JPH08334489A - 酵素電極ならびにその製造方法および使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 従来の電極の先端部に丸味を付けること、ま
た、電極を酵素膜に当接状態に保持する必要があるこ
と、酵素膜の電極への装着に熟練性が要求されることを
回避する酵素電極を提供する。 【構成】 酵素を用いて電気化学的な方法により試料溶
液中の基質濃度を測定するために使用する酵素電極は、
（１）作用極および対極が露出した面を有して成るベー
ス電極、ならびに（２）測定すべき基質に特異性を持つ
酵素を含む膜を有し、作用極および対極が露出した面と
酵素を含む膜との間には水溶性高分子物質が含まれてい
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、特定の酵素（例えばグ
ルコースオキシダーゼ）と試料溶液中の特定の基質（例
えばグルコース）を反応させ、その時に生じる電気化学
的に検知することができる物質（例えば過酸化水素）の
量を測定することにより試料溶液中の基質の濃度を求め
る場合に使用する酵素電極ならびにその製造方法および
使用方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】試料溶液中のある物質の濃度を測定する
方法として、酵素電極を用いて電気化学的に測定する方
法が使用されている。この方法は、自体周知であり、種
々の利点があるため、近年注目され、臨床検査等の分野
で広く使用されている。試料溶液中の例えばグルコース
の濃度を測定するために、上述の酵素電極を用いる測定
装置として図１に模式的に示すような装置が使用されて
いる。この装置は、測定セル（１）中に入れられた試料
溶液（１１）中のグルコース濃度を電極（３）を用いて
測定するための装置であって、測定セル（１）の側面に
設けた開口部（１５）に酵素膜カートリッジ（５）が配
置されている。

【０００３】このカートリッジ（５）は、図示するよう
に、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）を保持する、好
ましくは固定化状態で保持する酵素保持膜（７）を有し
て成る。電極（３）では、その先端部（９）にて作用極
（例えばＰｔ電極、図示せず）および対極（例えばＡｇ
電極、図示せず）が露出し、また、先端部は丸み（所定
曲率のＲ）を有するように十分に研磨されている。電極
（３）の先端部（９）は、酵素保持膜（７）を測定セル
内に向かう方向（即ち、図１の矢印（Ａ）の方向）に力
を加えられて膜（７）に当接した状態で保持されてい
る。図１では、膜（７）と電極先端部（９）との間には
隙間があるように描いているが、これは、双方の要素を
明確に示して理解し易くするためだけの意図であり、実
際には、この隙間は、実質的に存在せず、膜（７）と電
極先端部（９）とは接触状態にある。

【０００４】測定に際しては、最初に緩衝液を測定セル
内に入れてベース電流値を安定させた後に、測定セル内
を濃度を測定すべき基質を含む試料溶液（１１）と入れ
替え、スターラー（１３）により試料溶液を撹拌し、電
流測定装置（図示せず）に接続した状態で流れる電流値
を測定し、この測定値に基づいて試料溶液中の基質濃度
を求める。尚、測定セル（１）の開口部（１５）は、測
定セル（１）に対してカートリッジ（５）を押し付ける
ように力を加えることによってそれに配置されたＯ−リ
ング（１７）により液漏れが無いように（即ち、液密的
に）封止されている（図示した状態では、Ｏ−リングと
測定セルとの間に隙間があり、液密的に描いていない
が、これは双方の要素を明確に示して理解し易くするた
めだけのものであり、実際にはこれらは液密状態で接触
している。）

【０００５】このような装置を使用して試料溶液中の基
質濃度を測定する場合、カートリッジは、一般的には１
０００〜３０００回の測定に使用され、その間、時間の
経過に伴い酵素保持膜（７）は膨潤してくる。膜が膨潤
した場合、セル内の試料溶液をスターラーにより撹拌し
ているので、膜が揺らぎ、その影響により測定の再現性
が低下するという問題がある。

【０００６】このような問題点を解決するために、図１
に示すような装置を用いて試料溶液中の基質濃度を測定
する場合、矢印Ａの方向にバネ等により常にある程度の
力を加えることにより、膜が膨潤すると自動的に電極
（３）が更に測定セル（１）に向かって（矢印Ａの方向
に）押し付けられ、従って、膜が常に電極先端部と当接
した状態が保持されるように工夫されている。別法で
は、膜の膨張につれて、電極先端部をネジ式に回転して
矢印Ａの方向に進めて膜に対して押し付けるようにする
方式も使用されている。このように、膜（７）が膨潤し
た状態であっても、膜（７）と電極先端部（９）が当接
状態を保持している様子を図２に模式的に示している。
尚、図２では、理解を容易にするために、膜の膨潤を誇
張した状態で模式的に示している。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上述のような方式で膜
と電極先端部との当接状態を維持する場合、図１に示す
ように電極の先端部に丸味を付けることにより、電極と
膜との間で当接状態を維持してその間で隙間が形成され
ないようにすることにより、応力の発生を防止して膜が
電極の周縁部と接する箇所にて膜が損傷を受けにくいよ
うにする必要がある。このように電極の先端部を丸くす
るためには、電極を一つ一つ研磨して先端部を丸めると
いう繊細かつ緻密な作業が必要があり、電極のコストが
高くなるという問題がある。

【０００８】また、図１に示すような電極を使用する場
合、電極先端部と膜との間に気体（空気）が存在する
と、測定値がバラつき、ひどい場合には、測定不能とな
る。そのため、通常は、膜の電極と接する側を緩衝液で
濡らした後、電極と膜とを当接さて電極と膜との間に気
泡が入りにくいように電極（３）をカートリッジ（５）
内に嵌め込むことにより気泡の混入を避けるように操作
されているが、（図では、それほど困難な操作には見え
ないかも知れないが、膜が可撓性を有することもあっ
て）この操作には非常な熟練度が要求されるという問題
がある。そこで、本発明は、これらの問題点を解決すべ
く為されたものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】第１の要旨において、本
発明は、酵素を用いて電気化学的な方法により試料溶液
中の基質濃度を測定するために使用する、（１）それぞ
れ少なくとも１つの作用極および対極が露出した面（以
下、「電極露出面」とも呼ぶ。）を有して成るベース電
極、ならびに（２）測定すべき基質に特異性を持つ酵素
を含む膜（以下、「酵素膜」とも呼ぶ。）を有して成る
酵素電極であって、

【００１０】作用極および対極が露出した面と酵素を含
む膜との間に水溶性高分子物質が含まれていることを特
徴とする酵素電極を提供する。本発明の酵素電極におい
て、酵素を用いる電気化学的な方法とは、試料溶液中に
おいて特定の基質と酵素とを反応させることによって生
成または消滅する電気化学的に検知可能な物質の量を作
用極および対極を介してガルバノスタット的（等電流
的）またはポテンシオスタット的（等電位的）に測定す
る方法であり、この方法は、当該分野においては周知の
ものである。このような電気化学的方法は、例えば特公
平第２−１２６１号公報、特公平第５−１４２２７号公
報、特公平第７−２１４７９号公報に記載されている。

【００１１】本発明の酵素電極において酵素膜に含まれ
る酵素としては、以下のものを例示できる： （１）酸化還元酵素 例えば、シュウ酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダー
ゼ、乳酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ
−アミノ酸オキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、グ
ルコースオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ジア
ミンオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ウリカー
ゼ、ガラクトースオキシダーゼ、アシルコエンザイムＡ
オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ザルコシ
ンオキシダーゼ、パーオキシダーゼ、カタラーゼ、乳酸
脱水素酵素（ＬＤＨ）、グリセロール−３−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ、３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、
３αステロイドデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、
マレートデヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナ
ーゼ

【００１２】（２）加水分解酵素 例えば、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、アスパルタ
ーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ヌクレオシダーゼ、シ
トシンデアミナーゼ、クレアチン・アミノジヒドロラー
ゼ、ウレアーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、アル
カリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ピルビン酸
デカルボキシラーゼ、ウロキナーゼ、ホスホリパーゼ
Ｃ、リパーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ロイシンアミ
ノペプチダーゼ、アミラーゼ、コリンエステラーゼ、ア
ルドラーゼ、プラスミン、トリプシン、リボヌクレアー
ゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、プロテアーゼ、グルコ
アミラーゼ

【００１３】（３）転移酵素 例えば、ピルビン酸キナーゼ、ミオキナーゼ、アシルコ
エンザイムＡシンセターゼ、オルニチンカルバミルトラ
ンスフェラーゼ、クレアチンキナーゼ、アスパラギン酸
アミノトアンスフェラーゼ、アラニンアミノタランスフ
ェラーゼ （４）異性化酵素 例えば、グルタミン酸ラセマーゼ、アラニンラセマー
ゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ。

【００１４】実用的な面および社会的要請の観点から、
なかでも、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、乳酸オ
キシダーゼ（ＬＯＤ）、コレステロールオキシダーゼ、
ウリカーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ等を本発明の酵素
電極に特に好ましく使用できる。また、使用する酵素の
量は、特に限定されるものではなく、例えば目的とする
基質濃度等に応じて容易に選択できる。また、本発明の
酵素電極は、試料溶液中の基質の濃度を測定する。この
試料溶液は、水を主成分とする水性試料であればよい。
例えば血漿のような溶解性成分のみを含む試料溶液であ
っても、血液のような非溶解性成分を含むエマルジョン
であってもよいが、測定すべき基質は、試料溶液中に溶
解している必要がある。

【００１５】本発明の酵素電極を用いて測定できる基質
は、酵素の特異性のため使用する酵素によって決まり、
従って、使用する酵素が選択されれば自動的に決まるも
のであるので、選択されたある酵素を用いた場合にどの
基質の濃度を測定できるかは当業者には自明である。具
体的に例示すると、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）
を使用する場合はグルコース濃度、乳酸オキシダーゼ
（ＬＯＤ）を使用する場合は乳酸濃度、コレステロール
オキシダーゼを使用する場合はコレステロール濃度、ウ
リカーゼを使用する場合は尿酸濃度、ピルビン酸をオキ
シダーゼを使用する場合はピルビン酸濃度がそれぞれ測
定できる。

【００１６】本発明の酵素電極は、作用極および対極が
露出した面を有するが、これらの電極の数および形状な
らびにこれらの電極を構成する材料等は特に限定される
ものではなく、当該分野にて常套的に採用されているも
のを用いることができる。具体的に例示すると、作用極
を露出面が円形（白金製）の極とし、対極を作用極の周
囲に位置する露出面がリング状（銀製）の極としてよ
い。作用極および対極、従って、これらを有する露出電
極面は、酵素膜に対して面するように配置されているの
が好ましい。

【００１７】本発明の酵素電極において、ベース（下
地）電極とは、作用極および対極を共に含む絶縁材料か
ら構成された全体としての電極を意味し、これは電流測
定装置のような電気的装置に電気的に接続され、最終的
にデータ処理機により測定値が得られるようになってい
る。

【００１８】本発明の酵素電極に使用する酵素を含む膜
とは、先に例示したような酵素を保持する膜状要素、好
ましくは酵素が固定化された膜状要素を意味する。本明
細書において、酵素を保持するとは、いずれかの適当な
手段により膜が酵素を移動可能または不可能な状態で有
することを意味し、具体的には、膜と膜との間に酵素が
充填されているようなものおよび何らかの物理的および
／または化学的手段により膜に酵素が結合されているも
のが含まれる。また、酵素が固定化されているとは、上
記の酵素が実質的に移動不可能に結合されている状態を
意味する。

【００１９】更に、膜状要素とは、厚さが薄い膜により
形成された酵素を有する要素を意味し、膜の枚数は特に
限定されるものではないが、好ましくは１枚または２枚
程度であり、より好ましくは２枚の膜の間に酵素が含ま
れているか、あるいは１枚の膜に酵素が結合されてい
る。また、膜の形状は、少なくとも作用極および対極の
双方の一部分、好ましくは少なくとも作用極および対
極、従って、露出電極面を覆うことができるようになっ
ているのが好ましい。このような酵素を含む膜は、周知
であり、また、広く市販されている。

【００２０】この膜状要素に使用する膜は、測定すべき
基質およびそれを溶解する液体（従って、非溶解成分を
除く試料溶液）を通過させるが、後で詳細に説明する水
溶性高分子物質を通過させない程度の孔寸法を有する多
孔性材料である必要がある。このような膜も当該分野で
は周知であり、具体的には、セルロースアセテート膜
（膜孔６Å：水［Ｈ₂Ｏ、分子量１８］や過酸化水素
［Ｈ₂Ｏ₂、分子量３４］等の低分子物質のみ透過可
能）、ポリカーボネート膜（膜孔３０００Å：グルコー
ス［Ｃ₆Ｈ₁₂Ｏ₆、分子量１８０．１６］やアスコルビン
酸［Ｃ₆Ｈ₈Ｏ₆、分子量１７６．１３］が透過可能。も
ちろん水なども透過可能。）を例示できる。

【００２１】このような酵素および膜を考慮して、ま
た、実用的な面も更に考慮すると、本発明の酵素電極に
特に好ましく使用される酵素膜としては、特開昭第５５
−１６４３４９号公報に記載されているようなものを例
示できる。また、市販品としては、東洋紡績株式会社製
グルコースオキシダーゼ膜を例示することができる。

【００２２】本発明の酵素電極において、作用極および
対極が露出する面と酵素膜との間に水溶性高分子物質が
存在している。本発明において、水溶性高分子物質と
は、水に溶解し得る高分子物質を意味し、これは、水分
が少ない場合にはゲルとして存在できるものであっても
よい。また、水溶性高分子物質の混合物を使用すること
も可能である。特に、極性基を有する合成高分子（具体
的には、例えばポリアクリルアミド、ポリビニルアルコ
ール、ボリビニルピロリドン）、多糖類のゲル（具体的
には、例えばアガロース、カルボキシメチルセルロー
ス、アルギン酸ナトリウム）および蛋白質（具体的に
は、例えばコラーゲン、ゼラチン）を例示できる。更
に、とりわけ、ゼラチン、ポリビニルアルコール、カル
ボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、アルギン酸ナトリ
ウムを水溶性高分子物質として使用するのが好ましい。

【００２３】本発明の酵素電極は、少なくとも使用に際
して、水溶性高分子物質は酵素膜により測定セルから隔
離されるようになっている。例えば、図１のように、酵
素膜の外側（即ち、露出電極面に面する側と反対の側、
従って、測定セル側）にＯ−リングのような封止手段を
例えば接着剤により固定し、酵素電極を測定セル側に押
し付けると、酵素電極と測定セルとの液密的な係合が確
保されると同時に、酵素膜が露出電極周縁部にて押し付
け力により実質的に接触し、押し付け力が維持される限
り、この接触状態は維持される。ここで、少なくとも使
用時というのは、使用時、即ち、濃度測定時以外の時、
例えば使用前には酵素膜は露出電極面と接触状態である
必要は必ずしもないことを意味する。従って、本発明の
酵素電極では、その使用前の状態では、酵素膜は水溶性
高分子物質のために露出電極面から離されている状態で
あってもよい。

【００２４】別法では、酵素膜を露出電極面の周縁部に
例えば接着剤により予め結合しておき、酵素膜と露出電
極面の間が水溶液高分子物質により充填されるようにし
てもよい。この場合、酵素膜と露出電極面との間に気泡
が実質的に残らないように留意する必要がある。従っ
て、本発明の酵素電極において、酵素膜の外側に適当な
封止手段、例えばＯ−リングを配置することが好まし
く、酵素電極の使用に際して、酵素電極と測定セルとの
間の封止を確保して、測定セルからの液漏れを防止し、
また、酵素膜の周縁部を露出電極面に接触して固定させ
る。

【００２５】このように、本発明の酵素電極において、
極露出面と酵素膜との間に水溶性高分子物質が存在する
場合、酵素電極の使用に際して酵素膜の周縁部が電極露
出面に固定された場合、測定すべき試料溶液が酵素膜を
介して電極側に浸入して酵素膜と露出電極面との間に存
在する水溶性高分子物質を溶解し、他方、水溶性高分子
物質は酵素膜を通過して測定セル内に拡散して行かず、
その結果、酵素膜と露出電極面との間の圧力が高くな
り、たとえ、酵素膜が膨潤した場合であっても、膜の緊
張状態が維持されて酵素膜がたるむことはなくなると考
えられる。

【００２６】特定の理論により拘束されるものではない
が、本発明の酵素電極において、上述のような作用が得
られるのは、水溶性高分子物質が測定セル側に移動でき
ないので、水溶性高分子物質溶液側の浸透圧が高い状態
で保持されるためであるとも考えられる。また、膨潤の
程度が小さい場合は、水溶性高分子物質が水分を含み
（吸水して）膨張状態となるために、水溶性高分子物質
側が陽圧になるためでもあるとも考えられる。しかしな
がら、これは単なる考え得る可能性であって、真偽のほ
どの確認はできていない。いずれにせよ、酵素膜と露出
電極面との間に水溶性高分子物質が存在する本発明の酵
素電極を使用すると従来技術の問題点を解消できること
は確認できている。

【００２７】第２の要旨において、本発明は、酵素を用
いて電気化学的な方法により試料溶液中の基質濃度を測
定するために使用する、作用極および対極を有して成る
露出電極面を有するベース電極ならびに測定すべき基質
に特異性を持つ酵素膜を有して成る酵素電極の製造方法
であって、（１）露出電極面と酵素膜との間に水溶性高
分子物質溶液を介在させ、（２）水溶性高分子物質溶液
を乾燥することを特徴とする酵素電極の製造方法を提供
する。尚、本発明の製造方法において、酵素電極自体を
構成する要素および材料ならびにそれらの特徴について
は、先に説明した本発明の酵素電極に関する事項が当て
はまる。

【００２８】本発明の製造方法の酵素膜と露出面との間
に水溶性高分子物質溶液を介在させる工程（１）は、例
えば水溶性高分子物質溶液を電極露出面に塗布するこ
と、あるいは電極露出面の部分を水溶性高分子物質溶液
に浸漬することのようないずれかの適当な操作により、
水溶性高分子物質溶液を電極露出面に例えば薄層状また
は半滴状に配置し、その後、配置された水溶性高分子物
質溶液上に酵素膜を載置することにより行うことができ
る。

【００２９】この酵素膜の載置に関しては、水溶性高分
子溶液の薄層の上方から垂直下向きに酵素膜を薄層上に
載置して酵素膜が一度に薄層に相互に接触するようにし
てもよい。この載置方法を、図３に模式的に概念図にて
示している。矢印で示すように、露出電極面（３１）上
に形成した水溶性高分子物質溶液の層（３３）の上方か
ら酵素膜（３５）を実質的に真下方向に下げて、水溶性
高分子物質溶液の層（３３）と酵素膜（３５）が実質的
に同時にかつ相互に接触するようにする。しかしなが
ら、この方法は、水溶性高分子物質溶液が破線で示すよ
うに半滴（３７）状に電極露出面に配置されている場合
に特に好ましい。

【００３０】別法では、水溶性高分子溶液の層の縁部分
と酵素膜の縁部分とを初めに接触させ、膜の可撓性を利
用して、その接触部分から順次接触面積を増やしていく
ようにして水性高分子物質溶液の層に酵素膜を載置す
る。この載置方法を、図４に模式的に概念図にて示して
いる。矢印で示すように、露出電極面（４１）上に形成
した水溶性高分子物質溶液の層（４３）の縁部分（４
７）と酵素膜（４５）の縁部分（４９）とを最初に接触
させ、その後、好ましくは酵素膜の可撓性を利用して、
これらの縁部分に隣接する部分を相互に接触させてい
き、好ましくは縁部分（４７）および（４９）の反対側
の縁部分を最後に相互に接触させるようにして、酵素膜
（４５）を水溶性高分子物質溶液（４３）上に相互に接
触するように載置する。

【００３１】露出電極面に配置する水溶性高分子物質溶
液の量は、水溶性高分子物質の性質、酵素電極の性能等
を考慮して試行錯誤的に選択できるが、一般的には３μ
l程度以上、好ましくは４〜１０μl程度で十分である。
また、水溶性高分子溶液を乾燥させる工程（２）は、工
程（１）の後に比較的穏やかな条件下、例えば室温〜５
０℃程度、好ましくは４０℃程度の温度で空気中にて加
熱炉にて乾燥することにより実施できる。乾燥時間は、
乾燥温度により変化するが、通常１０分〜３０分程度で
十分である。このような条件で穏やかに乾燥すると、露
出電極面上に実質的に溶媒を含まない水溶性高分子物質
の薄層が形成され、その上に酵素膜が隣接して配置され
た構造になり、露出電極面と酵素膜との間には気泡が実
質的に残存しないようになると考えられる。このような
方法では、水溶性高分子物質が接着剤としての機能をも
果たし、酵素膜が露出電極面に固定されるという利点も
ある。

【００３２】本発明の製造方法において、水溶性高分子
物質溶液は、電極露出面および酵素膜に悪影響を与え
ず、取り扱いが容易な溶媒、例えば水、使用する酵素が
反応を行うのに適したｐＨを維持する緩衝液、例えばリ
ン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＴＲＩＳ塩酸緩衝液等、好ま
しくは水に、溶質としての水溶性高分子物質を溶解させ
たものである。この溶液において、水溶性高分子物質の
濃度は、粘度が高くなって露出電極面への溶液の塗布が
困難でないような濃度である必要がある。しかしなが
ら、一般的には、約０．１〜１０重量％、好ましくは約
０．５〜２重量％の水溶性高分子物質を含む溶液で十分
である。

【００３３】第３の要旨において、本発明は、作用極お
よび対極を有して成る露出電極面を有するベース電極な
らびに測定すべき基質に特異性を持つ酵素を有する膜を
有して成る酵素電極であって、露出電極面と酵素膜との
間に水溶性高分子物質が含まれていることを特徴とする
酵素電極を用いて電気化学的な方法により測定セル中の
試料溶液の基質濃度を測定する方法であって、（１）適
当な封止手段を介して測定セルに上記酵素電極を液密的
に装着し、（２）測定セルに測定すべき試料溶液を加
え、（３）酵素膜の周縁部が露出電極面に実質的に接触
する状態を維持し、それにより、酵素膜により露出電極
面および水溶性高分子物質を測定セル中の試料溶液から
隔離し、また、（４）酵素と基質との反応により生成ま
たは消滅する物質の量を電気化学的に測定することを含
んで成る方法を提供する。

【００３４】本発明の測定方法において、使用する酵素
電極は、第１の要旨にて説明した酵素電極であり、好ま
しくは試料溶液を撹拌しながら、測定方法を実施する。
本発明の測定方法において、工程（３）は、酵素膜の周
縁部と露出電極面との間で接触状態を保持することによ
り、水溶性高分子物質が占める酵素膜と露出電極面との
間の空間を測定セルから隔離する。この場合において、
酵素膜と露出電極面との間の空間は測定セルから隔離さ
れていても、測定セル中の溶液は、酵素膜を介してのみ
該空間に入り込むことができる。このような状態を確保
するには、酵素膜の周縁部を露出電極面に対して押し付
けるように力を加えるだけで十分である。具体的には、
例えばＯ−リングを有する酵素膜を測定に際して測定セ
ルに押し付ける方式を採用すればよい。本発明の測定方
法では、第１の要旨にて説明した酵素電極を使用するた
め、酵素膜の弛みの発生が常に防止されるので、再現性
のある測定値を容易に得ることができる。

【００３５】

【作用】先にも説明したように、本発明において、酵素
電極において酵素膜と電極露出面との間に水溶性高分子
物質が介在する場合、そのような酵素電極を使用して試
料溶液中の基質濃度を測定すると、測定回数を重ねるこ
とにより酵素膜が膨潤した場合であっても、酵素膜を通
って電極露出面と酵素膜との間に介在する水溶性高分子
物質内に試料溶液が浸入し、その結果、酵素膜の膨潤の
程度に応じて、水溶性高分子物質が膨潤（膨潤していな
い場合および膨潤の程度が小さい場合）または入ってき
た試料溶液に溶解（膨潤の程度が大きい場合）して電極
露出面と酵素膜との間の体積が増加して、結果的に、測
定セルに対して陽圧を形成するので、酵素膜が弛まない
で緊張状態が常に維持される。この状態を模式的に図５
および図６に電極露出面の部分の断面図にて示す。図５
は、酵素膜が殆ど膨潤していない状態であり、図６は酵
素膜が相当膨潤した状態を模式的概念図に示している。
容易に理解するために、膨潤の程度および水溶性高分子
物質が占める領域は誇張して図示している。

【００３６】図５および図６において、露出電極面の部
分（５１）（電極は図示せず）と酵素膜（５３）との間
に水溶性高分子物質（５５）が存在し、酵素膜（５３）
はその周縁部分においてＯ−リングによる押圧のために
露出電極面（５１）に接触状態で実質的に固定されてい
る。図６の態様では、図５の態様より酵素膜（５３）の
膨潤の程度は相当大きいにも拘わらず、存在する水溶性
高分子物質のために、陽圧を維持できる。

【００３７】

【効果】本発明の酵素電極を使用して試料溶液中の基質
濃度を測定する場合、酵素膜が弛まないで緊張状態が常
に維持されるので、先に説明した従来技術の問題点が容
易に解消される。特に、従来技術の酵素電極では、酵素
膜の膨潤を補償するために露出電極面に丸みを付ける必
要があり、しかも、電極を酵素膜に常に当接状態に維持
するための工夫が必要であったが、本発明により、酵素
膜が弛まないことが確保されるので、露出電極面に丸み
を付ける必要が解消される。従って、露出電極面を平坦
にすることができ、この場合、電極を研磨するに際し
て、一つ一つ研磨しないで、一度に複数の電極の研磨が
可能となり、経済的に有利に酵素電極を製造できる。

【００３８】また、露出電極面が酵素膜に常に当接して
いる状態を維持するための工夫、例えばバネやネジによ
る付勢の必要性が解消され、全体としての電極の構造が
簡素化され、これも酵素電極の製造の経済性に有利であ
る。更に、本発明の酵素電極では、使用前の状態におい
て酵素膜と露出電極面との間には既に実質的に気泡が存
在しない状態で製造されるので、測定セルに酵素電極を
直接装着でき、従来技術の酵素電極を使用するに際して
カートリッジの電極への取り付けに際して気泡が噛み込
まないようにするための熟練度が要求される点も解消で
きる。

【００３９】

【実施例】

（実施例１）市販のグルコースオキシダーゼ膜（東洋紡
績株式会社製）にＯ−リングをエポキシ系接着剤により
接着し、Ｏ−リングの周囲に沿って切り取って酵素膜を
準備した。次に、白金製作用極およびその周囲に位置す
る環状の銀製対極から成る露出電極面を有するベース電
極の露出電極面上に２％ゼラチン水溶液（ゼラチンは、
新田ゼラチン社製、商品名：Ｇ−１９６３０）５μlを
分注し、その上に酵素膜を載置した。この載置した状態
で乾燥機内で４０゜Ｃにて３０分間で乾燥し、本発明の
電極（４本）を得た。

【００４０】このようにして製造された本発明の酵素電
極（７１）の斜視図を図７に、また、その分解斜視図を
図８に模式的に示す。図面において、酵素電極（７１）
は、作用極（７３）および対極（７５）が露出した電極
露出面（７７）を有して成るベース電極（７９）ならび
に測定すべき基質に特異性を持つ酵素膜（８１）を有す
る。酵素膜（８１）には、断面矩形のＯ−リング（８
３）が接着されている。図示した態様では水溶性高分子
物質を示していないが、図８において、露出電極面（７
７）に水溶性高分子物質溶液を分注した後に、矢印Ｂに
示す方向で酵素膜（８１）を載置する。別法では、酵素
膜を先に載置してから、Ｏ−リング（８３）を酵素膜に
結合してもよい。

【００４１】図９に、図７の本発明の酵素電極の露出電
極面（７７）の部分のみを模式的に断面図にて示す。図
示した態様では、水溶性高分子物質（９１）が酵素膜
（８１）と露出電極面（７７）との間に位置することが
理解されよう。尚、理解を容易にするために、酵素膜
（６１）および水溶性高分子物質（９１）の部分は誇張
して図示している。測定に際しては、Ｏ−リング（８
３）の押し付け力により酵素膜（８１）の周縁部（９
３）は露出電極面（７７）に接触して固定され、水溶性
高分子物質（９１）および露出電極面（７７）は測定セ
ル内の試料溶液から隔離される。

【００４２】このような酵素電極を京都第一科学社製の
血糖自動分析装置（商品名：ＧＡ−１１４０）に装着し
た。即ち、評価機のセルの開口部の周囲に本発明の電極
のＯ−リングを押し付けて液密性を確保して装着した。
その後、測定セル内に緩衝液を入れてベース電流を安定
させ（２０〜３０分後）、次に、緩衝液をグルコース標
準液（グルコース濃度：１５０ｍｇ／ｄｌ）を用いて測
定値の再現性を評価した（ｎ＝２０）。

【００４３】（比較例１）実施例１にて使用した評価機
に、市販の酵素電極を標準装着した。この市販の酵素電
極は、京都第一科学社製の商品名：Ｅ−０８として市販
されているものであり、酵素膜が図１に模式的に示すよ
うなカートリッジ形式であり、酵素膜と露出電極面との
間に気泡が入らないように注意してカートリッジを電極
先端部に装着するタイプのものである。この電極の酵素
膜および電極自体は実施例１に使用したものと実質的に
同じである。この装着には、標準装着と呼ばれ、カート
リッジの酵素膜の電極側の面を緩衝液で濡らした後にカ
ートリッジに装着して気泡が噛み込まないようにする方
法を用いた。電極を装着後、実施例１と同様にして測定
値の再現性を評価した。

【００４４】（比較例２）比較例１において緩衝液によ
り酵素膜を濡らすことをしない（酵素膜が乾燥した状態
で装着）以外は、比較例１を繰り返し、測定値の再現性
を評価した。上記実施例１ならびに比較例１および比較
例２の結果をＣ．Ｖ．値にて下記の表１に示す。

【００４５】

【表１】 電極 Ｃ．Ｖ． 実施例１−１ ０．４５ 実施例１−２ ０．６１ 実施例１−３ ０．４９ 実施例１−４ ０．６７ 比較例１ ０．６２ 比較例２ 電極面と酵素膜との間の空気のために測定不能

【００４６】（実施例２）表１から明らかなように、本
発明の酵素電極による測定値のバラつきは従来技術の酵
素電極と少なくとも同等であることが判る。ゼラチンの
種類を変更した以外は、実施例１と同じ酵素電極を作製
し、実施例１と同様に評価した。結果を表２に示す。

【００４７】

【表２】 電極番号 ゼラチン商品名 Ｃ．Ｖ． １ ゼラチンＴｙｐｅ−Ａ（ＳＩＧＭＡ社製） ０．４７ ２ ゼラチンＴｙｐｅ−Ａ（ＳＩＧＭＡ社製） ０．６６ ４ ゼラチンＥＰ（ナカライテスク社製） ０．４７ ７ ゼラチンＥＰ（ナカライテスク社製） ０．３９ １３ 精製ゼラチンＧＲ（ナカライテスク社製） ０．４４ １４ 精製ゼラチンＧＲ（ナカライテスク社製） ０．４７ 表２から明らかなように、本発明の酵素電極では、ゼラ
チンの種類の影響を実質的に受けることはないことが判
る。

【００４８】（実施例３）実施例１と同じ方法で本発明
の酵素電極を作製し、ベース電流安定後および電極装着
２４時間後の双方で標準グルコース水溶液（１５０ｍｇ
／ｄｌ）のグルコース濃度をそれぞれｎ＝２０で５回繰
り返して測定した。尚、評価機としては京都第一科学社
製のＧＡ−１１４０を用いた。

【００４９】それぞれのｎ＝２０の測定値について Ｒ＝｛（測定値の最大値−１５０）の絶対値と（測定値
の最小値−１５０）の絶対値の内の大きい方の数値｝ を求め、その５つのＲを平均してＲ（ａｖｅ）として求
め、測定値のバラ付きの尺度とした。従って、Ｒ（ａｖ
ｅ）は、測定値の実際の濃度からの隔たりを意味し、こ
の値が小さいほど、バラつきが小さいことを意味する。
更に、Ｃ．Ｖ．値についても算出した。

【００５０】（実施例４）電極を測定セルに装着するに
際して、酵素膜を緩衝液により予め濡らしたこと以外は
実施例３を繰り返した。 （比較例３）実施例３のように測定時間を変えた以外
は、比較例１を繰り返して測定値のバラつきを評価し
た。 （比較例４）実施例３のように測定時間を変えた以外
は、比較例２を繰り返して測定値のバラつきを評価し
た。上記実施例３ならびに比較例３および比較例４の結
果を下記の表２に示す。

【００５１】

【表３】 電極 測定時刻 Ｒ（ａｖｅ） Ｃ．Ｖ． 実施例３ ベース電流安定後 ３．０ ０．５０ 装着２４時間後 ２．８ ０．５４ 実施例４ ベース電流安定後 ２．８ ０．５５ 装着２４時間後 ３．０ ０．５１ 比較例３ ベース電流安定後 ２．６ ０．５２ 装着２４時間後 ３．０ ０．５１ 比較例４ 電極面と酵素膜との間に気泡が存在したため測定不能 この表から、明らかなように、本発明の酵素電極のバラ
つきは従来技術のものと少なくとも同等であることが判
る。

【００５２】（実施例５）ゼラチン水溶液の代わりに水
溶性高分子物質水溶液として０．５％カルボキシメチル
セルロース水溶液、１．０％ポリビニルアルコール水溶
液または１．０％アルギン酸ナトリウム水溶液を使用し
た以外は、実施例３を繰り返してＲ（ａｖｅ）および
Ｃ．Ｖ．値を求めた。結果を、以下の表４に示す。

【００５３】

【表４】 水溶性高分子物質 Ｒ（ａｖｅ） Ｃ．Ｖ． カルボキシメチルセルロース ３．４ ０．６６ ポリビニルアルコール ３．２ ０．６２ アルギン酸ナトリウム ２．６ ０．５３ 表４から明らかなように、ゼラチン以外の水溶性高分子
物質を用いた場合であっても、本発明の酵素電極ではバ
ラつきの小さい測定値が得られることが判る。

【００５４】（実施例６および実施例７）本実施例で
は、酵素電極を用いるグルコース濃度測定における妨害
物質であるアスコルビン酸に対する耐性について検討し
た。グルコース標準液にアスコルビン酸を加えてアスコ
ルビン酸濃度が１００ｍｇ／ｍｌまたは５００ｍｇ／ｍ
ｌとなるように標準液を調製した以外は、実施例１（同
じ方法で作製した４つの電極）および実施例２を繰り返
し、それぞれ実施例６および実施例７とした。尚、アス
コルビン酸含有標準液とアスコルビン酸非含有標準液と
を交互に５回測定し、それぞれの回について測定値の差
を求め、これを平均してアスコルビン酸耐性の尺度とし
た。

【００５５】（比較例５および６）比較例１および２と
同様に電極を装着し、実施例６と同様の方法でアスコル
ビン酸耐性を測定し、それぞれ比較例５および比較例６
とした。実施例６および実施例７ならびに比較例５およ
び比較例６の結果を以下の表５に示す。

【００５６】

【表５】 実施例 アスコルビン酸耐性（１００ｍｇ／ｄｌ，５００ｍｇ／ｄｌ） 実施例６−１ ＋０．２／＋０．４ 実施例６−２ ０．０／＋０．８ 実施例６−３ ＋１．０／＋０．４ 実施例６−４ −０．４／＋０．２ 実施例７（ゼラチンＴｙｐｅ−Ａ） −０．４／＋０．４（電極番号１） 実施例７（ゼラチンＴｙｐｅ−Ａ） ＋０．２／＋０．２（電極番号２） 実施例７（ゼラチンＥＰ） ＋０．８／＋２．０（電極番号４） 実施例７（ゼラチンＥＰ） ＋０．４／＋１．２（電極番号７） 実施例７（精製ゼラチンＧＲ） ＋０．４／＋０．２（電極番号１３） 実施例７（精製ゼラチンＧＲ） −２．２／−０．４（電極番号１４） 比較例５ ＋０．６／＋０．８ 比較例６ 酵素膜と電極面との間の気泡のため測定不能 表５から明らかなように、本発明の酵素電極は、従来技
術の酵素電極と少なくとも同等のアスコルビン酸耐性を
有することが判る。

【００５７】（実施例８）種々のグルコース濃度の標準
液を用いて本願発明の酵素電極の応答の直線性を評価し
た。使用した酵素電極は、実施例２において作製したも
の（電極番号１４）と同じものであり、グルコース標準
液のグルコース濃度は、１２５ｍｇ／ｄｌ、２５０ｍｇ
／ｄｌ、５００ｍｇ／ｄｌ、７５０ｍｇ／ｄｌおよび１
０００ｍｇ／ｄｌであった。５種類の標準液を順に測定
し、これを６回繰り返して測定値の平均を求めた。測定
結果を図１０に示す。測定結果から明らかなように、本
発明の酵素電極は広範囲のグルコース濃度にわたって、
精度のある測定結果が得られることが判る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、従来技術の酵素電極を使用する基質
濃度測定セルを模式的に示す断面図である。

【図２】 図２は、膜が膨潤した状態の従来技術の酵素
電極を使用する基質濃度測定セルを模式的に示す断面図
である。

【図３】 図３は、本発明の酵素電極を製造する方法を
示す、模式的断面図である。

【図４】 図４は、本発明の酵素電極を製造する方法を
示す、別の態様の模式的断面図である。

【図５】 図５は、本発明の酵素電極において酵素膜が
殆ど膨潤していない状態を説明するための模式的概念図
である。

【図６】 図６は、本発明の酵素電極において酵素膜が
相当膨潤した状態を説明するための模式的概念図であ
る。

【図７】 図７は、本発明の酵素電極の模式的斜視図で
ある。

【図８】 図８は、図７の酵素電極の模式的分解斜視図
である。

【図９】 図９は、本発明の酵素電極の電極露出面の部
分の模式的断面図である。

【図１０】 図１０は、本発明の酵素電極を用いた場合
のグルコース濃度の測定結果を示すグラフである。

【符号の説明】

１…測定セル、３…電極、５…カートリッジ、７…酵素
膜、９…電極先端部、１１…試料溶液、１３…スターラ
ー、１５…開口部、１７…Ｏ−リング、３１…露出電極
面、３３…水溶性高分子物質溶液、３５…酵素膜、３７
…水溶性高分子物質溶液、４１…露出電極面、４３…水
溶性高分子物質溶液、４５…酵素膜、４７…水溶性高分
子物質溶液、４９…一方の周縁部、５１…露出電極面、
５３…酵素膜、５５…水溶性高分子物質、５７…Ｏ−リ
ング、７１…酵素電極、７３…作用極、７５…対極、７
７…電極露出面、７９…ベース電極、８１…酵素膜、８
３…Ｏ−リング、９１…水溶性高分子物質、９３…酵素
膜周縁部。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 酵素を用いて電気化学的な方法により試
   料溶液中の基質濃度を測定するために使用する、 （１）それぞれ少なくとも１つの作用極および対極が露
   出した面を有して成るベース電極、ならびに（２）測定
   すべき基質に特異性を持つ酵素を含む膜を有して成る酵
   素電極であって、 作用極および対極が露出した面と酵素を含む膜との間に
   水溶性高分子物質が含まれていることを特徴とする酵素
   電極。
2. 【請求項２】 水溶性高分子物質が、ゼラチン、カルボ
   キシメチルセルロース、ポリビニルアルコールおよびア
   ルギン酸ナトリウムから選択される少なくとも１種から
   成る請求項１記載の酵素電極。
3. 【請求項３】 酵素がグルコースオキシダーゼである請
   求項１または２記載の酵素電極。
4. 【請求項４】 酵素を用いて電気化学的な方法により試
   料溶液中の基質濃度を測定するために使用する、作用極
   および対極を有して成る露出電極面を有するベース電極
   ならびに測定すべき基質に特異性を持つ酵素膜を有して
   成る酵素電極の製造方法であって、 （１）露出電極面と酵素膜との間に水溶性高分子物質溶
   液を介在させ、 （２）水溶性高分子物質溶液を乾燥することを特徴とす
   る酵素電極の製造方法。
5. 【請求項５】 水溶性高分子物質が、ゼラチン、カルボ
   キシメチルセルロース、ポリビニルアルコールおよびア
   ルギン酸ナトリウムから選択される少なくとも１種から
   成る請求項４記載の製造方法。
6. 【請求項６】 酵素がグルコースオキシダーゼである請
   求項４または５記載の製造方法。
7. 【請求項７】 作用極および対極を有して成る露出電極
   面を有するベース電極ならびに測定すべき基質に特異性
   を持つ酵素を有する膜を有して成る酵素電極であって、
   露出電極面と酵素膜との間に水溶性高分子物質が含まれ
   ていることを特徴とする酵素電極を用いて電気化学的な
   方法により測定セル中の試料溶液の基質濃度を測定する
   方法であって、 （１）適当な封止手段を介して測定セルに上記酵素電極
   を装着し、 （２）測定セルに測定すべき試料溶液を加え、 （３）酵素膜の周縁部が露出電極面に実質的に接触する
   状態を維持し、それにより、酵素膜により露出電極面お
   よび水溶性高分子物質を測定セル中の試料溶液から隔離
   し、また、 （４）酵素と基質との反応により生成または消滅する物
   質の量を電気化学的に測定することを含んで成る方法。
8. 【請求項８】 水溶性高分子物質が、ゼラチン、カルボ
   キシメチルセルロース、ポリビニルアルコールおよびア
   ルギン酸ナトリウムから選択される少なくとも１種から
   成る請求項７記載の測定方法。
9. 【請求項９】 酵素がグルコースオキシダーゼである請
   求項７または８記載の測定方法。