JPH07507205A

JPH07507205A - 遺伝子操作をした微生物の生存をそれらの環境において制限する方法

Info

Publication number: JPH07507205A
Application number: JP5516999A
Authority: JP
Inventors: モリン，セーレン; ギブスコウ，ミヒャエル; クリステンセン，クラウス　ステルンベルウ; バイ，アシム　ケー．; エベール，レオ
Original assignee: アポビア　アクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 1992-04-06
Filing date: 1993-03-30
Publication date: 1995-08-10
Also published as: AU3949193A; EP0635061B1; ATE162220T1; DE69316352T2; WO1993020211A1; CA2133345A1; ES2111745T3; DK0635061T3; CA2133345C; DE69316352D1; AU685391B2; EP0635061A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】２３、負に機能している調節ヌクレオチド配列が、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子の、転写を妨げる終止配列である請求の範囲第１７項記載の細胞。

２４、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子の発現が、前記遺伝子に操作によって連結されている切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列の、部位特異的組換え切り出しの結果として推計学的に誘導され、その調節ヌクレオチド配列が、細胞に存在している間は、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子の発現を阻害する請求の範囲第１項記載の細胞。

２５、切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列が、部位特異的切り出しのための最初の部位と部位特異的切り出しのための２番目の部位とに隣接された配列であり、２番目の部位は最初の部位と同じかまたは機能的に等しい多量体変形酵素による変形が可能であり、それにより前記調節要素が細胞において組換えにより切り出される請求の範囲第２４項記載の細胞。

２６、部位特異的切り出しのための最初と２番目の部位が、プラスミドＲＰ４に由来するｍｒｓ部位である請求の範囲第２４項記載の細胞。

２７、多形体変形酵素が、部位特異的変形のための部位に関してトランスに位置する遺伝子によってコードされている請求の範囲第２５項記載の細胞。

２８、多量体変形酵素をコードしている遺伝子が、プラスミドＲＰ４のｐａｒＡ遺伝子である請求の範囲第２７項記載の細胞。

２９、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子が第１の伝令ＲＮＡをコードし、前記遺伝子に操作によって連結されている切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列が、前記第１の伝令ＲＮＡとＲＮＡ−ＲＮＡ二重鎖を形成する第２の伝令ＲＮＡであり、それにより、それが発現されると、加水分解活性のある酵素をコードしている前記遺伝子の発現が阻害される請求の範囲第２４項記載の細胞。

３０．切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列が、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子の、転写のポリペプチドリプレッサーをコードしている遺伝子である請求の範囲第２４項記載の細胞。

３１、切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列が、Ｉａｃリプレッサーをコードしている遺伝子であり、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子が、操作によってＩａｅプロモーターに連結されており、前記ｌｉｅプロモーターがｌａｅリブ【ノッサーのためのオペレータ一部位を含んでいる請求の範囲第３０項記載の細胞。

３２、負に機能している調節ヌクレオチド配列が、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子の、転写を阻害する終止配列である請求の範囲第２４項記載の細胞。

３３、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子が、前記調節ヌクレオチド配列の逆位可能なプロモーター配列の、組換え逆位の結果として推計学的に発現され、前記プロモーターがその遺伝子に操作によって連結されている請求の範囲第１項記載の細胞。

３４、プロモーターが、ｆｉｍ＾プロモーターを運んでいる配列であるか、またはそれと機能的に相同な配列を運んでいる配列である請求の範囲第３３項記載の細胞。

３５、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子が、細菌プラスミド、細菌染色体、原核生物ウィルス、真核生物ウィルス、真核生物染色体、真核生物ミトコンドリア、真核生物葉緑体、および合成配列から成る群から選択した１ノブリコンに由来する請求の範囲第１項記載の細胞。

３６、加水分解活性のある酵素が、少なくとも１つのシスティン残基を含んでいる酵素である請求の範囲第１項記載の細胞。

３７、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子が　細菌レプリコンから由来した遺伝子である請求の範囲第３５項記載の細胞。

３８、加水分解活性のある酵素が、グラム陰性細菌から単離されたレプリコンに由来する遺伝子にコードされている請求の範囲第３７項記載の細胞。

３９、加水分解活性のある酵素が、セラチア属の一種に由来する遺伝子にコードされている請求の範囲第３８項記載の細胞。

４０、遺伝子が、セラチア・マルセセンス由来の遺伝子である請求の範囲第３９項記載の細胞。

４１、酵素が、以下のＤＮＡ配列： ■−にｉＡ画＝１℃＝Ａ５σ−冗成り０匡臓田α匡Ａムａのｍ虞１Ａ−０τひα 蟻砿心ａαニロク（ａｃｉＴＡｃｃＩＬＣＣＣＡＣＴＡＣＣＡＡ’ＣＡＷＸＡＡＣＴＣＴＴＣＴ”Ｉ■：ｃｔｃｃｔ餌−一＝世１−框−璽雷ム＝ｉ−；＝ム四プに＠コａｃ′１−ａａＡＣＱＩＪ℃＝１に＝ω×講α−ｍぽπ＝−■功富編Ｃ５コの＝μ講　！ロー匡＝工１カヵ＝ｎｏπＣＴＯＩに＝℃ａｍｅＣａＣＴロ＾８Ａｉ人ゴー心ウロフヵＪ＾ａｃｔつｚｔｃｃｔｃｃｕａココ：ＣノロＣＴＣｃ℃ χズ）コニｃＪＣＣＣＣａｃＣｅａＣＣＣｆズコフ＝【講ＣＪＣＣＣＴＣ）ｃ【ｅＴＴＡＣＩＣＡＣＴsＡＡＴＣＣＡＣＡＱＣｔＴＣｒＡｃτ℃Ｉズズズン＝ｒＴｉτｃ講（ズズ＝しルミ宵ＡＡのζ二ＡｃＡ−ロ心ω−−狐口ｉぽπ−画１〒Ａ−車πｍ＝α＾１Ａｉｔ慣真ｍＣＴＡＣＣＴＡ−＝Ａτ＾Ｇ＆００ａＫＡｍＣＡ’１Ｊｅｒ心−ひ℃りＡＡ８＾■０靜■カ０π■＝ｍ−繻一↑℃η心（９）＝＝；繊ＸＴ口ＣＣＣ１講ｕＣＣＣＣＴ１１ニー（シンココ；ｍｍＡＣｍｎ℃ｃｃｃｃａｔｃａｃｃτ’ｒｃｃａｃτＡＡＡＭ；ＴＡＣτ’ｔｅｎ℃ｍ■■wズズズココ１６ＴＡ′ｒＣ＋ＡＣＡＡ（Ｊζｌシニｃ１１ムＡ［χｒ、ｉ’ｍｃτ℃ズコニＪＡＴＴＣＣｃζχ；１＝Ａ（ゴコｃ１１］＝講ｃｅａｃａＴｅ撃戟|二ＡＡＪＯＺＩＷズｎ二ＡｔｅＡＡ工ＡＣＣＣＣＣＡＡＡＯｕＣＡＡ（χ：ＴｃＷＡＡ＃ＣａｃｃｃＴτＡｆｉＣ４ζｃｃ講ｃｉｃｃｃＡＣＣｔＣＸ：Ｉ℃ｚｃｃｔｃ’ｍａRｍｃｒＡｃτ π１η工σＣでχα’Ｊ：ｅＡｃｒ＋Ａαπ℃ＫａゴπｎゴひＪＩＪＱ−＾ＡＣ σαロフ１χωコαａｃＡｃｃｃｃｃｃｃａＣＪＣｃ（χズ；１）＝ｉｃｃλｃｃ’ｒｃｅｅａＡＣＩＣＡｃ〔）ＣＣ）ＣＣＣＣＣτ℃Ａを有する遺伝子によってコードされているエンドヌクレアーゼである請求の範囲第４０項記載の細胞。

４２、酵素が、以下のＤＮＡ配列：を有する遺伝子によってコードされているホスホリノ々−ゼである請求の範囲第４０項記載の細胞。

４３、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子が、グラム陽性細菌種に由来する請求の範囲第３７項記載の細胞。

４４、遺伝子が黄色ブドウ球菌由来の遺伝子である請求の範囲第４３項記載の細胞。

４５、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子か、または前記遺伝子を調節している配列の少なくとも１つが、ｌ・つあるいはそれ以上の部位において突然変異しており、それによって遺伝子にコードされている酵素の細胞機能制限効果が、細胞において発現される場合、前記遺伝子および前記ヌクレオチド配列を突然変異していない形で含んでいる細胞に比較して、同じかまたは増加している請求の範囲第１項記載の細胞。

４６、細胞がエンドヌクレアーゼをコードしている遺伝子を含んでいる請求の範囲第４６項記載の細胞。

４７、遺伝子がセラチア属の一種に由来する遺伝子である請求の範囲第４６項記載の細胞。

４８、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子の、転写を調節しているヌクレオチド配列が、細菌プラスミド、細菌染色体、原核生物ウィルス、真核生物プラスミド、真核生物ウィルス、真核生物染色体、真核生物ミトコンドリア、真核生物葉緑体、および合成配列から成る群から選択したレプリコンに由来する請求の範囲第１項記載の細胞。

４９、細胞が、非酵素の細胞機能制限遺伝子の産物をコードしている更なる調節発現可能な遺伝子を含んでいる請求の範囲第１項記載の細胞。

５０、更なる調節発現可能な遺伝子が、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子を調節している配列と同じタイプの調節ヌクレオチド配列によって調節されている請求の範囲第４９項記載の細胞。

５１、更なる調節発現可能な遺伝子が、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子を調節している配列の他のタイプの調節ヌクレオチド配列によって調節されており、前記の他のタイプが、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子を調節することもできる調節ヌクレオチド配列である請求の範囲第４９項記載の細胞。

５２、更なる調節発現可能な遺伝子が、プラスミドＲ１のｐａｒｅ領域か、またはＲ１ｈｏｋ遺伝子と機能的に相同なりＮＡ配列である請求の範囲第４９項記載の細胞。

５３、更なる調節発現可能な遺伝子が、ｇｅｆ遺伝子である請求の範囲第４９項記載の細胞。

５４、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子を運んでいるレプリコン、および（または）調節ヌクレオチド配列を運んでいるレプリコンとは天然には関係していないＤＮＡ配列を更に含んでいる請求の範囲第１項記載の細胞。

５５、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子、および（または）調節ヌクレオチド配列を運んでいるレプリコンとは天然には関係していないＤＮＡ配列が、免疫活性のある遺伝子産物をコードしている配列である請求の範囲第５４項記載の細胞。

５６、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子、および（または）調節ヌクレオチド配列を運んでいるレプリコンと天然には関係していないＤＮＡ配列が、農薬活性のある遺伝子産物をコードしている配列である請求の範囲第５４項記載の細胞。

５７、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子、および（または）調節ヌクレオチド配列を運んでいるレプリコンと天然には関係していないＤＮＡ配列が、汚染物質を分解する遺伝子産物をコードしている配列である請求の範囲第５４項記載の細胞。

５８、その発現の結果前記細胞の細胞質にあって加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子を含んでいる組換えレプリコンまたは複数の組換えレプリコンで形質転換した細胞であり、前記遺伝子の発現が、細胞の非制限機能に必要な加水分解可能な細胞質物質を加水分解する速度で、細胞の機能が制限される程度に、細胞における酵素の形成を導き、前記遺伝子の発現が、その遺伝子を含んでいる組換えレプリコンかまたは、形質転換された細胞に存在する他の組換えレプリコンに含まれている、調節ヌクレオチド配列によって調節されている請求の範囲第１項記載の細胞。

５９、細胞の細胞質にあって加水分解活性のある酵素をコードしている細胞において、調節発現可能な遺伝子が発現される時、前記遺伝子の発現が、細胞の非制限機能に必要な加水分解可能な細胞質物質を加水分解する速度で、細胞の機能が制限される程度に、細胞における酵素の形成を導き、前記遺伝子の発現が、組換えレプリコンかまたは、そのレプリコンを含んでいる他の組換えレプリコンに含まれている調節ヌクレオチドによって調節されている、調節発現可能な遺伝子を含んでいる組換えレプリコン。

６０、調節ヌクレオチド配列を含んでいる請求の範囲第５９項記載の組換えレプリコン。

６１、加水分解活性のある酵素が、そのレプリコンが細胞において発現される時、細胞内に保持される酵素である請求の範囲第５９項記載のレプリコン。

６２、コードされている酵素が、ヌクレアーゼ、ホスホリパーゼ、リパーゼ、リゾチーム、プロテアーゼ、およびカルボヒドラーゼから成る群から選択される請求の範囲第５９項記載のレプリコン。

６３、コードされている酵素がホスホリパーゼである請求の範囲第６２項記載のレプリコン。

６４、遺伝子の発現の結果、細胞の核酸におけるホスホジエステル結合を加水分解することのできるヌクレアーゼが形成され、前記遺伝子の発現が、細胞核酸の片方の鎖にニックが存在する結果となる速度で、細胞の核酸修復機構によって修復できない程度に、細胞におけるヌクレアーゼの形成を導き、それにより前記細胞の機能が制限される請求の範囲第５９項記載のレプリコン。

６５、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子が、もしそれが存在すれば細胞膜を通しての酵素の輸送が可能となるペプチドシグナル配列をコードしている配列を欠いている遺伝子である請求の範囲第５９項記載のレプリコン。

６６、調節ヌクレオチド配列が、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子に、操作によって連結されている調節可能なプロモーターを含んでいる請求の範囲第５９項記載のレプリコン。

６７、調節可能なレプリコンが、レプリコンを含んでいる細胞の環境条件、細胞の生理的状態、および推計学的事変から選択した因子によって調節されている請求の範囲第６６項記載のレプリコン。

６８、調節可能なレプリコンが、環境における物理条件、およびある種の化学薬品の環境における存在の有無から選択した因子である請求の範囲第６７項記載のレプリコン。

６９、化学薬品が、炭素源、窒素源、代謝物質、アミノ酸、ヌクレオシド、ピリミジン塩基、プリン塩基、および金属イオンから選択される請求の範囲第６８項記載のレプリコン。

７０、化学薬品がイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（［ＰＴＧ）である請求の範囲第６９項記載のレプリコン。

７１、物理条件が、環境における一般的な温度を含んでいる請求の範囲第６８項記載のレプリコン。

７２、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子の発現が、それが細胞に存在している間は加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子の発現を阻害する、切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列の、組換え切り出しの結果として推計学的に誘導される請求の範囲第５９項記載のレプリコン。

７３、前記切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列が、最初のフランキング配列と、前記最初のフランキング配列に本質的に相同である２番目のフランキング配列とに隣接された配列であり、それにより前記調節要素を細胞において組換えにより切り出すことができる請求の範囲第７２項記載のレプリコン。

フ４．フランキング配列が、１０Ｇ塩基対乃至５０００塩基対の範囲の長さを有する請求の範囲第７３項記載のレプリコン。

７５、フランキング配列が、２００塩基対乃至３０００塩基対の範囲の長さを有する請求の範囲第７４項記載のレプリコン。

７６、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子が、伝令ＲＮＡである第１のＲＮＡをコードしており、切り出し可能な負に機能しているヌクレオチド配列が前記第１のＲＮＡとＲＮＡ−ＲＮＡ二重鎖を形成する第２のＲＮＡをコードしている遺伝子であり、それにより、それらの転写が阻害される請求の範囲第７５項記載のレプリコン。

７７、負に機能する調節ヌクレオチド配列が、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子の、転写のポリペプチドリプレッサーをコードしている遺伝子である請求の範囲第６１項記載のレプリコン。

７８、負に機能している調節ヌクレオチド配列がＩａｃリプレッサーをコードしている遺伝子であり、加水分解可能な酵素をコードしている遺伝子が、　Ｉａｃプロモーターに操作によって連結されており、前記１ａｃプロモーターが、前記１ａｃリプレツサーのためのオペレータ一部位を含んでいる請求の範囲第７７項記載のレプリコン。

７９、負に機能している調節ヌクレオチド配列が、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子の転写を妨げる終止配列である請求の範囲第７２項記載のレプリコン。

８０、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子の発現が、前記遺伝子に操作によって連結されている切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列の、部位特異的組換え切り出しの結果として推計学的に誘導され、その調節ヌクレオチド配列が細胞に存在している間は、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子の発現を阻害する請求の範囲第５９項記載のレプリコン。

８１、前記切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列が、部位特異的変形のための最初の部位と、最初の部位と同一かまたは機能的に等しい多量体変形酵素によって変形可能である２番目の部位とに隣接された配列であり、それにより前記調節要素を細胞において組換えにより切り出すことのできる請求の範囲第８０項記載のレプリコン。

８２、部位特異的変形のための最初の部位および２番目の部位が、プラスミドＰＲ４由来のｍｒｓ部位である請求の範囲第８０項記載のレプリコン。

８３、多量体変形酵素が、部位特異的変形のための部位に関してトランスに位置する遺伝子によってコードされている請求の範囲第８１項記載のレプリコン。

８４、多量体変形酵素をコードしている遺伝子が、プラスミドＰＲ４のｐａｒＡ遺伝子である請求の範囲第８３項記載のレプリコン。

８５゜その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子が、伝令ＲＮＡである第１のＲＮＡをコードしており、前記遺伝子に操作によって連結されている切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列が、前記第１の伝令ＲＮＡとＲＮＡ−ＲＮＡ二重鎖を形成する第２のＲＮＡであり、そのためそれが発現されると加水分解活性のある酵素をコードしている前記遺伝子の転写を阻害する第二のＲＮＡをコードしている遺伝子である請求の範囲第８０項記載のレプリコン。

８６、切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列が、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子の、転写のポリペプチドリプレッサーをコードしている遺伝子である請求の範囲第８６項記載のレプリコン。

８７、切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列が、Ｉａｃリプレッサーをコードしている遺伝子であり、その遺伝子の発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子が、　Ｉａｃプロモーターに操作によって連結されており、前記ｌｉｅプロモーターが、Ｉａｅリプレッサーのためのオペレータ一部位を含んでいる請求の範囲第８６項記載のレプリコン。

８８、負に機能している調節ヌクレオチド配列が、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子の、転写を妨げる終止配列である請求の範囲第８０項記載のレプリコン。

８９、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子が、前記調節ヌクレオチド配列の逆位可能なプロモーター配列の、組換え逆位の結果として推計学的に発現され、前記プロモーターがその酵素をコードしている遺伝子に操作によって連結されている請求の範囲第５９項記載のレプリコン。

９０、プロモーター配列が、ｆｉｍＡプロモーターを運んでいる配列であるか、またはそれと機能的に相同な配列である請求の範囲第８９項記載のレプリコン。

９１、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子が、細菌プラスミド、細菌染色体、原核生物ウィルス、真核生物プラスミド、真核生物ウィルス、真核生物染色体、真核生物ミトコンドリア、真核生物葉緑体、および合成配列から成る群から選択したレプリコンに由来する請求の範囲第５９項記載のレプリコン。

９２、加水分解活性のある酵素が少なくとも１つのシスティン残基を含んでいる請求の範囲第５９項記載のレプリコン。

９３、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子が、細菌レプリコンに由来する請求の範囲第９１項記載のレプリコン。

９４、加水分解活性のある酵素が、グラム陰性細菌から単離したレプリコンに由来する遺伝子にコードされている請求の範囲第９３項記載のレプリコン。

９５、加水分解活性のある酵素が、セラチア属の一種由来の遺伝子にコードされている請求の範囲第９４項記載のレプリコン。

９６、遺伝子がセラチア・マルセセンスに由来する請求の範囲第９５項記載のレプリコン。

９７、加水分解活性のある酵素が、以下のＤＮＡ配列：ＣｅＡＣＣａＡＣＣＴＣＴＣＴＡＴＣＣＴ＝ＶコＡｔＡＣＣｎＣｕＱ１．ＩＣａＡＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＪＡＣＴｌ’ＣＣＱＪＡｎａＣ１ｎbｅＡＡａＣＡＣＩＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴτＣＱＣ＾ＣａＴｍＣｔｔｉＣＴ）ＣＣＡＡＴＡＴＣｂＡＣＪＡ（（ズー：ＴｌｕＣＣＣＡＣＱＩＪＡＴＡＣＴＣＴＡ＝植ｍＡＣａ−（、ｔＡ−ＡＡＡＣＣＱＩＹＣＣＣＣＣＣＣＴＣｊＡＣｍＣＡｍＴｔＡＣＪＣＴＣＣＣＣｅｆＪＡｆｆＩＣａ＋ｃｗＬｊ−ＣＣＴＴＣＴｅＣ！＝工４π薫ｒαＣＡＡＣ！ＡＴＣＴＣＡ＆Ｃｎ’Ｃｃｔｃｅ−τｃｃｃｃｃτ０ＴＣＡＣＯｊＣＣＣＣτＣＣｃＣｔｃＣＣτＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣτ（：ｅｅＪｍＡ↑ＣＣＣτＣ講ＡＴ↑Ａ（ bＴＣτＣ０ＡＣＡ丁ｅ、ｔＣＣＣＣＣＣ＾＾−ＭＴＣｔＱＴＣα口匡匡〇−に工京μ−ＣＣＣＱ顛Ｃ−αのは−ατ＾Ｃ−コＡＴのυｒでＡ　−＾Ｃ７７ＪＡＣＱＬ＝＝巾π＝−心つのＡ■鼻＠傾℃αりτ＾ｗτ＾τＡα−ｃｃｃｃｃｃｅｃｃτ＾１ＡＡＴＴＣＣＩｔＣＣＣＣＣＯＣ（ＣＣＣＯ：ｃｃａＣＣττＣ１講ＣｔＣＣＩＴＣＣＣＴＩ℃０（ＴＡＣＣＴＡＣＣＣＣＣＣＣτＡＴＡＣ`ＣＣａＣＣＯＣＪＴＡｉＯ口Ｃ−ＣＴｅＣＣＣＣＣＣＣＣ＾ＩＪＩルご丁ＡＣ■υ！ＡＪＣＴＯ：ｅｃｃυυ＾＾−υのπＣｘ＝σ＾α鐸−τｉ＾つ＾ひ＾０−＝−ゆＣτ℃χ−コＣ１シじＬ＾ＣＣＣｃ′ｒ′Ｉ″ｒＣ＋ＡｃｃｃｃｃｃｃｉＣシズ；ｒ〔コｒ「τＣχシ：ｔＷＣＴＣＣ’１ＡＣＸズ一；τｃｃ純刀FＪＴＣＡＣＣ！コｃｃａαＡ＾ＡメくｒｒＡも口（１−ｒＣに；ｎ；τＡπ＝電π顎つ（ＪＡυ■Ｗ−コ蘭蒐υａＴＴｃｃ−υコクズ岡力ＡＡ■のｎ℃ａｔａＣＪＺＣｔＪＡａＣＣＪＣＡＡＣＣＴａＣＴＣτＴＣＴＣＣｃｃｃＴＫＣｃｃｃｅｃｃｒａａｐＣａＣＣＣＴτメｐＣＣＣＣＣＡ（ＴbＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣτＡＣｒＡＣＴ寸＝：τ＝のＣ喚ば１施＾υのａａＣ蕉αＣαロＣルα匡αひυω匡ααπひ（（ＴＯＯ：ＪＡＣＩ：ひσてｍご宜匡α匡にυα匡σひを有する遺伝子によってコードされているエンドヌクレアーゼである請求の範囲第９６項記載のレプリコン。

９８、加水分解活性のある酵素が、以下のＤＮＡ配列：ｔＡｃＴｃＪＹＡ（ＣＣＡＡＡＴＴＣＡＡＡＡＴＣＣＡＣＪＣＣＴＣＡτＡｃＣζｚｃＣム（ＣＣｃｃＣｃ１講ｅを有する遺伝子によってコードされているホスホリパーゼである請求の範囲第９６項記載のレプリコン。

９９、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子が、グラム陽性細菌種に由来する請求の範囲第９３項記載のレプリコン。

１００、遺伝子が黄色ブドウ球菌に由来する遺伝子である請求の範囲第９９項記載のレプリコン。

１０１、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子か、または前記遺伝子を調節しているヌクレオチド配列が、１つあるいはそれ以上の部位で突然変異しており、それにより遺伝子にコードされている酵素の細胞機能制限効果が、細胞において発現される場合、突然変異したＤＮＡを含んでいない細胞において発現される酵素の細胞機能制限効果に比較して、同じかまたは増加している請求の範囲第５９項記載のレプリコン。

１０２、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子が、エンドヌクレアーゼをコードしている遺伝子である請求の範囲第１０１項記載のレプリコン。

１０３、エンドヌクレアーゼをコードしている遺伝子が、セラチア属の一種に由来する遺伝子である請求の範囲第１０２項記載のレプリコン。

１０４、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子の、転写を調節しているヌクレオチド配列が、細菌プラスミド、細菌染色体、原核生物ウィルス、真核生物プラスミド、真核生物ウィルス、真核生物染色体、真核生物ミトコンドリア、真核生物葉緑体、および合成配列から選択したレプリコンに由来する請求の範囲第５９項記載のレプリコン。

１０５、非酵素の細胞機能制限機能をコードしている、更なる調節発現可能な遺伝子を含んでいる請求の範囲第５９項記載のレプリコン。

１０６、更なる調節発現可能な遺伝子が、細胞機能を制限する加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子を調節している配列と、同じタイプの調節ヌクレオチド配列によって調節されている請求の範囲第１０５項記載のレプリコン。

１０７、更なる調節発現可能な遺伝子が、細胞機能を制限する加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子を調節している配列より他のタイプの調節ヌクレオチド配列によって調節されており、前記能のタイプは、細胞機能制限酵素をコードしている前記遺伝子を調節することができる請求の範囲第１０５項記載のレプリコン。

１０８、更なる調節発現可能な遺伝子が、プラスミドＲ１のｐａｒＢ領域からのｈｏｋ遺伝子か、またはＲ１ｈｏｋ遺伝子と機能上相同であるＤＮＡ配列である請求の範囲第１０５項記載のレプリコン。

１０９、更なる調節発現可能な遺伝子がｇｅｆ遺伝子である請求の範囲第１０５項記載のレプリコン。

１１０、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子を運んでいるレプリコン、および（または）調節ヌクレオチド配列を運んでいるレプリコンに、天然には関係していないＤＮＡ配列を更に含んでいる請求の範囲第５９項記載のレプリコン。

１１１、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子、および（または）ｍ節ヌクレオチド配列を運んでいるレプリコンに、天然には関係していないＤＮＡ配列が、免疫活性のある遺伝子産物をコードしている配列である請求の範囲第１１０項記載のレプリコン。

１１２、酵素をコードしている遺伝子、および（または）調節ヌクレオチド配列を運んでいるレプリコンに、天然には関係していないＤＮＡ配列が、農薬活性のある遺伝子産物をコードしている配列である請求の範囲第１１０項記載のレプリコン。

１１３、酵素をコードしている遺伝子、および（または）調節ヌクレオチド配列を運んでいるレプリコンに、天然には関係していないＤＮＡ配列が、汚染物質を分解する遺伝子産物をコードしている配列である請求の範囲第１１０項記載のレプリコン。

１１４、請求の範囲第１項記載の多数の細胞から成る細胞集団にして、前記細胞が、その発現の結果、前記細胞の細胞質にあって加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子を含んでおり、細胞は更に前記遺伝子の発現を調節する調節ヌクレオチド配列を含んでおり、前記遺伝子の発現が、細胞の非制限機能に必要な加水分解可能な細胞質物質を加水分解する速度で、細胞の機能を制限する程度に細胞における酵素の形成を導く細胞の集団。

！１５．請求項５９に定義したような組換えレプリコンで形質転換した、形質転換可能な細胞を含んでおり、前記レプリコンが前記細胞において複製することのできる請求の範囲第１１４項記載の細胞集団。

１１６、細胞が細菌細胞である請求の範囲第１１４項記載の細胞集団。

１１７、細菌細胞が、その天然の生育場所が、土壌、表面水、および植物から選択した生育場所である種から選択した請求の範囲第１１６項記載の細胞集団。

１１８、細菌細胞がグラム陰性細菌の細胞である請求の範囲第１１６項記載の細胞集団。

１１９、機能制限酵素をコードしている遺伝子の発現が、前記細胞がヒトまたは動物体、または外部環境に放出される際、リプレッサー物質が機能しない形に変わるまで崩壊を受けることのできるリプレッサー物質によって調節することができ、前記リプレッサー物質が集団の細胞内に異なる濃度で存在することにより、その直線的な崩壊の結果として、集団の細胞の機能がしだいに制限される請求の範囲第１１４項記載の細胞集団。

１２０、細胞集団の生存を第１または第２の環境において制限する方法にして、前記細胞集団の、その集団の細胞内で複製することのできる組換えレプリコンを用いた形質転換と、その発現の結果、前記細胞の細胞質にあって加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子を入れることとを含む方法であり、細胞は更に、環境因子によって調節され、前記遺伝子の発現を調節する調節ヌクレオチド配列を含んでおり、前記遺伝子の発現が、細胞の非制限機能に必要な加水分解能な細胞質物質を分解する速度で、細胞の機能を制限して、細胞集団の生存を制限するに至る程度に、細胞における酵素の形成を導く方法。

１２１、細胞集団が請求項１１１乃至請求項１１９に定義されているような細胞集団である請求の範囲第１２０項記載の方法。

１２２、細胞集団の生存を、遺伝子が発現する、第１の環境において制限し、前記細胞集団がそれによって第１の環境内に封じ込められる請求の範囲第１２０項記載の方法。

１２３、第１の環境に存在する間は細胞集団の生存を制限せず、第１の環境は、第１の環境とは物理的および（または）化学的に異なる第２の環境に変わることができ、第１の環境においては、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子は発現しないが、しかし第２の環境へ移すかまたは物理的および（または）化学的に変化した第１の環境に存在する場合には、遺伝子が発現し、細胞集団の生存を制限する請求の範囲第１２０項記載の方法。

１２４、リプレッサー物質をコードしている調節ヌクレオチド配列に、操作によって連結した加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子を、細胞に与えることにより、細胞集団の生存を制限し、前記細胞がヒトまたは動物の体、または外部環境に放出される時、リプレッサー物質が機能しない形に変わるまで崩壊を受けることができ、前記リプレッサー物質が集団の細胞内に異なる濃度で存在することにより、その集団の細胞の機能をしだいに制限する請求の範囲第１２０項記載の方法。

１２５、染色体外の組換えレプリコンを、前記レプリコンが天然に第２の種類の細胞に形質転換することのできる第１の種類の細胞に入れる方法にして、染色体外の組換えレプリコンへの、その発現の結果細胞の細胞質にあって加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子の供与を含んでおり、前記酵素の形成が、細胞の非制限機能に必要な加水分解可能な細胞質物質を加水分解する速度で、細胞の機能が制限される程度におこり、前記第１の種類の細胞は前記遺伝子の発現を阻害する調節ヌクレオチド配列を含んでいる染色体レプリコンを有するかまたは有すべく修飾してあり、それにより第１の種類の細胞を防御し、前記調節遺伝子は第２の種類の細胞にはないため、それによってもし第２の種類の細胞が染色体外の組換えレプリコンを受けとると、前記遺伝子は発現し、機能制限効果を及ぼす方法。

１２６、組換えレプリコンが、請求項５９に定義したような、調節ヌクレオチド配列を含まないレプリコンである請求の範囲第１２４項記載の方法。

１２７、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子の発現の結果、細胞の核酸におけるホスホジエステル結合を加水分解するエンドヌクレアーゼが形成され、前記遺伝子の発現が、細胞において核酸にニックが存在する結果となる速度で、細胞の核酸修復機構によって修復され得ない程度に、細胞におけるエンドヌクレアーゼの合成を導き、それにより前記細胞の機能を制限する請求の範囲第１２５項記載の方法。

１２８゜細胞集団の生存を推計学的に制限する方法にして、調節発現可能な遺伝子を含んでいる組換えレプリコンを用いた細胞の形質転換を含んでおり、調節発現可能な遺伝子が、細胞の細胞質にあって加水分解活性のある酵素をコードしている細胞において発現されると、前記遺伝子の発現が、細胞の非制限機能に必要な加水分解可能な細胞質物質を加水分解する速度で、細胞の機能を制限する程度に、細胞における酵素の形成に導き、前記遺伝子または複数の遺伝子の発現が、それが細胞に存在する間は酵素をコードしている遺伝子の発現を阻害する、切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列の、組換え切り出しの結果として推計学的に誘導され、前記負に機能している調節ヌクレオチド配列が、組換えレプリコンまたは、そのレプリコンを含んでいる集団の細胞に存在する他の組換えレプリコンに含まれている方法。

１２９、組換えレプリコンが、請求項７３に定義したレプリコンである請求の範囲第１２８項記載の方法。

１３０、細胞集団の生存を推計学的に制限する方法にして、調節発現可能な遺伝子を含んでいる組換えレプリコンを用いた細胞の形質転換を含んでおり、調節発現可能な遺伝子が、細胞の細胞質にあって加水分解活性のある酵素をコードしている細胞において発現されると、前記遺伝子の発現が、細胞の非制限機能に必要な加水分解可能な細胞質物質を加水分解する速度で、細胞の機能を制限する程度に、細胞における酵素の形成に導き、前記遺伝子の発現が、それが細胞に存在する間は酵素をコードしている遺伝子の発現を阻害する、切り出し可能な部位特異的組換え切り出しの結果として推計学的に誘導され、前記負に機能している調節ヌクレオチド配列が、組換えレプリコンまたは、そのレプリコンを含んでいる集団の細胞に存在する他の組換えレプリコンに含まれている方法。

１３１、組換えレプリコンが、請求項８１において定義されているようなレプリコンである請求の範囲第１３０項記載の方法。

１３２、細胞集団の生存を推計学的に制限する方法にして、調節発現可能な遺伝子を含んでいる組換えレプリコンを用いた細胞の形質転換を含んでおり、調節発現可能な遺伝子が、前記細胞の細胞膜の向こうへ輸送されず、細胞の細胞質で加水分解活性のある酵素をコードしている細胞において発現されると、前記遺伝子の発現が、細胞の非制限機能に必要な加水分解可能な細胞質物質を加水分解する速度で、細胞の機能を制限する程度に、細胞における酵素の形成を導き、前記遺伝子の発現が、前記調節ヌクレオチド配列の逆位可能なプロモーター配列の組換え逆位の結果として推計学的に発現され、前記プロモーターが酵素をコードしている遺伝子に、操作によって連結されており、それが細胞に存在する間は酵素をコードしている遺伝子の発現が阻害され、前記調節ヌクレオチド配列が、組換えレプリコンか、またはそのレプリコンを含んでいる細胞に存在する他の組換えレプリコンに含まれている方法。

１３３、プロモーター配列が、ｆｉｍＡプロモーターを運んでいる配列であるか、またはそれと機能的上の相同物を運んでいる配列である請求の範囲第１３２項記載の方法。

１３４、請求の範囲第１１４項記載の生存可能な機能制限細胞集団を含んでいる免疫活性のある組成物において、細胞は、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子または調節ヌクレオチド配列とは天然には関係していない、更なるＤＮＡ配列を含んでおり、更なる配列は免疫活性のある遺伝産物をコードしている配列であり、この組成物がヒトまたは動物に投与されると、効果的な免疫反応を前記ヒトまたは動物において得るために十分な期間および量で免疫活性のある遺伝子産物を細胞に発現させるが、しかしヒトおよび動物の中では生き残ることができない、という程度に細胞の機能が制限されている組成物。

１３５、細胞がその中に、免疫活性のある遺伝子産物をコードしている配列であって、免疫活性のある遺伝子産物とポリペプチドとを含んでなる融合タンパク質をコードしている配列を含んでおり、ポリペプチドの存在ｐ結果、前記融合タンパク質が、細胞の外表面へ輸送される請求の範囲第１３４項記載の組成物。

１３６、融合タンパク質に存在しているポリペプチドが、フィンブリリンタンパク質、繊毛、べん毛、ＯＭ表面タンパク質に由来するポリペプチドから選択した表面タンパク質である請求の範囲第１３５項記載の組成物。

１３７、細胞表面のポリペプチドが腸内細菌科、ビブリオ科、およびシュードモナス科から選択した細菌種に由来する請求の範囲第１３５項記載の組成物。

１３８、請求の範囲第１１１項記載の生存可能な細胞集団を含んでいる農薬活性のある組成物において、細胞が加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子または調節ヌクレオチド配列とは天然には関係していない更なるＤＮＡ配列を含んでおり、更なる配列が農薬活性のある遺伝子産物をコードしている配列であり、この組成物を害虫を含んでいる環境に施すと、前記環境において効果的な農薬効果を得るために十分な期間および量での、農薬活性のある遺伝子産物を細胞に発現させるが、しかし細胞は環境において生き残ることができないという程度に、細胞の機能が制限されている組成物。

１３９、更なるＤＮＡ配列が、昆虫またはそれらの子孫に有害な遺伝子産物をコードしている請求の範囲第１３８項記載の組成物。

１４０、更なるＤＮＡ配列が、バシラス・スリジエンシス由来の、殺虫作用のあるタンパク質をコードしている配列である請求の範囲第１３６項記載の組成物。

１４１、請求の範囲第１１４項記載の生存可能な細胞集団を含んでいる環境汚染物質を分解する組成物において、細胞が加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子または調節ヌクレオチド配列とは、天然には関係していない更なるＤＮＡ配列を含んでおり、更なる配列は環境汚染物質を分解する遺伝子産物をコードしており、この組成物を、分解されるべき汚染物質を含んでいる環境に施すと、前記環境において効果的な汚染物質分解効果を得るために十分な期間および量での、汚染物質を分解する遺伝子産物を細胞に発現させるが、しかし細胞は生き残ることができないという程度に細胞の機能が制限されている組成物。

１４２、その発現の結果、細胞機能を制限する酵素が形成される遺伝子、または複数の遺伝子が、汚染物質を分解する遺伝子産物によって分解することのできる汚染物質が、実質的に分解して初めて発現される請求の範囲第１４１項記載の組成物。

明細書遺伝子操作をした微生物の生存をそれらの環境において制限する方法発明の技術分野本発明は、遺伝子操作により得られた微生物の、生物的封じ込めについての新規なシステムを供する。本発明は、調節発現の可能な遺伝子、すなわちその発現の結果、細胞質で活性をもつ加水分解酵の形成が、細胞機能の制限に帰着する速度で行なわれる遺伝子を含んでいる細胞またはその細胞の集団に関しており、かかる調節発現の可能な遺伝子を含んでいる組換えレプリコンに関しており、発現可能な遺伝子を含んでいる細胞集団の生存を制限する方法に関しており、染色体外の組換えレプリコンを最初の種類の細胞に入れる方法、および細胞集団の生存を推計学的に制限する方法に関する。

また免疫活性のある組成物、農薬活性のある組成物、および環境汚染物質を分解する組成物をも供し、これらのすべては、細胞が更にそれぞれ免疫活性があるか、農薬として活性があるか、または環境汚染物質を分解する遺伝子産物をコードしているＤＮＡ配列を含んでいる、前文に定義したような細胞の集団を含む。

背景技術産業上有用な新規な微生物を設計するための組換えＤＮＡ技術の適用の増加は、科学者の社会および一般社会において、潜在的な危険性についての関心を引き起こしてきた。これらの関心は主として、かかる遺伝子操作により生じた微生物（ＧＥＭ）の故意のまたは故意でない放出についての、ヒトへの潜在的危害、および、好ましくないおよび（または）制御できない生態学的な影響に関するものである。

これらの関心は、かかる微生物が使用されている研究室および生産施設におけるＯＥＭの安全な取り扱いのための、公式のガイドラインの制定を達成させた。かかるガイドラインはこれまでは主として、研究室および生産施設において、かかる施設の労働者が汚染される見込み、またはＯＥＭが発酵容器のような最初の物理的環境から漏出する見込みを減少させる目的で、物理的に含んでいるＯＥＭの測定に向けられてきた。

現在では、ＯＥＭの取り扱いにおける安全性のレベルは、遺伝子操作により生じた生物がもし本来の環境から漏出した場合にその生存の可能性を減少させるために、物理的封じ込み手段と生物的封じ込め手段とを組合せることにより増加させることができると考えられている。

しかしながら最近では、外の環境へのＯＥＭの故意の放出および生きたワクチンとしてのＧＥＭの使用に関する潜在的危険性に、ますます関心が集中してきている。この点については、ＯＥＭの環境への放出またはワクチンとしてヒトまたは動物体へ投与した後に、放出された生物を調節された方法で効果的に殺す生物的封じ込めシステムか、またはかかるＧＥＭを、放出された環境の天然の微小植物相によって最終的には追い出されるであろう有意な競争上の不利益の下に置く程度に、放出されたＯＥＭの機能を制限する生物的封じ込めシステムを持つ必要性が痛切に感じられる。

生物的封じ込めの最初のシステムは、「安全」なりローニングベクターおよび弱らせた宿主細菌の使用に基づくものであった。たとえば、伝達機能を欠くか、または非常に狭い宿主範囲を天然にもつベクターの使用が示唆されてきた。弱らせた宿主細菌の例は、ＯＥＭの本来の環境の外側には存在しないか、または低濃度で存在する外米性の栄養素に対する絶対要求性を有する大腸菌変異体である。

他の提案されている生物的封じ込めシステムは、それによってベクターがＯＥＭに制限される機構に基づいており、たとえば、ある遺伝子の発現がプラスミドの複製に不可欠であるような遺伝子中にナンセンス突然変異のあるプラスミドベクターを使用するか、または染色体におけるサプレッサー突然変異を使用し、前記突然変異が遺伝子のメツセージの翻訳の読み通しを阻止するようにする。更なるアプローチは、ＯＥＭの染色体中にｒＤＮＡを組込むことにより、ｒＤＮＡを宿主内で安定に維持することである。

最近もう一つの生物的封じ込め戦術が開発されており、それによれば組換えベクターには細胞を殺す機能をコードしている遺伝子にして、ＧＥＭ本来の環境の外の広く一般的な条件のようなある環境条件下か、またはベクターが故意にではなく第二の宿主に伝達されるか、またはその発現が推計学的に誘導される場合にのみ発現されるプロモーターの支配下にある遺伝子が与えられている。かかる細胞致死機能のＧＥＭへの取り込みを使用し、適切な調節配列を選択することにより、本来の宿主細胞および（または）本来の物理環境に含まれるベクターを構築することができる。この文章において定義したような細胞致死機能もまた活発な生物的封じ込め因子と呼ぶことができる。

かかる生物的封じ込めシステムのために、もし推計学的に誘導される発現調節の機構が選ばれたなら、このシステムを含んでいるＯＥＭの集団は、外部環境への放出に際し、あるいは生きたワクチンとして用いられた場合に、ランダムな細胞致死作用を受け、それにより宿主細胞集団の倍加時間が増加するか、または最終的に生物が消滅する結果となる。

上記の、細胞を殺す機能をコードしている遺伝子は、しばしば「自殺遺伝子」とも呼ばれ、かかる遺伝子、すなわちその発現が前文に定義したように調節されている遺伝子の使用に基づいている生物的封じ込めシステムを、一般に条件致死システム、または「自殺」システムと称する。現在まで、細菌の染色体および原核生物のプラスミドにおいて種々の細胞致死機能が発見されてきた。細胞致死機能を有する染色体遺伝子の例は、大腸菌に−１２の遺伝子のｇｅｆ（Ｐｏｕｌｓｅｎら、１９９０）およびｒｅｌＦ　（Ｂｅｃｈら、１９８５．　ＢＩＩｂｏ、　ｖｏｌ、４　ｎｏ、４．１０５９−１０６６）である。自殺遺伝子をコードしているプラスミドの例は、各々プラスミドＲ１およびＦから単離したｈｏｋおよびｆｉｍ＾（Ｇｅｒｄｅｓら、１９８６）遺伝子、やはりプラスミドＦから単離した５ｎｒＢ遺伝子（Ａｋｉｍｏｔ。

ら、１９８６）　、およびプラスミドＲ１６およびＲ４８３から単離したｐｎｄ遺伝子（Ｓａｋｉｋａｗａら、１９８９、およびＯｎｏら、１９８７）である。

これらの遺伝子の共通した特徴は、それらが構成要素として翻訳され、翻訳後の段階で調節されており、それらがすべて約５０個のアミノ酸から成る小さな毒性タンパク質をコードしていることである。生物的封じ込めシステムにおけるｈｏｋ遺伝子の適用はＷＯ３７１０５９３２に開示されている。

理想的には、効果的な生物的封じ込めシステムの特徴は、最小限の必要性として、細胞を殺す機能が発現された時その機能が効果的であること、この封じ込めシステムが広範囲のＧＥＭ種において機能すること、たとえば自殺遺伝子またはその遺伝子の発現を調節している配列における突然変異により、細胞致死機能の排除の危険性が最小であること、および細胞が殺される時放出されるｒＤＮＡの、他の生物による取り込みの危険性が減じられていること、を含むべきである。

前述の周知のいかなる封じ込めシステムもこれらの理想的な必要性のすべてを満たさない。しかしながら本発明は、新規な有効な生物的封じ込めシステム、すなわち元来の細胞を殺す機能に基づくものではなく、遺伝子が挿入される細胞内でのその遺伝子の発現の結果、細胞質において加水分解活性があり、細胞膜の向こう側に輸送されない成熟型の細胞外酵素が形成される遺伝子を利用するシステムを供する。かかる酵素が発現されると、細胞の正常な機能は、かかる細胞集団の競争力およびそれに由来する生存力が有意に減少する程度に制限されるようになる。

供せられた加水分解活性のある酵素は、ＲＮＡ分解および（または）ＤＮＡ分解酵素であり、かかる酵素に基づく生物封じ込めシステムは、遺伝子操作により生じた宿主細胞のｒＤＮＡ分子が、遺伝子操作をした宿主微生物と同時に破壊される点において、周知の生物的封じ込めシステムを越える更なる利点を有するであろう。

発明の要約多くの細胞は、生来細胞外に移動する、すなわち細胞膜の向こう側へ排出される、加水分解活性のある酵素を産生ずる。かかる酵素を天然に産生じている細胞では、酵素が細胞内で発現される場合、酵素的には不活性な、未成熟な細胞外酵素分子（酵素前駆体）の形をとっており、それにより酵素前駆体が細胞膜の向こう側に輸送されるシグナルペプチドを含んでいる。細胞膜の通過に際し、シグナルペプチドは分子から切り離され、それにより分子は成熟型の酵素的に活性のある形に変わる。

本発明は、正常には、産生細胞の細胞質に存在している間は未成熟で酵素的に不活性な酵素前駆体の形である細胞外酵素を、ある細胞において、細胞質の中で酵素活性をもつ成熟した酵素の形で発現させることができ、かつ、かかる活性型の細胞外酵素の細胞質中での存在が、正常な細胞機能の制限に導く細胞損傷を引き起こすことができるという発見に基づくものである。

これらの発見に基づき、本発明は、ＧＥＭの環境における生存の制限を目的とする、ＯＥＭの生物的封じ込めへの新規なアプローチを供する。

従って第一の面においては、本発明は、ある遺伝子を含んでいる細胞にして、その遺伝子の発現の結果、前記細胞の細胞質に存在し、かつ加水分解活性のある酵素が形成される細胞であり、さらにその遺伝子の発現を調節する調節ヌクレオチド配列を含んでいる細胞であり、その発現が、細胞の非制限機能に必要な、加水分解可能な細胞質物質を加水分解する結果となる速度で、細胞の機能を制限する程度に、細胞における酵素の形成を導く調節ヌクレオチド配列である細胞を供する。

さらなる面において、調節発現の可能な遺伝子を含んでいる組換えレプリコンにして、細胞の細胞質に存在し加水分解活性のある酵素をコードしている細胞において発現されると、前記遺伝子の発現が、細胞の非制限機能に必要な、加水分解可能な細胞質物質を加水分解する結果となる速度で、細胞の機能を制限する程度に、細胞における酵素の形成を導き、前記遺伝子の発現が、組換えレプリコンまたはこのレプリコンを含んでいる細胞に存在している他の組換えレプリコンに含まれている、調節ヌクレオチド配列によって調節されているレプリコンが供せられる。

更なる面において、本発明は前文に定義したような様々な細胞から成る細胞集団に関している。

更に、本発明は細胞集団の生存を最初の環境または２番目の環境に制限する方法にして、前記細胞集団を、その細胞集団の中で複製し、かつその遺伝子の発現が前記細胞の細胞質に存在し加水分解活性のある酵素の形成を引き起こす遺伝子を含んでいる組換えレプリコンを用いて形質転換することを含んでおり、細胞は更に、環境因子によって調節され得るかつ前記遺伝子の発現を調節する調節ヌクレオチド配列を含んでおり、前記遺伝子の発現が、細胞の非制限機能に必要な、加水分解可能な細胞質物質を加水分解する結果となる速度で、細胞の機能を制限して細胞集団の生存の制限に導く程度に、細胞内における酵素の形成を導く方法に関する。

もう一つの面において本発明は、染色体外の組換えレプリコンを、前記レプリコンが２番目の種類の細胞に天然に伝達することのできる最初の種類の細胞へ入れる方法にして、染色体外の組換えレプリフン上に、その発現が細胞の細胞質に存在し加水分解活性のある酵素の形成を引き起こす遺伝子を与えることを含み、前記酵素の形成が、細胞の非制限機能に必要な、加水分解可能な細胞質物質を加水分解する結果となる速度で、細胞の機能を制限する程度になされ、染色体レプリコンを持つかまたは持つように修飾された前記の最初の種類の細胞は、前記遺伝子の発現を阻害する調節ヌクレオチド配列を含んでおり、それによって最初の種類の細胞を保護し、前記調節遺伝子は前記の２番目の種類の細胞にはないため、それによってもし二番目の種類の細胞が前記の染色体外組換えレプリコンを受け取ると、前記遺伝子は発現し、機能制限効果がもたらされる方法に関する。

もう一つの更なる面において本発明は、細胞集団の生存を推計学的に制限する方法にして、調節発現の可能な遺伝子を含んでいる組換えレプリコンを用いた細胞の形質転換を含み、その遺伝子が、細胞の細胞質に存在し加水分解活性のある酵素をコードしている細胞において発現される時、その遺伝子の発現が、細胞の非制限機能に必要な加水分解可能な細胞質物質を加水分解する結果となる速度で、細胞の機能を制限する程度に、細胞における酵素の形成を導き、前記遺伝子または複数の遺伝子の発現が、それが細胞に存在している間はこの酵素をコードしている遺伝子の発現を阻害する、切出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列の、組換え切出しの結果として推計学的に誘導され、前記の負に機能している調節ヌクレオチド配列が、組換えレプリコンか、またはレプリコンを含んでいる集団の細胞に存在する他の組換えレプリコンに含まれている方法に関する。

また更なる面においては、前文に定義したような、機能を制限された生存可能な細胞集団を含む免疫活性のある組成物にして、この細胞は加水分解活性をコードしている遺伝子または調節ヌクレオチド配列には天然には無関係な更なるＤＮＡ配列を含んでおり、更なる配列は免疫活性のある遺伝子産物をコードしている配列であり、この組成物がヒトまたは動物に投与される時、効果的な免疫反応を前記ヒトまたは動物において得るために十分な期間および量において、免疫活性のある遺伝子産物を細胞に発現させるが、しかし、ヒトおよび動物の中では細胞は生き残ることができない、という程度に細胞の機能が制限されている組成物が供せられる。

本発明はまた、この文章の中で定義したような生存可能な細胞集団を含む農薬として活性のある組成物にして、この細胞は加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子または調節ヌクレオチド配列とは天然には無関係な更なるＤＮＡ配列を含み、更なる配列は農薬活性のある遺伝子産物をコードしている配列であり、この組成物を害虫を含んでいる環境に施すと、前記環境において効果的な農薬効果を得るために十分な期間および量において、農薬活性のある遺伝子産物を細胞に発現させるが、しかし環境において細胞は生き残ることができない、という程度に細胞の機能が制限されている組成物を供する。

最後に、この文章において定義したような生存可能な細胞集団を含む、環境汚染物質を分解する組成物にして、この細胞は加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子または調節ヌクレオチド配列とは天然には無関係な更なるＤＮＡ配列を含み、更なる配列は環境汚染物質を分解する遺伝子産物をコードしており、この組成物を分解されるべき汚染物を含んでいる環境に施すと、前記環境において効果的な汚染物質分解効果を得るために十分な期間および量において、汚染物質を分解する遺伝子産物を細胞に発現させるが、しかし環境において細胞は生き残ることができないという程度に細胞の機能が制限されている組成物が供せられる。

発明の詳細な開示細胞機能を制限する効果を有する、細胞内で加水分解活性のある細胞外酵素の使用に基づく生物的封じ込めシステムの概念細胞膜を通過することのできない脂質、リン脂質、ＤＮＡ、　ＲＮＡ、および多糖類のような多くの高分子でも、細胞の成長のための基質として利用することができる。これらの基質は細胞により排出されたタンパク質酵素によって、細胞の外側の培地中において酵素的に加水分解（分解）される。細胞外の分解を仲介するかかる加水分解酵素を「細胞外酵素」と呼ぶ。外側の細胞膜を通過することができ、従って外側の培地中に排出される真の細胞外酵素に加えて、ある種の細胞は、あるものは細胞膜の中に入り、通り抜けるよりもむしろそこにとどまるという不完全に排出される加水分解酵素を産生ずる。

他の酵素は細胞膜を通過するが、外膜を通過することができず（ペリプラズム酵素）、さらに別のものは外膜の中にとどまっている。

このような情況においては、「細胞外酵素」という用語は、天然にその酵素を産生じている細胞か、またはかかる排出可能な酵素をコードしている遺伝子が挿入されている細胞により、細胞膜（細胞質膜）を通り抜けることによって、天然に排出された加水分解酵素を呼ぶために用いられており、従ってこの用語は、天然の真の細胞外酵素、細胞膜結合酵素、ペリプラズムに局在する酵素、および外膜結合酵素を含む。

一般的には、この文章の中に定義したような排出可能な細胞外酵素が排出されるメカニズムは共通した特徴をもつ。たとえば、これらのタンパク質が細胞質で最初に合成される時には、酵素活性のない前駆体分子の形（プロ酵素とも呼ばれる）であり、正しい場所に位置した後にシグナルペプチドと呼ばれるタンパク質のアミノ末端の部が除去されるため、それらの前駆体分子は細胞外の正しい場所に入った後のものより分子が大きい。シグナルペプチドの機能は、細胞外酵素タンパク質の位置する場所への移動を助けることである。

分子が正しい位置につくとシグナルペプチドは除去され、それによってタンパク質は成熟した、または「プロセスされた」酵素活性のある加水分解酵素に変る。

しかしながら、この文の中で定義したような、セラチア属の種のホスホリパーゼを含めたある種の加水分解活性のある細胞外酵素は、天然にこの酵素を産生じている細胞において発現される際シグナルペプチドが与えられない。ホスホリパーゼをコードしているｐｈｌＡ遺伝子に加えて、ホスホリパーゼを天然に発現しているセラチア属の細胞は、ホスホリパーゼタンパク質との相互作用により、細胞の中で発現されるホスホリパーゼからの損害に対して細胞を耐性にする、細胞内で活性をもつタンパク質をコードしているｐｈｌＢ遺伝子を含む。

前文に説明したように、本発明は有効な生物的封じ込めの概念に対する新規なアプローチを供しており、それは細胞の細胞質中に（すなわち細胞内に）酵素活性のある成熟型の細胞外酵素の存在を得ることができるという発見に基づいている。このことは、細胞外酵素分子をコードしているが、しかしそれに対応するシグナルペプチドをコードする配列を含まないヌクレオチド配列を、細胞内に挿入することにより得られる。シグナルペプチドをコードしている配列のヌクレオチド配列からの欠失によっても、細胞内で活性のある酵素分子を細胞膜の外側に移動できないようにすることができる。

前文の説明によれば、細胞内で活性のある細胞外酵素を得るための変法は、前記酵素の細胞内での活性に対して細胞を耐性にすることのできる遺伝子産物をコードしている遺伝子の存在なしに、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子を、本発明による細胞に与えることである。

細胞の細胞質は高分子の混合物を含んでおり、それらの高分子の存在および機能が、成長および複製のような基本的な生命の現われを含む細胞の非制限機能に必要である。これらの高分子の例は、ＤＮＡ、　ＲＮＡ、脂質、リン脂質、タンパク質、および炭水化物重合体を含む。

ある遺伝子の発現の結果、前文に定義したような細胞外酵素が形成される遺伝子を、本発明に従って細胞に挿入すると、天然に生じる細胞内高分子は、細胞内で活性のある加水分解酵素の基質として作用することができる。

もし細胞質の加水分解可能な高分子を加水分解する速度で、細胞の生命機能を制限する程度に、加水分解活性のある酵素が細胞内で発現されるとすれば、かかる細胞の、同じタイプであるがこの文の中に定義したような細胞外酵素が細胞内で活性のある形で発現されない細胞との競争力は減少するであろう。

このような情況においては、「非制限の細胞機能」という用語は、理想的には新しい細胞物質の合成と細胞の複製速度とによって表示されるような細胞の成長が、天然にはその細胞内に生じない細胞内加水分解による高分子の分解によって減少させられないことを意味する。従ってこの文章の中では、この用語は理想的には、前文に定義したような細胞内で活性をもつ細胞外酵素が発現されていない細胞の、ある一定の条件の下での成長速度および複製速度を記述するために用いられる。それ故この文章の中で使われている「制限された細胞機能」という用語は、細胞が前文に定義したような非制限細胞機能を有する同種類の細胞と同一の条件下で成長する時に、細胞内で活性のある細胞外酵素の発現の結果である細胞の状態を、理想的には減少した成長速度および減少した複製速度という言葉で相対的に述べるものである。

かかる制限された細胞機能の認知可能な表示は、最終的には細胞の死によって可能となるが、非制限細胞機能を有する細胞との比較において、遅滞期および（または）細胞の倍加時間の増加の結果としての、一定時間内の細胞数の増加の減少という結果に終わる、複製速度の減少として現われる細胞の成長の減少によっても可能である。他の表示は、一つあるいはそれ以上の栄養成分要求性の相対的な増加、または最適温度より低い温度や、毒物により引き起こされる細胞の損傷のような有害な環境因子に対する相対的に高い感受性によっても可能である。

かかる制限された細胞機能の表示（または複数の表示）の実際のタイプおよびその度合は、細胞において発現される細胞外酵素の特定の種類、細胞外酵素の発現速度、細胞質における一般的な条件の下で酵素が加水分解活性をもつ可能性、高分子基質の量およびかかる基質の非制限の細胞機能に対する重要性、および細胞内で活性をもつ細胞外酵素をコードしている遺伝子のコピー数に特に依存するであろう。

細胞機能を制限する効果を有する、細胞内で加水分解活性のある細胞外酵素本発明によれば、細胞内で活性のある適切な酵素とは、それが発現される時、原核細胞および真核細胞の細胞質に存在する高分子を、細胞の機能が制限される程度に、加水分解によって分解することのできるいかなる細胞外酵素でもよい。本発明において使用することができる興味深い加水分解酵素は、ヌクレアーゼ、ホスホリパーゼ、リパーゼ、リゾチーム、プロテアーゼ、およびカルボヒドラーゼを含む。

この文章の中で用いたように、「ヌクレアーゼ」という用語は核酸を分解することのできる細胞外加水分解酵素を意味する。核酸であるＤＮＡおよびＲＮＡは、ホスホジエステル結合によりヌクレオチドが連結することによって形成されるポリヌクレオチドである。あるヌクレアーゼはＤＮＡとＲＮＡの両方を分解することができるが、他のヌクレアーゼ（デオキシリボヌクレアーゼまたはＤＮアーゼ）はＤＮＡのみを分解し、さらに他のヌクレアーゼ（リボヌクレアーゼまたはＲＮアーゼ）はＲＮＡのみを分解する。ヌクレアーゼは、オリゴヌクレオチドの２つの末端のいずれかの最後のヌクレオチド残基を切断するホスホジエステル結合を加水分解するエキソヌクレアーゼか、またはポリヌクレオチドの内部に存在するホスホジエステル結合を切断するエンドヌクレアーゼのいずれでもよい。

本技術においては、「ニック」という用語は通常、エンドヌクレアーゼによるホスホジエステル結合の切断からの結果であるＤＮＡの一本鎖における欠失を記述するために使われる。「エキソヌクレアーゼ」という用語は、この特別な情況において用いる際には前文に定義したような活性様式を表しており、ここでは、通常細胞の外側に排出されるヌクレアーゼを呼ぶために使っているのではないことに注目しなければならない。

本発明の情況においては、有用なヌクレアーゼはＤＮＡのホスホジエステル結合を加水分解する能力を有するヌクレアーゼを含む。特にＤＮＡを分解する有用なヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼを含み、その活性は、二本鎖ＤＮＡを基質とする場合には、ＤＮＡ鎖の一方だけにホスホジエステル結合の切断にツク）を生じる。従って本発明の一つの態様においては、加水分解酵素はかかる能力を有するエンドヌクレアーゼである。

ＤＮＡにおける欠失は、すべての細胞において比較的高い頻度で自然に起こるものである。しかしながら、正常細胞においてはかかる欠失は、傷ついたＤＮＡ鎖の変化した部位が一連の酵素により認識され除去され、次いでＤＮＡポリメラーゼによりもとの形に置き換えられ、さらに最終的にＤＮＡリガーゼと呼ばれる酵素により、ＤＮＡらせんに残っていたニック（壊れたホスホジエステル結合）が閉じられ元のままのＤＮＡの復元が完了することに関与する、生来備わっているＤＮＡ修復機構により効果的に除去される。

この天然のＤＮＡ修復機構は、この文章において定義したようなヌクレアーゼの細胞内における酵素活性からの結果と考えられるＤＮＡの欠失にツク）も除去するであろう。従って、前文に定義したような細胞内で活性のあるヌクレアーゼが発現されている種類の機能は、細胞の核酸におけるニックの存在が、数においてＤＮＡ修復機構により修復され得る数を上回る場合にのみ制限され、ＤＮＡ欠失にツク）の数はあるレベルに達し、それによって細胞の機能は認知できるほどに制限されるようになる。

この文章において定義した細胞内で活性のある、ヌクレアーゼを含めた細胞外酵素の発現の速度はまた、その細胞の細胞質中における一般的な条件下での酵素の比活性により測定される。これらの条件は、正常にこの酵素を産生じている細胞の中にある場合、酵素が場所を移される細胞外の環境に一般的な条件とは異なってもよいと理解されるであろう。１つの例として、システィンおよびメチオニンのような含硫アミノ酸残基を含んでいる酵素は、酸化により損傷しやすいため、Ｒｈ値の高い細胞の細胞質中に存在している場合、少なくとも部分的に酵素的に不活性になると推定することができる。

しかしながら驚いたことに、本発明に散った研究の過程において、いくつかのシスティン残基を含んでいるエンドヌクレアーゼのような含硫アミノ酸を含んでいる酵素が、その酵素を発現する細胞の機能が制限される程度に、細胞内で酵素活性をもつことができることが発明された。従って本発明の一つの態様においては、加水分解活性のある酵素は、少なくとも一つの含硫アミノ酸残基を含んでいる、ヌクレアーゼのような酵素である。

グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌を含めたいくつかの原核細胞は、細胞膜の向こうへ場所を移される細胞外酵素を生来産生じており、それらの酵素の興味深い例は、セラチア属の一種によって産生されるエンドヌクレアーゼである。かかるエンドヌクレアーゼは、細胞外において高い比活性を有することが知られている。ＷＯ３６１０６７４３においては、セラチア属の一種のかかる細胞外ヌクレアーゼが大腸菌で発現されることが開示されており、それらが生物材料からの核酸の除去に有用であることが述べられている。セラチア属の一種のヌクレアーゼの一例は、Ｎ末端のシグナルペプチドをコードしている配列を除外すると、以下のＤＮＡ配列によりコードされる酵素である。

πＩぞπ工１シ１４　屯かかるセラチア属の一種のヌクレアーゼは、本発明に従って成熟した酵素の形、すなわちシグナルペプチドを欠いた形で細胞内番二発現されると、酵素が発現される細胞の機能を制限すること力（できる程度に酵素活性をもつことが、現在発見されている。従って、本発明の有用な態様においては、その遺伝子の発現の結果、細胞内で加水分解活性をもつ酵素が形成される遺伝子は、生来のシグナルペプチドのないセラチア属の一種のヌクレアーゼをコードして０る遺伝子である。

更に適したヌクレアーゼは、エロモナス属またはエルシニア属の種を含めた他のグラム陰性細菌から単離された遺伝子にコードされているヌクレアーゼであることが可能である。

本発明の他の態様においては、加水分解活性のある酵素は、スタフィロコッカス属の一種のようなグラム陽性細菌から単離された遺伝子にコードされているヌクレアーゼであり、その適切な一例は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）のＦｏｇｇ　ｉ株の成熟型エキソヌクレアーゼである。

この酵素をコードしている遺伝子はクローン化され、特徴がわかっている（ＳｈｏｒＬｌｃ、　１９８３．　Ｇｅｎｅ、　２２．１８１−１８９）。この酵素は、Ｃａ２＋により活性化される、１６．８ｋＤの熱安定性のある細胞外ホスホジェステラーゼであり、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を分解する。この酵素は１４９個のアミノ酸から成り、ジスルフィド結合およびスルフヒドリル基をもたない。

このヌクレアーゼをコードしている遺伝子は、この遺伝子を含んでいるプラスミドｐＦＯＧ４０８から引き出すことができる。

本発明に一致して細胞機能を制限する酵素として有用となり得る他の興味深い加水分解活性をもつ酵素は、たとえばセラチア属の一種から単離された遺伝子によってコードされているホスホリパーゼのようなホスホリパーゼである。その特別な一例として、ＷＯ３６１０６７４３）に開示されているホスホリパーゼを挙げることができ、それは以下のヌクレオチド配列によってコードされている。

Ａπ−π＝＝＝コａ；μユムひπ江ひにα＝＝＝ン買σα＝ひＯロα〃フ巾コひ π＝ひ匡パひαム匡にπロσπ＝ゴーα：　ｌ　、　ＡＡα工＝スππ＝１−胃ルα口＾　。

加水分解活性のある細胞外酵素を含んでいる細胞前文に記したように、本発明は、−面においてこの文章の中で定義した加水分解活性のある細胞外酵素をコードしている遺伝子を含んでいる細胞に関する。細胞は、いろいろな種類の細胞から、封じ込めに対する必要性の存在に関して選択することができる。従って含まれる細胞は、細菌細胞、原生動物細胞、酵母または藻類の細胞、または植物、動物、および藻類のような多細胞生物の組織に由来する細胞でよい。

加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子は、今定義したような、加水分解酵素を産生ずるいかなる生物にも含まれているいろいろな種類のレプリコンに由来することができる。従って、遺伝子の源は細菌染色体、細菌プラスミド、原核生物ウィルス、真核生物ウィルス、真核細胞プラスミド、または真核細胞染色体を含む。

遺伝子は標準的な方法により、合成により構築することもできる。

本発明によれば、この文章の中で定義されるような細胞は、それ自体が周知である方法によって得ることができる。これらの方法は、適切な細胞外加水分解酵素を発現している細胞のスクリーニング、その酵素をコードしている遺伝子の、かかる細胞からの単離、その遺伝子からのシグナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列の除去および、その遺伝子およびその発現を調節することのできるヌクレオチド配列の、含まれるべき細胞への挿入、その遺伝子の発現を可能にする条件下での細胞の成長、および細胞内における酵素活性のある形での酵素の存在の検査の各段階を含む。

加水分解活性のある細胞外酵素をコードしている遺伝子の挿入は、細胞の染色体でもよいし、あるいは細胞の中で複製することのできる組換えプラスミドのような、染色体外組換えレプリコンに遺伝子を挿入してもよい。

加水分解活性のある細胞外酵素の発現を調節する調節ヌクレオチド配列前文に記したように、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子の発現は、調節ヌクレオチド配列によって調節されている。

このような情況においては、「調節ヌクレオチド配列」という用語は、転写の段階または翻訳の段階において、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子の発現を、直接あるいは間接的に調節するヌクレオチド配列を表すものとされている。調節ヌクレオチド配列は、その機能の結果調節可能なプロモーターの活性が抑制または阻害されるものであればよい。かかる調節ヌクレオチド配列は、この文章の中では、「負に機能する調節ヌクレオチド配列」と呼ぶ。

かかる負に機能する調節ヌクレオチド配列の興味深い一例は、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子の発現を抑制する、リプレッサー物質をコードしている配列であり、リプレッサー物質は、それを含む細胞が、ヒトまたは動物の体、または外部環境に放出されると崩壊し、それにより酵素をコードしている遺伝子の発現の抑制が次第に減少し、リプレッサーの崩壊が完了すると、ついには抑制が解除される。

本発明の好ましい態様においては、調節ヌクレオチド配列は細胞内において、１つあるいはそれ以上のレプリコンに含まれることができ、さらに酵素をコードしている遺伝子を含んでいるものと同一のレプリコンに含まれることも、異なる組換えレプリコンに含まれることもできる。

細胞機能を制限する酵素の発現を、本発明に従って調節する１つの方法は、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子を、細胞に与えることにより転写の段階でその遺伝子を調節する方法である。転写段階における調節は、一つあるいはそれ以上の因子によって調節されるプロモーターによる調節を含めた種々の方法で行うことができる。これらの因子は、それらが存在することによって遺伝子の発現を確実にするものであるか、またはそのかわりに遺伝子の発現を抑制するものであって、それがなくなることにより酵素の発現が引き起こされるものでよい。

前文に定義したようなプロモーターの活性を調節する因子は、種々の因子から選択することができる。従って、細胞機能を制限する酵素をコードしている遺伝子の発現は、環境条件または細胞の生理的状態により、あるいは周期的または推計学的な事変によって決定することができる。現在の情況においては、「周期的な事変」という用語は温度条件、光の強さの変化、またはホルモン変化のような、遺伝子の発現に影響することにおいて潜在的に有用であることが知られているある種の因子に変化を引き起こす、周期的にくり返しておこる事変を意味するものと理解されている。「細胞の生理的状態」という用語は、細胞密度または細胞の増殖の相のような因子を意味する。

本発明によれば、プロモーターを調節する有利な因子は、環境におけるある種の化学物質の有無あるいは、効果のある温度または他の物理的要因（たとえば環境における光の強さ）のような、環境における物理的条件を含めた、容易に調節のできる因子である。従って、細胞を増やす発酵培地のような最初の環境に存在するある種の世代ごとの細胞あたりに、または単位時間あたりに、ある一定の頻化学物質が、細胞が放出される２番目の環境には存在しない時、あるいは細胞の成長または生存に必要な因子がもはや存在しない時、もしくはその因子が、細胞の環境から使い尽される時に期待した効果を表す、すなわち遺伝子が発現される、という因子である時に、細胞機能を制限する酵素をコードしている遺伝子が発現される、現在請求しているような封じ込めシステムを期待することができる。

細胞機能を限定する加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子の転写を調節しているプロモーターは、細胞の最初の環境には存在しないが、２番目の環境にはプロモーターを活性化させるに十分な量で存在しているある化学物質により、細胞の２番目の環境において活性化されることも可能である。同様にプロモーターは、たとえば発酵容器のような最初の環境における高い温度から、外部の２番目の環境における一般的な低い温度へのシフトのような、温度シフトによって活性化されるか、または光の強さによって、すなわちプロモーターが十分な強さの光の存在下に活性化されるが、発酵容器のような最初の環境における一般的な暗さにおいては不活性であるというように活性化されるプロモーターであってよい。

この文章において定義した細胞が、ある調節された方法で自然環境の中に、たとえば陸地の、ある限られた地域、あるいはヒトまたは動物の腸管に放出される細胞である場合には、調節可能なプロモーターは化学的に調節されるもの、すなわち前文に説明したように、細胞の環境におけるある化学物質の存在の有無によって調節されるものでよい。

しかしながら、調節可能なプロモーターは都合の良いことに、たとえば温度の変化によって、または最も都合の良いことには、推計学的事変によって、周期的に活性化されるプロモーターである。この文章の中で使われているような「推計学的事変」という用語は、代謝生成物、アミノ酸、ヌクレオシド、プリンまたはピリミジン塩度でランダムに起こる事変を表わそうとするものであり、本発明によれば、細胞機能を制限する、細胞内で活性のある細胞外酵素の発現の活性化が、任意に細胞の死に導く程度に起こる細胞において、細胞の機能を制限する結果に終わることができる。この推計学的事変は、プロモーターを運んでいる領域の周期的な逆位によって引き起こすことができるが、前文に定義したような、組換え切り出しの可能なネガティブに機能するヌクレオチド配列の組換え切り出しによって、さらに有利に誘導することができる。

本発明の一般的な適用性を確実にするためには、細胞機能を制限する酵素をコードしている遺伝子の、転写の開始に使用されるプロモーターが、好ましくは広範囲の細胞において前記遺伝子の発現を引き起こすことのできるプロモーターであることに注目しなければならない。

加水分解活性のある酵素の調節可能な発現の場合には、調節可能なヌクレオチド配列は、たとえばアミノ酸生合成に関する細菌オペロンから単離されるか、または増殖の定常期の後期に転写が活性化される細菌遺伝子から、あるいは繊毛のような細胞の表面構造の合成に関する細菌遺伝子から単離されるプロモーターであってよい。

適切なプロモーターの例は、トリブトファン不在下に活性化される大腸菌のｔｒｐ、温度感受性な調節ヌクレオチド配列により支配されているバクテリオファージλのＰ、およびＰＬプロモーター、胞子形成の間活性化される枯草菌遺伝子のプロモーター、および推計学的に活性化される大腸菌およびサルモネラ属の繊毛遺伝子のプロモーターである。

化学的に調節されるプロモーターの場合には、その存在の有無がプロモーターの活性化を決定する化学物質は、炭素または窒素源、示、のΦい＆；Ｌ麓ＪＭ１ａ／η）り急ヨ昏こ送供■るしとρ）でさる０１シ芋窃質が、それが存在すればプロモーター活性を抑制するものである場合には、細胞が自然環境に放出された時、プロモーターが活性化されない濃度では自然環境中にほとんど生じない物質であることが好ましい。たとえば大腸菌細胞における適切なプロモーターの一例は、ｔｒｐプロモーターであり、細胞の環境内にトリプトファンがあれば抑制され、環境内に十分量のトリプトファンがなければ抑制は解除される。　ｔｒｐプロモーターまたは他の、同じ方法で調節されているプロモーターを用いた封じ込めシステムは、従って、発酵容器のような最初の環境においてはプロモーターを抑制するための量のトリプトファンを含んでおり、それは最初の環境から２番目の環境、たとえば通常は非常に少量のトリプトファンを含んでいるか、またはトリプトファンを全く含まない自然環境に細胞が放出される時、抑制が解除される。

化学物質によって活性化が決定される、調節可能なプロモーターのもう一つの例は、たとえばイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘導されるｌａｃプロモーターである。

前文に述べたように、調節可能なプロモーターは、細胞機能を制限する酵素をコードしている遺伝子と、その遺伝子の発現を調節している調節可能なプロモーターとを含んでいる細胞の、環境において一般的な温度によってその活性が決定されるプロモーターであってもよい。かかる場合には、プロモーターの調節は、プロモーターのためのリプレッサーをコードしている温度感受性のある遺伝子が細胞に存在することにより有利に得られる。典型的な一例として、前文に記したものを含んでいるλプロモーターは、温度感受性のあるλｃｌリプレッサーにより調節することができる。

プロモーター領域の周期的な逆位によって推計学的に活性化されるプロモーター（このような情況においては、かかるプロモーターは、「逆位可能なプロモーター」および「逆位によるスイッチプロモーター」とも呼ばれる）であり、本発明の目的にとって有用であるプロモーターは、例としてｈｉｎ、　ｃｉｎ、およびｑ１ｎプロモーターを含む。特に有用な逆位プロモーターの一例は、大腸菌の繊毛のプロモーターであるｆ１ｍＡプロモーターである。このプロモーターの活性化（逆位によるスイッチ）は、本目的のためにｒｏｎＪおよびｒｏｆｆ」と名づけだ２つの遺伝子によって調節されており、Ｏｎ遺伝子産物はｏｆｆ（不活性）からｏｎ（活性）への切り換えを誘導し、ｏｆｆ遺伝子産物はｏｎからｏｆｆへの切り換えを誘導する。ｆｉ■Ａ遺伝子とそれに結合しているプロモーターが染色体上に１コピーとして存在している野生株の大腸菌細胞においては、逆位によるスイッチはおよそ、１世代あたり１０００細胞に１細胞の切り換え頻度で起こる。しかしながら、必要とされる逆位によるスイッチの頻度は、Ｏｎおよびｏｆｆ遺伝子の発現の量を調節することによって調節することができる。このことは、たとえばＯｎおよびｏｆｆ遺伝子を転写させるための適当なプロモーターによって成就される。これらのプロモーターによる転写の頻度は、形成されるｏｎおよびｏｆｆ遺伝子の産物の相対的な量を決定するであろう。

前文に説明したように、細胞機能を制限する酵素の細胞内における酵素活性は、前記酵素に対する耐性を細胞に与えるある遺伝子産物の、細胞内における有無により、たとえば酵素との相互作用により、その細胞機能を制限する効果が発現しないようにすることによっても調節することができる。

本発明によれば、細胞機能を制限する酵素をコードしている遺伝子の発現を推計学的に調節する特に有用な方法は、細胞にそれが存在している間はその遺伝子の発現が抑えられる、負に機能している切り出し可能な調節ヌクレオチド配列の、組換え切り出しの結果としての遺伝子発現の誘導である。このような情況においては、「組換え切り出し」という用語は、自然発生現象である遺伝的組換え（乗換え）の結果をさし、それによりレプリコンの中のヌクレオチド配列が、ＤＮＡに作用する酵素の連続的な作用により、ある調節された方法で、対合し、切断し、再結合して組換えレプリコンを形成する。細胞における組換えによる事変の頻度は、理想的には対合した相補的なヌクレオチド配列の間の相同性、および相補的な配列の長さに依存している。たとえば、細菌細胞で組換えを得るためには約５０塩基対の相同性が必要であることが示されてきた。

本発明によって細胞機能を制限する酵素をコードしている遺伝子を含んでいる、組換えのしやすい細胞において、負の調節ヌクレオチド配列が十分な長さの反復ヌクレオチド配列の間に直接挿入されると、反復配列の間の組換えの結果、負の調節ヌクレオチド配列の組換えによる切り出しを生じて遺伝子が発現されるようになり、それによって細胞機能を制限に導く量の、または任意に細胞の死をもたらす量の、細胞の機能を制限する酵素を産生ずることができる。

従って、この文章において用いられるような組換え切り出しの現象は、あるＤＮＡのサブ配列（すなわち負の調節ヌクレオチド配列）が、組換えの結果を通して、より長いＤＮＡ配列から切り出されることを意味する。本質において、長い方のＤＮＡ配列はサブ配列の両側で切断され、新しくできた末端はサブ配列をぬいて結合される。組換えは、十分に相同なフランキングなヌクレオチドサブ配列の間で起こる。たとえば、−殻構造がｗ−ｘ−ｙ−ｘ−ｚで、Ｘが反復配列でありＹが負の調節ヌクレオチド配列であるＤＮＡであれば、サブ配列Ｙを切り出し、再結合してＷ−Ｘ−Ｚを形成するであろう。

前文に述べたように、組換えの頻度は、反復の長さおよび（または）反復の間の距離を変えることにより、ある程度決定される。さらにその頻度は、相同性の異なる反復配列を用いることによって変えることができる。たとえば、反復ヌクレオチド配列が１００％相同で組換えを損わない大きさであれば、組み換え頻度が高い結果となり、従って負の調節配列は高い頻度で組換えにより切り出される結果となるのに対し、相補的な配列内のミス対合は、ミス対合の度合に依存して組換えの頻度を減少させるだろう。−例として、反復ヌクレオチド配列の間の１０％の相違が、組換えの頻度を４０％減少させることができることが発見されている。

従って、加水分解活性のある細胞外酵素をコードしている遺伝子を含んでいる細胞は、本発明によれば、最初のフランキングヌクレオチド配列と、実質的に最初のフランキング配列と相同な２番目のフランキングヌクレオチド配列とが両側に並んでいる、組換えによる切り出し可能な負に機能する調節ヌクレオチド配列である、調節ヌクレオチド配列を含んでいる細胞である。この文章の中で用いているように、「実質的に相同Ｊという用語は、相同性の度合いが、希望した組換え頻度という結果をもたらすに十分であることを意味するために用いる。ある態様においては、望ましい組換え頻度の最高値を得るためには、全くの反復（すなわち１００％相同な配列）を使用することが有利であり、それに対し、細胞機能の中程度の制限が望ましい態様においては、多少異質性があるが望ましい低い頻度の組み換えが起こることはまだ可能である反復の使用が適している。

従ってこのような情況においては、「十分に相同」という用語は、加水分解活性のある細胞外酵素をコードしている遺伝子と負の調節ヌクレオチド配列とを含んでいる細胞において、望ましい頻度の組換えによる事象を結果的に引き起こす、二つのフランキングヌクレオチド配列の間の相同性の度合いを表わすために適切に用いることができる。

すでに前文で述べたように、組換えの頻度はフランキング配列の長さに依存する。本発明の有用な態様においては、１ｏｏ〜５０００塩基対の範囲の長さをもつフランキング配列を使用する。ある好ましい態様においては、２００〜３００塩基対の範囲の長さをもつフランキング配列の使用が有利であると考えられる。フランキング配列としては、前文に定義したような十分な長さと相同性とをもついかなる反復配列も用いることができる。フランキング配列の有用な一例は、約９００塩基対の大きさを有し、プラスミドｐＢＲ３２５に生じる、前述したクロランフエニコル耐性遺伝子であろう（Ｂｏｌｉｖλｒ、　１９７８．　Ｇｅｎｅ。

４、１２１−１３６）。反復として挿入された結果組換えを起こすことのできる有用なヌクレオチドの他の例は、５９８塩基対というような、たとえば５００から約３０００塩基対の範囲の大きさを有する、プラスミドｐＫＫ３５３５から単離したｒｒｎＢ遺伝子のサブ配列である。

本発明の一つの興味深い態様においては、ある遺伝子の発現の結果加水分解活性のある酵素がその細胞内で形成される遺伝子を含んでいる細胞は、その中において前記遺伝子がメツセンジャーＲＮＡである第一のＲＮＡをコードしている遺伝子を含んでいる遺伝子であり、さらに、加水分解活性のある酵素をコードしている前記遺伝子に操作により連結された、切り出し可能な負の調節ヌクレオチド配列であり、前記の第一のメツセンジャーＲＮＡとＲＮＡ−ＲＮＡ二重鎖を形成し、その遺伝子が発現されると、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子の発現が阻害される、第二のＲＮＡをコードしている遺伝子を含んでいる細胞である。

本発明のもう一つの有用な態様においては、組換えによる切り出し可能な負の調節ヌクレオチド配列が、ある遺伝子の発現の結果加水分解活性のある酵素が細胞内で形成される遺伝子の、転写のポリペプチドリプレッサーをコードしている遺伝子である。かかるポリペプチドリプレッサーは、たとえばＩａｃリプレッサーである。有用なＩａｃリプレッサーの特別な例として、ｔ、ａｃｒｇ遺伝子にコードされているリプレッサーを挙げることができる。

本発明のさらに有用な態様においては、切り出し可能な負の調節ヌクレオチド配列は、その発現の結果加水分解活性のある酵素が細胞内で形成される遺伝子の転写を妨げる、転写終結配列である。本発明の特別の態様においては、かかる適切なターミネータ−配列は、プラスミドｐＨＢＡ１０２ｒｐｏｃｔから単離した、　ｒｐＯｃｔ’転写ターミネータ−であろう（ｓｑｕｉｒｅｓら、１９Ｂ！、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　９．６８２７−６８３９）。

本発明によれば適切とされる負の調節ヌクレオチド配列は、ウィルス由来、あるいは原核細胞または真核細胞由来のヌクレオチド配列から単離することができる。従って、このヌクレオチドの源は、細菌染色体、細菌プラスミド、原核細胞ウィルス、真核細胞ウィルス、真核細胞プラスミド、または真核細胞染色体を含む。

本発明の好ましい態様においては、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子と、いずれも前文に定義したような最初の、および２番目のフランキング配列とに、操作によって連結されている、切り出し可能な負の調節ヌクレオチド配列は、「カセット」の形で供せられ、この「カセット」という用語は、この文章の中では、少なくとも前述の配列を含み、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝を任意に含み、たとえば抗生物質に対する耐性をコードしている遺伝子のような、適当なマーカーを含んでいる更なるヌクレオチド配列を任意に含んでいる、容易に挿入可能なヌクレオチド配列を記述するために使われている。この情況においては、「挿入可能なＪという用語は、この文章の中で定義したようなカセットが、その両端に適当な制限部位を与えられ、同じ制限部位を有するレプリコンへの挿入が可能となっていることを意味する。従って、かかる好ましい制限部位は、挿入を望むレプリコンに頻繁に生じる部位を含むか、またはそのかわりに、かかるレプリコンに容易に与えられる制限部位を含む。

本発明によれば、前文に定義したカセットで、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子を含まず、負の調節ヌクレオチド配列に操作によって連結されているカセットは、前記遺伝子を含んでいるレプリコンとは異なるレプリコンに挿入することができると考えられる。任意で、前文に定義したようなカセットを、たとえばトランスポゾンのような最初のレプリコンに挿入し、続いてそのトランスポゾンを介して染色体に挿入し、この文章の中で定義したような細胞を得ることができる。

前文に説明したように、ｆｉｍＡプロモーターのような逆位を生じるプロモーター、またはそれと機能的に相同なプロモーターは、ｏｎ遺伝子およびｏＨ遺伝子の遺伝子産物によって調節される。このプロモーター調節機構が、前文に詳しく説明した方法により組換えによって切り出されるヌクレオチド配列としてこの文章において定義したような細胞に挿入することのできる負の調節ヌクレオチド配列として、ｏｆｆ遺伝子または機能的に相同な遺伝子を用いる可能性を与えることが理解されるであろう。従って、ある態様において、本発明は、遺伝子発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子が、調節ヌクレオチド配列の逆位を生じるプロモーターの組換え逆位の結果として推計学的に発現され、前記プロモーターが、操作によりその遺伝子に連結されている細胞が供せられる。

プラスミドにおいては、生来の機構が生じ、それによって複製の間のプラスミドの多量体変形が起きる。プラスミドＲＰ４の広い宿主範囲によって例証されるように、この変形システムは、（１）多量体変形酵素であるリシルベースをコードしている遺伝子、（２）部位特異的な、リシルベースに触媒される変形の部位を含むことができる。プラスミドＲＰ４においては、リシルベースをコードしている遺伝子はｐａｒＡであり、変形のための部位はｓｒｓと呼ばれる。もし２つのｓｒｓ部位が直線方向に位置していれば、これらの２つの部位の間に挿入されるヌクレオチド配列は、もしｐａｒＡ遺伝子が同じ宿主細胞に存在していれば、比較的高い頻度で欠失し、それにより部位特異的組換えシステムが供せられる。有用な態様においては、ｐａｒＡ遺伝子はトランスに局在するであろう。

かかる部位特異的組換えシステムは、前文に定義したような負の調節ヌクレオチドの組換えによる切り出しを得るために使用することができるため、かかる部位特異的組換えシステムが、この文章におＬｌて定義したような加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子のようなある遺伝子の発現を、推計学的に調節するための、有用な機構を供することが今明らかとなった。

従って、ある興味深い態様において本発明は、この文章の中で定義したような細胞において、負の調節ヌクレオチド配列が、部位特異的変形組換え酵素のための最初の部位と、部位特異的変形のための２番目の部位とが側面に並んでいる配列であって、２番目の部位も最初の部位と同じか、または機能的に相同な多量体を変形する酵素によって認識され、それによって調節遺伝子をその細胞において組換えにより切り出すことができる細胞を供する。ある特別な態様においては、多量体を変形する酵素をコードしている遺伝子は、部位特異的変形のための部位に関してトランスの位置にある。この情況において、適切な遺伝子の有用な例は、プラスミドＲＰ４から単離したｐａｒＡ遺伝子である。

前文に述べたように、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子は、本発明によれば、細菌のレプリコンを含む種々の源に由来することが可能である。本発明の一つの好ましい態様においては、その遺伝子は、セラチア属の一種、エロモナス属の一種、またはエルシニア属の一種のようなグラム陽性細菌に由来する遺伝子である。

特別な態様においては、セラチア属の種はセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）であり、加水分解活性のある酵素は、セラチア・マルセセンス遺伝子にコードされている、この文章の中で定義したような酵素である。特に好ましい態様においては、セラチア・マルセセンス遺伝子はエンドヌクレアーゼをコードしており、前文に定義したようなりＮＡ配列を有する遺伝子であるか、またはホスホリパーゼをコードしている前文に定義したようなりＮＡ配列を有する遺伝子である。

さらに有用な態様においては、本発明は、加水分解活性のある細胞外酵素をコードしている遺伝子を含んでいる前文に定義したような細胞にして、その遺伝子が、例としてシグナルペプチドのないヌクレアーゼをコードしている遺伝子を含めたグラム陽性細菌に由来し、黄色ブドウ球菌のようなスタフィロコッカス属の一種から単離され、たとえばプラスミドに運ばれる遺伝子である細胞を供する。

かかる遺伝子の一例は、プラスミドｐＦＯＧ４０８によって運ばれる遺伝ある態様においては、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子および（または）調節ヌクレオチド配列を、この（これらの）配列が最初に単離された形で挿入することによって得られるよりも高い酵素活性を得ることは好都合であろう。かかるより高い活性は、最初に単離された配列の挿入によって得られる量または比活性に比較して、発現される酵素の量の増加および（または）酵素の増加した比活性の結果であろう。

かかる酵素活性は、たとえば化学的突然変異誘発物質を用いた、あるいは部位特異的突然変異誘発による、または突然変異誘発活性のある放射線処理による、通常のｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏにおける突然変異誘発処理を、単離した配列に別々に、あるいは同時に施すことによって便利に得ることができる。

このように処理したヌクレオチド配列であって、細胞内の酵素活性の増加に帰着する突然変異または複数の突然変異が起きたヌクレオチド配列を含んでいる細胞は、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子の発現が可能な条件下で、細胞の培養物を成長させ、最初に単離した配列を含んでいる同じ条件下で成長させた細胞または細胞クローンに比較して、前文に定義したような細胞機能制限レベルの増加を示す細胞または細胞クローンを単離することにより選択することができる。

従って、一つの態様において本発明は、この文章に定義したような細胞にして、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子および、前記遺伝子を調節するヌクレオチドの少なくとも一つが、一つあるいはそれ以上の部位で突然変異し、それにより遺伝子にコードされている酵素の細胞機能制限効果が、細胞において発現されたとき、前記遺伝子および前記ヌクレオチド配列を突然変異していない形で含んでいる細胞において発現された酵素の細胞機能制限効果に比較して、同じかまたは増加している細胞を供する。

一つの興味深い態様においては、突然変異誘発処理によって酵素活性が増加した細胞は、たとえばセラチア属の一種に由来する遺伝子のような、エンドヌクレアーゼをコードしている遺伝子を含んでいる細胞である。

非酵素の、細胞機能を制限する機能をコードする、本発明による更なる調節発現可能な遺伝子を含んでいる細胞この文章の中で定義したような細胞における、細胞機能制限効果を増大させる方法としては、細胞機能を制限する非酵素の遺伝子産物をコードしている遺伝子である、更なる調節発現可能な遺伝子を、細胞に挿入することが有利である。従って、本発明は、一つの特別な態様において、前文に定義したような、更なる遺伝子を含んでいる細胞を供する。かかる更なる調節発現可能な遺伝子は、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子の調節配列と同じタイプの調節ヌクレオチド配列によって調節されるか、または別のタイプの調節ヌクレオチド配列によって調節される遺伝子で、前記の、別のタイプの調節遺伝子は任意に、細胞機能を制限する加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子の発現をも調節することができる。

更なる非酵素の調節発現可能な細胞機能制限遺伝子産物をコードしている、ある適切な遺伝子は、細胞を殺す機能を有する前述の遺伝子から都合よく選択することができる。ある好ましい態様においては、前記の更なる遺伝子はプラスミドＲ１のｐａｒＢ領域のｈｏｋ遺伝子、ｇｅｆ遺伝子、およびこれらの遺伝子のいずれかと機能的に同等であるＤＮＡ配列から選択する。

前文に定義したように、本発明による細胞は、免疫活性のある酵素、または農薬として活性があるかまたは汚染物質を分解する遺伝子をそれぞれコードしているＤＮＡ配列を更に含んでいる多数の細胞を含んでいる集団として生じる場合には、各々免疫活性のある組成物、あるいは農薬として活性があるかまたは汚染物質を分解する組成物において、それらの組成物が放出される特定の環境に含まれることによって有用となる細胞である。

従って、かかる特別の態様においては、細胞は、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子を運んでいるレプリコンおよび（または）調節ヌクレオチド配列を運んでいるレプリコンに天然には関係しないＤＮＡ配列を更に含んでおり、前記ＤＮＡ配列は免疫活性のある遺伝子産物をコードしている配列から、あるいは農薬としての活性がある遺伝子産物をコードしている配列および、汚染物質を分解する遺伝子産物をコードしている配列から選択することができる。

このような情況においては、［免疫活性のある遺伝子産物」という用語は、ヒトまたは動物の体に投与された時、そこにおいて抗体の産生を刺激することのできる病原性のある生物からのエピトープ（抗原決定基）を８己述するために使用する。本発明において定義したような、かかる遺伝子産物をコードしている一つあるいはそれ以上の遺伝子を含む細胞は、有用な生きたワクチンの調製に利用することができる。生きたワクチンによって与えられる免疫性のレベルはしばしば、殺した病原性生物またはその断片を含んでいるワクチンによって与えられるものよりも高いため、種々の病原体に対する免疫化においては、殺した病原体またはその断片に比較して、生きたワクチンの投与が有利であると考えられている。エピトープをもつ生きた生物体を含んでいるほとんどの周知のワチクンは、エピトープをコードしている非病原性生物の組換え体に基づくものであるか、または弱毒化した病原体に基づくものである。細胞は、特定の免疫活性のある遺伝子産物をそれぞれコードしている多数の遺伝子を、有利に含むことができる。

しかしながら、弱毒化と生存度と適切な免疫応答との的確な組合せを得ることはしばしば困難であるため、今に散るまで生きたワクチンの使用は制限されてきた。さらに、ワクチンとしての生きた組換え生物の使用の結果である、遺伝子を操作した微生物の生体および外部環境へのよく考慮した上での放出は、長期間の環境への影響の可能性、特に環境におけるＧＥＭの永久的な確立の危険性に関する社会的懸念のためどこの国でも許可されていない。

本発明は、エピトープを含んでいる生きた細胞に、前文に定義したような細胞機能を制限する加水分解活性のある酵素をコードしている調節発現可能な遺伝子を導入することにより、周知のＧＩ？Ｍｌこ基づく生きたワクチンの使用に伴うこれらの問題を避けるための有利な方法を供する。特に興味深い態様において本発明は、生きたワクチンのための有用な基盤として、その発現が推計学的に誘導される、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子を含む、前文に定義したような細胞を供する。

本発明の有用な態様においては、免疫活性のある遺伝子産物をコードしているＤＮＡ配列を含む細胞はさらに、細胞の外表面にエピトープが発現される際、エピトープを輸送する、すなわち細胞膜を横切って移動するための手段を含む。好ましくはかかる移動は、フィンブリリンタンパク質を含む繊毛、ビリ繊毛、べん毛、または例としてストレプトコツカス属の種に見られる０Ｍタンパク質を含めた他の表面タンパク質のような、細胞の外表面のポリペプチド構造をコードしているヌクレオチド配列に、エピトープをコードしている遺伝子を挿入することにより成就される。細胞内で発現され得る、かかるハイブリッドのヌクレオチド配列を細胞に与えることにより得られる遺伝子産物は、エピトープとそれに関係した細胞表面構造とを含んでいる融合タンパク質またはハイブリッドタンパク質であると考えられる。

融合タンパク質が発現される細胞で、それにより細胞が投与された体の粘膜細胞に接着することができる構造タンパク質に融合したエピトープを含んでいる細胞は、エピトープが粘膜と密に接触するようになり、それによって分泌抗体であるＩｇＡおよびＩｇＧ類の排出の形での防御免疫反応が効果的に刺激されるという点で特に有用であると考えられる。

さらに、エピトープを運んでいる細胞の接着は、希望する免疫反応を得るために十分な時間の間、ヒトまたは動物の体に細胞が保持されることを確実にするであろう。もし腸管のような特定の体の環境において、十分な数の細胞が、細胞表面に発現されるエピトープの性質および活性に依存して、１５〜３０日の範囲の期間存在するなら、十分な免疫化が典型的に得られると考えられる。

細胞機能を制限する加水分解酵素および調節ヌクレオチドをコードしている遺伝子についての前文の記述から理解されるように本発明は、免疫学的に有効でありかっ、ヒトおよび動物の微生物相または外部環境への組換え遺伝子の好ましくない拡散の危険なしに用いることの可能な組換え生物体に基づく生きたワクチンを供給する有用な方法を供することができる。

本発明によれば、生きたワクチンの調節に有用な細胞は、前文に述べた外部の表面構造を先天的に含んでいる細菌種から選択したものである。かかる種類は、例としてサルモネラ属および大腸菌の種のような腸内細菌科、ビブリオ科、およびシュードモナス科の種を含む。前文に定義したように生きたワクチンの基盤として、本発明において特に有用な、かかる種類の株が、非病原性の株または低い病原性の株であることは理解されるであろう。

前文に定義した細胞によって発現されたエピトープは、いかなる病原性生物またはそれに対する免疫性の獲得が望まれるいかなる作用物に由来するエピトープでもよい。かかる病原体はウィルス、細菌、および藻類、酵母、または原生動物のような真核生物を含む。

商業的に重要な態様においては、細胞は農薬として活性のある遺伝子産物をコードしているヌクレオチド配列を含むことができる。

このような情況においては、［農薬として活性のある遺伝子産物」という用語は、害虫、げっ歯頚や鳥のような害を与える物を含めた有害な小動物の存在を、減少または排除する必要がある環境に放出された細胞の中で発現された場合の産物を意味する。かかる有害な小動物は、出没している環境への毒性のある化学的農薬の施薬によって抑制することができるが、最近では、ウィルス、細菌、および藻類を含めた天然に生じた種々の農薬活性のある生物が、生物的有害生物を制御する生産品として使われるようになった。

農薬として活性のあるかかる生物の顕著な例は、昆虫、特に毛虫に対して毒性のあるクリスタラインタンパク質を産生ずるバシラス・スリンジエンシス種の同遺伝子型個体群または株、あるいは幼虫期または成虫期の昆虫に対して病原性のあるいくつかのウィルスを含む。しかしながらかかる生物の農薬効果はしばしば満足できないものであり、かつ農業、林業、および園芸には、農薬として活性のある改良された生物を供することが強く要求されている。この問題を解くための一つのアプローチは、改良された毒性効果または環境におけるより良い生存度を有する、遺伝子操作による生物を構築することである。

かかる改良された生物がもし開発されるなら、環境におけるそれらの使用は、かかる毒性または病原性のあるＧ［！Ｍの熟考した上での放出に関する潜在的危険性についての現在の社会的懸念の結果として、放出が、かかる生物が適用される環境におけるそれらの生物の好ましくない繁殖または延長された生存に導かない場合にのみ認可されるであろう。

本発明は明らかに、遺伝子操作による農薬活性のある生物の、環境における生存を制限する方法を供する。前文に説明したように、細胞機能を制限する加水分解活性のある酵素の発現速度は、推計学的に調節することができ、従って農薬活性のある細胞の生存率は、いかなる特殊な要求に対しても便利に適応される。また細胞機能制限効果は、本発明によれば、適当な細胞機能制限効果を有する加水分解活性のある酵素を選択することにより調節することができる。

もう一つの有用な態様において本発明は、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子と天然には関係していないＤＮＡ配列が汚染物質を分解する遺伝子産物をコードしている配列である細胞を供する。土壌および水を含めた外部環境を汚染する種々の生体異物化合物が、これらの化合物を分解する生来の能力を有する微生物により分解されることは周知である。明らかに、遺伝子工学の技法は、増進した汚染物質分解能または広範囲の化合物、特に炭化水素を分解する能力を有する改良された生物を供給する方法を供する。

しかしながらこのような情況においては、前文に記したような社会的懸念が関連しており、従って本発明は汚染物質を分解する改良された細胞であって、その生存が前文に定義したような細胞機能を制限する加水分解活性のある酵素の発現の調節により制御することの可能な細胞を供給するための有用な方法を供する。特に好まれる態様においては、細胞は汚染物質を分解する遺伝子産物をコードしている遺伝子を含み、その発現は、細胞により分解される汚染物質の存在によって誘導される。

この文章の中で定義されるような細胞は形質転換細胞である。

本発明の更に特別の態様においては、本発明による前文に定義したような細胞は、その発現の結果細胞機能制限酵素が形成される遺伝子を含んでいるレプリコンまたは組換えレプリコンで形質転換される細胞であり、前記遺伝子の発現はその遺伝子を含んでいる組換えレプリコンまたは形質転換した細胞に存在する他の組換えレプリコンに含まれている調節ヌクレオチド配列によって調節される。

前文に記したように、本発明は更なる面において、前文に定義したような細胞内で活性のある加水分解酵素をコードしており、細胞内で発現されると細胞機能制限効果を細胞に及ぼす調節発現の可能な遺伝子を含んでいる組換えレプリコンであって、前記遺伝子が前文に定義したような調節ヌクレオチド配列により調節され、さらにそのヌクレオチド配列が発現可能な遺伝子に操作によって連結されている組換えレプリコンに関する。本発明によれば、調節ヌクレオチド配列は同じレプリコンに含まれる配列でもよいし、発現可能な遺伝子を含んでいる細胞に存在する他のレプリコンに含まれている配列でもよい。

本発明によればレプリコンはまた、そこで、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子および（または）前記遺伝子の発現を調節しているヌクレオチド配列が、かかる配列がレプリコンに存在する場合に一つあるいはそれ以上の部位で突然変異し、遺伝子にコードされている酵素の細胞機能制限効果が、レプリコンを含んでいる細胞において発現される際、この文章の中で定義したような突然変異していないレプリコンを含んでいる細胞において発現される酵素の細胞機能制限効果と比較して、同じかまたは大きいレプリコンであることもできる。

一つの態様においては、非酵素の細胞機能を制限する機能をコードしており、その発現が細胞機能を制限する加水分解酵素をコードしている遺伝子の発現を調節している配列と同じタイプの調節ヌクレオチド配列により調節されている、更なる調節発現可能な遺伝子を含むことができる。他の態様においては、非酵素の細胞機能を制限する機能の発現を調節しているヌクレオチド配列は、異なるタイプのものであるがしかし、細胞機能を制限する加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子の発現を調節することもできる。

前記の更なる調節発現可能な遺伝子は、有用な態様においては、プラスミドＲ１のｐａｒｅ領域からのｈｏｋ遺伝子か、またはｈｏｋ遺伝子あるいは大腸菌染色体のｇｅｆ遺伝子と機能上では相同であるＤＮＡ配列でよい。

他の有用な態様においては、レプリコンはさらに前文に定義したような、天然にはレプリコンに関係していない、免疫活性のある遺伝子産物、農薬活性のある遺伝子産物、および汚染物質を分解する遺伝子産物から選択した遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列を含むことができる。

細胞機能制限効果を有する細胞内で加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子を含んでいる細胞の集団前文に記したように、本発明は更なる面において、前文に定義してきた多数の細胞から成る細胞集団に関係する。好ましくは細胞集団は、この文章において定義したような、細胞内で複製することのできる組換えレプリコンで形質転換された細胞を含む。興味深い用途においては細胞集団は外部環境に放出されるため、細胞は有利な態様においてはグラム陰性細菌種のような、天然の生息場所が土壌、地上水、および植物から選択した生息場所である種から選ばれた細菌細胞である。

このような情況においては、今定義したような細胞集団であってそこにおいて細胞機能制限酵素をコードしている遺伝子の発現を、細胞に存在するがしかし細胞の生理的状態によって量が異なるリプレッサー物質によって調節することができる細胞集団が、ヒトまたは動物の体、あるいは外部環境にその集団を適用する場合に、リプレッサー物質の、それによってリプレッサー物質が機能しない形に変えられる程度の崩壊の結果として調節されることに注目することは興味深い。放出される集団の個々の細胞におけるリプレッサー物質の量がもし異なるとすれば、この崩壊は細胞集団の生存能力の損失が次第に増加していく結果となるであろう。

細胞集団の生存を制限する方法前文にも記したように、本発明は一つの面において、調節ヌクレオチド配列がこの文章の中で定義したような環境因子によって調節され得る最初の、または２番目の環境における、細胞集団の生存を制限する方法を供する。好ましい態様においては、その方法は前文に定義したような細胞集団に関する。

この方法の特別な態様においては、細胞集団の生存は、細胞機能を制限する加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子が発現される最初の環境において制限され、それにより細胞集団は最初の環境に含まれる。このような情況においては、最初の環境は典型的には発酵容器のような細胞の最初の増殖の場である。

この方法のもう一つの特別な態様においては、細胞集団の生存は２番目の環境において制限されており、それはたとえばある化学物質の枯渇またはかかる化学物質の添加によって、化学的に異なる２番目の環境へ最初の環境を変更したものであるか、または、たとえば温度の変化あるいは光の強さの変化によって起こすことのできる、物理的に異なる２番目の環境へ変更したものであってもよい。

前文に記したように、この文章の中で定義したような細胞集団は、そこにおいて、細胞機能制限酵素をコードしている遺伝子の発現を、前記細胞がヒトまたは動物の体あるいは外部環境に放出された時、非活性の形に変わる程度に崩壊または減少するリプレッサー物質によって調節することができ、前記リプレッサー物質が集団内の細胞に異なる量で存在するため、前記の崩壊の結果として、細胞集団の機能は次第に制限される細胞集団である。

従って本発明は一つの有用な態様において、細胞がヒトまたは動物の体あるいは外部環境に放出された時、非活性の機能のない形に変えられる程度に崩壊または減少するリプレッサー物質をコードしている調節ヌクレオチド配列に、操作によって連結されている、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子を細胞に与え、前記リプレッサー物質が集団内の細胞に異なる量で存在するため、前記の崩壊の結果として、細胞集団の機能を次第に制限することにより、細胞集団の生存を制限する方法を供する。

染色体外組換えレプリコンを含ませる方法前文に定義したように、本発明はある面において、レプリコンを二番目の種類の細胞へ天然に伝達することのできる最初の種類の細胞へ、染色体外の組換えレプリコンを含ませる方法に関しており、この方法において、レプリコンは好ましくはこの文章の中で定義したような組換えレプリコンである。一つの好ましい態様においては、このレプリコンは調節ヌクレオチド配列を含んでおらず、さらに都合の良いことには、かかるレプリコンは、含まれるべきレプリコンを含んでいる最初の種類の細胞において、核酸の中のホスホジエステル結合を加水分解することのできるエンドヌクレアーゼである、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子を含む。

細胞集団において細胞機能を推計学的に制限する方法特に興味深い面において、本発明は前文に記してきたように、前文に定義したような細胞集団である細胞集団の生存を推計学的に制限する方法に関し、前記の方法は、この文章の中で定義したような組換えレプリコンによる細胞の形質転換を含んでいる。一つの有用な態様においては、その方法は、細胞機能を制限する加水分解活性のある酵素の発現が、その組換えレプリコンまたは細胞に存在する他の組換えレプリコンに含まれている、負に機能している調節ヌクレオチド配列であって、細胞に存在する場合には前記遺伝子の発現を阻害する、切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列の、部位特異的な組換えによる切り出しの結果として誘導される。

本方法のもう一つの有用な態様においては、今定義した組換えレプリコンで形質転換した細胞の生存は、負に機能している調節配列の逆位可能なプロモーター配列の前述の組換え逆位の結果として制限されている。本発明によれば、負に機能している調節配列は組換えレプリコンに含まれているものであるか、またはその細胞に存在している別のレプリコンに存在するものでもよい。一つの適切な例については、プロモーター配列はｆｉｍＡプロモーターを運んでいる配列、またはそれと機能上相同であるものでよい。

免疫活性のある組成物前文に定義したような免疫活性のある組成物は、生存可能な、機能を制限された細胞集団に加えて、薬理学的に受け入れられる担体および付加物を含む。受は入れられるかかる担体は、たとえば塩類溶液のような、ワクチン産生において慣例的に用いられているいかなる賦形剤をも含む。このような情況においては、適切な付加物は例として不完全および完全フロインドアジュバント、および他の非特異的な免疫刺激物質を含めた免疫応答増進物質を含む。

この組成物は、任意に塩類溶液のような適当な水溶性の賦形剤と組合せて、凍結乾燥した組成物の形で供されることが好ましい。今定義したような免疫活性のある組成物は、各々が特異的なエピトープをコードしている異なるタイプの細胞を含むことができる。そのかわりとして、免疫活性のある組成物は、本発明によれば、各々の遺伝子が異なる遺伝子産物をコードしている、免疫活性のある遺伝子産物をコードしている多数の遺伝子を含んでいる細胞集団を含むこともできる。

この文章の中で供された免疫活性のある組成物は、ヒトおよび動物の両方の免疫化に有用なワクチンである。

好ましい態様においては、免疫活性のある組成物は、免疫活性のある遺伝子産物をコードしている配列を含んでいる細胞を含み、その配列は前記遺伝子産物と、その存在の結果融合タンパク質が細胞の外表面へ輸送されるタンパク質とを含んでいる融合タンパク質をコードしている。適切な例として、組成物は、そこにおいてポリペプチドが、フィンブリリンタンパク質、細菌ピリ繊毛、細菌べん毛、および細菌のＯＭ表面タンパク質から選択したポリペプチドから選択したものである。

かかるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列は、腸内細菌科、ビブリオ科、およびシュードモナス科から選択した細菌から都合よく単離することができる。

農薬活性のある組成物本発明によれば、この文章に定義したような農薬活性のある組成物は、特別な有用な態様において、昆虫またはその子孫にとって毒性である遺伝子産物をコードしている更なるＤＮＡ配列を含む。一つの興味深い態様においては、更なるＤＮＡ配列は殺虫タンパク質をコードしているバシルス・スリンジエンシス株に由来するものである。

前文に記してきたように、この文章において定義したような細胞は、前文に記した殺虫タンパク質を含めた農薬活性のある遺伝子産物の一種をコードすることができる。従って、この組成物は広い範囲の害虫および有害小動物の制御に有用であろう。農薬として活性のある組成物である細胞は、農薬活性を産生ずるまたは有する天然に発生した生物体から単離された、活性のある遺伝子産物をコードしている遺伝子を適当に含むことができる。

組成物である細胞によってコードされている農薬活性のある遺伝子産物は、害虫または有害小動物に対して毒性効果を有する遺伝子産物であるか、または組成物としての細胞において発現されている害虫の病原性ウィルスでもよい。本発明により、この組成物において使用することのできる細胞は、望ましい農薬活性のある遺伝子産物をコードしている遺伝子を発現することのできる細胞を含む。かかる細胞は、細菌と藻類の細胞、および細胞の培養物として任意に成長させた動植物の細胞を含む。

農薬活性のある組成物は、適当な担体を更に含むことができる。

このような情況においては、「適当な担体」という用語は、担体が、組成物における細胞の生存を制限しないバルク薬剤のような、害虫がまん延している環境における組成物の広がりを増す化合物を含み、さらに組成物の産生および保存の間の、さらに任意に環境への適用の後の細胞の生存度の維持を確実にすることのできる化合物を含んでいることを示すために用いる。−例として、担体は、多くの生物に対して有害である紫外線に対して防御する化合物を含むことができる。

環境汚染物質を分解する組成物この文章において定義したような環境汚染物質を分解する組成物は、好ましくは、そこにおいて細胞機能を制限する加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子が、汚染物質を分解する遺伝子産物によって分解され得る汚染物質が実質的に分解されて初めて発現される細胞を含む。例として、かかる組成物は、その中で加水分解活性のある酵素の発現が、分解可能な汚染物質の存在によって抑制される細胞を含む。

図の説明本発明は図を参照にして下文に更に説明される。

図１はｐＵＨＥ２４−２のＢａｍＨＩ部位と５ａｌＩ部位との間に挿入されたＥａｇ　１部位を含んでいるオリゴヌクレオチドリンカーを示しているプラスミドｐＭ５１０８８のセグメントを示す。

図２はプラスミドｐＭ３１０８８のマツプを示す。

図３はプラスミドｐＭｓ１０９３のマツプを示す。

図４はｐＭＳ１０９３−１を含んでいる大腸菌Ｓ１７．１における突然変異したヌクレアーゼ（＋＋＋ｕｔ　１　）の活性を示している。培養物１．５＋ｎｌを採り、全ＤＮＡを調製した。レーン１．ＩＰＴＧ添加前に採取した試料；レーン２〜４、ＩＰＴＧ添加後３０分、　１２０分、および２７０分の試料；レーン５〜６、ＩＰＴＧ添加後３０分および６０分の試料に、ＤＮＡの調製に先立ちｐＵｃ１８ＤＮＡ　ｏ、ｓμｇを加えたちの；レーン７、）ｌｉｎｄｎ［で消化したラムダＤＮＡ。

図５はｐＣＫ２８の図式的な説明を示しており、ｐＣＫ２８は、相同的組換えの結果としてＩａｃｌＱリプレッサーが削除されたｐＣＫ２４と共に細胞に存在すると、死滅機能（ｇｅｆ遺伝子産物）を発現する。

図６Ａは、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含んでいるＬＢプレート上で３７℃ で成長させた、定常期の大腸菌Ｃ３Ｈ３６にいずれも含まれる、ｐＣＫ２４およびｐＣＫ２５の組換え速度を示す。表示した時間に細胞を採り、Ｃ３Ｈ３ＢのｒｅｃＡ欠損突然変異体である大腸ＩＩ　ＣＫＩ！９５に再形質転換させた。再形質転換体からのプラスミドをＰｓｔＩで消化した。結果として得られたフラグメントをゲルにて分析し、結果として得られたバンドの相対的な濃度を、組換え欠失のあるプラスミドの百分率の尺度として計算した。

図６は増殖している大腸菌Ｃ３Ｈ３６における、プラスミドの組換えの速やかな進行を示す。プラスミドを持っている株を１日１回、アンピシリン１００μｇ／ｎｌを含んでいるＬＢ培地に、１：１００の接種材料比で再接種し、数日ごとにＤＮＡ調製のための試料を回収した。ＤＮＡをＰｓｔＩで制限し、ゲルにて分析し、相対濃度を組換え欠失のあるプラスミドの尺度として計算した。

図７はプラスミドｐＣＫ７９の構築の図式的な説明を示す。

図８はプラスミドｐｃＫ８０の構築の図式的な説明を示す。

図９はプラスミドｐＣに８０．　ｐｃＫ８１．　ｐＣＫ８２、およびｐＣＫ９５の図式的な説明を示す。

図１ＯはプラスミドｐＣＫ７２．　ｐＣＫ８３、およびｐｃＫ３０と、ｐｃＫ３０に由来する組換えプラスミドｐＣＫ３２．　ｐｃＫ７０、およびｐｃＫ７１の図式的な説明を示す。

図１１はＩＰＴＧで誘導した（右のプレート）および誘導していない（左のプレート）ｐＳＮＵＣ−１を含んでいる大腸菌ＪＭ１０９における、シグナル配列を欠く、ｐＵＨＥ２４−２由来のスタフィロコッカスのヌクレアーゼ遺伝子の増殖および表現型の発現を示す。

図１２はＩ　ＰＴＧで誘導した（右のプレート）および誘導していない（左のプレート）ｐＳＮＵＣ−３を含んでいる大腸菌ＪＭ１０９における、シグナル配列を欠＜　ｐＵＨＥ２４−２スタフイロコツカスヌクレアーゼ遺伝子の増殖および表現型の発現を示す。

図１３はｐＵＨＥ２４−２プラスミドベクターにクローン化した、シグナル配列を欠＜　ｐＵＨＥ２４−２ヌクレアーゼ遺伝子のポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。レーン１１大きさの標準としての、１２３塩基対のＤＮＡラダー：レーン２、大きさの標準としての、）ｌｉｎｄＩ［ｒ制限酵素で消化したラムダＤＮＡ　、レーン３および５、Ｈｌｎｄｎ［で消化したｐＵＨＥ２４−２　、レーン４、ＨｉｎｄｌＩＩで消化したプラスミドｐＳＮＵＣ−１；レーン６、Ｌ　−５ＮＵＣおよびＲ−５ＮＵＣプライマーを用いてＰＣＲにより増殖した９ＦＯＧ４０８由来のヌクレアーゼ遺伝子フラグメントを示す。

図１４Ａは、ｌ　ＰＴＧを用いた、および用いない、液体培養における大腸菌ＪＭ１０９　（９３ＮＵＣ−１）の誘導の一動力学（ＯＤ、。）を示す。

図１４Ｂは、ＩＰＴＧを用いた、および用いない、大腸菌ＪＭ１０９　（ｐｓＮＵｃ　−１）の生育可能なプレートの対数を示す。

図１５Ａは、ＩＰＴＧを用いた、および用いない、液体培養における大腸菌ＪＭ１０９　（ｐＳＮＵＣ−３）の誘導の動力学（ＯＤｏ。）を示す。

図１５Ｂは、ＩＰＴＧを用いた、および用いない、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＳＮＣ −３）の生育可能なプレートの対数を示す。

図１６はＩＰＴＧを用いた、および用いない大腸菌ＪＭ１０９（ｐＳＮＣ−１）および大腸菌ＪＭ１０９　（ｐＳＮＵＣ−３’）の培養物からの、全タンパク質抽出物の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色した。大腸菌ＡＲ１２０（ｐＦＯＦ４０Ｂ）からの全細胞タンパク質をポジティブコントロールとして用い、大腸菌（ｐＵＨＥ２４−２　）をネガティブコントロールとして用いた。ヌクレアーゼのバンドを矢印で示した。

レーンｌ、タンパク質の大きさの標準；レーン２、ＩＰＴＧなしのｐｓＮＵｃ− １，レーン３、ＩＰＴＧのあるＩ）ＳＮＵＣ−１；レーン４、夏ＰＴＧのあるｐＳＮＵＣ−３、レーン４、ＩＰＴＧなしのｐｓＮｕｃ−３；レーン５、タンパク質の大きさの標準；レーン６、ＩＰＴＧのあるｐＳＮＵＣ−３、レーン７、ポジティブコントロールとしてのｐＦＯＧ４０８　、レーン８、ネガティブコントロールとしてのｐＵＨ［！２４−２゜図１７はＩＰＴＧ（７）ある、またはＩＰＴＧ１７）ない大腸菌ＪＭ１０９　（＋）ＳＮＵＣ−１）および大腸菌ＪＭ１０９　（ｐｓＮＵｃ　−３）の培養物からの細胞タンパク質のウェスタンプロット分析を示す。大腸！ＩＡＲ１２０（ｐＦＯＦ４０８）をポジティブコントロールとして用い、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵ）ＩＥ２４−２　）をネガティブコントロールとして用いた。１７．８ｋＤのヌクレアーゼタンパク質のバンドを矢印で示した。レーンｌ、タンパク質の大きさの標準；レーン２、ＩＰＴＧなしのｐＳＮＵＣ−１、レーン３、ＩＰＴＧのあるｐＳＮＵＣ−１；レーン４、ＩＰＴＧなしのｐＳＮＵＣ−３；レーン５、ＩＰＴＧのあるｐｓＮＵｃ　−３；レーン６、ポジティブコントロールとしてのｐＦＯＧ４０８　：レーン７、ネガティブコントロールとしてのｐＵＨＥ２４−２゜図１８はプラスミドｐＭＧ３２３の構築の図式的な説明を示す。

図１９はｐｈｌＡ誘導条件下（４１Ｔｌ：）および非誘導条件下（３７℃）における、アンジピリジン１００μｇ／ｍｌを加えたＬＢ培地における、ｐＭＧ３１７で形質転換した大腸菌Ｃ３Ｈ５０の生育可能な数（Ｖ、Ｃ，）を示す。

図２０はプラスミドｐＭＧ３１７．９ＭＧ３２３、およびｐＭＧ３２３／　３３の構築を示す。

酵素の略号二ＢｌはＢａｍ）目、Ｂ２はＢｇｌ　ＩＩ、ＥｌはＥｃａＲＩ、Ｈ３はＨｉｎｄｌｌ［、ＫｐはＫｐｎ　Ｉ、５ＩＩＩはＳｍａＩ、ＳｃはＳｅａ　Ｉ、ｓｐは５ｐｈＩＳＳｓは５ｓｔｌを表す。遺伝子：　ｂｌａおよびｎｌ１１は各々アンピシリンおよびカナマイシンに対する耐性をコードしており、０「１は複製開始、ｒｅｐは複製機能、ｍｏｂは接合性伝達、Ｃｌ８５７は温度感受性のあるラムダリプレッサー、ｐＲはラムダプロモーター領域、　１ａｃＩｇはラクトースリプレッサー、ｐｔａｃはｔａｃプロモーターを表す。太線はセラチア属のＤＮＡである。

図２１はりゾルベースを介する組換え反応の図式的な説明を示している。プラスミドｐｃＫ１５５を２つの別の種、ｐｃＫ１５５デルタおよびｐｃＫ１５オメガに変えた。制限酵素Ｎｄｅ　Ｉで切断した結果として生じるフラグメントを、各々のプラスミド構成について示した。

図２２はプラスミドｐｃＫ１５１．　ｐｃＫ１５５、およびｐｃＫ１６８の概観を示す。単独の制限部位を示した。括弧に示した制限部位はふさがれる（機能のない）部位を表す。略号ＴはｒｐｏｃＬ’ターミネータ−を表す。プラスミドｐｃＫ１５１およびｐｃＫ１５５はｐｕｃｔａに由来するレプリコンであり、一方ｐｃＫ１６８はｐＡｃＹｃ１８４に由来する。

図２３はｐｃＫ１５５の詳細なマツプを示す。

図２４はｉｎ　ｖｉｖｏにおけるｐａｒＡリシルベースを介する組換えの結果であるｐｃＫ１５５デルタにおけるハイブリッド変形部位を示す。その配列部分をｒｓｅｑ　Ｊで表し、ＲＰ４に起源する塩基にｒＲＰ４Ｊと印をつけた。

図２５はｐｃＫ１５５およびｐｃＫＩ５３　（、コントロール）を用いた増殖実験を示す。生育可能な数は、クロランフェニコル５０μｇ／＋ｎｌおよびアンピシリン１００μｇ／＋ｎｌ、またはクロランフェニコール５０μｇ／＋ｎｌおよびカナマイシン５０μｇ／＋ｎｌを含んでいるＬＢプレートのいずれかにおいて、表示された時点での、適切な希釈物からのプレート数として測定する。プレートはＩＰＴＧを含まない。

図２６はりゾルベース反応のｉｎ　ＶｉｔｒＯにおける滴定分析を示す（０，７％アガロースゲル）。レーンｌはｐｃＫ１５５デルタを１１０ｎｇ含んでいる（０）。レーン２〜１１は表示した量のりゾルベース（５〜１２００ｎｇ）で３７ ℃で３０分間処理したｐｃＫ１５５を含む。反応物はすべて制限酵素Ｎｄｅ　Ｉで１時間処理した後、試料ゲルに入れた。４４５９塩基のバンドは変形していないプラスミドｐｃＫ１５５を表し、２９３９塩基および１９１９塩基のバンドは各々プラスミドｐｃＫ１５５デルタおよびｐｃＫ１５オメガを表す。

図２７は図２６に図示したバンドに対応するスキャニング曲線を示す。

吸収単位は任意である。

図２８はりゾルベース反応の、ｔｎ　ＶｉｔｒＯにおける滴定を示す。反応したプラスミドの百分率を、ｐｃＫ１５５のＮｄｅ　Ｉ主要フラグメント（４４５９塩基）の長さで割った、ｐｃＫ１５５からの主要ピークの面積に比較して、それぞれのフラグメントの長さく２９３９塩基および１９１９塩基）で割ったｐｃＫ１５５デルタおよびｐｃＫ１５オメガのスキャンからの、図２７に示したピークの面積として定義した。

図２９はｉｎ　ｖｉけ０における変形反応の動力学を示したものである、ｐｃＫ１５５　１０ｎｇを２つの表示した量のりゾルベースで処理し、表示した時間に熱失活により反応停止させた。

実施例１細胞質ヌクレアーゼ遺伝子の構築セラチア・マルセセンスからの細胞外ヌクレアーゼをコードしている遺伝子をクローン化し配列決定した。このヌクレアーゼも大腸菌において発現される時、一部は細胞外に、一部は周辺質に存在することが示されてきた。この遺伝子の配列は、タンパク質の輸送が、タンパク質のＮ末端に認められるシグナルペプチドを介することを示し、排出された成熟したヌクレオチドのＮ末端アミノ酸配列の決定は、シグナルペプチドが輸送の間にタンパク質から除去されることを立証した。従って、Ｓ、マルセセンスまたは大腸菌において発現および排出の後に通常見られる活性酵素はプロセスされた形のタンパク質である。

Ｓ、マルセセンスのヌクレアーゼの細胞内における活性を調べるため、このタンパク質の成熟したプロセスされた部分に相当する、ヌクレアーゼをコードしている遺伝子に融合させた、誘導可能なプロモーターを運んでいるプラスミドを構築した。この構築は、シグナル配列と成熟ヌクレアーゼをコードしている配列との間の境界にあるＢａｇ　１部位の存在により容易となる。さらに′、Ｒａｇ　Ｉ部位はヌクレアーゼをコードしている配列のＣ末端側のすぐ下流に存在する。

従って、ヌクレアーゼの全成熟部分をコードしているＢａｇ　Ｉフラグメントは、ＷＯ３６１０６７４３によって開示された全ヌクレアーゼ前駆タンパク質をコードしているｐＮＵ１２１−ｎｕｃ＋のようなプラスミドを制限した後に単離することができる。

以下の構築物のために選択した誘導可能なプロモーターシステムは、誘導物質がない時は非常に抑制されており、かつＩＰＴＧによる誘導の後の転写が極めて効率的である合成！ａｃオペレーター・プロモーターを運んでいるプラスミドｐＵＨＥ！２４−２である。このプラスミドはまたマルチプルクローニングサイトに含まれている翻訳開始コドンに結合している、効率的なリポソーム結合部位も運んでいる。

ｐＵ）ｌＥ２４−２にはＢａｇ　Ｉ部位は存在しない。

シグナル配列のないヌクレアーゼ遺伝子を運んでいるＢａｇ　Ｉフラグメントを挿入するため、Ｂａｇ　１部位を含んでいるオリゴヌクレオチドリンカーを、ｐＵＩＩＥ２４−２のＢａｍ０１部位と５ａｌｌ部位との間に挿入した（図１参照）。次いで、成熟型ヌクレアーゼタンパク質をコードしている精製したＥａｇＩフラグメントを、Ｒａｇ　Ｉで制限した新たなｐＵＨＥ２４−２に連結し、　１ａｃｅ’遺伝子を含んでいるＪｕ１０５株の形質転換体の、ｌ　ＰＴＧを含んでいるプレート上での生存度を調べた。

ヌクレアーゼ遺伝子のない対照コロニーに比較して、いくつかのクローンを、ＩＴＰＯプレート上で弱い増殖を示すものとして同定した。

かかるクローンから単離したプラスミドのマツピングは、ヌクレアーゼ遺伝子が実際に正しい方向に挿入されていたことを示し、図２に示したようにがかる挿入は、発現ベクターの開始コドンとＲａｇ　Ｉフラグメントのヌクレアーゼ遺伝子との間のフレーム内融合を導く。

以下の文章では、表示した修飾を受けたヌクレアーゼ遺伝子をｎｕｃ”遺伝子と呼び、結果として得られるここに記したプラスミドをｐｓＭ１０８８と呼ぶ。

大腸菌に１２株、ＪＭ１０５に含まれるプラスミドｐｓＭ１０８８は、１９９１年８月２１日に、ジャーマン・コレクション・オブ・マイクロオーガニズムス・アンド・セルカルチャーズ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｗｏｎＭｉｋｒｏｏｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　Ｇｍｂｌ（、ドイツ、ブラウンシュライク３３００．マツシエローダーベーグＩＢ）に寄託した。

実施例２ｎｕｃ”遺伝子のＴｎ５への挿入構築したｎｕｃ”遺伝子を他の細菌の染色体に転移する容易な方法を得るために、発現プロモーター（ｐＵＨＥ２４−２　）をつけた遺伝子を、ｌａｃリプレッサーをコードしている遺伝子と共に、移動し得るブラースミド上のＴｎ５に挿入した。

使用した最初のベクターはｐＢＲ３２５の派生物、９ＳＵＰ２０２であり（Ｓｉｍｏｎら、１９８３．　Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌｏｇｙ、　１．７８４−７９０）　、これはｌｅｔ遺伝子の上流にプラスミドＲＰ４からのｍｏｂ部位の挿入を有する。染色体にＲＰ４の組込みのあるＳ１７．１株のような大腸菌株からは、ｐｓＵＰ２０２を広範囲の細菌に移動することができる。プラスミドｐｓＵＰ２０２の修飾を以下のように行なった。

ｉ）プラスミドをＥｃｏＲＩで制限し、一本鎖の末端をＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片でふさぎ、ＤＮＡを連結し、最後にＭＴｉＯ３へ形質転換する。選択はアンピシリン耐性に関して行ない、さらにクロラムフェニコール耐性の喪失についてコロニーをスクリーニングした（ＥｃｏＲＩ部位はｃｕｔ遺伝子内にある）。結果として得られたプラスミドを９５Ｍ８６５と名づけた。

ｉ）プラスミドｐＳＭ８６５をＢａｍＨＩおよびＳａｌ　Ｉ酵素で制限し、一本鎖化した末端をフレノウ酵素でふさぎ、ＤＮＡを連結し、最後に大腸菌に１２株のＩＪｃｌｏｏＯ（Ｓｉｍｏｎら、上記）を形質転換した。選択はアンピシリン耐性に関して行ない、さらにテトラサイクリン耐性の喪失についてコロニーをスクリーニングした（選択した制限部位はｔｅｔ遺伝遺伝子局在する）。結果として得られたプラスミドを９５Ｍ８７８と名づけた。

１ｉｉ）トランスポゾンＴｎ５を、Ｔｎ５を運んでいるラムダファージによるＭＣ１００Ｏ（９８Ｍ８７８）の感染を通して、９８Ｍ８７８に挿入した。カナマイシン耐性コロニーを選択した後、それらをプールし、プラスミドＤＮＡを調製し、続いてプラスミドのないＭＣ１００Ｏ株に形質転換し、再びカナマイシン耐性について選択した。形質転換体をアンピシリン耐性の喪失についてスクリーニングし、このようにしてｂｌａ遺伝子内のトランスポゾンの挿入を同定した。このことの確認は、結果として得られた９５Ｍ８９０と名づけだプラスミドの標準的なマツピングによって行なった。

ｉｖ）　Ｉａｃｌ″遺伝子を９５Ｍ８９０のＴｎ５に挿入した。プラスミドｐＴＴＱ１９をＥｃｏＯ１０９で制限し、Ｓａｔ　Ｉ断片をリンカ−挿入した。結果として得られたプラスミドから１ａｃｌ遺伝子をＳａｌ　Ｉ　−Ｓｃａ　Ｉフラグメントとして単離し、５ａｌｌおよび５Ｉ１１ａ　Ｉ酵素で制限した９５Ｍ８９０に連結した。結果として得られたプラスミドはＴｎＳ内に１ａｃＩ＠遺伝子をもっており、９５Ｍ１０１４と名づけた。

■）プラスミドｐｓ）Ｊ１０８８をＸｈｏ　Ｉおよび５ａｌＴ酵素で制限し、プラスミドｐｓＭ１０４をＳａｌ　Ｉで制限した。これらの二つのプラスミドＤＮＡを混合し、連結してＭＣ１００Ｏに形質転換し、カナマイシン耐性について選択した。ＩＰＴＧを含んでいるプレート上での減少した増殖に関してコロニーをスクリーニングし、結果として得られたプラスミドを分析しマツピングした。かかるプラスミドは、Ｔｎ５内にｐＵＨＲ２４−２およびＩａｃＩ＠遺伝子からの合成１ａｃプロモーターと結合しているｎｕＣ”遺伝子が挿入されており、９３Ｍ１０９３と名づけた。このプラスミドのマツプを図３に示す。

実施例３細胞内ヌクレアーゼの免疫学的分析ＬＢ培地中で対数増殖をしているＭＣ１０００ＭＣ１０００（１）Ｓの培養物に、１ｍ　ＩＰＴＧを００．、、が０．２となるように加えた。３０分間培養物の増殖を続けた後、クロランフェニコールを加えて濃度を１００μｇ／ｍｌとし、更に６０分間インキュベーションを続けた。試料５ｉ＋１を、ＩＰＴＧの添加前（誘導しないコントロール）　、ＩＰＴＧ添加３添加３０幻後びクロラムフェニコール添加後の異なる時点で採取した。クロラムフェニコールの添加は、細胞の細胞質におけるヌクレアーゼの安定性の評価を可能にする。５＋ｎｌの試料を遠心して細胞を集め、ＴＥ緩衝液０．５ＩＩ１１に再浮遊させた。これらの、ｌＯ倍濃度の細胞試料を透明になるまで音波処理し、破片を遠心によって除去した。

細胞抽出物中に存在しているヌクレアーゼの量は、基本的には以下の実施例１４に記したようなＥＬＩＳＡ法により、精製した細胞外ヌクレアーゼに対してウサギで調製し、あらかじめ吸着させたポリクローナル抗体を用いて測定した。

表１のデータは、ＯＤｔ。、のＥＬＩＳＡ測定値と標準的なヌクレアーゼ用の０Ｄｔｓ。の測定データとの間の比が、このような実験に典型的であることを示し、９３Ｍ１０９３のｎｕｃ”遺伝子にコードされているヌクレアーゼタンパク質が、誘導の結果として有意な量で発現されていることを示している。しかしながら、このタンパク質はかなり不安定であり、タンパク質合成の停止（クロランフェニコールの添加により成される）後およそ６０分では、検出し得るヌクレアーゼは細胞内に残っていない。

分　ＭＣ１００Ｏ５Ｍ８２５　５Ｍ１０６７０　１、５　１．３　１．１３０　４、　ｌ　３．６　２．５６０　０、８８　３．９　１．２９０　０、８５　２．２　１．２ＭＣ１００Ｏ：大腸菌、５Ｍ８２５　：エンテロバクター・クロアサエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｏｒ　ｃｌｏａｃａｅ）　、５Ｍ１０６７　：シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）　。

実施例４細胞内ヌクレアーゼの活性分析実施例３に記したような免疫学的に反応性のあるヌクレアーゼの証明は、このタンパク質が発現していることを示すにすぎない、すなわちこのタンパク質が細胞内で酵素活性を維持していたかどうかは証明されないままである。

ＭＣ１０００ＭＣ１０００（１）Ｓの細胞の培養物におけるヌクレアーゼ合成の誘導は、前文に記したようにｌ＋ｎＭのＩＴＰＧの添加により成就され、３０分間のインキュベーションの後に実験を停止した。［ＰＴＧ添加の前後に試料を採取し、細胞の溶解後に起こるヌクレアーゼによるＤＮＡの加水分解を防ぐかまたは非常に減少させるため高濃度のＥＤＴＡを用いる方法を使って、集めた細胞から全ＤＮＡを調製した。かかる溶解後の核酸分解によるＤＮＡの分解の対照として、あらかじめ精製しておいたプラスミドＤＮＡを、溶解の工程を始める前にＤＮＡ標品の一つに加えた。全ＤＮＡの調製の後、環状のプラスミドＤＮＡが存在したことは、細胞の採取後に何らのＤＮＡ分解も起きていないことを強く示唆していると解釈した。

た試料には、ＤＮＡは均一な消化されていないバンドとして見られる。

それに対し、ＩＰＴＧで誘導した後に採取した試料から調製したＤＮＡは、分解の度合いが高いことを示す非常にヘテロな様相（スメア）を示しており、さらに、かかる誘導した試料に加えたプラスミドＤＮＡがその均一性を保っていた（分解されなかった）ことから、ｎｕｃ”遺伝子の誘導後のＤＮＡの消化が細胞の内側において、すなわち細胞内で起こったはずである。従って、発現されたタンパク質は酵素活性を有していた。

実施例５ｎｕｃ’システムの他の細菌種への伝達プラスミドｐｓＭ１０９３においては、ＩＰＴＧで誘導することができるｎｕｃ”遺伝子は、移動可能なｐＢＲ３２２から派生したプラスミド上のＴｎ５トランスポゾン内に位置している。従って、ｎｕｃ”遺伝子を含んでいるトランスポゾンを、大腸菌を供与株として用いる接合交配によって、他の細菌へ誘導することができる。ｐＢＲ３２２プラスミドの複製を許す細菌（腸内細菌）においては、大腸菌における場合と全く同様に、トランス接合体が供与体プラスミド上のトランスポゾンを運ぶと考えられており、他の細菌（たとえばシュードモナス）においては、ｐＢＲ３２２プラスミドは複製せず、これらの種におけるトランスポゾンを介する抗生物質耐性の獲得は、受容生物における染色体または内在性プラスミドへの転位によって可能である。

接合交配は、抗生物質を含まないＬＢプレートの上で、浮遊させた供与細胞と受容細胞とを混合し、３０℃で一晩インキユベートすることによって行なわれる。

混合細胞のコロニーからアリコートをとり、選択プレート（トランスポゾンのカナマイシン耐性の選択、および受容生物の抗生物質、通常はりファンピシンに対する耐性マーカーの選択）の上で画線培養した。１〜３日のインキュベーションの後に現われるコロニーで選択プレート上に再び画線培養し、転移が実際に起きたことを確認するために、受容体の特異的な特徴について調べた。

結果として得られたトランス接合体株について、最後に、ＩＰＴＧを含んでいるプレート上での生存度について調べた。これらの種々の細菌におけるｎｕｃ”遺伝子の誘導は、これらのうちのいくつかの増殖を阻害する結果となったが、少数の細菌は明らかに誘導に対して耐性があった。一つの種、すなわちエンテロバクタ−・クロアサエは大腸菌よりも高い感受性を示した。

異なる細菌において、誘導に対して観察された異なる感受性の原因を研究するために、ヌクレアーゼタンパク質の誘導レベルの測定を、実施例３に記したようなＥＬＩＳＡ分析によって行なった。前文の表１に要約した結果は、誘導されたヌクレアーゼタンパク質のレベルと各々の細菌種の増殖阻害の程度との間に卓越した相関関係があることを示した。はとんどの細菌においてヌクレアーゼは大腸菌におけると同様に不安定であるが、しかしエンテロバクタ−・クロアサエにおいてはヌクレアーゼは更に安定であり、従ってこの生物に見られる増加した増殖阻害に一致して、より高いレベルの酵素を細胞内に得ることができることもまた注目すべきである。これらの結果は、ｎｕｃ”遺伝子の誘導後の増殖阻害力士、細胞内のヌクレアーゼの濃度によって変ることを示した。この濃度が一定のレベルを越えると、すべての細菌種はこの酵素の存在に対して等しく感受性になり、そのことは、閾値以下の速度で起きているＤＮＡの損傷が調べた細胞すべてにおいて等しく効率的に修復されていることを再び示すものである。

実施例６ｎｕｃ”活性の最適化プラスミドｐｓＭ１０９３について記述したような、ｎＬｌｃ’の発現システムの特徴から、プラスミドの突然変異によって更に効率のよい致死システムを引き出すことができることが明らかである。一般原則として、細胞におけるより高いヌクレアーゼ活性は、誘導後のタンパク質濃度の増加または、酵素の比活性の増加のいずれかによって得ることができる。タンパク質濃度の増加は、遺伝子量の増加が、遺伝子の発現レベルの増加か、またはタンパク質の安定性の増加の結果であると考えられ、比活性の増加はヌクレアーゼ遺伝子の構造における突然変異（複数の突然変異）を必要とする。

突然変異体をスクリーニングするプログラムは、ｎｕｃ”遺伝子の誘導の後に増殖阻害の増加を引き起こすどの型の突然変異を単離するのかという目的によって設計する。スクリーニングの基盤は、９３Ｍ１０９３をもっている大腸菌細胞が、ＩＰＴＧを含んでいるプレート上で、誘導後の残余増殖により、小さなコロニーを形成することができるという観察であった。そのため、増加した細胞内酵素活性を有する突然変異体は、そのプレート上で更に厳しい増殖阻害を示すことが期待される。

他の細胞へのｎｕｃ”システムの伝達の可能性の重大さのため、最適化に導く突然変異が大腸菌染色体の遺伝子（たとえば修復遺伝子またはヌクレアーゼの不安定さの原因となるプロテアーゼをコードしている遺伝子）にではなく、プラスミドに局在することを確かめることが重要であった。そのため、Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、１９７６、　Ｍｏ１．Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、、　１４５．１０１に従って、ヒドロキシルアミン法を用いて、精製したプラスミドｐｓＭ１０９３ＤＮＡに直接に突然変異誘発処理を行なった。

この方法は、２０μｍの単離精製したＤＮＡ（３μｇ）、ｌｎＭのＩＩ！ＤＴＡを含んでいる１００μｍのリン酸ナトリウム緩衝液（０，１Ｍ、　ｐｕ　ｅ、ｏ）、およびｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡを含んでいる８０μｌのＮＨ＊ＯＨ／　ＨＣＩ（Ｉ　ＭＳｐＨをＮａＯＨで６．０に調整）を含んでいる反応溶液の最初の調製を含む。この混合物を７０℃で４５時間インキュベートし、続いてＤＮＡ透析緩衝液に対して２℃で一晩透析した。

このようにして処理したＤＮＡを続いて突然変異を誘発していない大腸菌株（ＭＣ１００Ｏ）に形質転換した。選択プレート（ＬＢ十カナマイシン）上にコロニーが現れた後、ｎｕｃ”遺伝子の誘導のためにｌ　ＰＴＧも含んでいるプレート上にレプリカ培養した。３７℃で５〜６時間インキュベートした後、レプリカの増殖を調べ、ＩＰＴＧを含んでいるプレート上では増殖しないかまたは非常に少ない増殖を示しているコロニーを、マスタープレート（ＩＰＴＧなし）から選択プレートおよびＩＰＴＧを含んでいる選択プレート上に画線培養し、野生型９３Ｍ１０９３株の同様な画線と比較した。突然変異誘発の１サイクルから、ＩＰＴＧを含んでいるプレート上ですべてが大腸菌の増加した増殖阻害を示す７つのクローンを単離した。

突然変異したプラスミドの性質を調べるため、さらに突然変異（または複数の突然変異）の性質をできる限り示すために、一連の実験を行なった。先の実施例においてすでに記述した方法と分析法とを用いて、単離した突然変異体についてヌクレアーゼタンパク質の発現レベル（ＥＬＩＳＡ）　、酵素の安定性（ＥＬＩＳＡおよびヌクレアーゼ活性、スポット試験）、および細胞内ヌクレアーゼ活性のレベル（スポット試験）を調べた。さらに、単離した突然変異体クローンからのプラスミドＤＮＡを精製し、細胞内におけるこれらの相対量および制限酵素概観図をアガロースゲルの調査により決定した。すべての突然変異体はタンパク質量およびヌクレアーゼ活性の増加を示し、これらの２つのパラメーターの間の相関関係はすべての場合に酵素の発現の増加が起きたことを示した。いかなる突然変異体も、用いた方法で検出し得るタンパク質の安定性の増加を引き起こさなかった。また、いかなる突然変異体も、プラスミドのコピー数の増加を示さなかった。

従って、突然変異体の予備分析は、増殖阻害の増加の最もありそうな原因としての、誘導後のより高い発現レベルにねらいをつけた。

誘導後退も高い増殖阻害レベルおよび最も高い細胞内ヌクレアーゼレベルを示す一つの突然変異体、９５Ｍ１０９３−１は、９３Ｍ１０９３に比較して余分のＥｃｏＲＶ制限部位を有することが判明した。この部位の位置はＩａｃ　Ｉ”遺伝子の場所と一致しており、突然変異したリプレッサーがＩＰＴＧ誘導に対して更に適切に反応し、誘導後のより速いｎｕｃ”転写速度に導いたことを示唆している。更に特徴を明らかにするためいずれも最も高いヌクレアーゼ活性レベルを有するクローンを代表する２つの突然変異体を選択した。

実施例７９３Ｍ１０９３と２つの突然変異体プラスミドとの特性の比較基本的には以下の実施例１４において記述したように、Ｉ！ＬＩＳＡによって測定した誘導されたヌクレアーゼタンパク質のレベル（誘導後３０分）を表３に示す。示した数値は、ＯＤｓ＊ｔのＩ！ＬＩＳＡ測定値と標準的なヌクレアーゼのＯＤ□。の測定データとの間の比を表す。誘導物質であるＩＰＴＧは０分の時点で与え、クロラムフェニコールは３０分後に与えた。その結果は９３Ｍ１０９３　（野生型）が９５Ｍ１０９３−１よりも少ない酵素を産生ずることを明らかに示している。９５Ｍ１０９３−１からのヌクレアーゼの分解の初速度は非常に高く見えるが、これらの異なる株からの酵素は、クロラムフェニコールの細胞への添加の後は、同じ動力学で分解した。

分　９３Ｍ１０９３　９５Ｍ１０９３−１３０　５４．７　１１９．２６０　３１、６　３５．８ｐＳＭ１０９３−１からの、誘導したヌクレアーゼの増殖阻害および細胞致死の効率を増殖実験で調べた。結果を表４に示す。

２＋ｎＭ　ＩＰＴＧ添加　ＬＢ上での＋ｎｌあたりのコロニー形成単位後の時間　カナマイシン　カナマイシン＋ＩＰＴＧ０　１．２ＸｌＯ’　１．３Ｘ１０” １．５　２．７ｘｌＯ’　− ３，０３，０ＸＩＯ”　２．１Ｘ１０’−晩　１．０Ｘ１０’　８．７ｘｌＯ’ ０時間の試料はＩＰＴＧ添加の前に採取した。親のｎｕｃ”遺伝子および突然変異体派生物は、いずれもＴｎ５トランスポゾン内に位置しており、従って下文の実施例１１に記述したような、他の細菌種にそれらを伝達することができる。下文の実施例１Ｏに示したような、３つのプラスミドのそれぞれを、大腸菌ＳＩ７．１（供与体）からシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）およびシュードモナス・フルオレセンスに各々接合した。

トランス接合体の単離およびコロニーの精製の後、各々の接合体からの多数の独立したクローンのＩＰＴＧで誘導される増殖阻害について調べた。トランス接合体と受容体との各々の特異的な組合わせには変化はなく、受容体に対する転位に無関係に、誘導の効果が同じであることが示された。一般的な状況は大腸菌で見られたものとよく似ており、シュードモナスにおいても野生型より突然変異体の方が増殖阻害剤としては、より効果的である。

実施例８モデルとなる組換えシステムの構築および実験相同組換えに基づく、推計学的誘導システムの可能性を評価するための、モデルプラスミドを構築した。このプラスミドは性質のよくわかっているプラスミドｐＢＲ３２５（Ｂｏｌｉｖａｒ、　１９７８．　Ｇｅｎｅ、　４．１２１−１３６）に基づいており、そこにはクロラムフェニコール耐性遺伝子の繰り返しがある。この二つの相同なりＮＡのストレッチの間に、商品として得られるプラスミド、ｐＴＴＱ１９　（Ｓｔａｒｋ、１９Ｂ？、　Ｇｅｎｅ、　５１．２５５−２６７）からの１ａｃＩＱ遺伝子を挿入する。もしＩａｃ　Ｉによって抑制されているプロモーターにより支配されているもう一つの遺伝子が、同じ細胞内に、前文に記したようなモデルプラスミドのように存在しているとすれば、（さらにこの株のパックグラウンドがｌａｃ　Ｉだとすると）その遺伝子の誘導は、ｌａｃ　Ｉリプレッサーがこの工程において消失するため、モデルプラスミドの最後のコピーが再結合した時点で起こる。

ベクターｐＢＲ３２５は、典型的には細胞あたり５０コピｐＢＲ３２５をＥｃｏＲＩで直鎖化し、付着末端をＤＮＡポリメラーゼ■の大きいフラグメント（フレノウ断片）によってふさいだ。プラスミドを再び連結し、その結果、宿主細胞にアンピシリン耐性およびテトラサイタリン耐性を与えるがクロラムフェニコール耐性は与えないｐＣＫ２０を得た。同じ方法をプラスミドｐｓＵＰ２０２　（Ｓｌｍｏｎら、１９８３゜Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　１．７８４−７９０）に導入し、結果として９３Ｍ８６５を得た。

クロラムフェニコール遺伝子は、平滑末端を生じるＴｎ９の中央のＢｂｖ　Ｉフラグメントからクローン化した。このフラグメントをｐＵｃ１８（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、１９８５．　Ｇｅｎｅ、　３３．１０３−１０９）の平滑末端化したＸｂａ　１部位に挿入し、ｐＬＫＰ４６を得た。フラグメントの方向性は、ｐＵｃ１８のＲａｍ）ｌ　Ｉ部位に最も近い、内部のＥｃｏＲＩ部位によって決定した。Ｂａｗ＋ＨＩおよびＳａｔ　Ｉで切断したベクターｐｃＫ２０および９３Ｍ８６５に、ｐＬＫＰ４６のＢａｍＨＩ　／　Ｓａｔ　Ｉフラグメントを挿入し、それぞれクロラムフェニコール耐性であるが、テトラサイクリン感受性であるプラスミド、　ｐＣＫ２２およびｐＣＫ２３を得た。

プラスミドｐＨ８１０３は、プラスミドｐ’ｒ’ｒｑ　１９からの１ａｃＩＱ遺伝子を含む。切り出された１ａｃＩＱフラグメントは、以下の修飾を施したＳｓｐ　Ｉ　／　ＥｃｏＯ１０９Ｉフラグメントと等しい。すなわちＥｃｏＯ１０９Ｉ部位は平滑末端化され、５ａｌＩリンカ−にューイングランド・バイオラプス社　＃　１０２７）に連結し、続いてｐＫＫ２２３−３　（Ｂｒｏｓｌｕｓら、１９８４、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　８１．６９２９−６９３３）の小さな５ａｌｌ−ＢａｍＨＩフラグメントに連結した。従って、結果として得られる１ａｃｌＱフラグメントは、約１１００塩基対のＳｓｐ　Ｉ　／　ＢａｍＨＩフラグメント上にある。この断片を、ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで切断したｐＣＫ２２およびｐＣＫ２３に挿入して、各々ｐＣＫ２４およびｐＣＫ２５を得た。これらのプラスミドはモデルプラスミドであり、ｐＣＫ２５が２つの直接的な反復の間に、ＩａｃＴＱ遺伝子と共に挿入した１ｌＩＯｂ遺伝子（約２０００塩基対）を付加的に含んでいる点で異なっている。これらの二つのプラスミドにおいて相同なストレッチの長さは約９００塩基対であり、反復ストレッチの間は約１１００塩基対（ｐＣＫ２４）および約３１００塩基対（ｐＣＫ２５）である。

抑制可能なｌａｃ　Ｉプロモーターである、　ｔｒｐ−１ａｃハイブリツドｔａｃプロモーター（Ａｍａｎｎ、　Ｅ、ら、１９８３．　Ｇｅｎｅ、　２５．１６７−１７８）の支配下にあるｇｅｆ遺伝子を含んでいる付加的なプラスミドを構築した。ｇｅｆ遺伝子を含んでいるプラスミドｐＬＫＰ１１８　（Ｐｏｕｌｓｅｎら、１９８９．　Ｍｏ１ｅｃ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　３．１４６３−１４７２）を、旧ｎｄｎｌおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＨｉｎｄＩ［Ｉおよびｆ！ｃｏＲＩで開いたｐＫＫ２３３−３に連結し、ｐＨＢ１０１を得た。

ｐＨＢ１０１の約５００塩基対のＢａｍＨＩフラグメントをｐＡｃＹｃ１７７（Ｃｈａｎｇら、１９７８、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１３４．１１４１− １１５６）のＢａｍ）ｌ　Ｉ部位に挿入し、ｐＣＫ２８（図５）を得た。

モデルプラスミドｐＣＫ２４およびｐＣＫ２５を、染色体上にデルタ（ｌａｃ− ｐｒｏ）欠失を有し、さらに機能をもつｌａｃ　Ｉ遺伝子を除く完全なｌａｃオペロンを含んでいるＦ因子を有する大腸菌Ｃ３Ｈ３６株（コールド・スプリング・ハーバ−・コレクション、米国）に形質転換した。この株の表現型は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）を含んでいるプレート上では、細胞内にＩａｃ遺伝子が存在していないという条件では青色である。

ｐＣＫ２４またはｐＣＫ２５で形質転換した細胞をＸ−ｇａｌプレート上に播種した時の表現型は、白色、青色、および青色の扇形コロニーであり、コロニーの青色部分の細胞が、実際にモデルプラスミドにおいてＩａｃＩＱのすべてのコピーを欠いていることを示した。均一に白色であるコロニーをＸ−ｇａｌプレート上に再び画線培養すると、それらもまた−晩で扇形になった。均一に青色をしたコロニーは、しかしながら青色のままであった。

前文に記述したプレートからいくつかのコロニーを摘み取す、ＮａＣｌの等偏波２ｍｌに再浮遊した。この溶液から０．２ｍｌずつのアリコートを、一つの大きな水滴としてＬＢプレート上に分配し、３７℃でインキュベートした。

一つのアリコートは直ちに凍結した。次いで接種１日後、およびその後２日または３日ごとにプレートを採取した。プレートの採取は、ＮａＣＩの等偏波２＋１をプレートに加え、その中に細胞を再浮遊させることにより行なった。浮遊物を集め、遠心し、得られたペレットをＮａＣｌ　０．２ｍｌに再浮遊した。集めた細胞は、実験が終わるまで一２０℃に凍結保存した。およそ１５日後に細胞を融解し、ＤＮＡの微量標品用に使用した（ａ、　＋ｎ、　Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ，およびＪ、Ｄｏｌｙ、　１９７９．　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、　７．１５１３−１５２３）。

プラスミド全集団の遺伝子型を分析するために、Ｃ３Ｈ３６のｒｅｃＡ欠損変異体を構築した。すなわち、Ｃ３Ｈ３６は、デルタ−ｒｅｃＡ：　：ＴｎｌＯ株ＪＣ１０２８４（Ｃｚｏｎｋａら、１９７９．　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　９３．３２１−３４３）から調製したファージストックでＰＩ形質導入し、ＣＫＥ９５を得た。

前文に記述したプレートからのＤＮＡ試料をＣＫ［！９５に形質導入し、Ｘ−ｇａｌ上に播種し、コロニーの色を検討した。青色のコロニーの百分率は、対応するＤＮＡ試料における組換えプラスミドの分画に直接に相関していた。図に表してみると（図６）、組換えの明らかな進行が認められ、定常期のＣ３Ｈ３６細胞において組換えシステムが作動していることを示した。１４日後では、この集団の８０％より多いプラスミドが組換えていた。ｐＣ２４とｐＣ２５の反応の間には何ら有意な差がなかった。

組換え率を、シミュレートした連続的な対数増殖実験、すなわち、Ｃ３Ｈ３６＋　ｐＣＫ２４およびＣ３）１３６　＋　ｐＣＫ２５細胞を、アンピシリ：／　１１００ｕ／ｍｌを加えたＬＢ培地中で、３７℃で一晩振とうして増殖させ、毎朝新しいＬＢ培地に１：ｌＯＯの播種材料を用いて再播種する実験において検討した。再播種時に、−晩培養した培養物の一部分を直ちにＤＮＡの微量標品用に使用した。実験の終わりにＤＮＡ試料をＰｓｔＩで消化したが、その部位は両プラスミドモデルにおいて単独であり、組換えの工程で欠失される領域の外側に局在する。一つのＤＮＡ試料から得られる二つのバンドの相対的な濃度は、そのままのプラスミドに組換えられた割合の直接的な測定値となる。かかる実験の一つは、組換えたｐＣに２４プラスミドの百分率が、６日間にほとんど０から９０％になったことを示した。ゲルスキャニングによる分析では、９日後には培養物中のプラスミドは本質的にすべてが再配置を受けていた。ｐＣＫ２５も同様に反応した。このことは組換えシステムが対数増殖期の細胞において作動していることを示唆する（図６Ｂ）。

この実験はまた共同研究室の、大腸菌株Ｃ６０００（Ｂａｃｔｖ＋ａｎｎ、　１９８７、［大腸菌およびサルモネラ・ティフィムリウム（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉａｎｄ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）　Ｊ　Ｎｅ１ｄｈａｒｄ　Ｆ、Ｃ，ら編、ＡＳＭ、ｐｐＨ９Ｏ−１２１９）およびＭＣ１０００（Ｓｉｌｈａｖｙら、１９８４　ｒ遺伝子融合実験（１！ｘｐｅｒｌｉｅｎｔｓｗｉｔｈ　Ｇｅｎｅ　Ｆｕｓｉｏｎｓ）Ｊ　％　コールドスプリングハーバ−研究所、ニューヨーク　ｐｐｘｉ−ｘｉｉ）にも行なった。前述のようにＤＮＡを消化したゲルの視覚的な検査により、これらの株においても同様に組換えの進行が見られた。

ｐＣに２４および９ＣＫ２５を含んでいるＣ３Ｈ３６株を、和合性プラスミド上のｔａｃプロモーターの支配下にあるｇｅｆ遺伝子を含んでいるｐＣＫ２８で形質転換した。組換えによってＩａｃｌＱの最後のコピーが切除されると、プロモーターの抑制が解け、毒性のｇｅｆタンパク質の発現が始まり、宿主細胞の死を引き起こす。ＣＫＥ９５／　ｐＣＫ２４／　ｐＣＫ２８およびＣＫＥ９５／　ｐＣＫ２５／　ｐＣＫ２８を、適当な対照（ＣにＥ９５／　ｐＣＫ２４／　ｐＡｃＹｃ１７７およびＣＫＥ９５／　ｐＣＫ２５／ｐＡｃＹｃ１７？）と共に、０．２％グルコースか、０．５％グリセロールか、または０．５％酢酸塩のいずれかを唯一の炭素源として含んでおり、クロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を添加した最少プレート上での画線培養により、ｇｅｆプラスミドを含んでいる株の有意な増殖阻害が見られた。炭素源の質が低いほど、すなわち全体の増殖速度が遅いほど、阻害効果は激しい。この実験は、ｇｅｆプラスミドを含んでいる細胞に対して有意な不利益を与える前述のような機構として、推計学的な誘導システムが、研究室の基準に基づく封じ込めの情況に使用できることを示唆している。

組合せた株を更に調べるため、ＣＫＩ！９５／　ｐＣ２４／　ｐＣＫ２Ｂの倍加時間をＣＫＥ９５／　ｐＣＫ２５／　ｐＡｃＹｃ１７７ノ倍加時間と比較した。

実験は、０．２％グルコースを含み、クロラムフェニコール（５０μｇ／ｗ＋１）およびカナマイシン（５０μｇ／＋１）を添加した最少培地に、カザミノ酸を加えて、または加えずに行なった。カザミノ酸が存在する最少培地では、対照株の倍加時間が４３分であるのに対し、ｇｅｆプラスミドを含んでいる株の倍加時間は４５分であった。カザミノ酸のない最少培地では、倍加時間は各々８５分（対照）および９５分であった。この実験は、前文の最少プレート分析で見られた傾向を確証した。

実施例９システムの構成要素の簡単な概観ニジステムは二つの別々に構築されたプラスミドの集合に基づく：Ａ）前半は、いろいろな長さの、典型的には６００−１５００塩基対のＤＮＡ配列を制御するプロモーターを有するカセットから成る。この配列は実際の反復ＤＮＡとなるべきものである。このＤＮＡのストレッチの後に、任意で耐性因子、たとえばクロラムフェニコール遺伝子が存在する。最後に、転写ターミネータ−が５′の二つの制限部位Ｘｈｏ　ｌ−５ｐｈＩに、この順序で挿入されている。

Ｂ）後半は、少なくとも一部は前記の反復配列に等しく、任意に致死遺伝子または指示遺伝子が続く（または何もない）配列から成る。

このカセットは単一のＸｈｏ　Ｉおよびｓｐｈ　１部位に側面を接しており、それによってこのカセットを前文に記した前半部分に挿入することができる。完成した「組換えプラスミド」は二つのＮｏ口部位に側面を接しており、それによりその切り出しと、Ｔｎ５転位機構による宿主細胞染色体へのカセットの組込みのための自殺配達プラスミドへの挿入とが可能になる。

二つの基本的なりローニングベクター、ｐＵｃ１８Ｎｏｔ（Ｈｅｒｒｅｒｏら、１９９０、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７２．６５５７−６５６７）およびｐＵｃ１９（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、１９８５．　Ｇｅｎｅ、　１３．１０３−１０９）を、ポリリンカー配列の交換により修飾した。Ｓａｃ　Ｉ　／　Ｐｓｔ　Ｉで切断したｐＵｃ１８Ｎｏｔに、合成ポリリンカー５’−ＣＴＧ・・・・・・ＧＣＡ（上の方の鎖）を、もとのＰｓｔＩ部位を破壊し、Ｓａｃ　Ｉ部位を残して挿入し、ｐＣＫ２９を得た。

同様に、Ｓａｃ　Ｉ　／　Ｓｐｈ　Ｉで切断したｐＵ１９を、ｓｐｈ　Ｉと同様にＳａｃ　Ｉを残して、合成ポリリンカー５’−ＣＴＣ・・団・ＡＴＧ（上の方の鎖）に連結し、　ｐＣに３０を得た。

ｐＣＫ２９をＮ５ｉｌで切断し、ｒｐｏＣｔ’転写ターミネータ−（Ｓｑｕｉｒｅｓら、１９８１．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、　９．６８２７− ６８３９）を含んでいるプラスミドｐＨＢＡ１０２ｒｐｏｃＬからの２５０塩基対のＰＳｔＩフラグメントを、内部ノＢｇ１１部位がｐＣＫ２９（７）　ＢｇｌＩＩ部位に近くなるように挿入し、ｐＣＫ４５を得た。

クロラムフェニコール耐性遺伝子は、ＤＮＡポリメラーゼＩの大きいフラグメント（フレノウ断片）によって平滑化した、Ｔｎ９の中央のＢｂｖ　ｎフラグメントからクローン化した。このフラグメントをｐＵｃＩ８（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、前文参照）の平滑化したＸｂａ　Ｉ部位に挿入してｐＬＫＰ４６を得た。フラグメントの方向性は、ｐＵｃ１８のＢａｍＨＩ部位に最も近い、内部のＲｃｏＲＩ部位によって決定した。

ｐＬＫＰ４６をＳｍａ　Ｉおよび５ａｌｌで切断し、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含んでいるフラグメントを、Ｓａｌａ　ＩおよびＳａｌ　Ｉで直鎖化したｐＣＫ４５に挿入し、ｐＣＫ４９を得た。

１６ＳのｒｒｎＢ遺伝子の一部を含んでいるプラスミドｐＫＫ３５３５（Ｂｒｏｓｉｕｓら、　１９８１．　Ｐｌａｓｍｉｄ、６．１１２−１１８）からの、６９０塩基対のＢｃｌ　Ｉ　−ＢｇＩ　ｎフラグメントを、ｐＣＫ４５のＢｇｌ　ＩＩ部位に、前文に記したｐＣＫ４５のｒｐｏｃｔ’配列に対しＢｇｌ　１１部位が近くに再現されるよう挿入し、ｐＣＫ６８を得た。

ｐｃＫ６８をＳａｌ　Ｉで直鎖化し、ＰＡＩ１０１１０Ｓプロモーターを含んでいる、ｐＵＨＥ２４−２　（Ｌａｎｚｅｒら、１９８８．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８５゜８９７３−８９７７）からの１２７塩基対のＸｈｏ　Ｉ　／　Ｓａｌ　ｎフラグメントを挿入した。５ａｌｌ部位をｐｃＫＯ８の挿入されたリポソーム配列の最も近くに作り直し、ｐＣＫ７５を得た。

ｐＣＫ７５をＰｓｔＩおよびＢＧＩＩ［で切断し、小さい方のフラグメントをＰｓｔｌおよびＢａｍＨＩで切断したｐＣＫ４９に挿入し、ｐＣＫ７９を得た（図７参照）。

二つのプラスミド、ｐＣＫ７５およびｐＣＫ７９（図ｘｘ参照）は、組換えカセット（前半、５９８塩基対の反復）を構築するための基本的なプラスミドである。

ｐｃＫ３０をＢａｍＨＩおよびＳｍａ　Ｉで切断し、ｐＫＫ３５３５からの５９８塩基対のＢｃｌ　Ｉ　−Ｓｍａ　ｎフラグメントを挿入し、ｐＣＫ３７（図８）を得た。

組換えに際して発現される遺伝子を含んでいる種々のプラスミドを修飾し、このシステムに用いた。ＩａｃＺ遺伝子を含んでいるブラスミ　ドｐｃＢ２６７（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９８７．　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｉ＋ｏ１．、　１５３．　４５２−４６１）をＥｃｏＯ１０９Ｉで直鎖化し、前文に述べたような方法で末端を平滑化し、ＢａｍＨＩリンカ−にューイングランド・バイオラプス社、＃　１０２１）に連結し、ｐＣＫ５２を得た。

ヌクレアーゼ遺伝子（口ｕｃ”　、前文の実施例に記述したような、リーダー配列を欠いたヌクレアーゼ遺伝子）を含んでいるプラスミドｐｓＭ１０８８を同様に処理した。すなわち、旧ｎｄＩ［［およびＥｃｏＲ１部位を続いて平滑末端化し、前述のＢａｌ１ｌ）ｌ　Ｉリンカ−に連結し、各々ｐＣＫ５３およびｐＣＫ５９を得た。

以下のものをｐｃに３７のＢｇ１１１部位へ挿入した。

Ｂ）ｌａｃＺ遺伝子を含んでいる、ｐＣＫ５２の約３０００塩基対のＢｇｌＩ［ −Ｂａ＋ｎＨｎフラグメントを、ＢｇｌＩＩ部位がｐＣＫ３７のｓｐｈ部位に対して最も遠くなるように挿入し、ｐｃＫ５６を得た。

ｂ）ヌクレアーゼ遺伝子を含んでいる、ｐＣＫ５９の約１１００塩基対のＢａｍＨｎフラグメントを、その内部のＥｃｏＲＶ部位がｐＣに３７のＳｐｈ１部位に対して遠くなるように挿入し、ｐＫ６３を得た。

ｃ）　ｇｅｆ遺伝子を含んでいる、プラスミドｐＨ８８４からの約４００塩基対のＢａｍＨｎフラグメントを、フラグメントのＥｃｏＲＩ部位がｐＣＫ３７のＳｐｈ　ｒ部位に対して遠くなるよう挿入し、ｐＣに３６を得た（図８）。

ｐ）ＩＢ８４は、ＢａｍＨＩリンカ−にューイングランド・バイオラプス社＃　１０２１）をプラスミドｐＬＫＰ１１８　（Ｐｏｕｌｓｅｎら、１９８９．　Ｍｏ１ｅｃ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｆ、。

３、１４６３−１４７２）のＥｃｏＲ１部位の平滑末端に挿入して作製した。

ｄ）なしくすなわちｐＣＫ３７そのもの）これらの４つのプラスミドを基本的なプラスミドとして、組換えカセットの構築（致死機能かまたは指標遺伝子を含んでいるか、またはマーカーのない、後半部分の５９８塩基対）に用いる。

Ｂ１組換えカセットの集合と組込みプラスミドの作成前文に記した４つの基本的なプラスミドのＸｈｏ　Ｉ　／　Ｓｐｈ　Ｉ断片を、Ｘｈｏ　Ｉおよびｓｐｈ　Ｉで切断したｐｃに７９に導入し、結果としてそれぞれプラスミドｐＣＫ８２．　ｐＣＫ９５．　ｐｃＫ８０およびｐｃＫ８１を得た（図９参照）。

これらのプラスミドから組換えカセットを含んでいるＮｏロフラグメントを、自殺ベクターｐＵＴ−ｍｉｎｉ−Ｔｎ５−ＴｃおよびｐＵＴ−ｍｉｎｉ−Ｔｎ５− Ｋｍ（ｄｅ　Ｌｏｒｅｎｚｏら、１９９０．　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１７２．６５６８−６５７２）の単一のＮｏｔＩ部位に連結し、以下のベクターを得た。

ベクター　ｐＵｃ１８ＮｏＬ　ｐＵＴＴｃ　ｐＴＵＴＫｍＰ−＞　ＤＲ−ＣＩＩＲ−ＤＲ−ｇｅｆ　ｐＣに８０　ｐｃに８４　ｐＣＫ８７Ｐ−＞　ＤＲ−Ｃ＋ｎＲ−ＤＲ−ｐｃＫ８１　ｐＣに８５　ｐＣＫ８８Ｐ−＞　ＤＲ−ＣｍＲ−ＤＲ− ＬａｃＺ　ｐＣＫ８２　ｐＣＫ８６　ｐＣＫ８９Ｐ−＞　ＤＲ−Ｃ＋ｎＲ−ＤＲ −ｎｕｃ”　ｐＣＫ９５　ｐＣＫ９６　ｐＣＫ９７大腸菌Ｋ　１２．　ＭＣ１０００ｒｅｃＡに含まれるプラスミドｐＣＫ８１は、１９９１年７月５日にジャーマン・コレクション・オブ・マイクロオーガニズムス・アンド・セル・カルチャース（ドイツ、ブラウンシュワイク　３３００．マツシェローダー　ベーク１Ｂ）に寄託した。

実施例１Ｏ反復ＤＮＡの長いストレッチのある組換えプラスミドの構築未来の構築物のための、さらに用途の広い道具箱を供する目的で、主なシステムパラメーターである反復の長さの、容易で迅速な修飾を促進するための派生物を作った。長い−続きのｒｒｎＢ−ＤＮＡをｐＣＫ２９およびｐＣＫ７５ベクターに挿入した。ｒｒｎＢの望ましい部位で切断し、必要なら開いたベクターを平滑末端化し、さらに単一のＰｓ口部位での切断の後に、Ｐｓｔ　Ｉ　／　Ｓｍａ　Ｉで開環したｐＣＫ４５またはｐＣＫ４９に、得られた断片を挿入することができる。同様に、ｇｅｆ、　ｎｕｃ”　、および１ａｃＺを含んでいるが、ｒｒｎＢ配列のない一連のプラスミドを作り出した。これらのプラスミドにおいては、希望する長さの反復をｐＫに３５３５から直接に、Ｂｃｌ　Ｉフラグメントを平滑末端化したものとして切り出し、続いてプラスミドに挿入した。

このシステムの前半（直接反復■）のためのプラスミドを得るために、ｐＣＫ２９およびｐＣＫ７５をＢｇｌ　Ｉ［および５ｐｈＩテ開いた。ｐＣＫ２９へは、ｐＫＫ３５３５からの３１９６塩基対のＢｃｌ　Ｉ　／　Ｓｐｈ　ｆフラグメントを挿入し、ｐＣＫ７２を得た。ｐＫＫ３５３５（７）　２５０６塩基対＋７）　Ｂｇｌ　Ｉｆ　／　Ｓｐｈ　Ｉ　７ラグメントをｐＣＫ７５（ｒｒｎＢ配列の一部をすでに含んでいる）に挿入し、ｐＣＫ８３を得た。

以下のフラグメントを、Ｂｇｌ　１１部位で直鎖化したｐｃＫ３０に挿入した（図１Ｏ参照）。

ａ）ｌａｃＺを含んでいるｐＣＫ５２のＢｇｌ　ＩＩ　／ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐｃＫ３０の５ＩＩｌａ　１部位に対してＢｇｌ　ＩＩ部が近くなるように挿入し、ｐｃに７１を得た。

ｂ）　ｎｕｃ”遺伝子を含んでいるｐＣＫ５９のＢａｍＨＩフラグメントを、ｐｃＫ３０のＳｎａ　Ｉ部位に対して内部のＥｃｏＲＶ部位が近くなるように挿入し、　ｐｃＫ７０を得た。

ｃ）　ｇｅｆ遺伝子を含んでいるｐａｌ（８４のＢａｍＨＩフラグメントを、９ＣＫ３０のＳｍａ　１部位に対して内部のＥｃｏＲＩ部位が近くなるように挿入し、ｐＣＫ３２を得た。

ｄ）なしくすなわちｐｃＫ３０自身）。

実施例１１ｐＵＴ−派生物の挿入による異なる種類の株の構築ｐＵＴに基づくベクターの使用により、構築物は事実上いがなるグラム陰性細菌の染色体にも挿入することができ、従って、それは宿主染色体ＤＮＡと共に複製されるため、カセットの安定な維持が達成される。この組込みの特徴は、このシステムを、ベクター／宿主関係の適合性とは無関係にすることである。ｐＣＫ８４からｐＣＫ８９までのプラスミドは、シュードモナス・プチダ、およびシュードモナス・フルオレセンスの染色体にうまく組込まれる。ｐＵＴプラスミドは、複製にｐｉ「タンパク質を必要とする。ｐＵＴプラスミドの複製起点はやはりｐｉｒタンパク質をコードしている広い宿主範囲のＰＲ４プラスミドに由来する。ｐＵＴプラスミドはｐｉｒタンパク質をコードしておらず、従ってこのタンパク質は、もしプラスミドが染色体外に存在しているとすれば、トランスに存在する必要がある。ｐｉ「遺伝子を含んでいるラムダファージ遺伝子が組込まれている大腸菌５１７．１株の派生物を、プラスミドの他の種への接合による伝達のために用いた。適当なプラスミドを含んでいる３１７．１株をＬＢ寒天プレート上で受容株と混合し、混合物を１〜２日間、ラムダファージが溶菌相に入るのを妨げるため３０℃を越えない温度で静置した。

次いで接合完了体を、感受性株（たとえばリファンピシン）および挿入プラスミドのトランスポゾン部分（テトラサイクリンまたはカナマイシン）の選択のためのプレート上で選択した。導入は、接合完了体からのプラスミドＤＮＡ１１本によって確認した。

実施例１２ｐＣＫ組換えプラスミドを用いた予備実験ｐＣＫ８２をＭＣ１００Ｏ（組換えが堪能な、デルタＩａｃＸ７４を含む）に形質転換し、形質転換混合物を、アンピシリン１００μｇ／＋ｎｌおよびＸ−ｇａｌ　５０μｇ、’＋Ｉを含んでいるＬＢ寒天プレート上で画線培養した。数日後、いくつかの青色のコロニーを検出し、さらに予想通りに、組換えシステムが機能していたことを示す青色の扇形コロニーを検出した。

プラスミドｐｃＫ８０からｐＣＫ８２までと、ｐＣＫ７９（対照として）をＭＣ１００Ｏに形質転換し、各々のタイプの一つのコロニーを、ロイシン２ｏｍｇ／Ｌおよびアンピシリン１００μｇ／Ｉｌｌを加えたＡＢＴＧプレートまたはＡＢＴ＋０．５％グリセロールプレート上で画線培養した。ＡＢＴ＋グリセロールプレートでは、ｐｃＫ８０　（ｇｅｆ）を含んでいる細胞は他の三つの林よりもゆっくり増殖した。ＡＢＴＧ上では何ら差が認められなかった。

ｐｃＫ８６およびｐＣＫ８９をシュードモナス・プチダの染色体に組込み、Ｘ− ｇａｌを５０μｇ／１１１含んでいるＬＢプレート上で画線培養すると、宿主細胞は始めは白色のコロニーを形成したが、数日間の培養の後には明らかに青色のコロニーを形成した。６００塩基対が反復しており、宿主細胞染色体へのカセットの組込みの影響は、染色体外に局在するカセットを有する場合と比較して、青色のコロニーと白色の間のより低い比率で示されるように、組換え頻度を有意に低下させる。

実施例１３大腸菌ＪＭ１０９はインビトロジエン社（カリフォルニア州、サンジエゴ）から購入した。黄色ブドウ球菌Ｆｏｇｇｉ株のヌクレアーゼ遺伝子を含んでいるプラスミドｐＦＯＧ４０８はＡ、　Ｍｅｅｋｅｒから贈与された。クローニングベクターであるプラスミドｐＵＨＩ！２４−２は、Ｓ、　Ｍｏｌ　ｉｎから入手した。ＰＣＲ増幅用オリゴヌクレオチドは、ジェノシス社（米国）に注文して合成させた。

Ｂ、ヌクレアーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅プラスミドｐＦＯＧ４０８からのシグナル配列のないヌクレアーゼ遺伝子を、二つのオリゴヌクレオチドブライマー、Ｌ　−５ＮＵＣおよびＲ−３ＮＵＣを用いてＰＣＲ増幅した。プライマーＬ−３ＮＵＣは３７ヌクレオチドの長さであり（５’　−ＧＡＴ　・ＴＡＡ−３”）　５　’末にＢａｍＨＩ　、Ａｃｃ　Ｉｆ、およびＨｐａＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位から成る１１ヌクレオチドの突出部分がある。プライマーＲ−５ＮＵＣは３３ヌクレオチドの長さであり（５’　 −ＧＧＴ　・−ＧＡＣ−３’　）　、ＥｃｏＲｌ、ＨｐａＩ、およびＫｐｎ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位がある。ＰＣ＾増幅は、ＡｍｐＨＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（２，５単位）（パーキン・エルマー・シータス）、各々２００μＭのｄＮＴＰ　（ファルマシア）、ＰＣＲ反応緩衝液（反応緩衝液の１０倍濃度であり、５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｃｐＨ８，９）、５００ａ＋Ｍ　ＫＣＩ、および２５ｍＭＭｇＣＩ　ｔを含む）、および各プライマー０．５μＭを用いて、ＤＮＡサーマルサイクラ−４８０（パーキン・エルマー・シータス）の中で行なった。ＰＣＲ増幅は全部で２５サイクルにわたって行ない、各サイクルは９４℃での１分間の変性、５５℃での１分間のプライマーのアニーリング、および７２℃での１分間のプライマーの伸張から成る。ＰＣＲ増殖に成功した０、　５０７ｋｂのＤＮＡフラグメントを、１％シーケム・アガロースゲル（ＦＭＣ・バイオプロダクツ）で流し、ＥｔＢｒで染色し、Ｕｖトランスイルミネーターで可視化して測定した。

Ｌ　−５ＮＵＣおよびＲ−５ＮＵＣプライマーを用いたＰＣＲ増殖は０．５０７ｋｂの大きさの単一のＤＮＡバンドを産生じ、非特異的なプライミングが起きていないことを示した。上流へ向かうプライマー、Ｌ　−５ＮＵＣは正確に設計し、そのプライマーが遺伝子のシグナル配列の後の、最初のアミノ酸の最初のヌクレオチドをプライムするようにした（前文に定義した配列を参照）。さらに、プライマーの５′末端の１ｌｂｐの突出部分は、希望するヌクレオチドからの遺伝子の合成を確実にする。すなわちＰＣＲ増殖の間のフレームシフト突然変異の可能性が排除される。下流に向かうプライマー、Ｒ−５ＮＵＣは、停止コドンより更に下流で、この遺伝子をコードしている配列の外側のヘアピン構造の可能性のあるところに局在しており、この遺伝子の停止コドンを含むすべてのアミノ酸が完全かつ機能を保ったまま残ることを保証している。

Ｃ１増幅したヌクレアーゼ遺伝子のクローニングスタフィロコッカスのシグナル配列のないヌクレアーゼ遺伝子の増幅したＤＮＡを、Ａｕ５ｕｂｅｌら（１９８７）によって記述されているようにしてＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメントで末端を修復し、平滑末端化した。末端を修復した増幅されたヌクレアーゼ遺伝子を、セントリコン１００マイクロコンセントレータ−（アミコン、マサチューセッツ州）を用いて精製した。　ｐＵ１１８２４−２をＢａｍＨＩで直鎖化し、Ａｕ５ｕｂｅｌら（１９Ｂ？）によって記述されている方法に従って末端修復により平滑末端化し、精製した。クローン化およびクローン化されたＤＮＡの大腸菌ＪＭ１０９への形質転換は、Ａｕ５ｕｂｅｌら（１９８７）によって記述されたようにして行なった。形質転換したクローンを、指示色素としてメチルグリーンを含み、１１あたり４０μｇのアンピシリン、１＊Ｍイソプロピルーβ− Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、１０ｍＭ　ＣａＣ１ｔ、および１　ｍＭ　ＭｇＣ１＊を含んでいるＤＮアーゼテストアガー（ディフコ）プレート上へのレプリカ培養によって、適切なコロニーをスクリーニングした。

指示色を示したコロニーを、制限分析、ＰＣＲ増幅、およびＤＮＡ配列分析によりクローンについて更に調べた。推定されるクローンからのプラスミドＤＮＡをｐＳＮＵＣ−１およびｐＳＮＵＣ−３と名づけ、Ａｕ５ｕｂｅｌら（１９８７）によって記述されているようなアルカリ溶菌法により単離精製した。単離したプラスミドＤＮＡを旧ｎｄｌ［［制限酵素（ＵＳバイオケミカルス）を用いて製造業者に従って消化した。制限酵素で消化したプラスミドＤＮＡを１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、ＥｔＢｒで染色し、Ｕｖトランスイルミネーターで可視化した。ｐＳＮＵＣ−１およびｐＳＮＵＣ−３の両プラスミドにクローン化されたフラグメントのヌクレオチド配列分析を、Ｓａｎｇｅｔのジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７）により、シーフェンス・シーフェンシングキット（ＵＳバイオケミカルス）およびＬ　−５ＮＵＣプライマーを用いて行なった。これらの二つのクローンの特徴を、ヌクレアーゼの誘導および発現について更に明らかにした。またそれらの、アンピシリンＣ４０ｕ　ｇ　／　ＩＩ）　、１０ｍＭ　ＣａＣＩｔ、１　ｍＭ　ＭｇＣＩｔ、および１ｎＶ　ＩＰＴＧを含むかまたは含まないＬＢ寒天プレート上での増殖能について調べた。

形質転換した細胞はまず、アンピシリン４０μｇ／ｎｌを含んでいるＬＢ寒天プレートで選択した。ＤＮアーゼテスト寒天プレート上で指示色の変化を示す二つの推定上のクローンを、アンピシリン、ＣａＣＩｔ。

ＭｇＣｌ　ｔ、およびＩＰＴＧを含んでいるＬＨ寒天上で更に調べた。ｐｓＮＵｃ　−１を含んでいる大腸菌ＪＭ１０９は、ＩＰＴＧを含んでいる寒天プレート上では７２時間の培養の後でも何らの増殖を示さなかった（図１１）。これに対し、ｐＳＮＵＣ−３を運んでいる大腸菌ＪＭ１０９はｌ　ＰＴＧを含んでいる同じタイプの寒天プレート上で、阻害された増殖を示した（図１２）。

どちらの場合にも、対照となるＬＢ寒天プレートはＣａＣＩ　＊およびＭｇＣＩ　ｓを含んでいるがＩＰＴＧを含まず、１８〜２４時間の間に完全な増殖を示した。この実験においては、両タイプのプレート共に可能な限り植え込み数を等しく保っており、合計７回にわたって繰り返すたびに一致した結果を示した。

プラスミド１）ＳＮＵＣ−１およびｐＳＮＵＣ−３の旧ｎｄＩ［［を用いた制限分析は、約０．２１９ｋｂおよび４．０ｋｂの予期されたバンドを作り出した（図１３）。ヌクレアーゼをコードしている遺伝子には旧ｎｄｌｎ制限部位が一つあり、ベクター上に一つであるため、ベクター上のヌクレアーゼ遺伝子の正しい方向性を決定することができる。

ｐｓＮＵｃ−１およびｐＳＮＵＣ−３両プラスミドの５′末端にクローン化されているフラグメントの最初の４０塩基対のヌクレオチド分析は、ヌクレアーゼ遺伝子が正しい方向性を以って存在していることを確証した。

Ｄ、ｐｓＮＵｃ−１およびｐＳＮＵＣ−３（７）誘導大腸菌ＪＭ１０９　（ｐｓＮＵｃ　−１）および大腸菌ＪＭ１０９　（ｐｓＮＵｃ　−３）を、１０ｍＭ　ＣａＣＩｚおよびｌ　ｍＭＭｇＣＩｚを含んでいるＬＢジブロス中、３７℃で１時間、ｌｏｏｒｐｍで振とう培養し、光学密度（ＯＤ＊　ｓ　ｅ）が０．５−０．７に達して滅菌した１　ｍＶ　ＩＰＴＧ溶液を誘導のため添加する時点まで増殖させた。ＩＰＴＧの添加の前後にわたり、１時間ごとに０Ｄｌｏを記録し、培養物の一部をリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で連続的に希釈して、１０ｍＭＣａＣｌ１およびｌ　ｗ＋Ｍ　ＭｇＣＩｔを含むＬＢ寒天プレート上に播種し、生存可能なプレート数を測定した。各プラスミド構築物の対照培養物を、ヌクレアーゼ遺伝子の発現および致死効果の比較のために保持した。

Ｅ、誘導に続くクローン化したヌクレアーゼ遺伝子の発現大腸菌ＪＭ１０９　（ｐＳＮＵＣ−１）および大腸菌ＪＭ１０９　（ｐｓＮＵｃ　−３）を、先に記述したようにＬＢジブロス中対数期の中ごろ（ＯＤ４ｓｓで０．４〜０．５）まで増殖させ、誘導のためｌ　ＰＴＧを加えた。誘導は２０分間行ない、細胞を遠心し、Ａｕ５ｕｂｅｌら（１９８７）に記述されているような、ミニプロティン■ ゲルシステム（バイオラッド）を用いた５Ｏ５−ＰＡＧＥによる全タンパク質の分析用に調製した。ＰＡＧＥで分離したタンパク質をクーマシーブルーで染色した。誘導していない大腸菌ＪＭ１０８　（ｐｓＮＵｃ−１）および（ｐｓＮＵｃ　−３）の培養物、大腸菌ＡＲ１２０（ｐＦＯＧ４０８）　、および大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＨＥ２４−２　）の培養物を対照として使用した。

ｐＳＮＵＣ−］およびｐＳＮＵＣ−３においてクローン化したヌクレアーゼ遺伝子の性質を更に明らかにするため、ウサギ抗体（＾、Ｍｅｅｋｅｒからの寄贈）を用いたウェスタンプロットを行なった。ＰＡＧＥ！からのタンパク質を、ミニ・トランスプロットシステム（バイオラッド）を用いてニトロセルロース膜（ミリボア）に移した。１　：　１５，０００に希釈したウサギ抗体を用い、ビオチニル化したヤギの抗ウサギ免疫グロブリンおよびストレブタビジン・ペルオキシダーゼ（フィッシャ−・バイオチク）で検出した。発色は、ペルオキシダーゼの基質中でのインキュベートにより、４−クロロ−１−ナフトールにより行なった。適当な対照をこの実験において調べた。

大腸菌ＪＭ１０９　（ｐｓＮｕｃ−１）のＩＰＴＧによる誘導は、ＯＤｌ、。の表示度数および生存可能なプレート数によって測定されたように、２〜７時間の間に細胞数の有意な減少を示した（図１４ａおよび１４ｂ）。大腸菌ＪＭ１０９　（ｐｓＮＵｃ　−１）の１ｍｌあたりの細胞数は、生存可能なプレート数によって測定すると、０〜７時間の間に２Ｘ１０’から１．５Ｘ１０’へ減少した。

これに対し、大腸菌１１０９（ｐｓＵ　−３）をＩＰＴＧで誘導した場合には、ＯＤ４．。の測定および生存可能な細胞数によって測定すると、誘導していない対照に比較して、ゆっくりした細胞数の増加を明らかに示した（図１５ａおよび１５ｂ）。全細胞数は、０〜７時間の間に１！１１あたり、誘導していない対照が３Ｘ１０＠から２Ｘ１０１１１であるのに対し、同じ時間に３Ｘ１０’から７Ｘ１０’へ増加した。これらの結果から、ｐＳＮｕｃ−１に比較した場合の、誘導に対するプラスミドｐＳＮＵＣ−３の低い致死効果が、ＰＣＲによる［ｌＮＡ増幅の過程におけるヌクレオチド（または複数のヌクレオチド）の誤った取込みによって生じる突然変異によるものと予想することができる。しかしながら、これらの二つのクローンのどちらが、（もし両方ともでなければ）変化したヌクレオチド配列を有するのかは明らかでない。

指示色素としてメチルグリーンを含んでいるＤＮアーゼテスト寒天上での、プラスミド９５ＮＵＣ−１およびｐＳＮＵＣ−３においてクローン化したヌクレアーゼ遺伝子の表現型の発現は、予期した色の変化を示した。ｐＳＮＵＣ−１はｐＳＮＵＣ−３よりも速い色の変化を示した。対照プラスミドベクターである９３Ｍ１１２８は同じ寒天プレート上で何らの色の変化も示さなかったが、プラスミドｐＦＯＧ４０８は有意な色変化を示した。

実施例１４全タンパク質分析のためのＰＡＧＥゲルは、ＩＰＴＧで誘導したｐｓＮｕｃ　− １およびｐＳＮＵＣ−３プラスミドに関しておよそ１７．８ｋＤ程度の大きさのかすかなバンドを示した。誘導していない対照およびｐＵ）ＩＥ２４−２はかかるバンドを示さなかった（図１６）。ヌクレアーゼは細胞外へ分泌されるタンパク質であるため、ｐＦＯＧ４８プラスミドを運んでいる大腸菌株は、ゲル内に非常に弱いバンドを示した。プラスミドｐｓＮＵｃ−１およびｐＳＮＬＩＣ−３におけるクローン化したヌクレアーゼ遺伝子の発現を確認するため、ウェスタンプロットを行なった。ウェスタンプロットでは、プラスミドｐＳＮＵＣ−１およびｐＳＮＵＣ−３を運んでいる誘導した大腸菌株、およびｐＦＯＧ４０８プラスミドを運んでいる大腸菌ＡＲ１２０株から、１７．８ｋＤのはっきりしたタンパク質のバンドが明らかになった（図１７）。誘導していない培養物、および対照プラスミドｐｓＭ１１２８は、いかなるバンドも示さなかった。もう一つの約２０ｋＤの大きさの非特異的なバンドがすべての試料に認められ、二次抗体に対する非特異的な抗原反応であると考えられる。この実験は、誘導に際しｐＳＮＵＣ− １およびｐＳＮＵＣ−３両プラスミドによってヌクレアーゼが産生されることを示唆した。ｐＳＮＵＣ−Ｓプラスミドに関する低い致死効果は、変化したヌクレオチド配列によるもので、それによってタンパク質の構造および基質に対する機能が変わったと考えることができる。その代わりとして、プラスミドｐＳＮＵＣ −１についてその致死効力が相対的に高いことがあり侵る。両クローンに関する完全なヌクレオチド配列の分析は、この疑問を解くことができ、またこの酵素を更に効果的にすることのできるヌクレオチド配を遠心によって沈殿し、上清（ライゼート）をＥＬＩＳＡ分析に用いた。

スタフィロコッカスのシグナル配列のないヌクレアーゼ遺伝子５ｎｕｃをＰＣＲで増幅し、大腸菌ＪＭ１０９において、実施例１３で記述した各試料のアリコートを分光光度計による測定にかけ、全タンパク質濃度を測定した。ＥＬＩＳＡは、各ライゼートからの等量の全細胞タンパク質を用いて行なった。典型的には、種々の試料からのライゼートｌＯから５５μｍ　（各ライゼートの濃度による）をマイクロタイタ数期まで（ＯＤ４＆。が０．１２〜０．１５）増殖させ、その時点で１　ｍＶ　ＩＰＴＧ（最終濃度）を培養物に加えた。ｌ　ＰＴＧを用いた誘導を、３７℃で５分間行ない、細胞を遠心し、リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で２回洗浄した。細胞をブロスに再浮遊し、３７℃で更に３時間インキュベートした。誘導の前および５分後に、各培養物のアリコート１Ｉｌｌを集めた。同様にアリコートを遠心により集め、リン酸緩衝液（＋）Ｈ７，２）で２回洗浄し、音波処理をして全細胞タンパク質を放出させた。１）ＳＮＵＣ−１またはｐＳＮＵＣ−３のない大腸菌ＪＭ１０９の培養物をネガティブコントロールとして用いた。

全細胞タンパク質は前文に記述したように、音波粉砕機を用いて細胞を破砕することにより放出した。細胞内で発現されたスタフィロコッカスのヌクレアーゼのｆ！ＬＩＳＡ分析も前文に記述したように行なった。

前文に定義したような転写の阻害の数の、ｐＳＮＵＣ−１およびｐｓＮＵｃ−３によってコードされているスタフィロコッカスのヌクレアーゼタンパク質の量は、ＩＰＴＧを用いた誘導の後には有意な量であることがわかった。Ｉ）ＳＮＵＣ −１およびｐＳＮＵＣ−３についてのデータを各々表５および表６に要約した。

スタフィロコッカスヌクレアーゼの発現は、誘導後の最初の３０分間は、誘導の前に検出された量と比べて約２倍に増加した。ヌクレアーゼ酵素の活性は、リファンピシン処理後の最初の２時間の間残っていた。リファンピシン処理後２時間と３時間の間に（ＩＰＴＧで誘導してから２．５時間および３．５時間）、ヌクレアーゼ活性は有意に低下した。この実験から、スタフィロコッカスのヌクレアーゼは転写の阻害微少なくとも１．５時間は細胞内に安定していると結論することができる。

処　理　時間（時）　ＥＬＩＳＡ測定値１、　ＯＯ，６６６１、５０，６８５２、ＯＯ，６７５２、５０，５４２３、ＯＯ，４８Ｂ３、５　０．４０７ネガテイブコントロール　１．０　０．２７６処　理　時間（時）　ＥＬＩＳＡ測定値１、０　０．５５７１、５　０．５９３２、　ＯＯ，５５５２、５０，４４３３、００，４２７３、５０，３７８ネガテイブコントロール　１．０　０．２５８ＩＰＴＧで誘導した後短時間に（５分間）、細胞を遠心し、リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で洗浄し、栄養培地中で１５０分間増殖させて細胞における５ＮＵＣの安定性を測定した。

データの要約を表７および表８に示す。誘導後、５ＮＵＣの量は少なくとも３倍に増加した。ＥＬＩＳＡ分析によって測定したところでは、５ＮＵＣタンパク質はｐＳＮＵＣ−１においては誘導後１．５時間から２時間（５分と１２５分の間）は安定であり、ｐＳＮＵＣ−３においては誘導後１時間から１．５時間（５分と９５分の間）は安定であることがわかった。誘導物質（ＩＰＴＧ）の除去の後、ｐＳＮＵＣ−ｉでは１２５分後に１、　ｐｓＮＵｃ−３では９５分後に、５ＮＵＣ活性が有意に減少した。

処　理　時間（分）　［！ＬＩＳＡ測定値３５　０、５６０６５　０、５４３９５　０、５０１１２５　０、４５６１５５　０、３２９ネガテイブコントロール　３５　０．２０４表８．誘導５分後にＩＰＴＧを除去した後の、ｐｓＮＵｃ−３によって細胞処　理　時間（分）　ＥＬＩＳＡ測定値３５　０、４５８６５　０、４３０９５０゜３７５１２５　０、２６９１５５　０．２１０ネガテイブコントロール　３５　０．１６４実施例１５有害な加水分解活性のある酵素に基づく誘導可能な細胞機能を制限する機能を評価するためのモデルプラスミドを、大腸菌において構築し実験した。このシステムの活性成分は、セラチア・リケファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌ１ｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）株から得た細胞外ホスホリパーゼであり、ｐｈｌＡ遺伝子によりコードされている。プラスミドはｐＣＨ６２４（Ｂｏｒｏｓ　１９８４．　Ｇｅｎｅ、　３０．２５７−２６０）の派生物であるベクターｐＭＧ３００（ＧｉｖｓｋｏｖおよびＭｏ１ｉｎ　１９８Ｂ、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１７０．５８５５−５８６２）に基づいている。９ＭＧ３００　（図１８）はラムダファージの温度誘導性リプレッサープロモーターｃ１８５７／ｌ）Ｒを運ぶ。ｐｈｌＡ遺伝子はこのプロモーターの下流に挿入されており、ｐｈｌＡの誘導は増殖培地の温度を３０℃から４１℃に上昇させることにより成就される。誘導の結果、細胞は死プラスミドはアンピシリンに対する耐性を与える。ｐｈｌＡ遺伝子は、宿主範囲の広いプラスミドｐＶＬＴ３３のリプレッサー／プロモーターシステムであるｌａｃ　Ｉ″’／ｐｔａｃの下流に挿入されている。このプラスミドは接合によりグラム陰性細菌に伝達することができる。

Ａ、モデルプラスミドｐＭＧ３２３および９ＭＧ３１７の構築プラスミドｐＭＧ３００の構築は、ＧｉｖｓｋｏｖおよびＭｏｌ　ｉｎ、　１９８８．　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１７０．５８５５−５８６２により記載されている。有毒な加水分解活性のあるホスホリパーゼをコードしている遺伝子ｐｈｌＡは、ベクターｐＮＵ１２１　（Ｎｉｅｌｓｓｏｎら、１９８３．　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、１１．　８０１９−８０３０）の上に構築されており、セラチア・リケファシエンスのシーンバンクから入手した。ホスホリパーゼオペロンの遺伝子ｐｈｌＡおよびｐｈｌＢを運んでいる３２００塩基対の［！ｃｏＲｉ制限フラグメントを精製し、エキソヌクレアーゼＢａ１３１を用いてＩｎ　ＶｉｔｒＯで消化した。消化したＤＮＡを９ＭＧ３００のＳｍａ　Ｉ制限部位に連結した。ホスホリパーゼの発現が、温度で誘導することのできるプロモーターシステムによって支配される大腸菌のクローンを単離した。二つのプラスミドｐＭＧ３１７および９ＭＧ３２３はこの方法によって得たものである（図１８）。これらの二つのプラスミドおよびホスホリパーゼオペロンのＤＮＡ配列は、ＧｉｖｓｋｏｖおよびＭｏ１ｉｎ　１９８８．　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１７０．５８５５−５８６２によって記載されている。

プラスミドｐＭＧ３１７を持っている大腸菌株Ｃ３Ｈ５０を、アンピシリン１００μｇ／＋＋＋１および０．２％グルコースを加えた５０ｍ１のＬＢ培地中で、３００ｍ１の振とうしているエレンマイヤーフラスコにて、３０℃の温度において増殖させた。ＯＤ、ｔｏが０．２となった時点で培養物を０Ｄｔｉ。

が０．０５となるよう希釈し、００．１゜が０．２になるまで増殖を続けた。

培養物を二分し、一方は３０℃で培養を続け、それに対し他方は増殖温度を４１ ℃にシフトした。温度シフトの後の異なる時間に培養物の試料を採り、０．９％ＮａＣＩで希釈して、アンピシリン１００μｇ／ｙａｌを加えたＬＢ寒天プレートに播種した。３０℃で一晩インキユベートした後、ＬＢプレート上のコロニーの数（ＣＦＵ／＋＋＋ｌ）を数えることにより、培養物の生育可能な数を測定した。培養物におけるＰｈｌ”細胞の割合は、ホスホリパーゼの指示プレート、すなわち１％卵黄およびアンピシリン１００μｇ／＋ａｌを加えたＬＢ寒天を用いたプレートにレプリカ培養し、３０℃で一晩インキユベートし、更に４１℃で２時間インキュベートすることによって測定した（図１９）。

実験結果を次の表に要約する。

４１’Ｃにおける培養時間（分）　ＯＤ＋ｓ＊　ＣＦＵ／ｍｌ　％Ｐｈｌ＋０　０．４５０　１．８Ｘ１０’　１００１５　０、５３０　５００　７０３０　０、２８０　＜　１００　２６０　０、１８０　＜　１００　１１２０　０．１４５　＜１００　０１８０　０、１６０　８００　０２４０　０、１６０　４．３Ｘ　１０”　０１５分後の致死効果：　４　ＸＩＯ ’　、３０分後の致死効果：＞２ＸｌＯ’。

３０℃における培養時間（分）００．、。　ＣＦＵ／ｗ＋Ｉ　％Ｐｈｌ＋０　０．４５０　１．８ｘｌＯ’　１００！２０　３．００　１．２ｘ　１０”　１００上記の結果をまた図１９に図解した。

Ｂ、モデルプラスミドｐＭＧ３２３／３３の構築プラスミドｐＭＧ３２３をＢａｍＨＩおよびＳｃａ　Ｉで消化した。ｐＶＬＴ３３を）１ｉｎｄｌＩ［で消化し、フレノウポリメラーゼで処理して平滑末端を作り、ＢａｍＨＩで消化し、９ＭＧ３２３から得た、精製したＢａｍ）ｌ　Ｉ　−Ｓｅａ　Ｉ制限フラグメントに連結し、ＩＰＴＧの添加によってｐｈｌＡの産生を誘導することのできるプラスミドｐＭＧ３２３／３３　（図２０）を生じた。このプラスミドはカナマイシンに対する耐性を与え、接合によって他の細菌へ伝達される。

実施例１６部位特異的組換えを介する推計学的に調節された遺伝子誘導のためのプラスミドの構築宿主範囲の広いプラスミドＲＰ４の変形システムは、複製の間のプラスミドの多量体変形にとって基本的なものである（Ｇｒｉｎｌｅｒら、１９８９、　Ｐｌａｓｍｉｄ、　２２．２０３−２１４）　、関係する成分であるリシルベース遺伝子（ｐａｒＡ）　、およびこの部位特異的組換えのための部位（ｍｒｓ）は先にクローン化されている（Ｇｅｒｌｉｔｚら、１９９０　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７２゜６１９４−６２０３；　Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９０．　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７２．　６２０４−６２１６）。もし２つの＋ｎｒｓ部位がまっすぐな方向に位置していれば、介在している配列はｐａｒＡをトランスに配することによって高い頻度で欠失させることができる（Ｒｏｂｅｒｔｓら、前記）。この反応を図２１に概説する。

Ａ、リシルベースを介する組換えを実験するためのモデルシステムまっすぐな方向に位置している２つのｔｒｓ部位を、実施例９に記述したｐＣＫ４６およびｐＣに３０に基づいて構築した。ｐＭＲ３１９Ａ　（Ｅｂｅｒｌら、１９９２ａ、　Ｍｏ１ｅｃ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、印刷中）をＮｄｅ　Ｉで直鎖化し、ＤＮＡポリメラーゼ■の大きいサブユニット（フレノウ断片）で充填した。この末端を平滑化したフラグメントを次いで５ａｌＩで切断し、ｍｒｓ部位を含んでいる小さい方のフラグメントを、Ｓｍａｌおよび５ａｌＩで切断したｐＣＫ４６に連結し、ｐｃＫ１４５を得た。

９ＭＲ５１９ＡをＢａｍＨＩおよびｓｐｈ　Ｉで切断した。小さなフラグメントを、Ｂｇｌ　ＩＩおよびＳｐｈ　ｘで切断したｐＣに３０に挿入し、ｐｃＫ１４６を得た。

トランスポゾンＴｎ５を含んでいるプラスミド、９３Ｍ８９１を旧ｎｄｌ［［およびＳ＋ｎａ　Ｉで切断し、カナマイシン（ｎｐｔ）遺伝子を含んでいる約７０００塩基対のフラグメントを前記のようにして平滑末端化した。このフラグメントを、Ｓｍａ　Ｉで開いたｐｃＫ１４６に挿入した。結果として得られたプラスミドをｐｃＫ１５３およびｐＣに１５４と名づけた。ｐｃＫ１５３はＸｈｏ　Ｉ部位に対して近くなるように作り直した５ＩＩｌａ　１部位を有する。ｐｃＫ１５４においてはＴｎ５フラグメントは逆向きになっている。ｐｃＫ１５５　（図２２参照）はｐｃＫ１５３の約１５００塩基対のＸｈｏｌ−）１ｉｎｄｌｌｌフラグメントを、Ｘｈｏ　Ｉおよび旧ｎｄｌｌ［で直鎖化したｐｃＫ１４５に挿入して作成した。

リシルベースは９ＧＭＡ７０からクローン化した（Ｅｂｅｒｌら、　１９９２ｂ、準備中）。ｐＧＭＡ７０からのプロモーターのないｐａｒＡを、約１１００塩基対のＥｃｏＲｌ−ＨｌｎｄｌＩ［フラグメントとして切り出し、ＥｃｏＲＩ　 −ＨｌｎｄＩ［［で切断したｐＵＨＥ２４−１　（Ｌａｎｚｅｒら、１９８８．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５゜８９７３−８９７７）に挿入し、ｐｃＫ１５１を得た（図２２）。このプラスミドは、合成したＩａｃプロモーターｐＡＩ１０４１０３の支配下にあるｐａｒＡを含む。

リシルベースの発現は、ＩａｃリプレッサーであるＩａｃ　Ｉによって抑制することができ、このプラスミドを含んでいる培養物にＩＰＴＧ　（イソプロピル− β−Ｄ−チオガラクトシド）を加えることによって誘導することができる。このプラスミドは、精製を目的とするりゾルベースタンパク質の過剰発現に用いることができる。

ｐａｒＡ遺伝子は同様に、前文に記述したＥｃｏＲＩ−）１ｉｎｄｌｌ［フラグメントとしてｐＬＢＪ６５（Ｂｏｇｏ　Ｊｅｎｓｅｎら、１９９２、準備中）に移すことができる。結果として得られたプラスミド９ＣＫ１５８　（図２２）は、　ｐＡ１１０４／０３プロモーターとｌａｃ１ｇｌリプレッサー（Ｍｕｌｌｅｒ−４１１１１，１９７５゜Ｐｒｏｇ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ、　３０．２２７−２５２）との支配下にあるリシルベースをそれ自身のプロモーターと共に含んでいる。ｐＣＫ１５８からは、　Ｉａｃリプレッサーとプロモーターを伴うリシルベースとを含んでいる完全なカセットを、ｐＡｃＹｃ１８４（Ｃｈａｎｇら、１９７Ｂ、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ、１３４．１１４１−１１５６）のＥｃｏＲＶへ充填されるＮ０ｔｌフラグメントとして移し、結果として挿入部分の方向性が異なるｐＣＫ１５１およびｐＣＫ１６８を得た（図２２）。

ｐＣＫ１５１においてリシルベース遺伝子は、プラスミドの起点に最も近づくように局在している。

相同組み換え能のない（ｒｅｃＡ）株）ＩＢＩＯＩ　（Ｂｏｙｅｒら、１９６９．　Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　４１．４５９）を、ｐｃＫ１５５で形質転換し、カナマイシン（ｋａｎ）　５０μｇ／１１１またはアンピシリン（ａｍｐ）１００μｇ１０１のいずれかを加えたＬＢ寒天プレート上に播種した。ｐＣＫ　１５５は、アンピシリン耐性を与えるｂｌａ遺伝子を２つのｍｒｓ部位の外側に含み、さらにカナマイシン耐性を与えるｎｐｔ遺伝子を２つのｍｒｓ部位の間に含んでいる（図２３）。２つのｍｒｓ部位の間のいかなる相同組換えも、アンピシリンプレートに比べてカナマイシンプレートでのより低いコロニー形成率として同定されるだろう。

コロニー形成率には何ら有意な差は認められなかった。

ｐＬＥ０２６　（ＲＰ４のｐａｒ領域全体を含んでいるプラスミド）　（Ｅｂｅｒｌら、１９９２ａ、　Ｍｏ１ｅｃ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、印刷中）を、続いてｐＣＫ１５５を含んでいる株に形質転換し、前文に定義したような２つのタイプのプレートに更に、クロラムフェニコール耐性遺伝子を与えるｃａｔ遺伝子を含んでいるｐＬＥＯ２６を選択するために、クロラムフェニコール（ｃａｍ）を５０μｇ加えて播種した。この形質転換は約２０００のｃａｍおよびａｍｐ耐性形質転換体と４つのｃａｉ＋およびｋａｎ耐性形質転換体を生じ、細胞内で組換えが起きたことが示唆される。

ｐｃＫ１５３を、対照実験においてｐｃＫ１５５の代わりに用いた。この事に関しては何ら差異が見られなかった。［）ＣＫ１５５／９ＬＥＯ２６のｌｏコのクローンからＢｉｒｎｂｏｉｍら１９７９．　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　７．１５１３−１５２３）によって記述されている方法に従ってプラスミドを単離した。プラスミドはＨＢＩＯＩを通すことにより、再形質転換およびその後のプラスミドの調製によって分離した。制限酵素地図を作成してプラスミドを調べた。ｌＯコのプラスミドすべてにおいて制限パターンは、２つのｍｒｓ部位の間に部位特異的組換えを受けるプラスミドに予想されるものど似かよっている。１つのクローンを３ａｎｇｅｒら、１９７フ（ＰｒＯＣ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７４．５４６３−５４６７）、による配列決定法により、シーフェンシングキット（ユナイテッド・ステイッ・バイオケミカル）の供給者によって記述されているようなプラスミド配列決定のための変更とＭ１３万能万能法定プライマーとを用いて更に調べた。

結果として得られた配列（図２４）は、完全な部位特異組換えが起きたことを示した（ｐｃＫ１５５の制限地図参照、図２３）。Ｉｎ　ｖｌｖｏで欠失を受けたｐｃＫ１５５の派生物をｐｃＫ１５５デルタと名づけた。

ｐｃＫ１５５を含んでいる株をｐｃＫ１６８で形質転換し、４つの異なるプレートに播種した。

プレートタイプ　形質転換体数５０μｇ　ｃａｍ＋　＋００μｇ　ａｍｐ、　ＩＰＴＧなし　約１０００５０μ ｇ　ｃａ＋ｎ＋　１００μｇ　ａｍｐ、　２ＥＩＭ　ＩＰＴＧ　約１０００５０ μｇ　ｃａ＋ｎ＋　５０μｇ　ｋａｎ、　ＩＰＴＧなし　約５００５０μｇ　ｃａｍ＋　５０μｇ　ｋａｎ１２ｍＭ　ＩＰＴＧ　３誘導していない細胞における落ち込みは、リシルベース遺伝子を支配しているプロモーターの読み過ごしによるもので、そによって細胞内でバックグラウンドレベルのりゾルベースタンパク質が産生され、低量の組換えが可能になったとすることができる。

Ｃ，ｐＣに１５５の増殖実験ｐｃＫ１６５を含んでいる株をｐｃＫ１５５またはｐｃＫ１５３で形質転換し、カナマイシンおよびクロラムフェニコール耐性のコロニーを選んだ。

各々のタイプの株の再画線培養によるコロニーから、１０ｍ１のＬＢジブロス中培養物を採り、ｋａｎ　５０　Ｂ　ｇ　／　ｍｌおよびｃａｔ　５０μｇ　／ｍｌの存在下で一晩増殖させた。これらの培養物を、ｃａ＋ｎ　５０μＩ／＋ｏｌおよびａｍｐ　１００μｇ／＋ｎｌを加えたＬＢグロスを入れた５０ｍ１のフラスコに、ＯＤ４．。が０．０５となるように播種した。ＯＤ４．。が０．５となった時点で、培養物を同じタイプの新鮮な培地に希釈してＯＤ４．。を０，０５とした。

ＯＤを測定して培養物が平衡増殖をしていることを確認し、ＯＤがおよそ０．５となった時点で培養物を分割し、試料を採り、それぞれのプレート上での生存可能なカウントを測定した＝５０μｇ／Ｉｎｌ　ｋａｎ＋５０Ｂｇ／ｍｌｃａｍ、および１００μｇ／ｌｎｌ　ａｍｐ＋５０μｇ／ｍｌ　Ｃａ１ｌｌａ　ａｍｐ＋ｃａｍを含んでいるプレート上のカウントはプラスミドを運んでいる生存可能な細胞数を表し、それに対しｋａｎ　＋　ｃａｍプレート上のカウントは（少なくともｌコピーの）そのままの、すなわち組換えによる欠失のないｎｐｔ遺伝子のコピーを有する生存可能な細胞数を表す。

５分後に、各々の培養物の半分にＩ　ＰＴＧを加え、最終濃度を２＋ｎＭとした。更に５分後、もう１回の生存可能なカウント用試料を採った。

時間間隔をあけて試料を採り、−晩増殖した後にも試料を採った。

時間を関数とした生存可能なカウントを図２５に示す。

この実験は、プラスミドｐｃＫ１６８およびｐｃＫ１５５を含んでいる細胞において、リシルベース遺伝子の誘導に続いて、カナマイシン耐性細胞の生存可能なカウントに、誘導していない培養物に比較して５００倍の落ち込みが生じていることを示した。落ち込みは、誘導の５分後にすでに顕著である。更なる６０分の後では、誘導した培養物と誘導していない培養物との間の生存可能なカウントの差は５０００倍である。この時点を過ぎると、誘導された培養物中のカナマイシン耐性細胞は、誘導しいいない培養物中のカナマイシン耐性細胞と同じ速度で出現してくる。これはりゾルベース遺伝子かプロモーターのいずれか、あるいはｐｃＫ１５５における変形（ｒｅｓ）部位の突然変異体によるはずであり、どちらも細胞をカナマイシン遺伝子の欠失不能にする。どの時点でも、カナマイシン存在下に生存可能なカウントは、アンピシリンプレート上での誘導していない培養物の生存可能なカウントのわずかｌパーセントにすぎない。このことの説明は、リシルベースまたは２つのｒｅｓ部位の間の相同組換えを調節しているプロモーターの漏出変異とすることができる。誘導した培養物におけるアンピシリンで生存可能なカウントは、誘導していないそれを厳密にたどっており、ＩＰＴＧおよび変形反応それ自体がカナマイシンで生存可能なカウントの観察された落ち込みを負うものではないことを示唆している。このことは、対照培養物（ｐｃＫ１６８＋　ｐｃＫ１５３）の生存可能なカウントが、カナマイシンおよびアンピシリンの両者の上で、実験を通じて基本的に等しいという観察により確認される。

この実験の結果は、このｉｎ　ｖｒｖｏの構成においてリシルベースの作用が効果的であり、非常に速いということである。リシルベースを支配しているプロモーターは、誘導していない細胞におけるこのタンパク質のある程度の希望していない発現およびカナマイシン遺伝子の付随した欠失を負うものであろう。培養物におけるごく一部の細胞は、カナマイシン遺伝子の欠失ができず、ＩＰＴＧおよびカナマイシン存在下で正常に増殖した。

Ｄ、ＤＮＡ基質としてｐｃＫ１５５上の精製したりゾルベースを用いた１ｎｖｉｔｒｏの実験ｐｃＫ１５１をもっているＨＢＩＯＩの培養物がらりゾルベースを精製した。

細胞を２５０ｍ１のＬＢ中でＯＤｉ書。が０゜８から１．０になるまで増殖させ、続いてＩ　ｍＶ　ＩＰＴＧにより誘導し、更に４時間振とうした。細胞を集め、７．５ｍ１（７）緩衝液Ｃ（２５＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，０，０，ＩＩＩＭ　ＨＤＴＡ、　５０ＭＭベンズアミジン、　１００μＭ　ＰＭＳＦＳｌ　１１Ｍ　２−メルカプトエタノール、０．２％Ｂｒ１Ｊ、　２００＋ｎＭ　ＮａＣＩ）に再浮遊した。細胞を音波処理により開いた。ライゼートを４℃で３６０００ｒｐｗ＋で４５分間超遠心した。上清を緩衝液Ｂ（緩衝液Ａに最終濃度２５０ｍＭのＮａＣｌを加えたもの）に対して透析した。結果として得られたベレットを緩衝液Ａで洗浄し、続いて０．５＋ｏｌの緩衝液Ｃ（緩衝液Ａに最終濃度Ｉ　ＭのＮａＣ１を加えたもの）に溶かした。この溶液をおよそ５０μｍに濃縮した。

ｐｃＫ１５５を２回の塩化セシウム密度勾配遠心法（Ｍａｎｌａｔｌｓら、１９８２「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）Ｊコールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−出版、ニューヨーク〕により調製した。ＤＮＡの濃度は２６０ｒ＋ｍのＵＶ吸光度で測定し、タンパク濃度はＢｒａｄｆｏｒｄ。

１９７６　（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７２．２４８−２５４）の方法で測定した。

変形分析は反応容積ｌＯμｌにおけるｌＪＯｎｇのプラスζドＤＮＡを用いて行ナツタ。反応緩衝液ノ最終濃度ハ１５０ｄ　ＫＣＩ、１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ＋、３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，５、および１１Ｍ１．４−ジチオスレイトール（ＤＴＰ）であった。反応は６５℃ｌＯ分間の熱失活により停止した。試料をＮｄｅ　Ｉを用い、最終容積３０μｌにて消化することにより分析した。

上記の反応混合液に、酵素緩衝液および酵素を加え、得られた混合液を３７℃で１時間インキュベートした。試料を０．７％アガロースゲル上で、２Ｖ／ｃ＋ｎで一晩流した。ゲルをＥｔＢｒで染色し、ＵＶ光線を用いてポラロイドネガフィルムに撮影した。高滓スキャナー、モデルＣ５−９３０Ｖ−０５でネガを走査した。フラグメントの大きさに修正する際には、各ピークの下の面積を、ゲル上の相対するバンドにおけるＤＮＡ量とみなした（図２６および図２７参照）。

反応しなかったｐｃＫ１５５は４．５ｋｂおよび０．４ｋｂの２本のバンドを生ずるのに対し、変形したプラスミドはｐｃＫ１５５デルタおよび四に１５５オメガの２種類に変化し、各々２．９ｋｂおよび１．９ｋｂの２本のバンドを生じる（図２６）。

Ｅ、リシルベースの滴定１１００ｎのｐｃＫ１５５に異なる量のりゾルベース（１２００，６００，３００，１５０゜７５、３８．１９．９．５およびＯｎｇ）を加えた。反応は３７℃ で３０分間行なった。結果を図２８に記入した。そのままのプラスミドに比較して欠失したプラスミドの分画として表した、プラスミドを変形する能力においての比較釣魚な落ち込みが、１５０ｎｇと７５ｎｇとの間のタンパク質量において見られ、これはｒｅｓ部位あたり約６０分子のりゾルベース（１５０ｎｇ）に相当する。このことは、より低いレベルのりゾルベース濃度を測定することができ、これより低いレベルでは組換えが起こらないことを示唆する。リシルベース量がこのレベルより上の場合には、基本的にすべての基質を変化させる。

前回はりゾルベースを加えなくてもごく一部の基質が変化することを示している。これはプラスミドの増殖に使用した宿主大腸菌に固有のりゾルベースによるものと考えられる。同様に、リシルベースの非常に高い濃度においてもごく一部は変化しない。これはりゾルベースが超らせん化した基質を反応に必要とすることと、高度に精製したプラスミド標品のごく一部が弛緩している可能性があるこに注目することによって説明することができる。

Ｆ、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるリシルベースの動力学前文の基質ＯＮＡ　１１０ｎｇおよび、１２５ｎｇかまたは２５０ｎｇのいずれかのリシルベースを含む試料を、３７℃で異なる時間の間（１，５，１０゜３０、および６０分）インキュベートした。図２９に示したデータは、酵素の量が十分である時、反応は最初の１分以内にほとんど完了しく６５％以上が変化）、最初の５分以内に反応の最終量に達したことを示している。酵素の量が最適量より少ない時、動力学はより緩慢になり、このことはこの見かけの反応速度を、変形に必要な複合体形成の速度として考慮することにより説明することができる。

いＦｉｇ、　４０日１　１ａｃｌｏ　ＤＲＩＩ　ＡｍｐＲＤＲＩ　ＡｍｐＲｐＣＫ２４Δ ｔａｃｅｔＣＫ２８Ｆｉｇ、　５ｐＣＫ８１ｐｃＫ８０ＣＫ９５Ｆｉｇ、　９ａｃＺＦｉｇ、１０へ光学冨度（００４５０）時間（時）牛１’ｉ　１’ｌ　３１数の列数（ｃｒｕ／ｍ１）０１　２３４５６７’ 時間（時）光学密度（００４５０）時間（時）化合性計数の列数（ｃｆυ／ｍ１）０１２３４５６７Ｂ時間（時）Ｆｉｇ、　１５Ｂ７％　Ｚ　Ｓ　４４　５　＆　７　ＫＤの〇一一−−−−−−−−−−−−−−呻−−−一−−−−−−−−−−−−−−− −−呻−−一−−１７−で１０■ 〒１ｃａｔ　ＩａｃｌＱｌ　ｐａｒＡｂｌａ　ｒｅｓｌ　ｎｐｔ　Ｔ　ｒｅｓ２Ｅ７４二〜１９１９　ｂｐ　２９３９　ｂｐ　４４５９　ｂｐ０．８− ｂｐ補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成６年１０月　ケ日

Claims

【特許請求の範囲】１．遺伝子の発現の結果、細胞の細胞質にあって加水分解活性を有する酵素が形成される遺伝子を含んでいる細胞であり、細胞が更にその遺伝子の発現を調節する調節ヌクレオチド配列を含んでおり、前記遺伝子の発現が、細胞の非制限機能に必要な加水分解可能な細胞質物質を加水分解する結果となる速度で、細胞の機能が制限される程度に細胞における酵素の形成を導く細胞。２．酵素がヌクレアーゼ、ホスホリパーゼ、リパーゼ、リゾチーム、プロテアーゼおよびカルボヒドラーゼより成る群から選択される請求の範囲第１項記載の細胞。３．酵素がホスホリパーゼである請求の範囲第２項記載の細胞。４．遺伝子の発現の結果、細胞内の核酸におけるホスホジエステル結合を加水分解することのできるヌクレアーゼが形成され、前記遺伝子の発現が、細胞核酸の一方の鎖にニッタが存在する結果となる速度で、細胞の核酸修復機構によって修復できない程度に細胞におけるヌクレアーゼの形成を導き、それによって前記細胞の機能が制限される請求の範囲第１項記載の細胞。５．その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子が、祖換えレプリコンまたは複数の組換えレプリコンに含まれている請求の範囲第１項記載の細胞。６．調節配列が、組換えレプリコンまたは複数の組換えレプリコンに含まれている請求の範囲第５項記載の細胞。７．遺伝子および調節配列が、同一の組換えレプリコンに含まれている請求の範囲第５項記載の細胞。８．複数のレプリコンを含んでおり、各々のレプリコンが遺伝子および調節配列を共に含んでいる請求の範囲第７項記載の細胞。９．その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子が、もしそれが存在すれば細胞膜を通した酵素の輸送が可能となるペプチドシグナル配列をコードしている配列を欠く遺伝子である請求の範囲第１項記載の細胞。１０．調節ヌクレオチド配列が、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子に操作によって連結されている調節可能なプロモーターを含んでいる請求の範囲第１項記載の細胞。１１．調節可能なプロモーターが、細胞の環境条件、細胞の生理状態、および推計学的事変から選択した因子によって調節される請求の範囲第１０項記載の細胞。１２．調節可能なプロモーターが、環境における物理条件、およびある種の化学薬品の環境における存在の有無から選択した因子によって調節されている請求の範囲第１１項記載の細胞。１３．化学薬品が、炭素源、窒素源、代謝物質、アミノ酸、ヌクレオシド、ピリミジン塩基、プリン塩基、および金属イオンから選択される請求の範囲第１２項記載の細胞。１４．化学薬品がイソプロピルーβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）である請求の範囲第１３項記載の細胞。１５．プロモーターを調節している物理条件が、細胞の環境を支配している温度である請求の範囲第１２項記載の細胞。１６．その発現の結果、加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子が、それが細胞に存在している間は発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子の発現を抑えるヌクレオチド配列である、前記遺伝子に操作によって連結されている切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列の、組換え切り出しの結果として推計学的に誘導される請求の範囲第１項記載の細胞。１７．前記の切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列が、最初のブランキング配列と、前記の最初のフランキング配列に実質的に相同な２番目のブランキング配列とに隣接した配列であり、それによって前記の調節要素が細胞において組換えにより切り出し可能となる請求の範囲第１６項記載の細胞。１８．フランキング配列が、１００塩基対乃至５０００塩基対の範囲の長さを有する請求の範囲第１７項記載の細胞。１９．フランキング配列が、２００塩基対乃至３０００塩基対の範囲の長さである請求の範囲第１８項記載の細胞。２０．その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子が、伝令ＲＮＡである第１のＲＮＡをコードしており、前記遺伝子に操作によって連結されている切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列が、前記第１の伝令ＲＮＡとＲＮＡ−ＲＮＡ二重鎖を形成する第２のＲＮＡであり、そのためそれが発現されると加水分解活性のある酵素をコードしている前記遺伝子の転写を阻害する第二のＲＮＡをコードしている遺伝子である請求の範囲第１７項記載の細胞。２１．切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列が、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子の、転写のポリペプチドリプレッサーをコードしている遺伝子である請求の範囲第１７項記載の細胞。２２．切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列が、ｌａｃリプレッサーをコードしている遺伝子であり、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子が、ｌａｃプロモーターに操作によって連結しており、前記ｌａｃプロモーターが、ｌａｃリプレッサーのためのオペレーター部位を含んでいる請求の範囲第２１項記載の細胞。２３．負に機能している調節ヌクレオチド配列が、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子の、転写を妨げる終止配列である請求の範囲第１７項記載の細胞。２４．その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子の発現が、前記遺伝子に操作によって連結されている切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列の、部位特異的組換え切り出しの結果として推計学的に誘導され、その調節ヌクレオチド配列が、細胞に存在している間は、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子の発現を阻害する請求の範囲第１項記載の細胞。２５．切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列が、部位特異的切り出しのための最初の部位と部位特異的切り出しのための２番目の部位とに隣接された配列であり、２番目の部位は最初の部位と同じかまたは機能的に等しい多量体変形酵素による変形が可能であり、それにより前記調節要素が細胞において組換えにより切り出される請求の範囲第２４項記載の細胞。２６．部位特異的切り出しのための最初と２番目の部位が、プラスミドＲＰ４に由来するｍｒｓ部位である請求の範囲第２４項記載の細胞。２７．多形体変形酵素が、部位特異的変形のための部位に関してトランスに位置する遺伝子によってコードされている請求の範囲第２５項記載の細胞。２８．多量体変形酵素をコードしている遺伝子が、プラスミドＲＰ４のｐａｒＡ遺伝子である請求の範囲第２７項記載の細胞。２９．その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子が第１の伝令ＲＮＡをコードし、前記遺伝子に操作によって連結されている切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列が、前記第１の伝令ＲＮＡとＲＮＡ−ＲＮＡ二重鎖を形成する第２の伝令ＲＮＡであり、それにより、それが発現されると、加水分解活性のある酵素をコードしている前記遺伝子の発現が阻害される請求の範囲第２４項記載の細胞。３０．切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列が、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子の、転写のポリペプチドリプレッサーをコードしている遺伝子である請求の範囲第２４項記載の細胞。３１．切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列が、ｌａｃリプレッサーをコードしている遺伝子であり、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子が、操作によってｌａｃプロモーターに連結されており、前記ｌａｃプロモーターがｌａｃリプレッサーのためのオペレーター部位を含んでいる請求の範囲第３０項記載の細胞。３２．負に機能している調節ヌクレオチド配列が、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子の、転写を阻害する終止配列である請求の範囲第２４項記載の細胞。３３．その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子が、前記調節ヌクレオチド配列の逆位可能なプロモーター配列の、組換え逆位の結果として推計学的に発現され、前記プロモーターがその遺伝子に操作によって連結されている請求の範囲第１項記載の細胞。３４．プロモーターが、ｆｉｍＡプロモーターを運んでいる配列であるか、またはそれと機能的に相同な配列を運んでいる配列である請求の範囲第３３項記載の細胞。３５．その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子が、細菌プラスミド、細菌染色体、原核生物ウィルス、真核生物ウィルス、真核生物染色体、真核生物ミトコンドリア、真核生物葉緑体、および合成配列から成る群から選択したレプリコンに由来する請求の範囲第１項記載の細胞。３６．加水分解活性のある酵素が、少なくとも１つのシステイン残基を含んでいる酵素である請求の範囲第１項記載の細胞。３７．その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子が、細菌レプリコンから由来した遺伝子である請求の範囲第３５項記載の細胞。３８．加水分解活性のある酵素が、グラム陰性細菌から単離されたレプリコンに由来する遺伝子にコードされている請求の範囲第３７項記載の細胞。３９．加水分解活性のある酵素が、セラチア属の一種に由来する遺伝子にコードされている請求の範囲第３８項記載の細胞。４０．遺伝子が、セラチア・マルセセンス由来の遺伝子である請求の範囲第３９項記載の細胞。４１．酵素が、以下のＤＮＡ配列：【配列があります】を有する遺伝子によってコードされているホスホリパーゼである請求の範囲第４０項記載の細胞。４３．その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子が、グラム陽性細菌種に由来する請求の範囲第３７項記載の細胞。４４．遺伝子が黄色ブドウ球菌由来の遺伝子である請求の範囲第４３項記載の細胞。４５．その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子か、または前記遺伝子を調節している配列の少なくとも１つが、１つあるいはそれ以上の部位において突然変異しており、それによって遺伝子にコードされている酵素の細胞機能制限効果が、細胞において発現される場合、前記遺伝子および前記ヌクレオチド配列を突然変異していない形で含んでいる細胞に比較して、同じかまたは増加している請求の範囲第１項記載の細胞。４６．細胞がエンドヌクレアーゼをコードしている遺伝子を含んでいる請求の範囲第４６項記載の細胞。４７．遺伝子がセラチア属の一種に由来する遺伝子である請求の範囲第４６項記載の細胞。４８．その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子の、転写を調節しているヌクレオチド配列が、細菌プラスミド、細菌染色体、原核生物ウィルス、真核生物プラスミド、真核生物ウィルス、真核生物染色体、真核生物ミトコンドリア、真核生物葉緑体、および合成配列から成る群から選択したレプリコンに由来する請求の範囲第１項記載の細胞。４９．細胞が、非酵素の細胞機能制限遺伝子の産物をコードしている更なる調節発現可能な遺伝子を含んでいる請求の範囲第１項記載の細胞。５０．更なる調節発現可能な遺伝子が、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子を調節している配列と同じタイプの調節ヌクレオチド配列によって調節されている請求の範囲第４９項記載の細胞。５１．更なる調節発現可能な遺伝子が、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子を調節している配列の他のタイプの調節ヌクレオチド配列によって調節されており、前記の他のタイプが、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子を調節することもできる調節ヌクレオチド配列である請求の範囲第４９項記載の細胞。５２．更なる調節発現可能な遺伝子が、プラスミドＲ１のｐａｒＢ領域か、またはＲ１ｈｏｋ遺伝子と機能的に相同なＤＮＡ配列である請求の範囲第４９項記載の細胞。５３．更なる調節発現可能な遺伝子が、ｇｅｆ遺伝子である請求の範囲第４９項記載の細胞。５４．その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子を運んでいるレプリコン、および（または）調節ヌクレオチド配列を運んでいるレプリコンとは天然には関係していないＤＮＡ配列を更に含んでいる請求の範囲第１項記載の細胞。５５．その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子、および（または）調節ヌクレオチド配列を運んでいるレプリコンとは天然には関係していないＤＮＡ配列が、免疫活性のある遺伝子産物をコードしている配列である請求の範囲第５４項記載の細胞。５６．その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子、および（または）調節ヌクレオチド配列を運んでいるレプリコンと天然には関係していないＤＮＡ配列が、農薬活性のある遺伝子産物をコードしている配列である請求の範囲第５４項記載の細胞。５７．その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子、および（または）調節ヌクレオチド配列を運んでいるレプリコンと天然には関係していないＤＮＡ配列が、汚染物質を分解する遺伝子産物をコードしている配列である請求の範囲第５４項記載の細胞。５８．その発現の結果前記細胞の細胞質にあって加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子を含んでいる組換えレプリコンまたは複数の組換えレプリコンで形質転換した細胞であり、前記遺伝子の発現が、細胞の非制限機能に必要な加水分解可能な細胞質物質を加水分解する速度で、細胞の機能が制限される程度に、細胞における酵素の形成を導き、前記遺伝子の発現が、その遺伝子を含んでいる組換えレプリコンかまたは、形質転換された細胞に存在する他の組換えレプリコンに含まれている、調節ヌクレオチド配列によって調節されている請求の範囲第１項記載の細胞。５９．細胞の細胞質にあって加水分解活性のある酵素をコードしている細胞において、調節発現可能な遺伝子が発現される時、前記遺伝子の発現が、細胞の非制限機能に必要な加水分解可能な細胞質物質を加水分解する速度で、細胞の機能が制限される程度に、細胞における酵素の形成を導き、前記遺伝子の発現が、組換えレプリコンかまたは、そのレプリコンを含んでいる他の組換えレプリコンに含まれている調節ヌクレオチドによって調節されている、調節発現可能な遺伝子を含んでいる組換えレプリコン。６０．調節ヌクレオチド配列を含んでいる請求の範囲第５９項記載の組換えレプリコン。６１．加水分解活性のある酵素が、そのレプリコンが細胞において発現される時、細胞内に保持される酵素である請求の範囲第５９項記載のレプリコン。６２．コードされている酵素が、ヌクレアーゼ、ホスホリパーゼ、リパーゼ、リゾチーム、プロテアーゼ、およびカルボヒドラーゼから成る群から選択される請求の範囲第５９項記載のレプリコン。６３．コードされている酵素がホスホリパーゼである請求の範囲第６２項記載のレプリコン。６４．遺伝子の発現の結果、細胞の核酸におけるホスホジエステル結合を加水分解することのできるヌクレアーゼが形成され、前記遺伝子の発現が、細胞核酸の片方の鎖にニックが存在する結果となる速度で、細胞の核酸修復機構によって修復できない程度に、細胞におけるヌクレアーゼの形成を導き、それにより前記細胞の機能が制限される請求の範囲第５９項記載のレプリコン。６５．加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子が、もしそれが存在すれば細胞膜を通しての酵素の輸送が可能となるペプチドシグナル配列をコードしている配列を欠いている遺伝子である請求の範囲第５９項記載のレプリコン。一６６．調節ヌクレオチド配列が、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子に、操作によって連結されている調節可能なプロモーターを含んでいる請求の範囲第５９項記載のレプリコン。６７．調節可能なレプリコンが、レプリコンを含んでいる細胞の環境条件、細胞の生理的状態、および推計学的事変から選択した因子によって調節されている請求の範囲第６６項記載のレプリコン。６８．調節可能なレプリコンが、環境における物理条件、およびある種の化学薬品の環境における存在の有無から選択した因子である請求の範囲第６７項記載のレプリコン。６９．化学薬品が、炭素源、窒素源、代謝物質、アミノ酸、ヌクレオシド、ピリミジン塩基、プリン塩基、および金属イオンから選択される請求の範囲第６８項記載のレプリコン。７０．化学薬品がイソプロピルーβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）である請求の範囲第６９項記載のレプリコン。７１．物理条件が、環境における一般的な温度を含んでいる請求の範囲第６８項記載のレプリコン。７２．加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子の発現が、それが細胞に存在している間は加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子の発現を阻害する、切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列の、組換え切り出しの結果として推計学的に誘導される請求の範囲第５９項記載のレプリコン。７３．前記切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列が、最初のブランキング配列と、前記最初のフランキング配列に本質的に相同である２番目のブランキング配列とに隣接された配列であり、それにより前記調節要素を細胞において組換えにより切り出すことができる請求の範囲第７２項記載のレプリコン。７４．ブランキング配列が、１００塩基対乃至５０００塩基対の範囲の長さを有する請求の範囲第７３項記載のレプリコン。７５．ブランキング配列が、２００塩基対乃至３０００塩基対の範囲の長さを有する請求の範囲第７４項記載のレプリコン。７６．加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子が、伝令ＲＮＡである第１のＲＮＡをコードしており、切り出し可能な負に機能しているヌクレオチド配列が前記第１のＲＮＡとＲＮＡ−ＲＮＡ二鎖を形成する第２のＲＮＡをコードしている遺伝子であり、それにより、それらの転写が阻害される請求の範囲第７５項記載のレプリコン。７７．負に機能する調節ヌクレオチド配列が、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子の、転写のポリペプチドリプレッサーをコードしている遺伝子である請求の範囲第６１項記載のレプリコン。７８．負に機能している調節ヌクレオチド配列がｌａｃリプレツサーをコードしている遺伝子であり、加水分解可能な酵素をコードしている遺伝子が、ｌａｃプロモーターに操作によって連結されており、前記ｌａｃプロモーターが、前記ｌａｃリプレッサーのためのオペレーター部位を含んでいる請求の範囲第７７項記載のレプリコン。７９．負に機能している調節ヌクレオチド配列が、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子の転写を妨げる終止配列である請求の範囲第７２項記載のレプリコン。８０．その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子の発現が、前記遺伝子に操作によって連結されている切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列の、部位特異的組換え切り出しの結果として推計学的に誘導され、その調節ヌクレオチド配列が細胞に存在している間は、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子の発現を阻害する請求の範囲第５９項記載のレプリコン。８１．前記切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列が、部位特異的変形のための最初の部位と、最初の部位と同一かまたは機能的に等しい多量体変形酵素によって変形可能である２番目の部位とに隣接された配列であり、それにより前記調節要素を細胞において組換えにより切り出すことのできる請求の範囲第８０項記載のレプリコン。８２．部位特異的変形のための最初の部位および２番目の部位が、プラスミドＰＲ４由来のｍｒｓ部位である請求の範囲第８０項記載のレプリコン。８３．多量体変形酵素が、部位特異的変形のための部位に関してトランスに位置する遺伝子によってコードされている請求の範囲第８１項記載のレプリコン。８４．多量体変形酵素をコードしている遺伝子が、プラスミドＰＲ４のｐａｒＡ遺伝子である請求の範囲第８３項記載のレプリコン。８５．その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子が、伝令ＲＮＡである第１のＲＮＡをコードしており、前記遺伝子に操作によって連結されている切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列が、前記第１の伝令ＲＮＡとＲＮＡ−ＲＮＡ二重鎖を形成する第２のＲＮＡであり、そのためそれが発現されると加水分解活性のある酵素をコードしている前記遺伝子の転写を阻害する第二のＲＮＡをコードしている遺伝子である請求の範囲第８０項記載のレプリコン。８６．切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列が、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子の、転写のポリペプチドリプレッサーをコードしている遺伝子である請求の範囲第８６項記載のレプリコン。８７．切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列が、ｌａｃリプレッサーをコードしている遺伝子であり、その遺伝子の発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子が、ｌａｃプロモーターに操作によって連結されており、前記ｌａｃプロモーターが、ｌａｃリプレッサーのためのオペレーター部位を含んでいる請求の範囲第８６項記載のレプリコン。８８．負に機能している調節ヌクレオチド配列が、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子の、転写を妨げる終止配列である請求の範囲第８０項記載のレプリコン。８９．加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子が、前記調節ヌクレオチド配列の逆位可能なプロモーター配列の、組換え逆位の結果として推計学的に発現され、前記プロモーターがその酵素をコードしている遺伝子に操作によって連結されている請求の範囲第５９項記載のレプリコン。９０．プロモーター配列が、ｆｉｍＡプロモーターを運んでいる配列であるか、またはそれと機能的に相同な配列である請求の範囲第８９項記載のレプリコン。９１．加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子が、細菌プラスミド、細菌染色体、原核生物ウィルス、真核生物プラスミド、真核生物ウィルス、真核生物染色体、真核生物ミトコンドリア、真核生物葉緑体、および合成配列から成る群から選択したレプリコンに由来する請求の範囲第５９項記載のレプリコン。９２．加水分解活性のある酵素が少なくとも１つのシステイン残基を含んでいる請求の範囲第５９項記載のレプリコン。９３．加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子が、細菌レプリコンに由来する請求の範囲第９１項記載のレプリコン。９４．加水分解活性のある酵素が、グラム陰性細菌から単離したレプリコンに由来する遺伝子にコードされている請求の範囲第９３項記載のレプリコン。９５．加水分解活性のある酵素が、セラチア属の一種由来の遺伝子にコードされている請求の範囲第９４項記載のレプリコン。９６．遺伝子がセラチア・マルセセンスに由来する請求の範囲第９５項記載のレプリコン。９７．加水分解活性のある酵素が、以下のＤＭ配列：【配列があります】を有する遺伝子によってコードされているエンドヌクレアーゼである請求の範囲第９６項記載のレプリコン。９８．加水分解活性のある酵素が、以下のＤＮＡ配列：【配列があります】を有する遺伝子によってコードされているホスホリパーゼである請求の範囲第９６項記載のレプリコン。９９．加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子が、グラム陽性細菌種に由来する請求の範囲第９３項記載のレプリコン。１００．遺伝子が黄色ブドウ球菌に由来する遺伝子である請求の範囲第９９項記載のレプリコン。１０１．加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子か、または前記遺伝子を調節しているヌクレオチド配列が、１つあるいはそれ以上の部位で突然変異しており、それにより遺伝子にコードされている酵素の細胞機能制限効果が、細胞において発現される場合、突然変異したＤＮＡを含んでいない細胞において発現される酵素の細胞機能制限効果に比較して、同じかまたは増加している請求の範囲第５９項記載のレプリコン。１０２．加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子が、エンドヌクレアーゼをコードしている遺伝子である請求の範囲第１０１項記載のレプリコン。１０３．エンドヌクレアーゼをコードしている遺伝子が、セラチア属の一種に由来する遺伝子である請求の範囲第１０２項記載のレプリコン。１０４．加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子の、転写を調節しているヌクレオチド配列が、細菌プラスミド、細菌染色体、原核生物ウィルス、真核生物プラスミド、真核生物ウィルス、真核生物染色体、真核生物ミトコンドリア、真核生物葉緑体、および合成配列から選択したレプリコンに由来する請求の範囲第５９項記載のレプリコン。１０５．非酵素の細胞機能制限機能をコードしている、更なる調節発現可能な遺伝子を含んでいる請求の範囲第５９項記載のレプリコン。１０６．更なる調節発現可能な遺伝子が、細胞機能を制限する加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子を調節している配列と、同じタイプの調節ヌクレオチド配列によって調節されている請求の範囲第１０５項記載のレプリコン。１０７．更なる調節発現可能な遺伝子が、細胞機能を制限する加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子を調節している配列より他のタイプの調節ヌクレオチド配列によって調節されており、前記他のタイプは、細胞機能制限酵素をコードしている前記遺伝子を調節することができる請求の範囲第１０５項記載のレプリコン。１０８．更なる調節発現可能な遺伝子が、プラスミドＲ１のｐａｒＢ領域からのｈｏｋ遺伝子か、またはＲ１ｈｏｋ遺伝子と機能上相同であるＤＮＡ配列である請求の範囲第１０５項記載のレプリコン。１０９．更なる調節発現可能な遺伝子がｇｅｆ遺伝子である請求の範囲第１０５項記載のレプリコン。１１０．加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子を運んでいるレプリコン、および（または）調節ヌクレオチド配列を運んでいるレプリコンに、天然には関係していないＤＮＡ配列を更に含んでいる請求の範囲第５９項記載のレプリコン。１１１．加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子、および（または）調節ヌクレオチド配列を運んでいるレプリコンに、天然には関係していないＤＮＡ配列が、免疫活性のある遺伝子産物をコードしている配列である請求の範囲第１１０項記載のレプリコン。１１２．酵素をコードしている遺伝子、および（または）調節ヌクレオチド配列を運んでいるレプリコンに、天然には関係していないＤＮＡ配列が、農薬活性のある遺伝子産物をコードしている配列である請求の範囲第１１０項記載のレプリコン。１１３．酵素をコードしている遺伝子、および（または）調節ヌクレオチド配列を運んでいるレプリコンに、天然には関係していないＤＮＡ配列が、汚染物質を分解する遺伝子産物をコードしている配列である請求の範囲第１１０項記載のレプリコン。１１４．請求の範囲第１項記載の多数の細胞から成る細胞集団にして、前記細胞が、その発現の結果、前記細胞の細胞質にあって加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子を含んでおり、細胞は更に前記遺伝子の発現を調節する調節ヌクレオチド配列を含んでおり、前記遺伝子の発現が、細胞の非制限機能に必要な加水分解可能な細胞質物質を加水分解する速度で、細胞の機能を制限する程度に細胞における酵素の形成を導く細胞の集団。１１５．請求項５９に定義したような組換えレプリコンで形質転換した、形質転換可能な細胞を含んでおり、前記レプリコンが前記細胞において複製することのできる請求の範囲第１１４項記載の細胞集団。１１６．細胞が細菌細胞である請求の範囲第１１４項記載の細胞集団。１１７．細菌細胞が、その天然の生育場所が、土壌、表面水、および植物から選択した生育場所である種から選択した請求の範囲第１１６項記載の細胞集団。１１８．細菌細胞がグラム陰性細菌の細胞である請求の範囲第１１６項記載の細胞集団。１１９．機能制限酵素をコードしている遺伝子の発現が、前記細胞がヒトまたは動物体、または外部環境に放出される際、リプレッサー物質が機能しない形に変わるまで崩壊を受けることのできるリプレッサー物質によって調節することができ、前記リプレッサー物質が集団の細胞内に異なる濃度で存在することにより、その直線的な崩壊の結果として、集団の細胞の機能がしだいに制限される請求の範囲第１１４項記載の細胞集団。１２０．細胞集団の生存を第１または第２の環境において制限する方法にして、前記細胞集団の、その集団の細胞内で複製することのできる組換えレプリコンを用いた形質転換と、その発現の結果、前記細胞の細胞質にあって加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子を入れることとを含む方法であり、細胞は更に、環境因子によって調節され、前記遺伝子の発現を調節する調節ヌクレオチド配列を含んでおり、前記遺伝子の発現が、細胞の非制限機能に必要な加水分解能な細胞質物質を分解する速度で、細胞の機能を制限して、細胞集団の生存を制限するに至る程度に、細胞における酵素の形成を導く方法。１２１．細胞集団が請求項１１１乃至請求項１１９に定義されているような細胞集団である請求の範囲第１２０項記載の方法。１２２．細胞集団の生存を、遺伝子が発現する、第１の環境において制限し、前記細胞集団がそれによって第１の環境内に封じ込められる請求の範囲第１２０項記載の方法。１２３．第１の環境に存在する間は細胞集団の生存を制限せず、第１の環境は、第１の環境とは物理的および（または）化学的に異なる第２の環境に変わることができ、第１の環境においては、その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子は発現しないが、しかし第２の環境へ移すかまたは物理的および（または）化学的に変化した第１の環境に存在する場合には、遺伝子が発現し、細胞集団の生存を制限する請求の範囲第１２０項記載の方法。１２４．リプレッサー物質をコードしている調節ヌクレオチド配列に、操作によって連結した加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子を、細胞に与えることにより、細胞集団の生存を制限し、前記細胞がヒトまたは動物の体、または外部環境に放出される時、リプレッサー物質が機能しない形に変わるまで崩壊を受けることができ、前記リプレツサー物質が集団の細胞内に異なる濃度で存在することにより、その集団の細胞の機能をしだいに制限する請求の範囲第１２０項記載の方法。１２５．染色体外の組換えレプリコンを、前記レプリコンが天然に第２の種類の細胞に形質転換することのできる第１の種類の細胞に入れる方法にして、染色体外の組換えレプリコンヘの、その発現の結果細胞の細胞質にあって加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子の供与を含んでおり、前記酵素の形成が、細胞の非制限機能に必要な加水分解可能な細胞質物質を加水分解する速度で、細胞の機能が制限される程度におこり、前記第１の種類の細胞は前記遺伝子の発現を阻害する調節ヌクレオチド配列を含んでいる染色体レプリコンを有するかまたは有すべく修飾してあり、それにより第１の種類の細胞を防御し、前記調節遺伝子は第２の種類の細胞にはないため、それによってもし第２の種類の細胞が染色体外の組換えレプリコンを受けとると、前記遺伝子は発現し、機能制限効果を及ぼす方法。１２６．組換えレプリコンが、請求項５９に定義したような、調節ヌクレオチド配列を含まないレプリコンである請求の範囲第１２４項記載の方法。１２７．その発現の結果加水分解活性のある酵素が形成される遺伝子の発現の結果、細胞の核酸におけるホスホジエステル結合を加水分解するエンドヌクレアーゼが形成され、前記遺伝子の発現が、細胞において核酸にニックが存在する結果となる速度で、細胞の核酸修復機構によって修復され得ない程度に、細胞におけるエンドヌクレアーゼの合成を導き、それにより前記細胞の機能を制限する請求の範囲第１２５項記載の方法。１２８．細胞集団の生存を推計学的に制限する方法にして、調節発現可能な遺伝子を含んでいる組換えレプリコンを用いた細胞の形質転換を含んでおり、調節発現可能な遺伝子が、細胞の細胞質にあって加水分解活性のある酵素をコードしている細胞において発現されると、前記遺伝子の発現が、細胞の非制限機能に必要な加水分解可能な細胞質物質を加水分解する速度で、細胞の機能を制限する程度に、細胞における酵素の形成に導き、前記遺伝子または複数の遺伝子の発現が、それが細胞に存在する間は酵素をコードしている遺伝子の発現を阻害する、切り出し可能な負に機能している調節ヌクレオチド配列の、組換え切り出しの結果として推計学的に誘導され、前記負に機能している調節ヌクレオチド配列が、組換えレプリコンまたは、そのレプリコンを含んでいる集団の細胞に存在する他の組換えレプリコンに含まれている方法。１２９．組換えレプリコンが、請求項７３に定義したレプリコンである請求の範囲第１２８項記載の方法。１３０．細胞集団の生存を推計学的に制限する方法にして、調節発現可能な遺転子を含んでいる組換えレプリコンを用いた細胞の形質転換を含んでおり、調節発現可能な遺伝子が、細胞の細胞質にあって加水分解活性のある酵素をコードしている細胞において発現されると、前記遺伝子の発現が、細胞の非制限機能に必要な加水分解可能な細胞置物質を加水分解する速度で、細胞の機能を制限する程度に、細胞における酵素の形成に導き、前記遺伝子の発現が、それが細胞に存在する間は酵素をコードしている遺伝子の発現を阻害する、切り出し可能な部位特異的組換え切り出しの結果として推計学的に誘導され、前記負に機能している調節ヌクレオチド配列が、組換えレプリコンまたは、そのレプリコンを含んでいる集団の細胞に存在する他の組換えレプリコンに含まれている方法。１３１．組換えレプリコンが、請求項８１において定義されているようなレプリコンである請求の範囲第１３０項記載の方法。１３２．細胞集団の生存を推計学的に制限する方法にして、調節発現可能な遺伝子を含んでいる組換えレプリコンを用いた細胞の形質転換を含んでおり、調節発現可能な遺伝子が、前記細胞の細胞膜の向こうへ輸送されず、細胞の細胞質で加水分解活性のある酵素をコードしている細胞において発現されると、前記遺伝子の発現が、細胞の非制限機能に必要な加水分解可能な細胞質物質を加水分解する速度で、細面の機能を制限する程度に、細胞における酵素の形成を導き、前記遺伝子の発現が、前記調節ヌクレオチド配列の逆位可能なプロモーター配列の組換え逆位の結果として推計学的に発現され、前記プロモーターが酵素をコードしている遺伝子に、操作によって連結されており、それが細胞に存在する間は酵素をコードしている遺伝子の発現が阻害され、前記調節ヌクレオチド配列が、組換えレプリコンか、またはそのレプリコンを含んでいる細胞に存在する他の組換えレプリコンに含まれている方法。１３３．プロモーター配列が、ｆｉｍＡプロモーターを運んでいる配列であるか、またはそれと機能的上の相同物を運んでいる配列である請求の範囲第１３２項記載の方法。１３４．請求の範囲第１１４項記載の生存可能な機能制限細胞集団を含んでいる免疫活性のある組成物において、細胞は、加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子または調節ヌクレオチド配列とは天然には関係していない、更なるＤＮＡ配列を含んでおり、更なる配列は免疫活性のある遺伝産物をコードしている配列であり、この組成物がヒトまたは動物に投与されると、効果的な免疫反応を前記ヒトまたは動物において得るために十分な期間および量で免疫活性のある遺伝子産物を細胞に発現させるが、しかしヒトおよび動物の中では生き残ることができない、という程度に細胞の機能が制限されている組成物。１３５．細胞がその中に、免疫活性のある遺伝子産物をコードしている配列であって、免疫活性のある遺伝子産物とポリペプチドとを含んでなる融合タンパク質をコードしている配列を含んでおり、ポリペプチドの存在の結果、前記融合タンパク質が、細胞の外表面へ輸送される請求の範囲第１３４項記載の組成物。１３６．融合タンパク質に存在しているポリペプチドが、フィンブリリンタンパク質、繊毛、べん毛、ＯＭ表面タンパク質に由来するポリペプチドから選択した表面タンパク質である請求の範囲第１３５項記載の組成物。１３７．細胞表面のポリペプチドが腸内細菌科、ビブリオ科、およびシュードモナス科から選択した細菌種に由来する請求の範囲第１３５項記載の組成物。１３８．請求の範囲第１１１項記載の生存可能な細胞集団を含んでいる農薬活性のある組成物において、細胞が加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子または調節ヌクレオチド配列とは天然には関係していない更なるＤＮＡ配列を含んでおり、更なる配列が農薬活性のある遺伝子産物をコードしている配列であり、この組成物を害虫を含んでいる環境に施すと、前記環境において効果的な農薬効果を得るために十分な期間および量での、農薬活性のある遺伝子産物を細胞に発現させるが、しかし細胞は環境において生き残ることができないという程度に、細胞の機能が制限されている組成物。１３９．更なるＤＮＡ配列が、昆虫またはそれらの子孫に有害な遺伝子産物をコードしている請求の範囲第１３８項記載の組成物。１４０．更なるＤＮＡ配列が、バシラス・スリジエンシス由来の、殺虫作用のあるタンパク質をコードしている配列である請求の範囲第１３６項記載の組成物。１４１．請求の範囲第１１４項記載の生存可能な細胞集団を含んでいる環境汚染物質を分解する組成物において、細胞が加水分解活性のある酵素をコードしている遺伝子または調節ヌクレオチド配列とは、天然には関係していない更なるＤＮＡ配列を含んでおり、更なる配列は環境汚染物質を分解する遺伝子生物をコードしており、この組成物を、分解されるべき汚染物質を含んでいる環境に施すと、前記環境において効果的な汚染物質分解効果を得るために十分な期間および量での、汚染物資を分解する遺伝子産物を細胞に発現させるが、しかし細胞は生き残ることができないという程度に細胞の機能が制限されている組成物。１４２．その発現の結果、細胞機能を制限する酵素が形成される遺伝子、または複数の遺伝子が、汚染物質を分解する遺伝子産物によって分解することのできる汚染物質が、実質的に分解して初めて発現される請求の範囲第１４１項記載の組成物。