JPH07507206A - 自殺挙動のための予測アッセイ - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 自殺挙動のための予測アッセイ 発明の背景 本発明は、自殺及び他の異常挙動を予測するための新規方法に関する。特に、そ れは異常なセロトニン機能（ｓｅｒｏＬｏｎｅｒｇｉｃ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ）及 び関連する挙動に関連する、トリプトファンヒドロキシラーゼ遺伝子における多 量現象の検出に関する。

遺伝的因子は、家族及び双生児研究におけるアルコール中毒症、暴力及び自殺の 病因に包含されて来た０強い相互関係がそれらの表現型間に存在する。なぜなら ば、それらは同じ個人及び遺伝的に密接に関連する個人において生しる傾向があ るからである。それらの障害はそれらの臨床的発現において異質性であり、そし て復雑な原因を有するけれども、それらの問題を有する患者間でより均質のサブ グループを同定することが可能である。

低められた脳セロトニン濃度は、いくつかの挙動性特性、たとえば衝動的、攻撃 的及び自殺的挙動、放火狂（火をつける）及び日周期性リズムの破壊に関連して いる。セロトニン濃度と異常性挙動との間の関係を再調査するためには、Ｌｏｐ ｅｚ−１ｂｏｒなど、　（１９９１）　Ｉｎ５ｅｒｏｔｏｎｉｎ−ｒｅｌａｔｅ ｄ　ｐｏｙｃｈｉａｔｒｉｃ　ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ：ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｎｄ 　ｔｈｅｒａｐｏｕｔｊ■ ｌｉｎｋｓ（Ｅｄ、Ｃａ５ｓａｎｏ　ａｎｄ　Ａｋｉｓｋａｌ、　Ｒｏｙａｌ　 ５ｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　ＭｅｄｉｃｉｎｅＳｅｒｖｉｃｅｓ　Ｌｔｄ、）　ｐｐ 、３５〜４０を参照のこと、セロトニン活性は、脳を髄液におけるセロトニン代 謝物５−ヒドロキシインドール酢酸（５−）ＩＩＡＡ）の濃度に関係している（ Ａｓｂｅｒｇなど、　（１９７６）Ａｒｃｈ、Ｇｅｎ。

Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ　３３：１１９３〜１１９７）　。

脳を髄液（Ｃ５Ｆ）における５−ＨＩＡＡの低濃度は、遅延の不耐性又は衝動的 挙動により特徴づけられる挙動に関係する。それらは衝動的攻撃性（殺人を含む ）、放火狂（ひを付ける）、人格障害及びアルコール中毒症を包含する。セロト ニンはまた、Ｓ波（ｓｌｏｗ−ｗａｖｅ）睡眠、温度調節及び欲求挙動において 臨界である。減じられたｃｓｐ　５−４１１ＡＡｆｉ度は、うつ病患者における 自殺の危険性に関係していることが見出された。動物の研究においては、低めら れたセロトニン濃度のインデックスは、遅延に対する推定される不安関連不耐性 及び衝動の欠失したｔＪ４節に関連している。

Ｃ５Ｆにおける５−１（ＩＡＡｉｌ１度は異常なセロトン挙動に関連しているが 、マーカーとしての５−Ｈ［ＡＡの有用性は、Ｃ５Ｆを得ることの困難性により 制限される。　Ｃ５Ｆは侵入性で高価な非実用的な方法によってのみ得られる。

従って、５−ＨＩＡＡレベル及び異常なセロトン挙動性に関連する容品に型分け されるマーカーの必要性が存在する０本発明はこの及び他の必要性を満たす。

発明の要約 本発明は、衝動的ヒト対象における異常性セロトニン機能を予測する方法を提供 し、この方法はトリプトファンヒドロキシラーゼをコードする遺伝子のし対立遺 伝子を検出することを含んで成る。１つの態様においては、Ｌ対立遺伝子はホモ 接合状態で存在する。そのＬ対立遺伝子は、ポリメラーゼ鎖反応により及び他の 方法により対象から単離された核酸に検出され得る。Ｌ対立遺伝子はまた、−末 鎖コンホメーソヨン多型性分析により検出され得る。１つの態様において、Ｌ対 立遺伝子はトリプトファンヒドロキシラーゼをコードする遺伝子のイントロン内 での多型性に関連し；特に、前記イントロンはトリプトファンヒドロキシラーゼ をコードするマウス遺伝子のイントロン７に相当する。異常性セロトニン活性能 は特に自殺挙動又は放火狂の挙動であり得る。また、トリプトファンヒドロキシ ラーゼをコードする遺伝子のし対立遺伝子のサブ配列に対して特異的な配列を含 んで成る単離された核酸が請求されている。その核酸はポリメラーゼ鎖反応増幅 により得られる。）ム酸はトリプトファンヒドロキシラーゼをコードする遺伝子 のＵ対立遺伝子の反応する領域に対して特異的な第２核酸と同じ速度で変性ゲル において移動でき；そして第２核酸の移動速度の約１．０２倍の速度で非変性ゲ ルにおいて移動する。核酸配列は、イントロンを含んで成るし対立遺伝子のサブ 配列に対して特異的であり、特にイントロンはトリプトファンヒドロキシラーゼ をコードするマウス遺伝子のイントロン７に対応する。

定義 “衝動的ヒト対象”とは、正常な挙動バランス及び制御を欠いている個人を言及 する。そのような挙動は、ＤｉａｇｎｏｓＬｉｃ　ａｎｄ　Ｓｔａｔｉｓｔｊｃ ａｌＭａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍｅｎｔａｌ　Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ（Ｄｉａｇｎｏｓ ｔｉｃ　ａｎｄ　５ＬａｓＬｉｓｔｉｃａｌ　１Ｉｌａｎｕａｌｏｆ　Ｍｏｎｔ ａｌ　Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、　Ｔｈ１ｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ−Ｒｅｖｉｓｅｄ　 （ＤＳＭ−ｎ［−Ｒ）＋　５ｐｉｔｚｅｒ。

Ｒ，Ｌ、、　Ｃｈａｉｒ、　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　ｔｏ　ｒｅｖｉｓｅ　ＤＳＭ− ｍ、Ｐｒｅｓｓ　５ｙｎｄｉｃａｔｅ　ｏｆｔｈｅ　Ｕｎｉｖ、ｏｆ　Ｃａｍｂ ｒｉｄｇｅ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　ＵＫ、　１９８７；　これは引用により 本明細書に組込まれる）に分離されている障害を包含する。ＤＳ？！−ＩＩＩを 用いての衝動性の診断は、たとえばＷｏｏｄｃｏｃｋ（１９８６）Ｐｓｙｃｈｉ ａＬｒｉｃＣｌｉｎｉｃｓ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａ、　９：３４１ −３５２に記載される。対象により犯される、ある予測できない犯罪（たとえば 殺人、放火及び暴行）の変化により引き起こされるセロトニン活性における基準 からの変動に関連する障害を言及する。典型的には、異常なセロトニン活性は５ −）ＩＩＡＡレベルを測定することによって検出される。そのような障害は、自 殺挙動及び放火狂を包含するが、但しこれだけには限定されない。

”多望性”とは、ＤＮＡの相同領域が複数の個人間で比較される場合、異なる（ 典型的には、ヌクレオチド置換、欠失又は挿入の結果として）ヌクレオチドを言 及する。

“相同性゛とは、個々の個人において同じ機能を実施する複数の生物体（同じ又 は異なった種の）のゲノム内の、たとえば特定のタンパク質又はタンパク質の一 部をコードするヌクレオチド配列を言及する。相同性領域のヌクレオチド配列は 、異なった個人間で比較される場合、同しであっても又は異なっていても良い、 たとえば、トリプトファンヒドロキシラーゼをコードするヒト遺伝子は、マウス トリプトファンヒドロキシラーゼ遺伝子に相同であると言われる。

“対立遺伝子°は、染色体上の特定の遺伝子座を占める、遺伝子のいくつかの交 互形の１つである。

多望性は、特定の遺伝子座のための同じ対立遺伝子が、利用できる方法により同 定される場合、個々の生物体からの二倍体細胞における２つの相同染色体の個々 上に存在する場合、”ホモ接合性”であり又は“ホモ接合状ＪＩｌ”にあると言 われる。

多望性は、その多望性と遺伝子との間の組換え頻度が約０．５以下、好ましくは 約０．２５以下である場合、遺伝子に“結合される”と言われる。その多望性は 、遺伝子内か又は遺伝子外のいづれかであり得る。

多望性は、その多望性の頻度が対立遺伝子を有さない人々においてよりも対立遺 伝子を有する個人において高い場合、遺伝子の対立遺伝子に°関連する”と言わ れる。その多望性の遺伝子内か又は遺伝子外のいづれかであり得る。

遺伝子における配列は、その配列が他の生物体におけるその対応する配列と同じ フランキング配列又はコドン間で又はそれら内で生じる場合、もう１つの生物体 からの相同遺伝子における配列に゛相当する°と言われる。たとえば、マウスＴ ＰＩ＋遺伝子における、アミノ酸４２のためのコドンとアミノ酸４３のためのコ ドンとの間にあるヒトＴＰＨ遺伝子におけるイントロンは、マウスＴＰＨ遺伝子 のイントロン２に相当すると言われる。

標的核酸における”指数的”上昇を典型的には言及する”増幅性”又は°増幅” とは、核酸の選択された標的配列の数の直線的及び指数的上昇を説明するために 本明細書において使用される。増幅は、当業者に良く知られた多くの方法に従っ て実施され得る。そのような方法の例は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、リガ ーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、ＲＮＡ転写に基づく増幅システム及び同様の方法を包含 する。

°実質的に結合する”とは、オリゴヌクレオチドと標的の配列との間での相補的 ハイブリダイゼーションを言及し、そしてＰＣＲポリメラーゼのための所望する プライミング又はハイブリダイゼーシッンシグナルの検出を達成するために、ハ イブリダイゼーション培地の緊縮性を減じることによって調節され得るマイナー なミスマツチを包含する。

°単離された”とは、その生来の状態で見出さるような通常、付随する成分を実 質的に又は本質的に有さない材料を言及する。たとえば、親和性精製された抗体 又はモノクローナル抗体は、生物学的に精製された状態で存在する。

°ハイブリダイズする”とは、相補的塩基対を通して２つの一本鎖核酸の結合を 言及する。

°核酸”とは−末鎖形又は二本鎖形のいづれかでのデオキシリボヌクレオチド又 はリボヌクレオチドポリマーを言及し、そして特に限定しないなら、天然に存在 するヌクレオチドと類似する態様で機能することができる天然のヌクレオチドの 既知相同体を包含する。

°プライマー〇又は“核酸ポリメラーゼプライマー”とは、天然又は合成にかか わらず、核酸鎖に対して相補的なプライマー拡張生成物の合成が開始される条件 下で、すなわち適切な緩衝液において及び適切な温度で、４種の異なったヌクレ オチドトリホスフェート及び重合のための剤（すなわちＤＮＡポリメラーゼ又は 逆転写酵素）の存在下で、ＤＮＡ合成の開始の点として作用することができるオ リゴヌクレオチドを言及する。プライマーは好ましくは、オリゴデオキシリボヌ クレオチドであり、そして増幅において最大の効能のための一本鎖化されるが、 しかしまた、二本鎖化もされ得る。二本鎖化される場合、プライマーはまず、拡 張生成物を調製するために使用される荊、その鎖を分離するために処理される。

プライマーの正確な長さは、多くの因子に依存するが、しかし典型的には１５〜 ２５個のヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は一般的に、鋳型との 十分に安定したハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度を要する。プ ライマーは鋳型の正確な配列に影響を及ぼす必要はないが、しかし鋳型とハイブ リダイズするために十分に相補的であるべきである。プライマー中に組込まれ得 る非相補的配列の例は、制限酵素認識部位をコードする配列である（アメリカ特 許第４．８００．１５９号を参照のこと）。

プライマーは所望により、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的又は化学 的手段により検出可能なラベルを組込むことによってラベルされ得る。たとえば 、有用なラベルは、０ｐ、螢光染料、電子密集試薬、酵素（通常、ＥＬＩＳＡに 使用されるような）、ビオチン又はハプテン、もしくは抗血清又はモノクローナ ル抗体が利用できるタンパク質を包含する。ラベルはまた、固体支持体上へのプ ライマー又は増幅されたＤＮＡのいづれがの固定を促進するためにプライマーを “捕獲”するためにも使用される。

“プローブとは、標的核酸のサブ配列に相補的塩基対を通して結合するオリゴヌ クレオチドを言及する。プローブは、ハイブリダイゼーション条件の緊縮性に依 存してプローブ配列との完全な相補性を欠いている標的配列を典型的には実質的 に結合するであろうことは当業者に理解されるであろう、プローブは好ましくは 、同位体により直接的にラベルされ、又はストレプタビジン複合体が後で結合す るビチオンにより間接的にラベルされる。プローブの存在又は不在についてアッ セイすることによって、標的の存在又は不在を検出することができる。

核酸プローブを言及する場合、組換え”とは、天然のタンパク質、及びその天然 のゲノムの一部としてプローブ配列を天然において含む細胞から単離されたプロ ーブに典型的には関連する核酸を有さないオリゴヌクレオチドを言及する。ｍ喚 えプローブは、増幅手段、たとえばＰＣＲ、及び細菌がｍ換えプローブにより形 質転換される遺伝子クローニング法により製造されたものを包含する。

特定の対立遺伝子“に対して特異的な配列”は遺伝子の他の特徴づけられる対立 遺伝子により共有されない対立遺伝子に独特な配列である。対立遺伝子に対して 特異的な配列に対して相補的なサブ配列を含むプローブは典型的には、厳正な条 件下で（たとえば固体支持体をＺＸＳＳＣ、０，１％ＳＤＳにより７０”Ｃで洗 浄する）、他の単離物のゲノムの対応する部分にハイブリダイズしないであろう 。

用語“実質的に同一”とは、複数のヌクレオチド配列がそれらの大部分の配列を 共存することを示す、一般的に、これは、それらの配列の少なくとも９０％及び 好ましくは約９５％であろう、配列が実質的に同一であるもう１つの示唆は、そ れらがｗ！縮条件下でハイブリダイズするかどうかである（たとえば、Ｓａｍｂ ｒｏｏｋなど、、　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　Ｍａｎｕａｌ＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｉ（ａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　１９８５を 参照のこと）、９Ａ縮条件は配列依存性であり、そして異なった環境において異 なるであろう。

一般的に、緊縮条件は、定義されたイオン強度及び、Ｈで特定の配列のために熱 溶融点（Ｔ−）よりも約５℃低いように選択される。Ｔ謡とは、好ましくマツチ されたプローブに、標的配列の５０％がハイブリダイズする温度（定義されたイ オン強度及びｐＨなど）である、典型的には、緊縮条件とは、塩濃度がｐＨ７で 少なくとも約０．２モル濃度であり、そして温度が少なくとも約６０’Ｃである ような条件であろう。

°サブ配列°とは、核酸の長い配列の一部を含んで成る核酸の配列を言及する。

“標的領域”又は°領域”とは、通常、多裂性ＤＮＡ配列を含む、分析されるべ き核酸のサブ配列を言及する。

図面の簡単な説明 第１Ａ及び１８図は、ヒトＴＰＯ“イントロン７”の５ｓｃｐ分析を表わす、第 １Ａ図は、非変性ゲル上で電気泳動された、変性されていないＤＮＡサンプル、 レーン１及び２対変性されたＤＮＡサンプル（ｓｓｃｐ）　、レーン３及び４の オートラジオグラムである。Ｕ及びＬ対立遺伝子に対応するバンドが示されてい る。第１Ｂ図は、５ｓｃｐにより分析される場合、ＣＥＰＩ（類におけるＴＰ） ｌ多望性の透過性を示す。

上部で示される系図は下記レーンに対応する。

第２図は、他の地図形成された染色体１１遺伝子座に関してヒトＴＰＨ遺伝子の 遺伝子位置に対する情報を示す、隣接する位置におけるＴＰＨの配置に対する見 込みが示される。

第３図は、ＴＰＯ遺伝遺伝定型−旧＾Ａ濃度との間の関係を示す、対象の５−Ｈ ＩＡＡ濃度をそれらのＴＰＨ遺伝遺伝定型してプロットする。

非衝動性対象は空白の三角で示され、そして衝動性対象は黒くぬりつぶされた四 角で表わされる０個々のＴＰＯ遺伝遺伝定型いての平均５−旧＾Ａｆｉ度（±ｓ 、ｅ、ｍ）が示される。

第４図は、遺伝子型、５−１１１ＡＡ濃度及び衝動性対象における自殺未遂の歴 史の間の関係を示す。衝動性対象についての５−Ｈ１＾＾濃度がＴＰＨ遺伝遺伝 定型してプロットされる。自殺を決っして試みたことがない対象（黒くぬりつぶ された三角）、自殺を試みたことがある対象を試みたことがある対象（空白の四 角）及び自殺により死亡した対象（スラッシュが付いた空白の四角）が示される ０個々のＴＰＨ遺伝遺伝定型いての平均５−１１１ＡＡｄ度（±ｓ、ｅ、ｍ）が 示される。

第５図は、ＴＰＨ遺伝遺伝定型される血液グルコース濃度との関係を示す。

好ましいＢ様の記載 本発明は、衝動性対象における異常なセロトニン挙動を予測することにおいて有 用であるトリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ）遺伝子のある対立遺伝子に 関連する多裂性を検出するための方法を開示する。トリプトファンヒドロキシラ ーゼ（ＴＰＯ）　（ＥＣ１，１４，１６，４）は、トリプトファンのビオプテリ ン依存性−酸素化の５−ヒドロキシトリプトファン化を触媒しくＪｅｑｕｉｅｒ など、（１９６９）Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ。

１８：１０７１−１０８１；Ｋａｎｆｍａｎ（１９８７）Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ ｓ　ｉｎ　ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　ｄｉｓｅａｓｅ：ｎｅｗ　ｐｅｒｓｐｅｃｔ ｉｖｅｓ、　Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、、　ｐｐ、２０５−２３２） 、これは続いて、脱炭酸化され、神経伝達物質セロトニンが形成される。モノア ミンオキシダーゼＡ及びそれよりも少ないモノアミンオキシダーゼＢが、セロト ニンを脱アミン化し、これは続いて、酸化され、５−ヒドロキシインドール酢酸 （５−１１１ＡＡ）が形成される。　ＴＰＩ＋発現は、ヒトにおける少数の特定 組織、たとえば縫締ニューロン、松果体細胞、肥満細胞、単核性白血球及び小腸 粘膜細胞に制限される。脳幹の縫締ニューロンにおいて、ＴＰＨはセロトニンの 生合成において律速酵素である（Ｃｏｏｐｅｒなど、、　（１９６１）Ｊ、Ｐｈ ａｒＩＩａｃｏｌ　Ｅｘｐ、Ｔｈｅｒａｐ、１３２：２６５−２６８）。

ＴＰＯはセロトニンの生合成において律速酵素である（Ｇｒａｈａ硼ｅ−３ｍｉ ｃｈ（１９６４）Ｂｉｏｃｈｅｓ、Ｒ４ｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、（ｏｍｍｕｎ、１ ６：５８６）　＊従って、ＴＰＨ遺伝子の機能的変異体を明示する多裂性対立遺 伝子は、Ｃ３Ｐ５−ＨＩＡＡｆｉ度及び衝動性対象における異常なセロトニン機 能及び関連する挙動性に相互関係する。

ＴＰＨ遺伝子はマウスからクローン化されており（Ｓｔａｌｌ　ａｎｄＧｏｌｄ ｗｏｎ（１９９１）Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、Ｒｅｓ、２８：４５７−４６５）　 、そしてＴＰＨｃＤＮ＾は、ヒト（Ｂｏｕｌａｒａｎｄなど、　（１９９０）Ｎ ｕｃｌ、八ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、１８：４２５７）、マウス（ＳＬｏｌｌなど、（ １９９０）Ｇｅｎｕ＋１ｉｃｓ　７：８Ｂ−９６）、ラット（Ｋｉｎなと、（Ｌ ９９１）Ｍｏ１．Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、９：２７７−２８３）及びウサギ（Ｇｒ ｅｎｅＬｔなど、　（１９８７）　Ｐｒｏｃ。

ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４：５５３０−５５３４）から単離さ れている。それらの相同性ＴＰＨ遺伝子は高い程度の配列同一性を存する９体細 胞ハイブリッドを用いれば、ヒトＴＰＯ遺伝子は染色体１１の短いアーム（Ｌｅ ｄｌｅｙなど、（１９８７）Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｍｏ１．Ｇｅｎｅｔｉ ｃｓ　１３：５７５−５８０）及び現場ハイブリダイゼーションにｌす、染色体 領域１１ｐ１５．３−ｐ１４（Ｃｒａｉｇ（１９９１）Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ、Ｃ ｅ１ｌ　ＧｅｎｅＬ、４２：２９−３２）に存在されている。

染色体領域１１ｐ１５への二極性の疾病性障害の結合が観察されている（６ｇ６ １ａｎｄなど、（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ　３２５ニア８３−７８７）、　Ｌが しながら、続く研究はこの結果をひじょうに弱めた（Ｃｉａｒａｎｅｌｌｏ　ａ ｎｄ　Ｃ１ａｒａｎｅｌｌ。

（１９９１）＾ｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｅｄ、４２：１５１−１５８）　、最近の研究 （１！ａｋｓｔｉｓ（１９９１）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔ、８７：４７５−４８ ３）は、この領域でのＬＯＤ　（見込みの対数）評点はわずかに陽性であること を示した。低いが、しかし陽性のＬＯＤ評点は、遺伝的なペテロ接合性、すなわ ち部分的侵入性又は非遺伝的な場合の包含を示唆する。

本明細書に提供される証拠は、ＴＰＨ遺伝子における多型性は、衝動性対象にお ける種々のセロトニン性挙動へのＴＰＩ＋の遺伝的結合を研究するための価値あ る手段であることを示す、２つのＴＰＨ対立遺伝子（Ｕ及びＬ）は、衝動性及び 非衝動性グループにおいて同じ頻度で生じる。しかしながら、衝動性グループに おいては、異常なセロトニン機能及び関連的挙動性とＴＰ）Ｉ遺伝子型との間に 有意な相互関係が存在する。

それらの多型性は通常、ＴＰ）Ｉ活性に対する効果を有し、そして従ってまた、 セロトニン生合成に影響を及ぼす、他方、多型性は、ＴＰＨ遺伝子の活性、発現 又は調節を変えるＴＰＨ遺伝子座で別々の変異誘発に連結され得る。それらの多 型性の検出に基づけば、本発明は、対象が自殺、殺人を試み、火事を起こし、又 は他の異常な挙動を示すかどうかについて決定するための方法を提供する。

下記に記載される例示される方法において、衝動性対象における異常なセロトニ ン機能及び関連する挙動性は、トリプトファンヒドロキシラーゼ遺伝子のし対立 遺伝子に関連する多型性の存在と相互関係している。Ｌ対立遺伝子がトリプトフ ァンヒドロキシラーゼ遺伝子を担持する。相同性染色体（染色体１１）の両者上 に担持されることを意味する、ホモ接合状態におけるし対立遺伝子の存在は、ペ テロ接合多型性よりもさらに強い、異常なセロトニン機能の予測物である０例に おいて検出される特定の多望性部位は、マウスＴＰＩＩ遺伝子のイントロン７に 対応するヒトＴＰ）ｌ遺伝子のイントロン内に位置する（Ｓｔｏｌｌなど、（１ ９９１）Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｒｅｓ、２８：４５７−４６５；引用 により本明細書に組込まれる）。

多型性又はそれに関係する対立遺伝子は多くの異なった手段で検出され、そして 使用され得る。たとえば、ＴＰＨ官能変異体が家族において伝達される場合、遺 伝子に関与されるマーカー多型性の同定は、ＴＰＨ官能変異体が両親から子孫に 伝達されたかどうかについて高い信顛性で予測することを可能にするであろう、 他方、標準技法を用いて、個人から単離された核酸を分析することができる。た とえば、多型性又はそれに密接して関係する核酸を増幅し又は検出するために核 酸プライマー又はプローブを用いることができる。

いくつかの技法が、多型性を含むか又はそれに関連している核酸配列を検出する ために利用できる。それらの方法は、ポリメラーゼ鎖反応−一本鎖コンホメーシ ョン多型性（ＰＣＲ−５ＳＣＰ）　、リガーゼ鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１ ）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ＾８８：１８９−１９３Ｊｕな ど。

（１９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４：５６０−５６９；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒなど 、（１９９０）Ｇｅｎｅ　８９：１１７−１２２）、制限フラグメント長さ多型 性（ＲＦＬＰ）　（Ｂｏｔｓｔｅｉｎなど、　（１９８０）Ａｍ、Ｊ、）ｌｕｍ 、Ｇｅｎｅｔ、６９：２０１−２０５）、短いタンデム反復（ＳＴＲ，Ｄｅａｎ など。

（１９９１）Ａｍ、Ｊ、＾ｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、４９：６２１−６２６）、変性グ ラジェントゲル電気泳動（Ｍｙｅｒｓなど、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ　３１３ ：４９５−４９８）及びオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーン−ｓン（Ｃａｎ ｎｅｒなど、　（１９８３）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８３：５ｔ９４−５１９８）　（これらは引用により本明細書に組込ま れる）を包含するが、但しこれだけには限定されない。

−末鎖コンホメーション多型性（ｓｓｃｐ）分析は、ヌクレオチド配列変異体を 検出するための高い感受性の方法である（Ｏｒ　ｉ　ｔａなど。

（１９８９）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６：２７６６ −２７７０；　０ｒｉｔａなど、　（１９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　５：８７４ −８７９；　これらは引用により本明細書に組込まれる）。

単一の塩基の置換を包含する配列の変化は、電気泳動衝動性においてソフトとし て検出される。

典型的には、分析されるべきＤＮＡはＰＣＲ増幅により得られる。ラベルされた プライマーが検出を促進するためにその増幅反応に使用され得る。　ＰＣＲ工程 は当業界において良く知られている（アメリカ特許第４，４８３．１９５号；第 ４，６８３，２０２号；及び第４，９６５，１８８号を参照のこと）。さらに、 ＰＣＲ試薬は市販されており、そしてＰＣＲ技法は公開されている。従って、Ｐ ＣＲ技法の詳細な記載は本明細書においては包含されない。

次に、増幅されたフラグメントが５ｓｃｐにより分析され、ここで前記方法は、 非変性ゲルにおけるフラグメントの電気泳動を包含する。

フラグメントが長さ２ｏｏｂｐよりも存意に長い場合、小さなフラグメントに対 する多型性を得るために１又は複数の制限酵素により前記フラグメントを切断し 、そして従ってその分離の分析能を高めることが所望される。異なったＤＮＡ源 からのフラグメント間の多裂性差異は、電気泳動移動性における差異として可視 化され得る。

ＤＮＡの増幅及び５ｓｃｐ分析は、候補体遺伝子で生成する多型性マーカーのひ じょうに十分な手段であることがここで示される。さらに、比較的大きな配列が 増幅され得、そして制限酵素により切断され、５ｓｃｐ分析のためにひしように 適切である短い長さのフラグメントが供給されることが見出された。この技法を 用いれば、多型性が、対象の遺伝子又は配列の少々の領域のみを分析することに よって発見され得る。イントロンが分析のための標的である場合、イントロンの 位置及び配列はこの技法の促進に必要とされず、その結果、ｃＤＮ＾ＤＮＡデー タが単離するゲノムクローンの必要性を伴わないで直接的に使用され得る。

本発明の多型性はまた、制限フラグメント長さ多型性（ＲＦＬＰ）分析により検 出され得る。ｌ？ＦＬＰ分析は当業者に良く知られており、そしてたとえばＮｏ 　９２１００３８６（引用により本願明細書に組込まれる）に記載されている０ 手短に言えば、この技法は、対象の遺伝子又は対立遺伝子に隣接して位置するプ ローブマーカー配列としての使用を包含する。マーカー遺伝子のフラグメントが 直接的に単離され、そして使用され得、又は配列が知られている場合、オリゴヌ クレオチドプローブがこの配列に基づいて合成され得る。マーカー配列は多望的 に生し、すなわちマーカー配列のわずかに異なった形がその集団に生じる。マー カー配列の特定の形は、マーカー配列が対象の遺伝子とマーカー配列との間のＭ 換えがひじょうにまれであるように対象の遺伝子に密接して連絡されている場合 、対象の遺伝子の特定の形、たとえば特定の対立遺伝子と調和して関連している と言われる。マーカー配列は、それが異常性に関連している対象の遺伝子の特定 の形と調和して関連している場合、異常性を検出するために最とも有用である。

マーカー配列の変異体は、単離された［ｌＮＡが１又は複数の制限酵素により消 化される場合に生じる異なった制限フラグメントパターンにより同定される。マ ーカー配列内に又はその近くに位置する多型性は制限部位で創造し、又は破壊す る０部位が創造され、又は破壊されている酵素によるＤＮＡの消化は、個々の多 型性の形のために異なった制限フラグメントパターンをもたらす、その制限フラ グメントパターンは、消化された、電気泳動的に分別されたＤＮＡに、検出的に ラベルされたマーカー配列の単離されたフラグメントをハイブリダイズすること によって最とも通常には可視化される。

本発明はまた、異常なセロトニン挙動性に関連するＴＰＩＩ遺伝子の対立遺伝子 に対して特異的な単離された核酸を包含する。典型的には、核酸はＴＰＨ遺伝子 のイントロンのサブ配列に対して特異的である。マウスＴＰＩ（遺伝子のイント ロン７に対応するヒトＴＰＨ遺伝子におけるイントロンを含む単離された核酸が 特に有用である（ＳＬａｌｌなど、　（１９９１）前記）、その単離された核酸 は、ポリメラーゼ鎖反応増幅、リガーゼ鎖反応又は当業者に知られている他の増 幅法により得られる。

所望する対立遺伝子に対して特異的な単離された核酸は、上記で論ぜられたＰＣ Ｒ−５ＳＣＰ技法を用いて検出され得、又は配列に対して特異的なプローブを用 いて同定され得る。配列はまた、標準のハイブリダイゼーシッン技法（たとえば サザン又はノザンハイブリダイゼーシッン又はドツトプロット）を用いて、従来 の増幅を伴って又は伴わないで検出され得る。

本発明のＴＰＨ対立遺伝子からの核酸配列（たとえば、ゲノムＤＮＡ。

ｃＤＮＡ、又はＲＮＡ）はまた、コードされたタンパク質の発現を得るために種 々の組換え発現システムに使用され得る。原核又は真核宿主におけるヌクレオチ ド配列の組換え発現は当業界において良く知られている。　Ｓａｍｂｒｏｏｄな ど、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍ ａｎｕａｌ＋Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋ 　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ＋　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋１９８５を参 照のこと０発現されたタンパク質は、異常なセロトニンに関係する対立遺伝子に 対して特異的な免疫グロブリンを高めるために使用され得る。

免疫グロブリン、たとえばモノクローナル抗体は、種々の用途のために使用され 得る。たとえば、それらは、生物学的サンプルにおける特定の対立遺伝子により コードされるＴＰＨ酵素の存在についてアッセイするために使用され得る。モノ クローナル抗体生成の一般的方法の議論のためには、Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｌ ａｎｅ、　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ＋　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、 　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ＋　Ｎ、 Ｙ。

（１９８８）　（これは引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。

免疫グロブリンは、当業者に良く知られている標準のラベリングシステムを用い て検出され□得る。

例−」− この例は、イントロンのコンホメーション多型性を用いての、染色体１１ｐ１５ ．５に対するヒトトリプトファンヒドロキシラーゼ遺伝子の遺伝子地図を示す、 −末鎖コンホメーション多型性（ＳＳＣＰ）技法によるＰＣＲ増幅及び分析によ るヒトＴＰＨ遺伝子のイントロンを試験することによって、５ｓｃｐは無関係な 白人において０．４０及び０．６０の頻度で生じる２つの対立遺伝子により示さ れた。

２４の情報によるＣｅｎｔｒｅ　ｄ’Ｅｔｕｄｅ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｓｅ 　Ｈｕｍａｉｎ（ＣＥＰＨ）家族（Ｄａｕｓｓｅｔなど、（１９９０）Ｇｅｎｏ ｍｉｃｓ　６５７５−５７７）からのＤＮＡ　＠ＴＰＨイントロン多型性につい て型骨けし、そしてｐ１３とＰＩ３との間の染色体１１上での８個の連結される マーカーに関して分析し、ＴＰＯが染色体領域１５．５で）１８８近くに配置さ れていることが見出された。この領域は、Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ−Ｂｅｃｋｗｉｔ ｈ　Ｓｙｎｄｒｏｗｅ及びチロシンヒドロキシラーゼのための遺伝子を包含する いくつかの重要な遺伝子のための遺伝子座を含む。

林且反グ方広 ａ）ポリメラーゼ鎖反応、−末鎖コンホメーション多望性分析。

ポリメラーゼ鎖反応を、ヒ）　ＴＰＩＩ遺伝子の２つの領域に対して行なった。

次の議論においては、イントロン及びエキソン類は、マウス↑Ｐ）ｌ遺伝子にお けるイントロン及びエキソン位置に対応するものである。初めの領域は、マウス ＴＰＯ遺伝子のイントロン５に対応するイントロンを通して、エキソン５の３′ 端から及びエキソン６の５′端まで延びる。第２の領域は、マウスＴＰＨのイン トロン７に対応するイントロンを通して、エキソン７の３′端から及びエキソン ８の５′端まで延びる。′イントロン５″領域は、ヒトＴＰＩＩ配列に対応し、 そして約２３０個の塩基対の領域を増幅するプライマーＨＴＨ５ＳＣＰＩ及び１ （ＴＨ５ＳＣＰ３により増幅された。″イントロン７″領域は、ヒ）　ＴＰ）Ｉ 配列に対応し、そして約８９０個の塩基対の領域を増幅するプライマー）ＩＴＩ ＩＳＳＣＰ４及びＩＩＴＩ（ＳＳＣＰ５により増幅された。それらのプライマー の配列は下記の通りである： ＨＴＨ５ＳＣＰｌ：　５’−ＧＣＧＧＡＣＴＴＧＧＣＴＡＴＧＡＡＣＴＡＴＡＡ ＡＣ−３’ＨＴＨ３ＳＣＰ３：　５’　−＾ＡＴＣＴＣＣＴＣＴＴＣＡＧＴＧＡ ＡＴＴＣＡＡＣＣ−３’ＨＴＨ５ＳＣＰ４：　５’　−ＴＴＣＡＧＡＴＣＣＣＴ ＴＣＴＡＴＡＣＣＣＣＡＧＡＧ−３’ＨＴＨ３ＳＣＰ５：　５’　−ＧＧＡＣＡ ＴＧＡＣＣＴＡＡＧＡＧＴＴＣＡτＧＧＣＡ−３’増幅は、　１１００ｎのヒト ＤＮＡ、０．２μＭの個々のプライマー、２５０ｖＭの個々のｄＣＴＰ、　ｄＧ ＴＰ、　ｄＴＴＰ及びｄＡＴＰ、２５０ｖＭのスペルミジン、５０ｍＭのＭＣＩ 、　１．５＋Ｍの阿ｇｃ１．．０．００１％のゼラチン、１０ｍＭのトリス、ｐ Ｈ８，３，７，５〜１５μＣｉの”Ｐ−ＣＴＰ及び２単位の＾−ｐｌｉ　Ｔａｑ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）を用いて体積２５μｆにおいて行な われた（Ｓａｉｋｉなと、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：２７６６−２ ７７０）　、サンプルを、９４°Ｃで１分、“イントロン５″の増幅のためには 、６２°Ｃで２分及び“イントロン７”の増幅のためには６５°Ｃで２分及び７ ２′Ｃで３分、続いて７２°Ｃで７分の３０回のサイクルで増幅した。二のＰＣ Ｒ混合物５μｌを、１０単位のＨａｅ　ｍ　（ＢＲＬ）を含むＩ　ＸＲｅａｃｔ 　Ｂｕｆｆｅｒ　２（ＢＲＬ）　３０１ｔ　ｊ！中において２時間、消化した。

第１Ａ図、レーン１及び２においては、２μｌの消化されたＤＮＡを、１０μｌ の５％グリセロール、Ｏ，ＯＳ％Ｓｃモフェノールブルー（ＢＰＢ）及び０．０ ５％キシレンシラノール（ＸＣ）に希釈し、そして５μ２をレーン当たりに使用 した。第１Ａ図、レーン３及び４に関しては、２μ！の消化されたＤＮＡを、８ μｌの９５％ホルムアミド、１〇−りのＮａＯＨ，０，０５％ＢＰＢ及び０．０ ５％ＸＣにより希釈し、そして１００°Ｃで２分間インキュベートし、そして５ μｌをレーン当たりに使用した。残る５ｓｃｐ分析のためには、１ｔＩｌの消化 されたＤＮＡを、１９μｌの９５％ホルムアミド、１０１のＮａＯＨ１０，０５ ％ＢＰＢ及び０．０５％ＸＣにより希釈し、そして１００°Ｃで２分間インキュ ベートした。この変性されたＤＮＡ　７μｌをレーン当たりに使用し、そして配 列決定ゲル装置（Ｏｒｉ　ｔａなど、（１９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　５：８７ ４−８７９）を用いて５％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。Ｔ！１気 泳動は、２００ｖで室温で１７．５時間、行なわれた。ゲルを乾燥し、そして− ７０℃でオートラジオグラフ処理した。

ｂ）結合の分析 データはＣＥＰＨにより提供されるプログラムに入力され、そして染色体１１マ ーカーについてのファイルは５ＥＴＰＥＤを用いて調製された。

二点ＬＯＤ評点分析を門＾ＰＭＡＫＥＲ（Ｌａｎｄｅｒなと、（１９Ｂ？）Ｇｅ ｎｏｍｉｃｓ　ｌ：１７４−１８１）を用いて行ない、そしてその二点値を複数 点分析のために用いた。　Ｊｕｎｉｅｎ　ａｎｄ　Ｖａｎ　Ｈｅｙｎｉｎｇｅｎ （１９９１）Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ、Ｃｅ１ｌ　ＧｅｎｅＬ、５８：４５９−５５ ４の結合地図によれば、ＴＰＨはＭＡＰＭＡＫＥＲのＴＲＹ　９１能を有する地 図上に位置していた。すべての−次データは、Ｃ［！Ｉ’ｌ＋に寄与され、そし て自由に利用できる（ＰａｕｓｓｅＬなと、前記）。

ＴＰＨ遺伝子における多型性を同定するために、ＴＰＨイントロンの一本鎖コン ホメーション多型性（ＳＳＣＰ）分析を行なった。ヒトＴＰＨｃＤＮＡ配列（Ｂ ｏｕｌａｒａｎｄなど、（１９９０）Ｎａｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１８：４ ２５７）を、マウスゲノムＴＰＨ配列（Ｓｔａｌｌ　ａｎｄ　Ｇｏｌｄｓａｎ（ １９９１）Ｊ、Ｎｅｕｒｕｓｃｉ、Ｒｅｓ、２８：４５７−４６５）と整合し、 ヒトＴＰＩＩ遺伝子におけるイントロン位置を同定し、そしてオリゴヌクレオチ ドを合成し、マウスイントロン７に対応するヒトイントロンを増幅した。

マウスＴＰ）ｌ遺伝子のイントロン７に対応する領域が増幅される場合、約８３ ０ｂｐのイントロンの存在を示す約８９０ｂｐのフラグメントを増幅した。増幅 されたＤＮＡを、Ｈａｅ　ｍにより消化し、５００．２１０及び１８０ｂｐのフ ラグメントを生成し、ここでコンホメーシツン変異がより敏感に検出され得る（ 第１Ａ図、レーン３及び４）、多型性は天然のＤＮＡに関しては検出され得ない が（第１Ａ図、レーン１及び２）、２１０ｂｐのフラグメントにおける５ｓｃｐ 多型性は天然のゲル上での変性されたＤＮＡの５ｓｅｐ技法を用いて観察された （第１Ａ図、レーン３及び４）、２つの対立遺伝子変異体が同定され、そして第 １図に示されるようにしてＵ及びＬラベルされた。対立遺伝子頻度を７２人の無 関係な白人個人（ＣＥＰＨの両親）で決定し、そしてより共通するし対立遺伝子 は０．６０の頻度を有した。

ＴＰＨ対立遺伝子は、第１Ｂ図において家族１４２３に見られるように、共優性 メンゾリンアン態様で分離する。　ＴＰＨ遺伝子をその染色体位置について遺伝 子的に地図を形成するために、多型性を、情報を与えてくれるすべての２４のＣ ＥＰＩＩ家族においてタイプ分けした。上記に引用されるように、ＴＰＨは染色 体領域１１ｐ１５．３−＞ｐ１４への現場ハイブリダイゼーションにより物理的 に割当てた（Ｃｒａｉｇ（１９９１）Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ。

Ｃｅ１１．ＧｅｎｅＬ、５６：１５７−１５９）、結合地図上に遺伝子を配置す るために、二点及び多点結合分析を行なった。

第２図は、他の染色体１１マーカーに関して最大のＬＯＤ　（見込みの対数）評 点を示す、密接に結合される遺伝子座に対して特異的なＲＦＬＰマーカーを用い て、ＴＰ）Ｉ遺伝子の位置を地図にした。最とも密接するマーカーによる多点分 析は、インスリン、ヘモグロビン〜β（ｌ（８Ｂ）及び０１＋５１３４に対する 動源体ＴＰＨを定める。これは染色体領域１１ｐ１５５でＴＰＨ多型性を定める 。

斑−エ この例は、衝動性乱暴な対象において、トリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰ Ｈ）遺伝子における多型性が５−ヒドロキシインドール酢酸（５−）１１ＡＡ） 　ｉ１１度及びまた、自殺未遂に相互関係していることを示す、多型性はまた、 減じられた空腹時血液グルコース濃度に有意に相互関係する。　ＴＰＨ遺伝子型 と自殺未遂との間の強い関係は、このタイプの衝動性挙動が遺伝的要因により影 響されることを示す。

前の例において、ヒトＴＰＩ（遺伝子のイントロンの１つにおける多量性部位が 一本鎖コンホメーション多望性分析により同定された。

Ｕ及びＬ対立遺伝子として言及される２つの対立遺伝子を同定し、そしてトリプ トファンヒドロキシラーゼ付近の染色体１１に対して遺伝子的に地図を形成した 。Ｌ対立遺伝子は異常なセロトニン挙動性に相互関係した０両対立遺伝子は白人 においてひじように共通し、そしてＵ対立遺伝子は０，４１の頻度で存在した。

林粁反堕方抜 犯罪の特徴に基づいて衝動性又は非衝動性として分類された、フィンランド人の アルコール中毒性暴力性犯罪者及び放火犯の集団におけるＴＰ）ｌ遺伝子型、Ｃ ３Ｆ　５−ＨＩＡＡｉ１度、血液グルコース濃度及び自殺未遂の歴史について分 析した。衝動性犯罪は故意又は挑発を伴わないで行なわれ、ところが非衝動性犯 罪は明白に故意であった。

フィンランド人の健康な対象を対照グループとして使用した。衝動性グループに おける対象の多くは、ひじょうに低い濃度のＣ３Ｐ５−旧ＡＡを有し、そして従 って、セロトニン機能に関連する遺伝子座でマーカーへの結合関連について調査 するために理想的な集団を表わす。

対象はインタビューされ、そしてＤＳＭ−１［［基準を用いて精神病学的に診断 され、衝動性及び非衝動性サブセットへの対象の分割を確保した。　５ｐｉｔｚ ｅｒ　、前記、３３人の衝動性グループのうち１８人が反社会的な人格障害を有 し、他の１５人は断続的な激発障害を有した。すべての犯罪者はアルコール乱用 又は依存症についての基準を満たした。すべての健康な対象はいづれの精神的障 害も有しなかった。

Ｃ５Ｆ　５−）１１ＡＡｉ１１度、ＴＰＩ＋遺伝子型及び血液グルコース濃度を 、インタビューの結果とは関係なく測定した。　ＴＰＯ遺伝子型をすべての対象 におレーで決定した。自殺未遂のＣ５Ｆ　５−１＋１ＡＡ及び歴史を２４人の衝 動性犯罪者及び９人の非衝動性犯罪者及び２７人の健康な対象から利用できた。

Ｃ５Ｆを腰動脈を刺すことにより得、そして５−）１１ＡＡ濃度を５ｃｈｅｉｎ ｉｎなど、　（１９８３）　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３１　：２４６に より記載されるようにしてＨＰＬＣにより測定した。空腹時血液グルコース濃度 を次のようにして測定した。　８　：ＯＯａ、ｓ、で、１２時間の一晩の空腹の 後、対象は１ｇ／ｋｇ体重（４ｄ／ｋｇ）のグルコース溶液又は同一の体積の区 別できない甘さのアスパルテーム溶液を消費した（Ｌｅｉｒａｓ、　Ｔｕｒｋｕ 、　Ｆｉｎｌａｎｄ）。

１５ａｔの血液サンプルを、耐曲静脈からアプロチニン含有試験管（１２，５ｍ １Ｕ／ｄ、＾ＮＴＡＧＯ３ＡＮ　Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｓ、　Ｍａｒｂｕｒｇ 、　Ｇｅｒｍａｎｙ）に前記液体の投与の前に採取し、そしてその投与後１５． ３０．　Ｇｏ、　９０゜１２０、１８０．２４０及び３００分で採取した。試験 の初めの２時間、対象はヘッドで休息した。その後、彼らは病室での移動を許さ れるが、しかし休息は促進された。すべてのサンプルを二重アッセイした。

二重の測定の結果が５％以上食い違う場合、サンプルは再分析された。

猪−米 Ｃ５Ｆ　５−ＨＩＡＡ４度に対するトリプトファンヒドロキシラーゼ遺伝子型の 集団的関連が第１表に示されています、このフィンランド人のグループにおいて は、Ｕ対立遺伝子は０．４５の頻度で存在します。

衝動的及び非衝動的グループ間でのＴＰＨ対立遺伝子の頻度における差異は観察 されなかったが、衝動的グループにおいては、Ｃ３Ｆ５−）１１ＡＡｉｌ１度と ＴＰ）ｌ遺伝子型との間に有意な相互関係が存在する（第３図及び第１表）。衝 動性犯罪者間においては、Ｕυ遺伝子型グループは８５ｎＭ／ｉｄで最高の平均 ５−ＨＩＡＡ濃度を存し、ＵＬグループの濃度は５３ｎＭ／ｄであり、そしてＬ Ｌグループは４７ｎＭ／ｄであった。従って、Ｕ対立遺伝子は衝動性対象におい てそのＬ多量性相当物よりも高いＴＰＨ酵素活性に関連している。ホモ接合性り 対立遺伝子を有する衝動性犯罪者はホモ接合性Ｕ対立遺伝子を有する犯罪者より も低いセロトニンを合成し、そしてヘテロ接合性ＵＬ衝動性は比較的低い割合の セロトニン合成を有する傾向がある。

第１表、衝動性及び非衝動性フィンランド人における５−ＨＩＡＡ濃度及びＴＰ ）ｌ遺伝子型の集団関連性。

ｕｕ　ｓｓ±９（６）　５８±７（８）　７０±６　（１４）ｔｌＬ、５３±６ 　（１３）　６２±８　（１３）　５Ｂ±５　（２６）ＬＬ　４７±６（５）　 ６１±７　（１３）　５７±５　（１８）濃度　ｐ＝０．０１１　ｎ、ｓ、　ｎ 、ｓ。

５−）１１ＡＡ′ａ度：　６０ｔ５　（２４）　６１ｔ４　（３４）　６Ｎ＝３ 　（５Ｂ）（ｌｌｔｌ）の頻度：　０．２７　０．２４　０．２５Ｕ対立遺伝子 の頻度：　０．５２　０．４０　０．４５５−１（ＩＡＡ濃度はｎＭ／ｄ±ｓ、 ｅ、ｍ、として表わされ、そして対象の数は力、コ書きされている。確立はワン −ウェイＡＮＯＶＡにより計算された。

第２表及び第４図に記載されるように、衝動性犯罪者における自殺未遂の歴史と ＴＰＨ遺伝子型との間に強い関連性が存在する。Ｕ対立遺伝子は自殺を決して試 みたことがない個人においては０．７０の頻度で存在し、ところが前に自殺を試 みたことがある個人においてはたった０、３日であった。第２表は、ＵＶ衝動性 対象の１７％のみが自殺を試みており、そしてＵＬ遺伝子型及び８０％のＬＬ遺 伝子型を存する衝動性犯罪者の６２％が自殺を試みたことを示す、従って、衝動 性犯罪者の間では、１つのし対立遺伝子の存在は、自殺未遂の相対的危険性にお いて４．０倍、高く関与している。さらに、自殺未遂したこの研究における唯一 の非衝動性対象はＬＬ遺遺伝梨型有した。このサンプルにおける５　−）１１Ａ Ａ濃度は自殺挙動性に相互関係する。

第２表、衝動的暴行性フィンランド人におけるＴＰＨ遺伝遺伝反型５−旧ＡＡＩ 度と自殺未遂の集団関連性。

ＵＵ　９３±７　（５）　４９　（１）　０．１７ＵＬ　４９＋７　（５）　５ ６＋９　（８）　０．６４（ＵＵ）の頻度：　０．４５　０．０８Ｕ対立遺伝子 の頻度：　０．７０　０．３８５−１！１＾＾濃度はｎＭ／ｌｄ±ｓ、ｅ、ｓ、 として表わされ、そして対象の数はカッコ書きされている。確立はワンーウェイ 八ＮＯＶ八により計算された。

この研究は、このＴＰＨ多型性のための衝動性患者の遺伝子型が未来の自殺未遂 の危険性のための予測的測定を提供することを示す。

セロトニン関連状態、たとえばグルコース代謝はまた、ＴＰＨ多望性にも関連す る（第３表及び第５図）、空腹時の血液グルコース濃度がアルコール中毒の衝動 性フィンランド人において測定され、そして遺伝子型と相互関係されている場合 、有意に低いグルコース濃度がホモ相同性ＬＬ遺伝子型を有する対象に見出され た。この事から、本発明者は、低セロトニン生合成が減じられたグルコース濃度 を引き起こすことを結論づけることができる。セロトニンシステムとグルコース 代謝及び周期的リズムをｉｌ１節する領域との間での脳における分析的結合性は 知られている（たとえば、Ｍｏｏｒｅなど、、　（１９７２）Ｂｒａｉｎ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ　４２：２０１を参照のこと）。

第３表、衝動的及び非衝動的暴行性フィンランド人における血液グルコース濃度 とＴＰＨ遺伝遺伝反型集団関連性。

ＵＵ　３．３７±０．１８　（７）　３．１９±０．１７　（８）ｔｌＬ　３． ５０±０．０９　（１８）　３．４５±０．０８　（１５）ＬＬ　３．０６±０ ．０８　（７）　３．４７±０．０９　（１３）ｐ＝ｏ、０５３　ｎ、ｓ。

アスパルテームの投与後、示された時点のいづれかでの最低グルコース濃度が１ （±ｓ、ｅ、ｍ、）　として示され、そして対象の数がカッコ書きされている。

確立はワン−ウェイＡＮＯＶ＾により計算された。

結論的には、この例は、衝動性対象において、ＴＰＨ遺伝遺伝反型変更されたＣ ＮＳセロトニン代謝の表示であるＣ３Ｆ　５−旧ＡＡ濃度に関連していることを 示す、従って、セロトニン生合成の制御におけるこの遺伝子型差異は、自殺未遂 への高められた可能性及び減じられたグルコースレベルに特異的に関連している 。これは、特定の推定上のセロトニン挙動性の素因において特定の遺伝子を包含 することは最初の研究である。

ｊＬ この例は、Ｕ及びＬ対立遺伝子に関連する多望性のヌクレオチド配列がいかに決 定され得るかを記載する。そのような配列の決定は、個々の対立遺伝子の存在に ついて個人を試験するために、単純な方法、たとえばりガーゼ鎖反応の使用を促 進するために宵月である。

方−広 個人からのＤＮＡを、たとえばポリメラーゼ鎖反応により増幅する。

その増幅されたＤＮＡフラグメントを、必要により、ｌ又は複数の制限エンドヌ クレアーゼ酵素により消化し、多望性が位置するサブフラグメントを放す０次に 、消化されたフラグメントを非変性ゲルを通して電気泳動にかけ、そして多量性 含有フラグメントを同定する。

このフラグメントをゲルから精製し、そしてクローニングベクター中にクローン 化し、又は直接的に配列決定する（クローニング及び配列決定法は、たとえばＳ ａｍｂｒｏｏｌ（など１．前記に説明される）。

対象の対立遺伝子から増幅されたフラグメントのヌクレオチド配列を決定する。

遺伝子座の他の対立遺伝子の相同領域のヌクレオチド配列をまた決定し、そして そのヌクレオチド配列を、対立遺伝子間で変化するヌクレオチドを決定するため に比較する０次に、この情報を使用して、リガーゼ鎖反応に使用するための適切 なプローブを企画する。

上記の記載は例示的であって、制限的ではないことが理解されるべきである。多 くの実施態様は当業者に明らかであろう、従って、本発明の範囲は上記の記載に 関係なく決定されるべきであるが、しかし代わりに、そのような請求の範囲が権 利を与えられる同等の範囲と共に、本発明の請求の範囲に関係して決定されるべ きである。

Ａ、−一 ／／θ　ｌ ＦＩＧ、２゜ ＴＰＨ遺伝子型 ＦＩＧ、Ｊ。

丁ＰＨ遺伝子型 ＦＩＧ、４゜ ＴＰ）ｌ遺伝子型 ＰＣＴ／ＵＳ　９３１０３８１ｉ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号ＣＩ　２　Ｎ　９１０２ 　９３５９−４Ｂ（７２）発明者　リンノイラ、マルックアメリカ合衆国、メリ ーランド　２０８１７゜ベセスダ、チャールストン　コート　７９１２Ｉ （７２）発明者　ビルックネン、マツティフィンランド国、エファイエヌーヘル シンキ　１６．アニロアリュカツ　１セ−

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．衝動性ヒト対象における異常性セロトニン機能を予測するための方法であっ て、トリプトファンヒドロキシラーゼをコードする遺伝子のＬ対立遺伝子を検出 することを含んで成る方法。
2. ２．前記Ｌ対立遺伝子がホモ接合状態で存在する請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記Ｌ対立遺伝子が対象から単離される核酸に検出される請求の範囲第１項 記載の方法。
4. ４．前記Ｌ対立遺伝子がポリメラーゼ鎖反応を用いて検出される請求の範囲第１ 項記載の方法。
5. ５．前記ポリメラーゼ鎖反応が下記配列：【配列があります】 を含んで成るプライマーを使用する請求の範囲第４項記載の方法。
6. ６．前記ポリメラーゼ鎖反応が下記配列：【配列があります】 を含んで成るプライマーを使用する請求の範囲第４項記載の方法。
7. ７．前記Ｌ対立遺伝子が一本鎖コンホメーション多型性分析により検出される請 求の範囲第１項記載の方法。
8. ８．前記対立遺伝子が、トリプトファンヒドロキシラーゼをコードする遺伝子の イントロン内での多型性に関連する請求の範囲第１項記載の方法。
9. ９．前記イントロンがトリプトファンヒドロキシラーゼをコードするマウス遺伝 子のイントロン７に対応する請求の範囲第８項記載の方法。
10. １０．前記異常性セロトニン機能が挙動性である請求の範囲第１項記載の方法。
11. １１．前記異常性挙動が自殺挙動である請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．前記異常性挙動が放火狂である請求の範囲第１０項記載の方法。
13. １３．トリプトファンヒドロキシラーゼをコードする遺伝子のＬ対立遺伝子のサ プ配列に対して特異的な配列を含んで成る単離された核酸。
14. １４．前記核酸がポリメラーゼ鎖反応増幅により得られる請求の範囲第１３項記 載の核酸。
15. １５．前記ポリメラーゼ鎖反応が下記配列：【配列があります】 を含んで成るプライマーを使用する請求の範囲第１４項記載の核酸。
16. １６．前記ポリメラーゼ鎖反応が下記配列：【配列があります】 を含んで成るプライマーを使用する請求の範囲第１４項記載の核酸。
17. １７．前記核酸が： ａ）トリプトファンヒドロキシラーゼをコードする遺伝子のＵ対立遺伝子の対応 する領域に対して特異的な第２の核酸と同じ速度で変性ゲルにおいて移動し；そ して ｂ）前記第２の核酸の移動速度の約１．０２倍の速度で非変性ゲルにおいて移動 する請求の範囲第１３項記載の核酸。
18. １８．前記核酸配列がイントロンを含んで成るＬ対立遺伝子のサプ配列に対して 特異的である請求の範囲第１３項記載の核酸。
19. １９．前記イントロンが、トリプトファンヒドロキシラーゼをコードするマウス 遺伝子のイントロン７に対応する請求の範囲第１８項記載の核酸。