【発明の詳細な説明】
アミノ酸模倣物を溶出試薬として用いる親和精製方法
本発明は、タンパク質の分離及び精製技術に関する。
今日では、生物学の試料中の特定タンパク質を他の成分から分離するための多
種多様な方法、物質、及びアプローチが存在する。一般的なアプローチの１例と
して、基質に対するタンパク質の非特異的親和がある。例えば、タンパク質は、
分子の電荷に基づき、イオン交換クロマトグラフィーによって分離することがで
きる。すなわち、タンパク質混合物が反対の電荷のクロマトグラフィーマトリッ
クスに添加され、可逆的な静電気的相互作用によりさまざまなタンパク質がマト
リックスに結合する。マトリックスに吸着したタンパク質は、イオン強度を高め
ることにより、もしくは溶出緩衡液のｐＨを変化させることによって、結合の弱
いものから強いものの順に溶出される。
また別の一般的なアプローチとしては、分離手段としてタンパク質の物理的特
性を利用するものが挙げられる。例えば、ゲル濾過を用いて、タンパク質の大き
さに基づきタンパク質を分離することができる。この方法の場合、所定の大きさ
の孔を有するクロマトグラフィーのマトリックスを詰めたゲル濾過カラムにタン
パク質混合物を添加する。その後、タンパク質は、通常、緩衡剤水溶液を用いて
溶出され、個々のクロマトグラフィーフラクションとして収集されて分析される
。
最後に、第３の一般的なアプローチとしては、精製試薬（purifying reagent
）に対するタンパク質の特異的親和性を利用するものがある。例えば、そのタン
パク質に対して特異的な抗体を用いてタンパク質を精製することもできるし、ま
たは、逆に、抗体をそれに特異的な抗原によって精製してもよい。通常、抗体も
しくは抗原はカラム基材に結合され、その特定の抗原もしくは抗体を含んだ溶液
がそのカラムに添加されて、免疫複合体を形成することができる。続いて、結合
された免疫複合体の要素は、例えば非常にイオン強度が高い又はｐＨの高い若し
くは低い緩衡剤にさらすことにより、この抗原抗体複合体を不安定化させて溶出
さ
れる。あるいは、免疫複合体を形成して、免疫沈降によりこの抗原または抗体を
精製してもよい。この場合、抗原抗体複合体を凝集した後に沈澱させてもよいし
、あるいは、結合要素のうちの１つを固体粒子（セファロースすなわちアガロー
ス、など）と共有結合させ、免疫親和性複合体を遠心分離により分離してもよい
。いずれの方法の場合も、分離対象のタンパク質は、その後、前述の場合と同様
にイオン強度の高い、またはｐＨの高いもしくは低い緩衡剤にさらすことにより
複合体から分離される。
分子生物学者に特に興味深いのは、抗体もしくは組換え抗体融合タンパク質の
分離及び精製方法である。個々の抗体分子は、構造的に、２本の同一の重鎖（Ｈ
鎖）、及び２本の同一の軽鎖（Ｌ鎖）を有し、各Ｌ鎖がＨ鎖にジスルフィド結合
され、Ｈ鎖どうしがジスルフィド結合されて、分子の基本的二量体構造を形成し
ている。それぞれの鎖内部には、約１１０個のアミノ酸から成る単位が折り重な
って、単一の内部ジスフィルド結合によって互いに一体的に結合して小型ドメイ
ンを形成している。Ｌ鎖は２つのドメインを有し、Ｈ鎖は４もしくは５つのドメ
インを有する。
Ｈ鎖の初めの２本のＮ末端側ドメインは、２つのＬ鎖ドメインと相互反応して
「Ｆａｂドメイン」、すなわち特異的な抗原の認識及び結合を行う分子部分を形
成する。分子のもう一方の末端側においては、Ｈ鎖のＣ末端側ドメイン（ＣH２
ドメイン及びＣH３ドメイン）により「Ｆｃドメイン」を形成する。「Ｆｃドメ
イン」は、細胞の結合、補体結合、胎盤のトラバースなどを含む多数の免疫グロ
ブリン機能を行う分子部分である。さらに、ＦａｂドメインとＦｃドメインの間
に形成されるのが、ヒンジ領域を構成する小数のアミノ酸である。ヒンジ領域は
、固定されない領域で、分子の抗原結合部分の自由な動きを可能にする。発明の概要
本発明の目的は、アフィニティクロマトグラフィーカラムに吸着したタンパク
質を溶出するための安価で一般的な方法を供給することである。
上記の一般的な説明のように、アフィニティクロマトグラフィーは、精製した
いタンパク質と固相に固定化されたリガンドとの間の特異的な相互作用を利用す
る、非常に効果的なタンパク質精製方法である。通常、固相リガンドはいくつか
の固有の化学的特性を有し、それにより分離対象のタンパク質を選択的に吸着す
る。他の混入タンパク質（contaminant proteins）は、固相リガンドに結合しな
いか、もしくは適切な溶液で固相リガンドを洗浄することで除去される。これま
で、アフィニティカラムの溶出は次の２つの方法のうちのいずれかにより行われ
てきた：（ｉ）マトリックスを、固定化されたリガンドに類似する特異的なリガ
ンドの溶液によって洗浄する方法、または（ｉｉ）マトリックスを、イオン強度
の極めて高い、またはｐＨの非常に高い（１１より大きい）もしくは非常に低い
（３未満）の溶液で洗浄する方法。一般的には、方法（ｉｉ）よりも方法（ｉ）
の方が効果的とされるが、これは、非常にイオン強度の高い溶液は、タンパク質
に害を及ぼさない限りにおいては通常、アフィニティマトリックスにしっかりと
結合したタンパク質を分離させるのに効果がないのが普通だからであり、多くの
タンパク質は、分離対象のタンパク質を溶出するのに十分な酸性もしくは塩基性
を有する緩衡剤に対して不安定であるためである。しかしながら、特異的な溶出
リガンドが手に入らない場合や、特異的な溶出リガンドが実用上の理由により不
適切である場合、例えばその特異的リガンドが不安定であったり、高価であった
りする場合には、（ｉ）の方法も適用ができない。
リガンド自体がタンパク質である場合、特異的リガンドを含む溶出溶液を用い
て、固定化されたリガンドからタンパク質を溶出できることはまれである。これ
は、特異的リガンドがタンパク質もしくはペプチドのフラグメントである必要が
あるため、上述した実用上の理由により溶出が実行不可能となる。
本発明は、特異的なアミノ酸の側鎖を模倣した安価な低分子量化合物の使用に
基づき、アフィニティマトリックスを溶出する新規な方法を開示する。非タンパ
ク質アフィニティリガンドに結合したタンパク質を分離するためには、リガンド
の認識に関連する特異的アミノ酸の側鎖を模倣した溶出化合物が選択される。一
方、タンパク質のアフィニティリガンドに結合したタンパク質を分離する場合に
は、溶出化合物は、精製対象のタンパク質もしくは固定化されたリガンドのタン
パク質のいずれの側鎖を模倣してもよい。
適切な側鎖模倣化合物は、その水溶性及び分離するべきタンパク質との融和性
（compatibility）によって選択される。タンパク質どうしの相互作用は、疎水
的相互作用、特に芳香族の疎水的相互作用によって安定化されることが多いので
、最も好ましい溶出試薬は、ヒスチジン、チロシン、トリプトファン、及びフェ
ニルアラニンの側鎖模倣からなるグループから選択するのがよい。特定の実施例
においては、ヒスチジンの残基に結合することにより促進された相互作用を不安
定化するためには、イミダゾールを選択するのが適切である。チロシン側鎖の適
当な模倣物は、アミノフェノールもしくはヒドロキシベンゼンスルホン酸塩など
の置換基によって水溶性が促進されたフェノール及びフェノール化合物などのヒ
ドロキシル化された芳香族化合物である。トリプトファンの適当な模倣物は、イ
ンドール−３−硫酸塩またはインドール−３−酢酸などの置換されたインドール
、もしくはベンジミダゾール塩がよい。フェニルアラニンの適当な模倣物は、ベ
ンゾアート塩、フェニルスルホン酸塩、及びニコチン酸塩もしくはニコチンアミ
ドなどの水溶性の複素環がよい。
また、有益なアミノ酸模倣物は、荷電残基相互作用（charged residue intera
ctions）を破壊する分子から選択してもよい。このような荷電残基相互作用に干
渉する有用な化合物の例としては、アルギニンを模倣するグアニジン塩、リシン
を模倣するアルキルアミン、及びグルタミン酸塩（glutamate）もしくはアスパ
ラギン酸塩（aspartate）を模倣するアルカン酸（alkanoic acids）が挙げられ
る。
さらに、本発明において溶出試薬として有益なその他の化合物としては、脂肪
族の疎水性残基相互作用を干渉する化合物、例えば、脂肪族アルコール、水溶性
ポリアルキレングリコールの脂肪族エーテル、脂肪族アルコールの硫酸塩エステ
ル、及び脂肪族アミンがある。また、脂肪族に置換されたフェノールなど、二元
的（dual）疎水作用を有する化合物も、側鎖残基を模倣するのに有益であるとい
える。
以上のように、本発明は以下のステップから成る、試料からタンパク質を分離
する方法により特徴づけられる。（ｉ）タンパク質と結合して親和複合体を形成
することができる第１分子を供給する。（ｉｉ）親和複合体の形成が可能な状況
の下で、試料を第１分子と接触させる。（ｉｉｉ）複合体を取り出す。（ｉｖ）
第２分子によって複合体を処理する。この第２分子は、タンパク質もしくは複合
体の形成に不可欠な第１分子のいずれかのアミノ酸残基を模倣したものであるの
で、第２分子によりこの複合体は破壊され、タンパク質が複合体から放出される
。
（ｖ）分離されたタンパク質を取り出す。
好適な実施例においては、第２分子の全体もしくは一部は、アミノ酸側鎖を模
倣する。
別の好適な実施例においては、第１分子はプロテインＡであり、分離するタン
パク質は、プロテインＡ結合ドメインを有する抗体もしくは抗原融合タンパク質
である。この実施例によれば、第２分子はヒスチジン残基を模倣するのが好まし
く、例えばイミダゾールが好ましい。
その他の２つの好適な実施例においては、第１分子は抗体であり、分離するタ
ンパク質は組換えタンパク質である。あるいは、第１分子は抗原性タンパク質で
あり、分離するタンパク質はこの抗原性タンパク質に特異的に結合する抗体であ
る。
ここで、「アミノ酸残基を模倣する」ということは、アミノ酸残基そのもの、
もしくはタンパク質または非タンパク質の親和リガンド（すなわち「第１分子」
）と相互作用するその残基の能力に不可欠なアミノ酸残基の１部のいずれかと同
一のもしくはそれに類似する化学的組成を有する、という意味である。好ましく
は、模倣されたアミノ酸の部分は、その残基の側鎖である。このような模倣分子
は溶出試薬として用いられるので、この分子は水溶性で、精製されるタンパク質
の安定性と融合するのが好ましい。本発明では、いかなるアミノ酸模倣物でも有
益であるが、疎水性タンパク質−タンパク質相互作用を妨害するものが好ましい
。なお、このような相互作用には、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、及
びフェニールアラニンのアミノ酸を含む相互作用が含まれる。これらのアミノ酸
に対する好ましい模倣物は、上述の通りである。
「抗体融合タンパク質」とは、非免疫グロブリンポリペプチドに直接もしくは
間接的に共有結合する免疫グロブリンＦｃドメインの少なくとも１部分を有する
タンパク質を意味する。
「アミノ酸側鎖」は、アミノ酸の識別を決定する分子の中心炭素原子に結合す
る部分を意味する。本発明に係る好ましい側鎖には、ヒスチジン、トリプトファ
ン、チロシン、及びフェニールアラニンを特徴づける、疎水性の側鎖が含まれる
。
「プロテインＡ結合ドメイン」とは、プロテインＡと呼ばれる黄色ブドウ球菌
細胞壁成分と相互作用する免疫グロブリン分子の部分を意味する。結晶学上の研
究により、このドメインはＣH２／ＣH３の部分に最もよく配置されることが判明
した。
出願人は、親和精製技術を修正することにより、精製の最終ステップにおいて
アミノ酸模倣物を溶出試薬として使用し、分離対象のタンパク質を親和複合体か
ら分離できることを認識していた。このアプローチは、従来からの溶出技術（例
えば溶液のｐＨにおける急激な変化に基づく溶出ステップなど）に比べてかなり
穏やかである（gentler）ので、出願人によるこの方法によって、標準的な溶出
手順では活性が破壊（例えば不可逆的に変性）もしくは減少されたタンパク質の
分離及び精製を促進することができる。さらに、アミノ酸模倣物は便利で安価な
溶出試薬なので、これらの模倣物は、より安定したタンパク質の精製の溶出試薬
として利用することもできる。
本発明のその他の特徴及び効果は、以下に示す好適な実施例の記載及び請求の
範囲から明らかである。図面の簡単な説明
図１は、免疫グロブリン融合タンパク質ＣＤ６２Ｒｇを概略的に示した図であ
る。
図２Ａは、好中球の表面に結合するＣＤ６２Ｒｇに対するフローサイトメトリ
ーの測定結果を示す。
図２Ｂは、Ｈ３６３０細胞の表面に結合するＣＤ６２Ｒｇに対するフローサイ
トメトリーの測定結果を示す。
図２Ｃは、ＨＳＢ２細胞の表面に結合するＣＤ６２Ｒｇに対するフローサイト
メトリーの測定結果を示す。
図２Ｄは、Ｋ５６２細胞の表面に結合するＣＤ６２Ｒｇに対するフローサイト
メトリーの測定結果を示す。詳細な説明
本発明に係るタンパク質の分離及び精製手順、及び１つの特定免疫グロブリン
融合タンパク質の分離におけるその使用について、以下に説明する。組換えタン
パク質の非常に穏やかな溶出により、本来の結合反応を著しく損なうことなく精
製を行うことができる。本発明を限定するためでなく、説明するための例を以下
に示す。ヒスチジンの模倣物イミダゾールを用いた溶出による免疫グロブリンＧ１（Ｉｇ Ｇ１）の親和精製
ヒスチジンの模倣物であるイミダゾールを用いた溶出を含む親和性クロマトグ
ラフィーによって、ヒトのＩｇＧ１を以下のように精製した。
ヒトのＩｇＧ１をプロテインＡトリスアクリル担体（ピアス、イリノイ州、ロ
ックフォード）上に添加し、リン酸緩衡溶液で洗浄する。担体を数本の小型カラ
ムに分配する。これらのカラムを、濃度が１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、または５Ｍ
で、最終的なｐＨを６、７、８、または９に調整されたイミダゾールを含む溶液
で溶出した。この結果が、いずれのｐＨ値に対して得られた最大溶出のパーセン
トとして表１に示される。
いずれのｐＨ値でも、イミダゾールの濃度が最も高い場合には、カラムにわず
かなＩｇＧ１が残留した。ｐＨ値は概してイミダゾールの溶出力を媒介するのに
重要な役割を果たさなかったが、イミダゾールのｐＫ値は７．１であり、ｐＨ６
では分子の約９０％が荷電しているのに対してｐＨ８では約９０％が荷電されて
いないだろうということからは、この結果は予想外のものであった。
この方法を用いて、ＩｇＧ１単独の場合と同様に、免疫グロブリン融合タンパ
ク質を、免疫グロブリンの不変領域に融合されたタンパク質部分の生物的活性を
損なうことなくプロテインＡカラムから精製した。（詳しくは、以下のＣＤ６２
Ｒｇの精製を参照のこと。）このような方法で精製された融合タンパク質のいく
つかに対しては、酸性溶出条件が、免疫グロブリンのドメインに融合されたタン
パク質部分にあるとされる活性（すなわちリガンドの結合活性）を破壊すること
が知られていた。一般的に、これらの免疫グロブリン融合タンパク質の精製には
、適当なｃＤＮＡ構造体を用いたＣＯＳ細胞のトランスフェクションによって準
備された、融合タンパク質の粗製準備（crude preparation）（ある表面抗原の
細胞外ドメインに結合されたヒトのＩｇＧ１のヒンジ、ＣH２、及びＣH３ドメイ
ンを含む）に関する初期分離が含まれる。培養上清が、さらに５日から１０日の
間培養された導入細胞から集められ、遠心分離によって不純物が取り除かれ、プ
ロテインＡトリスアクリルもしくはプロテインＡアガロース担体に吸着される。
これらの担体を収集し、１％の非イオン性界面活性剤（Nonidet P40もしくはTri
ton X-100）を含むリン酸緩衡溶液（ＰＢＳ）、続いて緩衡剤だけにより入念に
洗浄して、さらに酢酸もしくは塩酸によりｐＨ８に調整された４Ｍのイミダゾー
ルで溶出する。このようにして溶出された融合タンパク質を緩衡液で透析する。
もしくはイミダゾールを２周期の遠心分離限外濾過によって除去する（Centrico
n 30）アミコン社、マサチューセッツ州、ビバリー）。
このような抗体融合タンパク質の精製の１つの特定例を以下に示す。溶性ＣＤ６２：免疫グロブリン融合タンパク質の分離
以下のように、ＣＤ６２の最初の４つのＮ末端側細胞外ドメインをヒトのＩｇ
Ｇ１のヒンジドメインに遺伝的に融合することによりＣＤ６２タンパク質キメラ
を準備した。ヒトのＩｇＧ１人工スプライスドナーシーケンスとの融合を可能に
するよう設計された合成オリゴヌクレオチドを用いて、レクチン（Ｌ）（lectin
）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、及び最初の２つの補体調節タンパク質繰り返し要
素（ＣＲ）をコードするＣＤ６２ ｃＤＮＡシークエンスを、複製連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）において増幅した（Aruffo et al．Cell 61，1303-1313，1990 参照）（
図１）。前進プライマーは、ＧＧＣ ＧＣＣ ＧＡＡ ＧＣＴ ＴＣＣ ＡＴＧ
ＧＣＣ ＡＡＣ ＴＧＣ ＣＡＡ ＡＴＡ ＧＣＣ ＡＴＣ ＴＴＧの配列（配
列番号：１）を有し、逆向きのプライマーはＧＧＣ ＣＡＧ ＡＴＣ ＴＣＣＣ
ＴＧ ＣＡＣ ＡＧＣ ＴＴＴ ＡＣＡ ＣＡＣ ＴＧＧ ＧＧＣ ＴＧＧの配
列（配列番号：２）を有した。この配列は、ＣＤ６２フラグメントがＨｉｎｄＩ
ＩＩからＢｇｌＩＩのフラグメントとして、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消
化されたベクターに挿入されることを可能にした。ＤＮＡを増幅するために、酵
素販売会社（ＵＳバイオケミカル、オハイオ州、クリーブランド）の薦める反応
緩衡剤、及び内皮細胞発現ライブラリー（Bevilacqua et al.，Science 243，11
60-1165ページ、１９８９年出版）から準備されたＭｌｕＩ消化されたＤＮＡを
用いて、９４℃で３０秒間、４５℃で２分間、７２℃で３分間の２０周期のＰＣ
Ｒを行った。この結果得られたＣＤ６２ Ｒｇと称される融合タンパク質が、図
１に概略的に示される。
ＤＥＡＥデキストランを用いて、ＣＤ６２ Ｒｇ発現プラスミドをＣＯＳ細胞
に導入した（Seed and Aruffo，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84：3365-3369，1
987参照のこと）。すなわち、１０枚の１００ｍｍのプレートに半ば込み合った
状態のＣＯＳ細胞はそれぞれの構築物で形質導入された。トランスフェクション
の１２時間後、細胞をトリプシン処理し、１００ｍｍの新しいプレートにまき直
し、７日から１０日の間培養した。４日目、それぞれのプレートに１０％のウシ
胎児血清を含む新しい培地５ｍｌが付加された。上清を採集し、遠心分離によっ
てこれから非粘着細胞と屑を取り除いた後、１つに集めて４℃で保存した。この
ような上清のゲル電気泳動により、発現プラスミドが組換えグロブリンをコード
すること、及びこれらのグロブリンは形質導入されたＣＯＳ細胞の上清中に溶性
の形で存在することが示された。
プロテインＡカラムを用いたクロマトグラフィーによってＣＤ６２ Ｒｇ融合
タンパク質を精製しようという初めの試みは、通常免疫グロブリンの溶出に用い
られる酸性の緩衡剤に対して融合タンパク質が不安定であるため成功しなかった
。この問題を回避するため、出願人は代わりにイミダゾールの溶液を用いて溶出
を行った。これは、（結晶構造の研究から仮定して、）この分子を過度に供給す
れば、抗体融合タンパク質のＣH２／ＣH３断片におけるプロテインＡとヒスチジ
ン残基により複合体の相互作用が破壊されるだろうと判断したためである。この
結果、４Ｍイミダゾールが、炭水化物（糖質）及び組織反応性を保持することの
できる、穏やかで効果的な溶出剤であることが証明された（以下を参照のこと）
。
上記のイミダゾールによる精製手順は次のようにして行われた。トランスフェ
クションの１２時間後、それぞれの構築物によって形質導入されたＣＯＳ細胞の
フラクションをフラスコにまいた。トランスフェクションの３６時間後、細胞を
リン酸緩衡溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、システイン−メチオニンを含まない培地を
３０分間添加した。最終濃度が１５０μＣｉ／ｍｌとなるように［35Ｓ］メチオ
ニンと［35Ｓ］システイン（TransLabel，ICN，カリフォルニア州、ＣＯＳタメ
サ）を添加して、細胞にこの標識を１晩取り込ませた。上清を採集し、２００μ
ｌのプロテインＡトリスアクリル（ピアス、ロックフォード、イリノイ州）と１
２時間、４℃で培養した。遠心分離により担体を収集し、ＰＢＳ／１％Ｎｏｎｉ
ｄｅｔ Ｐ−４０で洗浄した。分析のために、担体を１％のドデシル硫酸ナトリ
ウム２００μｌで溶出した。あらかじめメルカプトエタノールにさらした後、ま
たはさらさずに、各溶出液１０μｌに６％の不連続ポリアクリルアミドゲルを添
加した。予備的な溶出として、カラム体積に対し５倍量の（酢酸で中和された）
４Ｍイミダゾール（ｐＨ８）でカラムを洗浄した。溶出されたタンパク質は、４
℃または８℃のイミダゾール中にに短時間保存するか、もしくは遠心分離限外濾
過によって溶媒をＰＢＳに交換し、より長い時間保存した。ＣＤ６２ Ｒｇ組織反応性
精製されたタンパク質がＣＤ６２に特徴的な方法で細胞及び組織に反応できる
かどうかを検査するために、骨髄細胞株及び腫瘍細胞株、すなわち、通常天然Ｃ
Ｄ６２が結合する細胞における結合能解析が行われた。
１０％ウサギ血清存在下で、未希釈Ｒｇ上清を用いて、１０6個の細胞を３０
分間氷上で反応させた。細胞は、ＰＢＳで一度洗浄し、１から５μｇ／ｍｌの濃
度の、ヒトのＩｇＧもしくはＩｇＭに対する蛍光ヤギ抗体（キャッペル、マルバ
ー、ペンシルヴァニア州）に３０分間氷上でさらし、続いて４％のホルムアルデ
ビドを含むＰＢＳ内で固定化した。蛍光の値は、ＦＡＣＳｃａｎ分析装置を用い
て標準的な技術によって決定された。その結果を図２に示す。図において、実線
はＣＤ６２ Ｒｇとの反応性を示し、点線は対照のＣＤ７ Ｒｇタンパク質との
反応度を示している。
このようなフローサイトメトリー及び蛍光顕微法により、ＣＤ６２ Ｒｇが、
新しく分離されたヒトの顆粒球、胸部がん腫株Ｈ３６３０及びＨ３３９６、及び
骨髄細胞株ＨＬ６０、ＴＨＰ−１、Ｕ９３７の細胞表面リガンドに反応すること
が示された。一方、白血病性Ｔ細胞株ＨＳＢ−２、ジャーカット細胞、もしくは
ＨＰＢ−ＡＬＬ、Ｋ５６２（赤白血病）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＲＤ
（横紋筋肉腫）細胞、Ｈ３６０６及びＨ３６２０黒色腫細胞、またはＬ ｔｋ−
及びＮＩＨ ３Ｔ３マウス繊維芽細胞株には、細胞表面反応が見られなかった（
図２参照）。また、コントロールの免疫グロブリン融合タンパク質ＣＤ７ Ｒｇ
とＣＤ８ Ｒｇ、及び天然ＩｇＧはこれらの条件のもとで目に見える反応を示さ
なかった。多くの場合、浸透可能にされた細胞に結合したＣＤ６２ Ｒｇの量は
、浸透不可能な細胞に結合したＣＤ６２ Ｒｇの量を大きく上回ることにより、
実質的な内部保存が存在することが示唆された。ＣＤ６２ Ｒｇ炭水化物反応
糖脂質は、株限定発達パターン（lineage-restricted developmental pattern
）で複合炭水化物決定子を発現することがしばしばあるので、我々は、ＨＬ６０
細胞（前骨髄球白血球株）の脂質抽出が、溶解もしくは吸着された形状のいずれ
かでＣＤ６２Ｒｇに結合するかどうかを調べた。フォルチ分配したＨＬ６０細胞
の上層及び下層にシリカゲルを塗布したプレートを用いて薄層クロマトグラフィ
ーを行い、クロマトグラムを放射性同位元素を使って識別されたＣＤ６２もしく
は
コントロールの融合タンパク質とで反応させ、洗浄した後、以下のように蛍光間
接撮影を行った。２０倍量のクロロフォルム：メタノール溶液２：１を用いた均
質化により、細胞（１×１０8から５×１０8）が抽出された。粗抽出物を脂質を
含まないフィルタペーパーで濾過し、フォルチ分配を繰り返した（Hakomori and
siddiqui，Meth．Enzymol．32：345-367，1974参照）。上層と下層をともに脱
水した後、２００μｌのメタノール中に溶かした。培養上清からの脂質が、１Ｍ
のＮａＣｌで飽和されたブタノールと共に抽出された（１：１ ｖ／ｖ）。脱水
によってブタノール層を乾燥させ、残基をメタノールに懸濁させた。
アルミニウムを後面に塗布した（aluminum-backed）シリカゲルＨＰＴＬＣプ
レート（５ｃｍ×７．５ｃｍ）がクロマトグラフィーに用いられ、糖脂質は、ク
ロロフィルム／メタノール／水（１２０／７０／１４）で分離された。クロマト
グラフィーの後、プレートを乾燥し、０．１％のポリソブチルメタクリレートを
含むヘキサンに浸水させて固定し（Magnani et al.，Meth．Enzymol．83：235-2
41，1982）、阻止溶液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＣａＣｌ2，２％ＢＳ
Ａ）中に２２℃で１時間反応させた。３５Ｓ−識別Ｒｇ（１×１０5から２×１
０5ｃｐｍ／ｍｌ）、すなわちＣＤ６２ Ｒｇもしくはコントロールの融合タン
パク質ＥＬＡＭ−１ Ｒｇのいずれかを加えて、プレートともに１晩反応させた
。次に、クロマトグラムを１５０ｍＭ ＮａＣｌと３ｍＭ ＣａＣｌ2中で３０
分２回洗浄し、乾燥させ、Ｅｎ３Ｈａｎｃｅをスプレーし、フルオグラフィーを
行った。
単一バンドとして、あるいは異なる溶媒システムにおいては密接に配置された
二本のバンドとして移動する糖脂質が、ＣＤ６２ Ｒｇと強く反応することがわ
かった。これらの溶出条件もしくはより強い溶出条件のもとでは、ガングリオシ
ド分画には何の反応も見られなかった。
精製された異なる糖脂質のクロマトグラフィーパターンの平行評価により次の
ことが示された。ＨＬ６０脂質は、ウシの脳のスルファチド（シグマ、セントル
イス、ミズーリ州；マトレヤ、ベルフォンテ、ペンシルヴァニア州）、スフィン
ゴシン部分の２−アミノ位置に不均一脂肪アキル置換を有する３−スルフェイト
ガラクトシルセラミド（3-sulfated galactosyl ceramides）の商業的な準備と
共に、３つの異なる溶媒システム［具体的には、クロロフォルム／メタノール／
水（１２０／７０／１４、クロロフォルム／メタノール／水（７３／２１／４）
、クロロフォルム／メタノール／アセトン／酢酸／水（１０／２／４／２／１（
Ishizuka et al.，J．Biol，Chem．253：898-907，1978）］において移動した。
同じ条件下での精製糖脂質のクロマトグラフィー及び分析を行った。すなわち
、それぞれの脂質標準品（ウシの脳のガングリオシド（シグマ、セントルイス、
ミズーリ州；マトレヤ、ベルフォンテ、ペンシルヴァニア州）、スルファチド（
シグマ、セントルイス、ミズーリ州；マトレヤ、ベルフォンテ、ペンシルヴァニ
ア州））、トリシアリルガングリオシド（trisialyl ganglioside）ＧＴ１ｂ（
シグマ、セントルイス、ミズーリ州）、ヒドロキシル置換を有するガラクトシル
セラミド（シグマ、セントルイス、ミズーリ州）、もしくはリソスルファチド（
シグマ、セントルイス、ミズーリ州；マトレヤ、ベルフォンテ、ペンシルヴァニ
ア州））（乾燥質量で）２マイクログラムをＣＤ６２ ＲｇまたはＥＬＡＭ−１
Ｒｇと反応させ、クロロフォルム／メタノール／水（７３／２１／４）とで展開
した。これより、スルファチドがＣＤ６２と強く反応すること、及びよりイオン
化した形状がこれらの条件のもとで優先的に認識されたことが確認された。脂肪
アシル置換のないリソスルファチドは認識されなかった。また、硫酸残基のない
ガラクトシルセラミドは、脂肪酸鎖にヒドロキシル置換のあるものもないものも
認識されなかった。ＣＤ１５を有する糖脂質は、スルファチドの検出を可能にす
る条件の下では、認識できるような反応をＣＤ６２ Ｒｇとの間に示さなかった
。さらに、ＣＤ７ Ｒｇ、ＣＤ８ Ｒｇ（Aruffo et al.，Cell 61，1303-1313
，1990）、ＥＬＡＭ−１ Ｒｇ（Walz et al.，Science 250：1132-1135，1990
）、完全な（Intact）ＩｇＧ１、ＣＤ６２ Ｒｇに存在するＦｃフラグメントに
対応するＩｇＧ１のＣＯＳ細胞準備品のいずれもスルファチドと反応しなかった
。その他の実験例
出願人は、親和性精製技術を修正して、最終精製段階においてアミノ酸模倣物
を溶出試薬として使い、分離対象のタンパク質を親和性複合体から放出すること
ができることを認識した。このようなアミノ酸模倣物による溶出ステップは、例
えば、カラムに結合した複合体からもしくは免疫沈降に含まれた複合体からタン
パク質を分離するなど、いかなる標準的な親和性精製手順においても用いること
ができる。
多くのアミノ酸模倣物（例えば、上述の模倣物など）は混合物に簡単に組み入
れられるので、ここで説明した一般的な溶出技術は、相互作用接触点またはアミ
ノ酸配列が知られていないタンパク質を含む、いかなるタンパク質の精製にも利
用することができる。１つの特定例においては、上述の例示的なアミノ酸模倣物
のほとんどもしくはすべてが、（溶解性を考慮して）疎水性相互作用、脂肪族の
疎水性相互作用、及び／または荷電性相互作用に基づく多くの親和性複合相互作
用のいずれをも破壊する、一般的目的の溶出試薬に混合することができる。この
ような一般的目的の溶出試薬の場合、特異的親和性接触点のアミノ酸配列、もし
くは分離するタンパク質のアミノ酸配列さえも決定せずにすむ。
しかしながら、これらのアミノ酸配列の説明を、対象タンパク質を最も効果的
に溶出する模倣物の選択をガイドするものとして利用してもよい。例えば、一般
的に有益な親和性相互作用点は、いずれのタンパク質でも抗体複合物形成に係わ
る所定の領域である。この領域の識別は、技術によって、または実験的に（例え
ば、タンパク質の連続的欠失もしくは点変異解析を行った後に、例えば免疫沈降
もしくは抗体カラム結合による変異タンパク質の抗体結合能力の定量を行って）
決定することができた。この領域のアミノ酸配列の検索が、溶出試料として用い
ることのできる模倣物の選択に利用される。相互作用に係わるいかなる領域には
、１つ以上のアミノ酸接触点の候補が存在することもある。したがって、１つ以
上の模倣物を、単独であるいは組み合わせて検査することにより、どの模倣物が
最も効果的に複合体を破壊し、最も効果的なタンパク質溶出を可能にするかを決
定することができる。
配列リスト
（1）一般情報 ：
（i）出願人 ： シード ブライアン
（ii）発明の名称 ： アミノ酸模倣物を溶出試薬として用いる新和
精製方法
（iii）配列の数 ： ２
（iv）対応アドレス ：
（A）名宛人 ： フィッシュ アンド リチャードソン
（B）通り ： 225フランクリン ストリート
（C）市 ： ボストン
（D）州 ： マサチューセッツ
（E）国 ： アメリカ合衆国
（F）郵便番号 ： 02110-2804
（v）コンピュータ読み出し形態 ：
（A）媒体形式 ： 3．5”ディスク，1．44Mb
（B）コンピュータ ： IBM PS/2モデル50Z または55SX
（C）作動システム ： MS-DOS（バージョン5．0）
（D）ソフトウェア ： ワードパーフェクト（バージョン5．1）
（vi）現出願データ ：
（A）出願番号 ： 07/956,660
（B）出願日 ： １９９２年１０月２日
（C）分類 ：
（vii）優先出願データ ：
（A）出願番号 ：
（B）出願日 ：
（viii）代理人情報 ：
（A）氏名 ： クラーク ポール ティー
（B）登録番号 ： 30,162
（C）整理番号 ： 00786/153001
（ix）遠隔通信情報 ：
（A）電話番号 ： （617）542-5070
（B）ファックス番号 ： （617）542-8906
（C）テレックス番号 ： 200154
（2）配列番号１の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 42
（B）配列の型 ： 核酸
（C）鎖の数 ： 一本鎖
（D）トポロジー ： 鎖状
（xi）配列番号１の記載 ：
（2）配列番号２の情報 ：
（i）配列の特徴 ：
（A）配列の長さ ： 39
（B）配列の型 ： 核酸
（C）鎖の数 ： 一本鎖
（D）トポロジー ： 直鎖状
（xi）配列番号２の記載 ：
Detailed Description of the Invention
Affinity purification method using amino acid mimetics as elution reagents
The present invention relates to a protein separation and purification technique.
Today, there are many tools for separating specific proteins from other components in biological samples.
A wide variety of methods, materials and approaches exist. One example of a common approach
And there is a non-specific affinity of the protein for the substrate. For example, the protein
Based on the charge of the molecule, it can be separated by ion exchange chromatography.
Wear. That is, the protein mixture is a chromatographic matrix of opposite charge.
Of various proteins by reversible electrostatic interaction
Bind to lix. Proteins adsorbed to the matrix increase ionic strength
Binding, or by changing the pH of the eluent buffer
It is eluted in order from the strongest to the strongest.
Another common approach is to use physical properties of the protein as a means of separation.
One that uses sex. For example, using gel filtration, you can
Proteins can be separated based on With this method, the specified size
A gel filtration column packed with a chromatographic matrix with
Add the protein mixture. After that, the protein is usually prepared using an aqueous buffer solution.
Elute and collect as individual chromatographic fractions for analysis
.
Finally, the third general approach is to use a purifying reagent.
There are some that utilize the specific affinity of the protein for). For example, that tan
Proteins can be purified using antibodies specific for the protein, or
Or, conversely, the antibody may be purified by its specific antigen. Usually antibodies
Or, the antigen is bound to the column substrate and the solution containing the specific antigen or antibody.
Can be added to the column to form immune complexes. Then join
The components of the immunocomplexes that have been formed are, for example, very ionic or high pH.
This antigen-antibody complex is destabilized and eluted by exposure to low buffering agents.
It
Be done. Alternatively, an immune complex is formed and the antigen or antibody is immunoprecipitated.
It may be purified. In this case, the antigen-antibody complex may be aggregated and then precipitated.
, Or one of the binding elements is a solid particle (sepharose or agarose).
, Etc.) and the immunoaffinity complex may be separated by centrifugation.
. In either case, the protein to be separated is then the same as in the previous case.
Exposure to buffers with high ionic strength or high or low pH
Separated from the complex.
Of particular interest to molecular biologists are antibodies or recombinant antibody fusion proteins.
Separation and purification method. Each antibody molecule is structurally composed of two identical heavy chains (H
Chain) and two identical light chains (L chains), each L chain being a disulfide bond to the H chain
And the H chains are disulfide-bonded together to form the basic dimeric structure of the molecule.
ing. A unit consisting of about 110 amino acids is folded inside each chain.
The single internal disfilled connection allows them to be integrated together and
Are formed. The L chain has two domains and the H chain has 4 or 5 domains.
Have an inn.
The first two N-terminal domains of the H chain interact with the two L chain domains
Form the "Fab domain", ie, the portion of the molecule responsible for specific antigen recognition and binding.
To achieve. At the other end of the molecule, the C-terminal domain of the H chain (CHTwo
Domain and CH3 domains) form the “Fc domain”. "Fc Dome
“In” refers to a number of immunoglobins, including cell attachment, complement attachment, placental traverse, etc.
It is the molecular part that performs the brin function. Furthermore, between the Fab domain and the Fc domain
The small number of amino acids that make up the hinge region are formed in. The hinge area is
Allows free movement of the antigen-binding part of the molecule, in the unfixed region.Summary of the invention
The object of the present invention is to provide a protein adsorbed on an affinity chromatography column.
It is to provide an inexpensive and general way to elute quality.
Affinity chromatography was purified as described above in general.
A specific interaction between a protein and a ligand immobilized on a solid phase
It is a very effective protein purification method. Usually several solid phase ligands
Has the unique chemical properties of, which allows it to selectively adsorb proteins to be separated.
It Other contaminant proteins should not bind to the solid phase ligand.
Or the solid phase ligand is removed by washing with a suitable solution. This
Then, elution of the affinity column can be performed by either of the following two methods.
: (I) The matrix is loaded with a specific ligand that mimics the immobilized ligand.
Method, or (ii) the matrix by ionic strength.
Very high or very high pH (greater than 11) or very low
A method of washing with a solution (less than 3). In general, method (i) rather than method (ii)
Is more effective, but this is because solutions with very high ionic strength
In general, the affinity matrix should be firmly attached as long as it does not
It is usually ineffective in separating bound proteins, and many
The protein is sufficiently acidic or basic to elute the protein to be separated.
This is because it is unstable with respect to buffering agents having. However, specific elution
If the ligand is not available or the specific eluting ligand is not available for practical reasons.
If appropriate, eg its specific ligand was unstable or expensive
However, the method (i) cannot be applied.
If the ligand itself is a protein, use an elution solution containing the specific ligand
Thus, it is rare that proteins can be eluted from the immobilized ligand. this
Requires that the specific ligand be a protein or peptide fragment
Therefore, elution becomes infeasible for the above-mentioned practical reasons.
The present invention provides the use of inexpensive low molecular weight compounds that mimic the side chains of specific amino acids.
Based on that, a novel method of eluting the affinity matrix is disclosed. Non-tamper
In order to separate the protein bound to the cytoplasmic affinity ligand,
Eluted compounds are selected that mimic the side chains of specific amino acids associated with the recognition of one
When separating proteins bound to protein affinity ligands,
Is the protein to be purified or the ligand of immobilized ligand.
Any side chain of the protein may be mimicked.
Suitable side-chain mimetic compounds are water soluble and compatible with the proteins to be separated.
(Compatibility). Interaction between proteins is hydrophobic
Is often stabilized by dynamic interactions, especially aromatic hydrophobic interactions.
The most preferred elution reagents are histidine, tyrosine, tryptophan, and
It is better to choose from the group consisting of side chain mimics of nylalanine. Specific examples
In anxiety about interactions facilitated by binding to histidine residues
For normalization, it is appropriate to select imidazole. Suitable for tyrosine side chain
Such mimics are aminophenol or hydroxybenzene sulfonate, etc.
Of the phenol and phenolic compounds whose water solubility is promoted by the substituents of
It is a droxylated aromatic compound. A suitable mimic of tryptophan is
Substituted indole such as indole-3-sulfate or indole-3-acetic acid
, Or a benzimidazole salt is preferable. A suitable mimetic of phenylalanine is
Nzoate salt, phenyl sulfonate, and nicotinate or nicotine
Water-soluble heterocycles such as de are preferred.
Beneficial amino acid mimics are also charged residue intera
ctions) may be selected. Such charged residue interactions are
Examples of useful interfering compounds include lysine, a guanidine salt that mimics arginine.
Mimicking alkylamines, and glutamate or aspa
Included are alkanoic acids that mimic aspartate.
It
Further, other compounds useful as an elution reagent in the present invention include fat
Compounds that interfere with hydrophobic residue interactions of the family, eg, aliphatic alcohols, water-soluble
Polyalkylene glycol aliphatic ether, aliphatic alcohol sulfate ester
And aliphatic amines. In addition, binary such as aliphatically substituted phenols
Compounds with dual hydrophobicity are also said to be useful in mimicking side chain residues
Get
As described above, the present invention comprises the steps of separating a protein from a sample.
Is characterized by the method (I) binds to a protein to form an affinity complex
Supply a first molecule that can be. (Ii) Circumstances in which formation of an affinity complex is possible
Underneath, the sample is contacted with the first molecule. (Iii) Take out the complex. (Iv)
The complex is treated with the second molecule. This second molecule is a protein or complex
It mimics any amino acid residue of the first molecule that is essential for body formation.
Then, the second molecule destroys this complex and the protein is released from the complex.
.
(V) Take out the separated protein.
In a preferred embodiment, all or part of the second molecule mimics an amino acid side chain.
Copy.
In another preferred embodiment, the first molecule is protein A and the separating protein is
The protein is an antibody or antigen fusion protein having a protein A binding domain.
Is. According to this example, the second molecule preferably mimics a histidine residue.
For example, imidazole is preferable.
In two other preferred embodiments, the first molecule is an antibody and the separating tag
The protein is a recombinant protein. Alternatively, the first molecule is an antigenic protein
Yes, the separating protein is an antibody that specifically binds to this antigenic protein
It
Here, "mimicking an amino acid residue" means that the amino acid residue itself is
Or protein or non-protein affinity ligands (ie "first molecule")
) With some of the amino acid residues that are essential for the ability of that residue to interact with
It means having one or a similar chemical composition. Preferably
Is the side chain of the residue where the mimicked portion of the amino acid is. Such a mimicking molecule
Is used as an elution reagent, the molecule is water soluble and the protein to be purified
Preferably combined with the stability of Any amino acid mimetic may be used in the present invention.
Although beneficial, those that interfere with hydrophobic protein-protein interactions are preferred
. Note that such interactions include histidine, tryptophan, tyrosine, and
And phenylalanine containing amino acid interactions. These amino acids
Preferred mimetics for are as described above.
"Antibody fusion protein" refers to a non-immunoglobulin polypeptide directly or
Have at least a portion of an immunoglobulin Fc domain that is indirectly covalently linked
Means protein.
The "amino acid side chain" is attached to the central carbon atom of the molecule, which determines the identity of the amino acid.
Means the part that Preferred side chains according to the present invention include histidine, tryptopha
Includes hydrophobic side chains that characterize proteins, tyrosine, and phenylalanine
.
"Protein A binding domain" means Staphylococcus aureus called protein A
By the portion of an immunoglobulin molecule that interacts with cell wall components. Crystallographic research
By research, this domain is CH2 / CHIt turns out that it is placed most in part 3
did.
Applicants have modified the affinity purification technique to allow
Amino acid mimetics are used as elution reagents to separate proteins to be separated into affinity complexes.
I was aware that they could be separated from This approach is based on traditional elution techniques (eg
(E.g., an elution step based on a sudden change in the pH of the solution)
Standard elution by this method by the Applicant as it is gentler
The procedure involves the removal of proteins whose activity is disrupted (eg, irreversibly denatured) or reduced.
Separation and purification can be facilitated. Moreover, amino acid mimetics are convenient and inexpensive
As elution reagents, these mimics are more stable elution reagents for protein purification
It can also be used as.
Other features and effects of the present invention are described and described in the preferred embodiments below.
It is clear from the range.Brief description of the drawings
FIG. 1 is a diagram schematically showing the immunoglobulin fusion protein CD62Rg.
It
FIG. 2A shows flow cytometry for CD62Rg binding to the surface of neutrophils.
The measurement results of
FIG. 2B shows flow cytometry for CD62Rg binding to the surface of H3630 cells.
The measurement result of totometry is shown.
FIG. 2C is a flow site for CD62Rg binding to the surface of HSB2 cells.
The measurement result of the metric is shown.
FIG. 2D is a flow site for CD62Rg binding to the surface of K562 cells.
The measurement result of the metric is shown.Detailed description
Protein isolation and purification procedure according to the invention, and one specific immunoglobulin
Its use in separating fusion proteins is described below. Recombinant tongue
Due to the extremely gentle elution of the protein, purification is performed without significantly impairing the original binding reaction.
Can be made. The following examples are provided to illustrate, not to limit the invention.
Shown in.Immunoglobulin G1 (Ig by elution with a histidine mimetic imidazole G1) affinity purification
Affinity Chromatography Including Elution with Imidazole, a Histidine Mimic
Human IgG1 was purified by Ruffy as follows.
Human IgG1 was loaded onto Protein A Tris Acrylic Carrier (Pierce, IL, IL)
Cuckford) and wash with phosphate buffer solution. A small number of carriers
Distributor These columns are run at concentrations of 1M, 2M, 3M, 4M, or 5M
A solution containing imidazole with a final pH adjusted to 6, 7, 8 or 9
Eluted at. This result is the percent of maximum elution obtained for any pH value.
Are shown in Table 1.
If the imidazole concentration is the highest at any pH value
Kana IgG1 remained. The pH value generally mediates the dissolution output of imidazole
Although it did not play an important role, imidazole has a pK value of 7.1 and a pH of 6
About 90% of the molecule is charged, while at pH 8 about 90% is charged
This result was unexpected because it would not.
Using this method, as with IgG1 alone, immunoglobulin fusion proteins
The biological activity of the protein portion fused to the immunoglobulin constant region.
It was purified from the Protein A column without damage. (For details, see the following CD62
See Rg purification. ) The fusion protein purified by such a method
For some time, acidic elution conditions are used when the tantalum fused to the immunoglobulin domain.
To destroy the activity that is supposed to be in the protein part (ie, the binding activity of the ligand)
Was known. In general, purification of these immunoglobulin fusion proteins
, By transfection of COS cells with the appropriate cDNA construct.
Prepared, fusion protein crude preparation (of a surface antigen)
Human IgG1 hinge bound to the extracellular domain, CH2, and CH3 Domei
The initial separation with respect to The culture supernatant will continue for 5 to 10 days
They were collected from the intercultivated transduced cells, centrifuged to remove impurities, and
It is adsorbed on Rotein A Tris acrylic or Protein A agarose carrier.
Collect these carriers and use 1% non-ionic detergent (Nonidet P40 or Tri
Ton X-100) containing phosphate buffer solution (PBS), followed by buffer solution only
Washed and further adjusted to pH 8 with acetic acid or hydrochloric acid.
Elute with a gel. The fusion protein thus eluted is dialyzed against buffer solution.
Alternatively, imidazole is removed by two cycles of centrifugation ultrafiltration (Centrico
n 30) Amicon, Beverly, Mass.).
One specific example of purification of such an antibody fusion protein is shown below.Soluble CD62: Isolation of immunoglobulin fusion protein
The first four N-terminal extracellular domains of CD62 were labeled with human Ig as follows.
CD62 protein chimera by genetically fusing to the hinge domain of G1
Prepared. Allows fusion with human IgG1 artificial splice donor sequence
A synthetic lectin (L) (lectin
), Epidermal growth factor (EGF), and the first two complement regulatory proteins
The CD62 cDNA sequence encoding the element (CR) was cloned by the replication chain reaction (P
Amplified in CR) (Aruffo et al. Cell61, 1303-1313, 1990) (
(Fig. 1). The forward primer is GGC GCC GAA GCT TCC ATG.
Sequence of GCC AAC TGC CAA ATA GCC ATC TTG
Column number: 1), reverse primer is GGC CAG ATC TCCC
Distribution of TG CAC AGC TTT ACA CAC TGG GGC TGG
It had columns (SEQ ID NO: 2). This sequence shows that the CD62 fragment is HindI.
As a II to BglII fragment, it was digested with HindIII and BamHI.
It was possible to insert it into the vector which was modified. Fermentation to amplify DNA
Recommended reaction from a distributor (US Biochemical, Cleveland, Ohio)
Buffer and endothelial cell expression library (Bevilacqua et al., Science243， 11
60-1165, published in 1989) and digested with MluI digested DNA
20 cycles of PC at 94 ℃ for 30 seconds, 45 ℃ for 2 minutes, 72 ℃ for 3 minutes
R was done. The resulting fusion protein designated CD62 Rg is
1 schematically.
CD62 Rg expression plasmid was transferred to COS cells using DEAE dextran.
(Seed and Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA)84: 3365-3369, 1
See 987). That is, it was half full in 10 100 mm plates.
Conditioned COS cells were transduced with each construct. Transfection
12 hours after treatment, the cells were trypsinized and plated on a new 100 mm plate.
And cultured for 7 to 10 days. Day 4, 10% bovine on each plate
5 ml of fresh medium containing fetal serum was added. Collect the supernatant and centrifuge.
After removing the non-adherent cells and debris, the cells were collected and stored at 4 ° C. this
The expression plasmid encodes recombinant globulin by gel electrophoresis of such supernatant
And these globulins are soluble in the supernatant of transduced COS cells.
It was shown to exist in the form of.
CD62 Rg fusion by chromatography using protein A column
The first attempts to purify proteins were usually used to elute immunoglobulins.
Unsuccessful due to instability of the fusion protein to the acidic buffer
. To avoid this problem, Applicants used a solution of imidazole instead to elute
Was done. This oversupplies this molecule (assuming from crystal structure studies)
Then, the antibody fusion protein CH2 / CHProtein A and histidine in three fragments
This is because it was determined that the interaction of the complex would be disrupted by the amino acid residue. this
As a result, 4M imidazole retains carbohydrate (sugar) and tissue reactivity.
Proven to be a mild and effective eluent (see below)
.
The above imidazole purification procedure was performed as follows. Transfer
Twelve hours after transfection, COS cells transduced with each construct were
The fraction was spread in a flask. 36 hours after transfection,
Wash with phosphate buffer solution (PBS) and remove the cysteine-methionine-free medium.
Added for 30 minutes. Adjust the final concentration to 150 μCi / ml [35S] Methio
Nin and [35S] Cysteine (TransLabel, ICN, COS, CA)
Cells) to allow the cells to incorporate the label overnight. Collect the supernatant and
l Protein A Tris Acrylic (Pierce, Rockford, IL) and 1
Incubated for 2 hours at 4 ° C. Collect the carriers by centrifugation, PBS / 1% Noni
It was washed with det P-40. For analysis, the carrier was loaded with 1% sodium dodecyl sulfate.
Elution was performed with 200 μl of Um. After exposing to mercaptoethanol in advance,
Do not expose to 10 μl of each eluate and add 6% discontinuous polyacrylamide gel.
Added Five times the column volume (neutralized with acetic acid) as a preliminary elution
The column was washed with 4M imidazole (pH 8). 4 eluted proteins
Store in imidazole at 8 ° C or 8 ° C for a short time, or centrifuge ultrafiltration.
The solvent was changed to PBS by filtration and stored for a longer time.CD62 Rg tissue reactivity
Purified protein can react with cells and tissues in a manner characteristic of CD62
Bone marrow cell lines and tumor cell lines, ie, normally native C
Binding capacity analysis in cells to which D62 binds was performed.
Using undiluted Rg supernatant in the presence of 10% rabbit serum, 10630 cells
The reaction was allowed to proceed on ice for a minute. The cells were washed once with PBS and concentrated at 1 to 5 μg / ml.
Degree of fluorescent goat antibody against human IgG or IgM (Cappel, Malva
, Pennsylvania) for 30 minutes on ice, followed by 4% Holmarde
Immobilized in PBS with beads. Fluorescence values were measured using a FACScan analyzer.
Determined by standard techniques. The result is shown in FIG. In the figure, the solid line
Shows the reactivity with CD62 Rg, the dotted line with the control CD7 Rg protein
The reactivity is shown.
By such flow cytometry and fluorescence microscopy, CD62 Rg
Newly isolated human granulocytes, breast carcinoma lines H3630 and H3396, and
Responsive to cell surface ligands of bone marrow cell lines HL60, THP-1, U937
It has been shown. On the other hand, leukemic T cell line HSB-2, Jurkat cells, or
HPB-ALL, K562 (erythroleukemia) cells, HeLa cells, COS cells, RD
(Rhabdomyosarcoma) cells, H3606 and H3620 melanoma cells, or Ltk-
No cell surface reaction was found in the NIH 3T3 mouse fibroblast cell line (
See FIG. 2). In addition, a control immunoglobulin fusion protein CD7 Rg
CD8 Rg, and native IgG show a visible reaction under these conditions.
There wasn't. In many cases, the amount of CD62 Rg bound to the permeabilized cells is
, By greatly exceeding the amount of CD62 Rg bound to impermeable cells,
It was suggested that there is substantial internal conservation.CD62 Rg carbohydrate reaction
Glycolipid is a lineage-restricted developmental pattern.
), We often express complex carbohydrate determinants in HL60.
Lipid extraction of cells (promyelocytic leukocyte strain), either in lysed or adsorbed form
It was investigated whether or not it binds to CD62Rg. Forti-distributed HL60 cells
Thin layer chromatography using plates coated with silica gel on the upper and lower layers of
And the chromatogram was identified using radioisotopes and CD62 or
Is
After reacting with the control fusion protein and washing,
I took a close-up. Uniform with 20 volumes of chloroform: methanol solution 2: 1
Due to qualification, cells (1 x 108From 5 × 108) Was extracted. Crude extract with lipids
It was filtered with a filter paper not containing it, and the Forti distribution was repeated (Hakomori and
siddiqui, Meth. Enzymol.32: 345-367, 1974). Remove both upper and lower layers
After watering, it was dissolved in 200 μl of methanol. Lipid from the culture supernatant is 1M
Extracted with butanol saturated with NaCl (1: 1 v / v). dehydration
The butanol layer was dried by and the residue was suspended in methanol.
Aluminium-backed silica gel HPTLC plate with aluminum backside.
A rate (5 cm x 7.5 cm) was used for chromatography and glycolipids were
Separated with lorofilm / methanol / water (120/70/14). Chromatograph
After the graphic, the plate is dried and 0.1% polysobutylmethacrylate is added.
Immersed in hexane containing water and fixed (Magnani et al., Meth. Enzymol.83: 235-2
41, 1982), blocking solution (150 mM NaCl, 3 mM CaCl2, 2% BS
The reaction was carried out in A) at 22 ° C for 1 hour. 35S-Identification Rg (1 × 10FiveFrom 2x1
0Fivecpm / ml), ie fusion tan of CD62 Rg or control
Any of the protein ELAM-1 Rg was added and reacted with the plate overnight.
. Next, the chromatogram is analyzed with 150 mM NaCl and 3 mM CaCl.230 in
Wash twice, dry, spray with En3Hance,
went.
Closely arranged as a single band or in different solvent systems
It was found that glycolipids migrating as two bands react strongly with CD62 Rg.
won. Under these or stronger elution conditions, ganglios
No reaction was seen in the defraction.
By parallel evaluation of the chromatographic patterns of different purified glycolipids:
Was shown. HL60 lipid is a sulfatide of bovine brain (Sigma, Centru
Chair, Missouri; Matreya, Bellefonte, PA), Sphint
3-Sulfate with Heterogeneous Fatty Acyl Substitution at the 2-Amino Position of the Gossin Moiety
Commercial preparation of galactosyl ceramides (3-sulfated galactosyl ceramides)
Both have three different solvent systems [specifically chloroform / methanol /
Water (120/70/14, chloroform / methanol / water (73/21/4)
, Chloroform / methanol / acetone / acetic acid / water (10/2/4/2/1 (
Ishizuka et al., J. Biol, Chem.253: 898-907, 1978)].
Chromatography and analysis of the purified glycolipid under the same conditions was performed. Ie
, Respective lipid standards (bovine brain gangliosides (Sigma, St. Louis,
Missouri; Matreya, Bellefonte, PA), Sulfatide (
Sigma, St. Louis, Missouri; Matreya, Bellefonte, Pennsylvani
A)), trisialyl ganglioside GT1b (
Sigma, St. Louis, MO), galactosyl with hydroxyl substitution
Ceramide (Sigma, St. Louis, MO) or lysosulfatide (
Sigma, St. Louis, Missouri; Matreya, Bellefonte, Pennsylvani
A))) 2 micrograms (dry weight) of CD62 Rg or ELAM-1
React with Rg and develop with chloroform / methanol / water (73 / 21.4)
did. This shows that sulfatide reacts strongly with CD62, and more ionic
It was confirmed that the transformed shape was preferentially recognized under these conditions. fat
Lysosulfatide without acyl substitution was not recognized. Also, there are no sulfate residues
Galactosylceramide may or may not have hydroxyl substitution in the fatty acid chain.
Not recognized. Glycolipids with CD15 allow detection of sulfatide
Under the conditions, no discernible reaction was observed with CD62 Rg.
. Furthermore, CD7 Rg, CD8 Rg (Aruffo et al., Cell61, 1303-1313
, 1990), ELAM-1 Rg (Walz et al., Science250: 1132-1135, 1990
), An intact (Intact) IgG1, Fc fragment present in CD62 Rg
None of the corresponding IgG1 COS cell preparations reacted with sulfatide
.Other experimental examples
Applicants have modified the affinity purification technique to include amino acid mimetics in the final purification step.
Is used as an elution reagent to release the target protein from the affinity complex
I realized that I could do it. An elution step with such an amino acid mimic is an example
For example, from the complex bound to the column or from the complex involved in immunoprecipitation.
Use in any standard affinity purification procedure, such as protein separation
Can be.
Many amino acid mimetics (eg, those mentioned above) are easily incorporated into the mixture.
Therefore, the general elution technique described here is based on interaction points or
For purification of any protein, including proteins for which the acid sequence is unknown.
Can be used. In one particular example, the exemplary amino acid mimetics described above.
Most or all of the hydrophobic interactions (taking into account solubility), aliphatic
Many affinity complex interactions based on hydrophobic and / or charged interactions
It can be mixed with a general purpose eluting reagent that destroys any of the uses. this
For general-purpose elution reagents such as, the amino acid sequence of the specific affinity contact point, if
In other words, it is not necessary to determine the amino acid sequence of the separated protein.
However, the explanation of these amino acid sequences is most effective for the target protein.
It may also be used as a guide for the selection of mimetics that elute in the. For example, general
A beneficial affinity interaction point is involved in antibody complex formation in any protein.
Is a predetermined area. This area can be identified by technology or experimentally (eg
For example, after performing a sequential deletion or point mutation analysis of the protein, for example, immunoprecipitation.
Alternatively, quantify the antibody binding capacity of the mutant protein by antibody column binding)
I was able to decide. Amino acid sequence searches in this region were used as elution samples.
It is used to select imitable products. In any area of interaction
There may be more than one candidate amino acid contact point. Therefore, one or more
By inspecting the above mimics alone or in combination, which mimic
Decide which will most effectively disrupt the complex and allow the most efficient protein elution
Can be specified.
Sequence list
(1) General information:
(I) Applicant: Seed Bryan
(Ii) Title of invention: Shinwa using amino acid mimetics as elution reagents
Purification method
(Iii) Number of sequences: 2
(Iv) Corresponding address:
(A) Addressee: Fish and Richardson
(B) Street: 225 Franklin Street
(C) City: Boston
(D) State: Massachusetts
(E) Country: United States
(F) Zip code: 02110-2804
(V) Computer read mode:
(A) Media format: 3.5 ”disk, 1.44Mb
(B) Computer: IBM PS / 2 model 50Z or 55SX
(C) Operating system: MS-DOS (version 5.0)
(D) Software ： Word Perfect (Version 5.1)
(Vi) Current application data:
(A) Application number: 07 / 956,660
(B) Application date: October 2, 1992
(C) Classification:
(Vii) Priority application data:
(A) Application number:
(B) Application date:
(Viii) Agent information:
(A) Name: Clark Paul Tee
(B) Registration number: 30,162
(C) Reference number: 00786/153001
(Ix) Remote communication information:
(A) Phone number: (617) 542-5070
(B) Fax number: (617) 542-8906
(C) Telex number: 200154
(2) Information of SEQ ID NO: 1:
(I) Sequence features:
(A) Sequence length: 42
(B) Sequence type: Nucleic acid
(C) Number of chains: Single chain
(D) Topology: Chain
(Xi) Description of SEQ ID NO: 1:
(2) Information of SEQ ID NO: 2:
(I) Sequence features:
(A) Sequence length: 39
(B) Sequence type: Nucleic acid
(C) Number of chains: Single chain
(D) Topology: Linear
(Xi) Description of SEQ ID NO: 2: