterial activity against various Gram-negative bacteria Contrast with. Amino terminal fragment (rBPI_{twenty three}) And haloprotein (BPI₅₅ ) Are both encapsulated E. Growth inhibitory activity against Coli (about 1% compared to control) 1/00 reduction). BPI₅₅And rBPI_{twenty three}Both are Proteus Mirabilis Growth inhibition of a rough mutant of (Proteus mirabilis), but rBPI_{twenty three}Only It inhibited the growth of wild type smooth type organisms. rBPI_{twenty three}Halo protein BPI₅₅Well Inhibits rum-positive Staphylococcus aureus It was Z (Weiss et al. (1992) J. Clin. Invest. 90: 1122-1130). The other three families of granulocyte proteins exhibit LPS binding and antimicrobial activity. This Included in this is the 13-amino acid C-terminal peptide of bovine indolicidin, defene. It is a 30-35 amino acid family of syn and azurocidin (CAP37). Indolicidin Peptides and defensins were tested for gram-positive and gram-negative bacteria in hypotonic media. It only inhibits growth and is thus distinguished from RNIP. Recent publication is CAP1 Is CAP37 active at approximately 2-3 logs higher than that derived from 8? The peptides derived from the above are described. 4.Cellular receptor for rabbit RNIP RNIP was prepared with a biotin group attached to a lysine residue. This biotin- RNIP has been shown to have biological activity in the RNI assay (ie, bio Tinylation did not change the activity of the molecule). RAW264.7 cells in the absence of medium Biotinyl at 4 ° C in Iscove's DMEM, washed and supplemented with 1% fetal bovine serum The converted RNIP was bound. After that, the cells were made free of excess biotin-RNIP. After washing, streptavidin-phycoerythrin (PE) was added. For cells Otin-RNIP binding was assessed using flow cytometry. The result is shown in Figure 7. It is shown. 5.RNIP reverses LPS-induced inhibition of RAW264.7 cell proliferation. When LPS was added to RAW264.7 cells, this resulted in the cell's entry into the macrophage phenotype. It causes a dose-dependent inhibition of proliferation with differentiation. FIG. 8 contains 5 ng / ml of LPS When RNIP was added to the culture, this increased the RAW264.7 macrophage cell line. Reverses inhibition of reproduction and activation. Table 6 shows RNIP, CAP18 and defensin HP-1 and HP-2 (Territo et al. 1989) J. Clin. Invest. 84: 2017-2019) on LPS-induced tissue factor production Shows the comparison. Tissue factor test Was done as follows. Mouse peritoneal cells injected intraperitoneally in thioglycollate medium It was induced by injection and after 5 days harvested by irrigation with saline containing no pyrogen. Cells were washed with RPMI1640 medium, counted, glutamine (0.29mg / ml), penicillin (50 units / ml) and streptomycin (50 / ml) in serum-free RPMI medium At 1.5 to 2.0 x 10⁶Resuspended at a concentration of / ml. 5% CO₂60 minutes at 37 ℃ in the atmosphere Cell suspension in RPMI 1640 medium in a sterile culture bottle (Nunclon, 50 ml, Inter Med). Adherent cells were prepared by incubating 10 ml of the suspension. Aseptic rubber poly Plastic adherent cells were collected by stripping the bottle with a Suman. Next, the adherent cells Wash twice with RPMI medium and keep serum free in culture tubes (Nunc cryotube, Inter Med). Medium (1 x 10⁶/ Ml) and resuspended in 5% CO₂For 6 hours at 37 ° C in steps Stimulated with an amount of LPS. Centrifuge the cell suspension and -8 until the coagulation assay is performed. The cell pellet was frozen at 0 ° C. Human mononuclear cells were treated with sodium-metrizoate-ficoll (lymphocyte isolation culture). Citrate-added peripheral blood by centrifugation on the ground (Japan Antibody Research Institute, Gunma) Separated. Wash the resulting mixed mononuclear cell suspension three times with RPMI1640 medium Let Cell suspension (1 x 10⁶/ Ml) was stimulated with LPS for 16 to 18 hours. Veronal buffer solution (VBS) is added to the cell pellet and frozen / thawed 3 times. Lysis with icles, hand-held sonicator Microbe (Handy Sonic, UR-20P type , Tommy Seiko Co., Ltd., Tokyo). Modified deactivated partial thrombo Tissue factor activity was tested at plastin time (7) (7). Using mouse plasma 10 minutes of cell lysate (1 x 10⁶/ Ml) pre-incubated did. Next, 0.1 ml of 25 mM CaCl2 containing phospholipid₂Is added to the mixture and the (Bio Quest Division, Becton Dickinson, Cokeysville, USA) was used to measure coagulation time. Tissue factor activity to any tissue factor In order to translocate to a sub-unit (1 μg / ml), a rabbit brain blood coagulation promoter (Simpla stin, Ono Yakuhin Kogyo Co., Ltd.) and a standard curve obtained from a 2-fold serial dilution solution was used. Rabbit A value of 1000 units was assigned to the brain suspension. Statistical analysis: Mean tissue factor units + standard error was determined from 3-4 samples. Statistically significant difference Student's t-test for unpaired data to determine differences used. P-values with two tails less than 0.05 were considered significant. Table 7 shows another cationic peptide, CAP37 (Morgan et al. (1991) J. Imm. unol.147: 3210-3214) can inhibit the production of tissue factor. Indicates that you cannot. This result indicates that another cationic protein does not inhibit LPS activity. Have proved. Similar results with defensins and histones (Table 6) are shown in RNIP. Is a specific inhibitor of LPS. 6.In vivo activity of RNIP Galactosamine was used in mice against the lethal effect of LPS at a rate of 1000 or more. Sensitize. CAP18 and LPS were mixed and injected intraperitoneally into the sensitized mice. It was CAP18 can neutralize the lethal effect of LPS in this type of endotoxemia It (See Table 8). 7.Cloning of human CAP13 PCR primer designed from rabbit RNIP (C-terminal 37 amino acids of rabbit CAP18) Numerous attempts were made to identify human CAP18 using . This approach was unsuccessful. Next, the lambda gt11 human bone marrow cDNA library (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) from 1 million plaques and controls. Multiple filters were prepared. Screen a set of filters with rabbit CAP18 cDNA And screened another set with the rabbit RNIP probe. Both plots Using PCR³²Labeled with P. Standard stringency with other probes No positives were identified from a total of 500,000 plaques screened in won. However, the CAP18 probe was used to screen under reduced stringency. From a total of 500,000 plaques learned, 14 putative positives were identified. This In the case of Reduced formamide from 50% to 30% during dization, wash at 65 ° C instead Performed at 50 ° C. Select 6 of the strongest positives for secondary screening, Four of them are distinct positives Created a plaque. Purify lambda DNA and insert the TA sequencing vector Cloned into. One of these was a false positive, while three were only Were identified as cDNAs of CAP18 having different lengths. The human CAP18 cDNA sequence is No. 1 and the corresponding amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2. The cDNA consists of an amino-terminal cysteine protease inhibitor domain and a carboxy terminal. Clarification of a protein with two domains, the end endotoxin binding domain I chose FIG. 9 compares the cDNAs of human and rabbit CAP18. Figure 10 It is an inhibitor of human CAP18, human CAP18 protein and porcine cysteine protease. Comparing cathelin with. Table 9 below shows N-terminal cysteine protease Rabbit and human CAP18 protein nucleic acids in both the main and RNIP domains And amino acid composition homologs are compared. Compared to the carboxy-terminal RNIP domain The N-terminal cysteine protease inhibitor domain has much higher levels of There is mino acid preservation. 8.Biological activity of human RNIP A human RNIP polypeptide containing amino acids 134 to 170 of SEQ ID NO: 2 The solid phase synthesis method was used. The LPS inhibitory activity of human RNIP is shown in SEQ ID NO: 4. Of the rabbit RNIP containing amino acids 135-171 of the rabbit sequence of. LPS (2.5 RAW264.7, which produces a reactive nitrogen intermediate (nitric oxide) in the presence of For both cultures, equimolar concentrations of both human and rabbit RNIP (1 μM, 0.25 μM and 0.03 μM). The results are shown in Figure 11. 9.Anticoagulant activity of RNIP Clots and congestion are host defense systems against traumatic injury and microbial invasion. Is an important component of. Infections, especially those associated with endotoxin release, To over-activate the coagulation cascade, a condition called disseminated intravascular coagulation (DIC) Can be awakened. Traditionally, the coagulation cascade is divided into two parts: the intrinsic pathway. Have been divided into tracts and extrinsic pathways. Is the intrinsic pathway a damaged vascular endothelial cell? Activated by conversion of factor XII to factor XIIa, which is secondary to the collagen exposure. Be sexualized. The extrinsic pathway is expressed by activated monocytes and macrophages. Initiated by tissue factor (precursor of blood coagulant, tissue thromboplastin) There is. Tissue Factor converts Factor VII to Factor VIIa and the Tissue Factor-VIIa complex Convert Factor X to Factor Xa and Factor IX to Factor IXa. Both pathways are factor Xa , A complex of factor V, phospholipids and calcium ions Converges when is generated. Prothrombinase activates prothrombin (factor II). Convert to Rombin (IIa). Thrombin from fibrinogen to fibrin Generates monomer. Both monocytes and macrophages as well as endothelial cells The extrinsic pathway is LPS-induced D because it is induced to synthesize more tissue factor. It seems to play an important role in IC. A study reported 25 years ago Anticoagulation of granulocytes bound to heparin (Saba et al. 1968, Blood 31: 369-380) Contains cationic proteins (Saba et al. (1967) J. Clin. Invest. 46: 580-589) Showed that Polymorphonuclear neutrophils (PMNs) have been shown to have antimicrobial activity It contains a large number of selected cationic proteins and peptides. The best feature Included were bactericidal / permeability-enhancing protein (BPI), defensivity And azurosidine (CAP37). Here, the LPS-binding RNIP peptide binds to tissue factor LPS from mouse macrophages. Demonstrate inhibition of induced production. In addition, 2 RNIP peptides Activation of one site, factor X and prothrombin to thrombin (factor II? Also inhibits the coagulation cascade in its conversion to Factor IIa). RN The putative heparin-binding domain of IP correlates strongly with the following three observations. Therefore, it is involved in coagulation inhibition: (a) LPS-binding peptides inhibit coagulation but The binding peptide does not inhibit this; b) the LPS binding peptide binds at the N-terminus of RNIP. LPS non-binding peptides containing the census heparin binding domain do not. C) Peptides containing the heparin-binding domain inhibit coagulation, while Those that do not contain domains do not inhibit coagulation. The clot assay was performed as follows: Coagulation method: Human serum (Ortho plasma management, Ortho Diagnostic Co.). ATPP reagent ( Organo-Technica, Tokyo, Japan). Standard tissue factor, rabbit brain thromboplasti (Simplastin, Ono Pharmaceutical, Tokyo, Japan). Purified human factor VII, factor X, X Factor a (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Russel Viper Venom (RVV) and E chis Carinatus venom (ECV, SigmaCo.). Synthetic chromogenic substrate method: Factor Xa, substrate for S2222 (Kabi, Bz-Ile-Glu-Ar g-pNA) was used. Substrate for factor II (prothrombin), Boc-Val-Pro-Arg -pNA (Sigma Chemical Co.) was used. Equipment: Coagulation assay using a fibrometer (BioQuest Division, Becton Dickinson: Co keysville, NC, USA). Tissue factor test. Salmonella Minnesota smooth LPS for 5 minutes with each peptide (1 μg / ml) and then thioglycollate The mixture was added to peritoneal mouse macrophages obtained 4 days after stimulation. . Cells were cultured for 6 hours prior to assaying for tissue factor by coagulation test. Prothrombin time (PT). Incubate with 100 μl of each peptide for 3 minutes at 37 ° C. Incubate plasma (100 μl), then 100 μl tissue factor (250 μg / ml ) CaCl₂Was added and the coagulation time was measured. Partial thromboplastin time (PTT). Human plasma (100 μl) each for 3 minutes at 37 ° C Incubate with peptide (100 μl), then 100 μl CaCl containing phospholipids₂ Was added and the coagulation time was measured. Activated partial thromboplastin time (APTT). Human plasma (100 μl), 100 μl APTT reagent and 100 μl peptide were incubated for 5 minutes at 37 ° C, then CaC l₂Was added and the coagulation time was measured. Factor Xa-induced coagulation assay. 100 μl human plasma, 50 μl Xa (0.2 units / ml) and 50 μl of each peptide (0-40 μg / ml) incubated for 3 minutes at 37 ° C Then 100 μl of 25 mM CaCl 2 for the mixture.₂Was added and the coagulation time was measured . Factor Xa activity with synthetic substrate. Factor VII (1 unit / ml, 200μ for 10 minutes at 37 ℃) l), factor X (1 unit / ml, 200 μl), tissue factor (2.5 mg / ml, 50 μl), 25 mM −CaCl₂(50 μl) and 50 μl of several concentrations of peptide reaction mixture I had a cube. For 200 μl of reaction mixture, 60 μl of 4 mM S-2222, X Add synthetic substrate for factor a and 340 μl Tris-HCl buffer, pH 8.2, 15 Further incubation for minutes. The reaction was performed by adding 60 μl of 50% acetic acid. It was stopped and the OD for P-nitroaniline was read at 405 nm. Activation of prothrombin by Echis Carinatus venom (ECV), prothrombin (Factor II) (0.1 unit / ml, 200 μl), ECV (1 unit / ml, 200 μl), various concentrations of peptide (70 μl), 50 μl of 25 mM CaCl 2₂Over And 180 μl of Tris buffer reaction mixture were incubated at 37 ° C. for 10 minutes. 3 For 00 μl reaction mixture, 60 μl 4 mM thrombin substrate and 240 μl buffer Solution was added and incubated for another 15 minutes. Prothrombin activation by factor Xa (divided into 3 steps).a) Factor X activation. Factor VII (1 unit / ml, 400 μl), tissue factor (5 mg / ml ), 100 μl) and CaCl₂Incubate the reaction mixture at 37 ° C for 10 minutes Factor X (1 unit / ml, 400 μl) was activated. b)Activation of prothrombin (factor II). For 250 μl of reaction mixture, factor II Offspring (1 unit / ml, 50 μl), multiple concentrations of peptide (25 μl) and phospholipids (50 μg / ml, 25 μl) was added and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. c)Hydrolysis of thrombin substrate. For 300 μl of reaction mixture (step b), Add 60 μl of Rombin substrate and 240 μl Tris buffer and incubate for an additional 15 minutes. I had a cube. Interaction of heparin and synthetic peptides in a modified PT system. Each reaction mixture The mixture contained: 100 μl human plasma; 50 μl buffer or pep Tide; 100 μl tissue factor (250 μg / ml). Tissue factor lethal model. The standard tissue factor (Simplastin, 1 mg / mouse) was Ddy mice (male, postnatal 2) incubated with or without peptide Weekly 38-45g) IV was injected into the body. Ten.The RNIP peptide blocks macrophages from producing LPS-induced tissue factor. Stop. With thioglycollate-stimulated mouse peritoneal macrophages Mix various concentrations of Salmonella minnesota (Salmonella) for 5 minutes at 37 ° C prior to mixing. ella minnesota) Smooth type LPS was used for each peptide (197 (RNIP), 36-1, 32-1, and And 50-2). Tissue factor production after 6 hours by coagulation assay Was measured. FIG. 12 shows tissue factor and RNIP peptide (1 μg / ml), 197 and 36-1 shows inhibition of this response. Non-LPS binding peptide 32 -1 and 50-2 are unable to inhibit LPS-induced tissue factor. If LPS is absent, No tissue factor is synthesized by these cells. Next, LPS-stimulated macrophages at various time points after LPS stimulation. A synthetic RNIP peptide (197) was added to. When 3 hours have passed since LPS stimulation Notable for LPS-induced tissue factor production even at the point of addition of peptide 197 Inhibition was seen (Figure 13). In summary, RNIP-induced peptides with LPS binding activity. Peptides inhibit LPS induction of tissue factor, while related cuts lacking LPS binding activity. Onic peptides do not inhibit LPS induction of tissue factor. 11.The RNIP peptide blocks the in vitro coagulation assay. The above studies have shown that tissue factor activity is associated with the surface membrane of granulocytes. It was Homogenization or sonication of these cells, however, reduced tissue factor activity. It was observed that the inhibition of release of cationic proteins It was blamed. Assay for tissue factor utilizes the coagulation cascade Granulocyte-derived cationic proteins from other sites in the coagulation cascade It was inferred that it could directly inhibit Therefore, a series of in vitro coagulation assays The RNIP peptide was tested in. Active peptides, 197 (RNIP) and 36-1, inhibit prothrombin time (PT) However, it did not inhibit the inactive peptides 32-1 and 50-2. It was (Figure 14A). Additional studies have focused on active peptides. Both Peptide, partial thromboplastin time (PTT) (Fig. 14B) and activated partial peak. Romboplastin time (aPTT) (Fig. 14C) was all dose-dependently inhibited. last In addition, both peptides were thrombin-inducing even at peptide concentrations up to 10 μg / ml. It failed to inhibit the coagulation that was emitted (data not shown). The results of these conventional in vitro coagulation assays show that both intrinsic and extrinsic pathways It was suggested that the peptide may inhibit the steps common to the. Obedience Thus, two tests were performed to study Factor X. In the first case, Showing that active peptides 197 and 36-1 inhibit factor Xa-induced coagulation (FIG. 15A) In a second case, it was shown to inhibit Russell Viper venom (RVV) -activated coagulation (Fig. 15B). IS50s for early coagulation studies are summarized in Table 10. 12. Inhibition of factor X activation [X --- Xa] by RNIP peptide Initial studies demonstrated peptide inhibition of factor Xa-induced coagulation Therefore, the Xa substrate S2222 was used to measure the direct inhibition of Xa by the peptide. 1 RNIP peptide 197 at a concentration of 0 μg / ml or more Or with 36-1, no evidence of direct Xa inhibition was found (Table 11). ). Next, the RNIP peptide for the conversion of Factor X into Factor Xa by two methods. I studied the effect of de. In the first case, peptides 197 and 36-1 were 6. Factor X to Xa with IC50 of 7 μg / ml (1.1 μM) and 10.0 μg / ml (1.9 μM) It inhibited direct RVV activation of the factor (FIG. 16A; Table 11). In the second case, the X factor If the offspring were activated by tissue factor and purified factor VII, both peptides Both showed dose-dependent inhibition with an IC50 of 0.3-0.7 μg / ml (40-100 μM) (Fig. 6B; Table 11). In summary, these studies blocked the conversion of factor X to factor Xa. It was confirmed that the peptide inhibited the coagulation cascade by damaging it. 13.Inhibition of prothrombin activation (factor II ── factor IIa) by RNIP peptide Since the peptide inhibited Xa-induced coagulation, we determined that these peptides The hypothesis was that the protein acts at additional sites. Using the chromogenic assay , No direct inhibition of thrombin was seen (data not shown). Therefore, professional Studies of thrombin activation (factor II to factor IIa) can be performed by two methods. I was broken. In the first case, the active RNIP peptides 197 and 36-1 were purified II factor. Inhibition of factor IIa activation by Echis carinatus venom from pups, but inactivation Peptides 32-1 and 50-2 did not inhibit this (Figure 17A; see Table 11). Second In the case, factor II was used to incubate tissue factor, factor VII and factor X. When activated by more formed Xa (as described above), both activities Peptide showed dose-dependent inhibition (IC for 197₅₀ 2.8 μg / ml) 50 nM; 36 IC for -1₅₀<1.8 μg / ml) <30 nM] (FIG. 17B: Table 11). In summary, this In their study, the RNIP peptide activated prothrombin (from factor II to factor IIa Conversion) was demonstrated. 14.RNIP protects mice from tissue factor lethality. The anticoagulant activity of RNIP peptides was studied in an acute animal model. Tissue factor IV (Si Direct injection of mplastin (1mg / mouse) causes acute intravascular coagulation and death within 3 minutes Wake up. RNIP peptide 197 was treated with tissue factor as shown in Table 12. The mortality of mice was reduced by 57% and the survival time was prolonged. 15．Consideration The results show that the peptides derived from the rabbit granulocyte protein CAP18 are potent anti-antibodies. Demonstrate clotting activity. In cloning rabbit CAP18, this Clarified that it consists of the main. The N-terminal domain was initially Has high homology to purified porcine cathelin as a protease inhibitor. To do. Purified human CAP18 likewise exhibits significant cysteine protease activity. I testify. The C-terminal 37 amino acid domain (RNIP) of CAP18 is a LPS-induced nitrogen When the HPLC fraction was tested for its ability to inhibit the production of radicals, LPS binding Was identified as a combined domain. LPS-induced acid from mouse macrophages. A large series of RNIP-derived peptides were studied for LPS binding and neutralization of nitric oxide release. I investigated. These results indicate that the C-terminal of RNIP protein can be truncated without loss of activity. Its N terminus proved that it couldn't. Rabbit RNIP peptide is associated with prothrombin time, partial thromboplastin time and Standard In Vitro Coagulation Assay Including Inactivation and Activated Partial Thromboplastin Time However, the direct effect on thrombin was There was no evidence. Any evidence for a direct effect on the activity of factor Xa Could not be found. However, Factor Xa-induced coagulation (FIG. 15A) and Ru Both coagulation activated by ssell Viper venom (RVV) is converted to rabbit RNIP peptide More inhibited. These results were confirmed using a chromogenic assay. Thus , One of the active rabbit RNIP peptides was found to inhibit activation of factor Xa is there. Since the peptides inhibited factor Xa-induced coagulation, we found that these peptides An additional site, or possible activation of prothrombin (factor II To IIa)) was investigated. Rabbit RNIP peptide is purified Of Factors II to IIa by Echis carinatus Venom and Tissue Factor, VII Factor II activity due to Xa formed by incubation of factor and factor X Both were inhibited. Thus, these studies have at least the coagulation cascade Identifies two inhibitory sites, factor X activation and prothrombin activation . The exact mechanism of inhibition is not clear. However, these coagulation stages Since both require phospholipids, the peptide is a phospholipid required for activity. Binding to the quality may interfere with the activity of these enzymes. This tab Several molecules with Ip activity have been described previously. For example, Maki et al. (1984) Europ.J.Obsted.Gynec.Reprod.Biol.17: 149-154 Anticoagulant proteins from human placenta bound to murine and phospholipids were isolated. this The protein belongs to the annexin family of proteins (greisow). However , Russell Viper Activation of factor X by venom and prothrombin by Echis carinatus venom The observation that phospholipids are not required is due to the peptide-mediated coagulation cascade. Inhibition of these steps in skeleton can be more complex than simple phospholipid binding, Suggests that. We found that rabbit CAP18 is heparin-sepharose at high NaCl concentration (2.0M). It has a high affinity binding site for heparin since it was eluted from Infer that. Consistent with this reasoning is that it is especially in the C-terminal RNIP domain. It is a fact of discovery that the content of basic amino acids is high. Table 13 shows a series of known hepa 3 shows a sequence comparison of RNIP with a phosphorus binding protein. Many of these proteins Kuga consensus peptide sequence, X-B-B-X-X-B-B-B-X-X-B-B-X-X (SEQ ID NO: 9) Is included. Here, B is a basic amino acid and X is any amino acid. (Sobet et al, (1992) J. Biol. Chem. 267: 8857-8862). This sequence is the N of RNIP Appears at the end. We note that this domain of RNIP is important for heparin binding. Not only that, but also the hypothesis that it participates in LPS binding. RNIP activity and A comparison of the sequences of the active fragments reveals that the inactive fragment shows this intact heparin. It becomes apparent that the protein binding domain is lacking. The human RNIP peptide has a Lack of the consensus heparin-binding domain present in highly responsive rabbit RNIP There is. Although human RNIP retains some of the anti-LPS activity of rabbit RNIP, preliminary studies Studies have shown that human RNIP lacks significant anticoagulant activity. these The findings provide confirmation of the heparin binding hypothesis. A correlation between the intact heparin binding domain and anticoagulant activity was discovered. Heparin And heparinoids have been intensively studied as anticoagulants in recent years. Heparin Binds its antithrombin III to its thrombin It is believed to mediate its activity by increasing bin affinity. Protease inhibitor, which is an inhibitor of factor VIIa and factor Xa, inhibits tissue factor pathway The activity of harmful substances (TFPI) is also enhanced by heparin. RNIP is its high base Due to the oxidative charge, the target protein, cell surface heparan or other negatively charged charcoal It can interact with the anion domain on the hydrate. The target molecule is unknown However, limited structural studies reveal a high degree of specificity in the activity of RNIP. This is a common finding for oppositely charged heparinoids. is there. The invention described above uses figures and examples for the sake of clarity. Have been described in some detail, but some modifications within the scope of the appended claims And it is also clear that modifications can be made. Sequence listing (1) General information: (I) Applicant: Lalique James W. Wright, Susan C. Hirata Mishimasa (Ii) Title of the invention: a herb having lipopolysaccharide binding and anticoagulant activity Cation protein (Iii) Number of sequences: 30 (Iv) Document communication address: (A): Addressee: Townsend and Townsend Coo Lee and Crew (B): Street name: 1, Market Plaza, Stuart Tower, Sweet 2000 (C): City name: San Francisco (D): State name: California (E): Country name: United States (F): Zip code: 94105 (V) Computer readable format (A) Media type: floppy disk (B) Computer: IBM PC compatible (C) Operation system: PC-DOS / MS-DOS (D) Software: Patent Inn, Release # 1.0, Verge # 1.25 (Vi) Current application data: (A) Application number: PCT (B) Date of application: (C) Classification: (Viii) Patent Attorney / Agent Information: (A) Name: Heslin, James M. (B) Registration number: 29,541 (C) Reference / Case reference number: 15325-9PC (Ix) Telecommunications information: (A) Phone number: 415-326-2400 (B) Fax number: 416-326-2422 (2) Information on SEQ ID NO: 1 (I) Sequence characteristics: (A) Length: 584 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Chain structure: 1 (D) Topology: straight line (Ii) Type of molecule: DNA (genomic) (Xi) Sequence contents: Sequence number 1 (2) Information on SEQ ID NO: 2 (I) Sequence characteristics: (A) Length: 170 amino acids (B) Type: amino acid (C) Chain structure: 1 (D) Topology: straight line (Ii) Type of molecule: protein (Xi) Sequence contents: SEQ ID NO: 2 (2) Information on SEQ ID NO: 3 (I) Sequence characteristics: (A) Length: 587 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Chain structure: 1 (D) Topology: straight line (Ii) Type of molecule: DNA (genomic) (Xi) Sequence content: SEQ ID NO: 3 (2) Information on SEQ ID NO: 4 (I) Sequence characteristics: (A) Length: 171 amino acids (B) Type: amino acid (C) 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content: SEQ ID NO: 28 (2) Information on SEQ ID NO: 29 (I) Sequence characteristics: (A) Length: 12 amino acids (B) Type: amino acid (C) Chain structure: 1 (D) Topology: straight line (Ii) Type of molecule: peptide (Xi) Sequence contents: SEQ ID NO: 29 (2) Information on SEQ ID NO: 30 (I) Sequence characteristics: (A) Length: 12 amino acids (B) Type: amino acid (C) Chain structure: 1 (D) Topology: straight line (Ii) Type of molecule: peptide (Ix) Features: (A) Name / key: part (B) Position: 1 (C) Other information: / Note = "Xaa is a basic amino acid" (Ix) Features: (A) Name / key: part (B) Position: 3,8 (C) Other information: / Note = "Xaa is a basic amino acid" (Ix) Features: (A) Name / key: part (B) Position: 10 (C) Other information: / Note = "Xaa is a basic amino acid" (Xi) Sequence content: SEQ ID NO: 30

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 7/08 8318−4Ｈ 14/745 8318−4ＨＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4ＢＧ０１Ｎ 33/566 8310−2Ｊ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者ライト，スーザンシー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 95070, サラトガ，ウィリアムズアベニュ 20430 (72)発明者平田陸正岩手県盛岡市西松園４―20―３─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI C07K 7/08 8318-4H 14/745 8318-4H C12P 21/02 C 9282-4B G01N 33/566 8310-2J (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG) , CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CZ, DE, DK, ES, FI, GB, HU, JP, KP, KR, KZ, LK, LU, MG, MN, MW, NL, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SK, UA, US, VN (7 2) Inventor Wright, Susan Sea. USA, California 95070, Saratoga, Williams Avenue 20430 (72) Inventor Rikumasa Hirata 4-20-3 Nishimatsuen, Morioka City, Iwate Prefecture

Claims

[Claims] 1. A sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 or its complement Cationic Antibacterial Mammalian with Amino Acid Sequences that Have Similar Homology to the Sequence An isolated polynucleotide that encodes a protein. 2. -Transcriptional promoter -A DNA having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4, and -Transcription terminator, A DNA construct for the expression of a mammalian cationic antibacterial protein comprising . 3. It consists of amino acids 134 to 170 of SEQ ID NO: 2 and amino acids 135 to 171 of SEQ ID NO: 4. Mammalian reaction having an amino acid sequence homologous to one sequence selected from the group An isolated polynucleotide encoding a reactive nitrogen inhibiting peptide (RNIP). 4. Amino acids homologous to at least the amino terminal amino acid of 25 of SEQ ID NO: 6 The isolated polynucleotide of claim 3, which encodes a sequence. 5. A transcription promoter; An amino acid sequence homologous to at least the 25 amino terminal amino acids of SEQ ID NO: 6 DNA encoding -And a transcription terminator, A DNA construct for the expression of mammalian RNIP, which comprises: 6. Binds to the lipopolysaccharide on monocytes and macrophages and activates this lipopolysaccharide And 9 adjacent amino acids in the sequence consisting of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 At least about 9 amino acids that are substantially identical An isolated and purified polypeptide comprising a no acid. 7. 7. The method according to claim 6, comprising at least one active RNIP fragment. Isolated and purified polypeptide of. 8. An active RNIP fragment comprises substantially the amino acids 135-158 of SEQ ID NO: 2. Isolated and purified according to claim 7, containing identical amino acids Polypeptide. 9. An active RNIP fragment comprises substantially the amino acids 135-159 of SEQ ID NO: 4. Isolated and purified according to claim 7, containing identical amino acids Polypeptide. Ten. The active RNIP fragment contains substantially the same amino acids 1 to 25 of SEQ ID NO: 6. 8. The isolated and purified protein according to claim 7, which contains one amino acid. Lipid. 11. Used to modulate biological responses when administered to vertebrate hosts. 11. A method according to claims 6-10, which is present in a pharmaceutically acceptable carrier in a reasonable amount. A pharmaceutical composition comprising the polypeptide according to any one of claims. 12. The polypeptide according to any one of claims 6 to 10 is used as a host. A method for modulating a biological response in the body of a vertebrate comprising administering. Law. 13. The biological response is that the host is at risk of septic shock or endotoxin shack. 13. An immune response that has or is affected by these shocks, as claimed in claim 12. The method described. 14. 13. The method of claim 12, wherein the biological response is the coagulation pathway. 15． In an assay for detecting lipopolysaccharide in a sample, -A lipopolysaccharide having the amino acid sequence according to any one of claims 6 to 10. Exposing samples to polypeptides with glycosylation activity Stage; and -Detecting the binding between the lipopolysaccharide and the polypeptide that may be present in the sample, An assay method comprising. 16. Sample suffers from or is at risk of septic shock or endotoxic shock The assay according to claim 15, which is blood from a human.