JPH0833396B2 - 免疫測定用試薬およびそれを用いた免疫測定法 - Google Patents

免疫測定用試薬およびそれを用いた免疫測定法

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JPH0833396B2
JPH0833396B2 JP29887288A JP29887288A JPH0833396B2 JP H0833396 B2 JPH0833396 B2 JP H0833396B2 JP 29887288 A JP29887288 A JP 29887288A JP 29887288 A JP29887288 A JP 29887288A JP H0833396 B2 JPH0833396 B2 JP H0833396B2
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Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は,免疫凝集反応(抗原抗体反応)に基づいて
被測定物質を測定するために用いられる免疫測定用試
薬,および該試薬を用いた感度および精度の高い免疫測
定法に関する。
(従来の技術) 体液中の微量成分などの測定方法のひとつとして,目
的とする被測定物質(抗原または抗体)に該測定物質と
抗原抗体反応しうる物質(抗体または抗原)を作用さ
せ,生じる凝集の度合を測定する免疫測定法が採用され
ている。このような測定法としては,免疫比濁法,ラテ
ックス凝集法などが知られており,凝集による反応系の
濁度の上昇を光学的に測定する方法,粒子数または粒子
径の分布の変化を血球カウンターを用いて測定する方法
などにより測定が行われる。その他,簡単に定性または
半定量を行う場合には,生じた凝集像を目視観察する方
法もとられている。
このような免疫測定法において被測定物質を標準物質
とし,吸光度を測定して検量線を作成する場合,通常,
検量線は免疫反応特有のシグモイド型(S字型)を呈す
る。そのため,反応が直線性を示さない低濃度および高
濃度の範囲において測定結果に誤差が生じやすい。これ
を避けるためには,検量線が直線性を示す濃度範囲で測
定を行うことが好ましいが,それでは測定の範囲が狭く
限られてしまう。より広い濃度範囲における測定を可能
にし,かつ誤差を少なくするために,免疫測定のための
専用の測定システムを用いて検量線を補正する方法が採
用されている。例えば,2種以上の濃度の被測定物質の標
準品を測定してあらかじめ検量線を作成することによ
り,不溶性担体の凝集の度合と検体中の被測定物質(抗
原または抗体)の濃度との正確な関係が明らかとなる。
しかし,標準品を2回以上測定することは手間がかかる
うえにコストも高くなる。そのため,この方法を自動分
析器に応用しようとする場合に多くの制約を与えること
になる。また,この方法においても補正に限界があり十
分に正確な値は得られない。
そこで,免疫反応そのものを直線に近づけようとする
試みも行われている。例えば,特開昭55-151264号公報
には,少なくとも2つの異なった量の同一抗原または抗
体を負荷した2種の異なったサイズ範囲のラテックス粒
子を含有させた試薬および該試薬を用いた測定方法が記
載されている。この試薬および方法を用いると,被測定
物質と抗原抗体反応を行なった場合に,粒径の大きいラ
テックス粒子は早い時期に凝集塊が成長する。粒径の小
さいラテックス粒子はややおくれて凝集塊が成長する。
従って,検量線の低濃度および高濃度領域におけるラテ
ックス粒子の散乱光強度の増加率が一定に近づき,より
広い濃度範囲において正確な測定結果が得られる。しか
し,この試薬および方法を用いた場合にも,測定しうる
濃度範囲および補正に限界があり十分とはいえない。
上記免疫反応を光学的に測定する方法においては,ラ
テックス粒子の吸光度もしくは散乱光強度の増加率が一
定になるような免疫測定用試薬および免疫測定法の開発
が望まれている。
また,免疫反応を目視観察することによる測定方法に
おいては,検出力の高い免疫測定用試薬および免疫測定
法の開発が望まれている。
(発明が解決しようとする課題) 本発明は上記従来の課題を可決するものであり,その
目的とするところは,測定感度および精度に優れた特性
を有する免疫測定用試薬を提供することにある。本発明
の他の目的は,上記優れた特性を有する免疫測定用試薬
を用いて,生体成分などを抗原抗体反応による凝集を利
用して精度よく測定し得る免疫測定法を提供することに
ある。
(課題を解決するための手段) 本発明1の免疫測定用試薬は,抗体Ab1を担持させた
不溶性担体を含む液と,該抗体Ab1に対応する抗原Ag2ま
たは該抗体Ab1に対応する抗体Ab2の所定量とを混合し,
該混合液の吸光度が実質的に一定になるまで,該不溶性
担体の一部を凝集反応させることにより得られる。
本発明2の免疫測定用試薬は,抗原Ag1を担持させた
不溶性担体を含む液と,該抗原Ag1に対応する抗体Ab2の
所定量とを混合し,該混合液の吸光度が実質的に一定に
なるまで,該不溶性担体の一部を凝集反応させることに
より得られる。
本発明3の免疫測定法は,(A)上記抗体Ab1に対応
する抗原Ag2または抗体Ab1に対応する抗体Ab2を含有す
る検体と,本発明1の免疫測定用試薬とを混合して凝集
反応させる工程;および(B)得られた反応液の凝集状
態を光学的に測定し,測定値から検体中の抗原Ag2また
は抗体Ab2の濃度を算出する工程;を包含する。
本発明4の免疫測定法は,(A)上記抗原Ag1に対応
する抗体Ab2を含有する検体と,本発明2の免疫測定用
試薬とを混合して凝集反応させる工程;および(B)得
られた反応液の凝集状態を光学的に測定し,測定値から
検体中の抗体Ab2の濃度を算出する工程;を包含する。
本発明5の免疫測定法は,上記本発明3または4の免
疫測定法において,(A)の工程に続く(B)の工程と
して,(B)得られた反応液の凝集状態を目視観察する
工程;を包含する。
本発明の免疫測定用試薬に使用する不溶性担体として
は,無機物質粉末,有機高分子粉末,微生物,血球,細
胞膜片などが用いられる。無機物質粉末の素材として
は,例えば,金,チタン,鉄,ニッケルなどの金属;ア
ルミナなどの金属酸化物;またはシリカなどのケイ素酸
化物が用いられる。有機高分子粉末の素材としては,例
えば,ポリスチレン,スチレン−スチレンスルホン酸塩
共重合体,メタクリル酸重合体,アクリル酸重合体,ア
クリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体,塩化
ビニル−アクリル酸エステル共重合体,ポリ酢酸ビニル
−アクリレート共重合体などの重合体が用いられる。特
に,これらの重合体の粒子粉末を均一に懸濁させたラテ
ックスが好適に用いられる。ラテックスの平均粒径は被
測定物質の検出方法,検出濃度または測定機器によって
適宜選択されるが,通常0.05〜1.0μmであり,特に0.0
5〜0.5μmが好ましい。
本発明の免疫測定用試薬を調製するには,例えば,ま
ず上記のような不溶性担体に抗体または抗原(抗体Ab1
または抗原Ag1とする)を担持させる。使用する不溶性
担体の濃度は,光学的測定に用いる場合には,通常0.05
〜3mg/ml,好ましくは0.2〜1.0mg/mlであり;目視観察に
用いる場合には,通常0.5〜20mg/ml,好ましくは1.0〜5.
0mg/mlである。この不溶性担体に担持させる抗体Ab1と
しては,モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体
のいずれもが使用され得る。これらのモノクローナル抗
体およびポリクローナル抗体は,一般的な免疫および精
製の工程を採用し,公知の方法により得られる。例え
ば,モノクローナル抗体は,ハイブリドーマを用いる方
法;リンパ腫を引き起こすEBウィルスを用いて特定のB
リンパ球を増やす方法;またはマウス骨髄由来の培養細
胞や酵母などの微生物を遺伝子操作する方法を用いるこ
とにより得られ,各種クロマトグラフィー(例えば,ゲ
ルクロマトグラフィー,イオン交換クロマトグラフィ
ー,アフィニティクロマトグラフィーなど)を組み合わ
せて使用することにより精製される。そして,ポリクロ
ーナル抗体は,例えば,抗原となる物質で適当な動物を
免疫することにより得られ,モノクローナル抗体と同様
の操作を行うこにより精製される。その他,γ−グロブ
リン(免疫グロブリン)またはIgG,およびこれらの抗体
のFc部分を酵素により分解・除去した抗体(例えば,F
(ab′)2)も使用され得る。使用される抗原の種類も
特に限定されない。例えば,タンパク質,ポリペプチ
ド,ステロイド,多糖類,脂質などが,測定の目的に応
じて用いられる。これらの抗体Ab1または抗原Ag1を上記
不溶性担体に担持させるには,通常の化学的結合または
物理的吸着により行うことができる。
次いで,抗体Ab1または好転Ag1を担持させた不溶性担
体に,該抗体Ab1または抗原Ag1に対する抗原または抗体
(抗原Ag2または抗体Ab2とする)の所定量を添加・混合
して該不溶性担体の一部を凝集反応させる。これに用い
る抗原Ag2または抗体Ab2は,測定しようとする被測定物
質と同じであっても異なっていてもよい。例えば,被測
定物質がヒトフィブリノーゲンである場合,抗ヒトフィ
ブリノーゲン兎産生抗体が不溶性担体に担持され,不溶
性担体を一部凝集させるのに用いる抗原Ag2または抗体A
b2としては,ヒトフィブリノーゲンまたは抗兎山羊産生
抗体が使用され得る。このような選択は適宜行なわれ得
る。
本発明の免疫測定用試薬を調製する際に添加する抗原
Ag2または抗体Ab2の量は,次のような量であるのが好ま
しい:得られる試薬を光学的測定法に用いる場合には,
該抗原Ag2または抗体Ab2を添加した後の吸光度が該抗原
Ag2または抗体Ab2を添加する前の不溶性担体(抗体Ab1
または抗原Ag1を担持する)液の吸光度と比較して,2倍
を超えない量であることが好ましく;該試薬を目視観察
による測定法に用いる場合には,該抗原Ag2または抗体A
b2の量は,検体を加える前の試薬において目視観察によ
り凝集が確認できないような量であることが好ましい。
上記抗原Ag2または抗体Ab2の量は不溶性担体の粒径,不
溶性担体に担持された抗体Ab1または抗原Ag1の量,反応
混合液の組成などによって適宜調製される。上記抗原Ag
2または抗体Ab2の量が多すぎると,不溶性担体に担持さ
れた抗体Ab1または抗原Ag1が,該Ag2またはAb2と結合し
て凝集する。そのため,検体を加えても新たに凝集が生
じないか,もしくは凝集物の変化が観察しにくくなる。
逆に,添加する抗原Ag2または抗体Ab2の量が少なすぎる
と,不溶性担体の一部凝集がほとんど起こらないため,
後述の本発明の効果が得られない。
このような抗原Ag2または抗体Ab2と不溶性担体との凝
集反応の反応温度は,0〜50℃の範囲が好ましく,特に20
〜40℃が好適である。反応時間は設定した反応温度によ
る異なるが,通常20分以上が好ましく,例えば,37℃に
おいては20分以上,4℃においては1日以上が好ましい。
このような反応時間を採用することにより,反応液の吸
光度は実質的に一定となる。ここで,吸光度が実質的に
一定である状態とは,凝集反応がほぼ平衡状態に達し,
吸光度の変化がほとんど観察されない(例え吸光度の変
化があったとしても,問題にならない程わずかである)
状態をさす。反応液の吸光度が増加している反応時間を
採用した場合には,後述の本発明の効果が充分には得ら
れない。
このようにして調製された免疫測定用試薬を用いて,
検体中の被測定物質が定性または定量的に測定される。
本発明方法により測定すべき検体は,抗原,抗体などの
免疫学的に活性な被測定物質を含有する試料,特に生体
試料(例えば,血液,胸水,腹水,リンパ液などの体
液;尿,便,汗などの排せつ物;または組織の抽出物な
ど)である。上記検体の測定すべき成分としては,抗原
抗体反応しうる抗原,抗体などの免疫学的に活性なあら
ゆる物質が包含される。つまり従来測定されていた物質
のいずれもが包含される。例えば,アルファフェトプロ
テイン(AFP),フィブリノーゲン(Fg),C反応性タン
パク(CRP),ヒト繊毛膜ゴナドトロピン(HCG),癌胎
児性抗原(CEA)などのタンパクまたはポリペプチド;
多糖類;脂質;ステロイドなどが挙げられる。
本発明方法により検体中に含まれる被測定物質を光学
的に測定するには,例えば,まず検体を反応容器に分注
し,これに上記免疫測定用試薬を分注・混合して反応さ
せる。上記のように,検体中の被測定物質は,不溶性担
体に結合した抗体Ab1または抗原Ag1に対応する物質であ
る。これは上記試薬調製のために少量加えられるAg2ま
たはAb2と同一の場合もあり,異なる場合もある。いず
れの場合も不溶性担体上のAb1またはAg1と反応して凝集
物が形成される。この工程において検体および試薬の分
注の順序は,上記方法の逆でも同時(自動分析装置を用
いる場合)でもよい。反応におけるpHは,通常5〜10で
あり,特にpH6〜8が好ましい。使用される緩衝液とし
てはリン酸緩衝液,トリス緩衝液,グリシン緩衝液など
の通常の緩衝液がある。反応温度は,通常0〜50℃であ
り,20〜40℃が好適に用いられる。凝集反応の時間は,
通常20秒〜30分であり,特に1〜15分が好ましい。
このようにして得られる凝集物の産生量または産生速
度を測定することによって,検体中の被測定物質の濃度
が算出される。例えば,吸光度を1回測定する方法,吸
光度を2回測定する方法(例えば,特公昭58-11575号公
報および特公昭62-43138号公報に記載の方法)などがあ
る。吸光度を測定する代わりに散乱光を測定する方法も
用いられ得る。測定は300〜1000μmの適当な波長で行
うことができるが,ラテックスの粒径に対して十分に長
い波長を用いることが好ましい。このような光学的測定
は,既知の装置によってなされ得る。例えば,吸光度を
測定する通常の分光光度計,光の散乱強度を測定する装
置,粒子数および/または粒子径を測定するための装置
などが用いられる。上記免疫凝集反応を測定するための
専用装置としては,分光光度計を組み込んだ生化学自動
分析装置,免疫比濁法による凝集反応を測定するための
専用装置,フローインジェクションを利用して凝集反応
を測定するための専用装置,ラテックス凝集反応を測定
するための専用装置などがある。その他,通常の用手法
により測定装置セル内で凝集反応を行わせる方法も好適
に用いられる。
被測定物質を定性的に検出する場合には,凝集像を目
視観察する方法が簡便であり,好適に使用され得る。例
えば,検体を平板上に採取し,これに本発明の試薬を加
えて免疫反応を進行させて凝集像の目視観察が行なわれ
る。このときのpH,反応速度などの条件は,上記光学的
測定法の場合と同様である。
(作用) 上記のように、本発明の免疫測定用試薬では,抗体ま
たは抗原を担持させた不溶性担体の一部があらかじめ凝
集している。そのため,試薬中に存在する担体およびそ
の凝集塊により,あるサイズ分布が形成される。そのた
め,この試薬と検体とを混合し,光学的に測定する場合
に、免疫反応に特有のシグモイド型の反応が改良され,
検量線は直線に近づく。従って、一点で検量線の較正を
行なった場合にも正確に検体中の被測定物質が測定され
得る。
この効果は,例えば,実施例1に示したような実験で
証明される。実施例1では,抗ヒトCRP山羊産生抗体を
担持させたラテックスにCRPをごく少量添加することに
よりラテックスの一部を凝集させ,本発明の試薬(抗CR
P-CRPラテックス液)が調製されている。この抗CRP-CRP
ラテックス液にCRPを含有する検体を適当量添加して免
疫反応を行わせ,吸光度の増加(ΔAbs.)を測定する。
検体中のCRP抗原の濃度と吸光度の増加の対応曲線(検
量線)を作成すると,第1図のaのグラフ(実線)が得
られる。第1図には,CRPを含有する検体を添加する前
に,CRPを添加しない場合のΔAbs.と検体中のCRP濃度と
の関係がグラフb(実線)として示されている。図中の
点線(検量直線)は1点較正した場合のCRPの濃度と吸
光度との関係を示す。第1図から明らかなように,検体
中のCRPを添加する前にCRPを添加した場合は,添加しな
い場合と比較して検体中のCRP濃度と吸光度の増加との
対応性が良いことがわかる。このように本発明によれ
ば,例えば,免疫測定のための測定システムを用いて検
量線を補正することなく,広い濃度範囲の測定を精度よ
く行うことが可能である。
凝集反応を目視観察により検出する場合にも,本発明
の試薬中には担体およびその凝集塊によるあるサイズ分
布が形成されている。そのため,被測定物質が低濃度で
あっても精度よく検出される。一般に,検体中に被測定
物質が大過剰に含まれる場合には,形成された凝集物の
架橋が充分に進まないため,肉眼で観察し得る凝集像が
得られない。つまり,被測定物質が大量に存在すると,
凝集物は小さな単位になり検知し得るレベル以下とな
る。これに対して,本発明においては,最初に上記Ag2
またはAb2が加えられているため凝集物の光学的検知レ
ベルがかさ上げされた状態となる。そのため被測定物質
が比較的高濃度であっても陰性になりにくく,凝集像が
観察される。
(実施例) 本発明を以下の実施例につき説明する。
実施例1:CRPの光学的測定 (1)抗CRP抗体感作ラテックス(抗CRP−ラテックス液
の調製) 抗ヒトCRP抗体を1mg/mlの濃度で0.1Mグリシン緩衝液
(pH8.8)に溶解した液10mlに,平均粒径が0.13μmの
ポリスチレンラテックス(固形分10%,積水化学社製)
1mlを添加し,37℃にて60分間撹拌した。次いで,この液
を4℃にて60分間,18,000rpmで遠心分離した。得られた
沈澱物に0.5%ウシ血清アルブミンを含有する0.1Mグリ
シン緩衝液(pH8.8)10mlを添加し,ラテックスを懸濁
させ,抗CRP−ラテックス液を調製した。
(2)抗CRP-CRPラテックス液(a)の調製 上記(1)項で調製した抗CRP−ラテックス液の1mlに
対して,1.0μgのCRPを添加し,37℃にて1時間撹拌・混
合することにより抗CRP-CRPラテックス液(a)を調製
した。これを4℃で保存した。
(3)抗CRP-CRPラテックス液(a)を用いた免疫反応 プラスチック製のキュベット(光路長6mm)に,種々
の濃度の標準CRP液(0.0,2.0,5.0,10.0,20.0,40.0,60.
0,80.0,および100.0μg/ml)3μlと,上記(1)項で
使用したのと同じ0.5%ウシ血清アルブミン含有グリシ
ン緩衝液500μlとをそれぞれ分注した。これに,さら
に上記(2)項で調製した抗CRP-CRPラテックス液
(a)40μlを添加して撹拌・混合し,凝集反応を開始
させた。反応開始後60秒と160秒における吸光度を,分
光光度計を用いてキュベットに波長600nmの光を照射す
ることにより読み取り,光路長1cmの吸光度に換算し
た。この各CRP濃度における60秒後と160秒後の吸光度の
差をA0とした。標準CRP濃度が0μg/mlのときのA0値(A
0CRP=0)と40μg/mlのときのA0値(A0CRP=40)とを基準
とし,各濃度におけるA0に対応するCRPの理論濃度(A
1)を下記式から算出した。次に,実際のCRP濃度とこの
A1との差(A2)を算出した。このA2の値が小さい程,検
量線を描いたときの直線性に優れる。これらの値を表I
に示す。
A1=40×(A0−A0CRP=0)/(A0CRP=40−A0CRP=0(4)抗CRP−ラテックス液を用いた免疫反応 抗CRP-CRPラテックス液(a)の代わりに上記(1)
項で調製した抗CRP−ラテックス液を用いたことを除い
ては,上記(3)項と同様にして吸光度測定および計算
を行った。その結果を表IIに示す。
これらの結果から明らかなように,表Iと表IIのA2値
を比較すると,特にCRP濃度が低値の場合において表I
のA2値のバラツキが小さい。従って,抗CRP-CRPラテッ
クス液(a)を用いるとより直線に近い検量線が得られ
ることがわかる。
実施例2:CRPの光学的測定 (1)抗CRP-CRPラテックス液(b)の調製 実施例1で使用した平均粒径が0.13μmのポリスチレ
ンラテックスの代わりに0.10μmのポリスチレンラテッ
クス(固形分10%,積水化学社製)と0.19μmのポリス
チレンラテックス(固形分10%,積水化学社製)を容量
比1:1に混合したものを用い,実施例1の(1)項と同
様の方法で調製した抗CRP−ラテックス液の1mlに対して
0.5μgのCRPを添加し,4℃にて1日静置することにより
抗CRP-CRPラテックス液(b)を調製した。
(2)抗CRP-CRPラテックス液(b)を用いた免疫反応 抗CRP-CRPラテックス液(b)を用いたこと以外は実
施例1の(3)項と同様にして,凝集反応を開始させ
た。反応開始5分後の吸光度を実施例1の(3)項と同
様にして読み取り,このときの各CRP濃度における吸光
度をA0′とした。
以下,実施例1に準じて,標準CRP濃度が0μg/mlの
ときのA0′値(A0′CRP=0)と40μg/mlのときのA0′値
(A0′CRP=40)とを基準とし,同様にA1′およびA2′を
算出した。その結果を表IIIに示す。
A1′=40×(A0′−A0′CRP=0)/(A0′CRP=40−A0′
CRP=0(3)抗CRP−ラテックス液を用いた免疫反応 抗CRP-CRPラテックス液(b)の代わりに実施例2の
(1)項で調製した抗CRP−ラテックス液を用いたこと
を除いては,上記(2)項と同様にして吸光度測定およ
び計算を行った。その結果を表IVに示す。
これらの結果から明らかなように,表IIIと表IVのA
2′値を比較すると,CRP濃度の低値から高値の広い範囲
にわたって表IIIのA2′値のバラツキが小さい。従っ
て,抗CRP-CRPラテックス液(b)を用いるとより直線
に近い検量線が得られることがわかる。
実施例3:フィブリノーゲン(Fg)の測定 (1)抗フィブリノーゲン山羊産生抗体感作ラテックス
(抗Fg−ラテックス液)の調製 抗Fg抗体を2mg/mlの濃度で0.3Mリン酸緩衝液(pH7.
0)に溶解した液10mlに,平均粒径が0.10μmのポリス
チレンラテックス(固形分10%,積水化学社製)1mlを
添加し,室温にて120分間撹拌した。次いで,この液を
4℃にて60分間,18,000rpmで遠心分離した。得られた沈
澱物に0.2%ウシ血清アルブミンを含有する0.3Mリン酸
緩衝液(pH7.0)10mlを添加し,ラテックスを懸濁さ
せ,抗Fg−ラテックス液を調製した。
(2)抗Fg−抗山羊抗体ラテックス液(a)の調製 上記(1)項で調製した抗Fg−ラテックス液の1mlに
対して10μgの抗山羊抗体を添加し,37℃にて2時間撹
拌・混合することにより抗Fg−抗山羊抗体ラテックス液
(a)を調製した。ここで用いた抗山羊抗体は,山羊Ig
Gをウサギに免疫して得た抗血清から通常の方法で分画
して調製したものである。
(3)抗Fg−抗山羊抗体ラテックス液(a)を用いた免
疫反応 プラスチック製のキュベット(光路長6mm)に,種々
の濃度の標準Fg液(0.0,5.0,10.0,20.0,30.0,40.0,50.
0,および60.0μg/ml)10μlと,上記(1)項で使用し
たのと同じ0.2%ウシ血清アルブミンを含有するリン酸
緩衝液500μlとをそれぞれ分注した。これに,さらに
上記(2)項で調製した抗Fg−抗山羊抗体ラテックス液
(a)40μlを添加して撹拌・混合し,凝集反応を開始
させた。反応開始5分後における吸光度を,分光光度計
を用いてキュベットに波長570nmの光を照射することに
より読み取り,光路長1cmの吸光度に換算した。この吸
光度をA0′とした。
以下、実施例1に準じて,標準Fg濃度が0μg/mlのと
きのA0′値(A0′Fg=0)と30μg/mlのときのA0′値(A
0′Fg=30)とを基準とし,同様にA1′およびA2′を算出
した。その結果を表Vに示す。
A1′=30×(A0′−A0′Fg=0)/(A0′Fg=30−A0′
Fg=0(4)抗Fg−ラテックス液を用いた免疫反応 抗Fg−抗山羊抗体ラテックス液(a)の代わりに上記
(1)項で調製した抗Fg−ラテックス液を用いたことを
除いては,上記(3)項と同様にして吸光度測定および
計算を行った。その結果を表VIに示す。
これらの結果から明らかなように,表Vと表VIのA2′
値を比較すると,特にFg濃度が低値の場合において表V
のA2′値のバラツキが小さい。従って,抗Fg−抗山羊抗
体ラテックス液(a)を用いるとより直線に近い検量線
が得られることがわかる。
実施例4:CRPのラテックス凝集目視観察による測定 (1)抗CRP抗体感作ラテックス(抗CRP−ラテックス液
の調製) 平均粒径が0.13μmのポリスチレンラテックスのかわ
りに0.26μmのポリスチレンラテックス(固形分10%,
積水化学社製)を用いたこと以外は,実施例1と同様に
して抗CRP−ラテックス液を調製した。
(2)抗CRP-CRPラテックス液(a′)の調製 上記(1)項で調製した項CRP−ラテックス液の1mlに
対して0.1μgのCRPを添加し,37℃にて1時間静置する
ことにより抗CRP-CRPラテックス液(a′)を調製し
た。
(3)抗CRP-CRPラテックス液(a′)を用いたラテッ
クス凝集反応および抗CRP−ラテックス液を用いたラテ
ックス凝集反応の比較 標準CRP液(0.0,0.2,0.5,1,10,50,100,200,500および
1000μg/ml)50μlのそれぞれを判定板に採り,これに
抗CRP-CRPラテックス液(a′)または抗CRP−ラテック
ス液の50μlを滴下し,混和した。判定板を手に持ち,
ゆるやかに揺動し,1分後と3分後に凝集像をそれぞれ肉
眼で目視観察した。
結果を表VIIに示す。表の上段には抗CRP-CRPラテック
ス液(a′)を用いた場合の結果を,そして下段には抗
CRP−ラテックス液を用いた場合の結果を示す。表VIIの
各濃度において,左列は1分後の観察結果を,そして右
列は3分後の観察結果を示す。
この結果から明らかであるように,抗CRP-CRPラテッ
クス液(a′)を用いるとCRPが0.2μg/mlの低濃度から
検出でき,抗CRP−ラテックス液を用いた場合の検出限
界である1μg/mlに比べてかなり感度よく検出できるこ
とがわかる。さらに,抗CRP−ラテックス液を用いたと
きに,CRPが500μg/mlという高濃度では,陰性に変化し
ている。これに対して,抗CRP-CRPラテックス液
(a′)を用いると500μg/ml以上の領域においても陽
性(+)が維持され,広い濃度範囲にわたってCRPを検
出できることがわかった。
実施例5:Fgのラテックス凝集目視観察による測定 (1)抗Fg山羊産生抗体感作ラテックス(抗Fg−ラテッ
クス液)の調製 平均粒径が0.10μmのポリスチレンラテックスのかわ
りに0.32μmのポリスチレンラテックス(固形分10%,
積水化学社製)を用いたこと以外は,実施例3と同様に
して抗Fg−ラテックス液を調製した。
(2)抗Fg-Fgラテックス液の調製 上記(1)項で調製した抗Fg−ラテックス液の1mlに
対して1μgのFgを添加し,4℃にて1日間静置すること
により抗Fg-Fgラテックス液を調製した。
(3)抗Fg-Fgラテックス液を用いたラテックス凝集反
応および抗Fg−ラテックス液を用いたラテックス凝集反
応の比較 標準Fg液(0.0,0.1,0.5,1,10,50,100および200μg/m
l)50μlを判定板に採り,これに抗Fg-Fgラテックス液
または抗Fg−ラテックス液の50μlを滴下し,混和し
た。判定板を手に持ち,ゆるやかに揺動し,1分後および
3分後に凝集像をそれぞれ肉眼で目視観察した。
結果を表VIIIに示す。表の上段には抗Fg-Fgラテック
ス液を用いた場合の結果を,そして下段には抗Fg−ラテ
ックス液を用いた場合の結果を示す。表VIIIの各濃度に
おいて,左列は1分後の観察結果を,そして右列は3分
後の観察結果を示す。
この結果から明らかであるように,抗Fg-Fgラテック
ス液を用いるとFg濃度が0.1μg/mlから検出でき,抗Fg
−ラテックス液を用いた場合の検出限界である1μg/ml
に比べてかなり感度よく検出できることがわかる。さら
に,抗Fg−ラテックス液を用いたときに,Fgが200μg/ml
という高い濃度では,1分後には陰性を示し反応が弱くな
っている。これに対して,抗Fg-Fgラテックス液を用い
ると200μg/ml以上の領域においても陽性(+)が維持
され,広い濃度範囲にわたってFgを検出できることがわ
かった。
実施例6:Fgのラテックス凝集目視観察による測定 (1)抗Fg−抗山羊抗体ラテックス液(a′)の調製 実施例5の(1)項で調製したFg−ラテックス液の1m
lに対して10μgの抗山羊抗体を添加し,4℃にて1日静
置することにより抗Fg−抗山羊抗体ラテックス液
(a′)を調製した。ここで用いた抗山羊抗体は,実施
例3の(2)項と同様の方法で山羊IgGをウサギに免疫
して得た抗血清から調製したものである。
(2)抗Fg−抗山羊抗体ラテックス液(a′)を用いた
ラテックス凝集反応および抗Fg−ラテックス液を用いた
ときの判定結果の比較 抗Fg-Fgラテックス液の代わりに抗Fg−抗山羊抗体ラ
テックス液(a′)を用いたことを除いては実施例5と
同様にしてFgの測定を行い,凝集像を目視観察した。
結果を表IXに示す。表の上段には抗Fg−抗山羊抗体ラ
テックス液(a′)を用いた場合の結果を,そして下段
には抗Fg−ラテックス液を用いた場合の結果を示す。表
IXの各濃度において,左列は1分後の観察結果を,そし
て右列は3分後の観察結果を示す。
この結果から明らかであるように,抗Fg−抗山羊抗体
ラテックス液(a′)を用いると,実施例5の抗Fg-Fg
ラテックス液を用いた場合と同様の結果が得られた。こ
のように,抗Fg−抗山羊抗体ラテックス液(a′)を用
いると広い濃度範囲にわたってFgを検出できることがわ
かった。
(発明の効果) 本発明によれば,このように,免疫反応を利用した種
々の物質の定量が,より高感度および高精度で行われ
る。この方法を利用して,例えば,α−フェトプロテイ
ン(AFP),フィブリノーゲン(Fg),C反応性タンパク
(CRP),ヒト絨毛膜ゴナドトロピン(HCG),癌胎児性
抗原(CEA)などの各種物質の定量が効果的になされ
る。そのため本発明の試薬および方法は,疾病の診断お
よび治療のための臨床検査などの分野に広く利用され得
る。
【図面の簡単な説明】
第1図は,本発明および従来の免疫測定用試薬を用いて
CRPを測定したときの検量直線と,対応曲線との関係を
示すグラフである。

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】抗体Ab1を担持させた不溶性担体を含む液
    と,該抗体Ab1に対応する抗原Ag2または該抗体Ab1に対
    応する抗体Ab2の所定量とを混合し,該混合液の吸光度
    が実質的に一定になるまで,該不溶性担体の一部を凝集
    反応させることにより得られる,免疫測定用試薬。
  2. 【請求項2】抗原Ag1を担持させた不溶性担体を含む液
    と,該抗原Ag1に対応する抗体Ab2の所定量とを混合し,
    該混合液の吸光度が実質的に一定になるまで,該不溶性
    担体の一部を凝集反応させることにより得られる,免疫
    測定用試薬。
  3. 【請求項3】(A)特許請求の範囲第1項に記載の抗体
    Ab1に対応する抗原Ag2または抗体Ab1に対応する抗体Ab2
    を含有する検体と,特許請求の範囲第1項に記載の免疫
    測定用試薬とを混合して凝集反応させる工程;および (B)得られた反応液の凝集状態を光学的に測定し,測
    定値から検体中の抗原Ag2または抗体Ab2の濃度を算出す
    る工程; を包含する免疫測定法。
  4. 【請求項4】(A)特許請求の範囲第2項に記載の抗原
    Ag1に対応する抗体Ab2を含有する検体と,特許請求の範
    囲第2項に記載の免疫測定用試薬とを混合して凝集反応
    させる工程;および (B)得られた反応液の凝集状態を光学的に測定し,測
    定値から検体中の抗体Ab2の濃度を算出する工程; を包含する免疫測定法。
  5. 【請求項5】特許請求の範囲第3項または第4項に記載
    の免疫測定法において,(B)の工程が, (B)得られた反応液の凝集状態を目視観察する工程;
    である免疫測定法。
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