JPH08114588A - サイトカイン産生抑制剤の簡易評価法 - Google Patents
サイトカイン産生抑制剤の簡易評価法Info
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- JPH08114588A JPH08114588A JP6253139A JP25313994A JPH08114588A JP H08114588 A JPH08114588 A JP H08114588A JP 6253139 A JP6253139 A JP 6253139A JP 25313994 A JP25313994 A JP 25313994A JP H08114588 A JPH08114588 A JP H08114588A
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 in vivoでサイトカインの産生阻害剤を評価
する簡便な方法を提供し、喘息やアトピー性皮膚炎等の
アレルギー疾患の治療剤の評価に役立てること。 【構成】 実験動物を抗原で感作し、感作成立動物に被
検物質を投与後、抗原を局所投与することにより惹起さ
れる血清中又は抗原投与局所洗浄液中のサイトカイン濃
度を測定することを特徴とするサイトカイン産生抑制剤
の簡易評価法。
する簡便な方法を提供し、喘息やアトピー性皮膚炎等の
アレルギー疾患の治療剤の評価に役立てること。 【構成】 実験動物を抗原で感作し、感作成立動物に被
検物質を投与後、抗原を局所投与することにより惹起さ
れる血清中又は抗原投与局所洗浄液中のサイトカイン濃
度を測定することを特徴とするサイトカイン産生抑制剤
の簡易評価法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、喘息やアトピー性皮
膚炎等のアレルギー疾患の治療のために有用なサイトカ
イン産生阻害剤の簡易評価法に関する。
膚炎等のアレルギー疾患の治療のために有用なサイトカ
イン産生阻害剤の簡易評価法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、アレルギー反応はＩｇＥ肥満細胞
の系で説明されてきた。従って、ヒスタミン等の化学伝
達物質遊離阻害剤が数多く開発されてきたが、重症な喘
息やアトピー性皮膚炎には余り有効ではない。過敏症状
や慢性的アレルギー性炎症反応は別の機序でも起こるか
らである。その機序としてＴ細胞好酸球系が注目を集め
ている。Ｔ細胞が産生するサイトカインとしてはインタ
ーロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、Ｉ
Ｌ−５、ＩＬ−６、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）等
が知られている。例えば、このうちインターロイキン−
５（ＩＬ−５）はリンパ球の一種Ｔｈ２細胞の抗原刺激
によって産生される。ＩＬ−５は好酸球を活性化し、活
性化好酸球は病変組織に集まり組織障害性の蛋白質を遊
離する。その結果、刺激に対するバリアの細胞（気道上
皮細胞等）が剥離し、神経が露出し、過敏症状ひいては
慢性的アレルギー性炎症になると考えられる。従って、
Ｔｈ２細胞の機能を抑えてＩＬ−５産生を抑制する薬剤
は新しい作用機序の喘息及びアトピー性皮膚炎の治療薬
として有用であると考えられる。
の系で説明されてきた。従って、ヒスタミン等の化学伝
達物質遊離阻害剤が数多く開発されてきたが、重症な喘
息やアトピー性皮膚炎には余り有効ではない。過敏症状
や慢性的アレルギー性炎症反応は別の機序でも起こるか
らである。その機序としてＴ細胞好酸球系が注目を集め
ている。Ｔ細胞が産生するサイトカインとしてはインタ
ーロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、Ｉ
Ｌ−５、ＩＬ−６、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）等
が知られている。例えば、このうちインターロイキン−
５（ＩＬ−５）はリンパ球の一種Ｔｈ２細胞の抗原刺激
によって産生される。ＩＬ−５は好酸球を活性化し、活
性化好酸球は病変組織に集まり組織障害性の蛋白質を遊
離する。その結果、刺激に対するバリアの細胞（気道上
皮細胞等）が剥離し、神経が露出し、過敏症状ひいては
慢性的アレルギー性炎症になると考えられる。従って、
Ｔｈ２細胞の機能を抑えてＩＬ−５産生を抑制する薬剤
は新しい作用機序の喘息及びアトピー性皮膚炎の治療薬
として有用であると考えられる。
【０００３】最近、免疫抑制剤がＩＬ−５の産生を抑制
することが判った。例えば、免疫抑制剤であるＦＫ５０
６をアトピー性皮膚炎患者に塗布したところ、明らかに
症状の改善が認められた。同様な結果は他の免疫抑制剤
サイクロスポリンＡやステロイドでも認められている。
すなわち、ＩＬ−５の産生抑制剤はアレルギー性炎症を
抑え、喘息やアトピー性皮膚炎の有用な治療剤になると
考えられる。
することが判った。例えば、免疫抑制剤であるＦＫ５０
６をアトピー性皮膚炎患者に塗布したところ、明らかに
症状の改善が認められた。同様な結果は他の免疫抑制剤
サイクロスポリンＡやステロイドでも認められている。
すなわち、ＩＬ−５の産生抑制剤はアレルギー性炎症を
抑え、喘息やアトピー性皮膚炎の有用な治療剤になると
考えられる。
【０００４】サイトカイン産生阻害作用を試験する方法
としては、これまでin vitroで、ヒトもしくは動物の単
核球細胞からのサイトカイン分泌を定量する方法が一般
的に知られている。
としては、これまでin vitroで、ヒトもしくは動物の単
核球細胞からのサイトカイン分泌を定量する方法が一般
的に知られている。
【０００５】一方、in vivoではサイトカイン産生に対
する直接的な試験方法は報告されていない。しかし、サ
イトカインの関与が示唆される実験系の報告は数多く報
告されている。例えば、ＩＬ−５に関しては、Int.Arc
h.Allergy Apple.Immunol.，第８１巻，第８１頁（１９
８６年）、同，第９６巻，第４１頁（１９９１年）及び
Am.Rev.Respir.Dis.，第１４１巻，１２８９頁（１９９
０年）では、抗原感作動物に抗原を投与することにより
惹起される好酸球を中心とした細胞浸潤が起こること、
更にその細胞浸潤反応が免疫抑制剤のサイクロスポリン
Ａ（ＣｓＡ）や副腎皮質ステロイドのデキサメタゾン
（Ｄｅｘ）で抑制されること、また、Int.Arch.Allergy
Apple.Immunol.，第９４巻，第１７１頁（１９９１
年）では、感作及び反応惹起部位が肺である点で異なる
ものの前記報告と同様に細胞浸潤反応が抗ＩＬ−５抗体
で抑制されることが報告されている。
する直接的な試験方法は報告されていない。しかし、サ
イトカインの関与が示唆される実験系の報告は数多く報
告されている。例えば、ＩＬ−５に関しては、Int.Arc
h.Allergy Apple.Immunol.，第８１巻，第８１頁（１９
８６年）、同，第９６巻，第４１頁（１９９１年）及び
Am.Rev.Respir.Dis.，第１４１巻，１２８９頁（１９９
０年）では、抗原感作動物に抗原を投与することにより
惹起される好酸球を中心とした細胞浸潤が起こること、
更にその細胞浸潤反応が免疫抑制剤のサイクロスポリン
Ａ（ＣｓＡ）や副腎皮質ステロイドのデキサメタゾン
（Ｄｅｘ）で抑制されること、また、Int.Arch.Allergy
Apple.Immunol.，第９４巻，第１７１頁（１９９１
年）では、感作及び反応惹起部位が肺である点で異なる
ものの前記報告と同様に細胞浸潤反応が抗ＩＬ−５抗体
で抑制されることが報告されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、in vit
ro試験に関しては、in vitro試験であるため、生体内
におけるサイトカイン産生系と分泌機序が異なることが
考えられ、数種のサイトカインの分泌が均等に抑制され
てしまう可能性が高い。また、被験薬剤の生体に対する
影響が免疫系にどの様に作用するか不明である。また、
特にＩＬ−５に関しては、健常人末梢血単核球細胞や正
常動物単核球細胞からは各種刺激物質を用いて刺激を行
ってもほとんど産生されない。従って、喘息患者末梢血
単核球細胞やＩＬ−５高産生性のＴ細胞クローンを用い
る必要があり、細胞調製に多くの労力と時間を必要と
し、また多くの制約を受ける。
ro試験に関しては、in vitro試験であるため、生体内
におけるサイトカイン産生系と分泌機序が異なることが
考えられ、数種のサイトカインの分泌が均等に抑制され
てしまう可能性が高い。また、被験薬剤の生体に対する
影響が免疫系にどの様に作用するか不明である。また、
特にＩＬ−５に関しては、健常人末梢血単核球細胞や正
常動物単核球細胞からは各種刺激物質を用いて刺激を行
ってもほとんど産生されない。従って、喘息患者末梢血
単核球細胞やＩＬ−５高産生性のＴ細胞クローンを用い
る必要があり、細胞調製に多くの労力と時間を必要と
し、また多くの制約を受ける。
【０００７】in vivo試験に関しても、上記のいずれの
報告も局所の浸潤細胞を指標とした評価であり実験には
多くの労力と時間を要する。さらに、浸潤細胞を指標と
しているため、被検薬剤がどのサイトカインに対して作
用をしているかが不明であり、薬剤の性質を調べること
が不可能である。
報告も局所の浸潤細胞を指標とした評価であり実験には
多くの労力と時間を要する。さらに、浸潤細胞を指標と
しているため、被検薬剤がどのサイトカインに対して作
用をしているかが不明であり、薬剤の性質を調べること
が不可能である。
【０００８】本発明の目的は、in vivoでサイトカイン
の産生阻害剤を評価する簡便な方法を提供し、喘息やア
トピー性皮膚炎等のアレルギー疾患の治療剤の評価に役
立てることである。
の産生阻害剤を評価する簡便な方法を提供し、喘息やア
トピー性皮膚炎等のアレルギー疾患の治療剤の評価に役
立てることである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、この様な
課題を解決するために、以前より細胞浸潤反応はＩＬ−
５により引き起こされることに注目していた。そこで、
抗原を感作動物に投与することにより、動物の血清中及
び抗原投与部位局所にＩＬ−５を中心とした数種のサイ
トカインが分泌されるのではないかと検討した結果、Ｉ
Ｌ−５の他数種のサイトカインが分泌することを見いだ
し本発明を完成した。
課題を解決するために、以前より細胞浸潤反応はＩＬ−
５により引き起こされることに注目していた。そこで、
抗原を感作動物に投与することにより、動物の血清中及
び抗原投与部位局所にＩＬ−５を中心とした数種のサイ
トカインが分泌されるのではないかと検討した結果、Ｉ
Ｌ−５の他数種のサイトカインが分泌することを見いだ
し本発明を完成した。
【００１０】すなわち、本発明は、実験動物を抗原で感
作し、感作成立動物に被検物質を投与後、抗原を局所投
与することにより惹起される血清中又は抗原投与局所洗
浄液中のサイトカイン濃度を測定することを特徴とする
サイトカイン産生抑制剤の簡易評価法である。
作し、感作成立動物に被検物質を投与後、抗原を局所投
与することにより惹起される血清中又は抗原投与局所洗
浄液中のサイトカイン濃度を測定することを特徴とする
サイトカイン産生抑制剤の簡易評価法である。
【００１１】本発明におけるサイトカインはＴ細胞が産
生するサイトカイン、例えばインターロイキン−２（Ｉ
Ｌ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、
インターフェロンγ（ＩＦＮγ）等であり、好ましくは
ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５である。また、抗原はア
スカリス抽出物（Ａｓｃ）、卵白アルブミン（ＯＡ）、
ダニ抽出物（ｍｉｔｅ）、ブタクサ花粉抽出物（ｒａｇ
ｗｅｅｄ）、スギ花粉抽出物又はライ麦花粉抽出物（ｒ
ｙｅ ｇｒａｓｓ）であることが好ましい。また、実験
動物がラット又はマウスであることが好ましい。また、
感作方法が皮下感作又は腹腔感作であることが好まし
い。また、抗原の局所投与部位が腹腔内又は気道内吸入
投与であることが好ましい。また、サイトカイン定量試
料が血清中又は抗原投与局所洗浄液であることが好まし
い。また、被検物質の投与時に使用した溶媒を投与した
動物の各種サイトカイン濃度を比較することが好まし
い。
生するサイトカイン、例えばインターロイキン−２（Ｉ
Ｌ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、
インターフェロンγ（ＩＦＮγ）等であり、好ましくは
ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５である。また、抗原はア
スカリス抽出物（Ａｓｃ）、卵白アルブミン（ＯＡ）、
ダニ抽出物（ｍｉｔｅ）、ブタクサ花粉抽出物（ｒａｇ
ｗｅｅｄ）、スギ花粉抽出物又はライ麦花粉抽出物（ｒ
ｙｅ ｇｒａｓｓ）であることが好ましい。また、実験
動物がラット又はマウスであることが好ましい。また、
感作方法が皮下感作又は腹腔感作であることが好まし
い。また、抗原の局所投与部位が腹腔内又は気道内吸入
投与であることが好ましい。また、サイトカイン定量試
料が血清中又は抗原投与局所洗浄液であることが好まし
い。また、被検物質の投与時に使用した溶媒を投与した
動物の各種サイトカイン濃度を比較することが好まし
い。
【００１２】本発明の簡易試験方法を詳述すれば、実験
動物を抗原で感作し、感作成立動物に被検物質を２日か
ら１週間連続投与または、単回投与を行い、最終投与か
ら２〜４時間放置させた後抗原の一定用量を局所投与す
る。その後３〜８時間放置後、エーテル麻酔下に動物か
ら試料を得る。すなわち、血清の場合は、大腿動静脈切
断により採血し、遠心分離により血清を得る。局所洗浄
液の場合は、例えば腹腔洗浄液の場合、０．１％牛血清
アルブミン加生理食塩液１ｍｌにて腹腔洗浄を行い遠心
分離により、腹腔洗浄液を得る。
動物を抗原で感作し、感作成立動物に被検物質を２日か
ら１週間連続投与または、単回投与を行い、最終投与か
ら２〜４時間放置させた後抗原の一定用量を局所投与す
る。その後３〜８時間放置後、エーテル麻酔下に動物か
ら試料を得る。すなわち、血清の場合は、大腿動静脈切
断により採血し、遠心分離により血清を得る。局所洗浄
液の場合は、例えば腹腔洗浄液の場合、０．１％牛血清
アルブミン加生理食塩液１ｍｌにて腹腔洗浄を行い遠心
分離により、腹腔洗浄液を得る。
【００１３】得られた試料（血清又は局所洗浄液）につ
いて適度の希釈を行い、酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ法）等
により、各種サイトカイン量を定量し、溶媒投与の対照
群の値との比較により、被検物質の各種サイトカイン産
生に及ぼす作用をin vivoで評価することができる。
いて適度の希釈を行い、酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ法）等
により、各種サイトカイン量を定量し、溶媒投与の対照
群の値との比較により、被検物質の各種サイトカイン産
生に及ぼす作用をin vivoで評価することができる。
【００１４】
【発明の効果】本発明は血清中又は抗原投与局所洗浄液
中のサイトカイン濃度を測定すること、特に血清中のサ
イトカイン濃度を測定することに特徴があり、これによ
ってinvivoでサイトカインの産生阻害剤を評価する極め
て簡便な方法が提供された。従って、本発明の評価法は
喘息やアトピー性皮膚炎の治療剤の評価に使用できるこ
と。
中のサイトカイン濃度を測定すること、特に血清中のサ
イトカイン濃度を測定することに特徴があり、これによ
ってinvivoでサイトカインの産生阻害剤を評価する極め
て簡便な方法が提供された。従って、本発明の評価法は
喘息やアトピー性皮膚炎の治療剤の評価に使用できるこ
と。
【００１５】
【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説
明する。
明する。
【００１６】実施例 （試験動物）体重約２０ｇのＢＡＬＢ／Ｃ系雌性マウス
に、週１回、合計３回抗原であるＡｓｃ（５ｍｇ／ｋ
ｇ）で皮下感作を行った。最終感作の１週間後、感作成
立マウスを１８時間絶食後、１群４〜５匹で実験に使用
した。アラビヤゴム溶液に懸濁調製した被検物質の一定
用量（表１）を抗原投与の２４時間及び２時間前に経口
投与し、Ａｓｃ（５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。Ａ
ｓｃ投与後さらに６時間放置し、エーテル麻酔下、大腿
動静脈から採血し、遠心分離（３０００ｒｐｍ，１５
分）により得た血清中のサイトカイン（ＩＬ−２，ＩＬ
−４，ＩＬ−５）濃度を酵素免疫法により定量した。な
お、サイクロスポリンＡについては、Ａｓｃ投与の７日
前から、１日１回ずつ合計８回投与を行った。
に、週１回、合計３回抗原であるＡｓｃ（５ｍｇ／ｋ
ｇ）で皮下感作を行った。最終感作の１週間後、感作成
立マウスを１８時間絶食後、１群４〜５匹で実験に使用
した。アラビヤゴム溶液に懸濁調製した被検物質の一定
用量（表１）を抗原投与の２４時間及び２時間前に経口
投与し、Ａｓｃ（５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。Ａ
ｓｃ投与後さらに６時間放置し、エーテル麻酔下、大腿
動静脈から採血し、遠心分離（３０００ｒｐｍ，１５
分）により得た血清中のサイトカイン（ＩＬ−２，ＩＬ
−４，ＩＬ−５）濃度を酵素免疫法により定量した。な
お、サイクロスポリンＡについては、Ａｓｃ投与の７日
前から、１日１回ずつ合計８回投与を行った。
【００１７】（被検物質）サイクロスポリンＡ（サンド
薬品社製）、デキサメタゾン（シグマ社製）及びＦＫ−
５０６（藤沢薬品社製）を使用した。
薬品社製）、デキサメタゾン（シグマ社製）及びＦＫ−
５０６（藤沢薬品社製）を使用した。
【００１８】（実験結果）免疫抑制剤であるＦＫ−５０
６はＩＬ−５、ＩＬ−２産生を抑制したが、ＩＬ−４産
生については明確な抑制作用を示さなかった。副腎皮質
ステロイドであるデキサメタゾンはＩＬ−５、ＩＬ−
２、ＩＬ−４のいずれの産生も抑制し、特に、ＩＬ−５
の産生を強く抑制した。免疫抑制剤であるサイクロスポ
リンＡもＩＬ−５、ＩＬ−２、ＩＬ−４のいずれの産生
も抑制した（表１）。
６はＩＬ−５、ＩＬ−２産生を抑制したが、ＩＬ−４産
生については明確な抑制作用を示さなかった。副腎皮質
ステロイドであるデキサメタゾンはＩＬ−５、ＩＬ−
２、ＩＬ−４のいずれの産生も抑制し、特に、ＩＬ−５
の産生を強く抑制した。免疫抑制剤であるサイクロスポ
リンＡもＩＬ−５、ＩＬ−２、ＩＬ−４のいずれの産生
も抑制した（表１）。
【００１９】
【表１】
【００２０】以上の結果、喘息やアトピー性皮膚炎など
のアレルギー性疾患において顕著な治療効果が認められ
ている被検物質が抑制効果を示すことが確認され、本評
価法は喘息やアトピー性皮膚炎の治療剤の評価に使用で
きることが可能であると考えられた。
のアレルギー性疾患において顕著な治療効果が認められ
ている被検物質が抑制効果を示すことが確認され、本評
価法は喘息やアトピー性皮膚炎の治療剤の評価に使用で
きることが可能であると考えられた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田中 善孝 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正製 薬株式会社内 (72)発明者 高橋 晶子 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正製 薬株式会社内
Claims (7)
- 【請求項１】 実験動物を抗原で感作し、感作成立動物
に被検物質を投与後、抗原を局所投与することにより惹
起される血清中又は抗原投与局所洗浄液中のサイトカイ
ン濃度を測定することを特徴とするサイトカイン産生抑
制剤の簡易評価法。 - 【請求項２】 抗原がアスカリス抽出物、卵白アルブミ
ン、ダニ抽出物、ブタクサ花粉抽出物、スギ花粉抽出物
又はライ麦花粉抽出物である請求項１記載のサイトカイ
ン産生抑制剤の簡易評価法。 - 【請求項３】 実験動物がラット又はマウスである請求
項１記載のサイトカイン産生抑制剤の簡易評価法。 - 【請求項４】 感作方法が皮下感作又は腹腔感作である
請求項１記載のサイトカイン産生抑制剤の簡易評価法。 - 【請求項５】 抗原の局所投与部位が腹腔内又は気道内
吸入投与である請求項１記載のサイトカイン産生抑制剤
の簡易評価法。 - 【請求項６】 血清中のサイトカイン濃度を測定する請
求項１記載のサイトカイン産生抑制剤の簡易評価法。 - 【請求項７】 サイトカインがインターロイキン−２、
インターロイキン−４又はインターロイキン−５である
請求項１記載のサイトカイン産生抑制剤の簡易評価法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6253139A JPH08114588A (ja) | 1994-10-19 | 1994-10-19 | サイトカイン産生抑制剤の簡易評価法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6253139A JPH08114588A (ja) | 1994-10-19 | 1994-10-19 | サイトカイン産生抑制剤の簡易評価法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08114588A true JPH08114588A (ja) | 1996-05-07 |
Family
ID=17247060
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6253139A Pending JPH08114588A (ja) | 1994-10-19 | 1994-10-19 | サイトカイン産生抑制剤の簡易評価法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08114588A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002066979A1 (fr) * | 2001-02-22 | 2002-08-29 | Takara Bio Inc. | Procede de detection d'un antigene responsable de l'asthme |
| JP2008539177A (ja) * | 2005-04-26 | 2008-11-13 | トリオン ファーマ ゲーエムベーハー | 癌治療のための抗体およびグルココルチコイドの組み合わせ |
| JP2012254994A (ja) * | 2012-07-23 | 2012-12-27 | Trion Pharma Gmbh | 癌治療のための抗体およびグルココルチコイドの組み合わせ |
-
1994
- 1994-10-19 JP JP6253139A patent/JPH08114588A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002066979A1 (fr) * | 2001-02-22 | 2002-08-29 | Takara Bio Inc. | Procede de detection d'un antigene responsable de l'asthme |
| JP2008539177A (ja) * | 2005-04-26 | 2008-11-13 | トリオン ファーマ ゲーエムベーハー | 癌治療のための抗体およびグルココルチコイドの組み合わせ |
| JP2012254994A (ja) * | 2012-07-23 | 2012-12-27 | Trion Pharma Gmbh | 癌治療のための抗体およびグルココルチコイドの組み合わせ |
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