JPH0777556B2 - Gene for the small subunit of the site-specific endonuclease SceI - Google Patents
Gene for the small subunit of the site-specific endonuclease SceIInfo
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- JPH0777556B2 JPH0777556B2 JP2219566A JP21956690A JPH0777556B2 JP H0777556 B2 JPH0777556 B2 JP H0777556B2 JP 2219566 A JP2219566 A JP 2219566A JP 21956690 A JP21956690 A JP 21956690A JP H0777556 B2 JPH0777556 B2 JP H0777556B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、部位特異的エンドヌクレアーゼSceIの小サブ
ユニットをコードする遺伝子に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a gene encoding a small subunit of the site-specific endonuclease SceI.
本発明の遺伝子によれば、部位特異的エンドヌクレアー
ゼSceIの小サブユニットを複製することができ、得られ
た小サブユニットによって部位特異的エンドヌクレアー
ゼSceIを大量に製造することができる。According to the gene of the present invention, the small subunit of the site-specific endonuclease SceI can be replicated, and the obtained small subunit can produce a large amount of the site-specific endonuclease SceI.
（従来の技術及び解決すべき課題） 各種微生物のうち真核生物に属する各種酵母類由来の部
位特異的エンドヌクレアーゼSceIは、75KDaと50KDaのサ
ブユニットからなるヘテロ二量体であることが知られて
おり、遺伝子DNAの構造と機能を研究するための生化学
的試薬として用いられる他、生物の育種改良を目的とす
る遺伝子の人工変換に広く利用されることが期待されて
いる。(Prior art and problems to be solved) Among various microorganisms, the site-specific endonuclease SceI derived from various yeasts belonging to eukaryotes is known to be a heterodimer composed of 75KDa and 50KDa subunits. In addition to being used as a biochemical reagent for studying the structure and function of gene DNA, it is expected to be widely used for artificial transformation of genes for the purpose of improving breeding of organisms.
この酵母由来の部位特異的エンドヌクレアーゼSceI（以
下「SceI」と略称する）とその製造法に関しては、すで
に本出願人によって特許出願がなされている（特公昭59
-4115）。This yeast-derived site-specific endonuclease SceI (hereinafter abbreviated as “SceI”) and a method for producing the same have been filed by the applicant (Patent Publication No. 59).
-4115).
また、上記の75KDaサブユニットをコードする遺伝子（E
NS1）は、本発明者らによって既に単離され、その塩基
配列が決定されている（中川らによる、「酵母由来部位
特異的エンドヌクレアーゼSceIの75KDaサブユニットはH
SP70ファミリーに属する」、1990年７月、酵母遺伝学集
談会）。In addition, the gene encoding the 75 KDa subunit (E
NS1) has already been isolated by the present inventors and its nucleotide sequence has been determined (Nakagawa et al., “75KDa subunit of the yeast-derived site-specific endonuclease SceI is H
Belongs to the SP70 family ”, Yeast Genetics Roundtable, July 1990).
ところが、上記50KDaサブユニットをコードする遺伝子
については、未だその構造が明らかにされていない。However, the structure of the gene encoding the 50 KDa subunit has not been clarified yet.
（課題を解決するための手段） 従って、本発明者らは、部位特異的エンドヌクレアーゼ
SceIの上記50KDaサブユニット（以下「小サブユニッ
ト」と略称する。）をコードする遺伝子の構造を明らか
にするべく研究を行なった結果、上記小サブユニットを
コードする遺伝子を単離し、その塩基配列を決定するこ
とに成功し、本発明を完成するに至った。(Means for Solving the Problems) Therefore, the present inventors have found that the site-specific endonuclease
As a result of research to elucidate the structure of the gene encoding the above 50 KDa subunit of SceI (hereinafter abbreviated as "small subunit"), the gene encoding the small subunit was isolated and its nucleotide sequence was determined. Was successfully determined, and the present invention was completed.
即ち、本発明は、酵母由来の部位特異的エンドヌクレア
ーゼSceIの小サブユニットをコードする遺伝子（ENS2）
を提供することを目的とする。That is, the present invention provides a gene (ENS2) encoding a small subunit of the site-specific endonuclease SceI derived from yeast.
The purpose is to provide.
本発明は、第１図に示す塩基配列を有する部位特異的エ
ンドヌクレアーゼSceIの小サブユニットの遺伝子（ENS
2）に関する。The present invention relates to the gene of the small subunit of the site-specific endonuclease SceI (ENS having the nucleotide sequence shown in FIG.
Regarding 2).
以下、実施例により、本発明の部位特異的エンドヌクレ
アーゼSceIの小サブユニットの遺伝子（ENS2）について
詳細に説明する。Hereinafter, the gene (ENS2) of the small subunit of the site-specific endonuclease SceI of the present invention will be described in detail with reference to Examples.
（実施例） 実施例１ （小サブユニットの精製） 特公昭59-4115号公報に記載された方法によって、部位
特異的エンドヌクレアーゼSceI（上記公報の「エンドヌ
クレアーゼ型新核酸分解酵素Ａ」と同じ）を製造した。
次いで、この部位特異的エンドヌクレアーゼSceIを用い
て、 １）ポリアクリルアミドゲル電気泳動を蛋白質変性剤の
存在下で行う（U.K.レムリー（Laemmli）、Nature 227:
680-685に記載の方法に従う）か、または、 ２）ホスホセルロースカラムクロマトグラフィー（渡部
ら、J.Biochem.95:1677-1690に記載の方法に従う）を行
うことにより、小サブユニットを精製した。(Example) Example 1 (Purification of small subunit) By the method described in Japanese Examined Patent Publication No. 59-4115, the site-specific endonuclease SceI (same as the "endonuclease-type new nucleolytic enzyme A" in the above-mentioned Japanese publication) ) Was manufactured.
Then, using this site-specific endonuclease SceI, 1) polyacrylamide gel electrophoresis is performed in the presence of a protein denaturing agent (UK Laemmli, Nature 227:
680-685) or 2) phosphocellulose column chromatography (following the method described by Watanabe et al., J. Biochem. 95: 1677-1690) to purify the small subunit. .
この小サブユニットは下記の理化学的性質を有する。This small subunit has the following physicochemical properties.
小サブユニットは、分子量約50、000の塩基性蛋白質で
あり、DNA結合性を有する。このDNA結合性は、塩基配列
に特異的であり、SceIが切断する塩基配列を認識し、結
合する。The small subunit is a basic protein having a molecular weight of about 50,000 and has DNA binding properties. This DNA-binding property is specific to the base sequence, and recognizes and binds to the base sequence cleaved by SceI.
（部分アミノ酸配列の決定） R.H.アーバーソルト（Aebersold）ら、Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 84:6970-6974に記載の方法に従って、小サブユ
ニットをニトロセルロース膜に固定したまま蛋白質分解
酵素を用いて断片化した。(Determination of partial amino acid sequence) RH Arbersold et al., Proc.Natl.Acad.
According to the method described in Sci. USA 84: 6970-6974, the small subunits were immobilized on the nitrocellulose membrane and fragmented using a protease.
得られたペプチド断片混合物を膜より溶出した後、逆相
液体クロマトグラフィに供し、８種類のペプチドを精製
した。それぞれのペプチドの部分アミノ酸配列を気相式
プロテインシークエンサー477A（アプライドバイオシス
テムズ社製）を用いて決定した。The obtained peptide fragment mixture was eluted from the membrane and then subjected to reverse phase liquid chromatography to purify 8 kinds of peptides. The partial amino acid sequence of each peptide was determined using a gas phase protein sequencer 477A (manufactured by Applied Biosystems).
W.J.ウイルバーとD.J.リップマン（Wilbur and Lipma
n）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:726-730に記載の方法
に従って、米国ナショナルバイオメデイカルリサーチフ
ァウンデーション（National Biomedical Research Fou
ndation）の蛋白質データベース（Protein Identificat
ion Resource）に登録されている蛋白質を対象として、
上記の小サブユニットの部分アミノ酸配列と関連する配
列を検索した。WJ Wilbur and DJ Lipman
n), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 726-730, according to the National Biomedical Research Foundation.
ndation) Protein Database (Protein Identificat)
targeting proteins registered in ion resources)
A sequence related to the partial amino acid sequence of the above small subunit was searched.
W.E.S.ヒュドスペス（Hudospeth）ら、Biochim.Biophy
s.Acta 610:221−228に記載の方法に従って、SceI産生
酵母菌IAM4274のミトコンドリアDNAを調製し、それを制
限酵素EcoRI（宝酒造製）によって切断した。得られたD
NA断片を1.2％アガロースゲルによる電気泳動に付し、
E.M.サザン（Southern）、J.Mol.Biol.98:503-517に記
載の方法に従ってマグナグラフナイロン膜（マイクロン
セパレーションズ（Micron Separations）社製）上に転
写した。このナイロン膜上のDNAを上記小サブユニット
の部分アミノ酸配列のひとつである、 X-Glu-Met-Asp-Asn-Tyr-Asn-Asn-Asn-Asn に相当する合成オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさ
せた。WES Hudospeth et al., Biochim. Biophy
According to the method described in s. Acta 610: 221-228, mitochondrial DNA of SceI-producing yeast IAM4274 was prepared and cleaved with restriction enzyme EcoRI (Takara Shuzo). Obtained D
The NA fragment was electrophoresed on a 1.2% agarose gel,
EM Southern (J. Mol. Biol. 98: 503-517) was used to transfer onto a magnagraph nylon membrane (manufactured by Micron Separations). The DNA on this nylon membrane was hybridized with a synthetic oligonucleotide corresponding to X- Glu-Met-Asp-Asn-Tyr-Asn- Asn-Asn - Asn-Asn, which is one of the partial amino acid sequences of the small subunits. .
〔塩基配列の決定〕 ENS2遺伝子を含むDNA断片をpUC118にクローン化した。
このプラスミドDNAを制限酵素DraI（宝酒造製）による
部分切断、またはS.ヘニコフ（Henikoff）Gene 28:351-
359に記載の方法に従って部分欠失させて得られるサブ
クローンを用いて塩基配列の決定を行った。配列の分析
は、F.サンガー（Sanger）らProc.Natl.Acad.Sci.USA 7
4:5463-5467及びJ.メシング（Messing）ら、Nucleic Ac
id Res.9:309-321に記載の方法に従ってジデオキシヌク
レオチド鎖ターミネーター法により（ただしdGTPの代わ
りに７−デアザdGTPを用いた）行った。[Determination of nucleotide sequence] A DNA fragment containing the ENS2 gene was cloned into pUC118.
Partial digestion of this plasmid DNA with the restriction enzyme DraI (Takara Shuzo) or S. Henikoff Gene 28: 351-
The nucleotide sequence was determined using a subclone obtained by partial deletion according to the method described in 359. Sequence analysis was performed by F. Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7
4: 5463-5467 and J. Messing et al., Nucleic Ac
According to the method described in id Res. 9: 309-321, the dideoxynucleotide chain terminator method was used (however, 7-deaza dGTP was used instead of dGTP).
（ENS2遺伝子の同定） 本発明のENS2遺伝子関連の遺伝子を蛋白質データベース
において上述の方法により検索した結果、サッカロミセ
ス酵母の幾つかの株において、そのミトコンドリアDNA
中に小サブユニットの部分アミノ酸配列と同一のアミノ
酸配列をコードし得る塩基配列を見出した。(Identification of ENS2 gene) As a result of searching the protein related to the ENS2 gene of the present invention in the protein database by the above method, mitochondrial DNA of several strains of Saccharomyces yeast was
A base sequence capable of encoding the same amino acid sequence as the partial amino acid sequence of the small subunit was found therein.
SceI産生酵母菌IAM4274においては、ミトコンドリアのD
NAのサザンブロット解析により、1.7kb EcoRI断片が陽
性であった。この1.7kb断片をクローニングし、塩基配
列を上記の方法によって決定した結果、1428塩基からな
る読み枠が見出され、その中に小サブユニットにおいて
決定したすべての部分アミノ酸配列がコードされている
ことを確認した。In SceI producing yeast IAM4274, mitochondrial D
The Southern blot analysis of NA revealed that the 1.7 kb EcoRI fragment was positive. As a result of cloning this 1.7 kb fragment and determining the nucleotide sequence by the above method, an open reading frame consisting of 1428 bases was found, in which all the partial amino acid sequences determined in the small subunit were encoded. It was confirmed.
結果を第１図に示す。The results are shown in Fig. 1.
（発明の効果） 本発明によれば、部位特異的エンドヌクレアーゼSceIの
小サブユニットの遺伝子（ENS2）が提供される。(Effects of the Invention) According to the present invention, a gene (ENS2) for the small subunit of the site-specific endonuclease SceI is provided.
第１図は、本発明の部位特異的エンドヌクレアーゼSceI
の小サブユニットの遺伝子の塩基配列を示す図である。 枠で囲った８個の領域は、決定した部分アミノ酸配列と
一致したものを示す。 影付けをした２個の領域は、RNAマチュレース等、核酸
関連蛋白質に見られる保存配列を示す。 下線で示した塩基は、サッカロミセス・ウバラム属の類
似遺伝子の配列と異なるものを示す。 同様に星印は、サッカロミセス・ウバラム属の類似遺伝
子においては一塩基の挿入が見られる場所を示す。 尚、図に示した制限酵素断片には、小サブユニット遺伝
子の５′上流側に隣接する他の遺伝子（aap 1）の３′
部分領域が含まれている。FIG. 1 shows the site-specific endonuclease SceI of the present invention.
It is a figure which shows the base sequence of the gene of the small subunit of. The eight regions surrounded by a frame show those which were in agreement with the determined partial amino acid sequence. The two shaded regions represent conserved sequences found in nucleic acid-related proteins such as RNA maturase. The underlined bases are different from the sequences of similar genes of the genus Saccharomyces ovarum. Similarly, an asterisk indicates where a single nucleotide insertion is found in a similar gene of the genus Saccharomyces ovarum. The restriction enzyme fragment shown in the figure contains 3'of another gene (aap 1) adjacent to the 5'upstream side of the small subunit gene.
Contains subregions.
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Office reference number FI technical display area C12R 1: 865)
Claims (1)
ヌクレアーゼSceIの小サブユニットをコードする遺伝
子。 ATGAAAAAACAAAATTTAAATTCTATTTTATTAATGTATATTAATTATAT
TATTAATTATTTTAATAATATTCATAAAAATCAATTAAAAAAAGACTGAA
TTATAGAATATGAATATATATATAAATTTTTAATAAATAATATACTATGT
TTTATTAAATGAGATAATAATAAAATTTTATTATTATTAGATATATATTA
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TGCACGTAAACCTAAAGGATACATTAAATAA1. A gene encoding a small subunit of a site-specific endonuclease SceI having the following base sequence. ATGAAAAAACAAAATTTAAATTCTATTTTATTAATGTATATTAATTATAT
TATTAATTATTTTAATAATATTCATAAAAATCAATTAAAAAAAGACTGAA
TTATAGAATATGAATATATATATAAATTTTTAATAAATAATATACTATGT
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|---|---|---|---|
| JP2219566A JPH0777556B2 (en) | 1990-08-21 | 1990-08-21 | Gene for the small subunit of the site-specific endonuclease SceI |
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04104793A JPH04104793A (en) | 1992-04-07 |
| JPH0777556B2 true JPH0777556B2 (en) | 1995-08-23 |
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ID=16737521
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| JP2219566A Expired - Fee Related JPH0777556B2 (en) | 1990-08-21 | 1990-08-21 | Gene for the small subunit of the site-specific endonuclease SceI |
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|---|---|
| JP (1) | JPH0777556B2 (en) |
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|---|---|---|---|---|
| US6280942B1 (en) | 1998-05-22 | 2001-08-28 | Institute Of Physical And Chemical Research | Endonuclease |
| AU2982900A (en) * | 1999-02-03 | 2000-08-25 | Children's Medical Center Corporation | Gene repair involving the induction of double-stranded dna cleavage at a chromosomal target site |
-
1990
- 1990-08-21 JP JP2219566A patent/JPH0777556B2/en not_active Expired - Fee Related
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|---|---|
| JPH04104793A (en) | 1992-04-07 |
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