JPH0827184A - Peptide compound, its production and anti-human immunodeficiency viral agent - Google Patents
Peptide compound, its production and anti-human immunodeficiency viral agentInfo
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- JPH0827184A JPH0827184A JP6186385A JP18638594A JPH0827184A JP H0827184 A JPH0827184 A JP H0827184A JP 6186385 A JP6186385 A JP 6186385A JP 18638594 A JP18638594 A JP 18638594A JP H0827184 A JPH0827184 A JP H0827184A
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、ペプチド化合物に関
し、特に、抗HIV(抗ヒト免疫不全ウイルス)活性物
質NP−06及びその製造方法、並びに、該抗HIV活
性物質を有効成分として含有する抗HIV剤に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a peptide compound, and more particularly to an anti-HIV (anti-human immunodeficiency virus) active substance NP-06, a method for producing the same, and an anti-HIV active substance-containing anti-HIV active substance as an active ingredient. Regarding HIV agents.
【0002】[0002]
【従来の技術】近年、後天性免疫不全疾患(以下AID
Sと略称する)の患者は全世界的に増加傾向にある。特
にアジア、アフリカ地域においては、AIDSの原因で
あるHIVの感染爆発の状態にあり、今後AIDS患者
はこれらの地域を中心に急増すると考えられている。2. Description of the Related Art In recent years, acquired immunodeficiency diseases (hereinafter referred to as AID
The number of patients referred to as S) is increasing worldwide. Particularly in Asia and Africa, HIV, which is the cause of AIDS, is in a state of infection and explosion, and it is considered that AIDS patients will rapidly increase mainly in these areas in the future.
【0003】HIVは、RNAを遺伝子本体とするレト
ロウイルス科のウイルスである。HIVの感染は、血液
中に侵入したウイルス粒子が、該ウイルス粒子表面に有
するgp−120と呼ばれる糖タンパクを介してT細胞
表面に存在するCD4(クラスター オブ ディフェレ
ンシエイション アンチゲン 4)タンパクと特異的に
結合する吸着過程から始まる。細胞表面に吸着したウイ
ルス粒子は、細胞中にHIV遺伝子(RNA)を放出し
て脱殻し、次いでHIV遺伝子が逆転写酵素によりDN
Aに書き換えられる(逆転写過程)。そして、DNAに
書き換えられたHIVの遺伝情報が、更に、インテグラ
ーゼにより宿主細胞のDNA中に組み込まれる組み込み
過程を経て、ウイルス感染が成立する。HIV is a virus of the family of retroviridae, which has RNA as a gene body. HIV infection is specific to the CD4 (cluster of differentiation antigen 4) protein present on the surface of T cells through a glycoprotein called gp-120 on the surface of the virus particles, which virus particles invaded into the blood. It begins with an adsorption process that physically binds. The virus particles adsorbed on the cell surface release the HIV gene (RNA) into the cells to unshell, and the HIV gene then undergoes DN transcription by reverse transcriptase.
It is rewritten to A (reverse transcription process). Then, the HIV genetic information rewritten in DNA is further incorporated into the DNA of the host cell by integrase, and the viral infection is established.
【0004】感染した細胞内では、ウイルスの遺伝情報
を基にウイルス蛋白が生産される。生産されたウイルス
蛋白には、TatやRevと呼ばれるウイルス増殖制御
因子として作用する蛋白の存在することが明らかにされ
ている。宿主細胞内で生産されたウイルス蛋白は、プロ
テアーゼにより分割されたり、グリコシターゼにより糖
鎖が修飾されることにより、ウイルス構成蛋白質へと変
換される(成熟過程)。次に、合成されたウイルス蛋白
質とウイルス遺伝子とが集まり、新たなウイルス粒子が
形成される(パッケージング過程)。In infected cells, viral proteins are produced based on the genetic information of the virus. It has been clarified that the produced viral proteins include proteins called Tat and Rev that act as viral growth regulators. The viral protein produced in the host cell is converted into a viral constituent protein by cleavage with protease or modification of sugar chain by glycosidase (maturation process). Next, the synthesized viral proteins and viral genes are assembled to form new viral particles (packaging process).
【0005】新しく産生されたウイルス粒子は細胞外に
放出され(放出過程)、新たな細胞に感染していく。H
IVの感染により、免疫細胞は本来有する免疫機能を消
失し、或いは巨細胞形成を起こすことにより、通常、細
胞死に至る。HIVに感染した患者は、免疫細胞の減少
により極度の免疫不全状態に陥り、サイトメガロウイル
スやカリニ原虫といった病原菌による、日和見感染症が
引き起こされる。そこで現在では、ウイルスの細胞内増
殖或いは細胞感染を阻害する薬物を投与するという薬物
治療が、感染患者の免疫機能回復或いは延命効果をもた
らすと考えられている。The newly produced virus particles are released outside the cell (release process) and infect new cells. H
Upon infection with IV, immune cells lose their inherent immune function or cause giant cell formation, which usually leads to cell death. HIV-infected patients are severely immunodeficient due to the loss of immune cells, which causes opportunistic infections due to pathogenic bacteria such as cytomegalovirus and carinii protozoa. Therefore, at present, it is considered that drug treatment of administering a drug that inhibits intracellular proliferation of virus or cell infection brings about the effect of recovering immune function or prolonging the life of infected patients.
【0006】最近では、HIVのヒト免疫細胞(T細
胞)における生活環(ライフサイクル)についてより詳
しい解明がなされつつあり、特に、ウイルスの増殖に関
与する酵素や、レセプターの阻害活性を有する化合物
に、AIDS治療薬としての可能性が見い出されてい
る。ところで、現在、AZT(アジトチミジン)、DD
C(ジデオキシシチジン)、DDI(ジデオキシイノシ
ン)という3種類の核酸系化合物が、AIDSの治療薬
として認可を受けている。これらの核酸系の薬物はHI
Vのライフサイクルにおける逆転写過程に作用すること
により、抗HIV活性を発現する。[0006] Recently, the life cycle of HIV in human immune cells (T cells) has been elucidated in more detail, and in particular, the compounds having the inhibitory activity of the enzyme and the receptor involved in the growth of the virus are being investigated. , Has found potential as a therapeutic agent for AIDS. By the way, currently AZT (azitothymidine), DD
Three types of nucleic acid compounds, C (dideoxycytidine) and DDI (dideoxyinosine), have been approved as therapeutic agents for AIDS. These nucleic acid drugs are HI
It exerts anti-HIV activity by acting on the reverse transcription process in the V life cycle.
【0007】しかしながら、これらの核酸系化合物を用
いて薬物治療を行った場合には、薬剤耐性株の出現によ
り抗HIV活性が減少或いは消失するという問題や、強
い副作用等があるために長期間連続投与することが不可
能であるという問題が明らかとなっており、現在の認可
薬のみによるAIDS治療には限界がある。このような
現状から、将来のAIDS治療は、異なる作用機作を有
する複数の薬物を用いた併用療法が主流になると考えら
れている。そこで、現在、新たに、吸着阻害剤、脱殻阻
害剤、非核酸系逆転写阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、T
at阻害剤、グリコシル化阻害剤等を中心に、HIVの
増殖を特異的に抑える化合物の探索と開発が全世界的に
進められている。However, when drug treatment is carried out using these nucleic acid compounds, there is a problem that anti-HIV activity decreases or disappears due to the emergence of drug-resistant strains, and there are strong side effects and so on, which results in long-term continuous use. The problem of inability to administer has become clear, and there is a limit to the current treatment of AIDS with only approved drugs. Under such circumstances, it is considered that future AIDS treatment will be predominantly a combination therapy using a plurality of drugs having different modes of action. Therefore, at present, a new adsorption inhibitor, deshelling inhibitor, non-nucleic acid reverse transcription inhibitor, protease inhibitor, T
The search and development of compounds that suppress HIV growth specifically are being promoted worldwide, centering on at inhibitors and glycosylation inhibitors.
【0008】例えば、吸着阻害剤としては、CD4を可
溶性にした可溶性CD4(D.H.Smith,R.A.Byrn,S.A.Mar
sters,T.Gregory,J.E.Groopman and D.J.Capon, Scienc
e,238,1704(1987)他) 、デキストラン硫酸、ヘパリン硫
酸等の硫酸化多糖類(M.A.Skinner,R.Ting,A.Langlois,
K.J.Weinhold,H.K.Lyerly,K.Javaherian and,T.J.Matth
ews, AIDS Res.Hum.Retorovirus,4,187(1988)他) ;[0008] For example, as an adsorption inhibitor, soluble CD4 (DHSmith, RAByrn, SAMar) obtained by solubilizing CD4 is used.
sters, T.Gregory, JEGroopman and DJCapon, Scienc
e, 238,1704 (1987)), dextran sulfate, heparin sulfate, and other sulfated polysaccharides (MA Skinner, R. Ting, A. Langlois,
KJWeinhold, HKLyerly, K.Javaherian and, TJMatth
ews, AIDS Res. Hum. Retorovirus, 4,187 (1988) and others);
【0009】非核酸系逆転写阻害剤としては、TIBO
(テトラヒドロ−イミダゾ−ベンゾジアゼピン−オン
アンド−チオン)(Pauwels,R.,Andries,K.,Desmyter,
J.,et.al.,Nature(ネイチャー),343:470(1990)他) 、
HEPT(1−〔(2−ヒドロキシエトキシ)メチル〕
−6−(フェニルチオ)チミン)(Miyasaka,T.,Tanaka,
H.,Baba,M.,Hayakawa,H.,et.al.,J.Med.Chem.(ジャーナ
ルオブメデカルケミストリー),32,2507(1989)) 、プロ
テアーゼ阻害剤としては、Ro 31-8959(Roberts,N.A.,Ma
rtin,J.A.,Kinchington,D.,et.al.,Science,(サイエン
ス)248,358(1990))、KNI-272(Mimoto,T.,Imai,J.,Kisa
nuki,S.,Enomoto,H.,et.al.,Chem.Pharm.Bull.(ケミカ
ルファーマシュ−ティカルブルティン),40,2251(199
2)) 等が見い出されている。As a non-nucleic acid reverse transcription inhibitor, TIBO
(Tetrahydro-imidazo-benzodiazepin-one
And Thion) (Pauwels, R., Andries, K., Desmyter,
J., et.al., Nature, 343: 470 (1990) and others),
HEPT (1-[(2-hydroxyethoxy) methyl]
-6- (Phenylthio) thymine) (Miyasaka, T., Tanaka,
H., Baba, M., Hayakawa, H., et.al., J.Med.Chem. (Journal of Medical Chemistry), 32, 2507 (1989)), as a protease inhibitor, Ro 31-8959 ( Roberts, NA, Ma
rtin, JA, Kinchington, D., et.al., Science, (Science) 248,358 (1990)), KNI-272 (Mimoto, T., Imai, J., Kisa
nuki, S., Enomoto, H., et.al., Chem.Pharm.Bull. (Chemical Pharma-Tikal Burtin), 40,2251 (199
2)) etc. are found.
【0010】又、新たな化合物の可能性を求めて、天然
物から抗HIV活性物質を探索することも全世界的に行
われるようになりつつあり、既に、例えばRP−719
55(Gerard,H.,Catherine,D.,Jean-Francois,M.and Je
an,L.,J.Antibiotics,(ジャーナルオブアンチバイオテ
ィクス)46,1756(1993))等の抗HIV活性物質が見つか
っている。しかしながら、抗HIV作用に優れると共に
低毒性である抗HIV剤、或いは、抗HIV剤となりう
るリード化合物は未だ見い出されてない。[0010] In addition, searching for anti-HIV active substances from natural products in search of the possibility of new compounds is becoming popular all over the world, and already, for example, RP-719.
55 (Gerard, H., Catherine, D., Jean-Francois, M. and Je
Anti-HIV active substances such as an, L., J. Antibiotics, (Journal of Antibiotics) 46, 1756 (1993) have been found. However, an anti-HIV agent having excellent anti-HIV activity and low toxicity, or a lead compound which can be an anti-HIV agent has not been found yet.
【0011】[0011]
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者等
は、in vitroにおいて効果的に抗HIV活性を測定でき
るスクリーニング法(MTTアッセイ法)により、土壌
から分離された微生物の二次代謝産物をスクリーニング
した結果、特に、抗HIV作用に優れ、且つ低毒性の抗
HIV剤となりうるリード化合物及びその製造方法を見
出し、本発明に到達した。Therefore, the present inventors have investigated the secondary metabolites of microorganisms isolated from soil by a screening method (MTT assay method) which can effectively measure anti-HIV activity in vitro. As a result of the screening, a lead compound which has an excellent anti-HIV activity and can be a low-toxicity anti-HIV agent and a method for producing the same have been found, and the present invention has been completed.
【0012】従って、本発明の第1の目的は、抗HIV
作用に優れると共に低毒性である抗HIV剤となりうる
リード化合物を提供することにある。また、本発明の第
2の目的は、抗HIV作用に優れると共に低毒性である
抗HIV剤となりうるリード化合物の製造方法を提供す
ることにある。更に、本発明の第3の目的は、抗HIV
作用に優れると共に低毒性である抗HIV剤となりうる
リード化合物を有効成分とする抗HIV剤を提供するこ
とにある。Therefore, the first object of the present invention is to provide anti-HIV
An object of the present invention is to provide a lead compound which is an anti-HIV agent having excellent action and low toxicity. A second object of the present invention is to provide a method for producing a lead compound which is excellent in anti-HIV action and has low toxicity and can be an anti-HIV agent. Furthermore, the third object of the present invention is to provide anti-HIV
It is an object of the present invention to provide an anti-HIV agent containing a lead compound as an active ingredient, which has an excellent action and can be an anti-HIV agent having low toxicity.
【0013】[0013]
【課題を解決するための手段】本発明の上記の諸目的
は、下記化2で表されるペプチド化合物、及びその製造
方法、並びにそれを有効成分とする抗HIV剤によって
達成された。The above-mentioned various objects of the present invention have been achieved by a peptide compound represented by the following chemical formula 2, a method for producing the same, and an anti-HIV agent containing the same.
【化2】 Embedded image
【0014】以下本発明について詳述する。本発明者等
は、抗HIV作用に優れた抗HIV剤を提供することを
目的として、in vitro において効果的に抗HIV活性
を測定できるスクリーニング法(MTTアッセイ法)を
用いた。この方法は、HIV感染によって引き起こされ
るCD4陽性細胞の感染死と、薬剤による前記感染死の
抑制を判定するものであり、抗HIV活性と細胞毒性を
同時に、且つ、簡便に測定することが可能である優れた
方法である。The present invention will be described in detail below. The present inventors used a screening method (MTT assay method) capable of effectively measuring anti-HIV activity in vitro for the purpose of providing an anti-HIV agent excellent in anti-HIV action. This method is for determining the infection death of CD4-positive cells caused by HIV infection and the suppression of the infection death by a drug, and anti-HIV activity and cytotoxicity can be measured simultaneously and easily. There is an excellent way.
【0015】本発明者らは、このスクリーニング法を用
いて、土壌から分離された微生物の二次代謝産物をスク
リーニングするうちに、特に抗HIV作用に優れた物質
を見い出し、これをNP−06と命名した。上記の抗H
IV活性物質NP−06は、前記化2で表される構造を
有すると共に、以下の理化学的性質を有する物質であ
る。The present inventors used this screening method to screen the secondary metabolites of microorganisms isolated from soil, and found a substance particularly excellent in anti-HIV activity, which was designated as NP-06. I named it. Anti-H above
The IV active substance NP-06 is a substance having the structure represented by Chemical Formula 2 and having the following physicochemical properties.
【0016】性状:白色粉末 分子式:C97H131 O26N23S4 分子量:2163 溶解性:メタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチル
スルホキシドに易溶、水、酢酸エチル、クロロホルムに
難溶 酸加水分解生成物:グリシン(4)、シスチン(2)、
アラニン(2)、バリン(2)、フェニルアラニン
(2)、ロイシン(1)、アスパラギン酸(2)、セリ
ン(1)、イソロイシン(1)、チロシン(1) IR(KBr)cm-1:701,746,1178,1219,1337,1390,
1407,1454,1517,1649(C=O),2934,2964,3009,3082(C=C),
3306,3317,3376,3387(OH,NH) 旋光度:[α]D 20=−75°(C0.1%,MeO
H) 尚、構造決定に際しては、アミノ酸分析、MASSスペ
クトル測定、IR測定から得られたデータを基に、各種
NMR測定及び化学的分解手法を用いた。Properties: White powder Molecular formula: C 97 H 131 O 26 N 23 S 4 Molecular weight: 2163 Solubility: Easily soluble in methanol, dimethylformamide and dimethylsulfoxide, sparingly soluble in water, ethyl acetate and chloroform Acid hydrolysis product : Glycine (4), cystine (2),
Alanine (2), valine (2), phenylalanine (2), leucine (1), aspartic acid (2), serine (1), isoleucine (1), tyrosine (1) IR (KBr) cm -1 : 701,746, 1178,1219,1337,1390,
1407,1454,1517,1649 (C = O), 2934,2964,3009,3082 (C = C),
3306,3317,3376,3387 (OH, NH) Optical rotation: [α] D 20 = -75 ° ( C 0.1%, MeO
H) In determining the structure, various NMR measurements and chemical decomposition methods were used based on the data obtained from amino acid analysis, MASS spectrum measurement, and IR measurement.
【0017】本発明のNP−06は、先にGerard等によ
って報告されているRP−71955(Gerard,H.,Cath
erine,D.,Jean-Francois,M.,and Jean,L.,J.Antibiotic
s,46,1756(1993))と同じアミノ酸組成を有し、アミノ酸
配列においても非常に類似した構造を有していることが
明らかになった。即ち、NP−06とRP−71955
との相違点は、2箇所においてアミノ酸の種類が異なっ
ていることである。The NP-06 of the present invention is RP-71955 (Gerard, H., Cath, previously reported by Gerard et al.
erine, D., Jean-Francois, M., and Jean, L., J.Antibiotic
s, 46, 1756 (1993)), and it was revealed that they have a very similar structure in amino acid sequence. That is, NP-06 and RP-71955
The difference is that the types of amino acids are different at the two positions.
【0018】本発明の抗HIV活性物質NP−06は、
山口県寂地峡から採取された土壌から分離された、スト
レプトミセス属に属する微生物SKH−2344株を培
養して得られた培養物から単離され、従って、発明のN
P−06は、SKH−2344株を栄養源含有培地に接
種し、好気的に培養することにより製造されるが、本発
明で使用することのできるNP−06の生産菌は上記の
菌株に限らず、ストレプトミセス属に属しNP−06を
生産する能力を有するものであればよい。The anti-HIV active substance NP-06 of the present invention is
It is isolated from a culture obtained by culturing a microorganism SKH-2344 belonging to the genus Streptomyces, which is isolated from soil collected from Jakuchikyo, Yamaguchi Prefecture.
P-06 is produced by inoculating the nutrient source-containing medium with the SKH-2344 strain and aerobically culturing, and the NP-06 producing strain that can be used in the present invention is the above strain. However, it is not limited as long as it belongs to the genus Streptomyces and has the ability to produce NP-06.
【0019】ところで、SKH−2344株は以下の菌
学的性質を有する微生物である。 1.形態的特徴 本菌株を、1%酵母エキス及び1%グルコースを含む液
体培地で培養し、この菌体を6N塩酸を用いて110℃
で18時間加水分解した後薄層クロマトグラフィーで分
析したところ、L,L−ジアミノピメリン酸を検出し
た。また、寒天平板培地上に発育させた物について顕微
鏡観察を行ったところ、気菌糸は螺旋状を呈しており、
この他に特筆すべき形態は認められなかった。The SKH-2344 strain is a microorganism having the following mycological properties. 1. Morphological characteristics The strain was cultured in a liquid medium containing 1% yeast extract and 1% glucose, and the bacterial cells were grown at 110 ° C. using 6N hydrochloric acid.
When hydrolyzed at 18 ° C. for 18 hours and then analyzed by thin layer chromatography, L, L-diaminopimelic acid was detected. In addition, microscopic observation of the product grown on an agar plate medium showed that the aerial mycelium has a spiral shape.
No other remarkable morphology was observed.
【0020】2.各種培地上における生育状況(27℃
14日間培養、色調は日本規格協会発行の標準色表によ
る) (1)イーストエキス・モルトエキス寒天培地 発育: 良い 気菌糸: 多い 気菌糸色調: 5RP 6/2 裏面色調: 5R 2/2 可溶性色素: 無し2. Growth condition on various media (27 ℃
Culture for 14 days, color tone is based on the standard color table issued by Japan Standards Association) (1) Yeast extract / malt extract agar medium Growth: Good aerial hyphae: a lot of aerial hyphae color tone: 5RP 6/2 Back side color tone: 5R 2/2 soluble pigment : None
【0021】(2)オートミル寒天培地 発育: 良い 気菌糸: 豊富 気菌糸色調: 7.5R 5/2 裏面色調: 5Y 4/2 可溶性色素: 無し (3)スターチ・無機塩寒天培地 発育: 良い 気菌糸: 豊富 気菌糸色調: 7.5R 8/2 裏面色調: 2.5GY 3/2 可溶性色素: 無し(2) Oat mill agar medium Growth: good Aerial mycelium: abundant aerial mycelium color tone: 7.5R 5/2 Backside color tone: 5Y 4/2 Soluble pigment: None (3) Starch / inorganic salt agar medium Growth: good energy Mycelia: Abundant Aerial mycelial color tone: 7.5R 8/2 Back side color tone: 2.5GY 3/2 Soluble pigment: None
【0022】(4)グリセリン・アスパラギン寒天培地 発育: 良い 気菌糸: 少ない 気菌糸色調: 白 裏面色調: 2.5GY 4/2 可溶性色素: 無し (5)チロシン寒天培地 発育: 良い 気菌糸: 豊富 気菌糸色調: 7.5R 7/2 裏面色調: 2.5GY 3/2 可溶性色素: 無し(4) Glycerin / asparagine agar medium Growth: Good aerial hyphae: little Airborne hyphae color tone: white Backside color tone: 2.5GY 4/2 Soluble pigment: None (5) Tyrosine agar medium growth: good aerial hyphae: rich aerial Mycelial color tone: 7.5R 7/2 Back side color tone: 2.5GY 3/2 Soluble pigment: None
【0023】(6)シュクロース・硝酸塩寒天培地 発育: 良い 気菌糸: 無し 気菌糸色調: − 裏面色調: 2.5GY 6/2 可溶性色素: 無し (7)グルコース・アスパラギン寒天培地 発育: 良い 気菌糸: 少ない 気菌糸色調: 白 裏面色調: 2.5GY 4/2 可溶性色素: 無し(6) Sucrose / Nitrate Agar Medium Growth: Good Aerial mycelium: None Aerial mycelial color tone: -Backside color tone: 2.5GY 6/2 Soluble pigment: None (7) Glucose / asparagine agar medium Growth: Good aerial mycelium : Less aerial mycelial color tone: white Back side color tone: 2.5GY 4/2 Soluble pigment: None
【0024】(8)栄養寒天培地 発育: 良い 気菌糸: 無し 気菌糸色調: − 裏面色調: 2.5Y 9/4 可溶性色素: 無し (9)ベネット寒天培地 発育: 良い 気菌糸: 少ない 気菌糸色調: 白 裏面色調: 2.5GY 6/2 可溶性色素: 無し(8) Nutrient agar medium Growth: Good aerial hyphae: None Aerobic hyphae color tone: -Backside color tone: 2.5Y 9/4 Soluble pigment: None (9) Bennett agar medium growth: Good aerial hyphae: Low aerial hyphae color tone : White Backside color: 2.5GY 6/2 Soluble pigment: None
【0025】3.生育温度範囲(イーストエキス・モル
トエキス寒天培地、7日間) 7℃ 発育: しない 10℃ 発育: 普通 14℃ 発育: 普通 17℃ 発育: 普通 21℃ 発育: 良い 25℃ 発育: 良い 29℃ 発育: 良い 32℃ 発育: 良い 37℃ 発育: 普通 40℃ 発育: しない 45℃ 発育: しない 50℃ 発育: しない3. Growth temperature range (yeast extract / malt extract agar medium, 7 days) 7 ℃ Growth: Not 10 ℃ Growth: Normal 14 ℃ Growth: Normal 17 ℃ Growth: Normal 21 ℃ Growth: Good 25 ℃ Growth: Good 29 ℃ Growth: Good 32 ℃ Growth: Good 37 ℃ Growth: Normal 40 ℃ Growth: No 45 ℃ Growth: No 50 ℃ Growth: No
【0026】4.糖の利用 D−グルコース 発育: 良い D−フラクトース 発育: 良い L−ラムノース 発育: 良い ラフィノース 発育: 普通 D−キシロース 発育: 普通 L−アラビノース 発育: 良い シュクロース 発育: 良い イノシトール 発育: 良い D−マンニトール 発育: 良い4. Utilization of sugar D-glucose Growth: Good D-Fructose Growth: Good L-Rhamnose Growth: Good Raffinose Growth: Normal D-Xylose Growth: Normal L-Arabinose Development: Good Sucrose Growth: Good Inositol Development: Good D-mannitol : Good
【0027】上記の諸性質から、SKH−2344株
が、ストレプトミセス属に属する微生物であることが明
らかである。尚、本菌株は、工業技術院生命工学工業技
術研究所に平成6年3月22日付けで、FERM P−
14239として寄託されている。上記微生物の培養方
法は、原則的には一般の微生物の培養方法に準ずるが、
通常は液体培地による振盪培養法又は通気攪拌培養法で
行うのが好適である。培養に用いられる培地としては、
ストレプトミセス属に属する微生物が利用できる栄養源
を含有する培地であればよく、各種の合成培地、半合成
培地、天然培地等のいずれの培地も用いることができ
る。From the above properties, it is clear that the SKH-2344 strain is a microorganism belonging to the genus Streptomyces. This strain was confirmed by the FERM P-
Deposited as 14239. The method for culturing the above-mentioned microorganism is basically similar to the method for culturing a general microorganism,
Usually, it is preferable to carry out the shaking culture method or aeration stirring culture method using a liquid medium. The medium used for culturing is
Any medium containing a nutrient source that can be used by microorganisms belonging to the genus Streptomyces may be used, and any medium such as various synthetic media, semi-synthetic media and natural media can be used.
【0028】培地組成の炭素源としては、グルコース、
シュークロース、フルクトース、グリセリン、デキスト
リン、糖蜜、コーン・スティーブリカー、有機酸等を単
独或いは組み合わせて使用できる。窒素源としてはペプ
トン、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、カゼイン、尿
素、アミノ酸等の有機窒素源、硫酸アンモニウム、硝酸
ナトリウムなどの無機窒素源を、単独或いは組み合わせ
て使用できる。ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウ
ム塩、リン酸塩、その他の重金属等やビタミン類も必要
に応じて使用することができる。尚、培養中に発泡が著
しい場合には、アデカノールやシリコーンオイル等の公
知の消泡剤を適宜培地中に添加することもできる。The carbon source of the medium composition is glucose,
Sucrose, fructose, glycerin, dextrin, molasses, corn steep liquor, organic acids and the like can be used alone or in combination. As the nitrogen source, organic nitrogen sources such as peptone, meat extract, yeast extract, soybean powder, casein, urea and amino acid, and inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate and sodium nitrate can be used alone or in combination. If necessary, sodium salts, potassium salts, magnesium salts, phosphates, other heavy metals and vitamins can also be used. When foaming is remarkable during the culture, a known antifoaming agent such as adecanol or silicone oil can be appropriately added to the medium.
【0029】培地のpHは、微生物が良好に生育する中
性付近とすることが望ましい。また、培地の温度は微生
物が良好に生育する10〜37℃とすることが好まし
く、特に25〜30℃に保つことが好ましい。更に、培
養時間は一般に3〜6日程度である。これらの培養条件
は、使用する微生物の種類や特性などの条件に応じて、
適宜変更することができる。上記の培養により、NP−
06が菌体中及び培地中に蓄積される。It is desirable that the pH of the medium is around neutral, at which the microorganisms grow well. The temperature of the medium is preferably 10 to 37 ° C., at which the microorganisms grow well, and particularly preferably 25 to 30 ° C. Further, the culture time is generally about 3 to 6 days. These culture conditions, depending on the conditions such as the type and characteristics of the microorganism used,
It can be changed appropriately. By the above culture, NP-
06 is accumulated in the cells and in the medium.
【0030】上記の培養によって生産されたNP−06
の単離は、培養物(菌体及び培地)中にNP−06が蓄
積された後、好ましくは蓄積が最大になった時に、発酵
生産物を採取する一般的方法に準じて、例えば塩析法、
抽出法、各種ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等の各種手段
を単独または組み合わせて実施される。尚、NP−06
は、バイオアッセイ法やHPLC法、TLC法などによ
って検出する事ができる。NP-06 produced by the above culture
Was isolated after the accumulation of NP-06 in the culture (bacteria and medium), preferably when the accumulation was maximized, according to a general method for collecting the fermentation product, for example salting out. Law,
Various methods such as extraction method, various gel chromatography, ion exchange chromatography, adsorption chromatography and the like are used alone or in combination. In addition, NP-06
Can be detected by bioassay method, HPLC method, TLC method and the like.
【0031】即ち、上記培養により生産されるNP−0
6は、菌体内と培地中の両方に存在するので、濾過、遠
心分離等の手段で培養濾液と菌体固形分とを分離した
後、菌体固形分からは、メタノール、アセトン等の溶剤
を用いてNP−06を抽出し、必要に応じて更にエバポ
レーターなどで有機溶剤を減圧・溜去して抽出濃縮液を
得る。That is, NP-0 produced by the above culture
Since 6 exists both in the bacterial cells and in the medium, after the culture filtrate and the bacterial cell solids are separated by a means such as filtration and centrifugation, a solvent such as methanol or acetone is used for the bacterial cell solids. Then, NP-06 is extracted, and if necessary, the organic solvent is further distilled off under reduced pressure with an evaporator or the like to obtain an extract concentrate.
【0032】抽出液及び培養濾液中からは、アンバーラ
イトIRA−402、アンバーライトIRA−904、
アンバーライトIRA−958、アンバーライトIRA
−68、アンバーライトIRA−93やアンバーライト
IRA−35(オルガノ株式会社製陰イオン交換樹脂の
商品名)に吸着・溶離させる事によって、効率よく目的
物を回収する事ができる。また、n−ブタノール、酢酸
エチル等で目的物を抽出して回収しても良い。From the extract and the culture filtrate, Amberlite IRA-402, Amberlite IRA-904,
Amberlite IRA-958, Amberlite IRA
By adsorbing and eluting with -68, Amberlite IRA-93 or Amberlite IRA-35 (trade name of anion exchange resin manufactured by Organo Corporation), the target substance can be efficiently recovered. Further, the target substance may be extracted and recovered with n-butanol, ethyl acetate or the like.
【0033】次いで目的物を含有する抽出液を濃縮した
後、ダイヤイオンHP−20カラム、セファデックスL
H−20カラム、シリカゲルカラム、逆相カラム等を用
いたクロマトグラフィー等により精製する。このように
して得られたNP−06に、例えば、結晶セルロース等
を添加し、必要に応じて公知の如く錠剤とすることによ
り、NP−06を有効成分とする極めて優れた抗HIV
剤を得ることができる。Then, the extract containing the target substance was concentrated, and then the product was diluted with Diaion HP-20 column and Sephadex L.
It is purified by chromatography using an H-20 column, silica gel column, reverse phase column and the like. An extremely excellent anti-HIV containing NP-06 as an active ingredient is obtained by adding crystalline cellulose or the like to the thus-obtained NP-06, and forming a tablet as required by a known method, for example.
The agent can be obtained.
【0034】[0034]
【発明の効果】本発明のペプチド化合物であるNP−0
6は、抗HIV作用に優れていると共に、毒性が低いの
で、大量に、長期間服用することも可能であり、新たな
AIDS治療薬として極めて有望である。The peptide compound of the present invention, NP-0.
Since 6 has an excellent anti-HIV effect and low toxicity, it can be taken in a large amount in a long period of time and is extremely promising as a new AIDS therapeutic drug.
【0035】[0035]
【実施例】以下、本発明を実施例によって更に詳述する
が、本発明はこれによって限定されるものではない。
尚、%は、他に特定されない限り重量%を意味する。EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to the following Examples, but it should not be construed that the invention is limited thereto.
Incidentally,% means% by weight unless otherwise specified.
【0036】実施例1.30リットルのジャーファーメ
ンターを用いて、放線菌SKH−2344株をで20リ
ットルの培地(グルコース20g、スターチ10g、麦
芽エキス1g、乾燥酵母4g、大豆粉25g、食塩2
g、リン酸水素二カリウム54mg、水1リットル、p
H7.3)によって25℃で5日間培養した後、遠心分
離により、菌体と培養上清に分離した。Example 1 Using a 30 liter jar fermenter, actinomycete SKH-2344 strain was treated with 20 liter of medium (glucose 20 g, starch 10 g, malt extract 1 g, dry yeast 4 g, soybean powder 25 g, salt 2).
g, dipotassium hydrogen phosphate 54 mg, water 1 liter, p
After culturing for 5 days at 25 ° C. by H7.3), the cells were separated into the culture supernatant by centrifugation.
【0037】菌体は10リットルのメタノール中で一晩
攪拌、溶菌させた後、残渣を濾過により除去した。メタ
ノール溶液を減圧濃縮により乾固させた後、得られた固
形分を水飽和ブタノールに溶解し、等量の水で洗浄し、
活性成分をブタノール層に回収した。一方、培養上清を
減圧濃縮して得られた乾固物をメタノール1リットルに
一晩浸漬した後、不溶物を濾過により除去した。次い
で、メタノール溶液を減圧濃縮により乾固した後、得ら
れた固形分を水飽和ブタノールに溶解し、等量の水で洗
浄して活性成分をブタノール層に回収した。The cells were stirred overnight in 10 liters of methanol to lyse them, and the residue was removed by filtration. After the methanol solution was concentrated to dryness under reduced pressure, the obtained solid content was dissolved in water-saturated butanol and washed with an equal amount of water,
The active ingredient was recovered in the butanol layer. On the other hand, the dried solid matter obtained by concentrating the culture supernatant under reduced pressure was immersed in 1 liter of methanol overnight, and then the insoluble matter was removed by filtration. Then, the methanol solution was concentrated to dryness under reduced pressure, the obtained solid content was dissolved in water-saturated butanol, and washed with an equal amount of water to recover the active ingredient in the butanol layer.
【0038】活性成分を含む二つのブタノール溶液を合
わせ、ブタノールを溜去した後、得られた活性成分を少
量のメタノールに溶解し、シリカゲルカラムクロマトグ
ラフィーに付した(カラム径4cm×長さ25cm)。
展開溶媒としては酢酸エチル・メタノール・水(10:
5:0.25)の混合溶媒を用いた。カラム体積の約2
倍量の展開溶媒を流したときに、活性成分が溶出した。
活性画分を集めて減圧濃縮し、高速液体クロマトグラフ
ィー(カラム;YMC製ODS−AQカラム径2cm×
長さ30cm)に付した。移動溶媒としては、0.5%
のトリフルオロ酢酸含有アセトニトリルの38%水溶液
を使用した。活性画分を集めて溶媒を溜去し、白色の粉
末を得た。20リットルの培養液から得られたNP−0
6は約100mgであった。Two butanol solutions containing the active ingredient were combined, the butanol was distilled off, and the obtained active ingredient was dissolved in a small amount of methanol and subjected to silica gel column chromatography (column diameter 4 cm × length 25 cm). .
As a developing solvent, ethyl acetate / methanol / water (10:
The mixed solvent of 5: 0.25) was used. About 2 column volume
The active ingredient was eluted when a double volume of developing solvent was passed.
The active fractions were collected, concentrated under reduced pressure, and then subjected to high performance liquid chromatography (column; YMC ODS-AQ column diameter 2 cm ×).
30 cm in length). As a transfer solvent, 0.5%
A 38% aqueous solution of acetonitrile containing trifluoroacetic acid was used. The active fractions were collected and the solvent was distilled off to obtain a white powder. NP-0 obtained from 20 liters of culture
6 was about 100 mg.
【0039】次に、得られた白色粉末のNP−06につ
いて下記の分析及び各種活性試験を行った。 1.NP−06のアミノ酸分析 下記の如く、塩酸加水分解法によって、NP−06の構
成アミノ酸分析を行った。NP−06の構成アミノ酸分
析を塩酸加水分解法により行った。NP−06の減圧乾
燥粉末0.2mgを入れたアミノ酸分解用試験管に、6
Nの塩酸200μlを加えて減圧封管した。110℃で
24時間及び72時間、それぞれ加水分解を行った後、
試料をNaOH上で減圧乾燥した。Next, the obtained white powder NP-06 was subjected to the following analysis and various activity tests. 1. Amino acid analysis of NP-06 The constituent amino acid analysis of NP-06 was performed by the hydrochloric acid hydrolysis method as follows. The constituent amino acids of NP-06 were analyzed by the hydrochloric acid hydrolysis method. In a test tube for amino acid decomposition containing 0.2 mg of a dried powder of NP-06 under reduced pressure, 6
200 μl of N hydrochloric acid was added and the tube was sealed under reduced pressure. After hydrolysis at 110 ° C. for 24 hours and 72 hours respectively,
The sample was vacuum dried over NaOH.
【0040】得られた固形分を水50μlに溶解した
後、アミノ酸分析装置を用いてアミノ酸分析を行った。
アミノ酸分析結果(実測値)は表1に示した通りであ
る。After dissolving the obtained solid content in 50 μl of water, amino acid analysis was performed using an amino acid analyzer.
The amino acid analysis results (actually measured values) are shown in Table 1.
【表1】 尚、トリプトファンは酸加水分解反応中に分解するため
に、上記の方法では検出されず、アスパラギンは分解さ
れてアスパラギン酸となる。[Table 1] Since tryptophan decomposes during the acid hydrolysis reaction, it is not detected by the above method, and asparagine is decomposed into aspartic acid.
【0041】2.NP−06のC末端アミノ酸分析 ヒドラジン分解法によりNP−06のC末端アミノ酸分
析を行った。まず、NP−06の減圧乾燥粉末2mgを
入れたアミノ酸分解用試験管に、無水ヒドラジン100
μlを加え、減圧封管した。100℃で18時間分解反
応を行った後、2mlのDEAE樹脂カラム(東ソー株
式会社製カラムの商品名)に通液して、副生成物のヒド
ラジドを除去し、C末端アミノ酸の精製を行った。2. C-terminal amino acid analysis of NP-06 The C-terminal amino acid analysis of NP-06 was performed by the hydrazinolysis method. First, 100 mg of anhydrous hydrazine was added to a test tube for decomposing amino acid containing 2 mg of vacuum dried powder of NP-06.
μl was added and the tube was sealed under reduced pressure. After carrying out a decomposition reaction at 100 ° C. for 18 hours, the solution was passed through a 2 ml DEAE resin column (trade name of a column manufactured by Tosoh Corporation) to remove a by-product hydrazide and purify the C-terminal amino acid. .
【0042】得られたC末端アミノ酸は、TLC〔TL
Cプレート:Merk製シリカゲル60F245 、展開溶媒:
(1)クロロホルム/メタノール/28%アンモニア水
(2:2:1)(2)n−ブタノール/酢酸/水(3:
1:1)、検出:ニンヒドリン試薬〕により同定し結
果、トリプトファンであることが判明した。The obtained C-terminal amino acid is TLC [TL
C plate: silica gel 60F 245 manufactured by Merk, developing solvent:
(1) Chloroform / methanol / 28% ammonia water (2: 2: 1) (2) n-butanol / acetic acid / water (3:
1: 1), detection: ninhydrin reagent], and as a result, it was found to be tryptophan.
【0043】3.NP−06のNMR構造解析 使用機器:JNM EX−400(JEOL社製の商品
名) 測定条件:1)測定溶媒:DMSO−d6(内部標準T
MS)、試料濃度:100mM。測定温度:25℃ 2)測定溶媒:CD3 OH−H2 O(50%−50%)
(内部標準TMS)、試料濃度:10mM。測定温度:
40℃ 測定データ:HH−COSYスペクトル(DQF−CO
SYスペクトル) HOHAHAスペクトル NOESYスペクトル3. NMR structure analysis of NP-06 Equipment used: JNM EX-400 (trade name of JEOL) Measurement conditions: 1) Measurement solvent: DMSO-d6 (internal standard T
MS), sample concentration: 100 mM. Measurement temperature: 25 ° C. 2) Measurement solvent: CD 3 OH-H 2 O (50% -50%)
(Internal standard TMS), sample concentration: 10 mM. Measurement temperature:
40 ° C. Measurement data: HH-COSY spectrum (DQF-CO
SY spectrum) HOHAHA spectrum NOESY spectrum
【0044】(1)HH−COSY、HOHAHAスペ
クトル解析結果 HH−COSY、HOHAHAスペクトルの解析によ
り、21個のアミノ酸のうち、ロイシン(Leu)、イ
ソロイシン(ILe)、バリン(Val)×2、アラニ
ン(Ala)×2、グリシン(Gly)×4、セリン
(Ser)の11個のアミノ酸を確認した。残りの10
個のアミノ酸残基は、同じAMXスピン系列を示し、H
H−COSY、HOHAHAスペクトルでは区別できな
かった。(1) HH-COSY, HOHAHA spectrum analysis results HH-COSY, HOHAHA spectrum analysis revealed that among 21 amino acids, leucine (Leu), isoleucine (ILe), valine (Val) × 2, alanine ( 11 amino acids of Ala) × 2, glycine (Gly) × 4, and serine (Ser) were confirmed. The remaining 10
Amino acid residues represent the same AMX spin series, H
No distinction was possible with the H-COZY and HOHAHA spectra.
【0045】(2)NOESYスペクトル解析結果 HOHAHAスペクトルでは同定できない10個のアミ
ノ残基についての同定を行った。フェニルアラニン(P
he)×2、チロシン(Tyr)、トリプトファン(T
rp)の各アミノ酸残基については、それぞれフェニル
基とβ−プロトンとのNOE相関ピークによって同定し
た。残りの6アミノ酸残基については、アミノ酸分析結
果のシステイン(Cys)×4、アスパラギン(As
n)、アスパラギン酸(Asp)及び、Hβのケミカル
シフト値によって同定した。(2) Results of NOESY spectrum analysis The 10 amino residues which could not be identified by the HOHAHA spectrum were identified. Phenylalanine (P
he) × 2, tyrosine (Tyr), tryptophan (T
Each amino acid residue of rp) was identified by the NOE correlation peak between the phenyl group and β-proton. Regarding the remaining 6 amino acid residues, cysteine (Cys) x 4 and asparagine (As
n), aspartic acid (Asp) and the chemical shift value of Hβ.
【0046】同定されたアミノ酸のケミカルシフト値
(ppm)を表2に示す。Table 2 shows the chemical shift values (ppm) of the identified amino acids.
【表2】 [Table 2]
【0047】(3)NP−06のアミノ酸配列 NMRにより同定した21個のアミノ酸残基の配列を、
Hαi −HNi+1 間のNOE強度で読み取ることによっ
て決定した。C末端のアミノ酸では、Trp(21)の
HNとPhe(20)のHαとの相関ピークのみが認め
られたので、Trp(21)をC末端アミノ酸と決定し
た。この結果はヒドラジン分解法によるC末端アミノ酸
解析の結果と一致する。NOE強度解析結果を図1に、
NP−06のアミノ酸配列を図2に示す。(3) Amino acid sequence of NP-06 The sequence of 21 amino acid residues identified by NMR was
It was determined by reading the NOE intensity between Hα i and HN i + 1 . For the C-terminal amino acid, only the correlation peak between HN of Trp (21) and Hα of Phe (20) was observed, so Trp (21) was determined to be the C-terminal amino acid. This result is consistent with the result of C-terminal amino acid analysis by the hydrazine decomposition method. Figure 1 shows the NOE strength analysis results.
The amino acid sequence of NP-06 is shown in FIG.
【0048】(4)NP−06の1次構造解析 NP−06の1次構造解析の際に重要であることは、
4つのCysが、どのような組み合わせでSS結合を形
成しているかということ、及びCys(1)のN末端
アミノ基が、どのような状態であるのかということであ
る。そこで、この2点について詳しくLonge Range NO
E相関ピークを検討した。Cys(1)のHNとAsp
(9)のHβとの相関ピークから、Cys(1)のN末
端とAsp(9)のβ位カルボキシル基がアミド結合し
ていることを確認した。Cys(1)のHβとGly
(14)のHαとの相関ピークにより、Cys(1)と
Cys(13)がSS結合していることを確認した。C
ys(7)のHβとCys(19)のHβの相関ピーク
により、Cys(7)とCys(19)がSS結合して
いることを確認した。解析結果を図3に示す。(4) Primary structural analysis of NP-06 The important point in the primary structural analysis of NP-06 is:
It is the combination of the four Cys forming the SS bond, and the state of the N-terminal amino group of Cys (1). So, these two points are detailed in the Longe Range NO
The E correlation peak was examined. Cys (1) HN and Asp
From the correlation peak of (9) with Hβ, it was confirmed that the N-terminal of Cys (1) and the β-position carboxyl group of Asp (9) were amide-bonded. Cys (1) Hβ and Gly
From the correlation peak of (14) with Hα, it was confirmed that Cys (1) and Cys (13) were SS-bonded. C
From the correlation peak of Hβ of ys (7) and Hβ of Cys (19), it was confirmed that Cys (7) and Cys (19) were SS-bonded. The analysis result is shown in FIG.
【0049】以上の結果を基にNP−06の1次構造を
化3と決定した。Based on the above results, the primary structure of NP-06 was determined to be Chemical formula 3.
【化3】 この構造は前述した通り、最近報告されたRP−719
55と非常に類似しているが、Val(4)、ILe
(17)の位置が異なっている。Embedded image This structure is based on the recently reported RP-719, as described above.
Very similar to 55, but with Val (4), ILe
The position of (17) is different.
【0050】4.NP−06の抗HIV活性 NP−06の抗HIV活性を、MT−4細胞を用いた以
下の試験方法により測定した。この方法は、HIV感染
によって引き起こされるCD4陽性細胞の感染死と、薬
剤によるその抑制を判定するものであり、抗HIV活性
と細胞毒性を、同時に且つ簡便に測定することが可能で
ある優れた方法である。4. Anti-HIV activity of NP-06 The anti-HIV activity of NP-06 was measured by the following test method using MT-4 cells. This method determines the infection death of CD4 positive cells caused by HIV infection and its suppression by drugs, and is an excellent method that can simultaneously and simply measure anti-HIV activity and cytotoxicity. Is.
【0051】(試験方法)1×104 個のHIV−1
(HTLV−3B)に感染させたMT−4細胞と非感染
のMT−4細胞を、種々の濃度のNP−06と共に、9
6穴マイクロプレートの各穴に加えた。37℃のCO2
インキュベーター中で5日間培養した後、3-(4,5-dimet
hyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H tetrazolium bromi
de(MTT)を加え、更に2時間培養を続けた。この間
に生細胞に取り込まれた、MTTは細胞中のミトコンド
リアの有する酵素により還元され、青紫色の水不溶性色
素(formazan) を生成した。5%Triton X−100を
含む塩酸酸性2−プロピルアルコール溶液を添加し、生
成した色素を可溶化させた後、595nmにおける特異
的吸光度と655nmにおける非特異的吸光度をマイク
ロプレートリーダー(BIO−RADモデル3550)
を用いて測定することにより、両吸光度の差を求めた。(Test Method) 1 × 10 4 HIV-1
(HTLV-3B) -infected MT-4 cells and uninfected MT-4 cells with various concentrations of NP-06,
Added to each well of a 6-well microplate. CO 2 at 37 ° C
After culturing for 5 days in an incubator, 3- (4,5-dimet
hyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H tetrazolium bromi
de (MTT) was added, and the culture was continued for another 2 hours. During this period, MTT taken up by living cells was reduced by an enzyme contained in mitochondria in the cells to produce a blue-violet water-insoluble pigment (formazan). A 2-propyl alcohol acidic hydrochloric acid solution containing 5% Triton X-100 was added to solubilize the produced dye, and then the specific absorbance at 595 nm and the nonspecific absorbance at 655 nm were measured using a microplate reader (BIO-RAD model). 3550)
The difference between the two absorbances was determined by measuring with.
【0052】得られた数値を用いてコンピューター処理
(BIO−RAD Microplate Manager for Macintosh
)を行い、50%細胞死阻止濃度(EC50)と50%
細胞毒性濃度(CC50)を求め、治療係数(CC50/E
C50)を算出した。NP−06、及び、既に抗HIV効
果が明らかであると報告されている、デキストラン硫酸
ナトリウム(分子量5000)(比較薬剤)に対する抗
HIVアッセイ結果を、表3に示す。Computer processing (BIO-RAD Microplate Manager for Macintosh) using the obtained numerical values
) Is carried out and 50% cell death inhibitory concentration (EC 50 ) and 50%
The cytotoxic concentration (CC 50 ) was calculated and the therapeutic index (CC 50 / E
C50 ) was calculated. Table 3 shows the results of anti-HIV assay for NP-06 and dextran sulfate sodium (molecular weight 5000) (comparative drug), which has already been reported to show an anti-HIV effect.
【表3】 [Table 3]
【0053】5.NP−06の巨細胞形成阻害効果 HIVがT細胞に感染すると、感染細胞が互いに融合し
て巨細胞を形成することが知られている。そこで、NP
−06の巨細胞形成阻害効果を検討した。 (試験方法)5×104 個のHIV−1非感染MOLT
細胞とHIV−1持続感染MOLT−4細胞を、種々の
濃度のNP−06と共に、96穴マイクロプレートの各
穴に加え、37℃のCO2 インキュベーター中で24時
間培養した後、顕微鏡を用いて観察若しくは写真撮影を
行い、多核巨細胞形抑制作用の程度を観察し、抗HIV
−1活性(HIV−1吸着阻害活性)を評価した。5. NP-06 giant cell formation inhibitory effect It is known that when HIV infects T cells, the infected cells fuse with each other to form giant cells. So NP
The inhibitory effect of −06 on giant cell formation was examined. (Test method) 5 × 10 4 HIV-1 non-infected MOLT
Cells and HIV-1 persistently infected MOLT-4 cells with various concentrations of NP-06 were added to each well of a 96-well microplate and cultured for 24 hours in a CO 2 incubator at 37 ° C. Observe or take a picture to observe the degree of multinucleated giant cell shape inhibitory action, anti-HIV
-1 activity (HIV-1 adsorption inhibitory activity) was evaluated.
【0054】その結果は、表4に示した通りであり、N
P−06濃度が10μg/ml以上で、巨細胞阻害効果
が確認された。The results are shown in Table 4, where N
When the P-06 concentration was 10 μg / ml or more, giant cell inhibitory effect was confirmed.
【表4】 [Table 4]
【0055】実施例2.実施例1と同様に、30リット
ルのジャーファーメンターを用い、20リットルの培地
(グルコース20g、スターチ10g、麦芽エキス1
g、乾燥酵母4g、大豆粉25g、食塩2g、リン酸水
素二カリウム54mg、水1リットル、pH7.3)に
よって放線菌SKH−2344株を5日間培養した後、
遠心分離によって菌体と培養上清に分離した。菌体を1
0リットルのメタノール中で一晩攪拌した後、固形分を
濾過により除去した。次いで減圧濃縮してメタノールを
溜去し、水溶液を得た。Example 2. As in Example 1, using a 30-liter jar fermenter, 20-liter medium (glucose 20 g, starch 10 g, malt extract 1) was used.
g, dry yeast 4 g, soybean flour 25 g, salt 2 g, dipotassium hydrogen phosphate 54 mg, water 1 liter, pH 7.3), and then culturing the actinomycete SKH-2344 strain for 5 days,
The cells and the culture supernatant were separated by centrifugation. 1 fungus
After stirring overnight in 0 liter of methanol, solids were removed by filtration. Then, the solution was concentrated under reduced pressure to distill off methanol to obtain an aqueous solution.
【0056】培養上清と合わせて、pHを7.0に調製
した後、陰イオン交換樹脂(アンバーライトIRA−9
3(オルガノ株式会社製の商品名)塩酸塩型、カラム径
8cm×50cm)に通液し、活性成分を吸着させた。
0.5M燐酸一カリウム液(pH4.5)、水、50%
メタノールを順にそれぞれのカラムの3倍量通液した
後、0.1M酢酸含有50%メタノール溶液にて活性成
分を溶出させた。活性画分は減圧乾固して粗精製物32
0mgを得た(純度約80%)。以上の結果は本発明の
有効性を実証するものである。After adjusting the pH to 7.0 together with the culture supernatant, the anion exchange resin (Amberlite IRA-9) was used.
The solution was passed through 3 (trade name of Organo Co., Ltd.) hydrochloride type, column diameter 8 cm × 50 cm) to adsorb the active ingredient.
0.5M monopotassium phosphate solution (pH 4.5), water, 50%
After passing 3 times the amount of methanol through each column in order, the active ingredient was eluted with a 50% methanol solution containing 0.1 M acetic acid. The active fraction was dried to dryness under reduced pressure to give a crude product 32
0 mg was obtained (purity about 80%). The above results demonstrate the effectiveness of the present invention.
【図1】NP−06におけるアミノ酸のNOE強度解析
結果を示す図である。FIG. 1 is a diagram showing the results of NOE intensity analysis of amino acids in NP-06.
【図2】NP−06のアミノ酸配列を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing an amino acid sequence of NP-06.
【図3】NP−06におけるLong range NOE相関解
析結果を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing a result of Long range NOE correlation analysis in NP-06.
【図4】NP−06の 1H−NMRスペクトルを示す実
測図である。FIG. 4 is an actual measurement diagram showing a 1 H-NMR spectrum of NP-06.
【図5】NP−06の13C−NMRスペクトルを示す実
測図である。FIG. 5 is an actual measurement diagram showing a 13 C-NMR spectrum of NP-06.
【図6】NP−06のHH−COSYスペクトルを示す
実測図である。FIG. 6 is an actual measurement diagram showing an HH-COSY spectrum of NP-06.
【図7】NP−06のHOHAHAスペクトルを示す実
測図である。FIG. 7 is an actual measurement diagram showing a HOHAHA spectrum of NP-06.
【図8】NP−06のNOESYスペクトルを示す実測
図である。FIG. 8 is an actual measurement diagram showing a NOESY spectrum of NP-06.
【図9】NP−06のIRスペクトルを示す実測図であ
る。FIG. 9 is an actual measurement diagram showing an IR spectrum of NP-06.
【図10】NP−06のMASS(FAB+ )スペクト
ルを示す実測図である。FIG. 10 is an actual measurement diagram showing a MASS (FAB + ) spectrum of NP-06.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:465) (72)発明者 大田 久美子 山口県岩国市飯田町2丁目8番1号 日本 製紙株式会社岩国技術研究所内 (72)発明者 渡辺 和浩 山口県岩国市飯田町2丁目8番1号 日本 製紙株式会社岩国技術研究所内 (72)発明者 町田 誠 山口県岩国市飯田町2丁目8番1号 日本 製紙株式会社岩国技術研究所内 (72)発明者 村上 邦睦 山口県岩国市飯田町2丁目8番1号 日本 製紙株式会社岩国技術研究所内 (72)発明者 吉岡 英敏 東京都北区王子5丁目21番1号 日本製紙 株式会社中央研究所内─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Internal reference number FI technical display location C12R 1: 465) (72) Inventor Kumiko Ota 2-8-1, Iida-cho, Iwakuni-shi, Yamaguchi Japan Papermaking Co., Ltd. Iwakuni Research Institute (72) Inventor Kazuhiro Watanabe 2-8-1, Iida-cho, Iwakuni-shi, Yamaguchi Japan Iwakuni Research Institute (72) Inventor Makoto Machida 2-chome, Iida-cho, Iwakuni-shi, Yamaguchi Prefecture No. 1 Inside the Iwakuni Technical Research Institute of Japan Paper Manufacturing Co., Ltd. (72) Kunimitsu Murakami 2-8-1 Iida-cho, Iwakuni City, Yamaguchi Prefecture Inside the Iwakuni Technical Research Center of Japan Paper Manufacturing Co. 5-21-1 Oji Inside Central Research Institute, Nippon Paper Industries Co., Ltd.
Claims (5)
合物生産菌を培養し、培養物から請求項1に記載された
ペプチド化合物を採取することを特徴とする、ペプチド
化合物の製造方法。2. A method for producing a peptide compound, which comprises culturing a peptide compound-producing bacterium belonging to the genus Streptomyces, and collecting the peptide compound according to claim 1 from the culture.
合物生産菌が、放線菌SKH−2344株である、請求
項2に記載されたペプチド化合物の製造方法。3. The method for producing a peptide compound according to claim 2, wherein the peptide compound-producing bacterium belonging to the genus Streptomyces is actinomycete SKH-2344 strain.
オン交換樹脂を使用して、請求項1に記載されたペプチ
ド化合物を採取、精製する、請求項2又は請求項3に記
載されたペプチド化合物の製造方法。4. The peptide compound according to claim 2 or claim 3, wherein the peptide compound according to claim 1 is collected and purified from the culture of the peptide compound-producing bacterium by using an anion exchange resin. Manufacturing method.
有効成分とすることを特徴とする抗ヒト免疫不全ウイル
ス剤。5. An anti-human immunodeficiency virus agent, which comprises the peptide compound according to claim 1 as an active ingredient.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6186385A JPH0827184A (en) | 1994-07-15 | 1994-07-15 | Peptide compound, its production and anti-human immunodeficiency viral agent |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6186385A JPH0827184A (en) | 1994-07-15 | 1994-07-15 | Peptide compound, its production and anti-human immunodeficiency viral agent |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0827184A true JPH0827184A (en) | 1996-01-30 |
Family
ID=16187471
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP6186385A Pending JPH0827184A (en) | 1994-07-15 | 1994-07-15 | Peptide compound, its production and anti-human immunodeficiency viral agent |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0827184A (en) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000047609A1 (en) * | 1999-02-10 | 2000-08-17 | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. | Cyclic peptides and aids vaccines |
JP2007016044A (en) * | 1999-05-13 | 2007-01-25 | Japan Science & Technology Agency | Inhibitors for viral infection targeting integrase n-terminal region |
CN115475525A (en) * | 2022-10-06 | 2022-12-16 | 中国矿业大学 | Method for purifying biological dust suppressant by two-stage ultrafiltration |
-
1994
- 1994-07-15 JP JP6186385A patent/JPH0827184A/en active Pending
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US7378490B1 (en) | 1999-02-10 | 2008-05-27 | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. | Cyclic peptides and aids vaccines |
JP2007016044A (en) * | 1999-05-13 | 2007-01-25 | Japan Science & Technology Agency | Inhibitors for viral infection targeting integrase n-terminal region |
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CN115475525B (en) * | 2022-10-06 | 2024-03-05 | 中国矿业大学 | Method for purifying biological dust suppressant by double-stage ultrafiltration |
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