JPH08502646A

JPH08502646A - Immortalized cells and their use

Info

Publication number: JPH08502646A
Application number: JP6508223A
Authority: JP
Inventors: ミラー，ティモシー・ジェイ; ウィケル，スティーブン・ケイ; ラマチャンドラ，ランガッパ・エヌ
Original assignee: ファイザー・インコーポレイテッド; オクラホマ・ステイト・ユニバーシティ
Priority date: 1992-09-14
Filing date: 1993-09-14
Publication date: 1996-03-26
Also published as: EP0749319A1; EP0749319A4; AU4831497A; CA2144651A1; WO1994006463A1; AU5103293A

Abstract

(57)【要約】本発明は、不死化ダニ細胞系、不死化ウシＴ細胞系、ならびに、診断試薬およびワクチン組成物を含むその使用を提供するものである。 (57) [Summary] The present invention provides immortalized mite cell lines, immortalized bovine T cell lines, and uses thereof including diagnostic reagents and vaccine compositions.

Description

【発明の詳細な説明】不死化細胞およびその使用発明の分野本発明は、不死化一次細胞（immortalized primary cell）、さらに詳しくは、抗原および生物活性化合物の製造に有用な不死化細胞系に関する。発明の背景無限に増殖しうる能力によって特徴付けられる無限増殖性（continuous）または不死化細胞系は、免疫原の供給源として、新規生物活性化合物の供給源として、および、関連病原の産生および複製のために有用である。無限に増殖する培養を樹立しうる能力は、細胞が由来する動物種に依存して変わる。例えば、齧歯類の細胞は、通常、無限増殖性細胞系を生じるが、ニワトリの細胞は、ほとんど永久増殖しない。腫瘍細胞を除くヒトの細胞は、不死化細胞系の良好な供給源ではない。ダニ細胞培養は、ダニ媒介性病原および微生物の調査および研究について興味深いものである。現在入手可能なin vitro一次または連続ダニ細胞培養は、ダニ媒介性病原の長期間の不変な維持ができない。所定の病原に対するワクチンの開発における使用および調査目的のために、病原微生物の増殖を維持することができる細胞の永久増殖性in vitro細胞培養が当該技術分野において必要である。発明の概要本発明は、一次細胞の永久増殖性培養（immortalized culture）を提供するものである。これらの細胞系は、例えば、ワクチン組成物における抗原として、抗原の増殖および生産用容器として、診断試薬として、ならびに治療組成物において有用である。本発明の他の特徴および利点は、さらに、以下の好ましい具体例の詳細な説明において説明する。発明の詳細な説明本発明は、不死化ダニ細胞系および不死化ウシＴ細胞系を提供するものである。本発明のかかる不死化細胞系は、例えば、ダニに対するワクチン剤として、または、その製造において有用であり、病原、例えば、ダニ媒介性病原によって誘発される疾患に対する防御を提供する。本明細書中で使用する場合、「不死化細胞系」なる語は、以下に説明するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された細胞を意味する。本発明の不死化細胞は、適切な培養培地において無限増殖的に維持され得る後代（progeny）細胞系の均質な個体群を生産するために慣用技術によってクローン拡大してもよい。デルマセンター・アンダーソニ（Ｄermacentor andersoni）およびアンブリオンマ・アメリカーヌム（Ａmblyomma americanum）ダニの腸の永久増殖性培養が提供される。１つの例は、ＤＧＥＣ−１と称されるダニ細胞系である。この細胞系は、実施例１において詳述され、特徴付けられる。この系は、２６カ月間安定なままであり、１９９２年７月８日付でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された［ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１１０８４］。さらに詳細に以下に説明する本発明のＡＧＥＣ−１不死化ダニ細胞系も１９９２年７月８日付でＡＴＣＣに寄託された［ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１１０８３］。さらに、本発明は、Ｂｐｂｌ−Ｔ１（ウシ末梢血管リンパ球−Ｔ細胞）と称される不死化ウシＴ細胞系を提供するものである。この不死化ウシＴ細胞系は、とりわけ、Ｔ細胞依存性抗原標的アッセイ、Ｔ細胞レポーターおよび抗原認識研究、養子免疫細胞移入実験、ならびに、サイトカイン、抗原および／または他の生体応答修飾因子（bioresponse modifier）のin vitroスクリーニングに有用である。この系は、８カ月間安定なままであり、１９９２年９月１１日付でＡＴＣＣに寄託された［ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１１１２０］。本発明は、さらに、これらの細胞系の後代および誘導体、例えば、継代接種またはクローン拡大によって特別な所定の細胞系から誘導された細胞を含む。本発明の不死化細胞系に関して本明細書でなされた全ての記載は、それらの後代および誘導体に同様に適用できる。本発明の不死化ダニ細胞培養は、とりわけ、ライム病の原因微生物であるボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂorrelia burgdorferi）などのダニ媒介性病原のi n vitroでの増殖、およびこれらの病原に対する抗原の生産に有用である。これらの細胞系は、アナプラスマ・マルギナール（Ａ．marginale）、エールリキア（Ｅhrlichia）種、およびボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂorrelia burgdorf eri ）のin vitro培養を維持する際に有用であることも判明した。本発明の不死化Ｔ細胞は、所定の病原の増殖、およびこれらの病原に対する抗原の生産にも有用である。さらに、本発明の不死化Ｔ細胞は、Ｔ細胞感染能を有する病原、例えば、レンチウイルスの研究、およびＴ細胞シグナルトランスダクションの研究に有用である。本発明の不死化細胞は、抗原、例えば、好ましくは、寄生体媒介性病原に向けられる免疫応答を誘発する能力を有するタンパクまたは非タンパク様物質などの細胞成分の大量生産用システムを提供するものである。１つの具体例によると、本発明の不死化細胞は、それ自体、生物薬または治療薬、例えば、ダニ細胞ポリペプチドもしくはタンパク、または所定の病原抗原を含有するワクチン組成物の該ワクチンにおける防御免疫応答刺激能を増強するダニ細胞の他の成分もしくは画分を産生する。例えば、不死化ダニ細胞系ＡＧＥＣ−１またはＤＧＥＣ−１は、培養されると、自然に、医薬および獣医学的目的のために、抗凝集剤、抗炎症剤および利尿剤として有用なペプチド、ポリペプチド、タンパクまたは他の細胞画分を産生する。これらの典型的な薬剤および他の薬剤は、培養後に、本発明の不死化細胞によって自然に産生される生物産生物の範囲内である。かかる天然産生物の最大生産を得るのに適切な培養条件は、当業者によって決定され得る。これらの生物物質は、細胞内で産生され、化学的同一性または生物活性に基づいて、慣用の細胞粉砕、例えば、溶解、および物質またはそれを含有する細胞画分の溶解物からの精製によって培養したダニ細胞から得られる。別法としては、本発明の不死化細胞は、該薬物を培地中に分泌する。かかる生物物質または細胞画分の単離および精製方法は、当該技術分野で知られており、所望により利用される。別の具体例によると、本発明は、本発明の不死化細胞培養物を所定の病原微生物、例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂorrelia burgdorferi）、エールリキア・カニス（Ｅhrlichia canis）、アナプラスマ・マルギナリス（Ａnaplas ma marginalis）、バベシア・ボビス（Ｂabesia bovis）、タイレリア・パルバ（Ｔheileria parva）に感染させることによる、所定の病原に向けられた抗原の産生方法を提供するものである。感染した不死化細胞は、培養後、病原の天然複製および培養における病原タンパクの産生を可能にする。ウイルスまたは微生物のいずれかである病原自体、あるいは、サブユニット、ポリペプチド、細胞画分、その断片、または炭水化物、脂質およびリポタンパクなどの他の高分子を含む所望のタンパク様物質のいずれかは、慣用の生物学的および遺伝子工学的技術によって永久増殖性細胞培養中で生産され、該培養から単離される。不死化細胞または病原自体を含むかかるタンパク様および非タンパク様物質は、本明細書中で抗原と定義する。別法としては、病原は、病原に感染した細胞培養から共回収される。病原感染不死化細胞系によって産生されるタンパク様および非タンパク様物質は、不死化細胞生合成活性により生産された物質を含む。該細胞培養から単離された病原産生物質は、ワクチン組成物における使用を有すると思われる。例えば、かかる病原産生物質とダニ細胞誘導物質との結合は、ダニ細胞培養における病原の増加および増殖後にダニ細胞環境の影響によってワクチン接種を受けた人において増強された免疫性刺激能を有するワクチン組成物を提供する。同様の方法で、不死化ウシ細胞系およびその中で産生された産生物は、ウシ病原またはその抗原物質を含有するワクチン組成物を増強するために使用される。これらの細胞および物質は、さらに、ウシ抗原の同定の促進、および、ウシサイトカイン生産および活性についてのアッセイにも有用である。本発明の不死化細胞系を使用して所望の抗原またはポリペプチドを生産する別の具体例は、不死化細胞系中で複製および発現指向能を有する好適な調節配列の制御下、所望の抗原特性を有する異種ポリペプチドまたはタンパクを含有する組換え分子で該細胞系をトラスフェクトすることを含む。組換え分子を含有するトランスフェクトした不死化細胞系を培養して、細胞系における異種タンパクまたはポリペプチドの発現を可能にする。組換え分子の設計、異種タンパクおよび調節配列の選択、ならびに細胞系中へのその取込みに用いられる方法は、当該技術分野の範囲内である［例えば、マニアティス（Ｍaniatis）ら、モレキュラー・クローニング（ア・ラボラトリー・マニュアル）（Ｍolecular Ｃloning（ＡＬa boratory Ｍanual））、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバーのコールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress）（１９８９）、を参照］。不死化ダニ細胞をトランスフェクトするのに好適なベクターまたはプラスミドの例としては、昆虫ウイルス、昆虫組換えプラスミド、昆虫ポックスウイルス、およびアルボウイルスを含む操作的プロモーターを有するものが挙げられる。現在、昆虫プロモーター、例えば、バキュロウイルスのポリヘドロン（polyhedron ）、昆虫ポックスウイルスのスフェロイジン、ショウジョウバエプロモーターまたはアルボウイルス（セムリキ・フォレスト・ウイルス（Ｓemliki Ｆorest Ｖi rus））は、不死化ダニ細胞において最良の結果を生じる。同様に、哺乳動物細胞についてのべクター成分および公知のべクターは、ウシ細胞系Ｂｐｂｌ−Ｔ１をトランスフェクトする際の使用のために当該技術分野の当業者によって容易に選択される。例えば、マニアティスらの前記文献を参照のこと。本発明の不死化ダニ細胞系からの所望の抗原の産生を以下に例示する（実施例３）。同様の方法を使用して、本発明の不死化ウシ細胞系において抗原を生産してもよい。培地および病原感染不死化細胞からの細胞は、一般に、感染から２４〜１０８時間後に回収され、免疫化のための抗原の供給源として使用される。所望により、遠心により細胞結合物質から抗原含有培地を清浄化し、アリコットに分け、使用するまで−２０℃で貯蔵する。別法としては、病原抗原物質は、不死化細胞からの細胞物質と結合したままであり、ワクチン中に混合される。所定の病原抗原と結合した不死化ダニ細胞産生物質は、病原抗原の免疫刺激性効果を増強する。全ての抗原調製物は、ＥＬＩＳＡにより寄生体特異的タンパク（ＰＳＰ）について定量化することができる。細胞結合抗原は、無血清培地中、氷上で音波処理し、次いで、前記遠心工程を行うことによって調製される。タンパク濃度は、ブラッドフォード（Ｂradford）、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａnal ．Ｂiochem．）、７２：２４８（１９７６）の方法によって測定される。音波処理した寄生体懸濁液を、無血清培地中で最終濃度１０〜１００μg／mlに調整し、アリコットに分け、使用するまで−２０℃で貯蔵する。病原は、本発明の不死化細胞の細胞表面上で、または細胞内でレセプターを発現する。別法としては、病原は、細胞内に含有され、不死化細胞がin vitroで粉砕されるか、または病原含有不死化細胞をワクチン接種された動物によってin v ivoで処理された後に放出される。粉砕は、公知の手段を使用して、例えば、凍結−融解または他の生化学的もしくは機械的粉砕によって行われる。さらなる別法では、病原の抗原部分は、精製されるか、または混合物のままである。すなわち、抗原は、それらが産生され、ワクチン製剤中で使用される不死化細胞からの非精製細胞物質、ウイルスサブユニットまたは断片、培地、および、所望により、アジュバントの混合物からなる。前記に従って産生された抗原は、ワクチンの調製に使用され得る。該ワクチンは、体内投与に好適な形態で、本発明によって産生される１つ以上の、免疫原性量の抗原からなる。所定の病原または寄生体に向けられたかかるワクチンは、ウイルスおよび微生物を含む所定の病原に感染した本発明の不死化細胞培養を増殖させることによって産生される少なくとも１つ以上の、免疫原性量の病原抗原からなる。前記定義の病原抗原としては、病原全体、その所望のサブユニット、ポリペプチド、細胞画分もしくはその断片、または、所望の非タンパク様物質が挙げられる。別法としては、ワクチンは、全不死化細胞および病原抗原を含有する。該病原抗原は、該不死化細胞において細胞内で、または該細胞表面上で発現されるか、あるいは、該細胞の自然プロセシングの間に分泌されるか、あるいは、ワクチン製剤は、宿主による病原感染不死化細胞を含有する。別法としては、かかるワクチン組成物は、全細胞ではない不死化細胞のいくつかの細胞成分、例えば、不死化細胞の免疫原タンパクまたはポリペプチド断片、サブユニット非タンパク様物質またはその混合物を含有する。別の具体例では、ワクチンは、ダニに対して防御するように設計される。かかるワクチン組成物は、免疫原性量の本発明の不死化ダニ細胞、細胞画分、該細胞の抗原性タンパクもしくは断片、または本発明の不死化細胞の他の好適な免疫原性断片を含有する。別の具体例では、本発明の抗寄生体ワクチンは、全細胞、細胞画分、または該細胞からの唯一のタンパク様もしくは所望の非タンパク様物質のいずれかとして、本発明の不死化ダニ細胞系の両方またはその混合物を含有する。さらに、これらのワクチン組成物は、体内投与に好適な他の慣用の抗寄生体剤を含んでいてもよく、および／または、他の公知のダニワクチン組成物と一緒に投与されてもよい。実施例２は、本発明の抗タニワクチンとの異種間反応性（ cross-species reactivity）を説明する。本発明のＡＧＥＣ−１およびＤＧＥＣ−１不死化ダニ細胞系およひＢｐｂｌ− Ｔ１ウシ細胞系を使用して、取り込まれて複製する病原（実施例３を参照）および医薬的に許容される担体を用いて、または用いずにワクチンを調製する。例えば、ダニワクチンとして、非感染または無病原結合ダニ細胞は、（例えば、ローラービン、マイクロキャリヤー、懸濁液、中空繊維などの）当該技術分野の当業者に公知の大規模な細胞培養方法を使用して所望の容量および細胞密度に複製される。該細胞は、標準的な方法によって回収され、限外濾過または遠心によって濃縮される。該細胞は、１〜３サイクルの凍結−融解、または加熱または好適な化学的不活化によって不活化される。次いで、該不活化細胞を最適条件下でアジュバントして、細胞およびアジュバントの懸濁液を得る。ウシ細胞をワクチン組成物の調製のために同様に操作する。別の製剤において、回収した不死化細胞の膜タンパクは、標準的な方法によって分画して、単独で、または他の抗原と組み合わせて、本発明の不死化細胞の一部だけを含有するワクチンを形成することができる。このワクチンは、不活化工程を必要としないが、所望により、前記方法でアジュバントされ、投与されてもよい。同様に、当該技術分野の当業者は、本発明のワクチン組成物の含有物について、本発明の不死化細胞から誘導された所望の免疫原性タンパク、ペプチド、またはポリペプチドを同定するすることができる。同定されたかかるタンパク、ペプチド、またはポリペプチドは、単離および精製され、組換えにより産生されるか、または、公知の手段によって合成される。本発明のワクチンは、本発明のワクチンを動物に注射することによる所定の病原に対するヒトまたは動物の免疫化方法において使用される。一例として、ワクチン組成物は、細胞系ＡＧＥＣ−１またはＤＧＥＣ−１において産生され、該細胞系から精製されるか、または、ダニ細胞系由来の細胞物質と一緒に使用される所定のボレリア（Ｂorrelia）抗原をその活性成分の１つとして含有する。かかるワクチンは、ライム病またはダニに対する免疫性を刺激するためにヒトおよび動物に投与されるのが望ましい。ワクチンがボレリア（Ｂor relia）抗原だけからなる場合、該ワクチンは、ライム病の原因因子であるスピロヘータに対する免疫性を発生する。該ワクチンがダニ細胞抗原物質も含有する場合、該ワクチンは、該ダニが該スピロヘータをワクチンに移すことができる前に該ダニを破壊する免疫応答を発生する。同様の方法で、本発明のワクチンを使用して、ロッキー山紅斑熱、エールリキア症（Ｅhrlichiosis）、アルボウイルス、アナプラスマ症、タイレリア症、バベシア症、皮膚過敏症、およびアレルギー性皮膚炎に対して防御することができる。ここで、細胞系中で産生された抗原は、この症状を引き起こす病原の１つから誘導される。別法としては、本発明のワクチンがライム病に対して防御するように製剤化される場合、全不死化ダニ細胞、または該不死化細胞からの細胞画分またはサブユニット、ダニ細胞タンパクまたはペプチド断片、またはその混合物は、ダニ細胞に対する免疫性を刺激するための１つのワクチン成分を提供する。ダニ細胞ワクチン成分は、ボレリア（Ｂorrelia）から調製された全不活化病原細胞を含有するワクチンまたはサブユニットワクチンと一緒に別々に投与される。すなわち、ボレリア（Ｂorrelia）抗原は、不死化細胞中で産生される必要はない。それは、別の慣用方法で産生され、不死化ダニ細胞成分含有組成物と一緒に共投与されてもよい。別法としては、本発明では、ボレリア（Ｂorrelia）を不死化細胞中で増殖させ、次いで、全不死化細胞およびスピロヘータ物質を回収し、不活化し、好ましくは、前記のとおりアジュバントする。別の具体例は、増殖後に不死化細胞からスピロヘータまたはスピロヘータ産生タンパクまたは抗原断片を分離し、ワクチンとして該細胞からスピロヘータまたはタンパク様断片を別々に調製することを含む。この場合、スピロヘータは、不活化されるか、または、タンパクは、同様の方法で単離され、アジュバントされる。したがって、本発明は、ダニ媒介性病原による感染を予防するのに有用なワクチンを提供するものである。かかるワクチン組成物は、本発明の不死化ダニ細胞、またはその免疫原もしくは抗原断片、および所定の病原に向けられる抗原を含有する。この抗原は、全不活化ウイルス性もしくは細胞性病原またはその抗原タンパク、高分子もしくはポリペプチドである。例えば、好ましい具体例では、抗ライム病ワクチンは、該不死化細胞およびボレリア・ブルグドフェリ（Ｂorreli a burgdoferi）抗原の両方を含有する。かかる抗原の例は、実施例９に記載するスピロヘータである。しかしながら、本発明は、本発明の不死化ダニ細胞と共同して産生される抗原に限定されず、ボレリア（Ｂorrelia）抗原は、他の供給源から得られてもよい。かかるワクチンが単独でスピロヘータまたはそのサブユニットを含有するワクチンよりも優れた防御を提供することが予想される。本発明の不死化細胞は、また、所定の病原、例えば、ボレリア（Ｂorrelia）由来の遺伝子の発現のための組換えベクターとして使用することもできる。したがって、スピロヘータを増殖および維持する必要はなくなる。ボレリア（Ｂorre lia）の遺伝子を発現するかかる組換えベクターを、不死化ダニ細胞中に導入する。該遺伝子を発現するダニ細胞を前記のとおり回収し、不活化し、アジュバントし、安定性および効率について最適化する。例えば、ある種のボレリア（Ｂorrelia）は、標準的な研究培地中で増殖したボレリア（Ｂorrelia）と生きているダニを介してパッセージされるボレリア（Ｂorrelia）との間で差別的に識別する能力を有する外表面タンパク（ＯＳＰ）を発現する。組換えＤＮＡ研究を使用する場合、生きているダニによって病原菌伝播（vector）されたボレリア（Ｂorrelia）由来のＯＳＰを表す遺伝子を単離し、適切なベクター中で発現させる。特に有用なベクターとしては、セムリキ・フォレスト・ウイルス（Ｓemliki forest virus）ベクター、バキュロウイルスベクターおよび昆虫ポックスウイルスベクターが挙げられる。所望の抗原を産生するためにこれらのウイルスに感染した本発明の不死化ダニ細胞は、前記のとおり全細胞またはサブユニット抽出物として処理される。典型的には、本発明の不死化細胞と共同して産生される抗原タンパクは、ワクチン組成物中で使用されるのが望ましい。例えば、免疫原性量の抗原タンパクまたは望ましい非タンパク様物質は、医薬的に許容される担体と混合される。所定の病原抗原の免疫原性量は、一般に、抗原約０．０１μg〜１０．０mgであり、より好ましくは、０．０５μg〜１mgであり、抗原、病原および宿主動物の同一性に依存して、当業者によって決定される。不死化ダニ細胞の免疫原性量は、投与当たり約１０¹〜１０⁸細胞、好ましくは、約１０⁶細胞である。別法としては、合計不死化細胞タンパク様物質、細胞画分または望ましい非タンパク様高分子は、前記病原抗原について前記したとおり、約０．０５μg〜１mgの範囲である。しかしながら、当業者は、ワクチンに依存して適切な調整を行うことができる。前段に記載した活性成分に加えて、本発明のワクチン組成物に、例えば、安定化剤、担体およびアジュバントを含む他の任意成分を添加してもよい。安定化剤は、所望により、長い半減期を提供するか、または、本発明の製剤化ワクチンの効力を増強するために添加される。典型的には、安定化剤、アジュバント、および不活化剤は、標的動物における効力について最良の製剤を決定するために最も効果的に活用される。好適な安定化剤は、他の任意成分についてと同様に、当業者によく知られている。かかる安定化剤の例としては、カザミノ酸、シュークロース、ゼラチン、フェノールレッド、Ｎ−ＺアミンＡＳ、グルタミン酸一カリウム、モノリン酸カリウム、二リン酸カリウム、ウシアルブミン画分Ｖ、ラクトース、ラクトアルブミン加水分解産物、ドライミルク、および熱不活化血清が挙げられる。好適な医薬的に許容される担体は、タンパクおよび抗原の投与を促進するが、生理学的に不活性であり、および／または、無害である。担体は、当業者によって選択される。担体の例としては、無菌生理食塩水、ラクトース、シュークロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストリン、寒天、ぺクチン、落花生油、オリーブ油、ゴマ油、および水が挙げられる。さらに、担体または希釈剤としては、単独またはワックスと一緒の、モノステアリン酸グリセリンまたは二ステアリン酸グリセリンなどの時間遅延物質が挙げられる。さらに、徐放性ポリマー製剤を使用することもできる。本発明のワクチン組成物は、慣用の持続放出性マトリックス、移植製剤、錠剤製剤または注射用持続放出製剤およびマトリックス中に一体化される。かかる製剤の成分は、当該技術分野によく知られている。前記ワクチン成分の１つ以上を混合するか、または、慣用のアジュバントに吸着させる。アジュバントは、白血球を引き付けるか、または、免疫応答を増強するための非特異的刺激物として使用される。かかるアジュバントとしては、とりわけ、鉱油および水、水酸化アルミニウム、アンフィゲン（Amphigen）、アブリジン（Avridine）、Ｌ１２１／スクアレン、Ｄ−ラクチド−ポリラクチド／グリコシド、プルロニック型ポリオール、ムラミルジペプチド、死菌ボルデテラ（Bo rdetella）、サポニン、クイル（Quil）Ａなどのサポニン誘導体、および免疫刺激性複合物（ＩＳＣＯＭ）が挙げられる。不活化剤も本発明のワクチン製剤中に含まれてもよい。好適な不活化剤としては、ホルマリン、グルタルアルデヒド、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）、べータ−プロピオラクトン、ならびに、加熱および凍結／融解技術が挙げられる。他の好適な薬物は、当該技術分野でよく知られている。本発明のワクチンの望ましい投与量は、所望のワクチン組成物の１〜３回投与を含む。ここで、各画分の望ましい抗原含量は、本明細書中に記載されるとおりである。ワクチンは、約２週間〜３カ月間離して筋肉内または皮下注射で２回投与して、免疫化し、標的動物の免疫系を追加免疫する。しかしながら、本発明のワクチンの投与モードは、皮内、静脈内、腹腔内、経皮、局所的（例えば、パッチ軟膏による）および移植によることを含むいずれか好適な経路である。特定の動物についての特定の投与レベル、モードおよび投与タイミングは、動物の年齢、全身の健康状態および食餌；動物の種類；ならびに要求される防御の程度を含む種々の因子による。もちろん、投与は、所望により、年１回などの好適な間隔で繰り返すことができる。例えば、免疫原性量の活性ワクチン成分を含む無菌調製物の投与容量は、ウシにおける０．１〜５m1からイヌまたはネコなどの小動物における０．１〜１mlまで変えることができる。標的動物の活性免疫化を検出するための免疫測定は、ＥＬＩＳＡなどのin vitro検出系を使用して細胞タンパクに対する抗体の力価を試験することによって測定することができる。別の態様では、本発明の不死化細胞は、有意な治療用産生物を提供する。所望の治療薬を産生することができる本発明の不死化細胞系を培養するために適切な培地および他の条件は、慣用技術によって当業者によって容易に決定することができる。かかる治療薬は、直接、培養培地中に分泌され、当業者により慣用技術によって単離されてもよい。別法としては、内部で発現させる場合、当該薬物は、公知技術を使用してかかる細胞の培養溶解物から単離されうる。したがって、本発明は、本発明のワクチン組成物を動物に投与することによるダニ外寄生、ライム病、および他のダニ媒介性疾患に対する動物の免疫化方法を提供するものでもある。ダニ外寄生に対する動物の免疫化方法について、本発明のワクチン組成物は、免疫原性量の本発明の不死化ダニ細胞、ＤＧＥＣ−１、ＡＧＥＣ−１、後代もしくはその誘導体、またはこれらの細胞の混合物を含有する。ライム病に対する動物の免疫化方法について、本発明のワクチン組成物は、本発明の不死化ダニ細胞系中で、その上で、または、それによって産生される１つ以上の、免疫原性量のボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ. burgdorferi）抗原、単独または１つ以上のボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ. burgdorferi）抗原と混合した本発明の不死化ダニ細胞系、またはこれらの混合物を含有する。所定のダニ媒介性疾患に対する動物の免疫化方法について、本発明のワクチン組成物は、本発明の不死化ダニ細胞系中、その上、または、それによって産生されるダニ媒介性疾患を引き起こす病原由来の１つ以上の、免疫原性量の抗原、単独または１つ以上の該病原と混合した本発明の不死化ダニ細胞系、またはこれらの混合物を含有する。さらに、本発明は、病原が本発明の不死化ウシＴ細胞と共同して増殖する能力を有する、所定の病原に対する動物の免疫化方法を提供するものである。特に、ウシ白血病ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、またはウシリンパ球に感染する他の病原は、Ｂｐｂｌ−Ｔ１不死化ウシＴ細胞中での増殖のために好適な病原であると予想される。本発明の不死化細胞は、診断薬の供給源を提供するものでもある。例えば、本発明のＤＧＥＣ−１またはＡＧＥＣ−１不死化ダニ細胞系、あるいは、好ましくは、それら由来のタンパク配列は、感染の疑いをかけられた動物からの体液の試料における病原、特にダニ媒介性病原の存在を検出するためのin vitroアッセイにおいて診断試薬として使用される。さらに、本発明の不死化細胞において産生された病原およびそれらのタンパク配列は、病原についての診断薬を提供するものでもある。さらに、該不死化細胞レセプターの特異性を使用して、かかる微生物に対して曝露された疑いのある患者から単離した微生物の分類を決定することもできる。レセプターが同定されると、レセプター特異的分類を行うことができる。かかる診断アッセイは、本発明の細胞系と検出可能な標識との結合およびこの診断試薬の試料流体とのインキュベーションを含む。例えば、本発明の不死化ダニ細胞上のレセプターの特異性を使用して、ダニに噛まれた疑いのある患者から単離した微生物を分類することができる。ＤＧＥＣ−１細胞は、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂorrelia burgdorferi）の菌株２９７を特異的に凝集するので、凝集を使用して、他のボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ. burgdorferi）菌株を分類することができる。病原の細胞への結合は、凝集、増幅、病原抗原、例えば、ボレリア（Borrelia）上のＯＳＰの刺激、および病原、例えば、ボレリア（ Borrelia）に対するＭＡｂまたは本発明の不死化細胞系上のレセプターを使用する競合結合を含む種々の慣用のアッセイによって検出することができる。１つの具体例では、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ. burgdorferi）は、in vitroでＤＧＥＣ−１細胞への吸着後に特異的に凝集し、これは、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ. burgdorferi）およびＤＧＥＣ−１細胞上の特異的レセプターを示す。吸着の数日後、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ. burgdorferi ）は誘発されて複製する。通常、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ. burgdorfer i ）は、ＤＧＥＣ−１培地中で複製しない。結合、凝集および分離は、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ. burgdorferi）とＤＧＥＣ−１との間の活性化（相乗作用）工程を示す。したがって、不死化細胞および／またはボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ. burgdorferi）は、培地中で増殖因子を精密化する。本発明の不死化ダニ細胞系ＤＧＥＣ−１またはＡＧＥＣ−１上のレセプターに対する抗体は、診断アッセイにおいて使用される。好適なポリクローナル、組換え体、または、より望ましくは、モノクローナル抗体の作製のための慣用技術は、当業者によく知られている［例えば、コーラー（Ｋohler）およびミルスタイン（Ｍilstein）；ダブリュ・ディ・ヒューズ（Ｗ．Ｄ．Ｈuse）ら、サイエンス（Ｓcience）、２４６：１２７５−１２８１（１９８８）；１９８６年３月１３日に公開されたＰＣＴ特許公開ＰＣＴ／ＷＯ８６／０１５３３；１９８７年１０月７日に公開された英国特許出願ＧＢ２１８８６３８Ａ；アミット（Ａmit）ら、サイエンス、２３３：７４７−７５３（１９８６）；クィーン（Ｑueen）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ（Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci.，ＵＳＡ）、８６：１００２９− １００３３（１９８９）；１９９０年７月２６日に公開されたＰＣＴ特許公開ＰＣＴ／ＷＯ９０／０７８６１；およびリーチマン（Ｒiechmann）ら、ネイチャー（Ｎature）、３３２：３２３−３２７（１９８８）を参照］。診断目的のため、抗体は、相互作用して、検出可能なシグナルを生じるのが好ましい個々の標識と結合される。最も好ましくは、該シグナルは、可視的に検出可能である。比色検出について、適切に操作する種々の酵素系は、当該技術分野で開示されている。ＤＧＥＣ−１またはＡＧＥＣ−１上のレセプターに対して特異的な抗体を標的薬物として治療学的に使用して、治療化合物を運搬してもよい。標識と結合されるよりも、かかる治療薬は、病原の複製メカニズムを無力にする能力を有する薬物またはリガンドに連結した抗体を使用する。別法として、抗体は、病原の標的細胞への結合をブロックする。かかる抗体は、ダニ外寄生を治療するための治療組成物においても有用である。以下の実施例は、単に、本発明の種々の態様を説明するだけであり、本発明の範囲を限定するものではない。実施例１−形質転換細胞系の特徴付けデルマセンター・アンダーソニ（Dermacentor andersoni）の腸上皮管から誘導された不死化細胞ＤＧＥＣ−１は、細胞の「鎖状」クラスターを生じることができる出芽プロセスによる無限増殖および複製を示す。増殖特徴は、増加した培養期間で変化する。しかしながら、この方法に従って形質転換された腸細胞間の複製比は、形質転換の容易さを変化させるのに従って変わる。培養の開始後約９カ月間で、細胞複製比が増加し、わずかな形態変化が生じた。目立った核が初めて肉眼で見ることができるようになった。細胞は、培養条件に適応させ、細胞増殖および発達に必要ではないトランスフェクトされたＤＮＡを欠失するのにこの時間を必要とするかもしれない。３種類の細胞が異種個体群において観察された：小さくて丸い透明な細胞；大きな顆粒状の茶色の細胞；および大きくて透明な細胞。細胞は、培養期間を通して貧食能を有する。抗菌物は、細胞増殖特徴の検出可能な変化を伴わずに樹立培養から取り出された。ＤＧＥＣ−１細胞系は、さらに、（１）ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂorre lia burgdorferi）（レセプター媒介因子）による選択的吸着、（２）混合した血球個体群における赤血球細胞の異なる貧食作用および（３）ダニ外寄生および摂食を低下させたモルモットにおける免疫応答の誘発によって特徴付けられる。該株は、１５カ月間にわたって安定なままであった。さらに、この細胞系ならびにアンブリオンマ・アメリカーヌム（Amblyomma am ericanum ）（ＡＧＥＣ−１）由来の不死化腸上皮細胞は、アナプラスマ・マルギナール（Ａ. marginale）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂorrelia burgdorfe ri ）およびエールリキア（Ｅhrlichia）種のin vitro培養を維持するのに有用であることを証明した。これらの細胞系は、アルボウイルス（Ａrboviruse）、バベシア（Ｂabesia）および他のダニ媒介性病原のin vivo培養を維持するのにも有用である。これらのうちある種の病原の増殖を下記実施例３に記載する。実施例２−不死化ダニ腸細胞によるモルモットの免疫化ダニ腸抽出物によるモルモットの好結果のワクチン接種は、常に、反復ワクチン接種後に増強することができるよりも特異的抗体力価を伴う。これらの抗体力価は、通常は、ＥＬＩＳＡ試験によって測定される。不死化腸細胞がダニの免疫抑制のために重要な抗原を合成する能力を保持しているか否かを測定するために、該細胞を使用して、モルモットにワクチン接種した。モルモットがダニ外寄生に対して成功裏に免疫化されたか否かを測定するために、３つのパラメーターを使用した：（ａ）血粉を採取している間または直後に死亡、（ｂ）産卵の低下または消失、（ｃ）産卵された卵の塊からの孵化の低下または欠乏。これらのパラメーターは、いずれもダニの生活環をブロックすることができるので、ダニ外寄生に対する臨床的測定値に加えられる。この実施例は、モルモットモデルにおけるワクチン接種および攻撃（challenge）研究の結果を記載し、ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて天然ダニ腸組織と交差反応する不死化ダニ細胞に対する抗体の産生を示す。本発明の無限増殖性ダニ腸細胞をＬ−１５Ｂ完全培地から回収し、遠心し（１５０×ｇ；１０分間）、次いで、Ｌ−１５Ｂ不完全培地中で３回洗浄した。次いで、該細胞をＬ−１５Ｂ不完全培地に再懸濁させ、１．０×１０⁶細胞／mlに調節した。０日目および１４日目に、各モルモットに１００万細胞を皮下注射によって投与した。各注射は、１mlの容量であり、２つの部位に分けて投与した。アンブリオンマ・アメリカーヌム（Ａmblyomma americanum）細胞について６匹およびデルマセンター・アンダーソニ（Ｄermacentor andersoni）について６匹の合計１２匹のモルモットを使用した。最後の細胞注射の２週間後、心臓穿孔によって動物に出血させ、各動物から血液４mlを回収し、血清を分離し、−２０℃で貯蔵した。以下のとおり酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定すると、免疫化された動物は、強い抗体応答を示した。以下のとおり、抗原を調製した。成体雌性の摂食させていないデルマセンター・アンダーソニ（Ｄermacentor andersoni）およびアンブリオンマ・アメリカーヌム（Ａmblyomma americanum）（各２００）を表面滅菌し、それらの腸組織を無菌ＰＢＳ（pＨ７．２、０．１５Ｍ）中に回収した。腸調製物を音波処理し、ピー・ケイ・スミス（Ｐ．Ｋ．Ｓmith）ら、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａnalytical Biochemistry）、１５０：７６−８５（１９８５）の記載に従って、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイによってタンパク含量を測定した。ウエル用コーティングは、炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液中に懸濁させた腸抗原５ μg／mlからなり、１００μl／ウエルを負荷し、次いで、４℃で一晩インキュべートした。該ウエルを１％ウシ血清アルブミンでブロックした。１：１０〜１：２０４８０の血清希釈液（対照および免疫の両方）を調製した。使用した二次抗体は、１％ＢＳＡ（ＰＢＳ、０．０５％トゥイーン（Ｔween− ２０））中のＨＲＰＯ中ウサギ抗モルモット（ＩgＧ、Ｈ＆Ｌ）、１：１０００であった。基質は、ｏ−フェニレンドラミン［ＯＰＤ；ニューヨーク州ロチェスターのイーストマン・コダック（Ｅastman Ｋodak）］であり、光学密度を４９０nmで測定した。これらのアッセイの結果を下記第１表〜第３表に示す。第１表および第２表は、前記実施例５に記載の技術によって不死化されたアンブリオンマ・アメリカーヌム（Ａmblyomma americanum）腸細胞で免疫化されたモルモットに対して行われた結果を示す。天然腸抗原（５μg／ml）は、公知の方法を使用して、酵素結合免疫吸着検定法ＥＬＩＳＡによって測定すると、１００μl中５００ng／ウエルであった。標準として、試験前にダニ腸タンパク濃度を測定した。各々同一の抗体希釈液および検出用抗体を使用して、各ウエルを同等に被覆した。標識抗体は、ウサギ抗モルモット−ＨＲＰＯ（ＩgＧ、Ｈ＆Ｌ）、１：１０００であった。アンブリオンマ・アメリカーヌム（Ａ. americanum）抗原の予備免疫化力価（ＯＤ₁₆₀）は０．０３７であり、デルマセンター・アンダーソニ（Ｄ. andersoni）抗原のＯＤ₁₆₀は０．０６４であった。第１表は、不死化アンブリオンマ・アメリカーヌム（Ａ. americanum）細胞（ＡＧＥＣ−１）で免疫化され、ダニによって攻撃されていない動物における抗体応答の測定を表す。期間は、血清を試験した接種後時間を示す。抗原は、試験において使用された抗原を表す。以下のデータは、アンブリオンマ・アメリカーヌム（Ａ. americanum）細胞で免疫化され、かつ、ダニ攻撃された動物におけるＥＬＩＳＡによる抗体応答の測定を表す。新しく腸を単離したデルマセンター・アンダーソニ（Ｄ. andersoni）から単一細胞懸濁液を調製した。単離した細胞を凍結し、融解した。モルモットをこの調製物で０．５mg／ml／動物に免疫化した。３回のブースター注射の合計を、接種間の１０日間隔で投与した。下記第３表のデータから分かるように、不死化デルマセンター・アンダーソニ（Ｄermacentor andersoni）腸細胞（ＤＧＥＣ−１）で免疫化した動物は、強い抗体応答を表した。第３表の抗原は、スクリーニングのために使用したものである。モルモットの免疫化によって新しく調製したダニ腸組織に対して生じた抗体を免疫蛍光アッセイにおいて使用して、１１カ月間培養中に維持した不死化ダニ腸細胞上での反応性エピトープを検出した。これらのモルモット抗体は、ダニにより攻撃された動物から得られた。イムノローカリゼーションのための血清の回収後、免疫化動物を感作種の幼虫、若虫または成虫で攻撃した。このイムノローカリゼーションデータは、防御研究結果と相互に関係する。下記第４表は、対照動物についてのデルマセンター・アンダーソニ（Ｄermace ntor andersoni）ダニの生活環パターンに対する効果を示し、デルマセンター・アンダーソニ（Ｄermacentor andersoni）天然腸抗原で免疫化された動物についての同様のデータを示す第５表と比較する。このデータは、新しく調製したデルマセンター・アンダーソニ（Ｄ. anderson i ）腸細胞で免疫化された動物がダニ成虫による外寄生に対して耐性であったことを示す。４匹の雌性マダニのうちいずれも、卵を産んだ免疫化モルモットに外寄生せず、これは、明白な抗ダニ応答を示した。下記第６表および第７表は、前記技術によって不死化されたアンブリオンマ・アメリカーヌム（Ａmblyomma americanum）腸細胞で免疫化した動物におけるアンブリオンマ・アメリカーヌム（Ａmblyomma americanum）およびデルマセンター・アンダーソニ（Ｄermacentor andersoni）に対するこの効果を示す。ｎ¹（摂食した幼虫１００％が生き残った）ｎ²｛４５匹が成虫に脱皮し（７５．０％）、１５匹が死亡した（２５．０％）｝赤色は、ダニ腸が明らかに崩壊したことを示す。１匹のダニは、カプセル中で破裂した。この研究におけるダニ成虫は、死んだか、または、卵を産む能力がなかった。卵塊は、全く生産されなかった。 n¹（１７匹が成虫に脱皮し（２８．３％）、４３匹が死亡した（８１．８％）。 ^*成虫について、雌によって生産された卵が孵化しなかったことを示す。幼虫についてのデータがないのは、それらが宿主に付着しなかったことを示す。しかしながら、摂食はなかったが、噛まれた部位に重篤な皮膚反応が見られる。卵塊は、これらの摂食１５日間に全く生産されなかった。該データは、さらに、免疫化が、repleteまでの長い時間、低い最終体重および低下した生存可能な卵塊によって示される種交差防御を誘発することを示す。下記第８表および第９表は、前記技術によって得られた不死化デルマセンター・アンダーソニ（Ｄermacentor andersoni）腸細胞で免疫化された動物におけるアンブリオンマ・アメリカーヌム（Ａmblyomma americanum）およびデルマセンター・アンダーソニ（Ｄermacentor andersoni）ダニに対するこの効果を示す。 n¹｛２５匹は、成虫に脱皮し（４１．７％）、３５匹は、死んだ（５８．４％）｝^* 郷化しなかった卵塊（３２４．６mg）の生産を示した。^** 卵塊３５３．５mgの生産を示した。２匹のダニが摂食期間中に早期に死んだ。幼虫に関するデータがないのは、付着しなかったことを示す。しかしながら、幼虫について摂食は生じなかったが、噛まれた部位で重篤な皮膚反応が見られた。 ^* 卵塊１３１．５mgの生産を示す。^** 卵塊１６７．４mgの生産を示す。不死化細胞で免疫化された動物を同種の幼虫、若虫または成虫で攻撃した。予備観察は、成虫および若虫攻撃に対する耐性が存在することを示した。成虫ダニは、長い摂食を必要とし、うっ血が変わる。多くの雄性、雌性および若虫ダニは、うっ血の後に死んだ。さらに、卵の生産は、低下した。アンブリオンマ・アメリカーヌム（Ａ. americanum）の不死化消化管細胞は、デルマセンター・アンダーソニ（Ｄ. andersoni）起源の細胞よりも外寄生に対するより確実な耐性を刺激するのが明らかである。このデータは、免疫化が種交差防御を誘発することを示す。実施例３−不死化ダニ細胞における病原の増殖Ａ．エールリキア・カニス（Ｅhrlichia canis）およびグラニュロサイティック・カニン・エールリキア（Ｇranulocytic Ｃanine Ｅhrlichia）エールリキア・カニス（Ｅhrlichia canis）およびグラニュロサイティック・カニン・エールリキア（Ｇranulocytic Ｃanine Ｅhrlichia）（ＧＣＥ）は、デルマセンター・アンダーソニ（Ｄermacentor andersoni）（ＤＧＥＣ−１）およびアンブリオンマ・アメリカーヌム（Ａmblyomma americanum）（ＡＧＥＣ−１）の不死化腸細胞において成功裏に増殖された。これらの微生物に実験的に感染したイヌから回収した末梢血からエールリキア（Ｅhrlichia）を得た。エールリキア・カニス（Ｅ. canis）は、リンパ球および単核細胞に結合する。ＧＣＥは、顆粒球に結合する。ヘパリンを含有するバキュテイナー（vacutainer）中に末梢血を回収した。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をフィコール（Ｆicoll）勾配液（ヒストパク（Ｈi stopaque））によって単離し、Ｌ−１５Ｂ不完全培地中で３回洗浄した。次いで、細胞数を１．０×１０⁶細胞／mlに調節し、腸細胞を含有するフラスコ（６ml ）に添加した（末梢血リンパ球調製物中に数個の赤血球も存在した）。二重勾配法においてヒストパク（Ｈistopaque）１０７７および１１１９を使用して、シグマ・ケミカルズ（Ｓigma Ｃhemicals）によって開示された方法によって、血液から顆粒球を単離した。単離した顆粒球を、腸細胞（１．０×１０⁶ 細胞／ml）を接種したＬ−１５Ｂ不完全培地中で２回洗浄した。感染から２〜３日後に培養物の顕微鏡実験は、腸細胞周辺にＰＢＬ／顆粒球の凝集を示した。アンブリオンマ・アメリカーヌム（Ａmblyomma americanum）腸細胞は、大きく、楕円形で、かつ、ＰＢＬ／顆粒球よりも大きいので、アンブリオンマ・アメリカーヌム（Ａmblyomma americanum）腸細胞においてこのことは非常に明らかである。接種の約２〜３週間後、混入したＲＢＣが退化し、ＰＢＬ／顆粒球は、粗い表面を示し、培養物中で多くの顆粒状物質が観察された。さらに、アンブリオンマ（Ａmblyomma）細胞は、ヘモグロビンの食菌作用を示した（色において、赤が出現した）。細胞に感染してから８〜１０週間後、微小体の数が増加し、これらの微小体の多くは、腸細胞の表面に、特に、アンブリオンマ・アメリカーヌム（Ａmblyomma americanum）腸細胞上に点在した。ディフークイック（Ｄiff−Ｑuick）染色培地塗抹標本および１ミクロン薄片（トルイジンブルー染色した）は、多くの微小体（同形微小体の芝）を示し、この多くの微小体も腸細胞の表面に点在した。エールリキア症に罹っているイヌから回収した血清試料を抗体の供給源として使用し、これを使用して、蛍光抗体試験によって培養物中の微生物を同定した。培養物のアセトン固定化塗抹標本をエールリキア（Ｅrhlichia）に対する抗体と反応させ、これらの免疫グロブリンをフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート抗カニン抗体によって局在化させた。感染したイヌ由来の物質を含有する培養物は、反応性を示した。不死化腸細胞の外観は、微小蛍光抗体の点在を示した。Ｂ．ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂorrelia burgdorferi）ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂorrelia burgdorferi）菌株２９７［スミスクライン・ビーチャム・アニマル・へルス（ＳmithＫline Ｂeecham ＡnimalＨe alth）］を、公知の技術に従って、慣用のＢＳＫ−II培地中で増殖した。ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ. burgdorferi）の菌株Ｂ３１［スミスクライン・ビーチャム（ＳmithＫline Ｂeecham）］およびＳＨ−２−８２［ナショナル・インスティチューツ・オブ・ヘルス（Ｎational Ｉnstitutes of Ｈealth）］も樹立された。２つのべクターコンピテント菌株としては、コネクティカット州スタンフォード（Ｓtamford）においてイクソーデス・ダミニ（Ｉ. dammini）から単離された２７９８５およびぺロマイサス・ロイコプス（Ｐeromysus ｌeucopus）から単離された２１３０５が挙げられる［両方とも、コネクティカット・アグリカルチュラル・リソース・ステイション（Ｃonnecticut Ａgricultural Ｒesour ce Ｓtation）のジョン・アンダーソン（Ｊohn Ａnderson）から入手可能である］。しかしながら、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．burgdorferi）の他の公知の菌株も使用することができる。ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ. burgdorferi）菌株２９７の８〜１０日齢培養物（２００μl）を２つのＴ−２５フラスコの各々に添加した。デルマセンター・アンダーソニ（Ｄermacentor andersoni）不死化腸細胞（ＤＧＥＣ−１）およびアンブリオンマ・アメリカーヌム（Ａmblyomma americanum）不死化腸細胞（ＡＧＥＣ−１）を、スピロヘータを接種する２４〜４８時間前に、無抗生物質Ｌ−１５Ｂ完全培地中で培養した。以下のとおり、スピロヘータ感染ダニ細胞培養物を乾燥インキュベーター中で３０℃でインキュベートした。１．デルマセンター・アンダーソニ（Ｄermacentor andersoni）感染の２４時間後、スピロヘータが細胞に付着し始めた。インキュベーションを続けると、スピロヘータによる細胞の凝集が増加する。感染の４〜５日後、スピロヘータによる細胞の明らかな巻き込みが明らかであった。培養物における細胞のタイプ、小さく、丸く、透明な腸細胞にスピロヘータが付着したことが観察された。大きく、丸く、茶色の細胞は、スピロヘータ付着に対して耐性がある。感染の１０〜１２日後、スピロヘータ感受性細胞を粉砕し、培養物中にスピロヘータ耐性細胞だけが存在した。感染の１５日後、いわゆるスピロヘータ耐性細胞は、増殖し始め、数が増加し始めた。感染の２０日後、スピロヘータ耐性細胞は、フラスコの全体にわたって一様に見られた。スピロヘータも増殖が見られた。スピロヘータの数は、増加した。スピロヘータ耐性細胞は、スピロヘータの増殖に関する増殖因子を提供する。細胞中でスピロヘータを１２日間培養した後、スピロヘータを腸細胞を含有する新しいフラスコ中に通過させた。最初の通過において、細胞の凝集は、感染の４〜５日後まで見られなかった。このフラスコにおいても、スピロヘータ付着は、小さく、丸く、透明な細胞に関してのみであった。大きく、丸く、茶色の細胞は、スピロヘータによって影響を受けなかった。２．アンブリオンマ・アメリカーヌム（Ａmblyomma americanum）これらの腸細胞は、同様にスピロヘータ付着を示した。この系において観察された唯一の差異は、４〜５日後のみに見られた。大きく、楕円形で、茶色の細胞は、スピロヘータによって攻撃されなかった。Ｃ．アナプラスマ・マルギナーレ（Ａnaplasma marginale）この微生物は、ヘパリンを含有するバキュテイナー中でアナプラスマ症に罹っているウシまたはアナプラスマ・マルギナーレ（Ａ．marginale）感染ウシから回収され、血液塗抹標本実験によって測定すると２７％寄生虫血症を示した末梢血から得られた。アナプラスマ・マルギナーレ（Ａ. marginale）のバフィーコートを遠心によって除去し、赤血球をＬ−１５Ｂ不完全培地中で２回洗浄した。抗体を含有しない全ての成長因子を有するＬ−１５Ｂ完全培地中で、赤血球数を１．０×１０⁷細胞／mlに調節した。不死化デルマセンター・アンダーソニ（Ｄermacentor ander soni ）およびアンブリオンマ・アメリカーヌム（Ａmblyomma americanum）腸細胞約５mlを含有するフラスコに感染赤血球１．０×１０⁶細胞／mlを接種した（各細胞タイプについて２つのフラスコ）。接種後、以下のとおり、細胞を約３０ ℃でインキュベートした。赤血球（ＰＢＣ）を培養物中に接種してから２４時間後、腸細胞は、腸細胞表面上にＰＢＣの付着を示した。これは、デルマセンター（Ｄermacentor）細胞よりもアンブリオンマ（Ａmblyomma）細胞における方がより明らかである（両方の細胞タイプにおいて、これらの付着が見られる）。接種の４８時間後、腸細胞によるＰＢＣの食菌作用があった。腸細胞の細胞膜は、厚くなり、数多くなった；ＰＢＣは、腸細胞の表面上に点在した。さらに、これらの腸細胞は、黒ずんだ茶色を示した。接種の５日後、腸細胞は、非常に顆粒状であり、数多くの一様な微小封入体を含有し、多くの細胞は、破裂し、周囲の培地中にこれらの封入体を放出した。感染腸細胞分析用透過型電子顕微鏡のために培養試料を回収した。変化は、アンブリオンマ細胞においてより明らかであった。本発明の多くの修正および変形は、前記定義の明細書中に含まれ、当業者に明らかであると予想される。本発明の組成物および製造方法に対するかかる修正および変形は、以下の請求の範囲の範囲中に包含されると思われる。Detailed Description of the Invention Immortalized cells and their use Field of the invention The present invention relates to immortalized primary cells, more specifically , Immortalized cell lines useful for the production of antigens and bioactive compounds. Background of the Invention Characterized by the ability to grow indefinitely Immortalized cell lines serve as a source of immunogens and as a source of novel bioactive compounds. , And for the production and replication of related pathogens. Infinitely growing culture The ability to establish a cell line varies depending on the animal species from which the cell is derived. For example, rodents Cells of the genus normally give rise to an infinitely proliferating cell line, whereas chicken cells are almost permanent. Does not grow for a long time. Human cells, excluding tumor cells, are a good source of immortalized cell lines Absent. Tick cell cultures are of interest for investigating and studying tick-borne pathogens and microorganisms It is deep. Currently available in vitro primary or continuous mite cell cultures Inability to maintain long-term, constant transmission of vector-borne pathogens. For use in investigating vaccines against a given pathogen and for research purposes, the disease Permanently proliferating in vitro cell culture of cells that can maintain the growth of the original microorganism Required in the art. Summary of the invention The present invention also provides an immortalized culture of primary cells. Of. These cell lines can be used as anti-antigens, for example in vaccine compositions. As a container for the propagation and production of raw materials, as a diagnostic reagent, and in therapeutic compositions Useful. Other features and advantages of the present invention are further described in the detailed description of the preferred embodiments below. Will be explained. Detailed Description of the Invention The present invention provides immortalized mite cell lines and immortalized bovine T cell lines. . The immortalized cell line of the present invention can be used, for example, as a vaccine agent against ticks. Or is useful in its manufacture and is induced by pathogens, for example, tick-borne pathogens. Provides protection against the disease being developed. As used herein, the term "immortalized cell line" refers to the candy described below. Means the cells deposited in the Lican Type Culture Collection (ATCC) To taste. Immortalized cells of the invention are maintained indefinitely in a suitable culture medium. By conventional techniques to produce a homogenous population of progeny cell lines to obtain You may expand the clone. Derma Center Andersoni (Dermacentor andersoni) And Ambrio Nama Americanum (Amblyomma americanum) A permanent growth culture of the mite intestine Provided. One example is the tick cell line designated DGEC-1. This cell The system is detailed and characterized in Example 1. This system is stable for 26 months As it is, American Type Culture Collection dated July 8, 1992 (ATCC Deposit No. CRL 11084) deposited with the T.C. (ATCC). The AGEC-1 immortalized mite cell line of the present invention, which is described in further detail below, is also 1992. Deposited with the ATCC on July 8, 2010 [ATCC Deposit No. CRL 11083] . Further, the present invention is referred to as Bpbl-T1 (bovine peripheral blood lymphocyte-T cell). To provide an immortalized bovine T cell line. This immortalized bovine T cell line Reasoning, T cell-dependent antigen targeting assay, T cell reporter and antigen recognition research , Adoptive cell transfer experiments, and cytokines, antigens and / or other live Useful for in vitro screening of bioresponse modifiers It This system has remained stable for eight months and was dated September 11, 1992 in the ATCC. [ATCC Deposit No. CRL 11120]. The invention further extends to the progeny and derivatives of these cell lines, such as passage. Or cells derived from a particular defined cell line by clonal expansion. Departure All statements made herein with respect to the clear immortalized cell line include their progeny and And derivatives as well. The immortalized mite cell culture of the present invention is particularly suitable for the bacterium responsible for Lyme disease. Lea Burgdorferi (Borrelia burgdorferiI) for tick-borne pathogens such as It is useful for in vitro growth and production of antigens against these pathogens. this These cell lines are anaplasma marginal (A．marginale), Erlichia (Ehrlichia) Species, and Borrelia burgdorferi (Borrelia burgdorf eri It was also found to be useful in maintaining the in vitro culture of). The immortalized T cells of the present invention are capable of proliferating certain pathogens and anti-resistance to these pathogens. It is also useful for raw production. Furthermore, the immortalized T cell of the present invention has T cell infectivity. Pathogens, such as lentivirus studies, and T cell signal transduction It is useful for studying options. The immortalized cells of the invention are directed against antigens, eg, preferably parasite-mediated pathogens. A protein or non-proteinaceous substance having the ability to elicit an immune response The present invention provides a system for mass production of cell components. According to one example, The immortalized cells of the invention may themselves be biological or therapeutic agents such as mite cell poly. Vaccine composition containing peptide or protein or predetermined pathogenic antigen Other components of mite cells that enhance the ability to stimulate protective immune response in the vaccine or Produce a fraction. For example, the immortalized mite cell line AGEC-1 or DGEC-1 , Cultured, naturally, for pharmaceutical and veterinary purposes, anticoagulant, anti-inflammatory , Polypeptides, proteins or other cells useful as agents and diuretics Produce a fraction. These exemplary agents and other agents may be added to the invention after culturing. Within the range of biological products naturally produced by immortalized cells. Such natural products Appropriate culture conditions for obtaining maximal production of organisms can be determined by one of ordinary skill in the art. This These biological substances are produced intracellularly and are based on their chemical identity or biological activity. , Conventional cell disruption, eg lysis, and the substance or cell fraction containing it Obtained from cultured mite cells by purification from lysates. Alternatively, Light immortalized cells secrete the drug into the medium. Such biological material or cell fraction Isolation and purification methods are known in the art and are optionally utilized. . According to another embodiment, the present invention provides the immortalized cell culture of the present invention to a pathogenic microbe. Objects, for example Borelia Burgdorferi (Borrelia burgdorferi), Ale Rikia Canis (Ehrlichia canis), Anaplasma marginalis (Anaplas ma marginalis), Babesia Bovis (Babesia bovis), Theileria parva (Theileria parva) Of the antigens directed to a given pathogen by It provides a production method. Infected immortalized cells are not cultivated in the natural Allows production of pathogenic proteins in production and culture. Virus or microorganism , The subunit itself, the polypeptide, the cell fraction , Fragments thereof, or other macromolecules such as carbohydrates, lipids and lipoproteins Any of the desired proteinaceous materials can be applied to conventional biological and genetic engineering techniques. Thus, it is produced in a permanently growing cell culture and isolated from that culture. Immortalized cells Such proteinaceous and non-proteinaceous substances, including pathogens themselves, are referred to herein Defined as an antigen. Alternatively, the pathogen is co-recovered from the cell culture infected with the pathogen. Be done. Proteinaceous and non-proteinaceous substances produced by pathogenically infected immortalized cell lines Include substances produced by immortalized cell biosynthetic activity. Isolated from the cell culture The resulting pathogens would have use in vaccine compositions. For example , The binding between such pathogenic substances and mite cell inducers causes disease in mite cell culture. In vaccinated persons due to the effects of the mite cell environment after the increase and proliferation of the raw material A vaccine composition having enhanced immune stimulating ability is provided. Similar method , The immortalized bovine cell line and the products produced therein are It is used to enhance vaccine compositions containing antigenic material. These cells And substances further facilitate identification of bovine antigens and bovine cytokine production. And also useful for assays for activity. Another method of producing the desired antigen or polypeptide using the immortalized cell line of the invention Is a suitable regulatory sequence capable of directing replication and expression in immortalized cell lines. A set containing under control a heterologous polypeptide or protein with the desired antigenic properties. Including transfecting the cell line with a replacement molecule. To contain recombinant molecules Culturing the transfected immortalized cell line to allow heterologous proteins or Allows the expression of the polypeptide. Designing recombinant molecules, heterologous proteins and preparations The method used to select the nodal sequences and their incorporation into cell lines is well known in the art. Within the field [eg Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual) (Molecular Cloning (ALa boratory Manual)), Coal of Cold Spring Harbor, NY Cold Spring Harbor Press (19) 89),]. Suitable vector or plasmid for transfecting immortalized mite cells Examples of insect virus, insect recombinant plasmid, insect pox virus, And those having operative promoters including arbovirus. Present Insect promoters, such as the baculovirus polyhedron ), Insect poxvirus spheroidin, Drosophila promoter or Or Arbovirus (Semliki Forest Vi rus)) produces the best results in immortalized mite cells. Similarly, mammals The vector component and the known vector for cells are the bovine cell line Bpbl-T1. Easily for use in transfecting To be selected. See, for example, Maniatis et al., Supra. The production of the desired antigen from the immortalized mite cell line of the invention is exemplified below (Examples 3). A similar method was used to produce antigen in the immortalized bovine cell line of the invention. May be. Cells from media and pathogenically infected immortalized cells are generally Recovered after ~ 108 hours and used as a source of antigen for immunization. Place If desired, clean the antigen-containing medium from the cell-bound material by centrifugation and aliquot Separate and store at -20 ° C until use. Alternatively, the pathogenic antigenic substance is immortal It remains associated with cellular material from activated cells and is mixed into the vaccine. Predetermined Immortalized mite cell producers associated with pathogenic antigens enhance the immunostimulatory effect of pathogenic antigens To be strong. All antigen preparations were tested by ELISA for parasite-specific protein (PSP ) Can be quantified. Cell-bound antigen is sonicated in serum-free medium on ice. It is prepared by subjecting to a wave treatment and then performing the centrifugation step. Protein concentration Is Bradford, Analytical Biochemistry (Anal) ． Biochem. ), 72: 248 (1976). Sonic wave Adjust the prepared parasite suspension to a final concentration of 10-100 μg / ml in serum-free medium. , Aliquot and store at -20 ° C until use. The pathogen emits a receptor on the cell surface of the immortalized cell of the present invention or intracellularly. Reveal. Alternatively, the pathogen is contained intracellularly and the immortalized cells are powdered in vitro. In v by animals crushed or vaccinated with pathogenic immortalized cells Emitted after being processed by ivo. Grinding may be performed by using known means, for example, freezing. Tying-Thawing or by other biochemical or mechanical milling. Further another In the method, the antigenic portion of the pathogen is either purified or remains a mixture. Sanawa The antigens from the immortalized cells from which they are produced and used in the vaccine formulation Unpurified cellular material, viral subunits or fragments, media, and, if desired, , A mixture of adjuvants. The antigen produced according to the above may be used in the preparation of a vaccine. The vaccine Are one or more of the immunogenic agents produced by the invention in a form suitable for internal administration. Consists of a quantity of antigen. Such vaccines directed against a given pathogen or parasite are By growing an immortalized cell culture of the invention infected with a given pathogen, including It comprises at least one or more immunogenic amounts of pathogenic antigens produced by. The above definition Pathogenic antigens include all pathogens, their desired subunits, polypeptides, cells Fractions or fragments thereof, or desired non-proteinaceous substances may be mentioned. Alternatively, the vaccine contains whole immortalized cells and pathogenic antigens. The pathogen The antigen is expressed intracellularly in the immortalized cell or on the cell surface, Alternatively, it is secreted during the natural processing of the cells, or a vaccine The formulation contains immortalized cells for pathogenic infection by the host. Alternatively, you can The Ting composition may include some cellular components of immortalized cells that are not whole cells, such as immortalized cells. Immunogenic proteins or polypeptide fragments of non-humanized cells, non-proteinaceous subunits Quality or a mixture thereof. In another embodiment, the vaccine is designed to protect against ticks. Scarecrow The vaccine composition comprises an immunogenic amount of the immortalized mite cells of the present invention, a cell fraction, and the cells. Antigenic proteins or fragments of, or other suitable immunogens of immortalized cells of the invention Containing sex fragments. In another embodiment, the anti-parasitic vaccine of the invention comprises a whole cell, Cell fraction, or the only proteinaceous or desired nonproteinaceous material from the cell Either of the immortalized mite cell lines of the invention or a mixture thereof. It In addition, these vaccine compositions are suitable for other conventional antiparasitic agents suitable for internal administration. Agents and / or with other known mite vaccine compositions May be administered to. Example 2 shows the cross-reactivity with the anti-Tani vaccine of the present invention ( cross-species reactivity). The AGEC-1 and DGEC-1 immortalized mite cell lines of the present invention and Bpbl- Using the T1 bovine cell line, pathogens that are taken up and replicate (see Example 3) and And vaccines with or without pharmaceutically acceptable carriers. example For example, as a mite vaccine, non-infected or pathogen-free bound mite cells (eg, Skill in the art (for example, rabin, microcarriers, suspensions, hollow fibers, etc.) Replicate to desired volume and cell density using large-scale cell culture methods known to Be done. The cells are harvested by standard methods and by ultrafiltration or centrifugation. Concentrated. The cells may be freeze-thawed for 1-3 cycles, or heat or suitable It is inactivated by chemical inactivation. The inactivated cells are then agitated under optimal conditions. Substrate to obtain a suspension of cells and adjuvant. Bovine cell vaccine group The same procedure is used for the preparation of the product. In another formulation, the recovered immortalized cell membrane proteins were collected using standard methods. Fractionated, alone or in combination with other antigens, to immortalized cells of the invention. Vaccines containing only parts can be formed. This vaccine is inactivated Although it is not necessary, even if it is adjuvanted and administered by the above method, if desired. Good. Similarly, one of ordinary skill in the art would be interested in the content of the vaccine composition of the present invention. A desired immunogenic protein, peptide derived from the immortalized cell of the present invention, Alternatively, the polypeptide can be identified. Such proteins identified, The peptide, or polypeptide, is isolated and purified and recombinantly produced. Alternatively, it is synthesized by a known means. The vaccine of the present invention is Immunization of humans or animals against certain pathogens by injecting vaccines into animals It is used in a chemical method. As an example, the vaccine composition may be in the cell line AGEC-1 or DGEC-1. Produced and purified from the cell line or derived from the mite cell line A given Borrelia antigen used in combination with one of its active ingredients Contained. Such vaccines stimulate immunity to Lyme disease or mites Therefore, it is desirable to administer it to humans and animals. The vaccine is Borrelia relia) antigens alone, the vaccine is a vaccine that is responsible for the Lyme disease. Develops immunity to roaches. The vaccine also contains mite cell antigenic material If the vaccine is before the mite can transfer the spirochete into the vaccine And generate an immune response that destroys the tick. In a similar manner, the vaccine of the present invention can be used. Use for Rocky Mountain Spotted Fever, Ehrlichiosis, Arboill , Anaplasmosis, theileriosis, babesiosis, skin hypersensitivity, and allergic disease -Can protect against dermatitis. Where the antigen produced in the cell line Is derived from one of the pathogens that causes this condition. Alternatively, the vaccine of the invention is formulated to protect against Lyme disease. Whole immortalized mite cells, or a cell fraction or subunit from the immortalized cells. Knit, mite cell protein or peptide fragment, or a mixture thereof, One vaccine component for stimulating immunity against. Tick cells Chin component contains whole inactivated pathogen cells prepared from Borrelia Vaccine or subunit vaccine. That is, Borrelia antigens need not be produced in immortalized cells. that is , Produced by another conventional method and co-administered with a composition containing immortalized mite cell components May be. Alternatively, in the present invention, Borrelia is used in immortalized cells. Cells, then collect and inactivate all the immortalized cells and spirochete material. , Preferably adjuvanted as described above. Another embodiment is immortalization after growth Fine The spirochete or spirochete-producing protein or antigenic fragment from the cell, Separate preparation of spirochete or proteinaceous fragments from the cells as a vaccine Including that. In this case, the spirochete is inactivated or the protein is , Isolated and adjuvanted in a similar manner. Therefore, the present invention provides a vaccine useful for preventing infection by a tick-borne pathogen. It is to provide Chin. Such a vaccine composition is an immortalized mite cell of the present invention. , Or an immunogen or antigenic fragment thereof, and an antigen directed against a given pathogen. Have. This antigen can be a whole inactivated viral or cellular pathogen or its antigen target. A polymer, a polymer or a polypeptide. For example, in a preferred embodiment, Lyme disease vaccine uses the immortalized cells and Borrelia burgdorferi (Borreli a burgdoferi) Contains both antigens. Examples of such antigens are described in Example 9. It is a spirochete. However, the present invention does not cooperate with the immortalized mite cells of the present invention. Borrelia antigens are not limited to antigens produced by May be obtained from Such a vaccine alone would produce spirochete or its subunits. It is expected that it will provide better protection than vaccines containing vaccines. The immortalized cells of the invention may also be associated with certain pathogens, such as Borrelia. It can also be used as a recombinant vector for the expression of the gene of origin. did Thus, there is no need to grow and maintain spirochetes. Borre The recombinant vector expressing the lia) gene is introduced into immortalized mite cells. It Mite cells expressing the gene are harvested, inactivated, and adjuvanted as described above. Optimized for stability and efficiency. For example, some Borrelia were grown in standard research media Borrelia (Borrelia) and passage through live ticks ( Borrelia) and outer surface protein (OSP) capable of discriminating against Express. Pathogens by live mites when using recombinant DNA research Isolation of vector expressing OSP derived from Borrelia And express in a suitable vector. A particularly useful vector is Semliki Forest virus (Semliki forest virus) vector, baculovirus Vectors and insect poxvirus vectors. Produce the desired antigen The immortalized mite cells of the present invention infected with these viruses in order to Processed as whole cells or subunit extracts. Typically, the antigenic proteins produced in association with the immortalized cells of the invention are It is preferably used in a tin composition. For example, immunogenic amounts of antigenic proteins or Alternatively, the desired non-proteinaceous material is mixed with a pharmaceutically acceptable carrier. Predetermined The immunogenic amount of the pathogenic antigen is generally about 0.01 μg to 10.0 mg of the antigen, More preferably, it is 0.05 μg to 1 mg, which is the same as that of the antigen, pathogen and host animal. It will be determined by the person skilled in the art depending on the sex. The immunogenic amount of immortalized mite cells is about 10 per dose.¹-10⁸Cells, preferably , About 10⁶Is a cell. Alternatively, total immortalized cell proteinaceous material, cell fraction Or the desired non-proteinaceous macromolecule is as described above for the pathogenic antigen , About 0.05 μg to 1 mg. However, one of ordinary skill in the art would depend on the vaccine. You can make the appropriate adjustments. In addition to the active ingredients mentioned in the preceding paragraph, the vaccine composition according to the invention may, for example, be stable Other optional ingredients may be added including agents, carriers and adjuvants. Stabilizer Optionally provides a long half-life, or of the formulated vaccines of the invention. Added to enhance potency. Typically, stabilizers, adjuvants, and And inactivators are most important in determining the best formulation for efficacy in target animals. It is effectively used. Suitable stabilizers are well known to those skilled in the art, as are other optional ingredients. It Examples of such stabilizers are casamino acids, sucrose, gelatin, phosphite. Enol Red, NZ amine AS, monopotassium glutamate, potassium monophosphate Um, potassium diphosphate, bovine albumin fraction V, lactose, lactoalbumy Hydrolysates, dry milk, and heat-inactivated serum. Suitable pharmaceutically acceptable carriers facilitate the administration of proteins and antigens, It is physiologically inert and / or harmless. The carrier can be Selected. Examples of carriers include sterile saline, lactose, sucrose. , Calcium phosphate, gelatin, dextrin, agar, pectin, peanut oil, Included are olive oil, sesame oil, and water. Furthermore, as a carrier or diluent Is glyceryl monostearate or disteer, alone or with wax. Examples include time delay substances such as glycerin phosphate. In addition, made of sustained-release polymer Agents can also be used. The vaccine composition of the present invention comprises a conventional sustained release matrix, implant formulation, tablet. Incorporated into a formulation or sustained release formulation for injection and matrix. Such product The ingredients of the agent are well known in the art. Mixing one or more of the above vaccine components or inhaling in a conventional adjuvant. To wear. Adjuvants attract leukocytes or enhance the immune response Used as a non-specific stimulant. As such an adjuvant, By the way, mineral oil and water, aluminum hydroxide, Amphigen, Abri Avridine, L121 / squalene, D-lactide-polylactide / gly Coside, Pluronic type polyol, Muramyl dipeptide, Bordetella killed (Bo rdetella), saponins, saponin derivatives such as Quil A, and immunization An irritant complex (ISCOM) may be mentioned. Inactivating agents may also be included in the vaccine formulation of the present invention. As a suitable inactivating agent Is formalin, glutaraldehyde, binary ethyleneimine (BEI), Beta-propiolactone and heating and freeze / thaw techniques . Other suitable drugs are well known in the art. The desired dose of the vaccine of the present invention is 1 to 3 times of the desired vaccine composition. including. Here, the desired antigen content of each fraction is as described herein. Is. The vaccine is given twice by intramuscular or subcutaneous injection, separated by about 2 weeks to 3 months. Donate to immunize and boost the immune system of the target animal. However, according to the invention The mode of administration of the vaccine can be intradermal, intravenous, intraperitoneal, transdermal, topical (eg Any suitable route, including by means of a tea ointment) and by implantation. The specific dose level, mode and timing of administration for a particular animal will vary. Age, general health and diet; animal type; and required protection It depends on various factors, including the degree. Of course, if desired, the administration may be once a year or the like. It can be repeated at appropriate intervals. For example, the dose volume of a sterile preparation containing an immunogenic amount of an active vaccine component is From 0.1 to 5 ml in 1 to 0.1 ml in small animals such as dogs or cats. Can be changed with. Immunoassays for detecting active immunization of target animals are described in E. Test the titer of antibodies against cellular proteins using an in vitro detection system such as LISA. It can be measured by testing. In another aspect, the immortalized cells of the invention provide a significant therapeutic product. Desired Suitable for culturing an immortalized cell line of the invention capable of producing a therapeutic agent of Media and other conditions can be readily determined by one of ordinary skill in the art by routine techniques. it can. Such therapeutic agents are secreted directly into the culture medium and are routinely used by those skilled in the art. May be isolated by. Alternatively, when expressed internally, the drug , Can be isolated from culture lysates of such cells using known techniques. Therefore, the present invention provides a vaccine composition of the present invention by administering it to an animal. How to immunize animals against tick infestation, Lyme disease, and other tick-borne diseases It is also provided. The present invention relates to a method for immunizing animals against tick infestation. Vaccine composition of the present invention comprises an immunogenic amount of the immortalized mite cells of the present invention, DGEC-1, A. Contains GEC-1, progeny or derivatives thereof, or mixtures of these cells . Regarding the method of immunizing animals against Lyme disease, the vaccine composition of the present invention One or more produced in, on, or by a clear immortalized mite cell line An immunogenic amount of Borrelia burgdorferi (B. burgdorferi) Antigen, simple Germany or one or more Borrelia burgdorferi (B. burgdorferi) Mixed with antigen Containing a combined immortalized mite cell line of the invention, or a mixture thereof. Predetermined da D. Regarding the method of immunizing animals against mediated diseases, the vaccine composition of the present invention comprises In or on the immortalized mite cell line of the invention, or a mite medium produced thereby. One or more immunogenic amounts of antigens from a pathogen that causes a mediated disease, alone or 1 Immortalized mite cell line of the invention mixed with one or more said pathogens, or a mixture thereof. contains. Furthermore, the present invention provides the ability of pathogens to grow in concert with the immortalized bovine T cells of the present invention. And a method of immunizing an animal against a predetermined pathogen. Especially, Infect bovine leukemia virus, bovine immunodeficiency virus, or bovine lymphocytes Is a preferred pathogen for growth in Bpbl-T1 immortalized bovine T cells. Is expected. The immortalized cells of the invention also provide a source of diagnostic agents. For example, a book DGEC-1 or AGEC-1 immortalized mite cell line of the invention, or preferably The protein sequences derived from them were tested on body fluids from animals suspected of being infected. In vitro assay for detecting the presence of pathogens in foods, especially tick-borne pathogens Used as a diagnostic reagent in. In addition, produced in immortalized cells of the invention The identified pathogens and their protein sequences also provide diagnostics for pathogens. It is also In addition, the specificity of the immortalized cell receptor is used to Determining the classification of microorganisms isolated from patients suspected of being exposed to an organism You can also Once the receptors are identified, receptor-specific classification can be performed. It Such a diagnostic assay provides for the binding of the cell line of the invention to a detectable label and Including incubation of the diagnostic reagent with the sample fluid. For example, the immortalization From a patient suspected of being bitten by a tick using the specificity of the receptor on the two cells The isolated microorganism can be classified. DGEC-1 cells are Borrelia bull Gudolferi (Borrelia burgdorferi) Strain 297 specifically aggregates , Using other coagulation, Borrelia burgdorferi (B. burgdorferi) Strain Can be classified. Binding of pathogens to cells can be associated with aggregation, amplification, pathogenic antigens, eg For example, stimulation of OSP on Borrelia, and pathogenesis, eg, Borrelia ( Borrelia) or a receptor on the immortalized cell line of the invention. Can be detected by a variety of conventional assays, including competitive binding. In one example, Borrelia Burgdorferi (B. burgdorferi) Is in In vitro, it was specifically aggregated after adsorption to DGEC-1 cells, which Rugdolferi (B. burgdorferi) And specific receptors on DGEC-1 cells Show A few days after adsorption, Borrelia burgdorferi (B. burgdorferi ) Is triggered and replicates. Normally Borrelia Burgdorferi (B. burgdorfer i ) Does not replicate in DGEC-1 medium. Binding, aggregation and dissociation of Borrelia ・ Burgdorferi (B. burgdorferi) And DGEC-1 activation (synergy Action) step. Therefore, immortalized cells and / or Borrelia burgd Ruffeli (B. burgdorferi) Refines growth factors in the medium. The receptor on the immortalized mite cell line DGEC-1 or AGEC-1 of the present invention Antibodies against are used in diagnostic assays. Suitable polyclonal, recombinant Or, more preferably, conventional techniques for producing monoclonal antibodies are , Well known to those skilled in the art [eg Kohler and mill styling. Milstein; W. D. Huse et al., Science (Science), 246: 1275-1281 (1988); March 13, 1986. Published PCT Patent Publication PCT / WO86 / 01533; 1987 10 UK Patent Application GB 2188638A, published 7th March; Amit et al. Science 233: 747-753 (1986); Queen et al., Proceedings of National Academy of Sciences You -S.A. (Proc. Natl. Acad. Sci., USA), 86: 10029- 10033 (1989); PCT patent publication P published on July 26, 1990. CT / WO90 / 07861; and Riechmann et al., Nature (Nature), 332: 323-327 (1988)]. For diagnostic purposes , The antibody preferably is an individual label that preferably interacts to produce a detectable signal. Combined with. Most preferably, the signal is visually detectable. Colorimetric Various enzyme systems that are appropriately engineered for detection are disclosed in the art. . Targets antibodies specific for receptors on DGEC-1 or AGEC-1 It may be used therapeutically as a drug to deliver therapeutic compounds. Combined with the sign Rather than such drugs, such therapeutic agents have the ability to neutralize pathogenic replication mechanisms. An antibody linked to the entity or ligand is used. Alternatively, the antibody is the target of the pathogen Block binding to cells. Such antibodies are therapeutics for treating tick infestation It is also useful in compositions. The following examples merely illustrate various aspects of the present invention and It does not limit the range. Example 1-Characterization of transformed cell lines Derma Center Andersoni (Dermacentor andersoni) From the intestinal epithelium Directed immortalized cells DGEC-1 can give rise to "chain" clusters of cells Shows endless growth and replication with possible budding processes. Growth characteristics are It changes depending on the feeding period. However, between enterocytes transformed according to this method The replication ratio changes as the ease of transformation is changed. About 9 after the start of culture During the months, the cell replication ratio increased and a slight morphological change occurred. The prominent nucleus first Now it can be seen with the naked eye. The cells should be adapted to the culture conditions and expanded. This was used to delete the transfected DNA that is not required for reproduction and development. May need time. Three types of cells were observed in a heterogeneous population: small, round, transparent cells; large. Fine granular brown cells; and large, clear cells. The cells are Have a poor diet. Antimicrobials are established and established without any detectable changes in cell growth characteristics. Removed from nutrition. The DGEC-1 cell line further comprises (1) Borrelia burgdorferi (Borre lia burgdorferi) (Receptor mediated factor) selective adsorption, (2) mixed Different phagocytosis of red blood cells in blood cell populations and (3) tick infestation and It is characterized by the induction of an immune response in guinea pigs with reduced feeding. The strain remained stable for 15 months. In addition, this cell line as well as Ambrionma americanum (Amblyomma am ericanum ) (AGEC-1) -derived immortalized intestinal epithelial cells are Nar (A. marginale), Borrelia Burgdorferi (Borrelia burgdorfe ri ) And Erlichia (Ehrlichia) Useful for maintaining in vitro culture of the species Proved that there is. These cell lines are called Arbovirus In vivo cultivation of Babesia and other tick-borne pathogens It is also useful for maintaining nutrition. The growth of certain of these pathogens is described in Example 3 below. Example 2-Immunization of guinea pigs with immortalized mite enterocytes Successful vaccination of guinea pigs with mite intestinal extract has always been repeated With specific antibody titers that can be enhanced after vaccination. These antibody power Value is usually measured by an ELISA test. Immortalized enterocytes immunize ticks To determine whether they retain the ability to synthesize important antigens for suppression The cells were used to vaccinate guinea pigs. Guinea pig infested with ticks Three parameters to determine whether or not it was successfully immunized against Used: (a) died during or immediately after collecting blood meal, (b) decreased egg production. Or disappearance, (c) reduced or lack of hatching from the spawned egg mass. These para All meters can block the life cycle of mites, so Added to clinical measurements for life. This example is for a guinea pig model. The results of the vaccination and challenge studies described in Of antibodies against immortalized mite cells that cross-react with natural mite intestinal tissue in Shows production. The infinitely growing mite intestinal cells of the present invention were recovered from L-15B complete medium and centrifuged (1 (50 × g; 10 minutes), and then washed 3 times in L-15B incomplete medium. Next And resuspend the cells in L-15B incomplete medium at 1.0 x 10⁶Adjust to cells / ml I saved. On days 0 and 14, each guinea pig was injected subcutaneously with 1 million cells. Was administered. Each injection had a volume of 1 ml and was administered in two sites. A Umbrianma Americanum (Amblyomma americanum) About 6 cells And Derma Center Andersoni (Dermacentor andersoni) About 6 animals A total of 12 guinea pigs were used. Two weeks after the last cell injection, by cardiac puncture The animals were bled to collect 4 ml of blood from each animal, serum was separated, and at -20 ° C. Stored. It is measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) as follows. Upon immunization, the immunized animals showed a strong antibody response. The antigen was prepared as follows. Adult female unfed Derma center ・ Andersoni (Dermacentor andersoni) And Amblyomma Americane Mu (Amblyomma americanum) (200 each) and surface-sterilized to remove their intestinal tissue. The cells were collected in bacterial PBS (pH 7.2, 0.15M). Sonicate the intestinal preparation and -K. Smith et al., Analytical Biochemistry (Analytical Biochemistry), 150: 76-85 (1985). The protein content was determined by bicinchoninic acid (BCA) assay. Well coatings consisted of intestinal antigen 5 suspended in carbonate-bicarbonate buffer Consist of 100 μl / well, consisting of μg / ml, then incubate overnight at 4 ° C. I started. The wells were blocked with 1% bovine serum albumin. Serum dilutions of 1:10 to 1: 20480 (both control and immunization) were prepared . The secondary antibody used was 1% BSA (PBS, 0.05% Tween- 20)) rabbit anti-guinea pig in HRPO (IgG, H & L), 1: 1000. Met. Substrate is o-phenylendramine [OPD; Roches, NY Eastman Kodak], with an optical density of 49 It was measured at 0 nm. The results of these assays are shown in Tables 1 to 3 below. Tables 1 and 2 show the immortalized immortalized crystals by the technique described in Example 5 above. Briomma Americanum (Amblyomma americanum) Immunized with enterocytes The results performed on guinea pigs are shown. Natural intestinal antigen (5 μg / ml) is known 10 as determined by enzyme-linked immunosorbent assay ELISA using the method 500 ng / well in 0 μl. As a standard, tick intestinal protein concentration before testing Was measured. Use the same antibody diluent and detection antibody for each well to Etc. Labeled antibody is rabbit anti-guinea pig-HRPO (IgG, H & L) , 1: 1000. Ambrionma Americanum (A. americanum) Pre-immunization titer of antigen (OD₁₆₀) Is 0.037, and Derma Center Ann Dasoni (D. andersoni) Antigen OD₁₆₀Was 0.064. Table 1 shows the immortalized Amblyomma Americanum (A. americanum)cell( Antibodies in animals immunized with AGEC-1) and not attacked by mites Represents a measure of response. Duration indicates the time after inoculation at which the serum was tested. Antigen tested Represents the antigen used in. The following data is from Ambrionma Americanum (A. americanum) In cells Measurement of antibody responses by ELISA in immunized and tick-attacked animals Represents a constant. Dermacenter Andersoni (with newly isolated intestine)D. andersoni) To simple A single cell suspension was prepared. The isolated cells were frozen and thawed. This guinea pig The preparation was immunized at 0.5 mg / ml / animal. The total of 3 booster injections Doses were administered at 10 day intervals between species. As can be seen from the data in Table 3 below, the immortalization data Luma Center Andersoni (Dermacentor andersoni) Enterocytes (DGEC-1 The animals immunized with) displayed a strong antibody response. Antigens in Table 3 are screenini It was used for Antibodies generated against newly prepared mite intestinal tissue by immunization of guinea pigs Immortalized mite intestine used in an immunofluorescence assay and maintained in culture for 11 months Reactive epitopes on the cells were detected. These guinea pig antibodies are transmitted by ticks. Obtained from the attacked animal. Recovery of serum for immunolocalization Immunized animals were then challenged with sensitized larvae, nymphs or adults. This immuno locala Rization data correlates with defense research results. Table 4 below shows the Dermacenter Andersoni (Dermace ntor andersoni) Shows the effect of mites on life cycle patterns, Andersoni (Dermacentor andersoni) For animals immunized with natural intestinal antigens Compare with Table 5 which shows all similar data. This data is for the newly prepared Dermacenter Andersoni (D. anderson i ) Animals immunized with enterocytes were resistant to adult infestation by adult mite And indicates. None of the four female ticks were exposed to the laid immunized guinea pigs. No parasitism, which showed a clear anti-mite response. The following Tables 6 and 7 show the amblyonma immortalized by the above technology. Americanum (Amblyomma americanum) In animals immunized with enterocytes Umbrianma Americanum (Amblyomma americanum) And Derma Center -Anderson (Dermacentor andersoni) To this effect. n¹(100% of the fed larvae survived) n²{45 molted to adult (75.0%) and 15 died (25.0%) ｝ Red color indicates that the mite intestine has apparently collapsed. One tick in a capsule Ruptured. Adult ticks in this study are either dead or not capable of laying eggs. won. No egg mass was produced. n¹(17 molted to adult (28.3%), 43 dead (81.8%)) . ^*For adults, shows that eggs produced by females did not hatch. The lack of data on larvae indicates that they did not attach to the host . However, no food was eaten, but a serious skin reaction was observed at the bite site . No egg mass was produced during these 15 days of feeding. The data is Immunization, long time until replete, low final weight and reduced viability It is shown to induce cross-species defense exhibited by the egg mass. The following Tables 8 and 9 are the immortalized derma centers obtained by the above-mentioned technology. ・ Anderson (Dermacentor andersoni) In animals immunized with enterocytes Amburi Onma Americanum (Amblyomma americanum) And Dermasee Inter Anderson (Dermacentor andersoni) Show this effect against ticks . n¹{25 animals molted to adults (41.7%), 35 dead (58.4%) ｝^* It showed the production of non-localized egg mass (324.6 mg).^** It showed a production of 353.5 mg of egg mass. Two mites died prematurely during the feeding period. No data on larvae Indicates that you did not wear it. However, feeding did not occur for the larvae, A serious skin reaction was seen at the bite site. ^* It shows the production of 131.5 mg of egg mass.^** It shows the production of an egg mass of 167.4 mg. Animals immunized with immortalized cells were challenged with allogeneic larvae, nymphs or adults. Foresight Note observations showed that there was resistance to adult and nymph attack. Adult mite Requires long feeding and changes in congestion. Many male, female and nymphal ticks , Died after congestion. In addition, egg production was reduced. Ambrionma Ame Rikanum (A.americanum) Immortalized gastrointestinal tract cells -Soni (D.andersoni) Sure more reliable resistance to infestation than the cells of origin It is clear that it will be intense. This data shows that immunization induces cross-species protection. Example 3-Proliferation of pathogens in immortalized mite cells A. Erlichia canis (Ehrlichia canis) And granulocytic Ku Kanin Aerrikia (Granulocytic Canine Ehrlichia) Erlichia canis (Ehrlichia canis) And granulocyclic Kanin Ayrrikia (Granulocytic Canine Ehrlichia) (GCE) is the Luma Center Andersoni (Dermacentor andersoni) (DGEC-1) and Ambrionma Americanum (Amblyomma americanum) (AGEC-1 ) Were successfully propagated in immortalized enterocytes. Experimentally infect these microorganisms Ehrlichia was obtained from peripheral blood collected from the dogs. Airi Kia Canis (E. canis) Binds to lymphocytes and mononuclear cells. GCE , Bind to granulocytes. In a vacutainer containing heparin Topical blood was collected. Peripheral blood lymphocytes (PBL) were washed with Ficoll gradient solution (Histopak (Hi stopaque)) and washed 3 times in L-15B incomplete medium. Then , Cell number 1.0 × 10⁶Adjusted to cells / ml, flask containing intestinal cells (6 ml ) (Some red blood cells were also present in the peripheral blood lymphocyte preparation). Use Histopaque 1077 and 1119 in the dual gradient method. For the method disclosed by Sigma Chemicals. Therefore, granulocytes were isolated from blood. The isolated granulocytes were converted into enterocytes (1.0 x 10⁶ Cells / ml) and washed twice in L-15B incomplete medium. Microscopic examination of cultures 2-3 days after infection showed that PBL / granulocytes were found around enterocytes. It showed agglomeration. Ambrionma Americanum (Amblyomma americanum) Intestine The cells are large, oval, and larger than PBL / granulocytes Onma Americanum (Amblyomma americanum) In enterocytes this is Very obvious. Approximately 2-3 weeks after the inoculation, the mixed RBCs deteriorate and the PBL / Granulocytes showed a rough surface and many granules were observed in the culture. Further In addition, Amblyomma cells showed the phagocytic effect of hemoglobin ( In color, red appeared). Eight to ten weeks after infection of cells, the number of microparticles increases and Many are found on the surface of intestinal cells, especially Ambrionma americanum (Amblyomma americanum) Scattered on intestinal cells. Diff-Quick dyeing culture Ground smears and 1 micron slices (stained with toluidine blue) show many microscopic Shows a body (a homomorphic turf), many of which were also scattered on the surface of enterocytes. Serum samples collected from dogs with ehrlichiosis as a source of antibodies Used to identify microorganisms in culture by fluorescent antibody test. Acetone-immobilized smears of cultures were transferred to Erlichia (Erhlichia) Antibody to And reacting these immunoglobulins with fluorescein isothiocyanate (FI Localized by TC) conjugated anti-canin antibody. Cultures containing material from infected dogs showed reactivity. Immortalized enterocytes The appearance of the sample showed the scattering of micro fluorescent antibodies. B. Borrelia Burgdorferi (Borrelia burgdorferi) Borrelia Burgdorferi (Borrelia burgdorferi) Strain 297 [Smith Klein Beecham Animal Heels alth)] was grown in conventional BSK-II medium according to known techniques. Borelli A Burgdorferi (B. burgdorferi) Strain B31 [SmithKline Vi SmithKline Beecham] and SH-2-82 [National Lee] National Institutes of Health] Was erected. Two vector competent strains are available in Sta., Connecticut. Ixodes Damini (at Stamford)I. dammini) To simple Separated 27985 and Peromysus Leukops (Peromysus leucopus) 21305 isolated from [[Both Connecticut Agri Cultural Resource Station (Connecticut Agricultural Resour) Ce Station) available from John Anderson ]. However, Borrelia Burgdorferi (B. burgdorferi) Other public Known strains can also be used. Borrelia Burgdorferi (B. burgdorferi) 8 to 10 days old strain 297 Cultures (200 μl) were added to each of two T-25 flasks. Dermassen Tar Anderson (Dermacentor andersoni) Immortalized enterocytes (DGEC-1) And Amblyonma Americanum (Amblyomma americanum) Immortalized intestine Cells (AGEC-1) without antibiotics 24-48 hours before inoculation with spirochete Quality L-15B complete culture. Spirocheta-infected mite cells as follows Cultures were incubated at 30 ° C in a dry incubator. 1. Derma Center Andersoni (Dermacentor andersoni) Twenty-four hours after infection, spirochete began to attach to the cells. incubation Continuing to increase the aggregation of cells by spirochete. 4-5 days after infection, Apparent involvement of cells by the pyrochetes was apparent. Fine in culture Cell type, small, round, clear intestinal cells with spirochete attached Was done. Large, round, brown cells are resistant to spirochete attachment. Ten to twelve days after infection, spirochete-sensitive cells were disrupted and spirocheted in culture. Only data-resistant cells were present. 15 days after infection, so-called spirochete resistant cells Began to grow and the numbers started to increase. Twenty days after infection, spirochete-resistant cells , Uniformly throughout the flask. Spirochetes were also seen to proliferate. The number of spirochete has increased. Spirohe Ta-resistant cells provide growth factors for the growth of spirochete. After culturing spirochete in cells for 12 days, spirochetes contain enterocytes It was passed into a new flask. In the first pass, the aggregation of cells Not seen until 4-5 days later. Also in this flask, spirochet , Small, round, transparent cells only. Large, round, brown cells Was not affected by spirochete. 2. Ambrionma Americanum (Amblyomma americanum) These enterocytes also showed spirochete attachment. Observed in this system The only difference made was only after 4-5 days. Large, oval, brown cells Was not attacked by Spirocheta. C. Anaplasma Marginale (Anaplasma marginale) This bacterium suffers from anaplasmosis in a vacutainer containing heparin. Cattle or Anaplasma marginale (A. marginale) From infected cattle Peripheries recovered and showed 27% parasitemia when measured by blood smear experiment Obtained from blood. Anaplasma Marginale (A. marginale) Buffy coat What Were removed and the red blood cells were washed twice in L-15B incomplete medium. Contains no antibodies Red blood cell count was 1.0 x 10 in L-15B complete medium with all growth factors.⁷Fine Cells / ml. Immortal Derma Center Andersoni (Dermacentor ander soni ) And Ambrionma Americanum (Amblyomma americanum) Intestinal thinness Infected red blood cells 1.0 x 10 in a flask containing about 5 ml of cells.⁶Cells / ml were inoculated ( 2 flasks for each cell type). After inoculation, about 30 cells were prepared as follows. Incubated at ° C. Twenty-four hours after inoculation of red blood cells (PBC) into the culture, the intestinal cells became The adhesion of PBC was shown on the surface. This is the Derma Center (Dermacentor) Cells Rimo Ambrionma (Amblyomma) Is more obvious in cells (both These attachments are found in cell types). 48 hours after inoculation, There was a phagocytic action of PBC. The cell membranes of enterocytes have become thicker and more numerous; PBC were interspersed on the surface of enterocytes. In addition, these enterocytes are dark brown Showed a color. Five days after inoculation, the enterocytes were very granular and contained numerous uniform microinclusions. Containing, many cells burst and released these inclusion bodies in the surrounding medium. Feeling Culture samples were collected for transmission electron microscopy for enterocyte analysis. Change is Ambu It was more obvious in ryoma cells. Many modifications and variations of the present invention are included in the specification of the above definitions and will be apparent to those skilled in the art. Expected to be mild. Such modifications to the compositions and manufacturing methods of the present invention And variations are believed to fall within the scope of the following claims.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4ＢＧ０１Ｎ 33/531 Ｚ 8310−2Ｊ (72)発明者ウィケル，スティーブン・ケイアメリカ合衆国オクラホマ州74074、スティルウォーター、ウエスト・エイティーンス・アベニュー4713番 (72)発明者ラマチャンドラ，ランガッパ・エヌアメリカ合衆国オクラホマ州74075、スティルウォーター、アパートメント・ナンバー１、ノース・ユニバーシティ・プレイス 19番─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification number Internal reference number FI C07K 16/28 C12N 15/09 C12P 21/08 9358-4B G01N 33/531 Z 8310-2J (72) Inventor Wykel, Steven Kay United States Oklahoma 74074, Stillwater, West Eighteenth Avenue No. 4713 (72) Inventor Ramachandra, Languppa N. United States Oklahoma 74075, Stillwater, Apartment Number 1, North・ University Place No. 19

Claims

[Claims] 1. Immortalized mite cell line AGEC-1 (ATCC Accession No. CRL11083), Progeny and its derivatives. 2. The immortalized cell line according to claim 1, which is infected with a predetermined pathogen. 3. The gene product is under the control of a regulatory sequence capable of expressing the gene product of interest. 2. A DNA encoding a product, which is derived from a predetermined pathogen and is transfected. Immortalized cell line. 4. Immortalized mite cell line DGEC-1 (ATCC Accession No. CRL11084), Progeny and its derivatives. 5. The immortalized cell line according to claim 4, which is infected with a predetermined pathogen. 6. The gene product is under the control of a regulatory sequence capable of expressing the gene product of interest. 5. A DNA derived from a predetermined pathogen encoding a product is transfected. Immortalized cell line. 7. Immortalized bovine T cell line Bpbl-T1 (ATCC Accession No. CRL-1112 0), progeny and derivatives thereof. 8. The immortalized cell line according to claim 7, which is infected with a predetermined pathogen. 9. The gene product is under the control of a regulatory sequence capable of expressing the gene product of interest. 9. A DNA derived from a predetermined pathogen encoding a product is transfected. Immortalized cell line. 10. AGEC-1, DGEC-1, progeny and its inducers infected with a predetermined pathogen Produced by culturing immortalized mite cells selected from the group consisting of conductors Isolated pathogenic antigen. 11. Consists of Bpbl-T1 infected with a given pathogen, progeny and its derivatives An isolated disease produced by culturing an immortalized bovine T cell line selected from the group The original antigen. 12. Said gene under the control of a regulatory sequence capable of expressing a given gene product AGEC-transfected with DNA from a given pathogen encoding the product 1. Culture immortalized mite cells selected from the group consisting of progeny and its derivatives An antigen produced by. 13. Said gene under the control of a regulatory sequence capable of expressing a given gene product DGEC-transfected with DNA from a given pathogen encoding the product 1. Culture immortalized mite cells selected from the group consisting of progeny and its derivatives An antigen produced by. 14. The gene under the control of a regulatory sequence capable of expressing a given gene product Bpbl-transfected with DNA from a given pathogen encoding the product Culturing immortalized bovine T cells selected from the group consisting of T1, progeny and derivatives thereof An antigen produced by 15. AGEC-1, DGEC-1, progeny and its inducers infected with a predetermined pathogen Produced by culturing immortalized mite cells selected from the group consisting of conductors Against a given pathogen consisting of at least one immunogenic amount of pathogenic antigen A vaccine with protective ability. 16. Consists of Bpbl-T1 infected with a given pathogen, progeny and its derivatives Produced by culturing immortalized bovine T cells selected from the group of cell lines Waku with the ability to protect against infection of a given pathogen consisting of immunogenic amounts of pathogenic antigens Chin. 17． The pathogenic antigen is defined under the control of regulatory sequences capable of expressing the pathogenic antigen. Transfecting immortalized bovine T cells with DNA from a given pathogen encoding the antigen The vaccine according to claim 16, which is produced by 18. Against the transmission of certain tick-borne pathogens and against tick infestation A vaccine having protective ability, wherein the vaccine composition comprises AGEC-1, DG From immortalized mite cells selected from the group consisting of EC-1, progeny and derivatives thereof It consists of the resulting immunogenic amount of antigen and antigen from a given tick-borne pathogen. Vaccine characterized by. 19. Certain tick-borne pathogens are associated with Borrelia burgd orferi), Amblyomma americanum, Naplasma marginale, Babes bobis ia bovis), Theileria parva, Koudria luminan Cowdria ruminantium, Ehrlichia species, and arbo The vaccine according to claim 18, which is selected from the group consisting of arbovirus. 20. The pathogenic antigen is a given anti-antibody under the control of regulatory sequences capable of expressing the antigen. Transfecting immortalized mite cells with DNA from a given pathogen encoding the source The vaccine according to claim 19, which is produced by 21. The mite cell antigen is a whole immortalized mite cell, its cell fraction or subunit 19. The protein selected from the group consisting of proteins and macromolecules derived from the mite cells. The described vaccine. 22. Produced by a given pathogen by infecting immortalized mite cells with the pathogen The vaccine according to claim 18, which is 23. Selected from the group consisting of AGEC-1, DGEC-1, progeny and its derivatives Characterized by comprising an immunogenic amount of antigen obtained from selected immortalized mite cells A vaccine having the ability to protect against tick infestation. 24. The mite cell antigen is a whole immortalized mite cell, its cell fraction or subunit 22. selected from the group consisting of proteins and macromolecules derived from said mite cells. The described vaccine. 25. For certain tick-borne pathogens, which consist of in vivo vaccination of animals A method for immunizing an animal against a disease caused by a vaccine composition, comprising: D. antigens and the immortalized mite cells are AGEC-1, DGEC-1, progeny and Characterized in that it is selected from the group consisting of its derivatives, as well as antigens from a given pathogen. Animal immunization method to collect. 26. The pathogen is Borrelia burgdorferi, 26. The method of claim 25, wherein the disease is Lyme disease. 27. Selected from the group consisting of AGEC-1, DGEC-1, progeny and its derivatives Animals with a vaccine consisting of an immunogenic amount of antigen obtained from selected immortalized mite cells Immunization against tick infestation characterized by the step of internal administration to the animal Law. 28. The antigen is (a) a total immortalized mite cell, (b) a cell fraction of an immortalized mite cell, (C) immunogenic proteins or macromolecules of immortalized mite cells, and (d) (a) , A mixture of any one of (b) and (c), The vaccine according to claim 27. 29. Encodes a given antigen under the control of regulatory sequences capable of expressing the antigen Bpbl-T1 transfected with DNA from a given pathogen, progeny and A vaccine consisting of immortalized bovine T cells selected from the group consisting of Animal for diseases caused by certain pathogens characterized by internal administration to food Immunization method. 30. Consists of Bpbl-T1 infected with a given pathogen, progeny and its derivatives In vivo administration of a vaccine composition comprising immortalized bovine T cells selected from the group to animals A method for immunizing an animal against a disease caused by a predetermined pathogen, which comprises: 31. (A) Group consisting of AGEC-1, DGEC-1, progeny and derivatives thereof An immortalized mite cell selected from (b) a cell fraction of the immortalized mite cell, (c) An immunogenic protein or fragment of the immortalized mite cell, and (d) (a), (b) ) And (c) in the presence of an antigen selected from the group consisting of Characterized in that it comprises a step of incubating a body fluid sample collected from an animal. For detecting the presence of a tick-borne pathogen in the body fluids of animals. 32. Selected from the group consisting of AGEC-1, DGEC-1, progeny and its derivatives An antibody specific for a receptor on selected immortalized mite cells. 33. Immortality selected from the group consisting of Bpbl-T1, progeny and derivatives thereof An antibody specific for a receptor on bovine T cells. 34. (A) Group consisting of AGEC-1, DGEC-1, progeny and derivatives thereof An immortalized mite cell selected from (b) a cell fraction of the immortalized mite cell, (c) Immunogenic proteins or fragments of immortalized mite cells, and (d) (a), (b) And an antigen selected from the group consisting of a mixture of any one of (c) Characterized by A therapeutic composition useful for the treatment of tick infestation. 35. (A) Group consisting of AGEC-1, DGEC-1, progeny and derivatives thereof An immortalized mite cell selected from (b) a cell fraction of the immortalized mite cell, (c) An immunogenic protein or fragment of the immortalized mite cell, and (d) (a), (b) And an antigen selected from the group consisting of a mixture of any one of (c) and (c) A diagnostic reagent comprising: 36. (A) selected from the group consisting of Bpbl-T1, progeny and derivatives thereof Whole immortalized bovine cells, (b) cell fraction of immortalized bovine cells, (c) the immortalized bovine cells Vesicle immunogenic protein or fragment, and (d) (a), (b) and (c) Characterized by comprising an antigen selected from the group consisting of a mixture of any one of Diagnostic reagents to collect.