JPH0759596A - Determination of magnesium and reagent therefor - Google Patents
Determination of magnesium and reagent thereforInfo
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- JPH0759596A JPH0759596A JP20959393A JP20959393A JPH0759596A JP H0759596 A JPH0759596 A JP H0759596A JP 20959393 A JP20959393 A JP 20959393A JP 20959393 A JP20959393 A JP 20959393A JP H0759596 A JPH0759596 A JP H0759596A
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は酵素法によって試料中、
特に体液中のマグネシウムを測定する方法およびその試
薬に関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention relates to
In particular, the present invention relates to a method for measuring magnesium in body fluid and its reagent.
【0002】[0002]
【従来の技術】マグネシウムは生体内必須金属の一つで
あり、各種酵素の活性化剤として知られている。臨床的
には、高血圧、心臓病、糖尿病、腎結石など種々の循環
器系疾患に関連することが明らかになり、その存在が注
目されるようになってきた。マグネシウムの測定には、
従来より原子吸光法、キシリジンブルーに代表される比
色法などが一般に用いられてきたが、最近、特異性の高
い酵素的測定法がいくつか開発され実用性の高い方法と
してその利用価値が高まっている(検査と技術vol.19 n
o16 p507参照)。例えば、ヘキソキナーゼ・グルコース
-6- リン酸デヒドロゲナーゼ法は、D-グルコースおよび
ATPの存在下でヘキソキナーゼの反応速度がマグネシ
ウム濃度に依存することから、生成するグルコース-6-
リン酸にグルコース-6- リン酸デヒドロゲナーゼを作用
させ、補酵素であるNADHの減少を測定することによ
り、試料中のマグネシウムを測定する方法である。この
方法は、マグネシウムとATPの結合体が酵素の基質と
なることを利用したものである。その他、同一原理に基
づく測定法にグリセロールキナーゼ−グリセロリン酸オ
キシダーゼ法、マグネシウムが基質ではなく活性化剤と
して作用することを利用したホスホグルコムターゼ−グ
ルコ−ス-6−リン酸デヒドロゲナーゼ法などが知られて
いる。2. Description of the Related Art Magnesium is one of the essential metals in the living body and is known as an activator of various enzymes. Clinically, it has been clarified that it is associated with various cardiovascular diseases such as hypertension, heart disease, diabetes, and renal stones, and its existence has been attracting attention. To measure magnesium,
Conventionally, atomic absorption method, colorimetric method represented by xylidine blue, etc. have been generally used, but recently, several enzymatic methods with high specificity have been developed and their utility value as a highly practical method. Increasing (inspection and technology vol.19 n
See o16 p507). For example, hexokinase glucose
The -6-phosphate dehydrogenase method produces glucose-6- because the reaction rate of hexokinase in the presence of D-glucose and ATP depends on the magnesium concentration.
This is a method for measuring magnesium in a sample by allowing glucose-6-phosphate dehydrogenase to act on phosphoric acid and measuring the decrease of NADH which is a coenzyme. This method utilizes that a conjugate of magnesium and ATP serves as a substrate for the enzyme. Other known measurement methods based on the same principle include the glycerol kinase-glycerophosphate oxidase method and the phosphoglucomutase-glucose-6-phosphate dehydrogenase method that utilizes magnesium as an activator rather than a substrate. ing.
【0003】[0003]
【発明が解決しようとする課題】臨床検査におけるマグ
ネシウム測定は、従来行われてきたキシリジンブルーな
どを用いた化学法に代わる測定法として、特異性の高い
上記酵素法が普及しつつあるが、測定に用いる酵素や基
質の安定性が不充分、化学法に比べて測定に要する時間
が長く、定量域が狭いなどの問題もあることが知られて
いる。The above-mentioned enzyme method with high specificity is becoming widespread as a method for measuring magnesium in clinical tests as an alternative to the conventional chemical method using xylidine blue. It is known that the stability of enzymes and substrates used for the measurement is insufficient, the time required for the measurement is longer than that of the chemical method, and the quantification range is narrow.
【0004】[0004]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点を解決するマグネシウム測定方法を種々検討する中、
マグネシウムが酵素反応の活性化剤として作用するホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)を
用いる新たな測定法を見い出し、本発明に到達した。[Means for Solving the Problems] The present inventors have studied various magnesium measuring methods for solving the above problems,
The present invention has been accomplished by finding a new measuring method using phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) in which magnesium acts as an activator of an enzymatic reaction.
【0005】すなわち、本発明はマグネシウムを含有す
る試料にホスホエノールピルビン酸塩(PEP)および
重炭酸塩の存在下、ホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼを反応させ、生成したオキザロ酢酸にNADH
の存在下、マレートデヒドロゲナーゼ(MDH)を作用
させ、減少するNADHを測定することにより試料中の
マグネシウムを測定することを特徴とするマグネシウム
測定方法である。That is, according to the present invention, a sample containing magnesium is reacted with phosphoenolpyruvate carboxylase in the presence of phosphoenolpyruvate (PEP) and bicarbonate, and oxaloacetate produced is subjected to NADH.
In the presence of the above, a magnesium measuring method is characterized in that the magnesium in the sample is measured by causing malate dehydrogenase (MDH) to act and measuring the decreasing NADH.
【0006】本発明の測定原理は下記に示す通りであ
る。The measurement principle of the present invention is as follows.
【0007】[0007]
【化1】 [Chemical 1]
【0008】[0008]
【化2】 [Chemical 2]
【0009】また本発明は、(a)ホスホエノールピル
ビン酸塩、(b)重炭酸塩、(c)ホスホエノールピル
ビン酸カルボキシラーゼ、(d)NADH、(e)マレ
ートデヒドロゲナーゼおよび(f)緩衝液を含有するこ
とを特徴とするマグネシウム測定試薬である。The present invention also provides (a) phosphoenolpyruvate, (b) bicarbonate, (c) phosphoenolpyruvate carboxylase, (d) NADH, (e) malate dehydrogenase and (f) buffer. It is a magnesium measuring reagent characterized by containing.
【0010】本発明に使用するホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼは、多くの植物組織および細菌から
得ることができ、いずれの起源によるものを用いてもよ
い。しかし、公知の該酵素は、植物起源では安定性が不
充分であり、液状で長時間保存できず、一方、細菌起源
の多くはマグネシウム以外にも例えばアセチルコエンザ
イムAのような高価な活性化剤を反応に必要とすること
が知られている。これらの欠点を有することなく、本発
明の目的に好適な例としては、酢酸菌由来のホスホエノ
ールピルビン酸カルボキシラーゼが挙げられる。The phosphoenolpyruvate carboxylase used in the present invention can be obtained from many plant tissues and bacteria, and any source can be used. However, the known enzyme is not stable in plant origin and cannot be stored in a liquid state for a long time. On the other hand, many of the bacterial origins are expensive activators such as acetyl coenzyme A in addition to magnesium. Is known to be necessary for the reaction. An example suitable for the purpose of the present invention without these drawbacks is phosphoenolpyruvate carboxylase derived from acetic acid bacteria.
【0011】本発明に使用するマレートデヒドロゲナー
ゼは、いかなる起源のものを用いてもよいが、例えば豚
心臓由来、サーマス属由来、バチルス属由来のもの等が
挙げられる。ホスホエノールピルビン酸塩としては、カ
リウム塩、ナトリウム塩、トリシクロヘキシルアンモニ
ウム塩、モノシクロヘキシルアンモニウム塩等が挙げら
れる。重炭酸塩としては、カリウム塩、ナトリウム塩、
アンモニウム塩等が挙げられる。The malate dehydrogenase used in the present invention may be derived from any source, and examples thereof include those derived from pig heart, those derived from Thermus, and those derived from Bacillus. Examples of the phosphoenolpyruvate include potassium salt, sodium salt, tricyclohexyl ammonium salt, monocyclohexyl ammonium salt and the like. As the bicarbonate, potassium salt, sodium salt,
Examples thereof include ammonium salts.
【0012】本発明に使用する緩衝液は、ホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼおよびマレートデヒドロ
ゲナーゼ反応に適したpHに保たれるものであればいか
なるものでもよいが、通常pH7〜9が用いられる。例
えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、トリシン緩衝液な
どが挙げられる。緩衝液の濃度は特に限定されないが、
通常10〜100mM程度である。The buffer used in the present invention may be any buffer as long as it is maintained at a pH suitable for the reaction of phosphoenolpyruvate carboxylase and malate dehydrogenase, but a pH of 7-9 is usually used. For example, phosphate buffer, Tris buffer, Tricine buffer and the like can be mentioned. The concentration of the buffer solution is not particularly limited,
Usually, it is about 10 to 100 mM.
【0013】本発明の試薬には必要により、界面活性
剤、防腐剤、安定化剤、酵素賦活剤等を加えてもよい。
界面活性剤、防腐剤、安定化剤、酵素賦活剤は、特に限
定されるものではない。界面活性剤としては、非イオン
性界面活性剤が好適に用いられる。防腐剤としては、N
aN3 、キレート剤、抗生物質が好適に用いられる。安
定化剤、酵素賦活剤としては、効果を示すものであれば
特に限定されない。例えば、アルブミン、アセチルコエ
ンザイムA、マンガンイオン等が挙げられる。If necessary, a surfactant, a preservative, a stabilizer, an enzyme activator and the like may be added to the reagent of the present invention.
The surfactant, preservative, stabilizer and enzyme activator are not particularly limited. As the surfactant, a nonionic surfactant is preferably used. As a preservative, N
AN 3 , chelating agents and antibiotics are preferably used. The stabilizer and the enzyme activator are not particularly limited as long as they exhibit the effect. Examples thereof include albumin, acetyl coenzyme A, manganese ion and the like.
【0014】本発明試薬は一般的な組成を以下に示す。 弱アルカリ性緩衝液 10〜50mM ホスホエノールピルビン酸塩 2〜5mM 重炭酸塩 5〜20mM NADH 0.1〜0.3mM ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ 0. 02〜0. 2U/ml マレートデヒドロゲナーゼ 1〜10U/mlThe general composition of the reagent of the present invention is shown below. Weak alkaline buffer 10-50 mM Phosphoenolpyruvate 2-5 mM Bicarbonate 5-20 mM NADH 0.1-0.3 mM Phosphoenolpyruvate carboxylase 0.02-0.2 U / ml Malate dehydrogenase 1-10 U / ml
【0015】更に具体的な組成の一例を以下に示す。 トリス塩酸緩衝液 10〜50mM ホスホエノールピルビン酸カリウム塩 2〜5mM 炭酸ナトリウム 5〜20mM NADH 0. 1〜0. 3mM 酢酸菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ 0. 02〜0. 2U/ml マレートデヒドロゲナーゼ 1〜10U/mlAn example of a more specific composition is shown below. Tris-HCl buffer 10-50 mM phosphoenolpyruvate potassium salt 2-5 mM sodium carbonate 5-20 mM NADH 0.1-0.3 mM phosphoenolpyruvate carboxylase from acetic acid bacteria 0.02-0.2 U / ml malate dehydrogenase 1-10 U / ml
【0016】また試料中のラクテートデヒドロゲナーゼ
とピルビン酸による妨害反応を抑えるために、オキザメ
ートのようなラクテートインヒビターを1〜20mM程
度添加することが望ましい。本発明はマグネシウムがホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性化剤と
して作用し、特定の条件下でマグネシウム量とホスホエ
ノールピルビン酸カルボキシラーゼの反応速度が比例す
ることを利用して、試料中のマグネシウム量を測定する
ことを特徴とするマグネシウム測定方法である。従っ
て、試料中のマグネシウムとホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼの急速な結合を弱めるために、EDT
Aのようなキレート剤を適量加えることで測定感度を自
在に調節することも可能である。Further, in order to suppress the interfering reaction of lactate dehydrogenase and pyruvate in the sample, it is desirable to add lactate inhibitor such as oxamate to about 1 to 20 mM. The present invention measures the amount of magnesium in a sample by utilizing the fact that magnesium acts as an activator of phosphoenolpyruvate carboxylase and the amount of magnesium is proportional to the reaction rate of phosphoenolpyruvate carboxylase under specific conditions. The method for measuring magnesium is characterized by Therefore, in order to weaken the rapid binding of magnesium and phosphoenolpyruvate carboxylase in the sample, EDT
It is also possible to freely adjust the measurement sensitivity by adding an appropriate amount of a chelating agent such as A.
【0017】上記試薬3. 0〜10mlを30℃で5分
間程度予備加温した後、マグネシウムを含む試料0. 1
mlを混合後、30℃で1〜10分間反応させ、NAD
H濃度の減少を、例えば340nm、360nm、38
0nm等の吸光度から測定する。Preliminary heating of 3.0 to 10 ml of the above reagent at 30 ° C. for about 5 minutes, and then a sample containing magnesium 0.1
After mixing ml, react at 30 ° C for 1 to 10 minutes, NAD
The decrease of the H concentration is, for example, 340 nm, 360 nm, 38
It is measured from the absorbance such as 0 nm.
【0018】[0018]
【実施例】次に本発明を実施例を挙げて具体的に示す。 実施例1 アセトバクター・ハンゼニイ(Acetobacter hansenii)
IFO14820由来のホスホエノールピルビン酸カル
ボキシラーゼを用い、以下に示すマグネシウム測定試薬
を作成した。 トリス塩酸緩衝液(pH8. 0) 50mM ホスホエノールピルビン酸カリウム塩 3. 5mM 炭酸ナトリウム 10mM NADH 0. 14mM ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ 0. 1U/ml マレートデヒドロゲナーゼ 1U/mlEXAMPLES Next, the present invention will be specifically described with reference to Examples. Example 1 Acetobacter hansenii
Using the phosphoenolpyruvate carboxylase derived from IFO14820, the following magnesium measuring reagents were prepared. Tris-HCl buffer (pH 8.0) 50 mM phosphoenolpyruvate potassium salt 3.5 mM sodium carbonate 10 mM NADH 0.14 mM phosphoenolpyruvate carboxylase 0.1 U / ml malate dehydrogenase 1 U / ml
【0019】上記試薬3. 0mlを30℃で5分間予備
加温した後、マグネシウム0〜2mMを含む試料0.1
mlを添加し、30℃で5分間反応させ、340nmに
おける吸光度の減少を測定した。試料中のマグネシウム
濃度と1分間当りの吸光度の減少量の関係を図1に示
す。マグネシウム0〜2mMでは、吸光度変化との間に
直線関係が成立した。After preliminarily heating 3.0 ml of the above reagent at 30 ° C. for 5 minutes, a sample 0.1 containing magnesium 0-2 mM was prepared.
ml was added, the mixture was reacted at 30 ° C. for 5 minutes, and the decrease in absorbance at 340 nm was measured. The relationship between the magnesium concentration in the sample and the amount of decrease in the absorbance per minute is shown in FIG. For magnesium 0 to 2 mM, a linear relationship was established with the change in absorbance.
【0020】実施例2 アセトバクター・パスツリアヌス(Acetobacter pasteu
rianus)IFO14814由来のホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼを用い、以下に示すマグネシウム
測定試薬を作成した。 トリス塩酸緩衝液(pH8. 0) 50mM ホスホエノールピルビン酸カリウム塩 3. 5mM 炭酸ナトリウム 10mM 硫酸マグネシウム 30mM NADH 0.14mM ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ 0. 05U/ml マレートデヒドロゲナーゼ 1U/mlExample 2 Acetobacter pasteu
rianus) IFO14814-derived phosphoenolpyruvate carboxylase was used to prepare a magnesium measuring reagent shown below. Tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 8.0) 50 mM phosphoenolpyruvate potassium salt 3.5 mM sodium carbonate 10 mM magnesium sulfate 30 mM NADH 0.14 mM phosphoenolpyruvate carboxylase 0.05 U / ml malate dehydrogenase 1 U / ml
【0021】上記試薬3. 0mlを30℃で5分間予備
加温した後、マグネシウム0〜1Mを含む試料0. 1m
lを添加し、30℃で5分間反応させ、340nmにお
ける吸光度の減少を測定した(試料中のマグネシウム濃
度0mM時の減少量をブランクとして減じた)。試料中
のマグネシウム濃度と1分間当りの吸光度の減少量の関
係を図2に示す。マグネシウム0〜1. 2Mの間で、吸
光度変化との間に直線関係が成立した。After preliminarily warming 3.0 ml of the above reagent at 30 ° C. for 5 minutes, 0.1 m of a sample containing 0-1 M magnesium
1 was added, and the mixture was reacted at 30 ° C. for 5 minutes and the decrease in absorbance at 340 nm was measured (the decrease amount when the magnesium concentration in the sample was 0 mM was reduced as a blank). The relationship between the concentration of magnesium in the sample and the amount of decrease in absorbance per minute is shown in FIG. A linear relationship was established with the change in absorbance between 0 and 1.2 M of magnesium.
【0022】[0022]
【発明の効果】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼを用いる本発明によれば、従来の酵素法に比べて、
測定に使用する酵素や基質の安定性が充分であり、化学
法に比べて測定に要する時間が短く、定量域が広い。し
かも高い特異性という酵素法の利点を生かしながら、安
価で迅速なマグネシウム測定が可能であり、特に循環器
系疾患の予防・診断に行われるマグネシウム測定に有用
である。According to the present invention using phosphoenolpyruvate carboxylase, compared with the conventional enzymatic method,
The stability of the enzyme and substrate used for measurement is sufficient, the time required for measurement is shorter than that of the chemical method, and the quantification range is wide. Moreover, it is possible to inexpensively and rapidly measure magnesium while making use of the advantage of the enzyme method of high specificity, and it is particularly useful for magnesium measurement performed for prevention / diagnosis of cardiovascular diseases.
【図1】2mM硫酸マグネシウム水溶液の希釈直線性を
示す。FIG. 1 shows the dilution linearity of a 2 mM aqueous magnesium sulfate solution.
【図2】1M硫酸マグネシウム水溶液の希釈直線性を示
す。FIG. 2 shows the dilution linearity of a 1M magnesium sulfate aqueous solution.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川村 良久 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (72) Inventor Yoshihisa Kawamura 10-24 Toyomachi, Tsuruga City, Fukui Prefecture Toyobo Co., Ltd.
Claims (3)
エノールピルビン酸カルボキシラーゼを反応させること
により、試料中のマグネシウムを測定することを特徴と
するマグネシウム測定方法。1. A method for measuring magnesium, which comprises measuring magnesium in a sample by reacting a sample containing magnesium with phosphoenolpyruvate carboxylase.
エノールピルビン酸塩および重炭酸塩の存在下、ホスホ
エノールピルビン酸カルボキシラーゼを反応させ、生成
したオキザロ酢酸にNADHの存在下、マレートデヒド
ロゲナーゼを作用させ、減少するNADHを測定するこ
とにより試料中のマグネシウムを測定することを特徴と
するマグネシウム測定方法。2. A sample containing magnesium is reacted with phosphoenolpyruvate carboxylase in the presence of phosphoenolpyruvate and bicarbonate, and malate dehydrogenase is allowed to act on the produced oxaloacetate in the presence of NADH. A method for measuring magnesium, which comprises measuring magnesium in a sample by measuring decreasing NADH.
(b)重炭酸塩、(c)ホスホエノールピルビン酸カル
ボキシラーゼ、(d)NADH、(e)マレートデヒド
ロゲナーゼおよび(f)緩衝液を含有することを特徴と
するマグネシウム測定試薬。3. (a) phosphoenolpyruvate,
A magnesium measuring reagent containing (b) bicarbonate, (c) phosphoenolpyruvate carboxylase, (d) NADH, (e) malate dehydrogenase and (f) buffer.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP20959393A JPH0759596A (en) | 1993-08-24 | 1993-08-24 | Determination of magnesium and reagent therefor |
Applications Claiming Priority (1)
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---|---|---|---|
JP20959393A JPH0759596A (en) | 1993-08-24 | 1993-08-24 | Determination of magnesium and reagent therefor |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0759596A true JPH0759596A (en) | 1995-03-07 |
Family
ID=16575399
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP20959393A Pending JPH0759596A (en) | 1993-08-24 | 1993-08-24 | Determination of magnesium and reagent therefor |
Country Status (1)
Country | Link |
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JP (1) | JPH0759596A (en) |
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1993
- 1993-08-24 JP JP20959393A patent/JPH0759596A/en active Pending
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