JPH08503132A

JPH08503132A - Treatment of heat shock proteins and tumors

Info

Publication number: JPH08503132A
Application number: JP6511867A
Authority: JP
Inventors: ジョゼフコルストン，マイケル; ローリー，ダグラス; ヴェロニカルカクス，カタリン
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1992-11-13
Filing date: 1993-11-15
Publication date: 1996-04-09
Anticipated expiration: 2019-04-19
Also published as: DE69331762T2; EP0670899A1; AU5430794A; GB9223816D0; ES2174856T3; DE69331762D1; CA2149309A1; PT670899E; ATE215125T1; WO1994011513A1; AU690085B2; DK0670899T3; JP3520086B2; US6328957B1; EP0670899B1

Abstract

(57)【要約】腫瘍の治療に使用するための発現ベクターであって、熱ショックポリペプチド（hsp）またはシャペロンであるポリペプチドを発現可能な形態でコードする少なくとも一つの配列を含む核酸を含むベクターが提供される。 (57) [Summary] An expression vector for use in the treatment of tumors is provided which comprises a nucleic acid comprising at least one sequence encoding a polypeptide that is a heat shock polypeptide (hsp) or chaperone in an expressible form.

Description

【発明の詳細な説明】熱ショックタンパク質および腫瘍の治療本発明は熱ショックタンパク質またはシャペロン（chaperone）を発現する発現ベクターに関する。通常、固型腫瘍は手術、化学療法および放射線療法の組み合わせにより治療される。また、白血病の如きその他の腫瘍は化学療法および放射線療法により治療される。しかしながら、これらの治療方法は理想的ではない。何となれば、放射線療法および化学療法は不快な副作用を生じ、また脳腫瘍の如き或る種の固型腫瘍は手術により治療し得ないからである。これらの理由のために、腫瘍を治療し、予防するための新規な方法が絶えず探究されている。現在研究されている一つの方法は、例えば、IL-2またはTNFをコードする遺伝子の遺伝子移入の使用である。腫瘍はマウスに腫瘍細胞系を投与することにより誘発し得る。特に、マウスマクロファージ腫瘍細胞系J774が投与されるマウスは、大きな、腹腔内の、悪性度の高いリンパ細網腫瘍を発生する。驚くことに、このような腫瘍細胞がマイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)65kD hspをコードする遺伝子を移入され、続いてマウスに投与される場合、細胞の腫瘍形成性の低下または消失があることがわかった。更に、このような移入細胞をマウスの如き宿主に投与し、続いて宿主が移入されなかった同じ細胞系からの腫瘍細胞で抗原投与する場合、腫瘍は発生しない。それ故、その技術は、腫瘍の治療に関する別の、または付加的なアプローチにつき可能性を有する。本発明は、熱ショックポリペプチド（hsp）またはシャペロンであるポリペプチドを発現可能な形態でコードする少なくとも一つの配列を含む核酸を含む、例えば、腫瘍の治療における治療薬として使用するための哺乳類細胞または発現ベクターを提供する。ポリペプチドとして、例えば、熱ショックタンパク質、熱ショックタンパク質フラグメント、熱ショックタンパク質類縁体、シャペロン、シャペロンフラグメントまたはシャペロン類縁体が挙げられる。フラグメントは、長さが少なくとも 10、好ましくは少なくとも15、例えば、20、25、30、40、50または60のアミノ酸残基であろう。類縁体は一般に少なくとも５、好ましくは少なくとも10、例えば、20、40、60または100 以上の連続するアミノ酸の領域にわたって熱ショックタンパク質またはシャペロンに対し少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％または90％、更に好ましくは少なくとも95％相同であろう。類縁体のアミノ酸配列は、少なくとも一つの残基が欠失、挿入または置換される場合は、熱ショックタンパク質またはシャペロンのアミノ酸配列と異なっていてもよい。シャペロンは、タンパク質からそれらの活性なコンホメーションへの折りたたみを媒介するタンパク質である。シャペロンおよび熱ショックポリペプチドの両方であるポリペプチドが存在する。熱ショックポリペプチド、例えば、hsp60 、 hsp65 およびhsp70 はその他のタンパク質の折りたたみおよびトランスロケーションに関与し、それ故、またシャペロンである。フラグメントは、グリコシル化されていないが、それらの抗腫瘍活性を保持するポリペプチドを含む。類縁体は、異なるアミノ酸配列で操作されているが、それらの抗腫瘍活性を保持するタンパク質を含む。本発明の発現ベクターの核酸は一本鎖または二本鎖であってもよく、またRNA またはDNA であってもよい。一般に、核酸は本明細書に特定されたようなポリペプチドをコードする唯一の配列を含むが、核酸は本明細書に特定されたようなポリペプチドを別々にコードする２、３、４またはそれより多い配列を含んでいてもよい。本発明の発現ベクターまたは細胞系中に含まれる核酸は、本明細書に特定されたようなあらゆる好適なポリペプチドをコードするが、好ましくは宿主のポリペプチドをコードしない。ポリペプチドはシャパロニンであることが好ましく、またポリペプチドはバクテリアのhsp 、例えば、マイコバクテリウム・レプラエ65 kD hsp またはマイコバクテリウム・レプラエ70kD hspであることが最も好ましい。本発明の発現ベクターは、一般に、ウイルス、プラスミド、コスミド、エピソームベクターまたは裸の核酸である。一般に、裸の核酸は、調節配列と一緒にポリペプチドをコードする配列を含む。裸の核酸は、一般に、少なくとも100 、例えば、少なくとも200 、400 、600 、800 、1000、2000または4000の塩基対を含む。裸の核酸は一本鎖または二本鎖であってもよく、またDNA またはRNA であってもよい。好適なプラスミドとして、例えば、pZIPNeo、pLXSN およびMFG が挙げられる。本発明の発現ベクターとして都合よく使用されるウイルスとして、ベクターの核酸がRNA であるウイルス、例えば、不能状態のレトロウイルス、およびDNA ウイルス、例えば、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスが挙げられる。ベクターまたはウイルスは、感染細胞中のポリペプチドの発現を得るように宿主に直接投与されてもよく、または最初に細胞系にとり込まれ、次にこれが宿主に投与されてもよい。ベクターまたはウイルスが宿主に直接投与される場合、使用されるウイルスは一般にヘルパーを含まず、かつ複製欠損である。発現ベクターは組換え核酸を含むことが好ましい。また、本発明は、裸の核酸以外の発現ベクターの生産方法を提供するものであり、その方法は本明細書に特定されたポリペプチドをコードする遺伝子をベクターにクローン化することを含む。本発明の方法によれば、ポリペプチドをコードする遺伝子は既知の方法（Silva，Palacios，Colston およびLowrie，Microbiol P-athogenesis 12，27-38（1992））を使用して発現ベクターに直接クローン化し得る。また、本発明は、異種DNA を細胞のゲノムに挿入し、または本発明の発現ベクターを細胞系に移入することを含む細胞の生産方法を提供する。本発明によれば、異種DNA は既知の方法（Molecular Cloning： A Laboratory Manual ，T.Maniat-isら，Cold Spring Harbour，1989）を使用してゲノムに挿入し得る。移入細胞系は、通常の技術を使用してポリペプチドをコードする遺伝子を好適なベクター、例えば、レトロウイルスシャトルベクター、例えば、pZIPNeoSV（x ）にクローン化し、そして既知の方法（Silvaら）を使用してそのベクターを細胞系に移入することにより調製される。本発明の発現ベクターがとり込まれ得る細胞系は一般に哺乳類であり、腫瘍細胞系、MHC IおよびII陰性細胞系、並びにマウスおよびヒトの細胞系を含む。それらが、特に、定着した腫瘍を治療するために投与されるであろう宿主または患者に由来する細胞系、例えば、腫瘍細胞系を使用することが可能である。移入される細胞系は、それに対する保護が探究される腫瘍の細胞系であることが最も好ましい。本発明の発現ベクターまたは細胞は、腫瘍関連抗原またはインターロイキンをコードする配列を更に含んでいてもよい。本発明の発現ベクターまたは細胞は、腫瘍関連抗原またはインターロイキンをコードする配列を有する発現ベクターを含んでいてもよい。幾つかの研究は、サイトカインをコードする遺伝子によるマウス腫瘍細胞のトランスフェクションが親腫瘍の免疫拒絶を生じることを示した。この種の実験に使用されたサイトカイン遺伝子として、IL-4、IL-2、γIFN、T NF α、IL-6、IL-7およびGM-CSFが挙げられる。これらの遺伝子の一種以上が本発明のポリペプチドをコードする遺伝子と相乗作用し、それ故、腫瘍撲滅を得る機会を最大にし得る。異なり、かつ無関係の腫瘍細胞系により生じた腫瘍は共通の腫瘍関連抗原を有することがあり、この場合、このような共通抗原を発現する一つの細胞系による本発明の免疫化が、また共通抗原を有するその他の腫瘍に対する保護を与え得る（しかし、共通抗原を有しない腫瘍に対して大きな保護を与えそうもない）。それ故、本発明はまた本明細書に特定されたポリペプチドおよび腫瘍関連抗原を発現する細胞系を提供する。このような細胞系は、腫瘍関連抗原をコードする別のベクターと一緒に本発明の発現ベクターが移入されてもよく、またはそれらは発現可能な形態の腫瘍関連抗原をコードする配列をも含む本発明の発現ベクターが移入されてもよい。本発明によれば、発現ベクターまたは細胞系は、健康な宿主（患者）の腫瘍の予防及び宿主（患者）に存在する腫瘍の治療に使用し得る。発現ベクターは患者に直接投与し得る。発現ベクターがウイルスである場合、細胞トランスフェクションはウイルスを宿主に直接投与することによりin vivo で行い得る。また、in vitroの免疫化は、宿主（患者）から採り出した好適なリンパ球を本発明の移入細胞系に感作し、そしてリンパ球を宿主（患者）に戻すことにより行い得る。また、本発明は、（a）有効な無毒量の発現ベクターまたは細胞系を宿主に投与することを含む腫瘍の治療方法、（b）腫瘍の治療に使用するための発現ベクターまたは細胞系および（c）腫瘍の治療用の薬剤を製造するための発現ベクターまたは細胞系の使用を提供する。更に、本発明は、腫瘍の治療用の薬剤を製造するための本明細書に特定された核酸の使用を提供する。本発明は精製された形態の本明細書に特定された発現ベクターまたは細胞を提供する。更に、本発明は単離された場合の本明細書に特定された発現ベクターまたは細胞を提供する。更に、本発明は熱ショックポリペプチド（hsp）またはシャペロンであるポリペプチドを発現可能な形態でコードする少なくとも一つの配列を含む核酸から実質的になる本明細書に特定された発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターまたは細胞は、治療される症状に適したあらゆる経路によりヒトを含む哺乳類に投与でき、好適な経路として、経口経路、直腸経路、鼻内経路、局所経路（頬側および舌下を含む）、膣内経路および非経口経路（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、鞘内および硬膜外を含む）が挙げられる。好ましい経路は、例えば、レシピエントの状態および求められる治療の型により変化し得ることが理解されるであろう。こうして、存在する腫瘍は全身治療されてもよく、またはベクターもしくは細胞を病変の部位に直接送出するように選択された経路により治療し得る。予防措置は、おそらく標的腫瘍により冒されているであろう組織中で予防免疫を剌激することを目的とするであろう。本発明の発現ベクターは、単独で、またはリポソームもしくはその他の送出分子と組み合わせて患者に投与し得る。有効投与量は、いずれの送出分子が使用されるのかに依存するが、一般に、好ましくは腫瘍に局所注射される、腫瘍１g当たり100〜500mgのベクター、または治療もしくは転移の予防のために静脈内注射される毎週体重１kg当たり10〜100mgである。下記の製剤中の活性成分は先に特定された本発明のベクターもしくは細胞またはin vitroで免疫化された細胞である。上記の実用性および指示のそれぞれにつき、個々の活性成分の必要量は、治療される症状の重度およびレシピエントの同一性を含む幾つかの因子に依存するであろうし、また最終的には主治医の判断によるであろう。しかしながら、一般に、これらの実用性および指示のそれぞれにつき、治療が移入腫瘍細胞で行われる場合、好適な有効投与量は、毎週レシピエントの体重１kg当たり10⁴〜10¹⁰の細胞の範囲、好ましくは毎週体重１kg当たり10⁵〜10⁸の細胞の範囲、最も好ましくは毎週体重１kg 当たり10⁵〜10⁷の細胞の範囲であろう。投与量は、所望により、その週にわたって適当な間隔で投与される２回、３回、４回またはそれより多い回数のサブ投与量として与えられてもよい。治療がhsp65 遺伝子を含むベクターを用いて行われる場合、有効投薬量は毎週体重１kg 当たり10⁴〜10¹²の無ヘルパーの複製欠損ウイルスの範囲、好ましくは毎週体重１kg 当たり10⁵〜10¹¹のウイルスの範囲、最も好ましくは毎週体重１kg 当たり10⁶〜10¹⁰のウイルスの範囲であろう。本明細書に記載された投与量は上記の投与量のそれぞれに適用可能である。化合物は単独で投与することが可能であるが、それらを医薬製剤として与えることが好ましい。本発明の製剤は、一種以上の許容可能な担体および必要によりその他の治療成分とともに、先に特定された少なくとも一種の活性成分を含む。一種以上の担体は、製剤のその他の成分と適合性であり、そのレシピエントに有害ではないという意味で“許容可能な”必要があり、例えば、リポソームである。好適なリポソームとして、例えば、正に荷電された脂質Ｎ［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（DOTMA）を含むもの、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）を含むもの、および３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（DC-Chol）を含むものが挙げられる。製剤として、経口投与、直腸投与、鼻内投与、局所投与（頬側および舌下を含む）、膣内投与または非経口投与（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、鞘内および硬膜外を含む）に適した製剤が挙げられる。製剤は単位投与形態で都合よく与えられてもよく、また薬学の分野で公知の方法のいずれかにより調製されてもよい。このような方法は、一種以上のアクセサリー成分を構成する担体と活性成分とを混在させる工程を含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体もしくは微細な固体担体またはその両方と一様かつ緊密に混在させ、次に、必要により、その製品を成形することにより調製される。経口投与に適した本発明の製剤は、それぞれ、前もって決めた量の活性成分を含むカプセル、カシェ剤または錠剤の如き不連続単位として；粉末または顆粒として；水性液または非水性液中の溶液または懸濁液として；または水中油液体エマルションもしくは油中水液体エマルションとして与えられてもよい。また、活性成分は巨丸剤、舐剤またはペーストとして与えられてもよい。錠剤は、必要により一種以上のアクセサリー成分と一緒に、圧縮または成形によりつくられてもよい。圧縮錠剤は好適な機械中で必要によりバインダー（例えば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、ナトリウム澱粉グリコレート、架橋ポビドン、架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース）、表面活性剤または分散剤と混合された粉末または顆粒の如き易流動性形態の活性成分を圧縮することにより調製し得る。成形錠剤は好適な機械中で不活性液体希釈剤で湿らされた粉末化合物の混合物を成形することにより製造し得る。錠剤は必要により被覆または刻まれてもよく、また、例えば、種々の割合でヒドロキシプロピルメチルセルロースを使用してその中の活性成分の遅い放出または調節された放出を与えて所望の放出プロフィールを与えるように製剤化し得る。製剤は、例えば、0.075 〜20％w/w、好ましくは0.2 〜15％w/w、最も好ましくは0.5 〜10％w/w の量の活性成分を含む局所軟膏またはクリームとして適用し得る。軟膏中で製剤化される場合、活性成分はパラフィン系または水混和性の軟膏ベースと共に使用し得る。また、活性成分はクリーム中で水中油クリームベースで製剤化し得る。また、眼への局所投与に適した製剤は点眼剤を含み、この場合、活性成分は好適な担体、特に、活性成分用の水性溶媒中に溶解または懸濁される。活性成分は 0.5 〜20％、有利には0.5 〜10％、特に、約1.5 ％w/w の濃度でこのような製剤中に存在することが好ましい。口中の局所投与に適した製剤として、矯味矯臭されたベース、通常、蔗糖およびアカシアまたはトラガカント中に活性成分を含むロゼンジ；不活性ベース、例えば、ゼラチンおよびグリセリン、または蔗糖およびアカシア中に活性成分を含むトローチ；並びに好適な液体担体中に活性成分を含む含嗽剤が挙げられる。直腸投与用の製剤は、例えば、ココアバターまたはサリチル酸塩を含む適当なベースを含む座薬として与えられてもよい。担体が固体であるような鼻内投与に適した製剤は、例えば、20〜500 ミクロンの範囲の粒子サイズを有する粗大粉末を含み、これは嗅剤が、例えば、鼻の近くに保持された容器から鼻通過による迅速な粉末の吸入により摂取されるような方法で投与される。例えば、鼻内スプレーまたは点鼻液としての投与に適した製剤（その担体は液体である）として、活性成分の水性または油性の溶液が挙げられる。膣内投与に適した製剤は、活性成分の他に、当業界で適当であることが知られているような担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたはスプレー製剤として投与し得る。非経口投与に適した製剤として、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤および製剤を意図されるレシピエントの血液で等張性にする溶質を含んでいてもよい水性および非水性の滅菌注射液；並びに懸濁剤および増粘剤、およびリポソームまたはその他の微粒状系（これらはその化合物を血液成分または一つ以上の臓器を標的とするように設計される）を含んでいてもよい水性および非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は単位投与容器または多投与容器、例えば、シールされたアンプルおよびバイアル中で与えられてもよく、また、使用直前に滅菌液体担体、例えば、注射用の水の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で貯蔵し得る。注射溶液および懸濁液は前記の種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から即時に調製し得る。好ましい単位投与製剤は、活性成分の、本明細書に上記された毎日の投与量または単位の毎日のサブ投与量またはその適当なフラクションを含む製剤である。特に上記された成分の他に、本発明の製剤は、当該製剤の型に関して当業界で通常のその他の薬剤を含んでいてもよいことが理解されるべきであり、例えば、経口投与に適した製剤は矯味矯臭剤を含んでいてもよい。本発明の発現ベクターまたは細胞により治療し得る腫瘍の例は、例えば、骨原性肉腫および軟組織肉腫を含む肉腫、癌種、例えば、乳癌、肺癌、膀胱癌、甲状腺癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、子宮癌、および卵巣癌、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、神経芽細胞腫、メラノーマ、骨髄腫、ウィルムス腫瘍、並びに急性リンパ芽球性白血病および急性骨髄芽球性白血病を含む白血病、グリオーマおよび網膜芽細胞腫である。添付図面中、図１（a）は対照細胞および本発明に従って調製された移入細胞中のマイコバクテリウム・レプラエ65kD熱ショックタンパク質（hsp）をコードする遺伝子の発現を示す。図１（b）は21日にわたる親細胞、ベクター単独を移入された親細胞およびマイコバクテリウム・レプラエ65kD hsp遺伝子を移入された親細胞の増殖を示す。図２は本発明に従って免疫化されたマウスの脾臓細胞のin vitroでの細胞毒性を示す。標的細胞はJ774-hsp 65 （□）、J774（△）、Pu518（◇）およびWehi 164（○）であった。図３はDNA 含量に対する増殖細胞の数を示す。J774細胞、ベクター単独を移入されたJ774細胞、リン酸カルシウム沈殿によりhsp-65遺伝子を移入されたJ774細胞およびリポソーム介在性遺伝子移入によりhsp-65遺伝子を移入されたJ774細胞に関する結果が示される。図４はJ774-hsp 65 細胞中でp53 エピトープを発現する細胞の％を示す。図５はhsp 65遺伝子を含むプラスミドを受けるマウス（○）およびhsp 65遺伝子を受けないマウス（□）中の腫瘍サイズを示す。本発明が下記の実施例により説明される。実施例１腫瘍細胞系に熱ショックポリペプチド（hsp）をコードする遺伝子を移入する効果を、マウスマクロファージ腫瘍細胞系J774にマイコバクテリウム・レプラエ 65kD hspをコードする遺伝子を移入することにより調べた。遺伝子トランスフェクションを、Silva，Palacios，Colston＆Lowrie，Microb iol Pathogenesis 12, 27-38（1992）に記載されたようにして行った。M.レプラエ65kD hsp遺伝子をレトロウイルスシャトルベクターpZIPNeoSV（x）にクローン化し、これをリン酸カルシウム沈殿によりウイルスパッケージング細胞系psi-CR E に移入した。ネオマイシン耐性クローンからの上澄みをポリブレンおよび選択されたネオマイシン耐性細胞の存在下でJ774-G8 細胞でインキュベートした。65 kD hsp遺伝子の発現を、モノクローナル抗体C1118（これはM.レプラエ65kDタンパク質を認識する）およびフルオレセインイソチオシアネート標識ウサギ抗マウスF（ab'）₂を使用する間接標識後に細胞のFACS分析により分析した。図１（a）は間接免疫蛍光により分析された対照細胞および移入細胞中のhsp65 の発現を示す。破線は二次抗体単独との反応性を示す。親（J774）細胞系および移入細胞系の腫瘍形成性を胸腺機能正常マウスおよび胸腺欠損マウスで試験した。腫瘍細胞は親J774-G8（J774）細胞、ベクター単独を移入された親細胞系（J774-ベクター）、またはミクロバクテリアhsp65 遺伝子を移入された親細胞系（J774-hsp65）であった。成功した安定なトランスフェクションをSilvaらに記載されたようにしてノーザンブロッティングおよびウェスタンブロッティングにより更に確かめた。群当たり５匹のマウスに10⁶の細胞を腹腔内注射した。図１（b）はそれぞれ正常 Balb/cマウスおよび胸腺欠損Balb/ｃマウス中の細胞系の増殖を示す。腫瘍サイズを、試験マウスの一次腫瘍および腹部臓器を計量し、そして５匹の年齢のマッチした正常な対照の腹部臓器の重量を引くことにより計算した。図１に示された結果から、J774-hsp65細胞を注射されたマウス中の腫瘍の発生率はJ774細胞またはJ774- ベクター細胞を注射されたマウス中の腫瘍の発生率より極めて低いことが明らかである。注射の21日後に、J774細胞またはJ774ベクター細胞を注射された全てのマウスが少なくとも８gの重量の腫瘍を有し、一方、J 774-hsp65 細胞を注射されたマウスは腫瘍を発生しなかったか、または３g未満の重量の腫瘍を有する。実施例２正常なBalb/cマウス、胸腺欠損Balb/cマウスおよびCBA マウスに、表１に示された数の腫瘍細胞を腹腔内注射した。細胞を最初にエンドトキシンを含まないPB S 0.5ml 中で懸濁した。腫瘍細胞は実施例１と同じ方法で調製し、親細胞系（J7 74）、ミコバクテリアhsp65 遺伝子を移入された親細胞系（J774-hsp65）、またはベクター単独を移入された親細胞系（J774-ベクター）であった。腫瘍発生率を腫瘍細胞の注射の21日後に剖検および組織検査により測定した。結果を表１に示す。実施例３ J774-hsp65細胞を実施例１に記載された方法に従って調製した。正常なBalb/c マウスおよび胸腺欠損Balb/cマウスを、毎週の間隔で与えられる10⁶のJ774-hsp65細胞を４回の腹腔内注射で免疫した。28日目に、マウスに異なる起源の10⁶の細網肉腫細胞を腹腔内に抗原投与した。腫瘍発生率および腫瘍サイズを抗原投与の21日後に記録した。腫瘍サイズを実施例１と同じ方法で測定した。結果を表２に示す。表２に示された結果は、正常なBalb/cマウスが、J774-hsp細胞で注射された場合、J774細胞およびJ774- ベクター細胞に対して良好な免疫を発生することを示す。また、これらの結果は、正常なBalb/c免疫マウスがPu518 細胞系に対し若干の抵抗性を有することを示す。全てのマウスが腫瘍を発生するとは限らず、そして発生したマウスにおいて、形成した腫瘍は免疫されなかったマウスよりかなり小さいサイズのものであった。Wehi 164細胞系に対し免疫されたマウスの抵抗性は不十分であった。マウスの大部分が、免疫されなかったマウスに発生した腫瘍と同様のサイズである腫瘍を発生した。 J774-hsp65細胞による免疫化はBalb/c胸腺欠損マウスに対し効果を有しなかった。実施例４ J774-hsp65細胞を実施例１に記載された方法に従って調製した。 J774-hsp65細胞で免疫されたマウスからの脾臓細胞のin vitroでの細胞毒性活性を、正常なBalb/cマウスおよびBalb/c胸腺欠損マウスを、毎週の間隔で、10⁶ のJ774-hsp65細胞を４回の腹腔内注射で免疫することにより調べた。28日目に、脾臓を採り出し、単細胞懸濁液をRPMI 1640＋10％ウシ胎児血清中で調製した。細胞を30Gyにより照射されたJ774-hsp65細胞で６日間インキュベートした。Ｂ細胞をウサギ抗マウスIgG 被覆プレートでパンニングすることにより除去した。CD 4 およびCD8 Ｔ細胞サブセットを、LukacsおよびKurlander，J．Immunol．143， 3731-3736（1989）に記載された方法を使用して精製した。NK細胞およびCD4 細胞またはCD8 細胞を、４℃で30分間の10μg/mlのPK136（抗NK1.1）および抗L3T4または抗Lyt 2モノクローナル抗体により10⁷/mlの細胞を処理することにより採り出し、続いて37℃で60分間、ウサギ補体の1/10希釈液によりインキュベートしてCD4 集団およびCD8集団を得、これらはFACS分析により測定して90％を越えて純粋であった。細胞毒性活性を、種々の数のCD4またはCD8エフェクター細胞を３重のウェル中で⁵¹Crで標識した2000/ ウェルの標的細胞でＶ字形の底の96ウェルマイクロタイター・プレート中で37℃で６時間にわたってインキュベートすることにより測定した。⁵¹Cr放出を、エフェクターＴ細胞および標的細胞を含むウェル（cp m _experimental）、培地単独中でインキュベートされた標的細胞を含むウェル（ cpm _spontan-eous）および標的細胞＋0.1 ％のトリトンＸを含むウェル（cpm _m _aximal ）中で測定した。次式を使用して、細胞毒性を計算した。結果を平均士標準偏差として図２に示す。標的細胞は、J774-hsp65（□）、J7 74（△）、Pu518（◇）およびWehi 164 （○）であった。図２中の結果は、免疫されたマウスからの脾臓細胞のin vitroでの細胞毒性が J774細胞に対するのと同様にJ774-hsp65に対して大きく、またPu518 細胞（細胞毒性は有意であったが、小さかった）およびWehi 164細胞（細胞毒性なし）に対するよりも極めて大きいことを示す。実施例５腫瘍細胞の細胞周期に関するhsp トランスフェクションの効果を、細胞をDNA 特異的ベンズイミド色素、ヘキスト33342 で染色することにより調べた。二つの異なる方法、リン酸Ca沈殿（J774-HSP-Ca）およびリポソーム介在性遺伝子移入（J774-HSP-L）によりマイコバクテリウム・レプラエhsp-65を移入されたJ774腫瘍細胞、並びに移入されなかった対照J774細胞およびベクター移入された対照J7 74細胞（２ x 10⁶/ml）を37℃で30分間にわたって10μg/mlのヘキスト色素で染色した。FACSアナライザーを使用して、DNAヒストグラムを得、そして細胞周期のそれぞれの時期の細胞の％を測定した。図３中の結果は、高DNA 含量を有する増殖細胞（Ｓ期およびG2期）の数がhsp- 65遺伝子（J774-HSP-CaおよびJ774-HSP-L）を移入された腫瘍細胞中で減少したことを示す。同時に、対照腫瘍細胞と比較して低DNA 含量を有するhsp-65発現細胞（GO/G1期）の数に増加が見られた。これらの実験は、hsp-65遺伝子による腫瘍細胞のトランスフェクションが細胞周期の調節の変化を生じることを示し、そして腫瘍細胞の基本的な特性の一つである制御できない増殖を変化させることを示唆する。実施例６機能不全性p53 腫瘍サプレッサータンパク質を生じるp53 遺伝子の突然変異は、悪性腫瘍における最も頻繁に観察される遺伝的病変である。マイコバクテリウム・レプラエhsp65 を移入された腫瘍細胞および対照腫瘍細胞を、p53 腫瘍サプレッサータンパク質の発現につき調べた。J774-HSP細胞を実施例１に記載された方法に従って調製した。p53 タンパク質の発現をFACS分析により分析した。細胞膜を0.05％のサポニンにより透過性にし、次に細胞をp53 に対し特異的なモノクローナル抗体（D．Laneにより提供されたAb-248およびAb-421）およびFITC標識ウサギ抗マウスF（ab'）₂二次抗体でインキュベートした。図４はJ774-hsp65細胞中の両方のp53 エピトープの増大された発現を示す。p5 3 は正常な細胞周期調節に必須のDNA 結合タンパク質であるので、本発明者らの実験はhsp65 がp53 腫瘍サプレッサータンパク質を通じて細胞周期に対するその効果を与え得ることを示唆する。hsp65 移入細胞の増大されたシャペロン活性は、有効ではない変異体p53 タンパク質の適当な折りたたみおよびコンホメーションをもたらすことができ、それにより腫瘍サプレッサー機能のその損失を修正することができた。実施例７後発的細網肉腫を有するBalb/cマウスが、10⁶のJ774腫瘍細胞による腫瘍誘発の14日後にマイコバクテリウム・レプラエhsp65遺伝子によるin vitroでの遺伝子治療を受けた。100 μg のpZIPML65プラスミドおよび100 μg のリポソームの混合物を腫瘍に腹腔内および静脈内に４回注射して転移細胞を治療した。21日目に、マウスを殺し、解剖を行い、そして腫瘍サイズを測定した。図５中の結果は hsp65 遺伝子を含むプラスミドを受けたマウスにおける腫瘍の縮小を示す。６匹の治療マウスの群のうち１匹のみに腫瘍が見られ、一方、６匹の治療されていない対照の全てが21日目までに大きな腫瘍を発生した。更なる研究が必要とされ、組織学的証拠が腫瘍縮小につき得られたが、本発明者らのデータはhsp65 遺伝子がin vitroで腫瘍にうまく送出され、腫瘍縮小をもたらし得ることを示す。hsp65 遺伝子のin vitro注射は、移入されることとなった細胞の失われた腫瘍形成性をもたらすことができ、その一方、移入細胞により生じた細胞毒性Ｔ細胞応答が残りの移入されなかった細胞の撲滅を果たすことができた。この二重の効果がhsp65 を癌の遺伝子治療における魅力的な選択にする。Detailed Description of the Invention Treatment of heat shock proteins and tumors The present invention expresses heat shock proteins or chaperones. Regarding the current vector. Solid tumors are usually treated with a combination of surgery, chemotherapy and radiation therapy. Be done. In addition, other tumors such as leukemia are treated with chemotherapy and radiation therapy. Is done. However, these treatment methods are not ideal. Radiant Radiation therapy and chemotherapy produce unpleasant side effects and also can affect certain solid tumors such as brain tumors. The ulcer cannot be treated by surgery. For these reasons, treating tumors , New ways to prevent are constantly being sought. One currently being studied The method is for example the use of gene transfer of a gene encoding IL-2 or TNF. It Tumors can be induced by administering the tumor cell line to mice. In particular, Mice administered the clofage tumor cell line J774 show large, intraperitoneal, malignant High-lymphoid tumor. Surprisingly, such tumor cells Cterium leprae(Mycobacterium leprae)Transfer the gene encoding the 65kD hsp When administered to mice and subsequently administered to mice, there is a reduction or disappearance of tumorigenicity of the cells I knew it was. Furthermore, administering such transfected cells to a host such as a mouse, When subsequently challenged with tumor cells from the same cell line in which the host was not transferred, No tumor develops. Therefore, that technique is not There is a possibility for a different approach. The present invention relates to heat shock polypeptides (hsps) or chaperones An example comprising a nucleic acid comprising at least one sequence encoding a tide in an expressible form , Mammalian cells or expression vectors for use as therapeutic agents in the treatment of tumors. Provide the actor. As a polypeptide, for example, heat shock protein, heat shock protein Fragments, heat shock protein analogs, chaperones, chaperones And chaperone analogs. The fragment has at least the length 10, preferably at least 15, for example 20, 25, 30, 40, 50 or 60 amino acids It will be a residue. An analog is generally at least 5, preferably at least 10, eg Heat shock over a region of 20, 40, 60 or 100 or more contiguous amino acids. At least 70%, preferably at least 80%, based on protein or chaperone. Or 90%, and more preferably at least 95% homology. Amino acid sequence of analog Is a heat shocker if at least one residue is deleted, inserted or replaced. It may differ from the amino acid sequence of the protein or chaperone. Chaperones fold from proteins into their active conformations It is a protein that mediates only. Both chaperones and heat shock polypeptides One polypeptide is present. Heat shock polypeptides, such as hsp60, hsp65 and hsp70 are folding and translocase for other proteins He is also involved in Neon and is therefore also a chaperone. The fragments are non-glycosylated but retain their antitumor activity Polypeptide. The analogs are different amino Includes proteins that have been engineered with acid sequences but retain their antitumor activity. The nucleic acid of the expression vector of the present invention may be single-stranded or double-stranded, and RNA Or it may be DNA. Generally, the nucleic acid is a polypeptide as specified herein. The nucleic acid contains a unique sequence that encodes a peptide, but the nucleic acid has the sequence as specified herein. Containing 2, 3, 4 or more sequences that separately encode a polypeptide Good. The nucleic acid contained in the expression vector or cell line of the invention is specified herein. Encoding any suitable polypeptide, such as Don't code Petit. Preferably the polypeptide is chaparonin, or Polypeptide is a bacterial hsp, such as Mycobacterium leprae 65 Most preferably kD hsp or Mycobacterium leprae 70 kD hsp Yes. The expression vector of the present invention is generally a virus, a plasmid, a cosmid, or an episodium. Vector or naked nucleic acid. In general, naked nucleic acid will be labeled with regulatory sequences. It includes a sequence that encodes a polypeptide. Naked nucleic acid is generally at least 100, eg For example, it contains at least 200, 400, 600, 800, 1000, 2000 or 4000 base pairs. Mu. Naked nucleic acid can be single-stranded or double-stranded, and can be DNA or RNA. May be. Suitable plasmids include, for example, pZIPNeo, pLXSN and MFG. You can As a virus that is conveniently used as the expression vector of the present invention, A virus whose nucleic acid is RNA, eg Retroviruses, and DNA viruses, such as vaccinia virus or adde virus. No virus. Vector or virus is a polypeptid in infected cells Can be administered directly to the host to obtain expression of Which may then be administered to the host. Vector or virus to host The virus used is generally helper-free and replicates when administered directly It is defective. The expression vector preferably comprises a recombinant nucleic acid. The present invention also provides a method for producing an expression vector other than a naked nucleic acid. The method involves vectoring the gene encoding the polypeptide identified herein. Including cloning into The method of the present invention encodes a polypeptide. Genes are known by known methods (Silva, Palacios, Colston and Lowrie, Microbiol Clone directly into expression vector using P-athogenesis 12, 27-38 (1992)) Can be transformed. In addition, the present invention inserts heterologous DNA into the genome of a cell, or Provided is a method of producing cells which comprises transferring an expression vector into a cell line. The present invention According to the method, heterologous DNA can be obtained by known methods (Molecular Cloning: A Laboratory Manual). , T.Maniat-is et al., Cold Spring Harbour, 1989) can be used to insert into the genome. . The transfected cell line will be prepared using standard techniques to identify the gene encoding the polypeptide. Vector such as a retrovirus shuttle vector such as pZIPNeoSV (x ) And clone the vector using known methods (Silva et al.). It is prepared by transferring into the cell line. Cell lines into which the expression vectors of the invention can be incorporated are generally mammalian and may contain tumor cells. Cell lines, MHC I and II negative cell lines, and mouse and human cell lines. So In particular, they are to be administered to treat established tumors. It is possible to use cell lines of different origin, for example tumor cell lines. Populated Most preferably the tumor cell line is the tumor cell line for which protection is sought. Good. The expression vector or cell of the present invention comprises a tumor-associated antigen or an interleukin. It may further include a coding sequence. The expression vector or cell of the present invention is Expression vector having a sequence encoding a tumor-associated antigen or interleukin May be included. Some studies have reported on genes based on cytokine-encoding genes. We have shown that transfection of Us tumor cells results in immune rejection of parental tumors . The cytokine genes used in this type of experiment include IL-4, IL-2, γIFN, T NFα, IL-6, IL-7 and GM-CSF. One or more of these genes is a book Synergizes with the gene encoding the polypeptide of the invention, thus obtaining tumor eradication You can maximize the opportunity. Tumors produced by different and unrelated tumor cell lines have common tumor-associated antigens. , In which case one cell line expressing such a common antigen Immunization of the invention may also confer protection against other tumors with common antigens (However, it is unlikely to provide great protection against tumors that do not have a common antigen). So Therefore, the present invention also provides the polypeptides and tumor-associated antigens identified herein. Provide an emerging cell line. Such cell lines are The expression vector of the invention has been transferred with another vector encoding a ulcer-associated antigen. Or they may also contain an expressible form of the tumor-associated antigen-encoding sequence. The expression vector of the present invention, which includes, may be transferred. According to the present invention, the expression vector or cell line is used in the tumor of a healthy host (patient). It can be used for prophylaxis and treatment of tumors present in the host (patient). Expression vector is patient Can be administered directly to. If the expression vector is a virus, cell transfection Can be performed in vivo by administering the virus directly to the host. Also, in In vitro immunization involves the transfer of suitable lymphocytes taken from the host (patient) of the present invention. This can be done by sensitizing the cell line and returning the lymphocytes to the host (patient). The present invention also provides (a) the administration of an effective non-toxic amount of an expression vector or cell line into a host. A method of treating a tumor, including: (b) expression of a vector for use in treating the tumor. Expression vectors for the production of drugs for the treatment of tumors or cell lines and (c) tumors Or the use of cell lines. Furthermore, the present invention has been specified herein for the manufacture of a medicament for the treatment of tumors. Use of the nucleic acid is provided. The present invention provides a purified form of the expression vector or cells identified herein. To serve. In addition, the present invention is directed to the expression vectors identified herein when isolated. Or provide cells. Furthermore, the present invention relates to heat shock polypeptides (hsp) or At least one sequence encoding a polypeptide that is a chaperone in an expressible form. An expression vector identified herein consisting essentially of a nucleic acid containing a sequence provide. The expression vector or cell of the invention may be delivered to any route suitable for the condition to be treated. More suitable for administration to mammals including humans, suitable routes include oral route, rectal route and nasal route. Internal, topical (including buccal and sublingual), vaginal and parenteral (subcutaneous) , Intramuscular, intravenous, intradermal, intrathecal and epidural). Preferred Sutra The route may vary depending on, for example, the condition of the recipient and the type of treatment sought It will be understood. Thus, the existing tumor may be treated systemically, Or a route chosen to deliver the vector or cells directly to the site of the lesion Can be treated by. Preventive measures likely affected by target tumor It will aim to stimulate preventive immunity in the tissue. The expression vector of the invention may be used alone or in liposomes or other delivery moieties. It may be administered to a patient in combination with a child. The effective dose depends on which delivery molecule is used. Generally, preferably 1 g of tumor, preferably locally injected into the tumor, depending on Or 100-500 mg of vector or intravenous injection for treatment or prevention of metastasis It is 10 to 100 mg / kg of body weight every week. The active ingredients in the formulations below are the vectors or cells of the invention identified above or Are cells immunized in vitro. For each of the above utilities and indications, the required amount of the individual active ingredients is Depends on several factors, including the severity of the symptoms and the identity of the recipient Well, and ultimately it will be at the discretion of the attending physician. However, in general , For each of these utilities and instructions, treatment is performed with the transferred tumor cells Place Therefore, a suitable effective dose is 10 per kg of recipient body weight weekly.^Four~Ten^TenCells of Range, preferably 10 per kg body weight weekly^Five~Ten⁸Range of cells, most preferably 10 per kg of body weight every week^Five~Ten⁷Range of cells. The dose can be Administered at appropriate intervals over the week 2, 3, 4, or more times It may be given as a number of sub-doses. Vectors whose treatment involves the hsp65 gene Effective dose is 10 per kg body weight weekly^Four~Ten¹²No helper Range of replication-defective viruses, preferably 10 per kg body weight weekly^Five~Ten¹¹No ui Ruth range, most preferably 10 per kg body weight weekly⁶~Ten^TenIn the range of viruses Ah The dosages described herein are applicable to each of the above dosages It The compounds can be administered alone, but they are given as a pharmaceutical formulation Is preferred. The formulations of the present invention may comprise one or more acceptable carriers and optionally It contains at least one active ingredient as specified above, together with other therapeutic ingredients. One or more carriers are compatible with the other ingredients of the formulation and Must be “acceptable” in the sense of not being harmful, eg liposomes . Suitable liposomes include, for example, the positively charged lipid N [1- (2,3-di Oleyloxy) propyl] -N, N, N-triethylammonium (DOTMA) Containing dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) , And 3β [N- (N ′, N′-dimethylaminoethane) -carbamoyl] co Examples include those containing lesterol (DC-Chol). Oral, rectal, intranasal, topical (buccal) And sublingual), vaginal or parenteral (subcutaneous, intramuscular, intravenous, intradermal) , Including intrathecal and epidural). Formulation in unit dosage form It may be conveniently given and prepared by any of the methods well known in the art of pharmacy. May be done. Such a method comprises a carrier that constitutes one or more accessory ingredients. And a step of mixing the active ingredient. In general, the formulations will include the active ingredient in a liquid carrier. Evenly and intimately mixed with finely divided solid carriers or both, and then Prepared by molding the product. Formulations of the present invention suitable for oral administration each contain a predetermined amount of active ingredient. As discontinuous units such as capsules, cachets or tablets containing; with powders or granules As a solution or suspension in an aqueous or non-aqueous liquid; or an oil-in-water liquid solution It may be provided as a marshon or a water-in-oil liquid emulsion. Also, live The sex ingredient may be given as a bolus, electuary or paste. Tablets may be compressed or molded, optionally with one or more accessory ingredients. May be made more. Compressed tablets may be placed in a suitable machine on a binder (eg For example, povidone, gelatin, hydroxypropyl methylcellulose), lubricant, inactive Diluents, preservatives, disintegrants (eg sodium starch glycolate, cross-linked povid , Cross-linked sodium carboxymethyl cellulose), surfactant or dispersant By compressing the active ingredients in a free-flowing form such as mixed powders or granules It can be prepared. Molded tablets are powdered in a suitable machine moistened with an inert liquid diluent. It can be produced by molding a mixture of products. Tablets may be coated or minced as needed Even if Well, for example, using hydroxypropylmethylcellulose in various proportions To provide a slow or controlled release of the active ingredient therein to provide the desired release profile. It may be formulated to give a feel. The formulation is, for example, 0.075 to 20% w / w, preferably 0.2 to 15% w / w, most preferably May be applied as a topical ointment or cream containing the active ingredient in an amount of 0.5-10% w / w It When formulated in an ointment, the active ingredient is a paraffinic or water-miscible ointment. Can be used with a base. In addition, the active ingredient is an oil-in-water cream base in the cream. Can be formulated in. Formulations suitable for topical administration to the eye also include eye drops wherein the active ingredient is It is dissolved or suspended in a suitable carrier, in particular an aqueous solvent for the active ingredient. The active ingredient is Such a formulation at a concentration of 0.5 to 20%, preferably 0.5 to 10%, especially about 1.5% w / w. It is preferably present in. Suitable formulations for topical administration in the mouth include a flavored base, usually sucrose and And lozenges with active ingredients in acacia or tragacanth; inert bases, eg For example, gelatin and glycerin, or sucrose and acacia contain the active ingredient. Troches; as well as gargles containing the active ingredient in a suitable liquid carrier. Formulations for rectal administration are suitable, for example, containing cocoa butter or a salicylate salt. It may be given as a suppository, including the base. Formulations suitable for intranasal administration, where the carrier is a solid, are for example 20-500 microns Coarse powders having a particle size in the range of Through the nose from the container held in It is administered in such a way that it is taken by rapid powder inhalation. Formulations suitable for administration, eg, as a nasal spray or nasal drops, in which the carrier is a liquid Are) and include aqueous or oily solutions of the active ingredient. Formulations suitable for vaginal administration are known to be suitable in the art in addition to the active ingredient. Pessaries, tampons, creams, gels, pastes, powders containing carriers such as It may be administered as a foam or spray formulation. Suitable formulations for parenteral administration include antioxidants, buffers, bacteriostats and formulations Aqueous, which may include solutes that render it isotonic in the blood of the recipient being illustrated and Non-aqueous sterile injectable solutions; and suspensions and thickeners, and liposomes or their Other microparticulate systems, which target the compound to blood components or one or more organs Aqueous and non-aqueous sterile suspensions, which may include Can be The formulations may be in unit-dose or multi-dose containers, eg sealed ampoules. And vials and may be given in a sterile liquid carrier, for example, immediately before use. It can be stored in lyophilized form requiring only the addition of water for injection. Injection solution and Extemporaneous suspensions may be prepared immediately from sterile powders, granules and tablets of the kind previously described. Preferred unit dosage formulations are the daily doses of active ingredient, as herein above recited. Or a unit containing a daily sub-dose or an appropriate fraction thereof. In addition to the ingredients particularly mentioned above, the formulations of the present invention are well known in the art with respect to the type of formulation in which they are made. It is possible that it may contain other usual drugs. It should be understood that, for example, a formulation suitable for oral administration may include a flavoring agent. Good. Examples of tumors that can be treated with the expression vectors or cells of the invention are eg osteogenic Sarcomas, including sarcomas and soft tissue sarcomas, cancer types such as breast cancer, lung cancer, bladder cancer, thyroid Adenocarcinoma, prostate cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, liver cancer, uterine cancer, and ovary Cancer, lymphoma including Hodgkin lymphoma and non-Hodgkin lymphoma, neuroblastoma , Melanoma, myeloma, Wilms tumor, and acute lymphoblastic leukemia and Leukemia, including acute myeloblastic leukemia, glioma and retinoblastoma. In the attached drawings, FIG. 1 (a) shows control cells and transferred cells prepared according to the present invention. Code for mycobacterium leprae 65kD heat shock protein (hsp) in The expression of the gene is shown. Figure 1 (b) shows the transfer of parental cells and vector alone for 21 days. Transfected parental cells and Mycobacterium leprae 65kD hsp gene Shows growth of parental cells. FIG. 2 shows in vitro cytotoxicity of splenocytes of mice immunized according to the present invention. Is shown. Target cells are J774-hsp 65 (□), J774 (△), Pu518 (◇) and Wehi It was 164 (○). FIG. 3 shows the number of proliferating cells with respect to the DNA content. Transfer J774 cells, vector alone J774 cells transfected with the hsp-65 gene by calcium phosphate precipitation. Cells transfected with hsp-65 gene by vesicle and liposome-mediated gene transfer Results are shown. Figure 4 shows the expression of p53 epitope in J774-hsp 65 cells. % Is shown. Fig. 5 shows mice (○) receiving the plasmid containing the hsp 65 gene and the hsp 65 gene. Tumor size in mice that do not receive pups (□) is shown. The invention is illustrated by the examples below. Example 1 Transferring a gene encoding heat shock polypeptide (hsp) into a tumor cell line Efficacy of the Mycobacterium leprae on mouse macrophage tumor cell line J774 It was examined by transfecting the gene encoding the 65 kD hsp. Gene transfection by Silva, Palacios, Colston & Lowrie, Microb It was performed as described in iol Pathogenesis 12, 27-38 (1992). M. Lepra D. The 65kD hsp gene was cloned into the retrovirus shuttle vector pZIPNeoSV (x). And then package this into the virus packaging cell line psi-CR by calcium phosphate precipitation. Moved to E. Supernatants from neomycin resistant clones were polybrene and selected Incubated with J774-G8 cells in the presence of neomycin resistant cells. 65 Expression of the kD hsp gene was confirmed by the monoclonal antibody C1118 (this is the M. leprae 65 kD Recognize protein) and fluorescein isothiocyanate labeled rabbit anti-mau Space F (ab ')₂The cells were analyzed by FACS analysis after indirect labeling using. Figure 1 (a) Shows expression of hsp65 in control and transfected cells analyzed by indirect immunofluorescence You The dashed line shows the reactivity with the secondary antibody alone. The tumorigenicity of the parental (J774) cell line and the transferred cell line was determined by Tested in athymic mice. Tumor cells are parent J774-G8 (J774) cells, vector alone The parental cell line (J774-vector), which was transfected with Or a parental cell line (J774-hsp65) that has been transfected with the microbacterium hsp65 gene. It was. Successful stable transfection was performed as described by Silva et al. Further confirmation by Northern and Western blotting. 10 in 5 mice per group⁶Cells were injected intraperitoneally. Figure 1 (b) is normal Shows proliferation of cell lines in Balb / c and athymic Balb / c mice. Tumor rhino The tumors were weighed for primary tumors and abdominal organs of the test mice, and 5 year old mice were examined. It was calculated by subtracting the weight of the normal control abdominal organs that were cut. From the results shown in Figure 1, tumor development in mice injected with J774-hsp65 cells. The rate depends on the incidence of tumors in mice injected with J774 cells or J774- vector cells. It is clear that it is extremely low. 21 days after injection, J774 cells or J774 vector -All mice injected with cells have tumors weighing at least 8 g, while J Mice injected with 774-hsp65 cells did not develop tumors or <3 g Having a tumor of weight. Example 2 Shown in Table 1 for normal Balb / c mice, athymic Balb / c mice and CBA mice. Tumor cells were injected intraperitoneally. Cell-first PB without endotoxin Suspended in 0.5 ml S. Tumor cells were prepared in the same manner as in Example 1, and the parental cell line (J7 74), a parental cell line transfected with the mycobacterial hsp65 gene (J774-hsp65), Was the parental cell line transfected with vector alone (J774-Vector). Tumor incidence Were measured 21 days after tumor cell injection by necropsy and histology. Decided Table 1 shows the results. Example 3 J774-hsp65 cells were prepared according to the method described in Example 1. Normal Balb / c Mouse and athymic Balb / c mice at weekly intervals Given by 10⁶J774-hsp65 cells were immunized with 4 intraperitoneal injections. On day 28, 10 different origins for mice⁶Of the reticulosarcoma cells were intraperitoneally challenged. Tumor incidence And tumor size was recorded 21 days after challenge. Tumor size same as in Example 1 It was measured by the method. The results are shown in Table 2. The results shown in Table 2 show that normal Balb / c mice were injected with J774-hsp cells. Show that it produces good immunity against J774 cells and J774- vector cells. You These results also indicate that normal Balb / c immunized mice showed a slight increase in the Pu518 cell line. It has the resistance of. Not all mice develop tumors Tumors formed in newly developed mice were significantly higher than those in non-immunized mice. It was of small size. Resistance of mice immunized against the Wehi 164 cell line Was insufficient. Tumor developed in the majority of nonimmunized mice Developed a tumor that was similar in size to. Immunization with J774-hsp65 cells has no effect on Balb / c athymic mice It was Example 4 J774-hsp65 cells were prepared according to the method described in Example 1. In vitro cytotoxic activity of splenocytes from mice immunized with J774-hsp65 cells Normal Balb / c mice and Balb / c athymic mice at 10 weekly intervals.⁶ J774-hsp65 cells were examined by immunization with 4 intraperitoneal injections. On day 28, Spleens were harvested and single cell suspensions were prepared in RPMI 1640 + 10% fetal calf serum. Cells were incubated with J774-hsp65 cells irradiated with 30 Gy for 6 days. B thin Cells were removed by panning with rabbit anti-mouse IgG coated plates. CD 4 and CD8 T cell subsets were analyzed by Lukacs and Kurlander, J. et al. Immunol. 143, Purified using the method described in 3731-3736 (1989). NK cells and CD4 cells Cell CD10 cells with 10 μg / ml PK136 (anti-NK1.1) and anti-L3T4 or 30 min at 4 ° C 10 with anti-Lyt 2 monoclonal antibody⁷Extracted by processing cells / ml CD4 by incubating with 1/10 dilution of rabbit complement for 60 minutes at 37 ° C. Populations and CD8 populations were obtained, which were> 90% pure as determined by FACS analysis. there were. Cytotoxic activity was demonstrated by varying the number of CD4 or CD8 effector cells in triplicate. In the hell⁵¹96-well microphone with V-shaped bottom with 2000 / well Cr-labeled target cells By incubating for 6 hours at 37 ° C in a rotiter plate Was measured.⁵¹Cr release was measured in wells containing effector T cells and target cells (cp m_experimental), Wells containing target cells incubated in medium alone ( cpm_spontan-eous) And target cells + 0.1% Triton X wells (cpm_m _aximal ). Cytotoxicity was calculated using the following formula. The results are shown in FIG. 2 as the average standard deviation. Target cells are J774-hsp65 (□), J7 It was 74 (△), Pu518 (◇) and Wehi 164 (○). The results in Figure 2 show that in vitro cytotoxicity of splenocytes from immunized mice was Large for J774-hsp65 as well as for Pu774 cells (cells Toxicity was significant, but small) and to Wehi 164 cells (no cytotoxicity). It is much larger than Example 5 The effect of hsp transfection on the cell cycle of tumor cells It was examined by staining with a specific benzimide dye, Hoechst 33342. two Different methods, Ca phosphate precipitation (J774-HSP-Ca) and liposome-mediated gene transfer J774 tumor transferred with Mycobacterium leprae hsp-65 by (J774-HSP-L) Tumor cells, as well as untransfected control J774 cells and vector-transfected control J7 74 cells (2 x 10⁶/ ml) with 10 μg / ml Hoechst dye for 30 minutes at 37 ° C. Colored. Obtain DNA histograms and cell cycle using FACS analyzer The percentage of cells at each time point was measured. The results in FIG. 3 show that the number of proliferating cells with high DNA content (S phase and G2 phase) was hsp-. 65 genes (J774-HSP-Ca and J774-HSP-L) decreased in transfected tumor cells Indicates that. At the same time, hsp-65 expressing cells with low DNA content compared to control tumor cells. The number of cells (GO / G1 phase) increased. These experiments show that tumors caused by the hsp-65 gene Showing that transfection of ulcer cells results in changes in cell cycle regulation. To change uncontrolled growth, which is one of the basic properties of tumor cells. Suggest. Example 6 Mutations in the p53 gene that result in dysfunctional p53 tumor suppressor proteins , Is the most frequently observed genetic lesion in malignant tumors. Mycobacteria Mu Leprae was populated with hsp65 Tumor cells and control tumor cells were tested for expression of p53 tumor suppressor protein. Examined. J774-HSP cells were prepared according to the method described in Example 1. p53 tan The expression of proteins was analyzed by FACS analysis. Permeation through the cell membrane with 0.05% saponin And then the cells were monoclonal antibody specific for p53 (provided by D. Lane). Ab-248 and Ab-421) and FITC-labeled rabbit anti-mouse F (ab ')₂Secondary Incubated on the body. Figure 4 shows increased expression of both p53 epitopes in J774-hsp65 cells. p5 Since 3 is a DNA-binding protein essential for normal cell cycle regulation, our Experiments show that hsp65 is involved in the cell cycle through the p53 tumor suppressor protein. It suggests that it can give an effect. Increased chaperone activity in hsp65 transfected cells , Inappropriate mutant p53 protein proper folding and conformation Can result in a loss of tumor suppressor function. We were able to. Example 7 Balb / c mice with late reticulosarcoma⁶Induction by J774 tumor cells In vitro with Mycobacterium leprae hsp65 gene 14 days after birth I received child treatment. 100 μg of pZIPML65 plasmid and 100 μg of liposomes The mixture was injected into the tumor four times intraperitoneally and intravenously to treat metastatic cells. 21st day Mice were sacrificed, necropsied, and tumor size determined. The results in Figure 5 are 8 shows tumor shrinkage in mice receiving a plasmid containing the hsp65 gene. 6 animals Only one in a group of treated mice Tumors were seen, while all 6 untreated controls were large by day 21 A tumor developed. Further research is needed and histological evidence is available for tumor shrinkage. However, our data indicate that the hsp65 gene was successfully delivered to tumors in vitro. , Can lead to tumor shrinkage. In vitro injection of hsp65 gene was transferred Can result in the lost tumorigenicity of the cells that are destined for Eradication of the remaining untransfected cells by the cytotoxic T cell response generated by the transferred cells. Was able to fulfill. This dual effect makes hsp65 attractive for cancer gene therapy Make the right choice.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 39/00 Ｈ 9284−4ＣＡ 9284−4Ｃ 48/00 8314−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 Ｂ 8615−4ＣＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 9282−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 35/12 7431−4Ｃ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:32） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＣ１２Ｒ 1:32） (72)発明者ローリー，ダグラスイギリス国エヌダブリュー７１エイエイロンドンミルヒル，ザリッジウェイ，ナショナルインスティテュートフォーメディカルリサーチ（番地なし) (72)発明者ルカクス，カタリンヴェロニカイギリス国エヌダブリュー７１エイエイロンドンミルヒル，ザリッジウェイ，ナショナルインスティテュートフォーメディカルリサーチ（番地なし)─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI A61K 39/00 H 9284-4C A 9284-4C 48/00 8314-4C C07H 21/04 B 8615-4C C12N 5 / 10 C12P 21/00 C 9282-4B // A61K 35/12 7431-4C (C12N 15/09 C12R 1:32) (C12N 15/00 A C12R 1:32) (72) Inventor Raleigh, Douglas England ND71 1A London Mill Hill, The Ridgeway, National Institute for Medical Research (No Address) (72) Inventor Lukax, Catalin Veronica NW 711A London Mill Hill, The Ridgeway ， National Institute for Medical research (no address)

Claims

Claims: 1. An expression vector for use in the treatment of tumors, comprising a nucleic acid comprising at least one sequence encoding a polypeptide which is a heat shock polypeptide (hsp) or chaperone in an expressible form. A vector containing. 2. The expression vector according to claim 1, wherein the polypeptide is chaparalonin. 3. The expression vector according to claim 1, wherein the polypeptide is bacterial hsp. 4. The expression vector according to claim 3, wherein the hsp is Mycobacterium leprae 65 kD hsp or Mycobacterium leprae 70 kD hsp. 5. A heat shock polypeptide other than an expression vector containing a nucleic acid containing a sequence encoding a 65 kDa antigen of Mycobacterium leprae 65 kD hsp, Mycobacterium leprae 70 kD hsp or Mycobacterium tuberculosi s. An expression vector comprising a sequence coding in an expressible form. 6. The expression vector according to any one of claims 1 to 5, which is a virus. 7. The expression vector according to claim 6, wherein the nucleic acid is RNA. 8. The expression vector according to claim 7, which is a retrovirus in a disabled state. 9. The expression vector according to claim 7, which is a retrovirus shuttle vector. 10. The expression vector according to claim 9, which is pZIPNeoSV (x). 11. The expression vector according to claim 6, which is a vaccinia virus. 12. The expression vector according to claim 6, which is an adenovirus. 13. The expression vector according to any one of claims 1 to 5, which is a plasmid. 14. The expression vector according to any one of claims 1 to 5, which is an episomal vector. 15. The expression vector according to any one of claims 1 to 14, further comprising a sequence encoding a tumor-associated antigen. 16. The expression vector according to any one of claims 1 to 15, further comprising a sequence encoding an interleukin. 17. A cell containing the expression vector according to any one of claims 1 to 16. 18. A tumor cell line in which the cells comprise the expression vector according to any one of claims 1-16. 19. A human cell or cell line according to claim 17 or 18. 20. A cell or virus having in its genome a heterologous nucleic acid encoding the polypeptide according to claim 1 in an expressible form. 21. The cell or cell line according to any one of claims 17 to 20, further comprising an expression vector having a sequence encoding a tumor associated antigen. 22. The expression vector according to any one of claims 6 to 12, which further comprises an expression vector having a sequence encoding a tumor-associated antigen or an interleukin. 23. A pharmaceutical composition comprising an expression vector, cell, cell line or virus according to any one of claims 1 to 22 and a pharmaceutically acceptable carrier. 24. The pharmaceutical composition according to claim 23, wherein the carrier is a liposome. 25. The pharmaceutical composition according to claim 23 or 24, which further comprises an expression vector having a sequence encoding a tumor-associated antigen or interleukin. 26. A pharmaceutical composition comprising a non-toxic effective amount of the expression vector, cell line, cell or virus according to any one of claims 1-22. 27. The method for producing an expression vector according to any one of claims 1 to 16, which comprises cloning a gene encoding a polypeptide into the vector. 28. The method for producing a cell or cell line according to any one of claims 17 to 21, which comprises cloning a gene encoding a polypeptide into a vector and transferring the vector into the cell or cell line. 29. Use of an expression vector, cell line, cell or virus according to any one of claims 1 to 22 for the manufacture of a medicament for the treatment of tumors. 30. Use of the nucleic acid according to any one of claims 1 to 4 for the manufacture of a medicament for the treatment of tumors. 31. Use according to claim 29 or 30, wherein the treatment is treatment of an existing tumor. 32. Use according to claim 29 or 30, wherein the treatment is prophylaxis. 33. Administering to the host a non-toxic effective amount of the expression vector, cell line, cell or virus of any one of claims 1 to 22 or the nucleic acid of any one of claims 1 to 4. A method for treating a tumor including the following. 34. The method of treatment according to claim 33, wherein the host is healthy and the treatment is prophylactic. 35. The therapeutic method according to claim 33, wherein the host has a tumor and the treatment is therapeutic. 36. An expression vector for use as a therapeutic comprising a nucleic acid comprising at least one sequence encoding a polypeptide that is a heat shock polypeptide (hsp) or chaperone in an expressible form.