JPH0814539B2 - Rate measurement method - Google Patents
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- JPH0814539B2 JPH0814539B2 JP62245988A JP24598887A JPH0814539B2 JP H0814539 B2 JPH0814539 B2 JP H0814539B2 JP 62245988 A JP62245988 A JP 62245988A JP 24598887 A JP24598887 A JP 24598887A JP H0814539 B2 JPH0814539 B2 JP H0814539B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 本発明は、レート測定法に関し、特に生化学、有機化
学、食品化学、化粧品化学、植物学、農芸化学、微生物
学、薬理学及び臨床化学等に多用される酵素活性、酵素
反応速度等の測定に関する。また、本発明は、液体試
料、特に血液、血漿、血清等の液体、尿等の排泄物、胃
液、膵液、胆汁、唾液等の分泌液、腹水、胸水等の穿刺
液などの検体についての自動分析方法における反応限界
レベルの設定に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION (a) Field of Industrial Application The present invention relates to a rate measuring method, and in particular biochemistry, organic chemistry, food chemistry, cosmetic chemistry, botany, agricultural chemistry, microbiology, pharmacology and clinical practice. The present invention relates to measurement of enzyme activity, enzyme reaction rate, etc., which are frequently used in chemistry and the like. Further, the present invention is an automatic sample for liquid samples, particularly liquids such as blood, plasma and serum, excrements such as urine, secretions such as gastric juice, pancreatic juice, bile, saliva, etc. Regarding the setting of the reaction limit level in the analytical method.
（ロ）従来の技術 例えば、生体試料中の酵素量又は基質量等は、酵素活
性を測定して求められている。この場合、多くの検体に
ついて迅速にかつ正確に分析するために、全工程の自動
化がはかられ、測定点を三以上設定し、二以上の吸光度
変化を求めるレート測定法が採用されている。(B) Conventional technology For example, the amount of enzyme or the amount of substrate in a biological sample is obtained by measuring the enzyme activity. In this case, in order to analyze many samples quickly and accurately, all steps are automated, and a rate measurement method is adopted in which three or more measurement points are set and two or more absorbance changes are obtained.
レート測定法を、例えば、シングルマルチ自動分析装
置により行う場合、キュベットロータにその回転中心を
中心とする円周に沿って、複数個のキュベットを配置
し、これを間欠的に移動させて、各キュベットを一個宛
各分析操作領域に送り、キュベットロータの間欠駆動の
停止時に、検体分注、第一及び第二試薬分注、攪拌、洗
浄及び乾燥等の分析操作を、夫々の分析操作領域に送ら
れたキュベットについて行わせ、一方、キュベットの列
に沿って測定装置を移動させて、各キュベット内の反応
について吸光度を測定し、これらの分析操作をキュベッ
トロータの間欠駆動の停止時毎に逐次行っている。When the rate measurement method is performed by, for example, a single multi-automatic analyzer, a plurality of cuvettes are arranged on a cuvette rotor along a circumference centered on the rotation center thereof, and the cuvettes are intermittently moved to each One cuvette is sent to each analysis operation area, and when intermittent driving of the cuvette rotor is stopped, analysis operations such as sample dispensing, first and second reagent dispensing, stirring, washing and drying are performed in each analysis operation area. The measurement is performed on the sent cuvette, while the measuring device is moved along the row of the cuvette to measure the absorbance of the reaction in each cuvette, and these analytical operations are sequentially performed every time the intermittent drive of the cuvette rotor is stopped. Is going.
このようにして、一個の検体について測定毎に求めら
れた複数の測定データから、目的とする当該酵素反応の
反応速度、特に反応初速度を求めて、目的の分析項目の
値を求めている。In this way, the reaction rate of the target enzyme reaction, particularly the initial reaction rate, is determined from the plurality of measurement data obtained for each measurement for one sample, and the value of the target analysis item is determined.
（ハ）発明が解決しようとする問題点 しかし、このようにして得られた複数の測定データか
ら成るデータ列は、例えば、酵素反応の進行と共に基質
が消費されて反応速度が低下するために、反応の直線性
が得られない部分を生じる。このような反応の非直線性
の部分を加味すると、反応の直線性が影響を受けて、正
確に反応速度の値を得ることができない。そこで、例え
ば、反応限界の吸光度を設定して測定が行われている。(C) Problems to be Solved by the Invention However, a data string composed of a plurality of measurement data obtained in this way is, for example, because the substrate is consumed and the reaction rate decreases as the enzymatic reaction progresses, A part where the linearity of the reaction cannot be obtained is generated. If such a non-linear portion of the reaction is taken into consideration, the linearity of the reaction is affected, and the value of the reaction rate cannot be accurately obtained. Therefore, for example, the absorbance at the reaction limit is set and the measurement is performed.
従来、このような反応限界の吸光度のレベル即ち反応
限界レベルは、試料毎に影響されるところから、第二試
薬分注前に測定され、第二試薬添加後の容量に容量換算
されて、試料毎に設定されているが、誤差を解消するに
到っておらず、その点改良すべく問題とされている。Conventionally, the level of the absorbance at the reaction limit, that is, the reaction limit level, is affected by each sample, and therefore is measured before the second reagent is dispensed and converted into the volume after the addition of the second reagent to obtain the sample. It is set for each, but it has not been solved yet, and it is a problem to improve it.
本発明は、従来のレート測定法における反応限界レベ
ルの設定に関する問題点を解消することを目的としてい
る。An object of the present invention is to solve the problems associated with setting the reaction limit level in the conventional rate measuring method.
（ニ）発明が解決しようとする問題点 本発明は、このような反応限界レベルの設定を行うこ
とができるレート測定法を提供することを目的としてい
る。(D) Problems to be Solved by the Invention An object of the present invention is to provide a rate measuring method capable of setting such a reaction limit level.
本発明は、従来法における誤差が、専ら、例えば、第
一試薬と第二試薬の混合後におけるpH等の条件の変化に
起因する点に着目してなされている。The present invention has been made paying attention to the fact that the error in the conventional method is due to, for example, a change in conditions such as pH after mixing the first reagent and the second reagent.
即ち、本発明は、分析試料に第一試薬を加え、その後
第二試薬を加えた反応液について、反応限界レベルを設
定して吸光度を複数回測定することにより、該反応液の
反応速度を求めるレート分析方法において、第二試薬ブ
ランク（LB2）、試薬組成に固有の吸光度（LR）及び第
二試薬を加えた後で第一回目の測定前における当該反応
液の吸光度（LM2）を求めて、反応限界レベル（L2）
を、次の式： L2＝LR＋（LM2−LB2） により設定することを特徴とするレート測定法にある。That is, the present invention obtains the reaction rate of the reaction liquid by adding the first reagent to the analysis sample and then adding the second reagent to the reaction liquid to set the reaction limit level and measuring the absorbance a plurality of times. In the rate analysis method, the second reagent blank (LB 2 ), the absorbance (LR) specific to the reagent composition, and the absorbance (LM 2 ) of the reaction solution after adding the second reagent and before the first measurement The reaction limit level (L 2 )
Is set by the following equation: L 2 = LR + (LM 2 −LB 2 ), which is a rate measurement method.
本発明においては、反応限界レベルは、第一試薬と第
二試薬の混合後におけるpH等の条件の変化を生じても、
正確に反応速度の値が求められるように、その実測デー
タの修正を適正に行うことができるものであり、第一試
薬と第二試薬の混合後の変化を包含できるように、第一
試薬と第二試薬の混合後における反応液の吸光度から求
められる。In the present invention, the reaction limit level, even if a change in conditions such as pH after mixing the first reagent and the second reagent,
It is possible to appropriately correct the actual measurement data so that the value of the reaction rate can be accurately determined, and to include the change after mixing the first reagent and the second reagent with the first reagent. It is determined from the absorbance of the reaction solution after mixing the second reagent.
本発明においては、この反応限界レベルは、第二試薬
添加後でレート測定用の第一回目の測定前の反応液の吸
光度を測定して、その値から反応限界レベルを求めるこ
とができる。また、本発明において、反応限界レベルに
は、第二試薬添加後に測定された吸光度がその侭使用す
ることができるが、もとより、標準試料により修正して
使用することもできる。この場合、反応液の測定箇所
は、第二試薬の添加位置に近いほど、例えば、第二試薬
添加直後であるのが、第二試薬添加後の反応の影響を受
けないので好ましい。したがって、本発明においては、
第二試薬添加後において、反応の影響を受けないか或い
は殆ど受けない時間内に反応液の吸光度が、反応限界レ
ベル設定用として測定される。しかし、例えば、第二試
薬添加後の反応の進行が早い場合などでは、レート測定
用の複数のデータの直線部から、第二試薬添加時の反応
液の吸光度を外挿法により求めることができる。しか
し、第二試薬添加後の反応液の吸光度を測定するのが、
正確であり好ましい。In the present invention, the reaction limit level can be determined by measuring the absorbance of the reaction solution after the addition of the second reagent and before the first measurement for rate measurement, and then determining the reaction limit level from the value. Further, in the present invention, the absorbance measured after addition of the second reagent can be used as the reaction limit level, but it can also be used after being corrected by a standard sample. In this case, it is preferable that the measurement position of the reaction solution is closer to the addition position of the second reagent, for example, immediately after the addition of the second reagent, since it is not affected by the reaction after the addition of the second reagent. Therefore, in the present invention,
After the addition of the second reagent, the absorbance of the reaction solution is measured for setting the reaction limit level within a time that is not or hardly affected by the reaction. However, for example, when the reaction proceeds rapidly after the addition of the second reagent, the absorbance of the reaction solution at the time of the addition of the second reagent can be obtained by extrapolation from the linear part of the plurality of data for rate measurement. . However, measuring the absorbance of the reaction solution after adding the second reagent is
Accurate and preferred.
（ホ）作用 本発明においては、レート測定法において、第二試薬
添加後で、レート測定用の第一回目の測定前における反
応液の吸光度を求めて反応限界レベルとするので、第一
試薬と第二試薬の混合液におけるpH等の変化の影響を受
けることなく、正確なレート測定を行うことができる。(E) Action In the present invention, in the rate measuring method, after the addition of the second reagent, the absorbance of the reaction solution before the first measurement for rate measurement is determined as the reaction limit level. Accurate rate measurement can be performed without being affected by changes in pH and the like in the mixed solution of the second reagent.
即ち、複数のキュベットは、キュベットロータにその
円周方向に配列されており、キュベットロータの間欠的
回転により、各分析作業領域、即ち、試料分注領域、第
一試薬分注領域、第一攪拌領域、第二試薬分注領域、第
二攪拌領域、反応領域、洗浄乾燥領域を逐次移動する。
そのキュベットロータの停止時において、洗浄乾燥領域
以外の各々の作業領域に位置するキュベットの内容物に
ついて、測定装置により測定が行われる。That is, the plurality of cuvettes are arranged in the cuvette rotor in the circumferential direction thereof, and by intermittent rotation of the cuvette rotor, each analysis work area, that is, the sample dispensing area, the first reagent dispensing area, and the first stirring area. The area, the second reagent dispensing area, the second stirring area, the reaction area, and the washing / drying area are sequentially moved.
When the cuvette rotor is stopped, the measuring device measures the contents of the cuvette located in each work area other than the cleaning / drying area.
本発明においては、第二試薬分注領域における、第二
試薬分注後の最初のキュベットロータの測定値から反応
限界レベルを設定することができる。また、本発明にお
いて、反応限界レベルは、第二試薬添加後の測定点の一
部における測定値から、演算により、或は外挿法により
設定することができる。In the present invention, the reaction limit level can be set from the measured value of the first cuvette rotor after the second reagent dispensing in the second reagent dispensing area. Further, in the present invention, the reaction limit level can be set by calculation or extrapolation from the measured value at a part of the measuring points after the addition of the second reagent.
本発明においては、レート測定終了後、吸光度が減少
する反応系では、上記反応限界レベル以上の測定値につ
いて演算を行い、反応速度が求められる。In the present invention, in the reaction system in which the absorbance decreases after the rate measurement is completed, the reaction rate is obtained by calculating the measured value above the reaction limit level.
（ヘ）実施例 以下、添付図面を参照して、本発明の実施の態様の例
を説明するが、本発明は、以下の説明及び例示により、
何ら制限を受けるものではない。(F) Examples Hereinafter, examples of embodiments of the present invention will be described with reference to the accompanying drawings.
There are no restrictions.
第１図は、本発明の一実施例について、従来技術と比
較する説明図であり、縦軸に吸光度がとられ、横軸に経
過時間がとられている。FIG. 1 is an explanatory diagram for comparing one embodiment of the present invention with the prior art, in which the vertical axis represents the absorbance and the horizontal axis represents the elapsed time.
本例において、複数の反応キュベットがキュベットロ
ータ（いずれも図示されていない。）に円周上に保持さ
れて、キュベットロータの間欠駆動により、検体分注、
第一試薬分注、第一攪拌、第二試薬分注、第二攪拌、反
応、洗浄及び乾燥等の各分析作業工程を間欠的に移動す
る。In this example, a plurality of reaction cuvettes are circumferentially held by a cuvette rotor (none of which is shown), and the sample is dispensed by intermittent driving of the cuvette rotor.
Each analysis work process such as first reagent dispensing, first stirring, second reagent dispensing, second stirring, reaction, washing and drying is intermittently moved.
時間（t0）においてキュベットに検体が分注され、そ
の後時間（t1）において、第一試薬が分注され（Ｒ−
１）、攪拌される（ST−１）。その後、時間（t2）にお
いて、第二試薬が添加され（Ｒ−２）、攪拌混合される
（ST−２）。その直後に、略同時間（t2）においてキュ
ベット内の反応液の吸光度について測定され、反応限界
レベルが演算され記録設定される。その後、時間（t3）
〜時間（t12）の各時間ごとに、キュベットの内の反応
液について、吸光度の測定が行われ記録される。The sample is dispensed into the cuvette at time (t 0 ) and then at time (t 1 ) the first reagent is dispensed (R-
1), it is stirred (ST-1). After that, at time (t 2 ), the second reagent is added (R-2) and mixed by stirring (ST-2). Immediately thereafter, the absorbance of the reaction solution in the cuvette is measured at approximately the same time (t 2 ), and the reaction limit level is calculated and recorded and set. Then time (t 3 )
The absorbance of the reaction solution in the cuvette is measured and recorded every time period (to 12 hours).
このように測定され記録された測定データは、その吸
光度が前記反応限界レベル以上にあるものについて集計
される。The measurement data thus measured and recorded are tabulated for those whose absorbance is above the reaction limit level.
本例においては、その集計された結果が、第１図に示
されている、第１図において、反応曲線１は試薬ブラン
クの反応曲線であり、反応曲線２は、検体を測定したと
きの反応曲線であり、反応曲線３は従来法における同一
の検体を測定したときの反応曲線である。In this example, the tabulated results are shown in FIG. 1. In FIG. 1, the reaction curve 1 is the reaction curve of the reagent blank, and the reaction curve 2 is the reaction when measuring the sample. A reaction curve 3 is a reaction curve when the same sample is measured in the conventional method.
本例の測定にあたって、予め、検体に代えて水を使用
して、上記と同様に第一試薬及び第二試薬を分注して、
第一試薬ブランク（LB1）、第二試薬ブランク（LB2）及
び試薬組成により固有の吸光度（LR）が各々測定され記
録されている。In the measurement of this example, in advance, using water instead of the sample, dispensing the first reagent and the second reagent in the same manner as above,
The specific absorbance (LR) is measured and recorded according to the first reagent blank (LB 1 ), the second reagent blank (LB 2 ), and the reagent composition.
また、本例における第二試薬添加直後の時間（t2）に
おいて求められた反応液の吸光度はLM2であり、従来例
における第一試薬添加後の吸光度はLM1である。Further, the absorbance of the reaction solution obtained in the time (t 2 ) immediately after the addition of the second reagent in this example is LM 2 , and the absorbance after the addition of the first reagent in the conventional example is LM 1 .
本例における反応限界レベル（L2）は、次の式、 L2＝LR＋（LM2−LB2） で与えられる。一方、従来例における反応限界レベル
（L1）は、次の式で与えられる。The reaction limit level (L 2 ) in this example is given by the following equation, L 2 = LR + (LM 2 −LB 2 ). On the other hand, the reaction limit level (L 1 ) in the conventional example is given by the following equation.
L1＝LR＋Ｋ（LM1−LB1） この式において、Ｋ＝（SV＋R1）／（SV＋R1＋R2）で
与えられる。但し、SVは試料の容量であり、R1は第一試
薬の容量であり、R2は第二試薬の容量である。 L 1 = LR + K (LM 1 -LB 1) In this equation, is given by K = (SV + R1) / (SV + R1 + R2). However, SV is the volume of the sample, R1 is the volume of the first reagent, and R2 is the volume of the second reagent.
第１図において、反応曲線２を、本例の反応限界レベ
ル（L2）により判定すると、反応限界レベル（L2）を越
える測定値、即ち時間（t3）〜時間（t9）の測定値が集
計される。In FIG. 1, when the reaction curve 2 is judged by the reaction limit level (L 2 ) of this example, the measured value exceeding the reaction limit level (L 2 ), that is, the measurement of time (t 3 ) to time (t 9 ). Values are aggregated.
一方、従来例の反応限界レベル（L1）により反応曲線
２を判定すると反応曲線２の時間（t3）〜時間（t12）
の測定値が集計される。On the other hand, when the reaction curve 2 is judged by the reaction limit level (L 1 ) of the conventional example, the reaction curve 2 time (t 3 ) to time (t 12 )
The measured values of are aggregated.
したがって、従来例においては、非直線性の時間（t
10）〜時間（t12）の測定値を加えて演算されており、
その分、反応曲線３の直線性から外れることになり、正
確な反応速度値が得られない。Therefore, in the conventional example, the nonlinearity time (t
It is calculated by adding the measured values from 10 ) to time (t 12 ),
As a result, the linearity of the reaction curve 3 is deviated, and an accurate reaction rate value cannot be obtained.
例えば、同一の吸光度減少反応を利用したシート測定
法（GOT,GPT）などの吸光度の場合本例によると、0.375
abs/minであるのに対し、従来例の場合には、0.310abs/
minであり、その差は大略20パーセントに及ぶ。For example, in the case of the absorbance of the sheet measurement method (GOT, GPT) using the same absorbance decrease reaction, according to this example, 0.375
abs / min, in the case of the conventional example, 0.310abs / min
min, and the difference is about 20%.
外挿法の場合には、時間（t3）における吸光度（AS）
及び試薬ブランク（AB）反応曲線２における時間（t3）
〜時間（t5）の測定区間における吸光度変化率△AS及び
試薬ブランク△AB各測定時間間隔△Ｔとすると、LM
2は、次式により求められ、 LM2＝AS−△AS・△ｔ また、試薬ブランクLB2は、次式により求められる。In the case of extrapolation, absorbance (AS) at time (t 3 )
And reagent blank (AB) Reaction curve 2 time (t 3 )
Absorbance change rate ΔAS and reagent blank ΔAB in the measurement section from ~ time (t 5 ) to each measurement time interval ΔT, LM
2 is obtained by the following equation: LM 2 = AS−ΔAS · Δt Further, the reagent blank LB 2 is obtained by the following equation.
LB2＝AB−△AB・△ｔ 反応限界レベルは、実測の場合と同様に、次式により
求められる。LB 2 = AB−ΔAB · Δt The reaction limit level is calculated by the following equation, as in the case of actual measurement.
L2＝LR＋（LM2−LB2） 本例においても、先の実施例と同様に正確な測定結果
が得られる。L 2 = LR + (LM 2 −LB 2 ) Also in this example, an accurate measurement result can be obtained as in the previous example.
（ト）発明の効果 本発明においては、レート測定法において、第二試薬
添加後で、レート測定用の第一回目の測定前における反
応液の吸光度を測定して反応限界レベルとするので、従
来法に比して、第一試薬と第二試薬の混合等による影響
を受けることがなくなり、正確な反応速度を求めること
ができる。また、従来法のように反応限界レベルを設定
するのに、容量換算する必要がなくなって、容量換算に
基づく誤差を生ずることもなくなる。(G) Effect of the Invention In the present invention, in the rate measuring method, after the addition of the second reagent, the absorbance of the reaction solution before the first measurement for rate measurement is measured to be the reaction limit level. Compared with the method, it is possible to obtain an accurate reaction rate without being affected by the mixing of the first reagent and the second reagent. Further, it is not necessary to convert the volume to set the reaction limit level as in the conventional method, and an error based on the capacity conversion is not generated.
第１図は、本発明の一実施例について、従来技術と比較
する説明図であり、縦軸に吸光度がとられ、横軸に経過
時間がとられている。 図中の符号においては、１は試薬ブランクの反応曲線で
あり、２は本例における反応曲線であり、３は従来例の
反応曲線である。t0〜t12は時間、Ｒ−１は第一試薬、S
T−１は攪拌、Ｒ−２第二試薬、ST−２は攪拌、LB1は第
一試薬ブランク、LB2は第二試薬ブランク、LRは固有の
吸光度、LM1は第一試薬添加後の吸光度、LM2は反応後の
吸光度、L1は反応限界レベル、L2は反応限界レベル、AS
は時間t3における吸光度、ABは時間t3における試薬ブラ
ンクである。FIG. 1 is an explanatory diagram for comparing one embodiment of the present invention with the prior art, in which the vertical axis represents the absorbance and the horizontal axis represents the elapsed time. In the reference numerals in the figure, 1 is the reaction curve of the reagent blank, 2 is the reaction curve of this example, and 3 is the reaction curve of the conventional example. t 0 to t 12 is time, R-1 is the first reagent, S
T-1 is stirring, R-2 is the second reagent, ST-2 is stirring, LB 1 is the first reagent blank, LB 2 is the second reagent blank, LR is the specific absorbance, and LM 1 is after the addition of the first reagent. Absorbance, LM 2 is the absorbance after reaction, L 1 is the reaction limit level, L 2 is the reaction limit level, AS
Is the absorbance at time t 3 , and AB is the reagent blank at time t 3 .
Claims (1)
薬を加えた反応液について、反応限界レベルを設定して
吸光度を複数回測定することにより、該反応液の反応速
度を求めるレート分析方法において、第二試薬ブランク
（LB2）、試薬組成に固有の吸光度（LR）及び第二試薬
を加えた後で第一回目の測定前における当該反応液の吸
光度（LM2）を求めて、反応限界レベル（L2）を、次の
式： L2＝LR＋（LM2−LB2） により設定することを特徴とするレート測定法。1. A rate for determining a reaction rate of a reaction solution obtained by adding a first reagent to an analysis sample and then adding a second reagent to the reaction solution to set a reaction limit level and measuring the absorbance a plurality of times. In the analysis method, determine the second reagent blank (LB 2 ), the absorbance specific to the reagent composition (LR), and the absorbance (LM 2 ) of the reaction solution before the first measurement after adding the second reagent. , A rate measuring method characterized in that the reaction limit level (L 2 ) is set by the following formula: L 2 = LR + (LM 2 −LB 2 ).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62245988A JPH0814539B2 (en) | 1987-09-30 | 1987-09-30 | Rate measurement method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62245988A JPH0814539B2 (en) | 1987-09-30 | 1987-09-30 | Rate measurement method |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6488233A JPS6488233A (en) | 1989-04-03 |
| JPH0814539B2 true JPH0814539B2 (en) | 1996-02-14 |
Family
ID=17141803
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62245988A Expired - Fee Related JPH0814539B2 (en) | 1987-09-30 | 1987-09-30 | Rate measurement method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0814539B2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5759150A (en) * | 1980-09-26 | 1982-04-09 | Olympus Optical Co Ltd | Method for biochemical analysis |
| JPS5782753A (en) * | 1980-11-10 | 1982-05-24 | Hitachi Ltd | Method and device for analysis with automatic setting of reaction limit |
-
1987
- 1987-09-30 JP JP62245988A patent/JPH0814539B2/en not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6488233A (en) | 1989-04-03 |
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