JPH08157497A - Control structure having protein crystalline form - Google Patents
Control structure having protein crystalline formInfo
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- JPH08157497A JPH08157497A JP30409394A JP30409394A JPH08157497A JP H08157497 A JPH08157497 A JP H08157497A JP 30409394 A JP30409394 A JP 30409394A JP 30409394 A JP30409394 A JP 30409394A JP H08157497 A JPH08157497 A JP H08157497A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】この発明は、蛋白質結晶形の制御
構造に関するものである。さらに詳しくは、この発明
は、生物素子、バイオセンサー、生体適合材料等の機能
構造として有用な、結晶形が制御された蛋白質結晶構造
に関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a protein crystal form control structure. More specifically, the present invention relates to a protein crystal structure in which the crystal form is controlled, which is useful as a functional structure of biodevices, biosensors, biocompatible materials and the like.
【０００２】[0002]
【従来の技術とその課題】従来より、蛋白質のある種の
ものの３次元結晶系は、溶液条件、結晶化条件に沿って
変化することが知られている。また、ある種の蛋白質
は、そのアミノ酸配列のある部位を別種のものに改変す
ることで結晶を形成することが知られている。2. Description of the Related Art Conventionally, it has been known that the three-dimensional crystal system of a certain kind of protein changes depending on the solution condition and the crystallization condition. Further, it is known that a certain protein forms crystals by modifying a certain site of its amino acid sequence to another protein.
【０００３】しかしながら、これまでの技術では、これ
らの蛋白質の結晶形を人為的に所要のものに制御するた
めの手段は確立されていないのが実情である。このこと
は、次世代の分子素子等への蛋白質工学の発展にとって
大きな障害になってもいる。たとえば、ヒト肝臓Ｈ−ア
ポフェリチンの８６番目のアミノ酸（リジン）をグルタ
ミンに改変することにより、従来は結晶が得られなかっ
た蛋白質について結晶が得られたことが報告されている
（Lawson, D. M., Artymiuk, P. J., Yeudall, S. J.,
Smith, J. M., Livingstone, J. C., Treffry, A., Lev
i, S., Arosio, P., Cesareni, G., Tomas, C. D., Sha
w, W. H., Harrison, P. M. Nature,２４８，５４１−
５４４（１９９１））が、このアミノ酸改変が普通の手
段として結晶形制御に適用できるとの思想は教示されて
いないし、その根拠も明示されていない。However, in the conventional technology, no means has been established for artificially controlling the crystal forms of these proteins to the required ones. This is also a major obstacle to the development of protein engineering for next-generation molecular devices and the like. For example, it has been reported that by modifying the 86th amino acid (lysine) of human liver H-apoferritin to glutamine, crystals were obtained for proteins that were not previously obtained (Lawson, DM, Artymiuk, PJ, Yeudall, SJ,
Smith, JM, Livingstone, JC, Treffry, A., Lev
i, S., Arosio, P., Cesareni, G., Tomas, CD, Sha
w, WH, Harrison, PM Nature, 248, 541-
544 (1991)) does not teach the idea that this amino acid modification can be applied to crystal form control as a common means, and the basis thereof is not specified.
【０００４】そこで、この発明は、以上の通りの従来技
術の限界を超えて、蛋白質の結晶形を制御することの手
段を確立し、この制御された構造を提供することを目的
としている。Therefore, the object of the present invention is to establish means for controlling the crystalline form of a protein, and to provide this controlled structure, beyond the limits of the conventional techniques as described above.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、金属イオンによる塩橋を形成す
る蛋白質、もしくは金属イオンコアを持つ蛋白質の塩橋
部位ないしは金属イオンコア形成部位にあるアミノ酸が
改変されていることを特徴とする蛋白質結晶形の制御構
造を提供する。Means for Solving the Problems The present invention is to solve the above problems by providing a protein which forms a salt bridge by a metal ion, or an amino acid at a salt bridge site or a metal ion core forming site of a protein having a metal ion core. The present invention provides a control structure of a crystal form of a protein, which is characterized by being modified.
【０００６】そしてこの発明は、上記構造において、電
荷を持たないアミノ酸によって改変されていることをそ
の態様としてもいる。The present invention also has an aspect that the above structure is modified by an amino acid having no charge.
【０００７】[0007]
【作用】この発明においては、上記の通り、塩橋が形成
される部位、あるいは金属イオンコアの形成部位にある
アミノ酸を改変することにより、その結晶形を制御する
ことを可能としている。これにより、従来より知られて
いるいわゆる野生型の蛋白質とは異なる各種の結晶形の
蛋白質結晶が得られる。このような制御構造は、蛋白質
工学における２次元配列結晶、あるいは３次元結晶の作
製にとって極めて有用なものとなる。アミノ酸の改変そ
のものは、従来公知の蛋白質工学（遺伝子工学）手法に
よって可能であり、対象とする蛋白質についても、前記
の通り、金属イオンを介して塩橋を形成するもの、ある
いは金属イオンによってコア形成するもののうちから適
宜に選択されることになる。In the present invention, as described above, the crystalline form can be controlled by modifying the amino acid at the site where the salt bridge is formed or at the site where the metal ion core is formed. As a result, protein crystals of various crystal forms different from the conventionally known so-called wild-type protein can be obtained. Such a control structure is extremely useful for producing a two-dimensional array crystal or a three-dimensional crystal in protein engineering. The amino acid modification itself can be performed by a conventionally known protein engineering (genetic engineering) method. As described above, the target protein also forms a salt bridge via a metal ion or forms a core with a metal ion. It will be appropriately selected from among the following.
【０００８】実際に結晶形を形成する場合には、たとえ
ば水銀やグルコース溶液の液面上に蛋白質の水、あるい
は有機溶媒溶液を展開して、水あるいは溶媒を蒸発、吸
引等により除去することで２次元結晶形が形成可能であ
り、３次元結晶については、金属イオンを使用すること
なく、蛋白質濃度を増大することで可能となる。これら
の結晶は、固体２次元基板上への転写付着、あるいは結
晶そのものの液面上からの単離によって、その利用目的
に沿った態様に転換することができる。When actually forming a crystal form, for example, water of a protein or an organic solvent solution is spread on the surface of a mercury or glucose solution, and the water or solvent is removed by evaporation, suction or the like. A two-dimensional crystal form can be formed, and a three-dimensional crystal can be formed by increasing the protein concentration without using metal ions. These crystals can be converted into a form suitable for the purpose of use by transferring and attaching the crystals onto a solid two-dimensional substrate or by isolating the crystals themselves from the liquid surface.
【０００９】たとえばこの発明が対象とする蛋白質とし
てはアポフェリチンや鉄、マンガン、ニッケル、コバル
ト等の遷移金属などのコアを持ったフェリチン等がその
代表例として示される。改変するためのアミノ酸として
は、たとえばセリン、トレオニン、グリシン、アラニン
等の電荷を持たないものがその代表例として示される。For example, as proteins to which the present invention is directed, apoferritin, ferritin having a core of a transition metal such as iron, manganese, nickel, cobalt and the like are shown as typical examples. Representative examples of amino acids for modification are those having no charge such as serine, threonine, glycine and alanine.
【００１０】以下、実施例を示し、さらに詳しくこの発
明について説明する。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
【００１１】[0011]
【実施例】蛋白質は馬肝臓よりクローニングしたＬ鎖の
みからなるアポフェリチン（Ｍｗ＝４４４，０００）を
大腸菌により発現させた組み換え体を使用した。アポフ
ェリチンはカドミニウムイオンの塩橋により３次元結晶
（面心立方格子Ｆ４３２）を作ることが知られている。
このアポフェリチンのカドミニウムイオン結合部位にあ
たるアスパラギン酸（８４）およびグルタミン（８６）
を電荷のないセリンにした改変体と野生型の結晶性を比
較した。[Example] As a protein, a recombinant clone was used in which apoferritin (Mw = 444,000) consisting only of L chain cloned from horse liver was expressed in Escherichia coli. It is known that apoferritin forms a three-dimensional crystal (face-centered cubic lattice F432) by a salt bridge of cadmium ion.
Aspartic acid (84) and glutamine (86), which are the cadmium ion binding sites of this apoferritin
The crystallinity of the wild-type was compared with that of the modified form in which the amino acid was changed to uncharged serine.
【００１２】２次元の結晶化には、図１に示した手順を
採用した。すなわち、次の通りとした。 ａ．直径１５ｍｍの円形テフロントラフに２％グルコー
ス溶液を０．５ｍｌ満たす。マイクロシリンジの注射針
をグルコース展開層の中にいれ、たん白質溶液（１−５
μｌ）を注入する。For the two-dimensional crystallization, the procedure shown in FIG. 1 was adopted. That is, it was set as follows. a. A circular theorefluff having a diameter of 15 mm is filled with 0.5 ml of a 2% glucose solution. Insert the needle of a microsyringe into the glucose spreading layer, and add the protein solution (1-5
μl) is injected.
【００１３】ｂ．たん白質溶液は比重の差により表面に
上昇し、表面に達するとすみやかに界面に展開する。こ
の方法をとることで均一で再現性のよい展開ができるよ
うになった。たん白質濃度は０．３−５ｍｇ／ｍｌであ
る。 ｃ．展開された、たん白質の一部は表面で変性して薄い
（約１ｎｍ）均一な膜を形成する。変性していないたん
白質はこの膜に吸着していく。B. The protein solution rises to the surface due to the difference in specific gravity, and when it reaches the surface, it quickly spreads to the interface. By adopting this method, uniform and reproducible development became possible. The protein concentration is 0.3-5 mg / ml. c. A part of the developed protein is denatured on the surface to form a thin (about 1 nm) uniform film. Undenatured protein adsorbs to this membrane.
【００１４】ｄ．グルコース溶液中に１０ｍＭＣｄＳＯ
4 ０．１５ＭＮａＣｌをいれておくとアポフェリチンは
大きな二次元結晶をつくる。この二次元結晶は変性膜と
共に、カーボン支持膜または多孔カーボン膜を張った電
顕用グリッドに水平付着法で転写する。とくに多孔カー
ボン膜に転写したものは質のよい２次元結晶が得られ
た。D. 10 mM CdSO in glucose solution
4 When 0.15M NaCl is added, apoferritin forms large two-dimensional crystals. The two-dimensional crystals are transferred together with the modified film to a grid for an electron microscope having a carbon support film or a porous carbon film by a horizontal attachment method. Especially when transferred to the porous carbon film, a good quality two-dimensional crystal was obtained.
【００１５】野生型アポフェリチンの場合、グルコース
溶液にカドミニウム（１０ｍＭ）を加えることで大きな
（１μｍ2 以上）２次元結晶（６方格子）の成長が観察
された。画像解析の結果、アポフェリチンは３回対称軸
を結晶面に垂直に向けた、面心立方格子Ｆ４３２の
（１，１，１）面と同じ分子配向をしていることが画像
解析の結果わかった（図２Ａ（ａ＝ｂ＝１３ｎｍ，γ＝
１２０°））。カドミニウム結合部位を持たない改変体
では、カドミニウムの有無にかかわらず２次元結晶、３
次元結晶を形成した。２次元結晶はａ＝ｂ＝１３ｎｍ，
γ＝９０°の正方格子、ａ＝ｂ＝１３ｎｍ，γ＝１００
°（図２Ｂ）およびａ＝１３，ｂ＝１５ｎｍ，γ＝１２
０°（図２Ｃ）の斜方格子、ａ＝ｂ＝１３ｎｍ，γ＝１
２０°（図２Ｄ）の六方格子などの結晶系が見られた。
野生型とは異なり、どの結晶系も２回対称軸を垂直にし
ていると考えられる。なお、図２Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ左側は
負染色した電顕像、中央はそのフーリエ変換像、右側は
フーリエ変換による再構成像である。また図３ａ，ｂ，
ｃにはＸ線構造解析より得られた構造因子を使って計算
した投影像を示した。ａは、（１，１，１）面の投影像
（２．０ｎｍ分解能）、ｂは、（１，１，０）面の投影
像（２．０ｎｍ分解能）およびｃは、（１，１，０）面
の投影像（２．４ｎｍ分解能）を示している。カドミニ
ウム結合部位を持たない改変体は結晶をつくらないと予
想していたが、生成した改変体はカドミニウム塩橋によ
る強い相互作用がなくなった結果、他の部位による蛋白
質間相互作用が顕著になって多彩な結晶系ができたもの
と考えられる。野生型でカドミニウムが存在しない場合
に結晶しないのは、その結合部位の電荷による斥力のた
めと考えられる。In the case of wild-type apoferritin, growth of large (1 μm 2 or more) two-dimensional crystals (hexagonal lattice) was observed by adding cadmium (10 mM) to the glucose solution. As a result of the image analysis, it was found that the apoferritin has the same molecular orientation as the (1,1,1) plane of the face-centered cubic lattice F432 with the 3-fold symmetry axis oriented perpendicular to the crystal plane. 2A (a = b = 13 nm, γ =
120 °)). In the modified form that does not have a cadmium binding site, a two-dimensional crystal with or without cadmium
A dimensional crystal was formed. Two-dimensional crystal has a = b = 13 nm,
Square lattice with γ = 90 °, a = b = 13 nm, γ = 100
(FIG. 2B) and a = 13, b = 15 nm, γ = 12
Orthogonal lattice at 0 ° (FIG. 2C), a = b = 13 nm, γ = 1
A crystal system such as a hexagonal lattice at 20 ° (Fig. 2D) was observed.
Unlike the wild type, it is considered that all crystal systems have the two-fold symmetry axis vertical. 2A, B, C, and D are negatively stained electron microscope images, the center is the Fourier transform image thereof, and the right side is the reconstruction image by Fourier transform. 3a, b,
In c, a projected image calculated using the structure factor obtained by X-ray structural analysis is shown. a is a projected image of the (1,1,1) plane (2.0 nm resolution), b is a projected image of the (1,1,0) plane (2.0 nm resolution), and c is (1,1,1). The projection image (2.4 nm resolution) of the (0) plane is shown. We expected that the variant without a cadmium binding site would not form crystals, but the resulting variant would lose its strong interaction with the cadmium salt bridge, resulting in significant protein-protein interactions with other sites. It is considered that various crystal systems were created. The fact that the wild type does not crystallize in the absence of cadmium is thought to be due to the repulsive force due to the charge at its binding site.
【００１６】このように、この発明によって、これまで
に実現されていない蛋白質結晶構造の制御が可能とな
る。As described above, according to the present invention, it becomes possible to control a protein crystal structure which has not been realized so far.
【００１７】[0017]
【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明によ
り、従来にない人為的に再構成される結晶形蛋白質構造
が実現され、分子素子等の次世代の蛋白質工学の技術発
展に大きく寄与し、かつ、機能材料としての応用を可能
とする。Industrial Applicability As described in detail above, according to the present invention, an artificially reconstructed crystalline protein structure which has not been hitherto realized is realized, which greatly contributes to the technological development of the next-generation protein engineering such as molecular devices. Moreover, it can be applied as a functional material.
【図１】２次元結晶の形成方法を例示した工程図であ
る。FIG. 1 is a process chart illustrating a method for forming a two-dimensional crystal.
【図２】実施例としての２次元結晶の電子顕微鏡像を示
した図面に代わる写真である。FIG. 2 is a photograph replacing a drawing showing an electron microscope image of a two-dimensional crystal as an example.
【図３】実施例としてのＸ線解析像について示した図面
に代わる写真である。FIG. 3 is a photograph replacing a drawing showing an X-ray analysis image as an example.
─────────────────────────────────────────────────────
─────────────────────────────────────────────────── ───
【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成７年５月１０日[Submission date] May 10, 1995
【手続補正１】[Procedure Amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】全文[Correction target item name] Full text
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction content]
【書類名】 明細書[Document name] Statement
【発明の名称】 蛋白質結晶形の制御構造Title: Control structure of protein crystal form
【特許請求の範囲】[Claims]
【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】この発明は、蛋白質結晶形の制御
構造に関するものである。さらに詳しくは、この発明
は、生物素子、バイオセンサー、生体適合材料等の機能
構造として有用な、結晶形が制御された蛋白質結晶構造
に関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a protein crystal form control structure. More specifically, the present invention relates to a protein crystal structure in which the crystal form is controlled, which is useful as a functional structure of biodevices, biosensors, biocompatible materials and the like.
【０００２】[0002]
【従来の技術とその課題】従来より、蛋白質のある種の
ものの３次元結晶系は、溶液条件、結晶化条件に沿って
変化することが知られている。また、ある種の蛋白質
は、そのアミノ酸配列のある部位を別種のものに改変す
ることで結晶を形成することが知られている。2. Description of the Related Art Conventionally, it has been known that the three-dimensional crystal system of a certain kind of protein changes depending on the solution condition and the crystallization condition. Further, it is known that a certain protein forms crystals by modifying a certain site of its amino acid sequence to another protein.
【０００３】しかしながら、これまでの技術では、これ
らの蛋白質の結晶形を人為的に所要のものに制御するた
めの手段は確立されていないのが実情である。このこと
は、次世代の分子素子等への蛋白質工学の発展にとって
大きな障害になってもいる。たとえば、ヒト肝臓Ｈ−ア
ポフェリチンの８６番目のアミノ酸（リジン）をグルタ
ミンに改変することにより、従来は結晶が得られなかっ
た蛋白質について結晶が得られたことが報告されている
（Lawson, D. M., Artymiuk, P. J., Yeudall, S. J.,
Smith, J. M., Livingstone, J. C., Treffry, A., Lev
i, S., Arosio, P., Cesareni, G., Tomas, C. D., Sha
w, W. H., Harrison, P. M. Nature,２４８，５４１−
５４４（１９９１））が、このアミノ酸改変が普通の手
段として結晶形制御に適用できるとの思想は教示されて
いないし、その根拠も明示されていない。However, in the conventional technology, no means has been established for artificially controlling the crystal forms of these proteins to the required ones. This is also a major obstacle to the development of protein engineering for next-generation molecular devices and the like. For example, it has been reported that by modifying the 86th amino acid (lysine) of human liver H-apoferritin to glutamine, crystals were obtained for proteins that were not previously obtained (Lawson, DM, Artymiuk, PJ, Yeudall, SJ,
Smith, JM, Livingstone, JC, Treffry, A., Lev
i, S., Arosio, P., Cesareni, G., Tomas, CD, Sha
w, WH, Harrison, PM Nature, 248, 541-
544 (1991)) does not teach the idea that this amino acid modification can be applied to crystal form control as a common means, and the basis thereof is not specified.
【０００４】そこで、この発明は、以上の通りの従来技
術の限界を超えて、蛋白質の結晶形を制御することの手
段を確立し、この制御された構造を提供することを目的
としている。Therefore, the object of the present invention is to establish means for controlling the crystalline form of a protein, and to provide this controlled structure, beyond the limits of the conventional techniques as described above.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、金属イオンによる塩橋を形成す
る蛋白質、もしくは金属イオンコアを持つ蛋白質の塩橋
部位にあるアミノ酸が改変されていることを特徴とする
蛋白質結晶形の制御構造を提供する。Means for Solving the Problems In order to solve the above-mentioned problems, the present invention has modified a protein forming a salt bridge by a metal ion or an amino acid at the salt bridge site of a protein having a metal ion core. A control structure of a protein crystal form is provided.
【０００６】そしてこの発明は、上記構造において、電
荷を持たないアミノ酸によって改変されていることをそ
の態様としてもいる。The present invention also has an aspect that the above structure is modified by an amino acid having no charge.
【０００７】[0007]
【作用】この発明においては、上記の通り、塩橋が形成
される部位にあるアミノ酸を改変することにより、その
結晶形を制御することを可能としている。これにより、
従来より知られているいわゆる野生型の蛋白質とは異な
る各種の結晶形の蛋白質結晶が得られる。このような制
御構造は、蛋白質工学における２次元配列結晶、あるい
は３次元結晶の作製にとって極めて有用なものとなる。
アミノ酸の改変そのものは、従来公知の蛋白質工学（遺
伝子工学）手法によって可能であり、対象とする蛋白質
についても、前記の通り、金属イオンを介して塩橋を形
成するもののうちから適宜に選択されることになる。In the present invention, as described above, it is possible to control the crystal form by modifying the amino acid at the site where the salt bridge is formed. This allows
Protein crystals of various crystal forms different from the conventionally known so-called wild-type protein can be obtained. Such a control structure is extremely useful for producing a two-dimensional array crystal or a three-dimensional crystal in protein engineering.
The modification of the amino acid itself can be performed by a conventionally known protein engineering (genetic engineering) method, and the target protein is also appropriately selected from those that form a salt bridge via a metal ion, as described above. It will be.
【０００８】実際に結晶形を形成する場合には、たとえ
ば水銀やグルコース溶液の液面上に蛋白質の水、あるい
は有機溶媒溶液を展開して、水あるいは溶媒を蒸発、吸
引等により除去することで２次元結晶形が形成可能であ
り、３次元結晶については、金属イオンを使用すること
なく、蛋白質濃度を増大することで可能となる。これら
の結晶は、固体２次元基板上への転写付着、あるいは結
晶そのものの液面上からの単離によって、その利用目的
に沿った態様に転換することができる。When actually forming a crystal form, for example, water of a protein or an organic solvent solution is spread on the surface of a mercury or glucose solution, and the water or solvent is removed by evaporation, suction or the like. A two-dimensional crystal form can be formed, and a three-dimensional crystal can be formed by increasing the protein concentration without using metal ions. These crystals can be converted into a form suitable for the purpose of use by transferring and attaching the crystals onto a solid two-dimensional substrate or by isolating the crystals themselves from the liquid surface.
【０００９】たとえばこの発明が対象とする蛋白質とし
てはアポフェリチンや鉄、マンガン、ニッケル、コバル
ト等の遷移金属などのコアを持ったフェリチン等がその
代表例として示される。改変するためのアミノ酸として
は、たとえばセリン、トレオニン、グリシン、アラニン
等の電荷を持たないものがその代表例として示される。For example, as proteins to which the present invention is directed, apoferritin, ferritin having a core of a transition metal such as iron, manganese, nickel, cobalt and the like are shown as typical examples. Representative examples of amino acids for modification are those having no charge such as serine, threonine, glycine and alanine.
【００１０】以下、実施例を示し、さらに詳しくこの発
明について説明する。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
【００１１】[0011]
【実施例】蛋白質は馬肝臓よりクローニングしたＬ鎖の
みからなるアポフェリチン（Ｍｗ＝４４４，０００）を
大腸菌により発現させた組み換え体を使用した。アポフ
ェリチンはカドミニウムイオンの塩橋により３次元結晶
（面心立方格子Ｆ４３２）を作ることが知られている。
このアポフェリチンのカドミニウムイオン結合部位にあ
たるアスパラギン酸（８４）およびグルタミン（８６）
を電荷のないセリンにした改変体と野生型の結晶性を比
較した。[Example] As a protein, a recombinant clone was used in which apoferritin (Mw = 444,000) consisting only of L chain cloned from horse liver was expressed in Escherichia coli. It is known that apoferritin forms a three-dimensional crystal (face-centered cubic lattice F432) by a salt bridge of cadmium ion.
Aspartic acid (84) and glutamine (86), which are the cadmium ion binding sites of this apoferritin
The crystallinity of the wild-type was compared with that of the modified form in which the amino acid was changed to uncharged serine.
【００１２】２次元の結晶化には、図１に示した手順を
採用した。すなわち、次の通りとした。 ａ．直径１５ｍｍの円形テフロントラフに２％グルコー
ス溶液を０．５ｍｌ満たす。マイクロシリンジの注射針
をグルコース展開層の中にいれ、たん白質溶液（１−５
μｌ）を注入する。For the two-dimensional crystallization, the procedure shown in FIG. 1 was adopted. That is, it was set as follows. a. A circular theorefluff having a diameter of 15 mm is filled with 0.5 ml of a 2% glucose solution. Insert the needle of a microsyringe into the glucose spreading layer, and add the protein solution (1-5
μl) is injected.
【００１３】ｂ．たん白質溶液は比重の差により表面に
上昇し、表面に達するとすみやかに界面に展開する。こ
の方法をとることで均一で再現性のよい展開ができるよ
うになった。たん白質濃度は０．３−５ｍｇ／ｍｌであ
る。 ｃ．展開された、たん白質の一部は表面で変性して薄い
（約１ｎｍ）均一な膜を形成する。変性していないたん
白質はこの膜に吸着していく。B. The protein solution rises to the surface due to the difference in specific gravity, and when it reaches the surface, it quickly spreads to the interface. By adopting this method, uniform and reproducible development became possible. The protein concentration is 0.3-5 mg / ml. c. A part of the developed protein is denatured on the surface to form a thin (about 1 nm) uniform film. Undenatured protein adsorbs to this membrane.
【００１４】ｄ．グルコース溶液中に１０ｍＭ ＣｄＳ
Ｏ4 と０．１５Ｍ ＮａＣｌをいれておくとアポフェリ
チンは大きな二次元結晶をつくる。この二次元結晶は変
性膜と共に、カーボン支持膜または多孔カーボン膜を張
った電顕用グリッドに水平付着法で転写する。とくに多
孔カーボン膜に転写したものは質のよい２次元結晶が得
られた。D. 10 mM CdS in glucose solution
When O 4 and 0.15M NaCl are added, apoferritin forms large two-dimensional crystals. The two-dimensional crystals are transferred together with the modified film to a grid for an electron microscope having a carbon support film or a porous carbon film by a horizontal attachment method. Especially when transferred to the porous carbon film, a good quality two-dimensional crystal was obtained.
【００１５】野生型アポフェリチンの場合、グルコース
溶液にカドミニウム（１０ｍＭ）を加えることで大きな
（１μｍ2 以上）２次元結晶（６方格子）の成長が観察
された。画像解析の結果、アポフェリチンは３回対称軸
を結晶面に垂直に向けた、面心立方格子Ｆ４３２の
（１，１，１）面と同じ分子配向をしていることが画像
解析の結果わかった（図２Ａ（ａ＝ｂ＝１３ｎｍ，γ＝
１２０°））。カドミニウム結合部位を持たない改変体
では、カドミニウムの有無にかかわらず２次元結晶、３
次元結晶を形成した。２次元結晶はａ＝ｂ＝１３ｎｍ，
γ＝９０°の正方格子、ａ＝ｂ＝１３ｎｍ，γ＝１００
°（図２Ｂ）およびａ＝１３，ｂ＝１５ｎｍ，γ＝１２
０°（図２Ｃ）の斜方格子、ａ＝ｂ＝１３ｎｍ，γ＝１
２０°（図２Ｄ）の六方格子などの結晶系が見られた。
野生型とは異なり、どの結晶系も２回対称軸を垂直にし
ていると考えられる。なお、図２Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ左側は
負染色した電顕像、中央はそのフーリエ変換像、右側は
フーリエ変換による再構成像である。また図３ａ，ｂ，
ｃにはＸ線構造解析より得られた構造因子を使って計算
した投影像を示した。ａは、（１，１，１）面の投影像
（２．０ｎｍ分解能）、ｂは、（１，１，０）面の投影
像（２．０ｎｍ分解能）およびｃは、（１，１，０）面
の投影像（２．４ｎｍ分解能）を示している。カドミニ
ウム結合部位を持たない改変体は結晶をつくらないと予
想していたが、生成した改変体はカドミニウム塩橋によ
る強い相互作用がなくなった結果、他の部位による蛋白
質間相互作用が顕著になって多彩な結晶系ができたもの
と考えられる。野生型でカドミニウムが存在しない場合
に結晶しないのは、その結合部位の電荷による斥力のた
めと考えられる。In the case of wild-type apoferritin, growth of large (1 μm 2 or more) two-dimensional crystals (hexagonal lattice) was observed by adding cadmium (10 mM) to the glucose solution. As a result of the image analysis, it was found that the apoferritin has the same molecular orientation as the (1,1,1) plane of the face-centered cubic lattice F432 with the 3-fold symmetry axis oriented perpendicular to the crystal plane. 2A (a = b = 13 nm, γ =
120 °)). In the modified form that does not have a cadmium binding site, a two-dimensional crystal with or without cadmium
A dimensional crystal was formed. Two-dimensional crystal has a = b = 13 nm,
Square lattice with γ = 90 °, a = b = 13 nm, γ = 100
(FIG. 2B) and a = 13, b = 15 nm, γ = 12
Orthogonal lattice at 0 ° (FIG. 2C), a = b = 13 nm, γ = 1
A crystal system such as a hexagonal lattice at 20 ° (Fig. 2D) was observed.
Unlike the wild type, it is considered that all crystal systems have the two-fold symmetry axis vertical. 2A, B, C, and D are negatively stained electron microscope images, the center is the Fourier transform image thereof, and the right side is the reconstruction image by the Fourier transform. 3a, b,
In c, a projected image calculated using the structure factor obtained by X-ray structural analysis is shown. a is a projected image of the (1,1,1) plane (2.0 nm resolution), b is a projected image of the (1,1,0) plane (2.0 nm resolution), and c is (1,1,1). The projection image (2.4 nm resolution) of the (0) plane is shown. We expected that the variant without the cadmium binding site would not form crystals, but the resulting variant lost the strong interaction due to the cadmium salt bridge, resulting in significant protein-protein interactions at other sites. It is considered that various crystal systems were created. The fact that the wild type does not crystallize in the absence of cadmium is thought to be due to the repulsive force due to the charge at its binding site.
【００１６】このように、この発明によって、これまで
に実現されていない蛋白質結晶構造の制御が可能とな
る。As described above, according to the present invention, it becomes possible to control a protein crystal structure which has not been realized so far.
【００１７】[0017]
【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明によ
り、従来にない人為的に再構成される結晶形蛋白質構造
が実現され、分子素子等の次世代の蛋白質工学の技術発
展に大きく寄与し、かつ、機能材料としての応用を可能
とする。Industrial Applicability As described in detail above, according to the present invention, an artificially reconstructed crystalline protein structure which has not been hitherto realized is realized, which greatly contributes to the technological development of the next-generation protein engineering such as molecular devices. Moreover, it can be applied as a functional material.
【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]
【図１】２次元結晶の形成方法を例示した工程図であ
る。FIG. 1 is a process chart illustrating a method for forming a two-dimensional crystal.
【図２】実施例としての２次元結晶の電子顕微鏡像を示
した図面に代わる写真である。FIG. 2 is a photograph replacing a drawing showing an electron microscope image of a two-dimensional crystal as an example.
【図３】実施例としてのＸ線解析像について示した図面
に代わる写真である。FIG. 3 is a photograph replacing a drawing showing an X-ray analysis image as an example.
Claims (7)
質、もしくは金属イオンコアを持つ蛋白質の塩橋部位な
いしは金属イオンコア形成部位にあるアミノ酸が改変さ
れていることを特徴とする蛋白質結晶形の制御構造。1. A control structure of a crystal form of a protein, wherein a protein forming a salt bridge by a metal ion or an amino acid at a salt bridge site or a metal ion core forming site of a protein having a metal ion core is modified.
れている請求項２の構造。2. The structure of claim 2 which is modified by an uncharged amino acid.
１または２の構造。3. The structure according to claim 1 or 2, wherein the protein is an apoferritin.
ン等の電荷を持たないアミノ酸により改変されている請
求項３の構造。4. The structure according to claim 3, which is modified with an uncharged amino acid such as serine, threonine, glycine, or alanine.
は２の構造。5. The structure according to claim 1, wherein the protein is ferritin.
る請求項１ないし５のいずれかの構造。6. The structure according to claim 1, which is composed of a two-dimensional crystal form or a three-dimensional crystal form.
展開により得られている請求項６の構造。7. The structure according to claim 6, wherein the two-dimensional crystal is obtained by spreading a protein solution on the liquid surface.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30409394A JPH08157497A (en) | 1994-12-07 | 1994-12-07 | Control structure having protein crystalline form |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30409394A JPH08157497A (en) | 1994-12-07 | 1994-12-07 | Control structure having protein crystalline form |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08157497A true JPH08157497A (en) | 1996-06-18 |
Family
ID=17928942
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30409394A Pending JPH08157497A (en) | 1994-12-07 | 1994-12-07 | Control structure having protein crystalline form |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08157497A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1431244A1 (en) * | 2001-11-08 | 2004-06-23 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Micrograin film and process for producing the same |
-
1994
- 1994-12-07 JP JP30409394A patent/JPH08157497A/en active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1431244A1 (en) * | 2001-11-08 | 2004-06-23 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Micrograin film and process for producing the same |
| US7037728B2 (en) | 2001-11-08 | 2006-05-02 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Fine particle film and producing method of the same |
| US7399642B2 (en) | 2001-11-08 | 2008-07-15 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Fine particle film and producing method of the same |
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