JPH07506007A - ICAM-related proteins - Google Patents

ICAM-related proteins

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JPH07506007A
JPH07506007A JP6516977A JP51697793A JPH07506007A JP H07506007 A JPH07506007 A JP H07506007A JP 6516977 A JP6516977 A JP 6516977A JP 51697793 A JP51697793 A JP 51697793A JP H07506007 A JPH07506007 A JP H07506007A
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ガラテイン，ダブリュ．，ミッシェル
ヴェゼウクス，ローズメイ
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イコス　コーポレイション
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 ｒｌｃＡＭ−関連タンパク質」 本願出願は、１９９２年１月２７日出願の係属中の米国特許出願筒０７／８２７ ．６８９号の一部継続出願である、１９９２年５月２６日出願の係属中の米国特 許出願筒０７／８８９．７２４号の一部継続出願である、１９９２年６月５日出 願の係属中の米国特許出願筒０７／８９４．０６１号の一部継続出願である、１ ９９３年１月２６日出願の国際出願Ｎｏ、　ＰＣＴ／ＵＳ９３１００７８７およ び係属中の米国特許出願筒０８１００９．２６６号の一部継続出願である。 発明の技術分野 本発明は、一般に細胞接着分子に関し、具体的には、細胞間接着分子のＩＣＡＭ −１および−２と構造上の関連性を有する新規のｒ　ＩＣＡＭ−ＲＪと称するヒ トポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現に関する。 発明の背景 このｌＯ年間における研究によって、体の細胞間の相互作用に関する現象、特に 、免疫系における細胞の挙動および活性化に関する現象が解明されてきた。　一 般には、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、　Ｎａｔｕｒｅ。 ３４６：　４２５−４３４　（１９９０）を参照のこと。　細胞表面タンパク質 、および、特に所謂細胞接着分子（”ＣＡＭｓ”）は、相応して、炎症部位への 白血球濡出および別異の標的組織への白血球の動きのプロセスに介入することを 目的とした製薬学的研究および開発のテーマとなっていた。　細胞接着分子の単 離および特徴、このような分子をコードするＤＮＡのクローニングおよび発現、 さらには炎症プロセス、ウィルス感染およびガン転移に関する治療薬および診断 薬の開発もまた、多くの米国および外国特許出願のテーマとなっている。　Ｅｄ ｗａｒｄｓ、　Ｃｕｒｒｅｎｔ　０ｐｉｎｉｏｎ　１ｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ 　Ｐａｔｅｎｔｓ、　１（１１）：１６１７−１６３０　（１９９１）およびそ の中で引用されている発行流「参考特許文献」を参照のこと。 本願発明の技術背景における重要事項は、細胞接着の特定の媒介体、すなわち、 Ｂ　ＩＪリンパ球１９２８球、単球、および顆粒球上に存在するヘテロダイマー 「インテグリン」細胞表面タンパク質のサブファミリーを形成する［ロイコイン テグリン」、ＬＦＡ−１％ＭＡＣ−１オヨヒｇｐ１５０．９５　（ＷＨＯ＜７） 命名法ニよルと、ＣＤ１８／ＣＤ１ｌａ、　ＣＤ１Ｂ／ＣＤ１ｌｂ、およびＣＤ １８／ＣＤ１１ｃとそれぞれ称される）の−刻も早い同定および特徴づけである 。　例えば、前出のＳｐｒｉｎｇｅｒの文献第４２９頁の表１を参照のこと。　 さらに、炎症プロセスに観られる現象である白血球の活性化、接着、運動性等に 影響を与える他の一本鎖接着分子（ＣＡＭｓ）も重要事項である。 例えば、現在、炎症プロセスに固有の白血球濡出に先がけて、白血球上で構造的 に発現しているインテグリンの活性化が起こり、次に、インテグリン（例えば、 ＬＦＡ−１）と血管内皮細胞表面上および他の白血球にて発現されるＩＣＡＭ− １およびＩＣＡＭ−２と称されている二つの相異なる細胞間接着分子（ＩＣＡＭ ｓ）の一方あるいは両方との間に堅固なリガンド／レセプター相互作用が生じる と考えられている。 今日までに特徴付けられている他のＣＡＭ　（例えば、１９９０年１１月１５日 に発行されたＰＣＴ　ＷＯ９０／１３３００に開示された管接着分子（ＶＣＡＭ −１）　；およびＮｅｗｍａｎら、５ｃｉｅｎｃｅ　、　２４７：　１２１９− １２２２（１９９０）および１９９１年７月２５日ニ発行されりＰＣＴ　ＷＯ９ １／１０６８３　Ｇ、：開示された血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ−１） ）と同様に、ＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−２は、他の免疫グロブリン遺伝子工 科と、それぞれの細胞外部分が類似のカルボキシ末端基を有する領域の連続から なるという点で、構造的に相同である。　「典型的な」免疫グロブリン様領域は 、通常、それぞれの末端の二つのシスティン間のジスルフィド結合によって固定 されているループ構造を含んでいる。　ＩＣＡＭ−１は、五つの免疫グロブリン 様領域を含んでおり；細胞分布の点でＩＣＡＭ−１と異なるＩＣＡＭ−２は、こ のような領域を二つ含んでおり、ＰＥＣＡＭ−１は六つ含んでおり；　ＶＣＡＭ は、接合の多様性、その他によって、六つあるいは七つを含んでいる。　さらに 、ＣＡＭｓは、典型的には、細胞表面の分子の配向に関係していると考えられる 疎水性「経膜的」領域およびカルボキシ末端「細胞質」領域を含んでいる。　Ｃ ＡＭｓの機能的配置のグラフィックモデルでは、一般的に、細胞の細胞質にまで 伸長している細胞質「テール」と、細胞表面から外側に向けて伸長している１つ 以上の免疫グロブリン様ループによって、経膜的領域に固定されている分子が認 められる。 ヒト・ライノウィルスに結合するためのＩＣＡＭ−１の能力を前提とする用途を 含んだ、細胞間接着分子の様々な治療上の使用が計画されてきた。　例えば、１ ９９２年１月２９日に発行された欧州特許出願箱４６８２５７　Ａ号は、リガン ド／レセプター結合活性、特に、ウィルス、リンパ球関連抗原およびプラスモデ ィウム・ファルシパラム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のよ うな病原体への結合する際の結合活性が向上するものと提案された（全長および 切断型分子形態を含む）　ＩＣＡＭ−１の様々な配座および形態の改良について 述べている。 同様にして、細胞間接着分子に免疫学的に関連しているタンパク質の様々な使用 が考案されてきた。　例えば、１９９１年１１月１４日に発行されたＷｏ　９１ ／１６９２８には、ヒト型化されたキメラ抗ＩｃＡＭ−１抗体、および特異的お よび非特異的炎症、ウィルス感染、および喘息の治療におけるその使用について 述べている。　抗ＩＣＡＭ−１抗体およびその断片は、菌体内置ショックの治療 に有効である旨が、１９９２年３月１９日に発行されたＷＯ９２１０４０３４に 述べられている。　抗ＩＣＡＭ−１抗イディオタイプ抗体および抗体断片による ＩＣＡＭ−１依存型炎症反応の阻害が、１９９２年４月１６日に発行されたＷｏ 　９２１０６１１９に述べられている。 Ｉ　ＣＡＭ−１のような細胞間接着タンパク質およびＬＦＡ−１のようなリンパ 球相互作用性インテグリンの同定および特徴づけによって得られた細胞接着現象 の基本的な洞察にもかかわらず、その全容解明は程遠い。　一般的には、炎症の プロセスおよび標識付けられたリンパ球の生体内における挙動には、多（の他の タンパク質が関与していると考えられている。　ごく最近になって、例えば、Ｓ ｐｒｉｎｇｅｒおよび彼の共同研究者等は、ＬＦＡ−１の第三のカウンターレセ プターの存在を予想し［ｄｅ　Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍ ｅｄ、、　１７４：２５３−２６７　（１９９１）］　、次いで、ｒ　ＩＣＡＭ −３Ｊと称する「第三のＪ　ＩＣＡＭリガンドを免疫沈降することに成功したこ とを報告した［ｄｅ　Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、 　１７５：１８５−１９０　（１９９２）コ。　この分子は、可溶性のＬＦＡ− １に結合し、休止リンパ球、単球、および好中球によって高度に発現される。 しかしながら、ＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−２とは異なり、この新しいリガン ドは、内皮細胞によって発現されることは認められていない。　Ｎ−グリアナー ゼ処理によって、分子量が約８７．０００にまで落ちることから、免疫沈降され た生産物が約１２４．０００の分子量を有し、高度にグリコジル化されているこ とは明らかである。 さらにもっと最近になって、別の研究グループも、同様にｒ　ＩＣＡＭ−３Ｊと 称するＬＦＡ−１のカウンターレセプターのｃＤＮＡ配列を記載した［Ｆａｗｃ ｅＬｔら、Ｎａｔｕｒｅ、　３６０：４８１−４８４　（１９９２）を参照のこ とコ。　さらに最近では、ＩＣＡＭ−３のアミノ酸配列が、ＩＣＡＭ−Ｒのそれ と同一であることを報告し、また、各タンパク質に特異的な抗体の免疫学的反応 性のパターンに基づいた分化抗原ＣＤｗ５０とＩＣＡＭ−３との同一性をそれぞ れ記した、二つの文献ＣｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　 Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、　１７７：　１１８７−１１９２　（１９９３）およびＪｕ ａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　２３：　１５０ ８−１５１２　（１９９３）　）が、Ｓｐｒｉｎｇｅｒと彼の共同編集者によっ て出版されている。 したがって、当該技術分野では、ヒトの細胞間の相互作用に関与するさらなるタ ンパク質、特に、そのタンパク質のアミノ酸配列を特異的に同定しかつ特徴づけ るのに役立つ情報が望まれている。　さらに、そのような分子が治療薬および診 断薬の開発の基礎を形成し得る程度に、それらをコードしているＤＮＡが解明さ れることが必須である。　そのような根本的な情報は、とりわけ、タンパク質の 大量生産に役立ち、タンパク質を天然に産生ずる細胞の同定を促し、そして抗体 物質あるいはそれらと特異的に結合する他の新規な結合タンパク質および／また は関与するリガンド／レセプター結合反応を抑制する他の新規な結合タンパク質 の調製を可能にする。 発明の要旨 一つの態様において１、本発明は、新規なヒトポリペプチドｒ　ＩＣＡＭ−ＲＪ およびＩＣＡＭ−Ｈに特異的な一つ以上のリガンド／レセプター結合生物学的活 性および／または免疫学的特性を有する（断片および類似体を含む）その変異体 をコードする精製・単離されたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列およびそ のＲＮＡ転写物）を提供する。　ＩＣＡＭ−Ｒ特異的リガンド／レセプター結合 生物学的活性には、ＩＣＡＭ−Ｒ細胞外ドメインおよび細胞質ドメインの両方と 他の分子との（例えば、細胞間の接着および／あるいはシグナルトランスダクシ ョンのプロセスにおける）相互作用か含まれる。　本発明の好ましいＤＮＡ配列 には、ゲノムの配列およびｃＤＮＡ配列ならびに全部あるいは部分的に化学合成 されたＤＮＡ配列が含まれる。　本発明のＤＮＡ配列の生物学的レプリカ（すな わち、ｉｎ　ｖｉｖｏあるいはｉｎ　ｖｉＬｒｏで調製された単離されたＤＮＡ 配列のコピー）も意図されてている。　さらに、ＩＣＡＭ−Ｒを有するプラスミ ドおよびウィルスベクターのような、自律的に複製する組換え構築物、特に、Ｉ ｃＡＭ−ＲあるいはＩｃＡＭ−Ｒ変異体をコードするＤＮＡが、内因性あるいは 外因性発現制御ＤＮＡ配列に機能的に結合しているベクターもまた提供される。 本発明の他の態様によると、特に、原核細胞および真核細胞のような単細胞の宿 主細胞が、所望のポリペプチドを発現できるように、本発明のＤＮＡ配列で安定 的に形質転換される。　このようなＩＣＡＭ−ＲおよびＩｃＡＭ−Ｒ変異体生産 物を発現する宿主細胞は、様々な有用な目的に役立つ。　発現した生産物が宿主 細胞の表面に「現れるｊ程度に、細胞は、ＩＣＡＭ−ＲおよびＩＣＡＭ−Ｒ変異 体と特異的に免疫反応する抗体物質の誘起のための有用な免疫原を構成し得る。 　本発明の宿主細胞は、適当な培養培地中で細胞を生育し、所望のポリペプチド 生産物が細胞あるいは細胞が生育していた培地から単離する、ＩＣＡＭ−Ｒおよ びＩＣＡＭ−Ｒ変異体の大量生産の方法に非常に有用である。 本発明の新規なＩＣＡＭ−ＲおよびＩＣＡＭ−Ｒ変異体生産物は、天然の細胞源 から得ることができるが、好ましくは、本発明の宿主細胞が関与する組換え操作 によって産生される。　生産物は、組換え生産および／あるいは単離復調製作業 のために選択された宿主細胞によって、完全にあるいは部分的にグリコジル化さ れた状態、部分的にあるいは完全に脱グリコジル化された状態、またはグリコジ ル化されていない状態で得られる。 本発明の生産物は、本明細書の配列番号＝１の−２９から５１８までのアミノ酸 残基の配列を有する単量体および多量体ポリペプチドを含む。　以下に詳しく説 明するように、この配列は、「成熟」タンパク質配列に先立つ、−２９から−１ にわたる残基の推定シグナルあるいはリーダー配列を含み、この配列の後に、順 番に、五つの推定免疫グロブリン様領域（それぞれ、残基〜ｌから９０、〜９１ から１８７、〜１８８から２８５、〜２８６から３８７、および〜３８８から約 ４５６）　、残基約４５７から約４８１に伸びる疎水性「縁膜的」領域、および カルボキシ末端で残りのポリペプチドを構成する「細胞質」領域がある。　アミ ノ酸組成に基づいて、グリコジル化あるいは他の翻訳後修飾か欠如している成熟 タンパク質の分子量の計算値は、約５２，４１７である。　本発明のＩＣＡＭ− Ｒ変異体は、上記した特定領域のすべであるいは一部を含み、および、例えば、 ＩＣＡＭ−Ｈの結合対象への結合能力、および／またはＩＣＡＭ−Ｒの天然結合 対象への結合阻害能力を含むＩＣＡＭ−Ｒの生物学的あるいは免疫学的特性を有 する上記した一つ以上の領域を含む、水に可溶性のＩＣＡＭ−Ｒ断片および不溶 性の単量体、多量体あるいは環状ＩＣＡＭ−Ｒ断片を含む。　本発明のＩＣＡＭ −Ｒ変異体は、さらに、一つ以上のアミノ酸が下記したような欠損あるいは置換 を有するポリペプチド類似体を含むものである：（１）損失なしで、好ましくは 、ＩＣＡＭ−Ｈの１つ以上の生物学的活性あるいは免疫学的特性が強化されてい る：あるいは（２）特定のリガンド／レセプター結合機能が特異的に無力化され ている。 多量体の形成を促進する付加的なアミノ酸（例えば、リシンあるいはシスティン ）残基を含む類似体ポリペプチドが、意図されている。 さらに、本発明では、ＩＣＡＭ−ＲあるいはＩＣＡＭ−Ｒ変異体に対する抗体物 質（例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、抗体断片、−木繊 抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体等）および他の結合タンパク質（例えば、特 異的（すなわち、Ｉ　ＣＡＭ−Ｒが構造上関連しているＩＣＡＭ−１およびＩＣ ＡＭ−２細胞間接着分子と非反応性である）ポリペプチドおよびペプチド）もま た意図されている。　抗体物質は、単離された天然あるいは組換えＩ　ＣＡＭ− ＲあるいはＩＣＡＭ−Ｒ変異体、またはそのような生産物を表面に発現する細胞 を用いて調製される。　本発明において特に例示されている抗体は、郵便番号２ ０８５２、メリーランド州、パークロラン、ロックビル１２３０１に所在のアメ リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に、１９９２年６月２ 日に、受託番号）ＩＢ１１０５３、ＨＢ１１０５４、ＨＢ１１０５５、およびＨ Ｂｌ１０５６としてそれぞれ寄託された、米国特許出願Ｎｏ、　０７／８９４． ０６１に開示した、２６Ｅ３Ｄ−１，２６１１８Ｆ−２，２６１１０８−２，２ ６Ｈ１１Ｃ〜２と称するハイブリドーマ細胞系、　ＡＴＣＣに、１９９２年１２ 月１６日に、受託番号ＨＢ１１２２１として寄託された、米国特許出願Ｎｏ、　 ０８１００９，２６６に開示した、４３Ｈ７Ｃと称するハイブリドーマ細胞系、 さらに、ＡＴＣＣに、１９９３年１月１５日に、受託番号ＨＢ１１２３５および ＨＢ１１２３６として寄託された同出願に開示した、４２Ｃ５Ｈおよび４２Ｄ９ Ｂと称するハイブリドーマ細胞系、　ＡＴＣＣに、１９９３年１月７日に、受託 番号）ＩＢ１１２３２およびＨＢ１１２３１として寄託された、米国特許出願Ｎ ｏ、　０８１００９．２６６に開示した、４６Ｄ７Ｂおよび４６１１２８と称す るハイブリドーマ細胞系：および、ＡＴＣＣに、１９９３年７月１５日に、受託 番号ＨＢ１１４０５、　ＨＢ１１４０９、ＨＢ１１４０８、ＨＢ１１４０７、Ｈ Ｂ１１４０６、およびＨＢ１１４０４としてそれぞれ寄託された、本願出願にて 開示する、６３ＥｌＩＤ、６３Ｇ４Ｄ、６３Ｈ４Ｃ、６３Ｈ６Ｈ、６３１１Ｃお よび６３［６Ｇと称するハイブリドーマ細胞系によって産生されるモノクローナ ル抗体である。 本発明の結合タンパク質の多様な特性は、これら抗体によって明らかにされてお り、本願実施例２１の表１１に要約しである。 かような特性には、細胞および細胞表面分子へのＩＣＡＭ−ＨのＣＤ１８−依存 性あるいはＣＤ１８−非依存性結合を調整する能力、ならびに、ＳＢＡおよび／ または同種抗原による白血球活性を調整する能力が含まれる。　本発明の結合タ ンパク質は、結合部位の構造（例えば、ＩＣＡＭ−Ｒアミノ酸配列のエピトープ および／または修飾に対する結合特性の感受性）に関する特性にも感受的である 。 結合タンパク質もまた、免疫のための組成物ならびに本発明のポリペプチドを精 製するため、および表面上にこのポリペプチドが現れる細胞を同定するために有 用である。　これらのタンパク質はまた、ＩＣＡＭ−Ｒが関与するリガンド／レ セプター結合生物学的活性、特に特異的および非特異的免疫系反応に関与するＩ ＣＡＭ−Ｒエフェクター機能を調節（すなわち、ブロッキング、阻害、あるいは 刺激）するのに明らかに役立つ。　抗ＩＣＡＭ−Ｒ抗体物質に特異的な抗イデイ タイプ抗体およびそのような抗イデオタイプ抗体物質の免疫反応の調節における 使用もまた目的とされている。　細胞表面上および血清などの液体中のＩＣＡＭ −Ｒの検出および定量のための分析には、「サンドイッチ」分析様式における単 一抗体物質あるいは多抗体物質が含まれる。 本発明のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列の開示によってもたらされる情報の科学 的価値は、明白である。　一連の例としては、ＩＣＡＭ−ＲのｃＤＮＡ配列の知 識によって、ＩＣＡＭ−ＲをコードするゲノムのＤＮＡ配列のＤＮＡ／ＤＮＡハ イブリダイゼーションによる単離、およびプロモーター、オペレーターなどのＩ ＣＡＭ−Ｒ発現制御調節配列の特定か可能となる。　本発明のＤＮＡ配列を用い た厳重な条件下でのＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションによって、ＩｃＡＭ −Ｈの対立変異体をコードするＤＮＡの単離、ＩｃＡＭ−Ｒに特異的な一つ以上 の生物学的および／あるいは免疫学的特性が共通する構造的に関連のある他のタ ンパク質の単離、そして、ＩＣＡＭ−Ｈに類似する非ヒト種（例えば、嘔歯動物 ）のタンパク質単離が期待される。　本発明のＤＮＡは、ＩＣＡＭ−Ｒを合成す る細胞の能力を検出するためのＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーション分析に有 用である。 さらに、本発明によって、通常ＩＣＡＭ−Ｒを発現する細胞によるＩｃＡＭ−Ｈ の発現の調節に関連するアンチセンス・ポリヌクレオチドが入手できるようにな る。　他の一連の例としては、ＩＣＡＭ−ＨのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列の 知識によって、組換え手段による、ハイブリッド融合タンパク質（時々、「免疫 接着体」と称する）などのＩＣＡＭ−Ｒ変異体の調製が可能になる。　この変異 体は、ＩＣＡＭ−Ｒタンパク質配列および免疫グロブリンＬ鎮不変領域および／ またはヒンジ領域の存在により特徴づけられる。 Ｃａｐｏｎ　ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３３７　：５２５−５３１　（１９８９）； 　Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐ、　Ｎ。 Ａ、Ｓ、　、　（ＵＳＡ）、　８８：１０５３５−１０５３９　（１９９１）； および１９８９年４月６日発行のＰＣＴ　ＷＯ８９１０２９２２を参照のこと。 　ＩＣＡＭ−Ｒ変異体融合タンパク質はまた、例えば、選択されたＩＣＡＭ−Ｈ の細胞外領域および他の細胞間接着分子の部分を含む。 本発明によって提供されるＤＮＡおよびアミノ酸配列の情報により、ＩＣＡＭ− Ｈの構造および機能の系統的分析およびＩＣＡＭ−Ｒが細胞外および細胞内レベ ルで相互作用する分子の定義付けが可能になる。　本発明の抗ＩＣＡＭ−Ｒモノ クローナル抗体のイディオタイプは、このような分子の例であり、天然の結合タ ンパク質（ペプチドおよびポリペプチド）を再現し得る。　この天然の結合タン パク質を通じてＩＣＡＭ−Ｒ細胞間および細胞内活性が調節され、あるいは、こ のタンパク質によりＩＣＡＭ−Ｒ分子が細胞間および細胞内現象を調節する。　 あるいは、このタンパク質は、ＩｃＡＭ−Ｒ活性の新しいクラスのモジュレータ −を意味する。　抗イデイオタイプの抗体もまた、生物学的に活性なＩＣＡＭ− Ｒ等価物の新しいクラスの例である。　ＩＣＡＭ−Ｈの活性を調整する抗体もし くは他の要素を同定するための１ｎｖｉｔｒｏ分析は、例えば、ＩｃＡＭ−Ｒ， あるいはＩＣＡＭ−Ｒが結合する天然リガンドを固定化し、固定化していない結 合対象を検出可能に標識付けし、結合対象と共にインキュベートし、そして、試 験化合物か欠如した条件下で結合した標識の量との比較における、試験化合物の 存在下で結合した標識の量の減少か、その試験薬剤かＩＣＡＭ−Ｒ結合の阻害剤 であることを示す手段によって、結合した標識の量に関する試験化合物の効果を 決定することによって行う。　本願発明によってもたらされたＤＮＡ配列情報は 、機能性ＩＣＡＭ−Ｒタンパク質の発現、あるいは変異１ｃＡＭ−Ｒタンパク質 の発現を阻害する鰯歯動物の作成をも、相同組み換えあるいは「ノックアウト」 法〔Ｋａｐｅｃｃｈｉ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４４：　１２８８−１２９２　 （１９８９））によって可能にする。　かような鰯歯動物は、ｉｎ　ｖｉｖｏで の、ＩＣＡＭ−ＲおよびＩＣＡＭ−Ｒ調整物の活性の研究のためのモデルとして 有用である。 図面の簡単な説明 本発明の多くの他態様および利点は、以下の詳細な説明、図面の説明を考慮すれ ば明らかである。 図１　（ＡからＧ）は、ＩＣＡＭ−ＲをコードするＨＬ６０細胞由来の単離され たｃＤＮＡクローン挿入物（配列番号：２）およびその読取枠の推定アミノ酸（ 配列番号＝１）を示す。 図２　（ＡからＢ）は、ＩＣＡＭ−ＲＤＮＡブローブオヨヒｌｃＡＭ−Ｉ　ＤＮ Ａプローブを用いた形質導入したし細胞のノーザンプロット・ハイブリダイゼー ションの結果を示す棒グラフである。 図３（ＡからＦ）は、ＩＣＡＭ−ＲＲＮＡプローブあルイハＩＣＡＭ−ＩＲＮＡ 　フローブを用いた形質導入されたし細胞のインサイチュ・ハイブリダイゼーシ ョンの結果を示す顕微鏡写真である。 図４Ａは、抗−ＣＤ１８抗体の存在あるいは欠乏下における可溶性ＩｃＡＭ−Ｒ への、白血球接着欠乏症を患った患者からの、ＰＭＡ−刺激あるいは無刺激リン パ芽球細胞の接着に関する分析結果を示す棒グラフであり、また、図４Ｂは、抗 −Ｃ０１８あるいは抗−ＣＤ１１ａ抗体の存在あるいは欠乏下における可溶性Ｉ ＣＡＭ−Ｒへの、他の様々なＰＭＡ−刺激あるいは無刺激細胞系の接着に関する 分析結果を示す棒グラフである。 図５は、ＩｃＡＭ−Ｒ，ＩＣＡＭ−１、あるいはＩＣＡＭ−２に特異的なモノク ローナル抗体を用いた形質導入し細胞の間接蛍光抗体染色のＦＡＣ３分析の結果 をヒストグラム様式で表している。 図６は、本発明の抗ＩＣＡＭ−Ｒモノクローナル抗体のエピトープをマツプする ために用いられた三つのキメラＩＣＡＭ−Ｒタンパク質を表している。 図７　（ＡからＢ）は、ＩＣＡＭ−ＲあるいはＩＣＡＭ−Ｉ　ＤＮＡプローブを 用いた、ヒト白血球細胞系および屓の緒内皮細胞のアクチン標準化ノーザン・プ ロット・ハイブリダイゼーションの結果を表す棒グラフを示している。 図８　（ＡからＢ）は、ＩＣＡＭ−Ｈに特異的なモノクローナル抗体を用いた、 ヒト細胞系由来の溶解物の免疫沈降のウェスターン・プロットの写真である。 図９　（ＡからＧ）は、抗ＩＣＡＭ−Ｒモノクローナル抗体を用いた、様々なヒ ト組織の免疫組織学的染色の顕微鏡写真を表している。 図１０は、抗−ＣＤ３抗体による白血球増殖の刺激に関する抗Ｉ　ＣＡＭ−Ｒモ ノクローナル抗体の効果を示す棒グラフである。 図１１（ＡからＢ）は、ヒト末梢血リンパ球の超抗原誘導増殖に関する抗ＩＣＡ Ｍ−Ｒモノクローナル抗体の効果を表す棒グラフであり、また、図１１Ｃは、ヒ ト末梢血リンパ球の超抗原誘導増殖に関する抗ＩＣＡＭ−Ｒモノクローナル抗体 の影響をロジスティック用量応答曲線を含むグラフである。 図１２は、同種抗原誘導Ｔ細胞増殖に関する抗ＩＣＡＭ−Ｒモノクロ−ナル抗体 の効果を表す棒グラフである。 図１３は、「記憶ＪＴ細胞の超抗原誘導増殖に関する抗ＩＣＡＭ−Ｒモノクロー ナル抗体の効果を表す棒グラフである。 図１４は、「休止ＪＴ細胞の超抗原誘導増殖に関する抗ＩＣＡＭ−Ｒモノクロー ナル抗体の効果を表す棒グラフである。 図１５は、架橋した別々のＩＣＡＭ−ＲエピトープかＩＣＡＭ−Ｒの細胞骨格へ の結合に個々に影響することを表した棒グラフである。 詳細な説明 本発明について、ヒトＨＬ６０プロミエロサイト細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ２４０） 由来のｃＤＮＡライブラリーから得られた、ＩｃＡＭ−Ｒをコードする全長のｃ ＤＮＡクローンの単離およびＬ細胞中でのＩＣＡＭ−Ｈの発現に関して、以下の 実施例で説明する。　より詳細には、実施例１は、ＩＣＡＭ関連ＤＮＡのＰＣＲ 増幅のためのオリゴヌクレオチドプローブの設計および構築について述へている 。　実施例２は、ＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−２をコードするＤＮＡと類似し た、別個のゲノムのＤＮＡ断片を増幅するためのプローブの使用について述べて いる。　実施例３は、さらなるＩＣＡＭ−Ｒコード配列を単離するためにゲノム の断片でｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることについて述べている。 　実施例４は、ＩＣＡＭ−Ｒをコードする全長のヒトｃＤＮＡを単離するために 、さらにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることについて述べている。 　実施例５は、ＩＣＡＭ−ＨのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列の情報の特徴づけ を行い、そしてＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−２とその構造との関連づけを行っ ている。　実施例６は、ＩＣＡＭ−Ｒの嘔歯類の類似体をコードするＤＮＡ配列 の単離について記載している。　実施例７は、ＩＣＡＭ−Ｒを発現する哺乳類の 宿主細胞の調製に関する。　実施例８は、ＣＤ１８依存性あるいはＣＤ１８非依 存性経路に関する細胞間接着現象に関する予備実験について記載している。　実 施例９は、ＩＣＡＭ−Ｒ由来のペプチドによる、ＩＣＡＭ−Ｒへの細胞接着の阻 害を示した実験について記載しである。　実施例１０は、誓歯動物１ｃＡＭ−Ｒ ／グルタチオンＳ転移酵素融合タンパク質の集団の構築と発現を開示している。 　実施例１１は、ＩＣＡＭ−Ｈの可溶性変異体の構築と発現に関する。　実施例 １２は、細胞外領域にて点変異したＩＣＡＭ−Ｒ変異体の構築と発現を開示して いる。　実施例１３は、抗ＩＣＡＭ−Ｒ抗体の調製と予備的特徴付、およびその Ｐａｂ’抗体の調製を開示している。　実施例１４は、本発明の抗１ｃＡＭ−Ｒ モノクローナル抗体によって認識されるＩＣＡＭ−Ｒエピトープのマツピングに 関する。 実施例１５．１６および１７は、ＩＣＡＭ−Ｒポリペプチドおよびそれをコード するＲＮＡの、正常細胞中、組織中および様々な細胞系中での分布および生物学 的特徴付けの評価に関する。　実施例１９は、ホモタイプの細胞−細胞の接着に おけるＩＣＡＭ−Ｒの関与に関する分析について記載している。　実施例２０は 、ＩＣＡＭ−Ｒが免疫細胞活性化／増殖に関与していることを示す予備実験につ いて述べている。　実施例２１には、本発明のＩＣＡＭ−Ｒ特異的モノクローナ ル抗体の特徴を要約しである。　実施例２２は、ＩＣＡＭ−Ｈの細胞質領域の異 なるリン酸化および細胞骨格結合を示す実験について記載している。 実施例１ 各々のＣＡＭｓのセット（例えば、ＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１）の核酸お よびアミノ酸配列では、関連の新規遺伝子を単離するための、共通タイプのプロ ーブのデザインに有用な情報を得るのに十分な分子間の保存が明らかにならなか った。　したかって、細胞間接着分子をコードする未知のＤＮＡを単離する試み の戦略の中心は、別個の様々な既知分子の推定ＤＮＡ配列を表す縮重共通オリゴ ヌクレオチドの開発、そして、（既知のＤＮＡに似ているが、同一ではない）中 間体遺伝子配列のＤＮＡ　？Ｊｊ製物のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅の ためのプライマーとしてのこれらのオリゴヌクレオチドの使用を含むものであっ た。　オリゴヌクレオチドプライマー設計の出発点は、ある種のＣＡＭｓの免疫 グロブリン様ループを形成しているシスティンを囲む領域中のアミノ酸がいくら か保存されていることに気付いたことであった。　反応部位のアミノ末端側の配 列が； であることが判明し、一方で、残基のカルボキシ末端側の配列が。 が、典型的である。　［Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、　３２３： 　１５−１６（１９８６）；　Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、、６：３８１−４０５　（１９８８）↓およびＮｅｗｍａｎら、前出の 文献を参照のこと。］　これらの二つのアミノ酸部位は、それ自身では、一般的 すぎて、共通の部位を持つであろう未知のＤＮＡのためのプローブとして有用な オリゴヌクレオチドの変性セットの構築はできない。　この問題を解決しようと する試みとして、個々のＣＡＭ配列が、上記のシスティン部位末端によって規定 される領域のサブファイルに分類された。　このサブファイルは、ヒト管接着分 子（ＶＣＡＭ−１）の七つの領域、ヒト血小板内皮細胞間接着分子（ＰＥＣＡＭ −１）の六つの領域、ＩＣＡＭ−１の五つの領域、ＩＣＡＭ−２の二つの領域、 ヒトミエログロビン関連グリコタンパク質およびヒト繊維芽細胞成長因子レセプ ター双方の四つの内の三つの領域、およびマウス神経細胞間接着分子（ＮＣＡＭ ）の五つの領域のそれぞれに対して調製された。　すべてのサブファイルはプー ルされ、システィン部位の周囲の共通配列を確かめることができるような配列の 樹木図を提供する［Ｃｏｒｐｅｔ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｈ、　１６　（２２）：１０８８１−１０８９０　（１９８８）］の「マル タリン」と称するマルチ配列相同性−コンピューターアルゴリズムを用いて、Ｃ ＡＭの起源から独立的に分離された。　アミノ末端のシスティン部位を示す共通 配列は、 と決定され、一方で、カルボキシ末端の共通配列は、と決定された。 部分的変性を解消するために、ヒトの好ましいフドンを取り入れ、推定アミノ末 端部位から増幅するためのトップ・ストランドＰＣＲプライマーを使用するため に、三つの異なる変性オリゴヌクレオチドのセットで、計１１５２個のプローブ を調製した。 三つのプールの特定の変性配列は、ＩＵＰＡＣ命名法に従って、以下の通りとな った。 各プライマーは、増幅された生成物のクローニングを促進す推定カルボキシ末端 部位から増幅するためのボトム・ストランドプライマーとして、ＩＵＰＡＣ命名 法で下記のような７６８個のプローブが設計された。　これら各プライマーは、 増幅された生成物のクローニングを促進するために、Ｘｂａ　Ｉ制限エンドヌク レアーゼ認識部位（ＴＣＴＡＧＡ）を含んでいた。 オリゴヌクレオチドは、アプライド・バイオシステムス社（Ｆｏｓｔｅｒ市、カ リフォルニア州）製のモデル３９４　ＤＮＡ自動合成機で、０．２マイクロモル ・スケール合成プログラムに従って、β−シアノエチル作用によって合成した。 　次に、６時間以上、５５°Ｃで加熱して保護基を除去した。　次に、オリゴヌ クレオチドを凍結乾燥し、ＴＥ（ｌｏｍＭ　ＴｒｉｓＳｐＨ７，０、ｌ　ｍｍ　 ＥＤＴＡ）中で再水和し、そしてＧ２５−１５０セフアデツクスで、サイズ排除 クロマトグラフィーによりＴＥ中で脱塩した。 実施例２ 設計と合成に関して、実施例１に記載の二つのセットのプローブを、ＩＣＡＭ− １およびＩＣＡＭ−２の免疫グロブリン様ループ領域と同様の大きさのＰＣＲで 作成した断片を単離し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（ＳｔｒａＬａｇｅｎ ｅ社、ＬａＪｏｌｌａ　、カリフォルニア州）中にサブクローン化し、そして配 列決定によって直接的に、ならびに順番にハイブリダイゼーションすることによ って、ＩｃＡＭ−２ＤＮＡに対する相同性を調べるために、ヒトゲノムＤＮＡ鋳 型のＰＣＲ増幅の操作に用いた。　断片の約５０％（もちろん、変性プライマー の領域を除いて）が、ＩＣＡＭ−１あるいはＩＣＡＭ−２と同じであった。 １３−３Ｃ７と称する一つのサブクローンは、ＩＣＡＭ−１およびＩｃＡＭ−２ のそれぞれの二番目の領域中の読取枠と同様のものを有していることが認められ た。　Ｇｅｎｅデータバンク中に存在するどの既知の配列とも対応しなかった。 　サブクローン１３−３Ｃ７の単離に至るまでの操作は、以下の通りであった。 末梢血白血球あるいはＨｅ１ａ細胞から得られたヒトゲノムＤＮＡを増幅させる ために、変性オリゴヌクレオチドを最終濃度ｌＯμｇ／ｍｌになるように、ＰＣ Ｒ反応液に混合した。　ＤＮＡ増幅は、ＰＣＲ緩衝液（２ｍＭ　ＭｇＣｌ２．２ ５ｍＭ　ＫＣＩ、１０ｍＭ　トリスｐＨ８，３）中で２ｍＭデオキシヌクレオチ ドの存在下で行なわれた。　９４℃での４分間の変性の後、６０℃にて２分間の アニーリング、７２℃にて４分間の伸長、そして９４℃にて１分間の変性を含む ＰＣＨのサイクルを３０回行なった。　約０．２ｋｂに移動したＤＮＡバンドを 、６％ポリアクリルアミドゲルから電気溶出によって抽出し、Ｘｂａ　１および Ｐｓｉ　Ｉ制限酵素で消化し、そして旧ｕｅｓｃｒｉｐＬベクター（Ｓｔｒａｔ ａｇｅｎｅ社）中にライゲーションした。　このプラスミドを大腸菌のＸＬ　１ −ブルー株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）中にエレクトロポレーションし、コロニ ーをＸ−ｇａｌ　ＩＰＴＧ、カーペニシリン寒天プレート上で選択した。　Ｍ１ ３Ｋｏ７ヘルパーフアージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、カーペニシリン、およ びカナマイシンをそれぞれのコロニーの２ｍｌ培養液に加えた後、−零値鋳型を 六つの白いコロニーから得た。　配列分析のために、次に、ＤＮＡ自動配列決定 機器（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびシークエナーゼ・キット （ＵＣＢＢｅｌｇｉｕｍ）双方を用いたサンガー法により、−零値鋳型を配列決 定シタ。　１８４−１８５塩基対（ｂｐ）長の、ＩＣＡＭ−２ト９２％−９５％ 相同性の四つの配列（クローン１．１．　１．３．１．４．１．６）が得られた 。　さらに、ＩＣＡＭ−１様領域の読取枠中にフレームシフトを含む１８２ｂｐ 長のＤＮＡ配列（クローン１．５）と、切断型免疫グロブリン様領域に対応する ６６ｂｐ　ＤＮＡ　（クローン１．２）か得られた。 クローン１．６．１．５．１．２の配列を、次の試験に用いる三つのオリゴヌク レオチドプローブ（ＲＭ１６、ＲＭ１５、ＲＭ１２）を設計するために用いて、 先に単離されたクローンと高度に相同性のあるＤＮＡを含むさらなるコロニーを 考慮から外した。　プローブＲＭ１Ｇ、ＲＭ１５、およびＲＭ１２のプローブの 配列は、以下の通りである。 プローブＲＭ１６　（配列番号　１２）ＧＡＧＡＣＴＣＴＧＣＡＣＴＡＴＧＡＧ ＡＣＣＴＴＣＧプローブＲＭ１５　（配列番号：１３）ＣＡＧＧＴＧＡＴＴＣＴ ＣＡＴＧＣＡＧＡＧＴＣＣＡＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＡＡＧＴＧＴＧＴ ＣＣＡＡ第２ラウンドの試験では、Ｘｂａ　ＩおよびＰｓｔ　Ｉで消化した起源 のＰＣＲ産物から、およびポリメラーゼＩのフレノウ断片によりさらに処理され て平滑末端化されたＰＣＲ生成物から、平滑末端ライゲーションによるサブクロ ーン化により、新しいコロニーを得た。　インサートを有するベクターを含んだ コロニーを、Ｘ−ｇａ　ｌおよび１ＰＴＧを含むカーペニシリン・Ｌブロス・ア ガロースプレートで選択した。　次に、それぞれの白いコロニーを、３００μＩ Ｌブロス中に、Ｍ１３ＫＯ７フアージ、カーペニシリン、およびカナマイシンを 加えて、生育させることによって、−零値鋳型を９６穴プレートで合成した。　 １０μｍのそれぞれの鋳型を尖った器具で、ナイロン膜に移し、変性させ、紫外 線ライトで固定させた。　（それぞれの９６穴プレートの、１０μｌのそれぞれ の鋳型を、異なる三つのナイロン膜に移した。）　オリゴヌクレオチドＲＭ１６ 、ＲＭ１５、ＲＭ１２を、［λ−”Ｐ］　ＡＴＰを用いたリン酸化により標識付 けした。　ナイロン膜を２０％ホルムアミド、５ｘｓｓｃ、ｓｘデンハート溶液 および０．５％ＳＤＳ中で、４２℃にて３時間プレハイブリダイズし、次に同し 条件下で異なった放射性同位元素標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて 、−晩ハイブリダイズした。　次に、膜を０．２ｘ　５ＳＣ１０，５％ＳＤＳ中 で、３回、１５分間ずつ室温にて洗浄し、次に、３７℃にて１５分間同じ緩衝液 で洗浄し、２ＸＳＳＣで洗浄し、感光させた。 三つのオリゴヌクレオチドプローブのいずれともハイブリダイズしなかったそれ ぞれの鋳型を、さらに、ＤＮＡ自動配列決定およびシークエナーゼキットを用い たサンガー法によって、配列決定した。　この方法を用いてクローン化された、 １３−３０７と称する１７０ｂｐのＤＮＡ配列が決定された。 実施例３ 実施例２で単離されたサブクローン１３−３Ｃ７のｃＤＮＡ挿入体を、ハイブリ ダイゼーションプローブとして用いて、ヒト膵臓、ヒト胎盤（二つのライブラリ ー）、およびヒト白血球細胞系Ｕ９３７（ＡＴＣＣＣＲＬ１５９３）から調製し た四つの異なるラムダファージｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた 。　簡単にまとめると、１２０個の陽性クローンを、（約１６０万個のスクリー ニングされたクローンから）取り、サブクローニングし、１３−３Ｃ７ブローブ で再度スクリーニングし、そして、再度スクリーニングされた陽性クローンを、 分析用ＰＣＲにて、ＤＮＡの挿入体に位置するプラスミドＤＮＡに対応するプラ イマーで、約５００ｂｐより大きい挿入体について、大きさに基づいて選択した 。　１９Ｃと称するＵ９３７　ｃＤＮＡ由来の１．３ｋｂのクローンを配列決定 し、そして、ｃＤＮＡ形成の前の不適当で不完全なｍＲＮＡスプライシングに起 因する、介在配列（イントロン）等で分けられる二つの免疫グロブリン様領域を コードするＤＮＡ領域が明らかになった。　二つの領域は、ＩＣＡＭ−１の領域 ２と領域３との比較で十分な相同性を示すが、結果的には異なり、ＩＣＡＭ−２ の領域ｌおよび領域２とは、より低い相同性を示した。 １９ｃの単離に至る手順は、以下の通りである。　ラムダｇ［１０フアージ（λ ｇｔｌＯ）中で、Ｕ９３７細胞系、慢性骨髄単球性白血病患者の膵臓、およびヒ ト胎盤から得られたｃＤＮＡを用いて、四つのライブラリーを構築した。　ｌ　 Ｈｒ−５′および１　）１ｒ−３’　と称する、正確に適合するオリゴヌクレオ チドを、（起源の変性プライマーの結合に関与する塩基を含めて）サブクローン １３−３Ｃ７の領域様領域の５゛および３′側に対応するように設計した。 ブライ？−ＩＨｒ−５°　（配列番号：１５）ＧＡＣＣＡＴＧＡＧＧＴＧＣＣＡ ＡＧ これらのオリゴヌクレオチドを１３−３Ｃ７挿入体鋳型および！２ｐ−ｄＣＴＰ と共にＰＣＲ反応に用いたところ、１４８ｂｐ長のＤＮＡプローブが作成された 。　ｃＤＮＡライブラリーをプレート腰ナイロン膜に移した。　この膜を４０％ ホルムアミド、５ｘＳＳＣ，５Ｘデンハート、０．５％ＳＤＳ中で、４２℃にて 少なくとも１５分間プレｌ＼イブリダイズし、次にプローブで、同し緩衝液中で 、４２℃にて一晩、ハイブリダイズした。　膜を２ｘＳＳＣ中で室温で数回洗浄 し、感光した。　プローブとハイブリダイズしたほとんどのファージプラークは 、Ｕ９３７　ｃＤＮＡライブラリー由来であった。 これらのファージは、、さらに精製され、そして、ＰＣＲで（Ｉ　Ｈｒ−５゛　 および１　）１ｒ−３’　をプライマーとして）　ｃＤＮＡ中の領域の存在に関 して試験した。　ファージはまた、クローンの長さおよびｃＤＮＡ断片中の領域 の位置を決定するために、（１３−３Ｃ７特異的プライマーおよび位置するラム ダｇｔｌｏベクター配列に類似するプライマーとの組合せを用いて）　ＰＣＲに よって試験された。　二つのクローンが選択された。　クローンＩＦは０．７ｋ ｂ長で、１９Ｃは１．３ｋｂ長であった。　これらのｃＤＮＡを、」ヨ旧で消化 し、そしてＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中にサブクローニングした。　さらに 、最大のｃＤＮＡ　（クローン１９ｃ）を超音波処理し、小さい断片を得て、配 列決定のために、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にサブクロン化した。 ＩｃＡＭ−１分子との相同性によって、クローン１９ＣｃＤＮＡは、それぞれＩ ＣＡＭ−１の領域２および領域３と相同性を有する、無関係のＤＮＡの介在配列 をもつ二つの領域を含んでいた。　これ以降、これらのＤＮＡ領域を、ＩＣＡＭ −Ｒの領域２および領域３と称する。 実施例４ 次に、実施例３で単離り、　ＩＣＡＭ−１の領域２および領域３に似た免疫グロ ブリン様ループをコードする領域を有する１、　３ｋｂのＤＮＡ（クローン１９ Ｃ）を、完全な長さのｃＤＮＡクローンを単離する試みにおいて、さらにｃＤＮ Ａライブラリーをスクリーニングするためのプローブを調製するために用いた。 　簡単に言えば、クローン１９ｃ中の領域２および３領域を、それぞれ、領域の アミノ末端（５°）およびカルボキシ（３′）末端部分に適合するように設計さ れた独特なプローブを用いて、ＰＣＲで増幅させた。　これらの増幅したＤＮＡ は、下記のものに由来するｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのためのプロ ーブとして提供された：　（１）　ＨＬ６０骨髄単球細胞系；（２）リボ多糖活 性化ヒト単球；　（３）　ＨＵＴ−７８Ｔ細胞（ＡＴＣＣＴｌＢ１６１）および （４）活性化末梢血白血球。　後者の二つのライブラリーからは、スクリーニン グで陽性体を得ることはできなかった。　ＨＬ６０および単球ｃＤＮＡライブラ リー由来の陽性体を、ＩＣＡＭ−１クローンを排除するために、次にＩＣＡＭ− ＩＤＮＡ　（ＧｅｎＢａｎｋ、受託番号２２６３４号）の領域２を有するプロー ブでスクリーニングした。　ラムダ３４５由来の一つのファグミド・クローンは 、ｐＶＺ−１４７と称する、陽性体を実施例４で単離したＤＮＡに基づくプロー ブとのハイブリダイゼーシヨーンで、陰性体をＩＣＡＭ−Ｉ　ＤＮＡプローブと のハイブリダイゼーションで、繰り返し試験された。　クローンｐＶＺ−１４７ からの約１．７ｋｂの挿入体を単離し、配列決定して、配列番号−２に示したよ うな１７８１ｂりの配列か得られた。　このＤＮＡによってコードされるポリペ プチドの推定アミノ酸配列を配列番号＝１に示す。　このポリペプチドは、Ｉｃ ＡＭ〜１およびＩＣＡＭ−２との構造上の関連性に基づいて、ｒｌｃＡＭ−ＲＪ 　と命名された。　ＩｃＡＭ−ＨのＤＮＡおよび推定アミノ酸配列は、この出願 の優先日の後に、Ｖａｚｅｕｘら、Ｎａｔｕｒｅ、　３６０：４８５−４８８　 （１９９２）に公表された。　この出願の優先日の後に、ＦａｗｃｅＬｔら、前 出の文献に公表されたＩＣＡＭ−３のＤＮＡ配列の読取枠は、本明細書の図１　 （ＡからＧ）に記載のＩＣＡＭ−ＲのＤＮＡ配列のコード領域と二つのヌクレオ チドの位置で異なっている。 （１９４位および１２７５位のヌクレオチドを参照のこと。）ラムダファージク ローンｐＶＺ１４７の単離のために行った操作は、以下の通りである。　すべて のｃＤＮＡライブラリーは、ラムダｇｔ１０中で構築されたか、ＨＬ６０ライブ ラリーは、ファージラムダ３４５中でクローン化された。　ライブラリーのスク リーニングおよび再スクリーニングに用いるためのオリゴヌクレオチドは、以下 の配列を有していた。 プローブｌＨｒ　２−５’　（配列番号、１７）ＴＴＣＡＣＣＣＴＧＣＧＣＴＧ ＣＣＡＡプローブＩＨｒ　２−３°　（配列番号、１８）ＡＡＡＧＧＧＧＣＴＣ ＣＧＴＧＧＴＣＧプローブＩＨｒ　３−５’　（配列番号：１９）ＣＣＧＧＴＴ ＣＴＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡプローブ［Ｈｒ　３−３’　（配列番号、２０）Ｃ ＡＴＧＡＣＴＧＴＣＧＣＡＴＴＣＡＧＣＡプローブｌｃａｍ　１−５　（配列番 号　２１）ＧＣＡＡＧＡＡＣＣＴＴＡＣＣＣＴＡＣプローブｌＨｒ　２−５’お よびＩｔ（ｒ　２−３°は、”Ｐ−ｄＣＴＰを用いたクローン１９ｃ鋳型のＰＣ Ｒ増幅に用いられ、ｃＤＮＡのスクリーニングのための領域２に特異的なプロー ブが調製された。　同様に、プローブＩＨｒ　３−５’およびｌＨｒ　３−３’ は、領域３に特異的なプローブを作成するために用いられた。　最後に、プロー ブＩｃａｍ　１−５およびプローブＩｃａｍ　１−３は、ＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡ 配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号２２６３４号）の４４０から６０９の塩基、すな わち、ＩＣＡＭ−１の第二領域に対応するＩＣＡＭ−１セグメント・プローブを 増幅するために用いられた。 ｃＤＮＡライブラリーをプレートし、ナイロン膜に移し、領域２プローブ（クロ ーン１９Ｃ由来）と、４０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ，５ｘデンハート、０． ５％ＳＤＳ中で７為イブリダイズさせ、上記したように洗浄した。　領域２プロ ーブと／”ｌイブリダイズするすべてのプラークは、単球およびＨＬ６０ライブ ラリー由来であった。　これらのファージプラークは、希釈、載置、移転および 領域２プローブとのハイブリダイゼーションにより精製された。　さらにｃＤＮ Ａクローンを特徴づけるために、領域２プローブとハイブリダイズしたそれぞれ のプラークを順番に三つ生育させ、ニトロ膜に移し、そして厳重な条件下（５０ ％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ，５Ｘデンハート、０．５％５ＤＳ）で、三つの異 なるプローブでハイブリダイズさせた。　プローブは、領域２プローブ、領域３ プローブ、およびＩＣＡＭ−１第二領域プローブであった。　領域２および領域 ３プローブの両方とハイブリダイズし、ＩＣＡＭ−１の第二領域プローブとはハ イブリダイズしないクローンが、ＨＬ６０ライブラリーから五つ、単球ライブラ リーから二つ認められら。　ＨＬ６０ライブラリーからの第６のクローンは、領 域２プローブとのみハイブリダイズし、そして、領域３あるいはＩＣＡＭ−１第 二領域とはハイブリダイズしなかった。　ＨＬ６０ライブラリー由来の６つのク ローンのｃＤＮＡは、さらに分析された。 ファージは、適性にスプライスされたｃＤＮＡの存在を、領域２の５゛末端に対 応するオリゴヌクレオチドプライマー（ＩＨｒ２−５’　）、および領域３の３ ゛末端に対応するオリゴヌクレオチドプライマー　（ＩＨｒ３−３’）を用いた ＰＣＨによって、試験された。　クローンはまた、クローン中の領域の長さおよ び位置を調べるために、ＰＣＲによって試験された。　ｃＤＮＡプラスミドは、 Ｓｆｉ　Ｉによる消化およびセルフライゲーションによって、ファージラムダ３ ４５から取り出されて、環化された。　−零値鋳型をつくり、両方向の配列決定 を行なうために、各ｃＤＮＡもまた、ＢＩｕｅｓｃｒｉｐＬ　ＳＫ＋ベクター（ Ｓｔｒａｇｅｎｅ社）中にサブクローン化した。　プラスミドｐＶＺ１４７は、 一つの読取枠に全ＩＣＡＭ−Ｒコード配列を含むものであると決定した。 図１　（ＡからＧ）は、上記の実施例４で単離されたラムダファージクローンｐ ＶＺ１４７のヒトｃＤＮＡ挿入体の配列を示す図である。 開示された全１７８１ｂ１１を、配列番号・２に示した。　配列番号：１に示し たＩＣＡＭ−Ｒポリペプチドの推定アミノ酸配列は、図１（ＡからＧ）で、以下 の領域に図中にて分けている。 （１）推定シグナルあるいはリーダー配列は、「成熟」タンパク質の前に表され ており、アミノ酸−２９から−ｌにわたっている。　翻訳生成物が実際に−２９ あるいは−２６にて開始するか否かを決定するのは、細胞間発現生成物のアミノ 酸配列決定による。　成熟タンパク質の最初の残基の指定は、分泌ヒトタンパク 質の成熟タンパク質およびリーダー配列の境界領域のアミノ酸（および対応する 塩基）残基の一般化された類似性に基づいた。　実際の成熟タンパク質の開始残 基の配座は、分泌された組換え生成物、あるいは、例えば、免疫精製された天然 生成物の配列決定を待つ。 （２）＋１から５１８にわたる成熟タンパク質中で、五つの推定免疫グロブリン 様ループ領域が示されている（黒に白字）。 この領域は、五つの推定免疫グロブリン様領域中のシスティンによって結合して いる（囲っである箇所）。　第一の領域（残基ｌから９１）では、ループ形成の 可能性が十分なシスティン残基は、２４位、２８位、６７位および７１位に存在 していることに留意すること。　残りの推定ループのそれぞれは、その末端に一 つの適切なシスティンを有している。 （３）同様に成熟タンパク質中では、第五の免疫グロブリン様領域の後の、推定 の疎水性「縁膜的」領域は、残基４５７がら４８１を結ぶダッシュで示している 。　推定カルボキシ末端「細胞質」領域は、残基４８２から５１８である。 （４）可能性のあるＮ−結合グリコシレーション部位〔共通配列、アスパラギン −Ｘ−（セリンあるいはスレオニン）］は、星印で示す。　可能性のある〇−結 結合グリコシレージョン部位、セリンあるいはスレオニン残基にある。 ＩＣＡＭ−Ｈのアミノ酸配列およびＩＣＡＭ−１の公表された５３７残基のアミ ノ酸配列（Ｇ６ｙＩＢａｎｋ受託番号２２６３４号−１釈、１９８８年１１月１ １日公開の欧州特許出願０２８９９４９号の図８）との比較を行なった。　この 比較によって、対応させた５３７残基中に２４９の適合か認められ、この二つの ポリペプチドの間では全体として４８％のアミノ酸の一致があることかわかった 。　もっとも高い適合率は、ＩＣＡＭ−１の領域２および３とＩｃＡＭ−Ｒの推 定領域２および３との間に存在することが示された。　同様に、配列番号：ｌと 公表されたＩＣＡＭ−２の２９５残基のアミノ酸配列（Ｇ（４１Ｂａｎｋ受託番 号２２６３５号２店罫、１９９０年９月１９日公開の欧州特許出願０３８７６６ ８号の図２）とを対応させてみると、２８２の残基の内、ち、７８の適合が認め られ、一つの並び方で、全体的には２７％の一致が認められた。　ある並び方に おいて、ＩＣＡＭ−Ｈの細胞質領域は、ＩＣＡＭ−１の細胞質領域と２０％一致 することか認められ、そしてＩＣＡＭ−２の細胞質領域と３４％一致することも 認められた。 Ｂ、ＩＣＡＭ−ＲＤＮＡの特徴付は ヒトＩＣＡＭ−ＲＤＮＡ配列（配列番号、２）を、公表されたＩＣＡＭ−１およ び前出のＩｃＡＭ−２のＤＮＡ配列と比較した。　ＩＣＡＭ−ＲおよびＩＣＡＭ −１の１６２３の塩基の中で、計６７７個の適合がみられ、全体として４１％が 一致していた。　ＩＣＡＭ−ＲおよびＩｃＡＭ−２ＤＮＡの１１３６塩基の間で ４２％の一致（４８４の適合）が認められた。 ＩＣＡＭ−Ｒ遺伝子の単離に「歴史的」重要性を有する、図１　（ＡからＧ）の ＤＮＡの参照符には、下記のものが含まれる。 （ａ）実施例２にて単離されたサブクローン１３−３Ｃ７に対応する塩基４２０ から５６７； （ｂ）実施例３のクローン１９ｃ中に位置する、免疫グロブリン様領域２に対応 する塩基３７３から６６３（実施例４に用いるためのオリゴヌクレオチドプロー ブの一つを提供するために、領域２のＰＣＲ増幅に用いられた、プローブＩｆ（ ｒ２−５’およびＩＨｒ２−３′にそれぞれ対応する、塩基４１８から４３５お よび５６１から５７８を含む。）；および （Ｃ）実施例３のクローン１９ｃ上に位置する、免疫グロブリン様領域３に対応 する塩基６６４から９５７（実施例４に用いるための他のオリゴヌクレオチドプ ローブを提供するために、領域３のＰＣＲ増幅に用いられた、プローブＩ！（ｒ ３−５°およびＩＨｒ３−３′にそれぞれ対応する、塩基６９９から７１７およ び８００から８１９を含む。） Ｃ，ヒトＩＣＡＭ−Ｒをコードする配列の染色体位置ヒトＩＣＡＭ−Ｒがコード する配列が、第１９染色体の短鎖（ｐ）領域に局在していることを決定するため に、Ｃａｎｎ１ｚｚａｒｏ　ｅｔ　ａｌ、。 Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　５１：　３８１８−３８２０　（１９９１）に記載 の方法によってＤＮＡプローブを調製した。 実施例６ ヒトＩＣＡＭ−Ｒの嘔歯類相同体をコードするＤＮＡ配列を、ＩＣＡＭ−Ｈに特 異的なプローブを用いて、低度の緊縮条件下でのハイブリダイゼーションにて単 離した。　かようなりＮＡは、ＩＣＡＭ−Ｒ発現が欠如した嘔歯類株を作成する ために、相同組み換えあるいは「ノックアウト」法にて使用することができる。 　加えて、嘔歯類１ｃＡＭ−ＲＤＮＡクローンは、ｉｎ　ｖｉｖｏでのＩＣＡＭ −Ｒの活性の調整のための嘔歯類モデルにて試験できる薬剤（例えば、モノクロ ーナル抗体）の作成に有用な、組み換え嘔歯類ＩＣＡＭ−Ｒタンパク質を調製す るために使用することができる。 Ａ、ラット・ゲノミックＩＣＡＭ−Ｒ領域２クローンの単離ＩｃＡＭ−Ｒの嘔歯 類の類似体が、ＩＣＡＭ−Ｒ特異的プローブを用いて低い厳重条件下でのハイブ リダイゼーションによって、単離された。 成体Ｂａ１ｂ／ｃマウスＰＢＬ　ｃＤＮＡラムダファージ・ライブラリーおよび ラットＰＢＣｃＤＮＡラムダファージ・ライブラリー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社、 　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）およびラット肝臓ＤＮＡおよびＣ６Ｖ Ｌリンパ芽球細胞ＤＮＡから調製されたラムダファージ・ラットゲノムＤＮＡラ イブラリーを、全長のヒトＩＣＡＭ−Ｒ遺伝子あるいはその断片でスクリーニン グした。　ライブラリープラークをＨｙｂｏｎｄ　Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓ ｈａｍ社、ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ　。 イリノイ州）に移した。　すべてのプレ／＼イブリダイゼーションおよびハイブ リダイゼーションは、４２℃にて、４０〜５０％ホルムアミド、５×デンハート 、５ｘＳＳＰＥおよび１．０％ＳＤＳの溶液中で行なわれた。！２ｐ放射性同位 元素標識したプローブを／−イブリダイゼーション溶液のＩＯ５〜１０’　ｃｐ ｍ／ｍｌの濃度で加えた。 ハイブリダイゼーションの後、フィルターを室温で２ｘＳＳＰＥ１０．１％ＳＤ Ｓ中でよく洗浄し、次にＸ線フィルムに感光した。 陽性クローンをさらなるハイブリダイゼーションによって、プラーク精製した。 　ラムダＤＮＡをそれぞれのクローンの溶解物から調製し、Ｈａｅ工Ｉ１１ある いはＲｓａ　Ｉのいずれかで消化した。 ゲノムＤＮＡの断片を分析のためにシーフェンス・ベクター中にクローン化した 。　嘔歯類のｃＤＮＡライブラリー由来の約２゜５×１０６個のプラークおよび ゲノムライブラリー由来の２．０ＸＩＯ’個のプラークを全長のヒトＩＣＡＭ− Ｒプローブでスクリーニングした。　ＩＣＡＭ−Ｈに関連するクローンはまった く確認されなかった。 さらに嘔歯類ｃＤＮＡライブラリー由来の０．５Ｘ　１０’個のプラークおよび 嘔歯類ゲノムライブラリー由来の１．　ＯＸ　１０’個のプラークを、配列番号 ＝２のヌクレオチド３７２から６６３に対応する、ＩＣＡＭ−Ｒ領域２特異的プ ローブで、スクリーニングした。　一つのラット由来のゲノムクローンは、ＩＣ ＡＭ−Ｒの領域２の嘔歯類相同物の候補として同定された。　配列番号＝２３お よび２４は、ラット領域２クローンの配列データ（３４１ｂｐ）を示している。 下記の表１は、ラットクローンの、ヒトＩｃＡＭ−Ｒ，ＩＣＡＭ−１、およびＩ ＣＡＭ−２に対応する領域へのＤＮＡおよびアミノ酸配列の一致を示す。 マウスＩＣＡＭ−２５４３８ Ｂ９部分的ラットＩＣＡＭ−ＲｃＤＮＡの単離ラットのマクロファージ、ＰＢＬ および膵臓λｇＬｌＯｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社、ラヨラ、 カリフォルニア州）をスクリーニングするために、ラットＩＣＡＭ−Ｒ領域２Ｄ ＮＡ（配列番号：２３）を、放射性標識材したプローブとして用いた。　ライブ ラリーのスクリーニング条件は、上記Ａ、にて言及した通りである。 単一のクローンが、膵臓λｇｔｌｏ　ｃＤＮＡライブラリーから単離された。　 クローンの配列解析から、全挿入体に及ぶ読取枠を有する（ＥｃｏＲ［端を含む ）　１２９４ｂｐの挿入体が認められた。　ヒトＩＣＡＭ−Ｒ配列との比較から 、ラット領域２クローンか、領域ｌの５゛端が欠失した領域２〜５、およびほと んどの縁膜領域、そして細胞質末端の３°端すべてをコードするヌクレオチドを 含んでいた。　部分的ラットＩＣＡＭ−ＲｃＤＮＡのＤＮＡ配列を、配列番号： ２５上記Ａ、にて記した手順によって実質的に単離した他のラット・ゲノミック ＩＣＡＭ−Ｒクローンは、ＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−Ｒ遺伝子が同し染色体 にあることを示す、ＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−Ｒ配列双方を含んでいた。　 Ｂａ１ｌａＬｙｎｅ　ｅＬ　ａｌ、、　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、　３：　５４７　（ １９９１）は、ラットＩＣＡＭ−１遺伝子は、ラット染色体９にあることを報告 している。　今日までに決定されているクローンのＤＮＡ配列は、ＩＵＰＡＣ命 名法により配列番号二２６に記しており、部分的ラットＩｃＡＭ−ＲｃＤＮＡク ローンに対応するエクソン、ならびにコード配列の１３４０ｂｐの上流域と９６ ０ｂｐの下流域をも含んでいた。 Ｄ、マウス・ゲノミッククローンの単離マウス・ゲノミッククローンを、ラット ＩＣＡＭ−ＲｃＤＮＡをプローブとして用いて、上記Ａ、にて記した手順によっ て単離した。 クローンのＩＣＡＭ−Ｒコード部分の５°端の１５９３ｂｐおよびクローンのＩ ＣＡＭ−Ｒコード部分の３°端の２８２０ｂｐのヌクレオチド配列を、ＩＵＰＡ ｃ命名法によって、配列番号：２７に記した。　クローンの配列決定部分は、配 列番号二２７でのＤＮＡ配列にてＮの表示で示した約１２０ｂｐの隙間によって 分離されている。 実施例７ ヒトＩＣＡＭ−ＲｃＤＮＡを、Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）マウス細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ　 １．３）中に形質導入し、そしてノーザンプロットおよびインサイチュハイブリ ダイゼーションによって、ＩＣＡＭ−Ｈの発現を調べるために、細胞の分析を行 った。 Ａ、　ＩＣＡＭ−ＲＤＮＡの形質導入 ｐＶＺ−１４７（実施例４）のヒトＩｃＡＭ−ＲｃＤＮＡ挿入体の全長およびそ のｃＤＮＡの３°側のファグミド・ベクターの一部を、制限酵素Ｎｏｔ　Ｉおよ びＸｂａ　Ｉを用いて切り出し、Ｎｏｔ　ＩおよびＸｂａ　Ｉで切断した市販の プラスミドｐＣＤＮＡ　１−ｎｅｏ　（ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＳａｎＤｉｅ ｇｏ　、カリフォルニア州）中にライゲーションして入れた。 得られた、ｐＣＤＮＡ　１−ｎｅｏ　ＩＣＡＭ−Ｒと称するプラスミドを、Ｃｈ ｅｎら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、７ ：　２７４５−２７４８　（１９８７）　Ｇ：記載のリン酸カルシウム沈殿法に よって、マウスＬ細胞中に形質導入した。　ＩＣＡＭ−Ｉ　ＤＮＡ　（ｐＣＤＮ Ａ−ｎｅｏ−１ｃＡＭ−１構築物）もまた、対照としてマウスＬ細胞中に形質導 入した。　完全なＩＣＡＭ−１タンパク質コード領域を含むｃＤＮＡ断片をプラ スミドｐＣＤＮＡ　１−ｎｅ。 にライゲーションし、リン酸カルシウム沈殿法によって、Ｌ細胞中に形質導入し た。　ネオマイシン耐性による選択に続（Ａて、個々のＩｃＡＭ−ＲあるいはＩ ＣＡＭ−１形質導入体を、クローニングシリンダー（Ｂｅｌｌｃｏ　Ｇｌａｓｓ 社、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、　＝　ニーーシャーシー州）を用いてサブクローン化し た。　次に、ＩＣＡＭ−ＲおよびＩＣＡＭ−１タンパク質を最も高いレベルで発 現しているクローンをセルソーターで分けた。 構築物ｐＣＤＮＡ−ｎｅｏ−ＩＣＡＭ−Ｒおよび匹ＤＮＡ−ｎｅｏ−ＩＣＡＭ− １もまた、ｃｖ−１細胞中に、リン酸カルシウム沈殿法によって、形質導入した 。 高いレベルのＩＣＡＭ−ＲおよびＩＣＡＭ−１を発現しているクローンを、上記 のし細胞形質導入体で述べたように選択した。　ＩＣＡＭ−ＲおよびＩＣＡＭ− １特異的抗体によるＦＡＣｓ分析に基づけば、タンｌ々り質発現のレベルは、Ｃ Ｖ−１形質導入体の方が、マウスＬＴＫ形質導入体より高かった。 Ｂ、ノーザンブロットハイブリダイゼーション全長のＩＣＡＭ−ＲあるいはＩＣ ＡＭ−１ｃＤＮＡｓをマウスＬ細胞中に形質導入した後、形質導入されたおよび 形質導入されていないし細胞中での、対応するｍＲＮＡ５の特異的発現を、３２ ｐ標識したＩＣＡＭ−ＲあるいはＩＣＡＭ−Ｉ　ＤＮＡプローブを用いたノーザ ンブロ・ソト／”ｔイブリダイゼーションによって調べた。　形質導入体は、対 数増殖期に来たとき、遠心分離して、１５０ｍＭのＮａＣｌで２回洗浄した。 沈殿を３．５ｍｌのＧＩＴ（グアニジウムイソチオシアナート）緩衝液中に再懸 濁し、２０秒間ポリトロンミキサーで破砕した。１．７ｍ１ＣｓＣ１緩衝液を超 遠心管に加えたのち、ＧＩＴ／ＲＮＡ混合物を上部に上層した。　試料を３５Ｋ 　（１７９，０００ｘ　ｇ）で、２０℃にて、２１時間遠心分離した。　すべて の液体を除去し、沈澱したＲＮＡを３００μｌの０．３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５ ，２中に再懸濁し、次に７５０μｌのエタノールで、−２０℃で沈殿させた。　 沈殿物を水中で再懸濁し、プロテアーゼにで処理してすべてのＲＮＡ５ｅを取り 除いた。 フェノール・クロロホルム抽出の後、ＲＮＡを再沈殿し、水中で再懸濁し、そし て２６０ｎｍにおけ試料の吸光度を測定した。 ジエチルピロカーボネート（ＤＢＰＣ）処理溶液で調製した溶液を用いて、ＲＮ Ａを１％ホルムアルデヒドアガロースゲル中で電気泳動した。　全ＲＮＡ試料１ ０μｇを、各レーンにのせた。　ＲＮＡを３０Ｖで、嬬動ポンプによって緩衝液 を連続循環させなから、約１８時間電気泳動した。　それぞれの得られたゲルを ２０ｘＳＳＰＨに２０分間、それぞれ室温で、二回浸した。　ＲＮＡのＨｙｂｏ ｎｄ−Ｃ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ　、イ リノイ州）への移行は、２０ＸＳＳＰＥ中、−晩、毛管現象を利用して行なわれ た。　Ｓｔｒａｔａ−ｇｅｎｅ社のストラタリン力−を用いて、紫外光に曝すこ とによって、それぞれの膜にＲＮＡを安定に架橋した。 ＩＣＡＭ−Ｉ　ＤＮＡプローブを調製するために、１００〜２００ｎｇの鋳型Ｄ ＮＡ　（ＩＣＡＭ−１コ一ド配列全体を含む１．　ｂｋｂの四／狂り断片）を水 およびランダムヘキサマーと、３２Ｐ−ｄＣＴＰおよび”Ｐ−ｄＴＴＰ。 １０−’Ｍ　ｄＧＴＰ／ｄＡＴＰ　５ＩＯＸクレノウ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ ｅｒ　ＭａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉ ｓ、インディアナ州）およびフレノウ酵素を混合し、５分間煮沸し、次に５分間 氷上でインキュベートし、そして混合物を１時間室温で放置した。　試料をＱｕ ｉｃｋｓｐｉｎ　Ｇ２５　ＤＮＡカラム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社）に通し、取 り込まれた標識を取り込まれていない標識から分離した。 ＩＣＡＭ−ＲＤＮＡプローブを作成すルタメニ、２００ｐｇ（７）　ＤＮＡ鋳型 （ポリＡテールを除くために切断したクローンｐＶＺ−１４７の１．４ｋｂの断 片）を、領域ｌの５゛および３°末端に相補的なオリゴヌクレオチドをプライマ ーとしてＰＣＲで増幅させた。　”Ｐ−ｄＣＴＰを反応混合物に加えた。　試料 を９４℃にて４分間維持し、次に温度変換工程（９４℃、１分；５０℃、２分； ７２℃、４分）（７）３０サイクルを行なった。　試料を次に、Ｑｕｉｃｋｓｐ ｉｎカラムに通し、標識の取り込みを１μｍのシンチレーション測定によって調 べた。 ＤＮＡプローブを５Ｍ　Ｎａ０）１で変性させ、次にＩＭのトリスで中和した。 　Ｈｙｂｏｎｄ　ｎ−Ｃ膜を、５０’Ｃにて３０分、５０％ホルムアミド・プレ ハイブリダイゼーション混合物でプレハイブリダイズした。 プローブをそれぞれの膜についてｌ　ＸＩＯ’　ｃｐｍ／ｍｌハイブリダイゼー ション混合物（５０％ホルムアミド、５×デンハート溶液、５ＸＳＳＰＥ、１％ ５ＤＳ）の濃度で加え、膜を一晩、４２℃にてインキュベートした。　次にそれ ぞれの膜を２　ｘ　５ＳＰＥ１０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分間ずつ、５回洗 浄した。　５０℃にて１０分間、０．５ＸＳＳＰＥ１０．１％ＳＤＳ中で１回洗 浄し、２ＸＳＳＰＥ中で１回洗浄した。 主要なＲＮＡ転写物とのハイブリダイゼーションを、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎ ａｍｉｃｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ社、カリフォルニア州）モデル４００Ａホスホ ・イメージヤ−を用いて定量した。 ノーザンブロットハイプリダイゼーションの結果は、図２（ＡからＢ）中に、棒 グラフの形で表した。　図２Ａは、ＩＣＡＭ−ＲプローブとＩＣＡＭ−Ｒ形質導 入体から抽出されたＲＮＡとの特異的ハイブリダイゼーションを表している。　 ＩＣＡＭ−１形質導入体由来のＲＮＡあるいは形質導入していないＬ細胞由来の ＲＮＡとは、ハイブリダイズしない。　逆に、図２Ｂは、ＩＣＡ、Ｍ−１プロー ブとＩＣＡＭ−１形質導入体由来のＲＮＡとはハイブリダイゼーションするが、 ＩＣＡＭ−Ｒ形質導入体由来のＲＮＡあるいは親のＬ細胞由来のＲＮＡとはハイ ブリダイゼーションしないことを示している。 Ｃ，インサイチュハイブリダイゼーションＬ細胞およびＩＣＡＭ−ＲあるいはＩ ｃＡＭ−１ｃＤＮＡで上記のように形質導入されたし細胞を、ＩｃＡＭ−Ｒある いはＩＣＡＭ−１由来の放射性同位元素標識した一零値ＲＮＡプローブでインサ イチュでハイブリダイズさせた。　−零値ＲＮＡプローブは、ＩＣＡＭ−Ｒある いはＩＣＡＭ−１の第一の（すなわち、Ｎ末端）免疫グロブリン様領域に対応す るＤＮＡ鋳型から、”５−ＤＴＰを取り込むｉｎ　ｖｉＬｒｏ　ＲＮＡ転写によ り調製した。　プローブは、約２００ｂｐにまで化学的に加水分解した。 形質導入済および未形質導入のし細胞を、ＶｅｃＬａｂｏｎｄ　（Ｖｅｃｔｏｒ ＬａｂＯｒａｔＯｒｉｅＳ社、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、カリフォルニア州）で被 覆したスライド上にのせ、−７０℃で保存した。　使用前に、スライドを一７０ ℃から取出し、５５°Ｃにて５分装置いた。　次に、載置部位を４％パラホルム アルデヒド中で、２０分間、４°Ｃで固定し、７０−９５−１００％エタノール 中で１０分間室温にて脱水し、３０分間空気乾燥した。　載置部位を７０℃、２ 分間、７０％ホルムアミド／２ＸＳＳＣ中で変性し、２ｘＳＳＣ中で洗浄し、脱 水して、３０分間空気乾燥した。　５０％ホルムアミド、０．３Ｍ　ＮａＣｌ、 ２０ｍＭトリスｐＨ８，０，１０％硫酸デキストラン、■×デンハート溶液、１ ００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）および５　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む混合物 で、２時間、４２°Ｃにて、プレハイブリダイゼーションを行なった。 ハイブリダイゼーションは、同じ混合物中で５０℃にて一晩（１２〜１６時間） 行なった。　この時、混合物中には、さらに３５Ｓ−標識ＩＣＡＭ−１あるいは ３５Ｓ−標識ＩＣＡＭ−ＲＲＮＡプローブ（６Ｘ　１１０５ｃｐ／載置部位）の いずれかが含まれていた。　ハイブリダイゼーションの後、２載置部位を、１時 間、室温にて、４　ｘ　ＳＳＣ／１０ｍＭ　ＤＴＴ中で、次に４０分間、６０℃ にて、５０％ホルムアミド７１　ｘ　ＳＳＣ／１０ｍＭ　ＤＴＴ中で、３０分間 室温にて、２ＸＳＳＣ中で、そして３０分間室温にて、Ｏ，ｌ　Ｘ　ＳＳＣ中で 洗浄した。　載置部位をアルコール脱水し、３０分間空気乾燥し、（４℃にて完 全な暗やみの中で保存した後）現像し、そして、ヘマトキシリン／エオシンで対 比染色した。 インサイチュハイブリダイゼーションの顕微鏡写真は、図３（ＡからＦ）に示さ れている。　ここで、顕微鏡写真３Ａは、ＩＣＡＭ−ＲＲＮＡてプローブした親 のし細胞であり；３Ｂは、ＩＣＡＭ−ＲＲＮＡでプローブした、ＩＣＡＭ−Ｒを 形質導入したし細胞であり；３Ｃは、ＩｃＡＭ−ＲＲＮＡでプローブした、ＩＣ ＡＭ−１を形質導入したし細胞であり：３Ｄは、ＩＣＡＭ−Ｉ　ＲＮＡでプロー ブした、親のし細胞であり：３Ｅは、ＩｃＡＭ−Ｉ　ＲＮＡでプローブした、Ｉ ＣＡＭ−Ｒを形質導入したし細胞であり、３Ｆは、ＩＣＡＭ−Ｉ　ＲＮＡでプロ ーブした、ＩＣＡＭ−１を形質導入したし細胞である。　顕微鏡写真は、それぞ れのＲＮＡプローブが、類似のｃＤＮＡで形質導入したし細胞のみと特異的にハ イブリダイズすることを示している。 実施例８ ＩｃＡＭ−Ｒを発現する形質導入したし細胞に対する、その表面上あるいは可溶 性ＩＣＡＭ−Ｒ（実施例１１）での白血球の接着を試験する実験により、ＩＣＡ Ｍ−Ｒが接着分子あるいは白血球上の分子のためのリガンド／レセプターである ことが示唆される。 Ａ、ＣＤ１８依存性細胞接着 Ｄｕｓｔｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、　３４１：　６１９−６２４　（１９８９）に 記載に従って、５ＫＷ３細胞（ＴＩＪンバ芽球細胞）をホルボールエステルで前 処理し、ＬＦＡ−１依存性接着を活性化し、そしてＩｃＡＭ−ＲおよびＩＣＡＭ −１形質導入体の結合について分析した。 形質導入していないし細胞あるいはＩＣＡＭ−ＲあるいはＩＣＡＭ−１（実施例 ７を参照のこと）のいずれかで形質導入したし細胞を、接着性分析の２４〜４８ 時間前に２４穴組織培養プレートに接種した（１つの穴あたり３Ｘ１０’個の細 胞）。　５ＫＷ３細胞を血清を含まないＲＰＭＩ　（Ｇｉｂｃｏ社、カナダ）で 洗浄し、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（Ｍｏｌａｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社、Ｂｕｇ ｅｎｅ、オレゴン州）で標識し、１０ｎｇ／ｍｌホルボールミリスチルアセテー ト（ＰＭＡ）で、２０分間、３７℃にて刺激した。　選択され、刺激された５Ｋ Ｗ３細胞を、次に、抗ＣＤ１８　（ＴＳＩ／１８、ＡＴＣＣＨＢ２０３）　、抗 ＣＤ　ｌ　ｌａ　（ＴＳ　１　／２２、ＡＴＣＣＨＢ２０２）ハイブリドーマ上 清あるいは対照として精製された抗ＣＤ２（ＡＴＣＣＨＢ１９５）モノクローナ ル抗体で、３０分間、付着性の形質導入したし細胞とインキュベーションする前 に、室温で前処理した。 抗体で処理した、あるいは抗体で処理していない、Ｃａ１ｃｅｉｎ標識した５Ｋ Ｗ−３細胞を、ＩＣＡＭ−ＲあるいはＩＣＡＭ−１の形質導入体の集密的単層に 加え（１穴あたり、５Ｘ１０５個の細胞）、モしてＲＰＭＩ／　１％ウシ胎児血 清（Ｆｅ２．　Ｈｙｃｌｏｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｌｏｇａｎ　、 ユタ州）中で、３７℃にて３０分間インキュベートした。 未結合の細胞を吸引し、そしてウェルをＲＰＭＩ−Ｆｅ２で満たした。 プレートをシールし、反転位して、２０Ｏｒｐｍで４分間遠心分離し、吸引した 。　次にプレートをＲＰＭＩ−Ｆｅ３で洗浄し、そして自動蛍光読取機で走査し た。 刺激した５ＫＷ３細胞のＩＣＡＭ−ＲおよびＩＣＡＭ−１形質導入体双方に対す る接着は、モノクローナル抗体で阻害された。　これらモノクローナル抗体は、 ＬＦＡ−１のａ　（ＣＤ１１ａ）あるいはβ（ＣＤ１８）鎖に対するものであっ た。　このことから、ＩＣＡＭ−Ｒは、β２インテグリン経路が関与する細胞間 接着現象に関与している可能性がうかがえた。　細胞内接着は、対照の抗ＣＤ２ 試薬によっては影響されなかった。 Ｂ、　ＣＤ１８非依存性細胞接着 白血球接着欠乏症（ＬＡＤ）を患った患者からのＣＤ１８陰性リン／々芽球細胞 は、実施例１１に記載の可溶性１ｃＡＭ−Ｈに結合した。（試験対照が、１％Ｂ ＳＡで被覆したプレートへの細胞の結合である図４Ａを参照。）　加えて、ＩＣ ＡＭ−ＲへのＪｕｒｋａＬ　Ｔリンパ芽球細胞系の結合のほとんど（８０〜９０ ％）が、抗−Ｃ０１８モノクローナル抗体［ＢｅａＬｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、 　１ｍｍｕｎｏ１．、１３１：　２９１３−２９１８　（１９８３）に記載の６ ０．３）あるいは抗ＣＤ１１ａモノクローナル抗体（ＴＳＩ／２２）（図４Ｂ） によって阻害されなかった。　これら結果は、ＩＣＡＭ−Ｈのこれら細胞系への 結合がＣＤ１８依存性であり、ＬＡＤおよびＪｕｒｋａｔ細胞がβ２インテグリ ンでないＩＣＡＭ−Ｈの対抗レセプターを発現することを示唆している。 実施例９ ヒト配列ＩＣＡＭ−Ｒペプチドを、５ＫＷ３およびＪｕｒｋａｔ細胞のＩＣＡＭ −Ｒへの結合を阻害するために用いた。　接着の前者のタイプは、ＣＤ１８依存 性であるのに対し、後者は概ねＣＤ１８非依存性である。 フィブロネクチンにおける公知のβ１インテグリン結合領域とのアミノ酸配列比 較、および細胞接着をブロックする抗ＩＣＡＭ−Ｒモノクローナル抗体（実施例 ２１の表１１、参照）に基づいて、正のインテグリン結合部位に対応するＩＣＡ Ｍ−Ｒペプチドを、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅｓ　（： ＩＯラド州立大学、フォート・コリンズ、コロラド州）によって合成した。　領 域ｌと３の間、あるいは予想されるβ鎖の間に横たわる４つのＩＣＡＭ−Ｒ配列 が選抜された。　同一ではないか、同様の、ＩｃＡＭ−Ｒに関するβ鎖の考察が 、５ｔａｕｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ、　６１：　２４３７２５４　（ １９９０）に記されている。　可溶性１ｃＡＭ−Ｒで被覆したプラスチックへの 細胞接着を含むシステムを用いて、阻害に関する分析を行った。　カルセイン標 識した細胞（上記Ａ節を参照）を、１〜２　ｍｇ／ｍｌのペプチドを用いて、２ ５℃で、２０分間インキュベートし、そして、予め可溶性ＩＣＡＭ−Ｒ（実施例 １１参照）で被覆し、最終濃度１０μｇ／ｍ１のホルボール１２−ミリステート １３−アセテート（ＰＭＡ）を含んだ９６穴ウエル板のウェルに細胞を移した。 　５０分後、板をＰＢＳ中に１０分間置き、未結合細胞を除去した。　結合した 細胞を、傾向濃度分析器を用いて定量した。 分析結果を下記表２に示したか、表中、ＩｃＡＭ−Ｒのペプチド残基の数字は、 配列番号、■に対応しており、一方で、ＩＣＡＭ−１のペプチド残基の数字は、 前出の５ｔａｕｎｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、の文献に示されたＩｃＡＭ−１アミノ 酸配列に対応しており、また、略字ｒＮＤ」は、「決定していない」ことを示す 。 ３　２３０−２３４　０％　３６％ ３　２７１−２７６　０％　１１％ ３　２６８−２７４　ＮＤ　ＮＤ 領域３からのＩＣＡＭ−Ｒペプチド配列は、ＩＣＡＭ−ＲへのＪｕｒｋａｔ細胞 の結合を阻害するが、ＩＣＡＭ−Ｒへの５ＫＷ３細胞の結合は阻害しない。 領域３ペプチドは、Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合阻害において、領域１ペプチドよ りも２倍程度効果的であり、このことは、ＡＭ−ＲへのＪ　ｕ　ｒｋａ　を細胞 の結合に、ＩｃＡＭ−Ｒ領域３が関与していることを示唆している。　配列番号 、１の７２〜７６残基に対応するＩＣＡＭ−Ｒ領域ｌペプチド（ＮＧＳＱＩ）は 、５ＫＷ３のＩＣＡＭ−Ｒへの結合を２６％阻害した。 対応するＩＣＡＭ−１ペプチド（ＤＧＱＳＴ　：配列番号、２８）は、結合を阻 害しなかった。　これに対して、配列番号：ｌのアミノ酸２３０〜２３４に対応 するＩｃＡＭ−Ｒ領域３ペプチド（ＧＤＱＭＬ）は、ＩｃＡＭ−ＲへのＪ　ｕ　 ｒｋａ　ｔの結合にて最高の阻害（３６％）を示した。　対応するＩＣＡＭ−１ ペプチド（ＧＤＱＲＬ　：配列番号・２９）は、ＪｕｒｋａＬの結合を２２％阻 害した。 トリペプチドＲＧＤは、β−１インテグリンのりガントである細胞外基質成分（ 例えば、フィブロネクチンおよびヴイトロネクチン）に共通する認識配列である 。　環状化ＲＧＤ−含有ペプチドは、ヴイトロネクチンへのインテグリンの結合 阻害効果を、１００倍程向上させた［Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ　ａｎｄ　Ｒ ｕｏｓｌａｈｔｉ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅｍ、、　２６２（３６）：　１７２９４−１７２９８　（１９８７）：ｌ 。　領域１の残基７２〜７７と領域３の残基２３０〜２３４に対応するＩＣＡＭ −Ｒペプチド配列を、先に概要を説明した分析方法にて試験するために、ブロモ 酢酸を用いて環状化した。 実施例１０ ラットＩＣＡＭ−Ｒ／グルタチオンＳ転移酵素（ＧＳＴ）融合タンパク質の集団 を、細菌用発現ベクターｐＧＥＸ−２７（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ 社、アラメダ、カリフォルニア州）を用いた免疫原として使用するために作成し た。　プラスミドベクターは、ＤＮＡ配列をコードするＧＳＴの上流に位置する マルチ・クローニング部位に近接して、ＩＰＴＧ誘導可能なプロモーターを含ん でいる。 Ａ、ラットＩＣＡＭ−Ｈの複数領域を含む融合タンパク質実施例６に記載のラッ トＩｃＡＭ−Ｈの部分的クローンを、ＩＣＡＭ−Ｒ断片、領域２．３の第一構成 部分、ラットＩＣＡＭ−Ｈの領域４（１〜２４０のアミノ酸）のＮ末端の３６個 のアミノ酸、および領域４の残りの１０４個のアミノ酸を含む第二構成部分、そ して領域５のすべて（２４０〜４３０のアミノ酸）をコードするポリヌクレオチ ドを作成するために用いた。　ｃＤＮＡクローン（配列番号：２５）の７１８位 にある一ＥｃｏＲ１部位を、ポリヌクレオチド断片を作成するために用いた。　 各断片を、配列をコードするＧＳＴのｐＧＥＸ−２Ｔ上流の−ＥｃｏＲ１部位に 挿入し、得られたプラスミドで大腸菌を形質転換した。　挿入方向および読取枠 は、配列分析によって確認した。　組み換えプラスミドを含む細菌を、−晩成長 させ、０．１ｍＭ　ＩＰＴＧで融合タンパク質の発現を誘導した。　ＩｃＡＭ− ＲとＧＳＴ融合タンパク質は共に、細菌をＰＢＳ＋５Ｏ３（１％）中での超音波 破砕により分解した後の、不溶性画分に残存していた。　不溶性タンパク質は、 ＳＯ３を加えた染料中にて煮沸し、１０％調製用ポリアクリルアミドＳＤＳゲル に適用した。　ゲルを、０．４Ｍ塩化カリウムで着色し、融合タンパク質バンド を切り出した。 融合タンパク質を、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ／１９２ｍＭグリシン・ゲル緩衝液を用 いて透析用チューブにて、ポリアクリルアミドゲル切片から電気溶出した。 Ｂ、ラットＩＣＡＭ−Ｈの単一領域を含む融合タンパク質うットＩＣＡＭ−Ｒ領 域特異的融合タンパク質も、ｐＧＥＸ−２Ｔにて構築した。　以下のプライマー は、領域１および２の５′および３′端に対応しており、ＩＣＡＭ−Ｒ領域１お よび２をそれぞれコードするＤＮＡ断片をＰＣＨによって作成するために用いた 。　領域１特異的ＰＣＲプライマーは、ラット・ゲノミック・クローンの配列に 基づいており、領域２特異的ＰＣＲプライマーは、ラットｃＤＮＡクローンの配 列（実施例６参照）に基づいている。 ＰＣＲは、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，３，５０ｍＭ塩化カリウム、および１ ．５ｍＭ塩化マグネシウムからなる緩衝液中に、領域ｌもしくは２の一対のプラ イ７−　（１０Ｂｇ／ｍｌ）　、４つのｄＮＴＰ　（各０．２ｍＭ）を含む混合 物、鋳型ＤＮＡ（１ｎｇのラットＩＣＡＭ−Ｒゲノミック・クローンＤＮＡ）、 およびＴａｑポリメラーゼ（１単位／反応）を含む５０μｌの反応混合物を用い て行った。　９５℃で２分間、５０℃で２分間、および７２℃で４分間のサイク ルを３０回行った。　得られた領域ｌもしくは２のＰＣＲ断片を、ｐＧｆ！Ｘ− ２ＴのＥｃｏＲ１部位にクローニングし、形質転換体を、適切な分子量を有する 融合タンパク質を生成する能力に関するスクリーニングに適用した。　ＤＮＡ配 列分析にて、適正な方向性と読取枠が確認された。　領域１および２　／ＧＳＴ 融合タンパク質の単離と精製を、上記Ａ節に記載されているようにして行った。 実施例１１ ＩＣＡＭ−Ｈの水可溶性の変異体は、以下のように構築および発現された。 ＩｃＡＭ−ＲのヒトｃＤＮＡは、部位特異的変異導入の標準的手順［例えば、Ｋ ｕｎｋｅｌら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８ ２：４８Ｂ−４９２（１９８５）を参照のこと］により改変し、タンパク質コー ド配列を、その細胞外領域および縁膜的領域の予定された継ぎ目（４５７位のア ミノ酸）の部分で切断した。　この領域は、水溶療法予測するコンピューター・ アルゴリズム［Ｋｙｔｅら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、。 １５７：　１０５−１３２　（１９８２）］で決定した。　ＩＣＡＭ−ＨのＤＮ Ａ配列は、ｐＶＺ１４７　Ｃ実施例４）から制限酵素Ｓａｔ　ＩおよびＮｏｔ工 Ｉで切断した。　得られた断片は、コード鎖の５′末端から始まり、そしてマル チクローニング部位の短いセグメントの３゛末端をも含む、完全なＩＣＡＭ−Ｒ コード配列を含んでいた。　この断片を、Ｓａｌ　ＩおよびＮｏｔ　Ｉで直鎖化 されたＭ１３８Ｍ２１ベクター（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社）中にサブクローン化 し、Ｍ１３８Ｍ２１１ＣＡＭ−Ｒと称する分子が得られた。 変異導入のためのオリゴヌクレオチドは、以下の配列のように合成された。 このオリゴヌクレオチドは、ＩｃＡＭ−Ｒの４５７位のフェニルアラニンを終止 コドンに変える。　オリゴヌクレオチドは、Ｋｕｎｋｅｌらの前出の文献んに記 載されているように用いられ、Ｍ１３８Ｍ２１１ＣＡＭ−Ｒから、４５７位に終 止コドンをコードする、六つのＭ１３ファージ単離物が調製された。　［１Ｍ２ １１ｃＡＭ−Ｒｌｌと称する単離物がさらなる研究のために選択された。 この−零値鋳型を、以下のように、フレノウＤＮＡポリメラーゼを用いたプライ マー伸長により、二本鎖ＤＮＡ分子に変えた。 精製した一本鎖Ｍ１３ＢＭ２１１ＣＡＭ−ＲＬ　ｌＤＮＡの１０Ｂｇを５０ｎｇ のＬａｃＺユニバーサル−２０プライマー（ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ Ｔ　、配列番号：３５）とアニールした。　アニールは、ｌＸＸフレノウＤＮＡ ポリメラーゼ衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃ１ｐｉｔ　７．５．５ｍＭ　Ｍｇｃ ＋２．７．５ｍＭジチオスレイトール）中で、混合物を６５℃にて５分間、そし て２５℃にて５分間インキュベートして行なった。　次に、以下の混合物をアニ ーリング反応に加えた：最終濃度３３μＭのｄＡＴＰ。 ｄＧＴＰ、　ｄｃ’ｒＰ、　ｄＴＴＰ；　４−Ｌｌ−ｙ　ト（ＤりＬ／／　ウＤ ＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社）、および１×クレノウ緩衝液。　 プライマー伸長反応は、１回のフェノール／クロロホルム（１：　ｌ）抽出およ びエタノール沈殿によって停止されるまで、４５分間、３７℃にてインキュベー トすることにより行なわれた。　ｃＤＮＡ挿入体の一部を、Ｍ１３８Ｍ２１１Ｃ ＡＭ−Ｒｔｌファージから、制限酵素Ｅｃｏ　ＲＶおよびＮｃｏ　Ｉを用いた制 限消化により、取り出した。　取り出されたＤＮＡの断片は、切断型ＩＣＡＭ− Ｈの完全なコード配列、３°の非翻訳領域およびＭ１３８Ｍ２１ファージ由来の ポリリンカー配列の小さなセグメントを含んでいた。　アガロースゲル精製の後 、この断片は、直鎖状になったベクターＢｌｕｅｂａｃ　ＩＩＩ　（Ｉｎｖｉｔ ｒｏｇｅｎ社、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ　、カリフォルニア州）にライゲーションし て、大腸菌のβガラクトシダーゼ遺伝子の発現を駆動させるＥＴＬプロモーター に位置する相同組換えのためのゲノムのバキュロウィルス配列、およびこの場合 ＩＣＡＭ−ＲＬＩである目的遺伝子の発現を駆動させるポリへドロンプロモータ ーを含む転移ベクターとした。 Ｂｌｕｅｂａｃ　ＩＩＩベクターは、以下のように調製し、その後ライゲーショ ンした。　３μｇのスーパーコイルプラスミドＤＮＡを、２０ユニツトのＨｉｎ Ｄ　１１１エンドヌクレアーゼ（Ｂｏｅｈｒ　ｉｎｇｅｒ社）で消化した。　フ ェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿の後に、ＤＮＡ沈殿を、ｌ× クレノウＤＮＡポリメラーゼ緩衝液；最終濃度３３μＭのｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ 、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰ　；　２ユニツトのフレノウＤＮＡポリメラーゼ（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社）中で再懸濁し、３７℃にて６０分間インキュベートして 分子の末端を修復した。　この修復の反応は、フェノール／クロロホルム抽出お よびエタノ加えて３７℃にて６０分間インキュベートした。 ＩＣＡＭ−Ｒｔｌ挿入体および直鎖状プラスミドのライゲーション反応の一部を 、エレクトロコンピテントＸＬ−１大腸菌（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）の形質転 換に用い、個々のコロニーを６０μ／ｍｌカーペニシリン添加のＬＢプレート上 で選択した。　１２個の個々の単離物を、診断の目的で、Ｐｓｔ　ＩあるいはＢ ｃｏ　Ｒ１を用いて、ミニプレ・ノブＤＮＡの消化により分析した。　期待され たバンドパターンを示す１つの単離物を、ｐＢＢＩＩｌ、　ＩＣＡＭ−Ｒｔｌと 命名した。 ｐＢＢＩ！１．　ＩＣＡＭ−Ｒｔｌ　ＤＮＡ　テ形質導入あルイハ感染されル５ ｆ−９細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）は、スピナー・フラスコでＴＮＭ−ＰＨ ［１０％熱不活性化ウシつ児血清およびｌＯμｇ／ｍｌのゲンタマイシンを添加 したブレース培地（Ｇｉｂｃｏ社、ｃｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、　＝＋Ｌ−Ｅ−り 州）コ中２７℃で、強制通風インキュベーターで保持された。　スピナー・フラ スコ・インペラーは、絶縁された５プレース・攪拌プレート上で６０ｒｐｍで回 転した。　９０％より多い生存数の対数増殖期の５ｆ−９細胞（１，５〜２．５ 　ｘ　ｔｏ’／ｍｌ）を、定期的に、１週間に２回、サブカルチャーした。 対数増殖期の５ｆ−９細胞を、ＴＮＭ−ＦＨ培地中に載置（２Ｘ　１０’細胞／ ６０ｍｍ皿）し、２７°Ｃにて１時間性着させた。　この後、以下の混合物を殺 菌したポリスチレン・チューブ中に作り、そして室温で１５分間インキュベート した＋　１　ｍｌ　ＴＮＭ−ＰＨ培地、１μｇの線状ＡｕＬｏｇｒａｈａ　ｄａ ｌｉｆｏｒｎｉｃａ核ポリヒドロシスウィルス（ＡＣＮＰＶ、バキュｃＪウィル ス）ゲノムＤＮＡ（ＩｎｖｉＬｒｏｇｅｎ社）、３１のｐＢＢＩＩｌ、ＩｃＡＭ −Ｒｔｌ　ＤＮＡおよび２０μｌのストック陽イオン性リポソーム溶液（Ｉｎｖ ｉＬｒｏｇｅｎ社）。　対照として、ｐＢＢＩＴＩ　ＩＣＡＭ−ＲＬＩ　ＤＮＡ の代わりに、二つの別々の混合物（ｐＢｌｕｅｂａｃｌｌ　Ｉの有無により区別 ）を調製した。　培地を接種したプレートから取り除き、２ｍｌのブレース培地 と置き換え、そして２分間インキュベートした。　すべての培地をプレートから 除去し、そしてＤＮＡ／リポソーム混合物をそれぞれのプレートの細胞上に１滴 ずつ加えた。　一つのプレートには、偽形質導入のコントロールとして、ＴＮＭ −ＦＨ培地のみを入れた。　次に、プレートを２７℃にて、時々揺らしながら、 ４時間インキュベートした。　このインキュベーションの後、１ｍｌのＴＮＭ− ＰＨ培地をプレートに加えた。　さらに４８時間インキュベーションした後、ウ ィルスを含む形質導入培地を除去し、そしてこれらのウィルスストックを、プラ ーク同定のために、５ｆ−９細胞のプレートを感染させるのに用いた。 Ｓ「−９細胞を、ＴＮＭ−ＦＨ培地中に、２　Ｘ　１０’細胞／６０ｍｍ皿にな るように接種し、そして約１時間２７℃にて付着させた。　培地を除去した。　 それぞれのウィルスストックから、数段階の十倍希釈物を作り、そして各々のｌ μｌの希釈物を付着性の５ｆ−９細胞の１つの皿に加え、そして２７℃にて１時 間インキュベートした。　ウィルス接種物を除去した後、それぞれの皿の細胞の 上に、３ｍｌのＴＮＭ−ＦＨ培地、０．６２５％低融点アガロースＣＢＲＬ社、 Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇｌ　メリーランド州）および３００　μｇ／＋ｎ　ｌ ハロゲン化イドリルーβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Ｂｌｕｏ−ｇａｌ、ＢＲＬ社 ）の混合物であって、あらかじめ約３０°Ｃにしておいたものを重層して、１時 間室温で固めた。　次に、プレートに青色が現われるまで（典型的には、４〜５ 日）インキュベートした。　組換え体のウィルスの（βガラクトシダーゼが発現 され、発色物質であるＢｌｕｏ−ｇａｌが、感染した細胞中で青い沈殿に変換す ることにより同定された）２４個のプラークを、ＴＮＭ−ＦＨ中に１ｍｌの５ｆ −９細胞（２Ｘ　１０５／ｍｌ）を播き、２４穴細胞培養プレートの個々のウェ ルに移した。　２７℃にて５日おいた後に培地を回収し、１．０００ｒｐｍで、 ４℃にて５分間微量遠心分離し、そして得られた上清を新しいチューブに移した 。　これらのストックは、ＢａｃＲ，Ｐ１ストックと命名し、それぞれに単離番 号を付与した。 ＢａｃＲ，ＰＬストックを抗原捕捉（ＢＬＩＳＡ）分析により、ＩＣＡＭ−Ｒの 産生について分析した。　抗ＩＣＡＭ−Ｒモノクローナル抗体２６１１０Ｅ−２ （実施例１０を参照のこと）を、以下のようにしてビオチン化した。　１　ｍｇ ／ｍｌのモノクローナル抗体２６１１０Ｂに、ｌ／１０容量のＬＭ　ＮａＣ０， を加えた。　ＮＨ３−ビオチン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社、Ｓ【。 Ｌｏｕｉｓ　、モンタナ州）をジメチルスルホキシド（ＤＩＩＩＳＯ。 Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、　Ｐａｒｉｓ、　ＫＹ）中に、１　ｍｇ／ｍｌで溶 解した。　１８０μｍのビオチン溶液をそれぞれ１ｍｇの抗体に加え、４°Ｃ− 晩、遠心した。　このビオチン化反応を、４℃で、１６時間、ＰＢＳを三回交換 する透析で停止させた。　ＢａｃＲ，ＰＬストックの分析用に、９６穴ウエルプ レートのそれぞれのウェルをモノクローナル抗体２６Ｅ３Ｄ（１０μｇ／ｍｌで ５０ａｌ）で、３７℃にて２時間あるいは４℃にて１６時間のいずれかで被覆し た。　次に被覆物を吸引し、ウェルをＰＢＳで２回洗浄した。　ウェルを、２０ ０μｌのＰＢＳ中の１％ＢＳＡで、３７℃にて３０分間ブロックした。　Ｂａｃ Ｒ，ＰＩストックのｌＯ倍段階希釈物をＰＢＳ中で二つ調製した。　ＢａｃＲ， ＰＬストック（そのまま）あるいは希釈物から、５０μｌを取り、ウェルに加え 、そして３７℃にて３０分間インキュベートした。　ＰＢＳで２回洗浄した後、 １％ＢＳＡ／ＰＢＳ中のビオチン化２６１１０Ｅのｌ：２５０希釈の５０μｍを ウェルに加え、３７℃にて３０分間インキュベートした。　ＰＢＳによる３回の 洗浄の後、ストレプトアビジンに結合し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中でｌ：４０００ に希釈した、５０μｍ／ウェルのセイヨウワサビペルオキシダーゼを加え、３７ ℃にて３０分間インキュベートシた。　ＰＢＳで２回洗浄した後、２００μｍ／ ウェルのＡＢＴＳ　（Ｚｙｍｅｄ社）入りの基質緩衝液を加え、そして室温にて 、発色反応が現われるまでインキュベートした。　プレートを自動プレート・リ ーダーで、４１０ｒｏｎの波長で計測した。 上記の抗原捕捉分析によって決定した可溶性ＩＣＡＭ−Ｒを最も高く発現するも のを、プラーク精製のために四つ選んだ。　そして、これらの単離体のＢａｃＲ ，ＰＬストックを１０倍段階希釈によって希釈し、アガー上層と共に播いた。　 最も高い希釈物から１つの青色プラークを単離し、そして１ｍｌのＴＮＭ−Ｆ） ｌ培地中に入れ、激しく渦巻き攪拌し、さらにプラーク単離するために段階希釈 した。　すべての野性型バキュロウィルスを除いた最終的なプラーク単離体を選 択し、そしてＴＮＭ−ＦＨ培地に２Ｘ１０”個の５ｆ−９細胞を播いたＴ−２５ フラスコに採った。　２７°Ｃにて５日間インキュベーションした後に、培地を １２００ｒｐｍ、　５分間の遠心分離によって回収し、そして４ｍｌの上清（Ｂ ａｃ−Ｒ，Ｐ２ストックとした）を、２Ｘ１０’細胞／ｍｌを播いた５００ｍ１ のＴＮＭ−ＦＨを含む、ｌす・ツタ−のスピナー・フラスコに移した。　さらに ２７℃にて５日間インキュベーションした後、感染した培地を、ｌｏｏｏｒｐｍ にて５分間遠心して回収した。　上清を４℃にて保存し、ＢＡＣＲ，Ｐ３ストッ クとした。　このＢＡＣＲ，Ｐ３ストックの力価を、ｌＯ倍段階希釈の一部を付 着性の５ｆ−９細胞上にプレートし、３００μｇ／ｍｌのＢ　Ｉｕｏ−ｇａ　Ｉ 　（ＢＲＬ）を添加したＴＮＭ−ＦＨ中の０．６２５％アガロースで上層するこ とにより測定した。　２７℃にて、４日間インキュベーションした後、プラーク の数を計測し、力価を測定した。 可溶性のＩＣＡＭ−Ｒタンパク質の発現のための感染を、１．５ＬのＥＸ／Ｃｅ １ｌ　４０１培地（ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｌｅｎｅｘａ、カンザス 州）を含む３Ｌフラスコで行なった。　対数増殖期に分けた５ｆ−９細胞（２ｘ 　１０’／ｍｌ）にＢＡＣＲ，Ｐ３ウイスルストックを感染の多重度（ｍｏｉ） 　５で感染させた。　４日後に、培地を回収し、そして遠心分離によって細胞か ら分離した。　可溶性のＩＣＡＭ−Ｒタンパク質は、昆虫細胞培地から、以下の ように精製した。　４ｍｌのＩＭＴｒｉｓ−ＣＩ　ｐＨ７，５をそれぞれ２００ ＋ｏｌの昆虫細胞上清に加え、そして、約３５ｍ１／時間で４℃にて、レンチル ・レクチン・セファロ−ス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｕｐｐｓａｌａ　、スウェ ーデン）の３．５ｍｌ以下カラム上に送液した。　このカラムは、あらかじめ２ ０ｍＭのＴｒｉｓ−ＣＩ　ｐＨ７，５１０，１Ｍ　ＮａＣ１（平衡化緩衝液）で 平衡化していた。　載置してから、カラムを２５ｍ　ｌの平衡緩衝液で洗浄した 。　次にカラムを、０．２Ｍのメチルα−ローマンノピラノシドを含む１１ｍ１ の平衡化緩衝液で溶出した。　溶出された液は、可溶性のＩＣＡＭ−Ｒを含んで いた。 部分精製された可溶性ＩＣＡＭ−Ｒタンパク質を、実施例８に記載のようにＬＦ Ａ−１依存性接着を活性化するために、ホルボールエステルで前処理した５ＫＷ ３細胞に対する結合について分析した。 レクチン溶出液を２５ｍＭカーボネートｐＨ９，６に調整した後、ＩＣＡＭ−Ｒ タンパク質を、９６穴ウエルイムロン４　（Ｄｙｎａｔｅｃｈ社）プレート上に 被覆し、そして４℃にて一晩インキユベートした。　プレートをＰＢＳで２回洗 浄し、２００μｍ／ウェルのＰＢＳ、］％ＢＳＡで３７℃にて３０分間ブロック し、細胞を加える前に再度ＰＢＳで洗浄した。　５ＫＷ３細胞を血清を含まない ＲＰＭ　［（Ｇ　ｉ　ｂｃｏ社）中で洗浄し、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ　（Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社）で標識し、そしてＰＭＡで刺激した。　次に、 細胞をプレートに加え、３７℃にて、１時間インキュベートした。　プレートを 予熱を加えたＰＢＳ、１％ＢＳＡ中にて反転させ、３０分間インキュベートした 。　そして、プレートを取り出し、各ウェルの半分の量を吸引した。　次に、プ レートを蛍光顕微鏡と自動蛍光読取器で走査した。　分析結果は、ＩＣＡＭ−Ｒ タンパク質が結合したプレートへのホルボールエステル活性化白血球の接着を実 証した。 抗体あるいはＩＣＡＭ−Ｈの活性を調整する他の成分を同定するためのｉｎ　ｖ ｉｔｒｏ分析は、可溶性ＩＣＡＭ−Ｒを利用することもできる。 例えば、かような分析法は、ＩｃＡＭ−ＲもしくはＩＣＡＭ−Ｒが結合する天然 リガンドを固定し、固定化されていない結合対象を検出可能に標識付けし、結合 対象と共にインキュベートし、そして、試験化合物が欠如した条件下で結合した 標識の量との比較における、試験化合物の存在下で結合した標識の量の減少が、 その試験薬剤がＩＣＡＭ−Ｒ結合の阻害剤であることを示す手段によって、結合 した標識の量に関する試験化合物の効果を決定することを含む。　前述した分析 法に利用できる機能性β２白血球インテグリンが、Ｄｕｓｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ、 、Ｃ３ＨＳｙｍｐ、　Ｑｕａｌ、　５４：　７５３−７６５（１９８９）に記載 されている。 以下の予備的な実験は、精製した可溶性ＩＣＡＭ−Ｒが、ポリスチレンビーズに 結合することができ、プラスチック表面に被覆された精製した白血球インテグリ ンに結合する能力を保持し、よって、ＩＣＡＭ−Ｒ結合の調整物質を同定する方 法の基礎が提供される。　精製した可溶性ＩＣＡＭ−Ｒを、使用説明書に従って 、−晩、６μｍ蛍光ポリスチレンビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｉｎｃ 、、　ウォーリントン、ペンシルベニア州）を被覆するために使用し、そして、 ビーズをＢＳＡでブロックした。　９６ウエルプレートのレプリカウェルを、精 製したＬＦＡ−１（ＣＤ１８／ＣＤ１１ａ）、Ｍａｃ−１（ＣＤ１８／ＣＤ１１ ｂ）、あるいはＧｐ　１５０，９５（ＣＤ１Ｂ／ＣＤ１１ｃ）の希釈液で被覆し た。 ＢＳＡでウェルをブロックした後、プレートを緩衝液のみ、あるいは抗ＣＤ１８ 抗体（６０，３）を含む緩衝液でインキュベートした。 ＩＣＡＭ−Ｒ被覆したビーズをウェルに分け、室温にて１時間、インキュベート し、そして、ウェルから未結合ビーズを除去するためにＰＢＳ−Ｄタンク内に置 いた。　ウェルに残った蛍光を、Ｃｙｔｏｆｌｏｕｒ　２３００　（Ｍｉｌｌｉ ｐｏｒｅ社、ベッドフォード、マサチューセッツ州）を用いて検出した。　並行 して、ＬＦＡ−１またはＭａｃ−１の白血球インテグリン調製物を、蛍光ポリス チレンビーズに被覆し、ＩＣＡＭ−Ｒを固定化した。 実施例１２ ＩｃＡＭ−Ｒ細胞外免疫グロブリン様領域での点変異の機能性（すなわち、対抗 レセプター結合）を迅速にスクリーニングするために、点変異した可溶性ＩＣＡ Ｍ−Ｒ分子が発現および精製されるシステムが採用された。　このシステムは、 試料タンパク質のアミンあるいはカルボキシ末端を融合したポリヒスチジン部分 の特異的な結合特性に依存している（Ｈｏｃｈｕｌｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏ ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　６：　１３２１−１３２５　（１９８８）　）。　 自然条件下でのタンパク質の精製における、このシステムの有用性は実証されて いる（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、　８８：８９７２−８９７６　（１９９１））。 るｐｃＤＮＡｌａｍｐ　（ＩｎｖｉＬｒｏｇｅｎ社）であるが、ｐＣ３６５，１ ０は、野性型のＧＩＬＩ３７およびＴｈｒ３ｇよりもむしろ、Ａｌａｓｔおよび ５ｅｒｓ＊それぞれをコードする点変異を含んでいる〕を、最初の研究のために 用いた。　これらＤＮＡは、ＩＣＡＭ−Ｒの全細胞外領域（アミノ酸−２９〜＋ ４５４）を放出するために、５ａｉｌと−ＥｃｏＲＩで消化し、断片をゲルで単 離した。 野性型残基５ｅｒａｓ＜およびＳｅｒ＜ｓｓをコードする二つの相補的なオリゴ ヌクレオチドが合成され、αヘリツクターン、それに続く六つのヒスチジン残基 と翻訳終始コドンを励起するように、ＧＩＹ＜ｓｓ、Ｐｒ０４ｓｔ、およびＧＩ Ｙ４ｓｓを導入した。　オリゴヌクレオチドの配列は。 末端に５ａｃ１部位およびＸｂａ１部位を含むオリゴヌクレオチ細胞外領域に連 結した。　一連の連結にて、合成りＮＡの５°端をリン酸化するための１／２単 位のポリヌクレオチドキナーゼを要し、これにより連結効果が向上する。　二番 目の連結反応では、予めリン酸化したオリゴヌクレオチドが使用される。　コロ ニーは、制限酵素消化分析とＩＣＡＭ−Ｒ特異的オリゴヌクレオチドブライマー を用いるＰＣＲ、あるいはＰＣＲのみのいずれかによってスクリーニングされる 。　数個のクローンについて、ＤＮＡ配列が得られた。　得られたプラスミドを 、ｐ５７．１ｗＬ旧Ｓ６およびｐｅｓ、　１０Ｅ３７ＴＨｉｓ６と命名した。 ＣＯ５細胞を１０ｃｍ皿に播き、皿当たり１０ｔｔｇの精製プラスミドＤＮＡを 用いた、血清を含まないＤＭＥＭによるＤＥＡＥデキストラン法により一過的な 形質変換あるいは疑似的な変換が生じる、約５０％の程度にまで細胞の成長を進 める。　ＤＭＳＯショックを短時間かけた後に、ウシ胎児血清を加えたＤＭＥＭ にて細胞をインキュベートした。　２４時間後、培地を交換し、そして、４日間 にわたって引き続き、細胞の集合が形成されるようにした。　最終培地を、細胞 単層から除去し、細胞を除去するために１１０００ｒｐで遠心分離し、そして、 カラムクロマトグラフィーに適用するまで４℃で保存した。 Ｎｉ”−ニトリロトリ酢酸（Ｎｉ”−ＮＴＡ）アガロース親和性カラムクロマト グラフィーを、溶解細胞よりもむしろ培地から精製を行ったことを除けば、Ｊａ ｎｋｎｅｃｈｔ　ｅｔ　ａｌ、、に記載された方法に従って行った。　培地と同 量の緩衝液Ａ　（８３０ｍＭ　ＮａＣｌ、３４％グリセロール、１．６ｍＭイミ ダゾール）を培地に加え、混合物を１０．０００Ｘｇにて、４℃で、１０分間の 遠心分離により清澄化した。 緩衝化培地試料１６ｍ１当たり１ｍｌのＮｉ”−ＮＴＡアガロースビーズ懸濁液 （５０％）（Ｑｉａｇｅｎ社）を、２５°Ｃで、３０分間、緩やかな振動を与え ることで、３．３ｍｌの０．５×緩衝液Ａにて予め平衡化した。 ビーズを、６００ｒｐｍで遠心してペレットにし、上清の大半を除去した。　ビ ーズを、全体積が３ｍｌの新しい０．５×緩衝液Ａにて再懸濁し、その１ｍｌを 清澄し、緩衝化した培地試料に分与した。 以後の調製は、４°Ｃにて行った。　６０分間にわたって一定に攪拌した各培地 試料を、ビーズを包むために、使い捨て可能な１０ｍ１のポリプロピレンカラム （Ｂｉｏｒａｄ社）に通し、そして、カラム通過物を回収した。　そして、ビー ズを０．８ｍＭイミダゾールを加えた９カラム容量（４，５ｍ１）の緩衝液Ｄ　 （１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７，９，５ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、０．１ｍＭ　ＥＤ ＴＡ、　５０ｍＭ　ＮａＣ１、ｌ　ｍＭジチオトレイトール、１７％グリセロー ル）で洗浄した。　次いで、ビーズを８ｍＭイミダゾールを加えた９カラム容量 の緩衝液りで二度、４０ｍＭイミダゾールを加えた５カラム容量の緩衝液りで二 度、および、８０ｍＭイミダゾールを加えた５カラム容量の緩衝液りで二度洗浄 した。 各画分ノ２００μｌのＩＣＡＭ−Ｒ免疫反応性を、使用説明書（Ｐｉｅｒｃｅ社 ）に従って、９６ウエルにて、酵素結合免疫濾過分析（ＥＬＩＦＡ）によって分 析した。　精製したモノクローナル抗体ＩＣＲ４，２（５μｇ／ｍ１）（実施例 １３参照）を、第一検出薬剤として、また、精製したヤギ抗マウスセイヨウワサ ビペルオキシダーゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｃａｌｓ）（１：５００）を、第二抗体として用いた。 可溶性基質ＡＢＴＳ　（Ｚｙｍｅｄ社）を用い、使用説明書に従って分析を進め 、そして、４１０ｎｍ試験用フィルターを備えたＤｙｎａＬｅｃｈのプレート・ リーダーで計測を行った。　その結果、ＩＣＡＭ−Ｒ免疫反応性か、最初の４０ ｍＭイミダゾール洗浄した試料にて顕著に認められた。 ｗｔＨｉｓ６、Ｅ３７Ｈｉｓ６および疑似形質変換体からのピーク画分を、Ｃｅ ｎｔｒｉｃｏｎ　３０　（Ａｍｉｃｏｎ社）遠心分離ユニットを用いて、約６． ５倍に濃縮した。　得られた濃縮物を、ＰＢＳ−Ｄを用いて等量（０，３４ｍ１ ）に調整した。　炭酸塩緩衝液ｐＨ９，６あるいは４０ｍＭイミダゾールを加え た緩衝液り中の対照の可溶性ＩＣＡＭ−Ｒ（１５Ｍｇ／ｍｌ）　（実施例１１） を調製した。　タンパク質溶液の５０μｌを、ウェルを被覆するために９６ウエ ルプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ　４、ＤｙｎａＬｅｃｈ社）の各ウェルに分け、そ して、未処理細胞、ＰＭＡ−処理した細胞、および抗ＣＤ１８モノクローナル抗 体（６０，３）処理した細胞を用いて、実施例１１の記載に従い、５ＫＷ３の結 合に関して分析を行った。 試験結果から、野性型のヒスチジン標識したタンパク質（ｗｔＨｉｓ６）が、５ ＫＷ３細胞の接着リガンドとして機能することがわかった。 実施例１３ ＮＳ−１ミエローマ細胞と、ＩｃＡＭ−Ｒを発現するヒト細胞系で免疫したＢａ １ｂ／ｃマウスの膵臓細胞との融合体から、ＩＣＡＭ−Ｈに特異的なモノクロー ナル抗体を調製した。　モノクローナル抗体を、融合体２６．４２．４３．４６ ．５６および６３と称する四つの異なる融合体から調製した。 Ａ、マウスの免疫措置 融合体２６のために、５匹の６〜１２週齢のＢａ１ｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅ ｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ　５ｅｒｖｉｃｅｓ社、Ｗｉｌｍｉ ｎｇｔｏｎ、　？サチューセッツ州、ＩＡＣＵＣ＃９０１１０３）を、ＨＬ−６ ０細胞で免疫し、抗ＩＣＡＭ−Ｒモノクローナル抗体を調製した。　０日目のプ レ免疫血清の回収のために、２匹のＢａ１ｂ／ｃマウスの採血を眼窩後方から行 った。　２日目に、各動物に０．５ｍｌ中の計６Ｘ１０’個のＨＬ−６０細胞（ ０，１ｍｌ　ｓ、ｃ、および０．４ｍｌ　ｉ、ｐ、）を与えた。　第二回目の、 ９．５Ｘ　１０＠個のＨＬ−６０細胞による免疫も、２８日目に同様に行なわれ た。　免疫血清を回収し、眼窩後方からの採血を３５日目に行い、ＦＡＣ３（Ｆ ＡＣＳスクリーニングは、以下の０節で詳細に記載した）で試験して、ＩｃＡＭ −Ｒ形質導入体に体する反応性を調べた。　これらの結果に基づいて、両方のマ ウスを５１日目に、６、５Ｘ　１０’個のＨＬ−６０細胞で３回目の免疫を行い 、そして５４日目に１匹の動物（＃７６４）から滅菌状態で取り出した膵臓細胞 で融合を行なった。 融合体４２のために、０日目に５匹のそれぞれのマウスから採血し、次に腹腔内 から、５０Ｍｇのアジュバントペプチド（Ｓｉｇｍａ社）を含む０．５ｍｌ　Ｐ ＢＳ中の５Ｘ１０’個の５ＫＷ３細胞によって、免疫した。　マウスに、同様に して２１日目および４２日目に追加免疫した。　３回目の注入の１０日後、マウ スから採血し、免疫血清をＦＡＣ３によって試験をした。　マウス＃８４３に、 ６４日目に５ＫＷ３細胞で最後の追加免疫を行なった。　３日後に膵臓を滅菌状 態で取り出した。 融合体４３のために、０日目に５匹のそれぞれのマウスから採血し、次に静脈か ら、赤白血痰細胞系に５６２由来の５Ｘ１０’個の細胞によって、免疫した。　 それぞれのマウスに、次の２日間毎日、１５０μｍ中の１．５ｍｇシクロホスフ ァミドを腹腔内から注射した。　１０日目に、アジュバントペプチド入りの５Ｋ ＷＩＯ細胞を融合体４２と同様に注入した。　３０日目に、マウスにさらにに５ ６２細胞を追加免疫し、その後シクロホスファミドを注入した。 ４２日目に、マウスをアジュバントペプチドを含む５ＫＷ３細胞で追加免疫した 。　５６日目にマウスから採血し、そして免疫血清をＦＡＣ３で試験した。　７ ８日目に、マウス＃１０２１に、５ＫＷ３細胞およびアジュバントペプチドで最 終的な追加免疫を行なった。　３日後に膵臓を滅菌状態で取り出した。 融合体４６のために、マウス（＃９００）を融合体４２に関して記載したのと同 様に免疫した。　１２８日目に、マウスに約４ＸＩＯ’個のＭａｃａｃａ　ｎｅ ｍｅＳＬｒｉｎａ牌臓細胞を最終追加免疫した。　サル牌臓の単一の細胞の懸濁 物を、次のパラグラフに記載するように調製した。　サル細胞を沈殿させ、以下 の赤血球溶血緩衝液中に再懸濁した：　０．１５Ｍ　Ｎ８４ＣＩ２、ＩＭ　ＫＨ ＣＯ，，０，１ｍＭ　ＮａＪＤＴＡ　。 ｐＨ７，２〜７．４゜　赤血球を溶血した後、膵臓細胞をＲＰＭＩで２回、ＰＢ Ｓで１回洗浄した。　最後に、細胞を５０Ｍｇアジュバントペプチドを含む４０ ０μｌ　ＰＢＳ中に再懸濁して注入した。　３日後にマウスの膵臓を滅菌状態で 取り出した。 融合体５６および６３のために、マウス（＃８４５と＃８４４）を、６４日目に ５ＫＷ３細胞の免疫処置を省いた以外は、融合体４２に関して記載したのと同様 に免疫した。　その代わりに、これらマウスは、１５８および２０４日目に、補 助ペプチドを加えたＰＢＳ中の５ＫＷ３細胞の追加免疫を行い、１２８および１ ７７日目に、５０Ｍｇの補助ペプチドを含む０．５ｍｌのＰＢＳにて、Ｍａｃａ ｃａ　ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａの腹腔注射を行った。　融合体５６のために、マウ ス＃８４５を、２．２４μｇの可溶性ＩＣＡＭ−Ｒ（実施例１１）を含む７００ μｍのＰＢＳを、ｉｏｏμｍ静脈注射で、そして残りを、腹腔注射にて投与した 。　４日後に、膵臓を無菌的に除去した。　融合体６３のために、２２６日目に 、マウス＃８４４を、融合体５６について記載したようにして、Ｍａｃａｃａ　 ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａで、そして、２４８日目に、５０Ｍｇの可溶性ＩＣＡＭ− Ｒを含む１００μＩの完全フロインドアジュバントで免疫処置した。　６６μｇ の可溶性ＩＣＡＭ−Ｒを含む１００μｍのＰＢＳを、マウスに静脈注射すること で最終処置とした。　４日後に、膵臓を無菌的に除去した。 Ｂ、融合 簡単に言えば、単一細胞の懸濁物を、それぞれのマウス膵臓から、膵臓を、２つ のガラス顕微鏡スライドの白い淵の間で擦り潰すことによって調製した。　この スライドは、２ｍＭＬ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、　１００ユ ニッｌ−／ｍｌペニシリン、および１１００ｔ１／ｍｌストレプトマイシン（Ｇ ｉｂｃｏ社）を添加した血清を含まないＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ社）中に 浸す。　この細胞懸濁液を滅菌した７０メツシユＮ１Ｌｅｘ細胞濾過器（Ｂｅｃ ＬｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ１ニューシャーシー州）で フィルター濾過し、そして、２００ｇで５分間遠心分離して、沈殿を２０ｍ１の 血清を含まないＲＰＭＩ中に再懸濁することにより、２回洗浄した。　３匹の普 通のＢａ１ｂ／ｃマウスから取り出した胸腺リンパ球を、同様に調製した。 融合の前の３日間、１１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）あるいは胎児クローン（Ｈｙ ｃｌｏｎｅ）入りのＲＰＭＩ中に対数増殖期に保持しておいたＮ５−Ｉ　Ｅエロ ーマ細胞を、２００ｇで５分間遠心分離し、そして沈殿を前述のパラグラフに記 載したように２回洗浄した。　洗浄の後、それぞれの細胞の懸濁液を血清を含ま ないＲＰＭＩで最終容量１０ｍ１になるようにし、そして１０μｍをＩｇｌｏｏ に希釈した。 それぞれの希釈液の２０μｌを取り、２０μｌの０．８５％生理食塩水（Ｇｉｂ ｃｏ社）中の０．４％トリパンブルースティンと混合し、ヘマサイトメーター（ ＢａｘＬｅｒ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｄｅｅｒｆ　１ｅｌｄ、イリノイ州） 」二に載せ、計測した。 ２Ｘ１０”個の免職細胞の試料を４Ｘ１０７個のＮ５−１細胞と結合させ、遠心 分離し、そして上清を吸引した。　チューブを軽くたたくことにより細胞の沈殿 を緩め、２ｍｌの３７℃のＰＥＧ　１５００（７５ｍＭヘペス、ｐＨ８，０中５ ０％）を１分間にわたってかき混ぜなから加え、その後血清を含まないＲＰＭＩ 　１４ｍ１を７分間かけて加えた。　さらに１６ｍ１のＲＰＭＩを加え、細胞を ２００ｇで１０分間、遠心分離した。　上清を廃棄した後、沈殿を、１５％ＦＢ Ｓあるいは胎児クローン、　１００μＭのヒボキサンチンナトリウム、０．４μ Ｍアミノプテリン、１６μＭチミジン（ＨＡＴ）　（Ｇ　１ｂｃｏ）、２５ユニ ット／ｍｌ　ＩＬ−６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社）および１．５Ｘ　１０’個の 胸腺細胞／ｍｌを含む２００ｍ　ｌのＲＰＭＩ中に再懸濁した。　懸濁液を１０ 個の９６穴平底組織培養プレートに、２００μｌ／ウエルになるよう分配した。 プレート中の細胞に、１８Ｇ針（Ｂｅｃｋｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）でそれ ぞれのウェルから約１００μｌを取り、１００μｌ／ウエルのプレート用培地（ １０ユニツ）／ｍｌのＩＬ−６を含み胸腺細胞を欠いている以外は、上記に記載 したのと同じ）を加えることによって、典型的には、融合の後２．４および６日 目の計三回栄養を与えた。 Ｃ，スクリーニング 細胞増殖か６０〜８０％の集密度（８〜１０日目）に達した時、融合体２６およ び４２のそれぞれのウェルから培養上清を取り、縦列あるいは横列によりプール し、ＦＡＣ３により親り細胞（融合体２６）あるいは親ｃｖ−ｉ細胞（融合体４ ２）　；　（陰性対照）およびＩＣＡＭ−ＲＤＮＡで形質導入されたＬ細胞（融 合体２６）あるいはＣＶ−１細胞（融合体４２）上で分析した。　簡単に言えば 、形質導入済および未形質導入のし細胞あるいはＣＶ−１細胞を、ＥＤＴＡ　（ Ｖｅｒｓｅｎｅ）処理および細胞をプラスチックの組織培養容器から取り除くた めに軽く擦ることにより、培養物から回収した。　細胞を、Ｃａ２＋およびＭｇ ２＋を含むダルベツコのＰＢＳ中で２回洗浄し、ｒＦＡ緩衝液」（Ｄ−ＰＢＳま たはＲＰＭ１１６４０のいずれか、１％ＢＳＡ　、　１０ｍＭ　ＮａＮ５）中で １回洗浄し、そして、９６穴丸底プレート中に１．５〜２．０×１０５細胞／１ ００μｌ　ＦＡ緩衝液／ウェルの割合で分配した。　この時点で、分析を４℃に て続けた。　細胞を４℃にて臨床用遠心機中で沈澱させた。　それぞれのウェル からの上清を注意深く吸い出し、分析用プレートのすべての部分を軽くたたくこ とにより、沈殿を壊した。　１００μｌのハイブリドーマ上清のプールを、１２ チヤンネルのピペットマンを用いてウェルごとに加えた。　モノクローナル抗体 を含む上清のプールのそれぞれを親細胞および形質導入した細胞上の両方で、４ °Ｃにて、１時間インキュベートした。　次に、分析用プレートを上記のように ＦＡ緩衝液で２回洗浄した。　最後の洗浄液を、ＦＡ緩衝液中で調製したヒツジ 抗マウスＩｇＧ（完全な分子）−ＦＩＴＣ結合物（Ｓｉｇｍａ社）のＦ（ａｂ’ ）２回片の、５０μＩ／ウエルの１：ｌＯＯ希釈液と交換した。 分析用プレートを、遮光しながら、４℃にて４５分間インキュベートした。　次 に、分析用プレートを、ＮａＮ５のみを含む（すなわち、ＢＳＡを含まない）　 Ｄ−Ｐｕｓで前記したのと同様に２回洗浄し、最後の洗浄液を、２００μｌ／ウ エルのＤ−ＰＢＳ中の１％パラホルムアルデヒドと交換した。　次に、試料を、 ＢｅｃｌｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ　ＦＡＣｓｃａｎ解析機でのフローサイト・メ トリ・ツク分析（ＦＡＣ３）のために、マルチチャンネルピペットマンでポリス チレンチューブに移した。 融合体４３および４６を、まず抗体捕捉ＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、ハ イブリドーマ上清中のマウスＩｇＧの存在について試験した。　イムシロン４プ レート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　。 マサチューセッツ州）を、４℃にて、５０ｍＭカーボネート緩衝液、ｐＨ９，６ でｌ　：　５０００に希釈した、５０μＩ／ウエルのヤギ抗マウスＩｇＡＸＩｇ Ｇ、あるいはＩｇＭ（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ社、Ｄｕｒｈａｍ、ノー スカロライナ州）で被覆した。　プレートを、３回、０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２ ０入りのＰＢＳ　（ＰＢＳＴ）で洗浄し、そして５０μｍの培養上清を加えた。 　３７℃にて３０分間インキュベーションし、上述したように洗浄した後、ＰＢ ＳＴ中でｌ：３５００に希釈した、５０μｍのセイヨウワサビペルオキシダーゼ を結合させたヤギ抗マウスＩｇＧ（ｆｃ）（Ｊａｃｋｓｏｎ　１ｍｍｕｎｏＲｅ ｓｅａｒｃｈ社、Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｖｅ、ペンシルバニア州）を加えた。　プレ ートを上記のようにインキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄し、そして、１　ｍ ｇ／ｍｌ　ｏ−フェニレンジアミン（シグマ社）および１００ｍＭクエン酸塩、 ｐＨ４，５中の０．１　ｕ　ｌ／ｍｌの３０％過酸化水素からなる、１００μＩ の基質を加えた。　発色反応は、５０μｍの１５％硫酸を加えて、５分間で停止 させた。 Ａ４９１１を自動プレートリーダーで計測した。 融合体５６および６３を、まず、抗原捕獲ＥＬＩＳＡによってスクリーニングし た。　イムロン４プレート（ＤｙｎａＬｅｃｈ社）を、５０ｍＭ炭酸塩緩衝液で 希釈した各ウェルを１１００ｎの２６８３Ｄ　Ｆａｂ’　（下記Ｆ節を参照）で 、４°Ｃにて一晩被覆した。　プレートを、１００μｍ／ウェル２％ＢＳＡを含 むＰＢＳで、常温にて、１時間ブロックした。　プレートを吸引した後、可溶性 ＩＣＡＭ−Ｒを含む培養上清を、ＰＢＳＴで１．８に希釈し、そして、５０μＩ ／ウエルで添加した。 常温にて、１時間インキュベートした後、ウェルをＰＢＳＴで三度洗浄し、５０ μＩ／ウエルでハイブリドーマ培養上清を添加し、そして、上述したようにして 、プレートを再度インキュベートした。　プレートを三度洗浄し、ＰＢＳＴでｌ 　：　３５００に希釈した、５０μＩ／ウエルのペルオキシダーゼ接合したヤギ 抗マウスＩｇＧを添加した。　以後の分析は、前節で述べたようにして行った。 Ｄ　サブクローニング 陽性の縦列および横列の交点の個々のウェルからの上清（融合体２６および４２ ）、あるいはＩｇＧを産生ずる個々のウェルからの上清（融合体４３および４６ ）、あるいは可溶性ＩＣＡＭ−Ｒ（融合体５６および６３）との反応性を有する ウェルを、次の日にＦＡＣ３により再スクリーニングした。　Ｌ細胞あるいはＩ ＣＡＭ−ＲＤＮＡで形質導入したし細胞を融合体２６の抗体をスクリーニングす るのに用い、ＣＶ−１細胞あるいはＩＣＡＭ−ＲＤＮＡで形質導入したＣＶ−１ 細胞を融合体４２．４３．４６．５６および６３由来の抗体をスクリーニングす るのに用いた。　２９個のウェル（２６Ｅ３Ｄ−１，２６２３Ｂ、２６）１３Ｇ 、２６Ｈ１１Ｃ−２，２６１８Ｆ−２，２６１１０８−２，２６１１０Ｐ１４２ Ｃ５Ｈ，４２Ｄ９Ｂ、４３Ｈ７Ｃ，４６Ｄ７Ｂ、５６Ｄ３Ｂ、　５６１４Ｅ　、 　６３Ａ１０Ｂ、６３Ｃ３Ｆ、　６３Ｃ１１Ａ、６３Ｅ９Ｇ、　６３Ｅ１２Ｃ， ６３０３Ｇ、６３）１６１Ｌ　６３１＋９８．　６３１１Ｃ，６３１６Ｇ、６３ １１２Ｆ、６３Ｇ４Ｄ、６３ＥｌｌＤ、６３Ｈ４Ｃ）は、対照細胞に対し、ＩＣ ＡＭ−Ｒ形質導入体によく染まった。　これらのウェルは、ＲＰＭＩ、１５％Ｐ ＢＳ、１００μＭヒボキサンチンナトリウム、１６μＭチミジン、およびｌＯユ ニット／ｍｌ　ＩＬ−６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社）中で２倍希釈することによ り、連続して２〜３回サブクローン化した。　４日後に、サブクローンプレート のウェルを視覚的に評価し、そして一番低い密度のウェル中のコロニーの数を記 録した。　それぞれのクローニングで選択されたウェルを、７〜１０日後にＦＡ Ｃ３により試験した。　活性は、９つの系で保持されていた［２６Ｆ！３Ｄ−１ （ＡＴＣＣＨＢ　１１０５３）　、２６８１１Ｃ−２（ＨＢ　１１０５６）、２ ６１８Ｆ−２（ＨＢ　１１０５４）、２６１１０Ｅ−２（ＡＴＣＣＨＢ　１１０ ５５）、４２Ｃ５Ｈ（ＡＴＣＣＨＢ　１１２３５）　、４２０９Ｂ（ＡＴＣＣＨ Ｂ　１１２３６）　、４３Ｈ７Ｃ（ＡＴＣＣＨＢ　１１２２１）、４６Ｄ７Ｅ（ ＡＴＣＣＨＢ１１２３２）、４６１１２Ｈ（ＡＴＣＣＨＢ　１１２３１）、６３ Ｅ１１Ｄ（ＡＴＣＣ）ＩＢ　１１４０５）、６３Ｇ４Ｄ（ＡＴＣＣＨＢ　１１４ ０９）、６３Ｈ４Ｃ（ＡＴＣＣＨＢ　１１４０８）　、６３Ｈ６Ｈ（ＡＴＣＣ） ＩＢ　１１４０７）　、６３１１Ｃ（ＡＴＣＣＨＢ　１１４０６）　、および６ ３Ｉ６Ｇ　（ＡＴＣＣＨＢ１１４０４）］。　最後のクローニングで、単一のコ ロニーを含む陽性のウェルを１１％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で拡げた。　ハイブ リドーマによって産生されたモノクローナル抗体に付与された名称を、実施例１ ４の表４に示した。 Ｅ、特徴付は 上記のハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体を、ＥＬＩＳＡ分 析によってタイプ分けした。　イムロン４プレート（ＤｙｎａＬｅｃｈ社）を、 ５０ｍＭカーボネート緩衝液、ｐＨ９，６中に１　：　５０００で希釈した、５ ０μｌ／ウエルのヤギ抗マウスＩｇＡＳＩｇＧあるいはＩｇＭ（オルガノン・テ クニカ）で、４℃にて被覆した。 プレートを、３７°Ｃにて３０分間、ＰＢＳ中１％ＢＳＡでブロックし、０．０ ５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳ　（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、そして５０μ ｌの培養上清（ＰＢＳＴで１＝１０希釈された）を加えた。　上記のようなイン キュベーションおよび洗浄の後、１％の正常ヤギ血清入りのＰＢＳＴで１　：　 １０００希釈されている５０μｌのセイヨウワサビペルオ苓シダーゼ結合ウサギ 抗マウスＩｇＧ＋、Ｇ２ａ　、ｃｚｂあるいはＧｓ　（Ｚｙｍｅｄ社）を加えた 。　プレートを上記したようにインキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄し、　１ ００ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４，５中のｌ　ｍｇ／ｍｌ　ｏ−フェニレンジアミン （シグマ社）および０．１μｍ／ｍｌの３０％過酸化水素からなる１００μＩの 基質を加えた。　発色反応を１５％硫酸５０μｌの添加により５分間で停止させ た。 Ａ４９゜をプレートリーダーで計測した。　モノクローナル抗体のイソタイプを 実施例２１の表１１に示した。 ＩＣＡＭ−ＲＳＩＣＡＭ−１、およびＩＣＡＭ−２に対するモノクローナル抗体 を用いた、コントロール細胞およびＩｃＡＭ−ＲあるいはＩＣＡＭ−Ｉ　ＤＮＡ で形質転換した細胞の、間接蛍光抗体染色のＦＡＣ５ＡＣ５分析った。　染色は 、実施例１０ｃのＦＡＣ３分析で記載したように行った。 この時、５ｘ１０５個の細胞当たり、０．１ｍｌのハイブリドーマ培養上清（抗 １ｃＡＭ−Ｒ）あるいは１Ｍｇの純粋なモノクローナル抗体（抗Ｉ　ＣＡＭ−１ あるいはＩＣＡＭ−２）を用いた。　この分析の結果は、図５にヒストグラム（ 分析した１０’個の細胞を示す）で表されている。　抗ＩＣＡＭ−Ｒ抗体２６Ｈ １ＩＣ−２は、ＩＣＡＭ−ＲｃＤＮＡで形質導入したし細胞に特異的に結合した が、親のし細胞あるいはＩＣＡＭ−１形質導入し細胞には結合しなかった。　Ｉ ＣＡＭ−Ｒは、ＩＣＡＭ−１に対する抗体（Ｅｄｗａｒｄ　Ｃ１ａｒｋ、　Ｗａ ｓｈｉｎｇｔｏｎ大学のモノクローナル抗体ＬＢ２）あるいはＩＣＡＭ−２に対 する抗体（ＩＣ２／２．　ＢｉｏｓｏｕｒｃｅＧｅｎｅｔｉｃｓ社、Ｖａｃａｖ ｉｌｌｅ　、カリフォルニア州）とは反応しなかった。　平行した実験では、抗 ＩＣＡＭ−Ｒモノクローナル抗体２６Ｅ３Ｄ−１，２６１１０Ｂ−２、および２ ６１８Ｆ−２は、形質導入体に対して、モノクローナル抗体２６８１１Ｃ−２と 同様の反応性を示した。　抗ＩＣＡＭ−Ｒ抗体の４２Ｃ５Ｈ、４２ＤＦ９Ｂ、　 ４３Ｈ７Ｃ、４６Ｄ７Ｂおよび４６１１２Ｂ抗体もまた、ＩＣＡＭ−Ｒて形質導 入された細胞と特異的に反応したが、親のＣＶ−１細胞あるいはＩＣＡＭ−１形 質導入ＣＶ−１細胞とは反応しなかった。 Ｍａｃａｃａ　ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ　、ブタ、あるいはイヌ末梢血白血球 の間接蛍光抗体のＰＡＣ３分析を、９つの抗１ｃＡＭ−Ｒモノクローナル抗体を 用いて行なった。　２０ｍ１のヘパリン化Ｍａｃａｃａ　ｆａｓｃｉｃｕｌａｒ ｉｓあるいはブタの血の２０ｍ　ｌを２８０ｍ　ｌの赤血球溶血緩衝液で希釈し 、室温で３〜５分間インキュベートし、そして５分間２００ｇで遠心分離した。 　上清を廃棄した。　沈殿を２％ウシ胎児血清を含む冷Ｄ−ＰＢＳで１回洗浄し 、細胞をヘマサイトメータで計測した。　２０ｍ１のヘパリン化したイヌの血を 、２倍容量の、２％の必須でないアミノ酸（ＮＥＡＡ）を含むｗａｙｍｏｕｔｈ の培地（Ｇｉｂｃｏ社）で希釈した。　それぞれ５ｍｌの血液溶液を、４ｍｌの ヒストバーク（Ｓｉｇｍａ社）の上に上層し、１０００ｇで２０分間室温にて遠 心分離した。　細胞を中間面から回収し、２％のＮＥＡＡを含むＷａｙｍｏｕｔ ｈの培地中で１回洗浄し、そして上述したようにして計測した。 それぞれの細胞の集団を、実施例１３Ｃ中で述べたように染色し、そしてＦＡＣ ５により分析した。　ハイブリドーマ細胞系２６１１０Ｅ。 ４６１１２Ｈ，６３Ｈ４Ｃ１５６１４Ｅ、および６３１１２Ｆによって産生され た抗ＩＣＡＭ−Ｒ抗体は、サルＰＢＬを特異的に染色したが、他の七つの抗体に はかような特異的な染色は観られなかった。　ブタあるいはイヌＰＢＬを特異的 に染色する抗体は、無かった。　ハイブリドーマ細胞系６３ＡＩＯＢ、６３Ｅ９ Ｇ、　６３Ｅ１２Ｃ，６３Ｇ３Ｇ、および６３Ｈ９Ｈによって産生された抗ＩＣ ＡＭ−Ｒ抗体は、試験しなかった。 Ｆ、ハ 実施例２１の表１１に列挙した抗１ｃＡＭ−Ｒモノクローナル抗体を含むハイブ リドーマ培養上清を、１．５Ｍグリシン、３．０Ｍ　ＮａＣｌ　５ｐ８８．９に 調整し、そして２ｍｌのヘッドボリュームのプロティンＡカラム（シグマ社）に 載せた。　１．５Ｍグリシン、３　Ｍ　ＮａＣ１，ｐｌ＋８．９での洗浄の後、 カラムを１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐ１１４．０で溶出した。　１ｍｌ の画分を１００ｕ　ｌの１．５Ｍ１−リス、ｐＨ８，８上に集めた。　Ａ２＊ｏ で決定した抗体を含む両分をプールし、ＰＢＳに対して透析した。 Ｇ、親和性 九つの精製した抗ＩＣＡＭ−Ｒモノクローナル抗体を連続希釈し、プラスチック に被覆した可溶性ＩＣＡＭ−Ｒ（実施例１１）の所定量への結合に関してＥＬＩ ＳＡ法によって分析した。　分析結果を下記表３に示し、表中、１８ｇ７ｍｌ以 下のモノクローナル抗体濃度での最高結合性か５０％のものを高親和性と、そし て、１μｇ／ｍｌを超えるモノクローナル抗体濃度での最高結合性が５０％のも のを低親和性とそれぞれ定義した。 Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｉｎ　Ｐｒａｃｔｉ ｃｅ、　０ｘｆｏｒｄ　Ｐｒｅｓｓ（１９８２）中のＪｏｈｎｓｔｏｎｅ　ｅｔ 　ａｌ、、　ｐ、５２に記載の方法によって、ハイブリドーマ２６Ｅ３Ｄ、２６ １１０Ｂ、４２Ｄ９Ｂ、４３Ｈ７Ｃ，および４６Ｄ７Ｂにより産生されたモノク ローナル抗体から、Ｆａｂ’断片を得た。 実施例Ｉ４ 実施例２１の表１１に列挙したＩＣＡＭ−Ｒ特異的モノクローナル抗体を、組み 換え可溶性ヒトＩＣＡＭ−ＲへのＪＹ細胞（ＣＤ１８”　）の結合阻害に関して 試験した。　実施例１２に記載されているようにして接着分析を行った。　細胞 をＰＭＡで処理し、最終濃度か１０Ｍｇ／ｍ１となるように抗体を加えた。　３ つの独立した実験を行い、データを３回採った。　全ＣＤ１８依存性結合を、対 照抗ＣＤ１８モノクローナル抗体６０．３によってブロックした接着Ｉとして決 定した。　各モノクローナル抗体で阻害された全ＣＤ１８依存性結合の割合を下 記表４に示し、表中、各ハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体 に付与した名称を使用している。 モノクローナル抗体の名称は、ハイブリドーマの表示に代えて、以後の実施例に て一貫して使用する。 ヒト末梢血白血球あるいは５ＫＷ３細胞（両方ともＩｃＡＭ−Ｒを発現する細胞 ）を用いた、ＦＡＣ３に基づいた競合分析により、モノクローナル抗体１ｃＲ− ４，２およびＩＣＲ−１，１が、ＩＣＡＭ−Ｒの離れたエピトープと免疫学的に 反応性があることが示された。　分析では、正常末梢血のフィコールハイバーク 遠心分離により得られた、ヒト末梢血白血球（ＰＢＬ）を、氷冷ＦＡＣ３緩衝液 （０，１％アジ化ナトリウムおよび１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ）中で ２回洗浄した。　そして、２ＸＩＯ５個の細胞を、５μｇのＩＣＲ−４，２、Ｉ ｃＲ−１，１、および対照のイソタイプＩｇＧ（シグマ社）のそれぞれを含む、 ポリプロピレンチューブ中で３つずつインキュベートした。　第一段階の抗体を 含むすべてのチューブを、次に４℃にて３０分間インキュベートし、冷ＦＡＣ８ 緩衝液中で２回洗浄した。 それぞれの３つのチューブに、下記した各々の第二段階の抗体５μｇを加えた： ビオチン化ＩＣＲ−４，２、ビオチン化ＩＣＲ−１，１。 ビオチン化抗うッ１−ＣＤ４（陰性対照）。　すべての第二段階の抗体は、実施 例１３に記載の標準手法に従ってビオチン化され、そして、すべてのチューブを 、次に４℃にてさらに３０分間インキュベートし、ＦＡＣ３緩衝液中で、２回洗 浄した。　次に、ストレプトアビジン−フィコエリスリン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、アラバマ州）のｌ：１ ０希釈物の５μｍを、５０７１１のＦＡＣ：Ｓ緩衝液を含むそれぞれのチューブ に加え、そしてすべてのチューブを、４℃にて３０分間インキュベートした。　 最後に、すべてのチューブをＦＡＣ３緩衝液中で２回洗浄し、そしてフローサイ トメトリー（ＦＡＣ３ｃａｎ、　Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｓｏｎ社）で分析した 。 モノクローナル抗体ＩＣＲ−４，２は、ＰＢＬ上のＩＣＡＭ−Ｈに対するビオチ ン化ＩＣＲ−４，２の結合をブロックしたが、モノクローナル抗体ＩＣＲ−１， １の結合をブロックしなかった。　同様に、モノクローナル抗体１ｃＲ−１，１ は、ビオチン化ＩＣＲ−１，１の結合をブロックしたが、モノクローナル抗体Ｉ ＣＲ−４，２の結合をブロックしなかった。　これらの結果から、２つの抗体が 、ＩＣＡＭ−Ｒ上の異なるエピトープを認識していることが示された。　以下の ヒト細胞系５ＫＷ３を用いた時にも同様の結果か得られた。　５ＫＷ３細胞をｌ μｇの抗体１ｃＲ−１，１あるいはＩＣＲ−４，２のいずれかで標識し、ＰＡＣ ３緩衝液中で洗浄し、ｌμｇのビオチン化１ｃＲ−１，１あるいはビオチン化１ ｃＲ−４，２とインキュベートした。　次に、すべてのチューブをＦＡＣ３緩衝 液中で洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリスリンとともに、４℃にて３０ 分間インキュベートし、そしてＦＡＣ３ｃａｎにより分析した。 分析においては、未標識の抗体（「ブロッキング」抗体）か、標識抗体のＩｃＡ Ｍ−Ｈに対する結合を阻害すれば、それは、未標識の抗体か標識抗体とＩＣＡＭ −Ｒに対する結合で「競合する」こと、および二つの抗体がＩＣＡＭ−Ｒ上の同 じエピトープを認識することを示す。　未標識の抗体が、標識抗体の結合を「競 合して離す」のに用いられる、競合分析の改変もまた、二つの抗体が同しエピト ープを認識するかとうかを決定するために用いられる。 本発明の様々なモノクローナル抗体によって認識される特異的なＩｃＡＭ−Ｒエ ピトープは、三つの異なる方法により、マツプさ本発明のＩＣＡＭ−Ｒ特異的抗 体によって認識される一次エピトープのマツピングの第一の方法は、マルチビン ペプチド合成システム（Ｃｈｉｒｏｎ　Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ　ＰＬｙ、社、Ｖｉ ｃｔｏｒｉａ、オーストラリア）を利用する方法である。　このシステムでは、 目的のタンパク質の重複するセグメントを表す１０個のアミノ酸ペプチドを、一 連のプラスチックビンの表面上に置くものである。　改変型ＥＬＩＳＡ試験を行 い、それぞれのペプチドに対するモノクローナル抗体の結合を決定した。 ＩＣＡＭ−Ｒペプチドに対するモノクローナル抗体の結合を決定するためのＥＬ ＩＳＡを、以下のように行なった。　ビンを２００μｌ／ウエルのブロッキング 緩衝液（２％重量／容量ＢＳＡ　、　０．１％容量／容量のＴｗｅｅｎ２０．０ ．ＯＩＭ　ＰＢＳ　ＳｐＨ７，２）を含む五つの９６穴プレートに置き、２０° Ｃにて攪拌しながら１時間インキュベートした。　ビンを１７５μｌ／ウエルの 希釈していない抗ＩＣＡＭ−Ｒモノクローナル抗体上浦の入ったプレートに移し 、４°Ｃにて、攪拌しながら一晩インキユベーションした。　次に、ビンをＯ， ＯＬＭＰＢＳ　、　ｐＨ７，２で４回洗浄（２０℃にて、攪拌しながら、１０分 間／１回の洗浄）し、接合希釈液（１％容量／容量のヒツジ血清、０．１％容量 ／容量のＴｗｅｅｎ　２０．０．１％重量／容量のカゼインナトリウム塩および ０．０１Ｍ　ＰＢＳ）で適当な濃度に希釈した１７５μｌ／ウエルのＨＲＰ−ヤ ギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）　（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　ＰｅｒｒｙＬ ａｂｏｒａｔｏｒｙ社、ＧａｉＬｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）を含むプ レート中に置いた。　プレートを２０℃にて１時間攪拌し、０．ＯＩＭ　ＰＢＳ で４回洗浄した。　ビンをＡＢＴＳ基質溶液［基質緩衝液（１７，９ｇ／Ｌ　Ｎ ａ２ＨＰａ、Ｈ，０１１６，８ｇルクエン酸モノハイドレート、ｐＨ４，０）中 の０．５ｍｇ／ｍ１ＡＢＴｓ、　０．０１％重量／容量Ｈ２Ｏ２コを含むプレー トに移し、４５分間２０℃にて攪拌し、次にプレートを４１０／４９５ｎｍで読 み取った。 個々のビンとの相対的反応性を、抗ＩＣＡＭ−Ｒおよび対照ハイブリドーマ上清 の免疫グロブリン濃度の違いならびに分析実験間の陽性対照の反応性の違いを標 準化した結果で決定した。　それぞれの上清のマウスＩｇＧレベルを、抗体捕捉 ＥＬＩＳＡで、以下のように決定した。　イムロン４プレートを、実施例１０ｃ に記載のように被覆し、そして洗浄した。　ＰＢＳＴ中で希釈した５０μＩ／ウ エルの培養上清［あるいは、ＰＢＳＴ中で２倍にした既知濃度（’）？ウス１ｇ Ｇ１およびＩｇＧｚａ　（ＭＯＰＣ−２１およびＵＰＣ−１０）　（シグマ社） ］をプレートに加えた。　室温にて１時間インキュベートしてＰＢＳＴで３回洗 浄した後、セイヨウワサビペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗マウスＩｇＧ（ ｆｃ）（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏ ｖｅ、ペンシルベニア州）をマウスＩｇＧ、用にｌ　：　２０００に希釈し、Ｉ ｇｃ２．用に１．　：　１０００に希釈し、そして５０μｌ／ウエルに加えた。 　プレートを室温にて１時間インキュベートしてＰＢＳＴ中で４回洗浄した後、 残りの分析を実施例１ｏｃに記載の方法に従って行った。　培養上清の抗体の１ 度は、測定した光学濃度をイソタイプに合った対照の標準曲線に当てはめること により決定した。 モノクローナル抗体ＩＣＲ−１，１の強い反応性が、以下に示す、アミノ酸１３ 〜２３にわたる２つの重複するペプチドで認められた。 配列番号：３７ ＶＬＳＡＧＧＳＬＦＶ 抗ＩＣＡＭ−Ｒ抗体と反応性のある領域は、以下の方法を用いて、明確にされ、 および／または証明される。 抗ＩＣＡＭ−Ｒ抗体によるエビトープマツピングもまた、ＮｏｖａＬＯＩ）ｅＬ ｉｂｒａｒｙ　Ｃｏｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　Ｓｙ ｓｔｅｍ　（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｍａｄｉｓｏｎ　、ウィスコンシン州）を用い て行った。　この方法を用いて、調査するタンパク質由来の小さいペプチドを含 んだポリペプチドを発現している細菌のクローンのライブラリーを作成した。　 次に、このライブラリーを、標準コロニーリフト方法により、モノクローナル抗 体をプローブとして用い、スクリーニングした。 ＩＣＡＭ−Ｈの外部領域（Ｉから４８０のアミノ酸）をコードする二本鎖ＤＮＡ を、２１°Ｃにて１０分間、１０ｍＭマンガンの存在下で異なる量のＤＮＡ５ｅ ｌにより、ｐＶＺ１４７　（実施例４参照）から切り出した。 反応をＥＤＴＡで停止させ、反応液の１７１０量を、エチジウムブロマイドを含 む２％アガロースゲルを、適当なマーカーとともに電気泳動した。　５０〜１５ ０ｂｐの範囲の断片を含む反応液をプールし、そして別の２％ゲル上で電気泳動 した。　５０〜１５０ｂｐの間の領域を取出し、その中に含まれる断片を透析チ ューブ（ＳＰＢｒａｎｄ　５ｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ　２．　ＭＷＣｏ　１２〜１ ４．０００）中に電気溶出し、次にフェノール／クロロホルム抽出し、そしてエ タノール沈殿した。 １μｇ　ＤＮＡを、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよびすべての４つのｄＮＴＰｓを 用いて、製造元のプロトコールに従い、平滑末端化した。　反応を、７５°Ｃで 、１０分間熱することにより停止し、次に、一つの３°ｄＡ残基を、Ｔｔｈ　Ｄ ＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、付加させた。　反応を、７０ ℃で、１５分間熱することにより停止し、そしてクロロホルムで抽出した。　１ μｇのＤＮＡから開始した場合、最終濃度は、８５μｍ中、１１．８ｎｇ／μｍ であった。 ｄＡデテール有する断片をｐＴＯＰＥ　Ｔ−ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）中に ライゲーションした。　このベクターは、挿入体を安定な融合タンパク質として 、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（この構造遺伝子は、宿主細胞中のレプリコン上に担 われている）により発現させるために設計された。　６ｎｇの１００ｂｐ　ＤＮ Ａ　（０，２ｐｍｏｌ）を用いて、ライゲーション反応を、１６℃にて５時間行 なった。ＮｏｖａＢＩｕｅ（ＤＥ３）　（Ｎｏｖａｇｅｎ社））細胞を１　ｕ　 Ｉ（１／１０）の反応混合物で形質転換し、モしてＬＢアガー（カーペニシリン ／テトラサイクリン）プレート上に拡げ、形質転換体の最初の計測値を得た。　 残りのライゲーション反応を、さらに１６時間、１６℃にて行なった。　最初の 載置に基ついて、２μｌのライゲーション反応液を４０μｍのコンビテンｌ−Ｎ ｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）細胞を形質転換するために用いた。 次に、八つのプレートを、抗体によるスクリーニングのために、約１２５０コロ ニー／プレートの密度に拡げた。 コロニーを、ニトロセルロース膜上で、クロロホルム蒸気室中で溶解して変性さ せる、標準コロニーリフト法を用いて、スクリーニングした。　ＴＢＳＴ　（ト リス緩衝液生理食塩水／Ｔｗｅｅｎ）中てｌ・１０希釈した、抗１ｃＡＭ−Ｒ抗 体１ｃＲ−１，１を一次抗体として用いて、アルカリホスファターゼ結合した二 次試薬を用いて、分析を行なった。　基質混合物を３０分間インキュベートした 。 一つの単離されたコロニーは、強い陽性反応を示した。　３つの他の領域（単離 されていないコロニー）は、弱い陽性反応を示した。　再スクリーニングのため に、単離されたコロニーあるいはコロニー領域のスタブから画線培養を行った。 　ＩＣＲ−１，１の再プローブによって、単離されたコロニー由来の画線培養物 が、基質との２０分間のインキュベーションの後に、陽性の反応性領域を有して いた。　他の３つのコロニー領域の試料は陰性であった。　ＩＣＡＭ−Ｒ反応性 領域由来のスタブをもう一度画線培養し、３７°Ｃにて一部インキユベートし、 そして基質と１０分間インキュベートすることにより再プローブした。　多くの ＩｃＲ−１，１反応性コロニーが得られた。　これらのコロニーから得られたプ ラスミドＤＮＡは、配列決定することができ、ＩＣＲ−１，１反応性のエピトー プに対応するアミノ酸配列を決定できる。 Ｃ０領域置換によるエピトープマツピングキメラＩＣＡＭ−Ｒ分子と欠失変異体 の構築本発明のモノクローナル抗体により認識されるＩＣＡＭ−Ｒの配座エピト ープは、領域置換実験によりマツピングできる。　これらの実験では、ＩＣＡＭ −Ｒのキメラ変異体か調製される。　キメラ変異体は、選択されたｒｃＡＭ−Ｒ の免疫グロブリン様領域をＩＣＡＭ−１の一部と融合して調製される。　そして 、この変異体をＦＡＣ３によって、本発明のモノクローナル抗体の結合について 分析する。 図７は、キメラタンパク質の図であり、その構築については、以下に述べる通り である。　番号ｌのタンパク質は、ＩｃＡＭ−Ｒのアミノ末端の免疫グロブリン 様領域（残基１から９３）を、ＩＣＡＭ−１（残基１１７から５３２）に融合し たものを含む。　番号２のタンパク質は、ＩＣＡＭ−Ｒのアミノ末端の始めの二 つの免疫グロブリン様領域（残基ｌから１９０）をＩＣＡＭ−１（残基１１８か ら５３２）に融合したものを含む。　番号３のタンパク質は、ＩＣＡＭ−Ｒの初 めの３つの免疫グロブリン様領域（残基ｌから２９１）をＩＣＡＭ−１（残基３ １７から５３２）に融合したものを含む。 番号１のタンパク質は、ＩＣＡＭ−ＲおよびＩＣＡＭ−１のコード配列中の、そ れぞれの免疫グロブリン様領域ｌおよび２の境目に、唯一のμ胆」部位を作るこ とにより調製された。　ＩＣＡＭ−ＨのＤＮＡ配列を、実施例１２に記載のよう に、Ｍ１３８Ｍ２１ベクター（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社）中にサブクローン化し 、Ｍ１３８Ｍ２１１ＣＡＭ−Ｒと称する分子を得た。　ＩＣＡＭ−１全体のコー ド配列［５１ｍｍ０ｆｌＳら、Ｎａｔｕｒｅ、３３１：６２４−６２７　（１９ ８８）コをプラスミドｐＢｓｓＫ（＋）（ＩｎｖｉＬｒｏｇｅｎ社）中にサブク ローン化した。　得られたｐｏｓｓＫ（＋）　ＩＣＡＭ−１を、Ｓａｔ　Ｉおよ びＫｐｎ　Ｉで切断し、ｆｃＡＭ−１］−ド配列をマルチクローニングサイトの 短いセグメントと共に取り出し、これを、制限酵素Ｓａｌ　ＩおよびＫｐｎ　Ｉ で切断したＭ１３９Ｍ２１にライゲーションし、Ｍ１３８Ｍ２１１ｃＡＭ−１と 称する分子を得た。 Ｍ１３ファージ単離体をＤＮＡ配列分析で確認した。 以下の配列を有する、変異導入のためのオリゴヌクレオチドＩＣＡＭ１．　Ｄｉ 、　Ｎｈｅｌ（ＩＣＡＭ−１の４２６から３９３のヌクレオチドに対応する）お よびＩＣＡＭＲ，ＤＩＮｈｅｌ（３６７から３９３のヌクレオチドに対応する） を通常の実験室の方法で合成した。 れぞれに相補的なりＮＡ配列とアニールした時に、ミスマツチ塩基対を形成する 。　両方のオリゴヌクレオチドとも、エンドヌクレアーゼ−Ｎｈｅ　ｒの認識部 位を導入する。　このオリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異導入により、 これらオリゴの配列を、それぞれＩＣＡＭ−１およびＩｃＡＭ−Ｒ標的ＤＮＡ配 列のＭ１３８Ｍ２１１ｃＡＭ−１およびＭ１３８Ｍ２１１ＣＡＭ−Ｈに導入した 。　それぞれの変異誘発反応から得られたいくつかのファージ単離体の配列を決 定し、正しいＤＮＡ配列か存在することを確認した。　これらの単離体は、Ｍ１ ３８Ｍ２１１ｃＡＭ−Ｒ，ＮｈｅｌおよびＭ１３８Ｍ２１　ＩＣＡＭ−１，Ｎｈ ｅｌと命名された。 ＩｃＡＭ−Ｒシグナルペプチドおよび免疫グロブリン様領域１のコード領域を、 以下の方法により、Ｍ１３８Ｍ２１１ｃＡＭ−Ｒ，Ｎｈｅｌから単離した。　１ ０μｇの精製した一本鎖Ｍ１３ＢＭ２１１ｃＡＭ−Ｒ，ＮｈｅｌファージＤＮＡ を、５０ｎｇのＬａｃＺユニバーサル−２０プライマー（配列番号　３５）にア ニールした。　アニールは、１×クレノウＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（１０ｍＭ 　Ｔｒｉｓ−Ｃ１ｐ）Ｉ　７．５．５　ｍＭ　ＭｇＣＬｚ、７．５ｍＭジチオス レイトール）中で、混合物を６５℃にて、５分間、次に、２５℃にて５分間イン キュベートすることにより行なった。 次に、以下の混合物をアニーリング反応液に加えた：最終濃度３３μＭのｄＡＴ Ｐ、　ｄＧＴＰＳｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰ　、　４ユニットのフレノウＤＮＡポリ メラーゼ（Ｂｏｅｈｒ　ｉｎｇｅｒ社）、およびｌ×クレノウ緩衝液。 プライマー伸長反応を、３７℃にて４５分間インキュベートして行い、１回のフ ェノール／クロロホルム（１：ｌ）抽出およびエタノユベーションした。　Ｉｃ ＡＭ−Ｒシグナルペプチドおよび免疫グロブリン様領域ｌのコード配列を含む、 ４１２ｂｐの断片をアガロースゲル精製した。 免疫グロブリン様領域２から５、縁膜的領域および細胞質領域のコード領域を含 む、ＩＣＡＭ−１のＤＮＡ配列を、制限酵素消化により単離した。　１０μｇの プライマー伸長したＭ１３ＢＭ２１１ＣＡＭ−１゜Ｎｈｅｌを、Ｎｈｅ　Ｉおよ びＮｏｔ　Ｉで切断した。　これにより、アガロースゲル精製した１４７６ｂｐ のＤＮＡ断片が取り出された。 ５μｇの哺乳類発現プラスミド匹ＤＮＡＩＡｍｐ　（Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ社）を 旦旧およびＮｏｔ　Ｉで消化し、スピンカラムクロマトグラフィーで精製した。 　２０μｍのライゲーション混合液を以下の成分を含むように調製した：　５０ ｎｇのＥｃｏ　Ｒ１およびＮｏｔ　Ｉ末端を有する直鎖状匹ＤＮＡＩＡｍｐ　、 　１１００ｎの４１２ｂｐのＩＣＡＭ−Ｒ断片、１１００ｎ　（７）１４７６ｂ ｐのＩＣＡＭ−１断片、ｌ×リガーゼ緩衝液および１ユニツトのＤＮＡリガーゼ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社）。　反応液を２５℃にて１６時間インキュベートし 、そしてコンピテントＸＬ−１細胞（Ｂｉｏｒａｄ社）を形質転換するのに用い た。　形質転換体を、最終濃度１００μｇ／ｍｌのカーペニシリンを添加したＬ Ｂプレート上で選択した。 形質転換体を標準ミニＤＮＡプレツブ法および実態分析のためのエンドヌクレア ーゼによる消化を用いて分析した。　ｐｃＤＮＡＩＡｍｐ、　ＲＤＩ　１０２− ５と命名された単離体を発現の研究のために選択した。 タンパク質番号１をコードするキメラ遺伝子も、以下の方法によって作成した。 　領域１を含むＩｃＡＭ−Ｒの約３７５ｂｐの−ＥｃｏＲＩ−ＩｃＡＭ−ＲとＭ １３８Ｍ２１１ＣＡＭ−１からの二本鎖（複製形態）　ＤＮＡの制限酵素消化、 および対応する二本鎖プラスミドＤＮＡのアガロースケル電気泳動の後に、ゲル 濾過した。　得られた二つのＤＮＡ断片を、ＥＣ０ＲＩ−Ｎ（■Ｉ消化と、子ウ シ腸上燐酸処理した発現ベクターｐｃＤＮＡｌ／Ａｍｐ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ ｎ社）への三方連結によってクローニングした。　大腸菌ＸＬＩブルー（ＳＬｒ ａｔａｇｅｎｅ社）株を、ライゲーション混合物で形質転換し、そして、形質転 換体をカーペニシリンを含むプレートにて選択した。　所望の挿入体を含むクロ ーンを、プラスミドＤＮＡ調製物の制限酵素消化によって同定した。 タンパク質２およびタンパク質３のコード配列の構築のために、唯一のＮｈｅ　 １部位か、免疫グロブリン様領域２および３の間に作成されているか、あるいは 唯一のＡｆｌ　＋１部位が、免疫グロブリン様領域３および４の間に作成されて いるＭ１３８Ｍ２１１ＣＡＭ−１およびＭ１３ＢＭ２１１ｃＡＭ−Ｒの調製体を 、上述のパラグラフと同様の方法で作成した。　以下の配列を有する４つのオリ ゴヌクレオチド（ＩｃＡＭ−１のヌクレオチド６８６から７１３に対応するＩＣ ＡＭ−１゜成した。 １５および１７は、オリゴヌクレオチドが、それぞれに相補的なりＮＡ配列にア ニールした時、ミスマツチ塩基対を形成する。 次に、ＩＣＡＭ−ＲおよびＩＣＡＭ−１の適当なコード配列（タンパク質２には 、Ｉ　ＣＡＭ−１残基１１８から５３２をコードする配列に融合しているＩＣＡ Ｍ−Ｈの初めの２つのアミン末端の免疫グロブリン様領域をコードする配列、な らびにタンパク質３には、ＩＣＡＭ−１残基３１７から５３２をコードする配列 に融合しているＩＣＡＭ−Ｈの初めの３つのアミノ末端の免疫グロブリン様領域 をコードする配列）を発現プラスミドｐｃＤＮＡＩＡｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ ｎ社）中にサブクローン化し、それぞれＩＣＡＭ−Ｒ変異体タンパク質２および ３をコードする、ｐｃＤＮＡＩＡｍｐ、　ＲＤＩ−２，０３−５および匹ＤＮＡ Ａｍｐ、　ＲＤＩ−３，１０４−５を作成した。 タンパク質番号２および３をコードする遺伝子融合物も、以下の方法によって構 築した。 配列をコードするタンパク質２を生成するために、ＩＣＡＭ−ＲおよびＩｃＡＭ −１双方における、領域２と３の間にて、ｉｎ　ＶｉｔｒＯ突然変異誘発を指示 するオリゴヌクレオチドによってＮｈｅｌを導入した。　領域１および２を含む ＩＣＡＭ−Ｈの約７００ｂｐの」匹Ｒ１−消化と、子ウシ編上燐酸処理したｐｃ ＤＮＡ　ｌ／Ａｍｌ＋ウラスミドＤＮＡへの三方連結によってサブクローニング した。　配列をコードするタンパク質３を生成するために、領域１〜３を含むＩ ＣＡＭ−Ｈのプラスミド［ｌＮＡの制限酵素消化およびアガロースゲル電気泳動 により精製した。　これら二つの断片は、Ｎｏｔｌによる消化と、燐酸処理した ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍ１１ウラスミドＤＮＡへの三方連結によってクローニングし た。　所望の方向性を有する挿入体を含むクローンは、プラスミドＤＮＡ調製物 の制限酵素消化によって同定した。 ＩｃＡＭ−Ｒ領域を削除した変異体を、キメラタンパク質番号１１２および３に 関して前述したオリゴヌクレオチドによる変異方法と同様の方法で作成した。　 ＩＣＡＭ−Ｒ（配列番号　ｌ）の２〜９０のアミノ酸を欠いた領域ｌの欠失変異 体、２〜２０３のアミノ酸を欠いた領域ｌおよび２の欠失変異体、および１８８ 〜２８５のアミノ酸を欠いた領域３の欠失変異体を構築した。 ＩＣＡＭ−ＲあるいはＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡ配列の全長を含む対照のプラスミド を、ゲル精製したｃＤＮＡ断片をプラスミドｐｃＤＮＡＩＡｍｐにライゲーショ ンすることによって作成した。　２つのプラスミドｐｃＤＮＡＩＡｍｐ　ＩｃＡ Ｍ−１および１ｌｃＤＮＡＩＡｎ＋ｐ　ＩＣＡＭ−Ｒは、それぞれ全長のＩＣＡ Ｍ−１およびＩＣＡＭ−Ｒタンパク質を発現し、等価の細胞内容物中で、天然の タンパク質に対するモノクローナル抗体の結合か評価され得るようにした。 ＩｃＡＭ−Ｒキメラあるいは欠失変異タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ 　、あるいは、プラスミドＤＮＡ　ｐｃＤＮＡＩＡｍｐｌｃＡＭ−１、ｐｃＤＮ ＡＩＡｍｐｌｃＡＭ−Ｒ、またはＩ）ＣＤＮＡＩＡｍｐを用いたＤＥＡＥデキス トラン法によってＣＯ３細胞を形質変換した。　一般的には、ＣＯ８細胞を、１ ０ｃｍ径プレートに約７．　ＯＸ　１０５細胞の密度で播き、そして、１０％胎 児ウシ血清（ＦＢＳ）を含むダルベツコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）にて− 晩成長させた。　翌日に、細胞単層をＤＭＥＭで洗浄し、ＤＭＥＭと、１０μｇ の所望のプラスミドＤＮＡ　、　Ｏ，１Ｍクロロキン、および５．０ｍｇのＤＥ ＡＥ−デキストランを含むｌｏｍｌの形質変換用混合物に、３７℃で、２．５時 間曝した。　インキュベーションした後、形質変換用混合物を吸引除去し、単層 を、１０％ＤＭＳＯを含むＰＢＳにて１分間処理した。　細胞をＤＭＥＭで一度 洗浄し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭでインキュベートした。　翌日に、培地を 新鮮なものと交換し、さらに三日間、インキュベーションを継続した。 領域ｌおよび２の欠失した変異体を除く、すべてのキメラおよび欠失変異体１ｃ ＡＭ−Ｒタンパク質の発現が認められた。　領域１と領域３の欠失した変異体は 、野性型ＩＣＡＭ−Ｒタンパク質と比較して５０〜６０％のレベルの発現を呈し た。 Ｃ（２）、領域置換−モノクローナル抗体結合分析によるエピトープマツピング 抗ＩＣＡＭ−Ｒモノクローナル抗体結合分析のために、ＩＣＡＭ−Ｒキメラタン パク質あるいは対照構築物をコードする構築物で形質変換したＣＯ３細胞を、Ｅ ！ＤＴＡ処置によって、プレートから除去し、そして、９６丸穴ウエルプレート の各ウェル当たり２．５Ｘ　１０５個の細胞を振り分けた。　細胞を、冷却した 洗浄用緩衝液（１％ＢＳＡと０．０５％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で３ 回洗浄した。 抗１ｃＡＭ−Ｒモノクローナル抗体を、５０μｌでの最終体積にて５．０μｇ／ ｍ　ｌの濃度で使用し、氷上にて３０分間インキュベートした。 そして、細胞を冷却した洗浄用緩衝液で３回洗浄し、１　：　１００の希釈度に て、ＰＩＴＣ標識した第二抗体（ヒツジ抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ’）ｚ）と共に 、暗黒下、５０μｍの最終体積にて、３０分間インキュベートした。　インキュ ベーションした後、細胞を再度、冷却した洗浄用緩衝液で３回洗浄し、２００μ ｍの１％バラホルムアルデヒド中に再懸濁した。　試料を、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉ ｃｋｉｎｓｏｎＦＡＣ８ｃａｎ装置にて分析した。　分析結果を下記表５にＣＯ ３細胞の形質変換の割合として示し、表中、ＭＯＰＣ２１（ＩｇＧ１）とＵＰＣ １０（ＩｇＧ２ａ）はイソタイプが拮抗する対照であり、１８Ｅ３ＤはＩＣＡｌ ｌｌ−１特異的モノクローナル抗体であり、そして、ＩＣＲ−１，１からＩＣＲ −９，２はＩＣＡＭ−Ｒ特異的モノクローナル抗体である。　モノクローナル抗 体ＩＣＲ−１，１からＩＣＲ−９，２の反応性を、モノクローナル抗体１ｃＲ− １２，１からＩＣＲ−１７，１とは異なる実験にて分析した。 ＩＣＲ−９，２２，１２６６，８４４６，６４５０，６９２，３９上記結果は、 ＩｃＲ−１，１，２，１，３，１，５，１，７，１，８，１、■２．１、■３． ｌ、１４．１．１５．１．１６．　ｌ、および１７，１の抗体は、ハイブリッド 分子を認識しており、その内、ＩＣＡＭ−１領域１のみか、ＩｃＡＭ−Ｒ領域１ と置換されていた。　ＩｃＲ−４，２，６，２および９．２は、ＩＣＡＭ−１の 二つの領域（領域ｌおよび２）の最小部分が、ＩＣＡＭ−Ｈの対応する領域と置 換されている。　これらの結果に基つき、抗体は、領域ｌ特異的あるいは領域２ 特異的のいずれかに分類されることになる。 ＩＣＡＭ−Ｒキメラおよび欠失変異タンパク構築物を、１０μｇの２ＸＣｓＣＩ バンドしたプラスミドＤＮＡを用いる、リン酸カルシウム共沈殿プロトコールに よるラットＬ細胞の形質導入に用いた。 このプロトコールでは、形質導入の４８時間後、細胞を穏やかなトリプシン処理 で皿から除去した。　細胞を分けて、１０μｇ／ｍｌの濃度の抗ＩＣＡＭ−Ｒモ ノクローナル抗体あるいは対照のイソタイプに適合するモノクローナル抗体、ま たはモノクローナル抗体が無い状態で、氷上で１時間インキュベートした。　そ して細胞を、先に実施例１３Ｃに記載したようにして、ＦＡＣ３分析にかけた。 Ｄ、アミノ酸置換によるエピトープマツピング本発明の抗１ｃＡＭ−Ｒ抗体の上 述したようなＩＣＡＭ−Ｒ変異体タンパク質との特異的な反応性は、ＩＣＡＭ− Ｒの特異的領域との反応性を示唆している。　特定の領域が特定の抗ＩＣＡＭ− Ｒモノクローナル抗体と反応することが確認されたら、それらの領域の個々の残 基を、オリゴ特異的部位特異的変異導入により変え、モノクローナル抗体結合に 対する、それらの相対的影響を調べる。　タンパク質のバイトロバシーおよび二 次構造を予測するコンピューターアルゴリズム（Ｋｙｔｅら、前出の文献）に基 づいて、抗体との相互作用の能力を持つ特定の残基を変異導入の標的とする。 ＩＣＡＭ−Ｈの突然変異を、前出のＫｕｎｋｅｌ　ｅｔ　ａｌの方法に従って実 施した。　大腸菌株Ｃｊ２３６（ｄｕｔ　ｕｎｇ）を、プラスミドｐｃＤＮＡ１ ／Ａｍ１１１ＣＡＭ−Ｒ（上記０節を参照）を用いた電気導入によって形質転換 した。　形質転換体を、カーペニシリンを含むプレートで選択した。　形質転換 体の一つを、ヘルパー・ファージＭ１３ＫＯ７で感染させ、−晩、成長させた。 　ウラシルを含む一本鎖ＤＮＡを、培養上清から調製し、そして、突然変異のた めに用いた。　突然変異用のオリゴヌクレオチドを、ｐｃＤＮＡｌ／Ａｍｐ−Ｉ ＣＡＭ−Ｈの一本鎖ＤＮＡを含むライシルとハイブリダイズした。　突然変異用 のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、また、Ｔ７　ＤＮＡポリメラー ゼと７４　ＤＮＡリガーゼそれぞれを用いることで、ＤＮＡ合成および結合反応 を行った。　合成反応液の一部を、大腸菌ＸＬＩブルー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ 社）株を形質転換するために用い、そして、形質転換体をカーペニシリンを含む プレートで選択した。　この株での、ウラシルを含むプラスミドＤＮＡの成長は 、ウラシルを含むＤＮＡ　（野性型）鎖の増殖を著しく低減する。　変異体を、 プラスミドＤＮＡ調製物と診断用制限酵素消化によって、選択した。　配列を、 ＤＮＡ配列分析によってさらに検証した。　作成された変異体は、Ｆ２］、Ｖ／ ＡＳ　、　８３２に／ＡＳ　、　Ｋ３３１／ＡＬ　、　Ｅ３７Ｔ／ＡＳ　。 Ｔ３８／Ａ　、　Ｌ４０／Ａ　、　Ｋ４２Ｅ／ＡＳ　、　Ｅ４３／Ａ　、　Ｌ４ ４Ｖ／ＡＬ　、　Ｗ５１Ａ／ＡＳ　。 Ｒ６４／Ｑ　、　Ｓ６８／Ａ　、　Ｙ７０／Ａ　、　Ｎ７２／Ｑ　、　Ｑ７５１ ／ＡＳ　５Ｎ８１／Ｑである。 例えば、「Ｆ２１ｖ／ＡＳ」トイウ変異は、ＩＣＡＭ−Ｒ（配列番号、１）の２ １位のフェニルアラニンと、２２位のバリンが、それぞれ、アラニンとセリンに 変換されることであり、一方で、ｒＴ３８／Ａ　Ｊという変異は、ＩＣＡＭ−Ｒ （配列番号、１）の３８位のスレオニンか、アラニンに変換されることを意味す る。　抗ＩＣＡＭ−Ｒモノクローナル抗体結合に関する各変異の効果を、上記０ 節に記載の手順に従って試験した。　下記表６には、得られた結果をまとめてお り、「臨界」効果か得られる変異とは、野性型ＩＣＡＭ−Ｒへの結合と比較して 、０〜２０％の抗体の結合が認められることを意味し、「重要」効果か得られる 変異とは、野性型１ｃＡＭ−Ｒへの結合と比較して、約５０％の抗体の結合か認 められることを意味し、そして、微小効果とは、野性型１ｃＡＭ−Ｒへの結合と 比較して、約７５％の結合か認められることを意味している。　抗体への結合に 影響を及はさない変異は、表６には記していない。 表　６　（続き） 変異Ｔ３８／Ａ　、　Ｔ６８／ＡおよびＲ６４／Ｑは、試験した九つの抗体のい ずれの結合にも影響を及ぼさなかったが、Ｅ４３／Ａの変異では、野性型ＩＣＡ Ｍ−Ｒへの結合と比較して、上記九つのモノクローナル抗体において、５０％の 結合の増加か認められた。　Ｆ２１Ｖ／ＡＳの変異は、すべての抗体の結合を解 消し、ＩＣＡＭ−Ｒの配座に大きく影響するものと思われる。 実施例１２ ＩＣＡＭ−Ｒタンパク質の分布および様々な細胞および細胞系中におけるＩｃＡ Ｍ−ＲのＲＮＡの発現をそれぞれ、ＦＡＣ５分析およびノーザンブロソトハイブ リダイゼーションにより分析した。 Ａ、ＩＣＡＭ−Ｒタンパク質分布のＦＡＣ８分析白血球細胞系および正常白血球 中 白血球細胞系上で、抗ＩＣＡＭ−Ｒモノクローナル抗体１ｃＲ−２，１、抗ＩＣ ＡＭ−１抗体（ＬＢ２）および抗ＣＤ１８抗体（ＴＳＩ／１８、ＡＴＣＣＨＢ２ ０３）を用いて、実施例１０Ｃに記載されたようにして行なったＰＡＣ３分析か ら、ＩｃＡＭ−Ｒが、主要な白血球系統において、ｉｎ　ｖｉＬｒｏで増殖した 細胞系、すなわち、１９２３球、８９２８球および骨髄細胞で広範に発現してい ることが示された。　ＩＣＡＭ−Ｈの表面発現は、初期の赤白血痰系に５６２上 では検出されなかった。　さらに、ＩＣＡＭ−Ｒは、培養ヒト謄静脈内皮細胞（ ）ｌｔｌＶＥｃｓ）により、腫瘍壊死因子による刺激前あるいは刺激後のいずれ にも、検出できるはとには発現しなかった。　この因子は、ＩＣＡＭ−１の発現 を向上させた。　この発現のパターンは、内皮細胞上で発現するＩＣＡＭ−２で 見られたものとも異なっている。　以下の表２は、それぞれの細胞の試料の平均 蛍光、および各細胞試料中の対照に対する陽性細胞の百分率を示している（例え ば、平均蛍光１３／１１％陽性細胞）。 嚢−二− Ｂ、ヒトおよびマカクザルの白血球におけるＩＣＡＭ−Ｒ分布のＦＡＣ５ＡＣ ５分析１０Ｃに記載に従って、正常ヒトおよびマカクザル末梢血白血球上で、Ｆ ＡＣ３分析を行なった。　これにより、抗１ｃＡＭ−Ｒモノクローナル抗体ＩＣ Ｒ−２，１が、リンパ球、単球および顆粒球の、三つの主要なヒト白血球系統と 反応することかわかった。 表２の最後の６つの項目を参照のこと。　さらに、モノクローナル抗体２６＋１ ０８−２および４６１１２Ｈは、マカクザル白血球と交差反応した（表２および 実施例１３Ｅ）。　これにより、これらのモノクローナル抗体か、この動物中で 実行される疾病モデル中でのＩＣＡＭ−Ｈの発現をモニターするのに有用であり 得ることが示された。 ヒト細気管支洗浄細胞（第一マクロファージ）を、５つの抗ＩＣＡＭ−Ｒ抗体（ ＩＣＲ−２，１、ＩＣＲ−３，１、ｆｃＲ−４，２、ＩＣＲ−６，２およびＩｃ Ｒ−７，１）で、実施例１３に記載した様にして染色し、ＦＡＣ３により分析を した。　どの抗体も特異的にこれらの細胞を染色しなかった。　免疫組織学試験 から得た他のデータは、ＩＣＡＭ−Ｒか、肺の隙間空間にあるマクロファージ上 に発現することを示唆している。　（肺組織中のＩＣＡＭ−Ｒの発現が記載され ている実施例１８を参照のこと。） Ｃ０白血球細胞系およびＨＵＶＥＣ５中におけるＩｃＡＭ−ＲＲＮＡ発現のノー ザンプロット分析ＲＮＡを、ヒト白血球細胞系および皿ＶＥＣ３から、実施例７ の記載に従って抽出した。　そして、ＩＣＡＭ−ＲあるいはＩＣＡＭ−１ｃＤＮ Ａのいずれかでプローブ接触することにより、（実施例７に記載されている）ノ ーザンハイブリダイゼーションによる分析を行なった。　最初のハイブリダイゼ ーションのリン光体イメージングの後、プロットを細長く切り、ヒトアクチンプ ローブを用いて、再分析した。　アクチン標準化したＩｃＡＭ−ＲおよびＩＣＡ Ｍ−１でプローブしたプロットのノーザンの結果は、図７　（ＡがらＢ）に棒グ ラフとして表されている。　ＪｉＮＡレベルでは、ＩＣＡＭ−Ｒは、様々な白血 球細胞タイプ中に発現した。　ＩＣＡＭ−ＲＲＮＡ発現は、必ずしもＩＣＡＭ− Ｉ　ＲＮＡの発現と同じではなかった。　例えば、刺激していないＨＵＶＥＣ５ は、低いレベルのＩＣＡＭ−１を発現し、発現はＴＮＦ刺激の後に上昇した（図 ７Ｂ）。　これに対して、検出し得るレベルのＩＣＡＭ−Ｒメツセージは、未刺 激あるいは刺激済ＨＵＶＥＣ３中で観られなかった（図７Ａ）。 実施例１７ 表面をビオチン化したヒト細胞系ＫＧ１ａＳＫ５６２およびＣＥＭの、界面活性 剤で可溶化した溶解物の免疫沈降を、４つの抗ＩＣＡＭ−Ｒモノクローナル抗体 （ｒ（Ｒ−２，１、ＩＣＲ−１，１、ＩＣＲ−４，２、およびＩＣＲ−３、■） を用いて行なった。 ヒト白血球細胞系ＫＧＩ　、　Ｋ５６２、およびＣ８Ｍ上の細胞表面タンパク質 を、以下のようなスルホ−ＮＯ３−ビオチン（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａ１社 、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州）との反応により標識した。 それぞれの反応で、０．５〜１×ｌＯ７個の細胞を、リン酸緩衝液生理食塩水（ ＰＢＳ）中で２回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁し、そしてＰＢＳ中で希釈 した１０ｕｌの１００ｍＭスルホ−Ｎ）Ｉｓ−ビオチンを加えた。　３７℃にて １０分間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し７、そして４ｍｌの １０ｍＭトリス１ｌＨ８，４，０，２５Ｍ蔗糖を加えた。　そして、次に細胞を ４℃にて３０分分間中かに混合しながらインキュベートした。　細胞を遠心分離 により沈澱し、上清を吸引し、そして沈殿を３００μｌの１０ｍＭ　トリスｐＨ ８，５０ｍＭ　ＮａＣ１，１％トリトンＸ−１００，］　ｍＭフェニルメチルス ルホニルフルオライド、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡで氷上で１５分間インキュベートし ながら溶解した。　溶解物を遠心分離で浄化し、上清を、２５μｍの正常マウス 血清を加えて、４℃にて１時間インキュベーションすることにより前処理した。 　この工程の後、あらかじめ２０μｇのアフィニティー精製したウサギ抗マウス 免疫グロブリン（２７ｍ８６社）と共にインキュベートしておいた、プロティン Ａセファロースビーズ（シグマ社）の２０μｍの５０１５０（ｖ／ｖ）溶液を加 えた。　４℃にて３０分間インキュベーションした後、遠心分離によりセファロ ースビーズを除去した。 次に、ウサギ抗マウス免疫グロブリン、および抗ＩＣＡＭ−Ｒあるいはコントロ ールのＩｇＧ１あるいは１ｇＧ２．モノクローナル抗体のいずれかと連続的にイ ンキュベーションすることによりあらかじめ結合しておいた、２０μｌのセファ ロースビーズを加えることにより、特異的免疫沈降を行なった。　４°Ｃにて攪 拌しながら一部インキュベーションをした後、セファロースビーズを微量遠心機 中で沈澱し、そして１　ｍｌ　１０ｍＭ　ヘペスｐＨ７，３，１５０ｍＭＮａＣ ｌ、１％ｌ・リドンｘ−ｉｏｏで２回、　０．１Ｍ　ｌ−リスｐＨ８，０，５Ｍ ＬｉＣｌ、１％βメルカプトエタノールで１回；そして２０ｍＭ　トリスｐＨ１ ，５，５０ｍＭ　ＮａＣｌ　、０．５％ＮＰ−４０で１回、連続的に洗浄した。 次に、ビーズを５０μｍの１５０ｍＭ　ｌ−リスｐＨ６，８、ブロムフェノール ブルー、２０％βメルカプトエタノール、４％ＳＤＳ、および２０％グリセロー ルで溶出し、５分間煮沸し、そして遠心分離で沈澱した。　次に、得られた溶出 液の３５μｌを５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１０％アクリルアミド）で分析した。　電 気泳動の後、タンパク質を、イモピロンＰメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、 Ｂｅｄｆｏｒｄ　、？サチューセッツ州）上に電気プロットし、そして、０，２ ％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むトリス緩衝液生理食塩水で希釈した、２％ウシ血清ア ルブミン中で４℃で２０分間インキュベートした。　次にプロットをストレプト アビジン（Ｖｅｃｔｏｒ社）に結合したセイヨウワサビペルオー３Ｆ−シ’；ｆ −セと、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で、室温にて２０分間インキュベーションした。 　ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄した後、ＥＣＬウェスタンブロッティング検 出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を加え、化学ルミネセンスバンドをＫｏｄａｋ　 Ｘ−ＯＭＡＴ−ＡＲフィルム上で視覚化した。 図８　（ＡからＢ）に、ウェスタンプロットの結果を示す。 ＫＧＩ細胞由来のモノクローナル抗体ＩＣＲ−２，１との免疫沈降で、特異的に 沈降した１２０ｋＤのバンドか見られたが、Ｋ５６２細胞由来のものでは認めら れなかった（図８八を参照のこと）。 Ｔ細胞系ＣＥＭの免疫沈降物中にも、１２０ｋＤのバンドか見られた（図８Ｂ、 ここでレーンＡは、モノクローナル抗体２６Ｈ１１Ｃ−２と；レーンＢは、モノ クローナル抗体ＩＣＲ−２，１と；レーンＣは、モノクローナル抗体１ｃＲ−４ ，２と：レーンＤは、モノクローナル抗体ＩＣＲ−１，１と；およびレーンＥは 、陰性対照抗体とそれぞれ反応１７た）。　他の免疫沈降で見られるＩＣＡＭ− Ｒか示すバンドの大きさは、細胞により多少異なった。　あるリンパ様細胞の１ １６　ｋＤ以下から、ある骨髄細胞の１４０　ｋＤ以下までの範囲のバンドか観 られた。　ＩｃＡＭ−Ｒ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて、コアペプチドの 予測サイズ（約５２ｋＤ）と、これらの結果から、ＩＣＡＭ−Ｒが翻訳後に高度 に修飾され、タンパク質の成熟細胞表面型か得られていることかわかる。 実施例１８ 抗ＩＣＡＭ−Ｒモ／　りｏ　−−３−ル抗体ＩＣＲ−４，２、ＩＣＲ−１，１オ 、Ｊ１．びＩＣＲ−２、ｌ、および対照抗体による、免疫組織学的染色を、扁桃 、膵臓、肝臓、肺、腎臓、心臓、消化器系、皮膚、滑膜、および脳（正常脳組織 および多発性硬化症に冒された脳組織）を含む様々なヒト組織に関して行った。 　異なる抗ＩＣＡＭ−Ｒ抗体と、精製した抗ＩＣＡＭ−Ｒモノクローナル抗体Ｉ ＣＲ−１，１あるいはハイブリドーマ上清を用いて、類似の染色パターンが得ら れた。 様々な組織の切片（６ｕｍ）を、Ｖｅｃｔａｂｏｎｄ　（Ｖｅｃｔｏｒ社）で被 覆したスライド上に載せ、そして−７０℃にて保存した（切片のいくつかは、− ２０℃で保存した）。　使用前に、スライドを一７０℃から取り、５５℃にて５ 分装置いた。　次に、切片を冷アセトン中で１０分間固定し、そして空気乾燥し た。　切片を１％ＢＳＡ、６０％正常ヒト血清、および６％正常ウマ血清を含む 溶液中で、室温にて３０分間ブロックした。　ＩＣＡＭ−Ｈに対する一次抗体、 陰性対照抗体、抗１ｃＡＭ−１モノクローナル抗体あるいは抗ＩＣＡＭ−２モノ クローナル抗体をそれぞれの切片に、室温にて１時間作用させた。　スライドを １ｘＰＢｓＴに３回、それぞれ５分間ずつ浸すことにより、未結合の抗体を洗い 落とした。　次に、ビオチン化抗マウス免疫グロブリン（Ｖｅｃｔｏｒ社）をそ れぞれの切片に同様にして作用させた。　ＡＢＣ−ＨＰＯ（Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉ ｏＬｉｎ複自体−ＨＰＯ）を二次抗体の検出に用いた。　１＋ｎｌの１％ＢＳＡ ／ＰＢＳＴ中で試薬Ｂ（９ｕ　Ｉ）　（Ｖｅｃｔｏｒ社）と結合した試薬Ａの溶 液（９ｕｌ）　（Ｖｅｃｔｏｒ社）を、それぞれの切片に室温にて３０分間作用 させた。　次に、スライドを１ｘＰＢｓＴ中で３回洗浄した。　ＤＡＢ基質（３ ′３ジアミノベンジジン−４塩酸塩、シグマ社）（ストック：　０．０５Ｍ　ト リス緩衝液、１）８７．６中で１：１０に希釈した６００ｍｇ／ｍｌ　ＤＡＢ　 、最終濃度１％になるように加えられた３％過酸化水素水）をそれぞれのスライ ドに、室温にて８分間作用させた。　スライドを水中で５〜１０分間室温にて洗 浄し、次に１％オスミウム酸を、（着色を促進するために）室温で１分間加えた 。　次に、スライドを生水で５〜ｌＯ分間洗浄し、そして室温にて３０秒間、１ ％Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｆａｓｔ　Ｒｅｄ　（ＮＦＲ）中で対比染色した。　最後に 、スライドをアルコール脱水し、ヒスドロクリアー処理し、そしてヒストマウン トを用いて、カバーガラスを取り付けた。 モノクローナル抗体で染色した結果の代表的なものを、図９（ＡからＧ）に顕微 鏡写真として示す。　この中で、図９Ａ。 ９Ｂ、および９Ｅの組織は、ヒト扁桃；９ｃおよび９Ｄは、ヒト肝臓；９Ｆは、 多発性硬化症のヒト患者由来の脳；そして９Ｇは正常ヒト脳である。　９Ａ、９ Ｃ，９Ｆ、および９Ｇに示されるセクションは、抗ＩＣＡＭ−Ｒモノクローナル 抗体ＩＣＲ−４，２で染色された。　９Ｂおよび９Ｄに示した切片は、陰性対照 抗体で染色され、一方、９Ｅに示される切片は、抗ＩＣＡＭ−１抗体で染色され た。　染色により、扁桃のようなリンパ組織中で高レベルのＩｃＡＭ−Ｒが発現 していることが明らかになった（９Ａ）。 発現は、肝臓のような他の非リンパ器官中の組織白血球上からも検出された。　 例えば、Ｋｕｐｆｅｒ細胞（肝臓マクロファージ）は、明らかに染色された（９ Ｃ）。　ＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−Ｒ発現がｉｎ　ｖｉｖｏで別々に調節さ れていることの証拠が、扁桃およびリンパ節での染色パターンで観られた。　Ｉ ＣＡＭ−１は、第二濾胞の胚中心のＢ細胞上でよく発現し、第−濾胞中では発現 しない。 一方、ＩＣＡＭ−Ｒは、第−濾胞中の細胞で発現し、胚中心中では発現しない（ １０Ａおよびｌ０Ｅ）。　意味深いことに、ＩＣＡＭ−Ｒ発現は、炎症部位に浸 潤している白血球上にも検出された。　例えば、ＩＣＡＭ−Ｈの発現は、多発性 硬化症に冒されている個体の脳組織中の、管周辺に浸潤している白血球上でも検 出された（９Ｆ）。 正常な個体由来の脳組織の解剖学的に等しい位置では、同様の染色は見られなか った（９Ｇ）。　ＩＣＡＭ−Ｒ発現は、関節の滑液に浸潤する白血球上でも検出 された。　さらに、ＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−２の発現は、内皮リグニング 管上で検出されたが、ＩＣＡＭ−Ｒは、典型的には、管内皮上では見られなかっ た。　ＩＣＡＭ−Ｈの発現は、肺の肺胞細胞上で検出された。 より一般的には、ＩＣＡＭ−Ｒを発現する細胞は、すべての正常組織および病気 の組織中に検出された。　これらのＩＣＡＭ−Ｒ発現細胞は、形態学的に、そし て、一連の免疫学的染色の比較によって、白血球および抗原提示細胞と同定され 得る。　様々な組織にみられるすべてのＣＤ３”　Ｔ細胞は、ＩＣＡＭ−Ｒを高 レベルで発現した。　これに対して、主要な小泡、胚細胞の中心分にみられるＢ 細胞のサブセット（ＩｇＤ＋）のみが、ＩＣＡＭ−Ｒを高レベルで発現した。　 抗原が存在する細胞の中で、上皮細胞に存在するランゲルハンス細胞か、ＩＣＡ Ｍ−Ｒを高レベルで発現した一方で、他の組織マクロファージの一つのサブセッ トのみか、ＩＣＡＭ−Ｒを発現した。 ＩＣＡＭ−Ｒモノクローナル抗体ＩＣＲ−１，１およびＩＣＲ−４，２も、ヒト 乳癌（導管および小裂片）および黒色腫双方の生検組織片を染色するために、上 述したのと同様の方法を用いた。　いずれの腫瘍のタイプにおいても、血管（静 脈、動脈および毛細血管）の領域にて、内皮の特異的で際立った染色部分がみら れた。 対応する正常な組織では、内皮でのＩＣＡＭ−Ｈの発現はみられなかった。 このように、一般的な脈管構造の内皮にてＩＣＡＭ−Ｈの典型的な発現はみられ なかったが、固形腫瘍の二つのタイプに関連する脈管のサブセットにて明確な発 現がみられた。　この蛍光を加味すれば、ＩＣＡＭ−Ｈに対する試薬（例えば、 モノクローナル抗体）を、正常な脈管構造に対して腫瘍を選択的に攻撃する、治 療用途の運搬体も提供できる。 要するに、ＩＣＡＭ−Ｒと、ＩＣＡＭ−１ならびにＩＣＡＭ−２との発現パター ンは非常に対照的である。　ＩＣＡＭ−２の本質的な発現は、白血球および内皮 細胞の双方にみられた。　白血球、内皮細胞、および上皮細胞でのＩＣＡＭ−１ の基礎的な発現は、低調あるいは皆無であるが、病理組織あるいはｉｎ　ｖｉｔ ｒｏにてその発現は誘導される。 はとんどの白血球にて、ＩＣＡＭ−Ｒは高レベルで発現し、にもかかわらす内皮 細胞に関連する腫瘍にて稀に発現するが、そして、管器官の内皮細胞では一般に 発現しない。 実施例１９ ＩＣＡＭ−Ｒが同型の細胞の接着に関与しているか否かを調べるために、ＩＣＡ Ｍ−Ｒを発現する細胞系の一部で凝集分析を行った。 これらの細胞系には、Ｔリンパ芽球細胞系（ＳｕｐＴｌ、ＣＥＭ　。 Ｍｏ１ｔ４　、Ｈｕｔ７８　、Ｊｕｒｋａｔ、５ＫＷ３）　、Ｂリンパ芽球細胞 系（Ｊｉｊｏｙｅ、　Ｒａｊｉ）　、単球細胞系（０９３７、ＨＬ６０）　、骨 髄細胞系（ＫＧ−１）　、および赤白血球細胞系に５６２が含まれる。　ＩＣＡ Ｍ−Ｒ分子の機能を調べるために、凝集を分析する前に、細胞を様々な抗体とイ ンキュベートした。　ハイブリドーマＩＣＲ−２，１、ＩＣＲ−１，１、ＩｃＲ −４，２およびＩｃＲ−３，１によって調製された抗１ｃＡＭ−Ｒ上清、ならび にβ２インテグリン経路を通じて凝集をブロックすることが知られている抗体調 製物が用いられた。　これらは、ＬＦＡ−１のβサブユニットであるＣＤ１８分 子に特異的なＴＳＩ／１８（ＡＬＣＣＨＢ２０３）　、　ＬＦＡ−１のα鎖であ るＣＤｌｌａ分子に特異的なＴＳＩ／２２（ＡＴＣＣＨＢ２０２）　；およびＭ ＡＣ−１のαサブユニットであるＣＤｌｌｂ分子に特異的なＬＭ２／１（ＡＴＣ ＣＨＢ２０４）である。　精製した抗ＩＣＡＭ−１抗体およびＶＬＡ−４分子の α鎖に対するハイブリドーマ（ハイブリドーマクローン１６３１（：　Ｍｉｃｈ ａｅｌ　Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒ社、Ａｌｂｅｒｔａ　１カナダ）上清を対照と して用いた。 凝集分析を、ホルボール１２−　ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）　（ ５０ｎｇ／ｍｌ）を添加あるいは無添加にて二連で行なった。 １０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０中の３ＸｌＯ’個の細胞を、平底９ ６穴マイクロテストプレート中に加えた。　１つの抗体を実験で試験した時、５ ０μｌの精製した抗体あるいはハイブリドーマ上清をウェル中に加えた（選択さ れたウェルに、同時にＰＭＡを加えた）。　二つの抗体を実験で試験した時、抗 体は、室温にて、細胞に連続的に加えられ、それぞれ３０分間インギュヘート（ ３７℃で１５分間のインキュベーションでも同じ結果が得られた）し、そして細 胞を３７℃でインキュベートした。　ＰＭＡを加える前にあるいはＰＭＡと同時 に、抗体を細胞とインキュベーションしても、凝集の結果に有為な変化はなかっ た。　単数あるいは複数の抗体とインキュベーションした後、細胞を均一に再懸 濁し５、そして次に３７℃にて４から２４時間インキユヘーヒトた。 凝集の評価を倒立顕微鏡で行なった。　それぞれの実験で、ＰＭＡ刺激の効果を 、Ｒａｊｉ細胞を等量のＰＭＡで刺激し、そしてＣＤ１８、ＣＤ１１ａおよびＩ ｃＡＭ−１分子に対するモノクローナル抗体によリブロックされ得る凝集の量を 測定することにより、平行して確認した。 以下の表８は、ＰＭＡを加えた１つの代表的な凝集の実験の結果を示すものであ る。　凝集の評価は、０から５までの範囲でなされている。　ここで、０は細胞 か全く集合していないことを示し：ｌは細胞の１０％未満が集合していることを 示し；２は細胞の１０から５０％が凝集していることを示し；３は細胞の５０か ら１００％か緩い集合になっていることを示し；４は細胞のほとんど１００％が 一体的な凝集体になっていることを示す。 興味深いことに、ＩｃＡＭ−Ｒに特異的な三つの抗体（ＩＣＲ−２，１、ＩＣＲ −１，１およびＩＣＲ−３，１）が同型の細胞間の凝集を刺激した（ＩＣＲ−１ ８１およびＩＣＲ−３，１のデータは示さず）。　刺激は、ホルボールエステル （ＰＭＡ）のような共刺激剤の存在および非存在下の両方で起こった。　四番目 の抗ＩＣＡＭ−Ｒモノクローナル抗体（ＩＣＲ−４，２）は、細胞凝集を刺激し なかったが、他の抗ＩＣＡＭ−Ｒ抗体によって刺激された凝集をブロックした。 　抗１ｃＡＭ−Ｒ抗体で刺激されたＰＭＡ処理細胞の凝集の少なくとも一部は、 ＣＤ１８あるいはＣＤ１１ａに対するモノクローナル抗体での前処理によりブロ ックされた。　このことから、１つ以上のロイコインテグリンか、このタイプの 接着に関与し得ることかわかった。 凝集か、抗ＩＣＡＭ−Ｒ抗体１ｃＲ−２，１５ＩｃＲ−１，１およびＩＣＲ−３ ，１により誘導されたことを確かめるために、同じ抗ＩＣＡＭ−Ｒモノクローナ ル抗体（ＩＣＲ−１，１）から精製された完全な免疫グロブリン（ＩＣＲ−１， １−１ｇ）およびＦａｂ’断片（ＩＣＲ−１，］−Ｆａｂ’　）の両方を用いて 、凝集分析を行なった。　Ｆａｂ’断片の産生には、ＪＯｈｎＳｔＯｎＥｊら、 Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、１ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｉｎ　Ｐｒａｃｔｉｃ ｅ、　０ｘｆｏｒｄ　Ｐｒｅｓｓ（１９８２）の第５２頁を参照のこと。　分析 は、ＩＣＲ−１，、１−１ｇおよびＩＣＲ−１，１−Ｆａｂ’をｌμｇ／ｍｌの 濃度で用い、上述した方法に従って５ＫＷ３Ｔ細胞で行なわれた。　抗ＣＤ１８ および抗ＩＣＡＭ−ＲＣＩＣＲ−１，１−上清およびＩＣＲ−４，２−上清）ハ イブリドーマを対照として用いた。 ４時間の後、完全な免疫グロブリンについて、Ｆａｂ’断片あるいはＩＣＲ−１ ，１上清と同し細胞凝集の増加が見られた（下記の表９を参照のこと）。 抗ＣＤ１８上清あるいは抗ＩＣＡＭ−ＲＩｃＲ〜４．２上清での凝集の増加は見 られなかった。　これらの結果から、凝集が強められたのは、抗体が介在する細 胞同士の結合によったものであるという、当然の説明か導きだされた。　この場 合、選択された抗体によるＩｃＡＭ−Ｒタンパク質の結びつきは、結合した細胞 の接着力を変えるシグナルを伝達するものである。 実施例２０ 免疫系細胞の活性化および増殖のプロセスは、細胞現象の連続性によって認識さ れる。　ある種の細胞表面細胞分子（例えば、ＣＤ６９およびトランスフェリン レセプター）の上昇は、細胞活性化の初期マーカーである。　同様に、細胞の凝 集は、活性化のプロセスの初期に起こる。　ＩＬ−２レセプターの上昇は、後期 段階の中間で起こり、細胞増殖は、後の現象である。　ＩＣＡＭ−Ｒか免疫細胞 の活性化／増殖に関与する程度を決定するために、二つのタイプの実験を行なっ た。　１番目のタイプでは、形質導入した細胞の表面に存在するＩＣＡＭ−Ｈの 、リンパ球の増殖を刺激する能力が調べられた。　２番目のタイプでは、ＩＣＡ Ｍ−Ｒ上の異なるエピトープを認識する本発明の抗体が、ＩＣＡＭ−Ｈの外部領 域と結合するためにプローブとして用いられ、抗体結合単独あるいは他の刺激剤 との組合せの、リンパ球の活性化と増殖に与える影響を調べた。　３番目のタイ プの実験では、Ｔ細胞増殖に関する可溶性ＩＣＡＭ−Ｒタンパク質の効果を決定 した。 Ａ、ＩｃＡＭ−Ｒ形　変換体によるＰＢＭＣ増殖の刺激ＩＣＡＭ−ＲｃＤＮＡあ るいはＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡで形質導入したマウスＬ細胞（実施例７）を分析し て、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖を刺激する能力を調べた。　測定は 、ＤＮＡ複製の割合の変化を示す３Ｈ−チミジン取込み分析で行なった。　形質 導入されていないマウスＬ細胞あるいは形質導入されているし細胞は、組織培養 フラスコからのトリプシン処理により得られ、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ Ｉ−１６４０中で洗浄した。　１２０ｕ　ｌの組織培養培地（１０％ウシ胎児血 清を含むＲＰＭＩ−１６４０）中の５ＸｌＯ’個のＬ細胞を、滅菌した９６穴平 底組織培養プレートの個々のウェルに加え、そしてプレートを、３７℃にて２４ 〜３６時間、５％ＣＯ２インキュベーターで、インキュベートした。　次に、培 地を滅菌状態で除去し、そして２Ｘ１０５個の新しく単離したＰＢＭＣ（全容量 は、組織培養培地で２００ｕｌ）を、形質導入したマウスＬ細胞あるいは形質導 入していないマウスＬ細胞を含むそれぞれのウェルに加えた。　ＰＢＭＣを、Ｌ 細胞を含まない対照のウェルにも加えた。　ＰＢＭＣは、健康なドナーからヒス トバークグラジェント（シグマ社）での遠心分離によって、あらがしめ単離した 。 新鮮な末梢血を等量のＰＢＳと混合し、ヒストパーク上に上層し、そして、４５ ０ｇで２０分間、制動無しで遠心分離した。　ＰＢＭＣを含む画分を回収し、Ｐ ＢＳ中で洗浄し、ウェルに加える前に、１×ｌ０１１個の生存能力のある細胞／ ｍｌに調整した。　次に、組織培養プレートを、最終濃度５　ｎｇ／ｍｌのＰＭ Ａの存在下あるいは非存在下のいずれかで、計４日間インキュベートした。　次 に、１ｕＣｉの３Ｈ−チミジン（ＮＥＮ社、Ｂｏｓｔｏｎ、　？サチューセッッ 州）を個々のウェルに、培養の最後の１８〜２４時間加えた後に、リンパ球の増 殖を評価した。　次に、ＰＨＤモデルブレートハーベスタ−（Ｃｏｓｔａｒ社、 Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　？サチューセッッ州）を用いて、それぞれのウェルの内 容をグラスファイバーフィルター片上に回収することによって、すべての培養を 終えた。　次に、それぞれのフィルターマットを、３ｍｌのエコリウム・シンチ レーションカクテル（ＩＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社、Ｃｏ５Ｌａ　Ｍｅｓ ａ、カリ７ｔルニア州）中に置き、βシンチレーションカウンターを使って計数 した。　ＩｃＡＭ−Ｒを発現するＬＴＫ細胞は、形質導入していない対照のＬＴ Ｋ細胞あるいはどの刺激剤も無い状態と比べて、ＰＢＭＣの増殖を刺激した（　 ＤＮＡ複製の増加によって示された）。　ＩＣＡＭ−１を発現するＬＴＫ細胞は 、ＰＢＭＣの増殖をほぼ同程度に誘導した。 ＰＢＭＣ上のレセプター（単数あるいは複数）に結合することによって、ＩｃＡ Ｍ−Ｒは、細胞間シグナルをＰＢＭＣに伝え、この場合、細胞増殖の結果となる 。 Ｂ、ＩＣＡＭ−Ｒ特異的モノクローナル抗体によるＰＭＢＣ活性本発明の抗１ｃ ＡＭ−Ｒ抗体もまた、免疫細胞の活性化および増殖に与える影響を調べるために 試験した。 まず、抗１ｃＡＭ−Ｒモノクローナル抗体の、細胞活性化の最初の現象に影響を 与える能力について、予備的に試験した。　これらの現象には、フローサイトメ トリー分析で測定される標的の細胞上の、細胞表面分子ｃＤ６９、トランスフェ リンレセプターおよびＩＬ−２レセプターの上昇が含まれる。　刺激されていな いリンパ球は、低いレベルのトランスフェリンおよびＩＬ−２レセプターを発現 している。　レセプターの発現は、リンパ球が活性化された時に、著しく増加し た。 抗ＩＣＡＭ−Ｒモ／　りｏ　−ナル抗体ＩＣＲ−１，１およびＩＣＲ−４，２（ ７）ソれぞれを、他の誘導刺激剤の非存在下で、ＰＭＢＣ活性化を誘導する能力 について試験した。　モノクローナル抗体１ｃＲ−１，１あるいはＩＣＲ−４， ２（あるいは対照のモノクローナル抗体）を、９６穴平底組織培養プレート個々 のウェルに加え（ＰＢＳ中に１０μｇ／ウェル）、３７℃にて、５％ＣＯ２イン キュベーター中で、３時間インキュベートした。　プレートを、滅菌したＰＢＳ で３回洗浄し、未結合の抗体を除去し、そして新たに単離されたＰＢＭＣをすぐ に加え、最終濃度を２００μｌの培地中で２Ｘ１０’個の細胞／ウェルとした。 　次に、プレートを１日あるいは３日のどちらかの期間、インキュベートし、こ の異なる抗体の存在下で培養した細胞を取り除き、０．０１％アジ化ナトリウム および１％ＢＳＡ（ＦＡＣ３緩衝液）を含むＰＢＳ中で、上記のように洗浄し、 ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎランスフェリンレセプターおよび 抗ＩＬ−２レセプター抗体のいずれかで染色した。　ＦＡＣ３ｃａｎ分析の結果 を得た。　ＩＬ−２レセプター以外のＣＤ６９およびトランスフェリンレセプタ ーの発現は、ＰＢＭＣを固定化（すなわち、架橋）抗体１ｃＲ−１，１上で培養 したとき１日後に増加したが、固定化抗体ＩＣＲ−４，２上で培養したときは増 加しなかった。　固定化したＩＣＲ−１，１あるいはＩＣＲ−４，２上で３日間 インキュベートしたＰＢＭＣは、トランスフェリンレセプターおよびＩＬ−２レ セプターの両方の細胞表面発現のレベルが増加したか、ＣＤ６９は増加しなかっ た。　しかしながら、これらのリンパ球活性化マーカーの発現の増加が１日およ び３日後に観察されたが、この発現の増加は、細胞のサイズによってもたらされ るものではなかった。　これらの結果から、抗ＩＣＡＭ−Ｒモノクローナル抗体 ＩＣＲ−１，１およびＩｃＲ−４，２が、別の外来性の刺激剤の非存在下で、Ｐ ＭＢＣ活性化の初期の現象を直接誘導することができるか、この活性化によって 、胚形質転換および関連した細胞の大きさの増加の結果にはつながらなかった。 Ｃ１１抗ＣＤ３抗によるＰＭＢＣ活性の刺激に関するＩＣＡＭ−Ｒ特異的モノク ローナル抗体の効果抗ＩＣＡＭ−Ｒモノクローナル抗体はまた、固定化洗ＣＤ３ モノクローナル抗体Ｇ　１９　［Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ、 、　１３５（４）：２３３１−２３３６　（１９８５）　ｉによって刺激される ＰＭＢＣ活性化の初期現象を変える能力について試験した。　モノクローナル抗 体Ｇ１９は、Ｔ細胞上のＣＤ３複合体（Ｔ細胞レセプター）に結合し、モしてＴ 細胞を活性化する。　ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３抗体（０，０５μｇ／ウェル）単独 であらかじめ被覆しておいたウェル中で培養したとき、ＣＤ６９の発現のみか１ 日後に上昇した。　３日後、ＣＤ６９、トランスフェリンレセプターおよびＩＬ −２の細胞表面発現は著しく上昇した。　これらの活性化マーカーの上昇は、細 胞の大きさの増加と相関関係にあった。 １０μｇの抗ＩＣＡＭ−Ｒモノクローナル抗体１ｃＲ−１，１あるいはＩＣＲ− ４，２（あるいはＨＬＡクラスＩの対照モノクローナル抗体；　５ｅｒＯ１ｅＣ 。 ０ｘｆｏｒｄ、　Ｅｎｇｌａｎｄ）を、０．０２５　ｕｇ／ウェルの抗ＣＤ３抗 体が最初に存在あるいは欠如している９６穴平底組織培養プレートのそれぞれの ウェルに加え、その後、未結合の抗体を除去するために洗浄した。　新しく得ら れたＰＢＭＣをすぐに加えた（　２　ｘ　ｉｏ’個の細胞／ウェル）。　次に細 胞を計１６時間あるいは３日間インキュベートし、氷冷ＦＡＣ３緩衝液中で２回 洗浄した。　２Ｘ１０’個の細胞を、次に５０μｌの氷冷ＦＡＣ３緩衝液中で再 懸濁し、そして５μＩのＦＩＴＣ接合抗ＣＤ６９、抗トランスフェリンレセプタ ー、抗ＩＬ−２レセプター抗体あるいは抗Ｆ［ＴＣ接合対照１ｇを加えた。　細 胞を４℃にて３０分間インキュベートし、そして次に０．５ＩＱ＋の氷冷ＦＡＣ ５ＡＣ５緩衝液洗浄した。　最後の洗浄の後、細胞を０．５ｍｌの氷冷ＦＡＣ３ 緩衝液中に再懸濁し、蛍光をＦＡＣ５ｃａｎ分析で測定した。　ＰＢＭＣを、０ ．０２５ｇｇ／ウェルの固定化抗ＣＤ−３（単独あるいはＨＬＡクラスＩに対す る固定化抗体の存在中）上で、３日間培養した時、トランスフェリンおよびＩＬ −２レセプターの発現は、このような低い量の固定化抗ＣＤ３では、上昇しない 。これに対して、０．０２５ｇｇ／ウェルの固定化抗ＣＤ３および固定化洗ＩＣ ＡＭ−Ｒ抗体ＩＣＲ−１，１あるいはＩＣＲ−４，２のいずれかの存在下で、Ｐ ＢＭＣを培養したところ、トランスフェリンおよびＩＬ−２レセプターの両方の 有為な上昇の結果となった。　抗体ＩＣＲ−１，１では、効果はより明らかであ った。　１６時間の培養の後もまた、同様の結果が得られた。　固定化したＩＣ Ｒ−１，１あるいはＩＣＲ−４，２抗体の存在下での低い量の抗ＣＤ３により、 ＣＤ６９の発現が誘導されたが、トランスフェリンレセプターは誘導されなかっ た。　一方、固定化した抗ＨＬＡ−１の存在下での低い量の抗ＣＤ　３　（０， ０２５μｇ／ウェル）は、ＣＤ６９あるいはトランスフェリンレセプターの発現 の増加を誘導しなかった。　これらの結果から、これらの抗１ｃＡＭ−Ｒ抗体が 、初期の免疫細胞活性化事象の共刺激分子として役立ち得ることがわかった。 Ｄ、　ＩＬ−２の存在下でのＰＭＢＣ増殖の刺激第二に、抗１ｃＡＭ−Ｒモノク ローナル抗体が細胞増殖の後期現象に関与しているかどうかを、再び３Ｈ−チミ ジン取込み分析による測定で決定するために、予備実験を行なった。 ＩＣＡＭ−Ｈに対するモノクローナル抗体を、ヒト組換えＩＬ−２の存在あるい は非存在のいずれかで、ＰＭＢＣ増殖を直接刺激する能力について試験した。　 このヒト組換えＩＬ−２は、細胞増殖を強化するが誘導はしない。　ＰＢＳ中の １０μｇのＩＣＡＭ−Ｒモノクローナル抗体２６１１０８−２および２６Ｅ３Ｄ −１（あるいは対照１ｇＧ＋および１ｇＧ２）抗体）を、９６穴平底組織培養プ レートのそれぞれのウェルに加え、そしてプレートを３７°Ｃにて３〜４時間、 ５％ＣＯ。インキュベーター中でインキュベートした。　インキュベーションの 後、それぞれのウェルをＰＢＳで３回洗浄し、新鮮なＰＢＬを、最終濃度が２０ ０μｌ中２　Ｘ　１０’個の細胞／ウェルになるように加えた。 次に、１０ユニット／ｍｌのヒト組換えＩＬ−２（Ｇｅｎｚ）＋＋ｎｅ社、１３ ｏｓｔｏｎ。 マサチューセッツ州）を、選択されたウェルに加えた。　プレートを計３日間、 ３７℃にて５％ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。　ＰＭＢＣに よる３Ｈ−チミジン取込みを本実施例の前半の記載に従って測定した。　抗ＩＣ ＡＭ−Ｒ抗体ＩＣＲ−１，１およびＩＣＲ−４，２、ｒｌＬ２の存在下でさえも 、ＰＢＭＣ増殖を誘導しなかった。　リンパ球増殖の陽性対照は、固定化した抗 ＣＤ３および抗ＬＦＡ−１（６０，３）モノクローナル抗体を含んでいた。　こ れらの結果から、固定化抗ＩＣＡＭ−Ｒ抗体は、ＣＤ６９などのような活性化マ ーカーの発現を刺激するが、それら自身では、多数のＰＢＭＣが細胞サイクルの ８期入りを、直接刺激することはないことがわかる。 Ｅ、ＩＣＡＭ−Ｒ特異的抗体によるリンパ球増殖の共刺激抗ＩＣＡＭ−Ｒ抗体は 、抗ＣＤ３抗体と共に、初期のＰＢＭＣ活性化現象を刺激するため、抗ＩＣＡＭ −Ｒ抗体を、固定化した抗ＣＤ３抗体により誘導されたリンパ球増殖を共に刺激 する能力について試験した。　加えて、抗ＩＣＡＭ−Ｒ抗体か不随細胞が欠けて いる条件下での１９２３球を共刺激するか否かを決定するために、抗ＩＣＡＭ− Ｒ抗体を、純ＣＤ４１Ｔリンパ球の増殖を共刺激する能力に関して試験し、随性 選択法を用いて単離した。　ＣＤ４＋細胞を単離するために、ＰＢＭＣを組織培 養培地に再懸濁し、７５ｍ　ｌ容の組織培養フラスｍｌ　（Ｃｏｒｎｉｎｇ社） に加え、そして、３７℃、５％ＣＯ２にて、１時間インキュベートした。　そし て、ＰＢＳで一度ゆっくりとフラスコを洗浄することで、プラスチックに接着し なかった細胞を除去した。　プラスチックに接着しなかった細胞（１０’細胞／ ｍｌ）の画分を、１０％ＦＢＳ−ＰＢＳ　（培地を含む）に、ｌμｇ／ｍｌの抗 ＣＤ８抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）、ｌ ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ１９（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）　、１　μｇ ／ｍｌの抗ＣＤ１ｌｂ（Ｂｅｃｋｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を含む抗体画分 に懸濁し、そして、４℃で、１時間インキュベートした。　未結合抗体を、被覆 培地で２回洗浄することで除去した。　そして、細胞（１０７細胞／ｍ１）を、 ヤギ抗マウスＩｇ被覆した磁性ビーズ（４５μｌ／ｌｏ’細胞）（Ａｄｖａｎｃ ｅｄ　Ｍａｇｎｅｔｊｃｓ社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を含む培地 に再懸濁し、４℃で、１時間インキュベートした。 磁性ビーズに結合した細胞を、強力磁石を用いて懸濁液から除去した。　この方 法を用いて得たＣＤ４＋集団が、流動細胞計測法分析によって、９０％を超える 純度であったことが判明した。 ＰＢＭＣあるいはＣＤ４＋細胞を、組織培養培地中、ｌＸｌ０’個の生存する細 胞／ｍｌの濃度に調整した。　９６穴平底組織培養プレートの個々のウェルを０ ．００１μｇの抗ＣＤ３モノクローナル抗体Ｇ１９／ウェルであらかじめ被覆し た。　プレートを、３７℃にて５％ＣＤ□インキュベーター中で３時間インキュ ベートし、未結合抗体をウェルをＰＢＳ中で３回洗浄することにより、除去した 。 最後のＰＢＳ洗浄の後、ＩＣＡＭ−Ｈに対するモノクローナル抗体（ＩＣＲ−４ ，２あるいはＩｃＲ−１，１）あるいは対照抗体を、最終濃度１０μｇ／ウェル ですぐに加えた。　次に、プレートをさらに３７℃にて３時間再インキュベーシ ョンした。　ウェルを再びＰＢＳで３回洗浄し、未結合の抗体を除去し、そして 新しく単離したＰＢＭＣをウェルに直ちに加えた（２００μ／ウエルの容量中２ ＸＩＯ’個の細胞）。　次に、プレートを３日インキュベートした。　リンパ球 の増殖は、ＰＭＢＣあるいはＣＤ４＋細胞の３Ｈ−チミジン取込みで測定した。 　図１０に示したように、固定化洗ＩＣＲ−１，１抗体ＩｃＲ−４，２は、ＰＢ ＭＣおよび精製したＣＤ４＋細胞の抗ＣＤ３に対する反応を増加させた。　固定 化抗ＩＣＡＭ−Ｒ抗体の、抗ＣＤ３モノクローナル抗体により誘導されるＰＢＭ Ｃ凝集（ＰＢＭＣ増殖より初期の現象）に対する影響もまた、この実験で調べた 。　抗ＣＤ３で刺激される凝集は、抗体１ｃＲ−１，１によりほぼ１００％阻害 されたが、固定化ＩＣＲ−４，２には影響されず、そして抗体１ｃＲ−２，１お よび抗体１ｃＲ−４，］によってはわずかに阻害された。 ＩＣＡＭ−Ｒを発現する細胞の増殖に影響を及ぼす抗ＩＣＡＭ−Ｒ抗体の能力の 分析の結果から、本発明の抗体のＩＣＡＭ−Ｒに対する結合により直接的な細胞 内シグナルが１９２３球に伝達され、それが細胞増殖を調節する。 Ｆ、可溶性ＩＣＡＭ−ＨによるＰＢＬの共刺激可溶性ＩＣＡＭ−Ｒを、ヒトリン パ球活性化を共刺激する能力に関して分析した。　ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離によって取得し、ウェル当たり２ 　Ｘ　１０’個の細胞を、プレートに結合した可溶性ＩＣＡＭ−Ｒ，プレートに 結合した抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）　、あるいはプレートに結合した抗ＣＤ３と可溶 性ＩＣＡＭ−Ｒのいずれかの培地の存在下にてインキュベートした。 培養を開始してから、４日と１７時間後に、細胞を除去し、ヒトリンパ球活性化 抗原へのモノクローナル抗体で染色し、そして流動細胞計測により解析した。 プレート結合した抗ＣＤ３　（０，５μｇ／ウェル）および可溶性ＩＣＡＭ−Ｒ （１，００ｎｇ／ウェル）の存在下で４日間培養したヒトリンパ球は、抗ＣＤ３ のみの存在下で培養したリンパ球と比較して、活性化抗原ＩＣＡＭ−ＩＳＩＬ− ２レセプター、およびトランスフェリンレセプターの上昇した数値を示した。　 これに対して、可溶性ＩＣＡＭ−Ｒ（１００ｎｇ／ウェル）のみの存在下で培養 したリンパ球は、培地のみで培養した細胞と比較して、これら活性化抗原の増加 は認められなかった。 最後に、ＩＣＡＭ−Ｒが細胞と細胞の接触に依存するＴリンパ球活性化の初期現 象に関与するかどうかを調べる実験も行った（例えば、スタフィロコッカスエン テロトキシンＡおよび同種抗原に対する応答）。 Ｇ、　ＰＢＬの超抗原誘導増殖に関するＩＣＡＭ−Ｒ特異的抗体の効果超抗原に より誘導されたヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の増殖および凝集を、本発明のＩ ｃＡＭ−Ｒ特異的抗体の存在下で評価した。 可溶性およびプレート結合したＩＣＡＭ−Ｒ抗体および抗ＨＬＡクラスＩ対照Ｂ −８９（ＳｅｒｏＬｅｃ社）抗体の、増殖および細胞凝集に与える影響を、ヒト ＰＢＬをスタフィロコッカスエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）（Ｔｏｘｉｎ　Ｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ社、５ａｒａｓｏＬａ、フロリダ州）での刺激の３日後に測定 した。　プレートに結合した抗体は、培養の日に以下のようにして調製した。　 精製した抗体（０，１ｍ１ＰＢｓ中ｌＯμｇ）を９６穴平底プレートのそれぞれ のウェルに加えた。　次に、プレートを３７℃にて４時間インキュベートした。 インキュベーションの後、未結合の抗体を、それぞれのウェルを吸引しかつ新鮮 なＰＢＳで４回洗浄することによって、除去した。　ヒｈ　ＰＢＬを健康なドナ ーから、ヒストバーク（シグマ社）グラジェント上で単離した。　新鮮な末梢血 を等量のリン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）と混合し、ヒストパーク上に上層し 、そして４５０Ｘｇで２０分間、制動無しで遠心分離した。　リンパ球の画分を 回収味そしてｌＯ％ウシ胎児血清を含む新鮮なＲＰＭＩを加えることによって２ 回洗浄し、そして８分間２００Ｘｇで遠心分離した。　ＰＢＬを最終容量１０ｎ ＋ｌのＲＰＭＩ−ＰＢＳ中で懸濁した。　生存しているＰＡＩＬを生体色素排除 法を用いて計数した。　２０μｌの０．４％トリバンブルー染色（Ｇｉｂｃｏ社 ）中の細胞懸濁物の希釈液をヘマサイトメーターチャンバーに加え、そして次に 色素排除細胞を倒立顕微鏡を用いて計数した。　次に、２０％個の生存しテイル ＰＢＬヲ、１００．１０あるいはｌμｇの可溶性あるいはプレート結合したＩＣ Ｒ−１，１５ＩＣＲ−２，１、ＩＣＲ−３，１、［ＣＲ−４，２、ＩＣＲ−５， １、ＩＣＲ−６，２、ＩＣＲ−７，１、ＩＣＲ−８，１５ＩＣＲ−９，２、ＩＣ Ｒ−１２，１゜ＩＣＲ−１３，１、ＩＣＲ−１４，１，ＩＣＲ−１５，１，ＩＣ Ｒ−１６，１ＳＩＣＲ−１７，１ＳＢ−Ｈ９あるいはｌ０Ｔ２　（ＡＭＡＣ社、 ウェストプルツク、メイン州）抗体を含む９６穴平底組織培養プレートに加えた 。　最後に、それぞれの培養物をＳＥＡ　テ刺激しく１０００あるいはｌｏｐｇ ／ｍｌ　テ３回）、３７°Ｃにて５％ＣＯＲ中で培養した。　３日後、増殖を３ Ｈ−チミジン取込みで測定し、凝集を倒立顕微鏡で測定した。 可溶性の抗ＩＣＡＭ−Ｒ抗体は、可溶性の対照抗体と比較してＰＢＬの増殖を変 えることはできなかった。　しかしながら、プレートに結合した（すなわち交差 した）抗体ＩＣＲ−１，１、＋ｃＲ−２：ｌ。 ＩＣＲ−５，１、ＩＣＲ−６，２、ＩＣＲ−５，１５ＩＣＲ−６，２およびＩＣ Ｒ−１７，１は、５ＥＡ（ｐ　＜　０．０５）に対して増殖を有為に阻害し、一 方、抗体ＩＣＲ−３、ｌ　、　ＩＣＲ−４，２、ＩＣＲ−７，１、ＩＣＲ−９， ２、ＩＣＲ−１３，１、ＩＣＲ−１４，１およびＩＣＲ−１５，１は阻害しなか った（図１１Ａおよび図１１Ｂ）。　抗体ＩＣＲ−１２，１およびＩｃＲ−１６ ，１は増殖をわずかに阻害したが、抗体ＩＣＲ−１２，１、ＩＣＲ−１３，１、 ＩＣＲ−１４，１，ＩＣＲ−１５，１およびＩＣＲ−１６，１は、最も低い濃度 での阻害効果に改善がみられた。　抗体ＩＣＲ−１，１およびＩＣＲ−８，１は 、最も顕著に増殖を阻害した。　図１１Ｃは、対照抗体の存在下での増殖との比 較にて観察された増殖の割合に関する、モノクローナル抗体ＩＣＲ−１，１、Ｉ ＣＲ−２，１、ＩＣＲ−５，１、ＩＣＲ−６，２およびＩＣＲ−８，１のロジス ティック用量応答曲線を示しており、下記表１０は、その曲線から得たＩＣ５， を示す。 細胞周期に導入する際に不随することに、ＳＥＡの細胞凝集がある。　細胞凝集 に関するモノクローナル抗体ＩＣＲ−１，１およびＩＣＲ−４，２の効果を、倒 立顕微鏡を用いて測定した。　プレート結合したＩＣＲ−１，１はまた、プレー ト結合したＢ−Ｈ９およびＩＣＲ−４，２抗体に比べて、両方のＳＥＡ濃度で細 胞凝集を有為に阻害した。　プレート結合したＩＣＲ−１，１による凝集の阻害 はほぼ完全であった。　これに対して、プレート結合したＩＣＲ−４，２抗体は 、プレート結合したＢ−Ｈ９と比べてわずかに凝集を阻害したのみであった。　 ＳＥＡにより誘導されるＰＢＬの凝集は、可溶性のＢ−Ｈ９９抗に比ヘテ、可溶 性抗ＩＣＡＭ−Ｒ抗体ＩＣＲ−１，１あルイハＩＣＲ−４，２によっては影響さ れなかった。 プレートに結合した抗ＩＣＡＭ−ＲがＳＥＡに誘導される増殖を阻害するのに必 要な最小限の時間もまた測定された。　ＰＢＬは、プレートに結合したＩＣＲ− ４，２、ＩＣＲ−１，１、あるいはイソタイプに適合した抗ＨＬＡ−１対照抗体 Ｂ−８９（ＩｇＧ＋）およびＩＯＴ２（ＩｇＧｚ）　（ＡＭＡＣ社、ウェストプ ルツク、メイン州）で、ＳＥＡとともに（１０１）ｇ／ｍｌ）あるいはＳＥＡ無 しで、３．５および７時間、あらかじめインキュベ−［・シた。　次に、ＰＢＬ を清潔なウェルに移し、そしてＳＥＡの存在下で（１０ｐｇ／ｍｌ）　、３日間 培養した。　３Ｈ−チミジン取込み（増殖）分析の結果を図１２にまとめている 。　固定化されたＩｃＲ−１，，１抗体および低レベルのＩＣＲ−４，２は、わ ずか３時間のインキュベーションの後に、イソタイプに適合した対照に比べて、 有為に増殖を減少させた。　この結果から、プレート結合したＩＣＲ−１，］あ るいはＩＣＲ−４，２のＩＣＡＭ−Ｈに対する結合が、細胞が固定化された抗体 から除去された後に、増殖を阻害することができる細胞内シグナルを伝達するこ とが示されたのである。　これら結果は、長期間にわたるＩｃＡＭ−Ｒ特異的薬 剤（例えば、モノクローナル抗体）の飽和レベルを維持することなく、ＩＣＡＭ −Ｈの治療上の効果を維持できることを示唆するものである。 Ｔ細胞も不随細胞も、高いレベルでＩＣＡＭ−Ｒを発現するので、ＩＣＲ−１， １によるＳＥＡへの応答時に細胞−細胞接触依存性Ｔ細胞の活性化の阻害は、Ｔ 細胞、不随細胞、あるいは双方へ結合するＩｃＲ−１，１によって介在される。 　さらに、ＩＣＡＭ−ＲとＩＣＡＭ−１は、非活性化Ｔ細胞での発現力において 顕著な相違か認められるので、抗１ｃＡＭ−１と抗ＩＣＡＭ−Ｒを、異なる活性 化状態にてＴ細胞サブセットを目標とすることで、ＳＥＡ応答を阻害することが 可能である。　新生細胞および記憶細胞でのＩＣＡＭ−Ｒの役割は異なるので、 ＣＤ４”　ＣＤ４５ＲＯ”　（ｒ記憶ｊ）細胞あるいはＣＤ４”　ＣＤ４５ＲＡ ”（「休止」）細胞の増殖を誘導したＳＥＡを阻害する抗ＩＣＡＭ−Ｒ抗体の能 力を試験した。　プラスミド非接着性ＰＢＭＣ（１０”細胞／ｍｌ）を、被覆培 地中に抗ＣＤ８、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ１ｌｂ　、および抗ＨＬＡ−ＤＲ（Ｂｅｃ ｋｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）および、　（ＣＤ４５ＲＡ”　ＣＤ４＋細胞を 取得するための）抗ＣＤ４５ＲＯ（Ａｍａｃ社）あるいは（ＣＤ４５ＲＯ”　Ｃ Ｄ４＋細胞を取得するための）抗ＣＤ４５ＲＡ　（Ａｍａｃ社）のいずれかを含 む抗体混合物（それぞれ１Ｈｇ／ｍｌ）を用いて、４℃で、１時間インキュベー トした。　被覆培地で細胞懸濁液を２回洗浄して、未結合抗体を除去し、ヤギ抗 体マウスＩｇＧ被覆した磁性ビーズを用いてインキュベートした。　そして、磁 性ビーズに結合した細胞を、強力磁石を用いて懸濁液から除去した。　この方法 で取得したＣＤ４５ＲＯ＋およびＣＤ４５ＲＡ＋集団が、流動細胞計測法分析に よって、９５％を超える純度であったことが判明した。　２０％個の記憶Ｔ細胞 、休止Ｔ細胞、あるいはプラスチック接着性細胞を、固定化したＩＣＲ−１，１ 、抗ＩＣＡＭ−１抗体ＬＢ−２、あるいは抗ＨＬＡ−１抗体ｐ１０．１（１０μ ｇ／ｍｌ）　（Ｇｅｒａｌｄ　Ｎｅｐｏｍ社、バージニア−７ンソン研究センタ ー、シアトル、ワシントン州）と共に、３時間インキュベートした。　抗体処置 した記憶あるいは休止Ｔ細胞を、クリーンウェルから除去し、２ＸＩＯ’プラス チック接着性細胞と共に混合した。　抗体処置した不随細胞を、未処理記憶Ｔ細 胞あるいは未処理体止Ｔ細胞のいずれかと混合した。 各調製培養物を、ＳＥＡ（１０１１ｇ／ｍｌ）で刺激した。　３Ｈ−チミジン取 込（増殖）分析法の結果を、図１３にまとめ、図中、ｒＡＰＣＪの略語は、この 分析法での不随細胞である「抗原提供細胞」を意味し、星印０）は、抗体によっ て前処理した細胞の集団を示している。　ＩＣＲ−１，１によるＣＤ４５ＲＯ” 　Ｔ細胞あるいは不随細胞（ＡＰＣ？？？）の前処置は、ｐｌＯ，ｌ対照抗体と の比較において、ＳＥＡに対する増殖反応をブロックしていた。　双方の細胞集 団を、ＩＣＲ−１，１で処理した時の阻害効果は、付加的であった。　接着性細 胞が前処理され、そして、混合した細胞を前処理してもその効果が強化されない 場合にのみ、抗ＩＣＡＭ−１抗体ＬＢ−２による増殖の阻害が生じる。　図１４ に示したように、ＩＣＲ−１，１によるＣＤ４５ＲＡ”　Ｔ細胞の前処理は、Ｓ ＥＡ応答に影響を与えなかった。 接着性細胞のＩＣＲ−１，１あるいはＬＢ２での前処理は、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞 の増殖の好適な阻害をもたらす。 Ｈ１同種照射した刺激細胞に対するリンパ球増殖の阻害ＩＣＡＭ−Ｒに対するモ ノクローナル抗体はまた、アロ抗原に曝された刺激細胞に応答したリンパ球増殖 （３Ｈ−チミジン取込みで測定した）を変える能力について試験された。　応答 細胞を、上述した旧５ｔｏｐａｑｕｅ遠心分離機を用いて、標準的なドナーから ＰＢＭＣを取得して調製した。　刺激細胞を調製するために、第二の無関係のド ナーからＰＢＭＣを同時に単離し、そして、γ放射セシウム源に曝すことにより １５００Ｒで照射した。　２０Ｍ個の応答細胞と２Ｘ１０’個の照射済の（培地 で懸濁した）刺激細胞を、可溶性あるいは固定化したＩＣＲ−１，１、ＩＣＲ− ２，１、ＩＣＲ−３，１゜ＩＣＲ−４，２、ＩｃＲ−５，１、ＩｃＲ−６，２、 ＩｃＲ−７，１、ＩＣＲ−８，１、ＩＣＲ−９，２、固定化したＢ−８９、固定 化したｐｌＯ，■、あるいは可溶性５１５Ｆ　（抗ラットＣＤ１８）抗体を含む ウェルに添加し、３７℃で、５％Ｃ０２にて、６日間インキュベートした。　リ ンパ球増殖（ｓｌ−チミジン取込みで測定した）を、培養の最後の１８〜２４時 間において測定した。 固定化したモノクローナル抗体１ｃＲ−１，１，２，１，６，２および８．１は 、対照抗体と比較して、−貫して増殖を阻害した。 ＩＣＲ−８，１は、可溶形態にて投与した場合に、同種抗原刺激した増殖も阻害 した。 実施例２１ 下記表１１は、先の実施例にて言及した、本願発明のＩＣＡＭ−Ｒ特異的モノク ローナル抗体の様々な特性をまとめたものである。 表１１において、ｒＮＣＪの略語は、「最終的に確認していないもの」を意味し 、ｒ　ＮＤＪの略語は、「未確定」を意味する。　表１１にて星印（ネ）にて印 を付けた抗体は、低濃度でも活性化を向上した抗体である。 Ｙ２Ｏ，Ｑ７５１．　Ｅ３２に、　Ｋ４２Ｂ。 表　１１（続き） ＩｃＡＭ−Ｈに特異的な抗体が、様々な刺激剤（例えば、ＳＥＡおよびアロ抗原 細胞）に対するリンパ球の応答を調節するという、上記の実施例からの、一つの 推論は、天然の対応レセプターあるいは本発明の抗体によるＩＣＡＭ−Ｒの結合 は、ＩＣＡＭ−Ｒを発現する細胞にシグナルを伝達しているということである。 　ＩＣＡＭ−Ｈに特異的なシグナルを出す現象には、ＩＣＡＭ−Ｈの細胞質領域 の一つ以上の第二メツセンジャー経路の細胞酵素成分（例えば、キナーゼ、ホス ファターゼ）および／あるいは細胞骨格の成分に対する、ＩＣＡＭ−Ｒに独特の 相互作用が関与する可能性がある。 予備実験は、この概念およびＩＣＡＭ−Ｒが第二メツセンジャー・システムとの 結合においてＩＣＡＭ−１と異なっているという考えと一致している。　以下の 様にして、刺激されていないＲａｊｉ細胞からの抽出物を調製し、分画し、そし てキナーゼ活性について分析した。　７ＸＩＯ’個の細胞をＰＢＳ中で１回洗浄 し、そして、２０ｍＭ　トリスｐＨ７，５，０，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％トリト ンＸ−１００（Ｐｉｅｒｃｅ社）　、１０ｕｇ／ｍｌペプスタチンおよびロイペ プチン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社）　、２ｍＭ　ＰＭＳＦを含む緩衝液中で、１ 時間氷上で溶解した。 溶解物を冷やしたマイクロファージ中で、１４．０００ｒｐｍで１５分間遠心分 離して沈澱させ、得られた上清を、２０ｍＭ　トリスｐ）１７．５．０、５ｍＭ 　ＥＤＴＡ　（緩衝液Ａ）で平衡化したＤＥＡＥセファセルカラム（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ社）にかけた。　カラムを０．２５ｍ１／分で流し、そして緩衝ＭＡ中 のＯから０．３５ＭのＮａＣｌの勾配で、６０分間かけて溶出した。これらの最 初の実験で、プロティンキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性が強化されている画分（アマ −ジャム分析キットを用いて製造元の指示に従って決定した）のみが調べられた 。　ＰＫＣ活性が強化された画分は、プールされ、そしてキナーゼ（単数あるい は複数）源として用いられ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、およびＩＣＡＭ−Ｒ の完全な細胞質領域の合成ペプチド（配列番号：ｌの４８１位から５１８位のア ミノ酸）の異なるリン酸化について試験した。 分析は、製造元の指示に従って、７５ｕＭの最終濃度のペプチドで行なった。　 １０ｕｌの反応混合液を３０ｕｌのＬａｅｍｍｌ　ｉ試料緩衝液中で煮沸し、１ ２．５％５Ｏ３−ＰＡＧＥゲル上で分離した。　ゲルをＸ線フィルム上で１．５ 時間曝したところ、ＩＣＡＭ−ＲおよびＩＣＡＭ−２のリン酸化は検出され、Ｉ ＣＡＭ−１は検出されなかった。　リン酸化がＰＫＣによるのか、あるいは共に 分画した他のキナーゼによるのかは決定されなかった。 さらに行う分析は、カラムクロマトグラフ工程、あるいはＣａ＋＋、Ｍｇ＋＋、 ｃＡＭＰ、ホスファチジルセリン、細胞質末端ペプチド、および［３２Ｐ］ＡＴ Ｐの存在下での可溶化細胞画分のいずれかから得られた反応画分に関連する。　 特異的なペプチドの燐酸化は、後続のゲル電気泳動による分析にて検定される。 　Ｊｕｒｋａｔ細胞を亜細胞性画分に分離し、そして、各画分を細胞質末端ペプ チドに関するキナーゼ活性について検定した。　これら実験にて、Ｉ　ＣＡＭ− １およびＩＣＡＭ−Ｒの燐酸化か検出されている。　しかしながら、細胞膜画分 に関連するＩ　ＣＡＭ−１を燐酸化するキナーゼ、一方で、ＩｃＡＭ−Ｒを燐酸 化するキナーゼは、膜内に存在するが、主要なサイトツルである。　これら二つ のＩＣＡＭに対して作用する異なるキナーゼは、これらキナーゼの精製に研究に よって支持されている。　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，５ｍＭ　ＥＤＴＡで平 衡化し、０．６Ｍ塩化ナトリウムで３０分にわたって勾配をかけたＭｏｎｏ　Ｑ カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に細分したＪｕｒｋａｔサイトツルは、ＩＣＡ Ｍ−Ｈに対して作用するキナーゼに関する非常に広範な軌跡を描いた。 これら画分のサブセットのみか、ＩＣＡＭ−１に対する活性を有していた。　こ のことは、ＩｃＡＭ−Ｒを特異的に燐酸化するが、ＩｃＡＭ−１への特異性を有 さない、細胞質のキナーゼが存在することの証拠を提供するものである。　これ ら燐酸化したペプチドの二元的燐アミノ酸分析から、ＩＣＡＭ−Ｒでのセリンの 燐酸化ならびにＩＣＡＭ−１でのスレオニンの燐酸化のみが判明した。 予備実験によって、ＩＣＡＭ−Ｈの細胞質領域が、細胞骨格成分と特異的に結合 することも示された。　競合しないモノクローナル抗体ＩＣＲ−１，１およびＩ ＣＲ−４，２のＩＣＡＭ−Ｈに対する結合が調べられ、それぞれの抗体の、リン パ球ＩＣＡＭ−Ｈの細胞骨格との結合に対する潜在的な影響か評価された。　抗 体は、ＩＣＡＭ−Ｒを細胞表面レセプターとして用いる異なる天然１ｃＡＭ−Ｒ リガンドを再現することかでき、それによって調節された細胞応答か引き出され る。 以前に他の研究者が、細胞表面膜貫通糖タンパク質として現われた多数のヒトＴ リンパ球表面抗原が、もしこれらの抗原に特異的な表面結合抗体が第二抗体と交 差する場合、細胞骨格と結合するために誘導され得ることを見い出した［Ｇｅｐ ｐｅｒｔら、Ｊ、Ｉｍ憇塵、、旦６　：３２９８　（１９９０）］。　多くのこ れらの細胞表面分子は、リンパ球接着および／あるいは活性化経路の成分である ことが明らかである。　細胞骨格との誘導性の結合の現象は、決められた条件の 下での界面活性剤抽出に対する細胞表面免疫複合体の耐性として機能上明らかに なる。　誘導性の界面活性剤耐性では代謝エネルギーは必要とされず、そして実 験の間中０℃〜４℃に維持された細胞中で観察される。 実験は、新しく調製されたＰＢＬあるいはヒトＴリンパ芽球細胞系ＣＢＭ−ＣＣ ＲＦ　（ＡＴＣＣＣＣＬｌ１９）を用いて行われた。　簡単にいえば、健康なボ ランティアのドナーから新しく取ったヒト血液を、ＰＢＳで１：ｌに希釈し、シ グマヒストパーク密度分離培地上に上層した。　勾配を１５０Ｏｒｐｍで３０分 間遠心分離しく６００Ｘｇ）、そして中間期の単核細胞画分を回収し、ＰＢＳで ３回洗浄した。 細胞の沈殿を完全なＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社、Ｌ−グルタミン、 ペニシリン／ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、２−メルカプトエタ ノール、およびｌＯ％ＦＢＳを含む）中に再懸濁し、そして付着性細胞の消耗の ために、組織培養処理ベトリ皿上に置いた。　プレートを、３７℃にて１〜２時 間、５％Ｃ０２中でインキュベートした。　その後、非付着性ＰＢＬを回収し、 水冷ＰＢＳで２回洗浄した。　フルオレセインイソチイオシアネート（ＦＩＴＣ ）を用いたモノクローナル抗体のフルオレセインへのえば、この手順は、精製し た抗体と過剰のＦＩＴＣ（シグマ社）とのＯ，ＩＭパイカーボネート緩衝液ｐ１ ４８．１中での、３７℃、９０分間のインキュベーション、およびその後の、未 反応のＦＩＴＣを除去するための、ＰＢＳを外液とする徹底的な透析を含むもの である。 ＰＢＬあるいは洗浄したＯＥＭ細胞懸濁液（ＩＸＩＯ’個の細胞）を、ファルコ ン１２Ｘ７５ｍｍチューブの水冷ＰＢＳ−５％ＦＢＳ中に分配し、沈澱させ、そ して５０μｌの同じ緩衝液中で、ＦＩＴＣ接合した抗１ｃＡＭ−Ｒモノクローナ ル抗体２６Ｅ３Ｄ−１あるいは２６１１０Ｂ−２中に再懸濁し、飽和濃度に調整 した。　抗体結合を氷上で３０分間行わせ、その後、原液の（希釈していない） ＦＢＳの下層クッション（０，７ｍ１）を通じて最初に１ｍｌのＰＢＳ−５％Ｆ ＢＳで再懸濁しておいた細胞を沈澱させることにより、未結合の抗体を除去した 。 ＦＩＴＣ接合モノクローナル抗体単独で染色したグループに対しては、１ｍｌの 懸濁液を三等分し、それぞれにＦＢＳを別々に下層し、遠心分離し、そして上清 を吸引により取り除いた。　細胞沈殿を次に２００ｕｌの対照緩衝液（１３ｍＭ 　トリスｐＨ８，０，１５０ｍＭＮａＣｌ、２　ｍＭ　ＭｇＣｈ、２　ｍＭ　Ｅ ＧＴＡ　、　２％ＦＢＳ、　２．５ｕｇ／ｍｌアプロチニン、１　ｍＭ　ＰＭＳ Ｆ　、　１０ｍＭヨードアセトアミド）あるいは界面活性剤緩衝液［対照緩衝液 中に０．５％ＮＰ−４０（ｖ／ｖ）（ＵＳ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ１社、Ｃ１ｅ ｖｅｌａｎｄ　、オハイオ州）コ中に再懸濁し、ＦＡＣ８ＡＣ８分析、室温で２ ０分間、あるいは４℃にて一装置いた。　第一の抗体染色工程の後に、細胞表面 に結合したモノクローナル抗体を第二の抗体と交差したグループについては、洗 浄した細胞沈殿物を、ＰＢＳ−５％ＦＣ３中で１：ｌＯＯ希釈した、５０ｕ１の ＦＩＴＣ−ヤギ抗マウスＩｇＧ　（Ｓｉｇｍａ社）中に再懸濁し、氷上で３０分 間インキュベートした。　次に、細胞を再懸濁し、上述のように二つのチューブ に分け、沈澱させ、そして界面活性剤の存在下あるいは非存在下で緩衝液で処理 した。　次に、ＦＡＣ３分析をこれらの細胞について行なった。 ＣＥＭ細胞について得られた結果（図１５を参照）は、ＰＢＬについて見られた 結果と同様であった。　界面活性剤耐性分析によって評価された細胞骨格とのＩ ＣＡＭ−Ｒ結合は、ＦＩＴＣ接合１ｃＲ−４，２あるいはＩＣＲ−１，１抗体を 単独で細胞表面ＩＣＡＭ−Ｒに結合させたとき、ごくわずかであった。　しかし ながら、細胞表面に結合したＩＣＲ−４，２抗体を第二の抗体と交差させたとき 、界面活性剤耐性のわずかな上昇が見られた。　第二の抗体を細胞表面に結合し た、ＩＣＲ−４，２によるものとは別のＩｃＡＭ−Ｒのエピトープを認識するＩ ｃＲ−１，１と交差するのに用いた場合、より大きな（ＰＢＬ中で約２倍、そし てＣ８Ｍ中で２〜３倍）界面活性剤耐性の増加が、繰り返しみられた。　このよ うに、ＩＣＡＭ−ＲリガンドのＩＣＡＭ−Ｈの異なる構造上の領域に対する相互 作用は、ＩＣＡＭ−Ｒの細胞骨格に対する結合に別々に影響するようである。 前述の具体的な実施例は、本発明の現在の好ましい態様に関し、それら実施例の 修正や変更も当業者であれば容易に思いつくものである。 明らかに、ＩＣＡＭ−Ｒをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよび ＲＮＡ）は、ＩＣＡＭ−Ｒおよび改変型ポリペプチドの発現を確保するのに有用 なだけでなく、正常な状態あるいは活性化された状態でＩＣＡＭ−Ｒを発現する 細胞（特に、免疫学的プロセスに関与する細胞）を同定するのに簡単に用いられ 得る。　ＩＣＡＭ−ＲＤＮＡを用いた、典型的な検出方法には、　（適当に標識 されて検出される）ＤＮＡあるいはＲＮＡが、試料中のＲＮＡにハイブリダイズ する、ノーザンブロットハイプリダイゼーション、ＲＮＡ５ｅ保護、およびイン サイチュハイブリダイゼーション細胞学的分析法か含まれる。　ＩＣＡＭ−Ｒを コードするＤＮＡ（特に、領域２および３をコードするＤＮＡよりも、ＩＣＡＭ −１およびＩＣＡＭ−２をコードするＤＮＡに対してより低い相同性しか持たな い、第一、第四および第五の領域をコードするＤＮＡ）は、ＩＣＡＭ−ＲＤＮＡ のための内因性の発現制御ＤＮＡ配列を特定するゲノムＤＮＡを含む、ＩＣＡＭ −ＲをコードするゲノムＤＮＡの単離に有用である。　前述したように、ＩＣＡ Ｍ−Ｒをコードするポリヌクレオチド配列および／あるいはＩｃＡＭ−Ｒの発現 を制御するポリヌクレオチド配列の知識により、ＩＣＡＭ−Ｒの発現の調節に役 立つ、様々なアンチセンスポリヌクレオチドが入手可能となる。 本発明によって、ＩＣＡＭ−Ｒポリペプチド、およびＩＣＡＭ−Ｒの五つの免疫 グロブリン様領域のうちの一つ以上を含む断片のような、可溶性断片であって、 グリコジル化型、非グリコジル化型、あるいは脱グリコジル化型のものを含む変 異体の作成ができるようになる。　本発明のタンパク質生成物を含む薬学的組成 物、例えば、ＩＣＡＭ−Ｒが関与する細胞間および細胞内リガンド／レセプター 結合反応の競合阻害剤あるいは刺激剤などは、免疫細胞の活性化／増殖の調節に 、治療上の可能性を有するものである。 このような治療上の可能性は、特に「イムノアトへシン」タイプの組換えハイブ リッド融合タンパク質に現われる。　このタンパク質は、アミン末端に一つ以上 のＩＣＡＭ−Ｈの領域を含み、カルボキシ末端に少なくとも一つの免疫グロブリ ンの不変領域を含む。　このようなハイブリッド融合タンパク質は、ホモダイマ ーの型で入手することかできるのが普通であり、１ｇ部分は、より長い血清半減 期を提供し、そしてＩＣＡＭ−Ｒ部分は、ＩＣＡＭ−Ｒ自身よりもＩ　ＣＡＭ− Ｒ被結合体に対して高い親和性を有している。 強化されたアビディティを有し得る他のＩｃＡＭ−Ｈの多量体の型もまた、治療 上の可能性を有しているものと考えられている。 抗体物質および結合タンパク質、特にモノクローナル抗体およびポリクローナル 抗体を含む単一特異的抗体は、本発明によって容易に入手できるようになる。　 このことは、ＩＣＡＭ−Ｒを天然に発現する細胞、本発明のポリペプチド産物を 産生ずる組換え宿主細胞、ＩＣＡＭ−Ｒポリペプチド生成物自体、および細胞間 の凝集を刺激するＩｃＡＭ−Ｒ特異的抗体に結合している本発明のポリペプチド 生成物（すなわち、ｒ高親和性」結合配剤形のポリペプチド生成物）を含む免疫 原の使用によってなされる。　このような抗体および他のＩＣＡＭ−Ｒ特異的結 合タンパク質は、ＩＣＡＭ−Ｒおよび変異体の免疫精製のために、ならびにＩＣ ＡＭ−Ｒおよびその可溶性断片のリガンド／レセプター結合のブロッキングおよ び／あるいは刺激を前提にした治療のための薬学的組成物に用いることかできる 。　薬学的組成物として用いるには、ＩＣＡＭ−Ｒ特異的抗体および抗イデイオ タイプ抗体物質は、当該分野で公知の組換え手法により、ヒト化（例えば、ＣＤ Ｒ−移植）される。 ＩＣＡＭ−Ｈの異なる領域に特異的な複数の抗体が、ＥＬＩＳＡシステムに用い られる。　このシステムでは、可溶性のＩＣＡＭ−Ｒポリペプチドの量が、血清 のような体液中で増加することにより特徴づけられる炎症のプロセスをモニター するための免疫学的「サンドイッチ」が含まれる。 ＩＣＡＭ−Ｒ関連産物によって処置され、あるいはモニターされる炎症の症状に は、以下の症状が含まれる：哺乳類の非特異的免疫系の応答に起因する症状（例 えば、成人呼吸障害症候群、敗血症から派生する多器官障害症候群、外傷から派 生する多器官障害症候群、組織の再還流障害、急性糸球体腎炎、反応性関節炎、 急性炎症成分での皮膚炎、発作、熱障害、血液透析、ロイコフェレシス、潰瘍性 大腸炎、クローン病、壊死全腸炎、顆粒球輸血関連症候群、およびサイトカイン 誘導性毒）および哺乳類の特異的免疫系の応答に起因する症状（例えば、乾癖、 器官／組織移植拒絶、およびレイノー病、自己免疫甲状腺炎、ＥＡＥ　。 多発性硬化症、リューマチ様関節炎、エリトマト−デスなどを含む自己免疫疾患 ）。　本発明のＩｃＡＭ−Ｒ生成物はまた、喘息、腫瘍増殖および／あるいは転 移、およびウィルス感染（例えば、ＨＩＶ感染）のモニターおよび処理に有用で ある。 従って、本発明の範囲は、添付の請求の範囲の記載によってのみ限定されるべき である。 配　列　表 （１）一般情報 （１）出願人：　ガラティン、タブリュ、ミッシエルヴエゼウクス、ローズメイ （ｉｉ）発明の名称：　ＩｃＡＭ−関連タンパク質（ｉｉｉ）配列の数：４５ （１ｖ）連絡先住所： （Ａ）名宛人：　マーシャル、オドウール、リュースティン、マレ−アンドボー ラン （Ｂ）番地＋　６３００シアーズ　タワー、　２３３サウス　ワラカー　ドライ ブ（Ｃ）都市名：　シカゴ （Ｄ）州名・　イリノイ （Ｅ）国名：　米国 （Ｆ）郵便番号＋　６０６（）６ （ｖ）コンピューター読取形式： （Ａ）媒体：　フロッピー　ディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣ互換機（Ｃ）操作システム：　ＰＣ−ＤＯＳ ／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア：　パテント　イン　リリースｇｉ、ｏ、バ ージョン１１．２５（ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号 （Ｂ）出願日・ （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先行出願データ。 （Ａ）出願番号＋　ＵＳ　０７／８２７，６８９（Ｂ）出願日：　２７−１月− １９９２（ｖｉｉ）先行出願データ： （Ａ）出願番号：　ＵＳ　０７／８８９．７２４（Ｂ）出願日：　２６−５月− １９９２（ｖｉｉ）先行出願データ。 （Ａ）出願番号：　ＵＳ　０７／８９４．０６１（Ｂ）出願日＋　０５−６月− １９９２（ｖｉｉ）先行出願データ： （Ａ）出願番号：　ＵＳ　０８１００９．２６６（Ｂ）出願日：２２−１月−１ ９９３ （ｖｉｉｉ）弁護士／弁理士情報。 （＾）氏名、ノーランド、グレタ　イー（Ｂ）登録番号：　３５．３０２ （Ｃ）参照／事件番号：　３１５７０ （ｉｘ）通信情報・ （Ａ）電話＋　（３１２）　４７４−６３００（Ｂ）ファックス：　（３１２） 　４７４−０４４８（Ｃ）テレックス・２５−３８５６ （２）配列番号：ｌの情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ：５４７アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トボロノー：直鎖状 （１１）配列の種類、タンパク質 （ｉｘ）配列の特徴。 （Ａ）特徴を表す記号：タンパク質 （Ｂ）存在位置：　３０．．５４７ （ｘｉ）配列：配列番号：１ Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｖａｔ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　 Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ−２５−２０〜１５ Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　 Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　ＰｈｅＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ａ ｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｓ ｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　５ｅｒＬｅｕ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｃｙ ｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙ ｓ　ｌｉｅ　ＡｌａＬｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ 　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　 Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　ｌｌｅ　Ｌｅｕ　ＣｙｓＳｅｒ　Ｖａｌ　Ｔ ｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　ｌｌｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｓ ｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　ｌｉｅ　ＴｈｒＶＪＩＩ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｐ ｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｐ ｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｒ■ Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　 Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙｌｏｏ　１０５　、 １１０　１１５ Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｖａｔ　 Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＧｌｕＬｅｕ　Ｓｅｒ　Ａ ｒｇ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇ ｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　ＴｈｒＶａｌ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｒ ｇ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙ ｓ　Ａｒｇ　ＴｈｒＧｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ 　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　５ｅｒ Ａｌａ　Ｐｒｏ＾ｒｇ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｌ ｅｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｔ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ＡｒｇＬｅｕ　Ｖａ、Ｉ　Ａ ｌａ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｔ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓ ｅｒ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｖａｔ　Ａｓ■ Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　 Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　ＬｅｕＡｌａ　Ｌｅｕ　Ｇ ｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　八ｌａ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｍ ｅｔ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　ＡｓｎＴｂｒ　Ｌｅｕ　Ｔｂｒ＾Ｉａ　Ｔｈｒ 　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ 　Ｇｌｕ　ＧｌｙＡｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｖａｔ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　 Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　ＧｌｕＡ ｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｐ ｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　ＡｓｎＬｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌ ｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｖａ ｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｔ　Ｓｅｒ　ＣｙｓＭｅｔ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｒｇ 　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｔｂｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｖａｔ　Ｐｒｏ 　Ａｌａ　ＡｌａＡｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　 Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　’Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓc Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　 Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｔ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　ＧｌｕＰｈｅ　Ｌｅｕ　１ ｌｉｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　 Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　ＰｒB Ｌｙｓ　ｌｉｅ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　 Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　ＬｙｓＴｈｒ　Ａｒｇ　ｔ （ｉｓ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　 Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌ■ Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　 Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｖａｔ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　１ｉｅＰｒｏ　Ｐｈｅ　Ｐ ｈｅ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　）Ｉｉｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　 Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｌ■ Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　 Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　ＧｌｕＡｌａ　Ｐｈｅ　Ｓ ｅｒ　Ｓｅｒ　Ｉｒ１ｓ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｖａｔ　 Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈ■ Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　 Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　ＧｌｕＨｉｓ　Ｇｌｎ　Ａ ｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ａｒ、ｇ　Ｇｌｕ　 Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅ■ Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　ＭｅＬ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　 Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　５ｅｒＡｒｇ　Ａｌａ　Ｇ ｌｕ （２）配列番号、２の情報 （夏）配列特徴 （Ａ）配列の長さ：　１７８１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数、−零値 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｘｌ）配列、配列番号：２ ＣＡＧＣＴＣＴＣＴＧ　ＴＣＡＧＡＡＴＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＡ　ＣＣＡＴ ＣＣＧＴＧＴ　ＴＧＴＧＧＣＣＣＡＧ　ＧＧＣＣＴＧＣＴＧf　６０ ＡＣＴＣＴＧＣＴＧＧ　ＴＣＴＧＣＴＧＴＣＴ　ＧＣＴＧＡＣＣＣＣＡ　ＧＧＴ ＧＴＣＣＡＧＧ　ＧＧＣＡＧＧＡＧＴＴ　ＣＣＴＴＴＴＧＣfＧ　１２０ ＧＴＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧＴ　ＧＣＴＣＴＣＴＧＣＴ　ＧＧＡＧ ＧＧＴＣＣＣＴＧＴＴＴＧＴＧＡＡ　ＣＴＧＣＡＧＴＡＣＴ@１８０ ＧＡＴＴＧＴＣＣＣＡ　ＧＣＴＣＴＧＡＧＡＡ　ＡＡＴＣＧＣＣＴＴＧ　ＧＡＧ ＡＣＧＴＣＣＣＴＡＴＣＡＡＡＧＧＡ　ＧＣＴＧＧＴＧＧＣb２４０ ＡＧＴＧＧＣＡＴＧＧ　ＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＣＴＴＣＡＡＴＣＴＣＡＧＣＡＡ ＣＧＴＧＡ　ＣＴＧＧＣＡＡＣＡＧ　ＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣR００ ＴＧＣＴＣＡＧＴＧＴ　ＡＣＴＧＣＡＡＴＧＧ　ＣＴＣＣＣＡＧＡＴＡ　ＡＣＡ ＧＧＣＴＣＣＴ　ＣＴＡＡＣＡＴＣＡＣＣＧＴＧＴＡＣＧＧf　３６０ ＣＴＣＣＣＧＧＡＧＣＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴ　ＧＧＣＡＣＣＣＣＴＧ　ＣＣＴＣ ＣＴＴＧＧＣＡＧＣＣＧＧＴＧＧＧ　ＣＣＡＧＡＡＣＴＴＣS２０ ＡＣＣＣＴＧＣＧＣＴ　ＧＣＣＡＡＧＴＧＧＡ　ＧＧＧＴＧＧＧＴＣＧ　ＣＣＣ ＣＧＧＡＣＣＡ　ＧＣＣＴＣＡＣＧＧＴ　ＧＧＴＧＣＴＧＣsＴ　４８０ ＣＧＣＴＧＧＧＡＧＧ　ＡＧＧＡＧＣＴＧＡＧ　ＣＣＧＧＣＡＧＣＣＣＧＣＡＧ ＴＧＧＡＧＧ　ＡＧＣＣＡＧＣＧＧＡ　ＧＧＴＣＡＣＴＧＣb５４０ ＾ＣＴＧＴＧＣＴＧＧ　ＣＣＡＧＣＡＧＡＧＡ　ＣＧＡＣＣＡＣＧＧＡ　ＧＣＣ ＣＣＴＴＴＣＴ　ＣＡＴＧＣＣＧＣＡＣＡＧ＾＾ＣＴＧＧＡb６００ ＾ＴＧＣＡＧＣＣＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＧＧ　ＡＣＴＧＴＴＣＧＴＧ　ＡＡＣＡ ＣＣＴＣＡＧ　ＣＣＣＣＣＣＧＣＣＡ　ＧＣＴＣＣＧＡＡＣb６６０ ＴＴＴＧＴＣＣＴＧＣＣＣＧＴＧＡＣＣＣＣＣＣＣＧＣＧＣＣＴＣＧＴＧＧＣＣ ＣＣＣＣＧＧＴＴＣＴＴＧＧＡ　ＧＧＴＧＧＡＡＡＣＧ　７Q０ ＴＣＧＴＧＧＣＣＧＧ　ＴＧＧＡＣＴＧＣＡＣＣＣＴＡＧＡＣＧＧＧ　ＣＴＴＴ ＴＴＣＣＡＧ　ＣＣＴＣＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＴＣＴＡＣV８０ ＣＴＧＧＣＧＣＴＧＧ　ＧＧＧＡＣＣＡＧＡＴ　ＧＣＴＧＡＡＴＧＣＧ　ＡＣＡ ＧＴＣＡＴＧＡ　ＡＣＣＡＣＧＧＧＧＡ　ＣＡＣＧＣＴＡＡbＧ　８４０ ＧＣＣＡＣＡＧＣＣＡ　ＣＡＧＣＣＡＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＧＧＡＴ　ＣＡＧＧ ＡＧＧＧＴＧ　ＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴ　ＣＧＴＣＴＧＣＡＡb９００ ＧＴＧＡＣＣＣＴＡＧ　ＧＧＧＧＣＧＡＧＡＧ　ＡＣＧＧＧＡＧＧＣＣＣＧＧＧ ＡＧＡＡＣＴ　ＴＧＡＣＧＧＴＣＴＴ　ＴＡＧＣＴＴＣＣＴ`　９６０ ｃｃＡｃｃｃＡＴＴｃ　ＴＧＡＡＣＣＴＣＡＧ、ＣＧＡＧＣＣＣＡＣＣＧＣＣＣ ＡＴＧＡＧＧ　ＧＧＴＣＣＡＣＡＧＴ　ＧＡＣＣＧＴＧＡＧs　１０２０ ＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧ　ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＴ　ＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧ　ＣＴＧ ＧＡＣＧＧＡＧ　ＴＴＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＧf　１０８０ ＣＡＧＡＣＡＧＣＴＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＴ　ＡＡＡＴＧＣＴＡＣＣＧＡＧＡＧ ＴＧＡＣＧ　ＡＣＧＧＡＣＧＣＡＧ　ＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣP１４０ ＡＧＴＧＣＣＡＣＴＣＴＣＧＡＧＧＴＧＧＡ　ＣＧＧＣＧＡＧＴＴＣＴＴＧＣＡ ＣＡＧＧＡ　ＡＣＡＧＴＡＧＣＧＴ　ＣＣＡＧＣＴＧＣＧＡ@１２００ ＧＴＣＣＴＧＴＡＴＧ　ＧＴＣＣＣＡＡＡＡＴ　ＴＧＡＣＣＧＡＧＣＣＡＣＡＴ ＧＣＣＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴＧＡＡ　ＡＴＧＧＡＡＡＧＡＴ@１２６０ ＡＡＡＡＣＧＡＧＡＣＡＣＧＴＣＣＴＧＣＡ　ＧＴＧＣＣＡＡＧＣＣＡＧＧＧＧ ＣＡＡＣＣＣＧＴＡＣＣＣＣＧＡ　ＧＣＴＧＣＧＧＴＧＴ　P３２０ ＴＴＧＡＡＧＧＡＡＧ　ＧＣＴＣＣＡＧＣＣＧ　ＧＧＡＧＧＴＧＣＣＧ　ＧＴＧ ＧＧＧＡＴＣＣＣＧＴＴＣＴＴＣＧＴ　ＣＡＡＣＧＴＡＡＣ`　１３８０ ＣＡＴＡＡＴＧＧＴＡ　ＣＴＴＡＴＣＡＧＴＧ　ＣＣＡＡＧＣＧＴＣＣＡＧＣＴ ＣＡＣＧＡＧ　ＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＧＴＧ@１４４０ ＧＴＧＡＴＧＧＡＣＡ　ＴＴＧＡＧＧＣＴＧＧ　ＧＡＧＣＴＣＣＣＡＣＴＴＴＧ ＴＣＣＣＣＧ　ＴＣＴＴＣＧＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＡＣＴＧ@１５００ ＡＣＣＣＴＧＧＧＣＧ　ＴＧＧＴＧＡＣＴＡＴ　ＣＧＴＡＣＴＧＧＣＣＴＴＡＡ ＴＧＴＡＣＧ　ＴＣＴＴＣＡＧＧＧＡ　ＧＣＡＣＣＡＡＣＧf　１５６０ ＡＧＣＧＧＣＡＧＴＴ　ＡＣＣＡＴＧＴＴＡＧ　ＧＧＡＧＧＡＧＡＧＣＡＣＣＴ ＡＴＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＣＧＴＣＴＡＴＧＣＡＧＣＣＧ　P６２０ ＡＣＡＧＡＡＧＣＡＡ　ＴＧＧＧＧＧＡＡＧＡ　ＡＣＣＧＴＣＣＡＧＡ　ＧＣＴ ＧＡＧＴＧＡＣＧＣＴＧＧＧＡＴＣＣＧＧＧＡＴＣＡＡＡＧ@１６８０ ＴＴＧＧＣＧＧＧＧＧ　ＣＴＴＧＧＣＴＧＴＧ　ＣＣＣＴＣＡＧＡＴＴ　ＣＣＧ ＣＡＣＣＡＡＴ　ＡＡＡＧＣＣＴＴＣＡ　ＡＡＣＴＣＣＣＡ`Ａ　１７４０ ＾ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡ　Ａ　１７８１（２）配列番号：３の情報 （ｉ）配列特徴。 （Ａ）配列の長さ　８アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：修飾部位 （Ｂ）存在位置：４ （Ｄ）他の情報、　この部位でのアミノ酸は、バリン、ロイシン、あるいはイソ ロイシンである。 （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：修飾部位 ＣＢ）存在位置二６ （Ｄ）他の情報・　この部位でのアミノ酸は、バリン、ロイシン、あるいはイソ ロイシンである。 （ｘｉ）配列、配列番号：３ Ｇｌｙ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｃｙｓ（２）配列 番号・４の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ：９アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類、ペプチド （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：修飾部位 （Ｂ）存在位置、９ （Ｄ）他の情報：　この部位でのアミノ酸は、バリンあるいはアラニンである。 （ｘ　ｉ）配列：配列番号、４ Ａｓｐ　Ｘａａ　Ｇｌｙ　Ｘａａ　Ｔｙｒ　Ｘａａ　Ｃｙｓ　Ｘａａ　Ｘａａ（ ２）配列番号、５の情報 （ｉ）配列特徴 （Ａ）配列の長さ二８アミノ酸 （Ｂ）配列の型、アミノ酸 （Ｄ）トポロン−・直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号、修飾部位 （Ｂ）存在位置、３ （Ｄ）他の情報　この部位でのアミノ酸は、アスパラギンあるいはセリンである 。 （１ｘ）配列の特徴。 （Ａ）特徴を表す記号：修飾部位 （Ｂ）存在位置、４ （Ｄ）他の情報、　この部位でのアミノ酸は、リジンあるいはフェニルアラニン である。 （１ｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：修飾部位 （Ｂ）存在位ＩＩ：６ （Ｄ）他の情報：　この部位でのアミノ酸は、リンノあるいはイソロイシンであ る。 （１ｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：修飾部位 （Ｂ）存在位置、７ ＣＤ）他の情報：　この部位でのアミノ酸は、アルギニンあるいはグルタミン酸 である。 （ｘｉ）配列、配列番号・５ Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｔｈｒ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｃｙｓ（２）配列 番号、６の情報 （１）配列時＠： （Ａ）配列の長さ、９アミノ酸 （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類、ペプチド （１ｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：修飾部位 （Ｂ）存在位置：１ （Ｄ）他の情報：　この部位でのアミノ酸は、アスパラギン酸あるいはグルタミ ン酸である。 （ｉｘ）配列の特徴・ （Ａ）特徴を表す記号：修飾部位 （Ｂ）存在位置：２ （Ｄ）他の情報、　この部位でのアミノ酸は、ヒスチジンあるいはアスＩくラギ ン酸である。 （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：修飾部位 （Ｂ）存在位置：３ （Ｄ）他の情報、　この部位でのアミノ酸は、ヒスチジンあるいはグリツジであ る。 （１ｘ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号、修飾部位 （Ｂ）存在位［：４ （Ｄ）他の情報・　この部位でのアミノ酸は、グリシジあるいはヒスチジンであ る。 （ｉｘ）配列の特徴。 （Ａ）特徴を表す記号：修飾部位 （Ｂ）存在位１１：５ （Ｄ）他の情報：　この部位でのアミノ酸は、アラニンあるいはアルギニンであ る。 （ｘｌ）配列：配列番号・６ Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ（ ２）配列番号・７の情報 （ｉ）配列特徴 （Ａ）配列の長さ：３１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー零値 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）配列、配列番号＝７ ＡＴＴＣＴＧＣＡＧＧ　ＣＡＡＲＡＡＹＣＴＳ　ＡＣＩＩＭＴＢＭＧＳＴ　Ｇ　 ３１（２）配列番号二８の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ：３１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー零値 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （目）配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）配列：配列番号、８ ＡＴＴＣＴＧＣＡＧＧ　ＣＡＡＲＡＧＹＴＴＹ　ＡＣＨＭＴＢＧＡＲＴ　Ｇ　３ １（２）配列番号：９の情報 （＋）配列特徴： （Ａ）配列の長さ＝３１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー零値 （Ｄ）トポロジー：直鎮状 （ｉｉ）配列の種類＋　ＤＮＡ （ｘｉ）配列：配列番号−９ ＡＴＴＣＴＧＣＡＧＧ　ＣＡＡＲＴＣＹＴＴＹ　ＡＣＨＭＴＢＧＡＲＴ　Ｇ　３ １（２）配列番号：１０の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ：３０塩基対 ＣＢ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー零値 （Ｄ）トポロジー、直鎮状 （１１）配列の種類：ＤＮＡ （ｘｌ）配列：配列番号：１０ ＡＴＴＴＣＴＡＧＡＲＡＡＲＴＴＲＧＣ３ＣＣＲＴＧＲＴＳＲＴＣ３０（２）配 列番号：１１の情報 （１）配列特徴： （Ａ）配列の長さ・３０塩基対 （Ｃ）鎖の数、−零値 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：　ＤＮＡ （Ｘｌ）配列：配列番号：１ｌ ＡＴＴＴＣＴＡＧＡＲＡＡＲＴＴＳＣＫＲＴ　ＧＳＣＣＲＴＳＫＴＣ３０（２） 配列番号：１２の情報 （ｉ）配列特徴； （Ａ）配列の長さ　２５塩基対 （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎖の数、−零値 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）配列：配列番号：１２ ＧＡＧＡＣＴＣＴＧＣＡＣＴＡＴＧＡＧＡＣＣＴＴＣＧ　２５（２）配列番号、 １３の情報 （１）配列特徴： （Ａ）配列の長さ・２６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数、−零値 （Ｄ）トボロンー：直鎖状 （目）配列の種類　ＤＮＡ （ｘｉ）配列、配列番号・１３ ＣＡＧＧＴＧＡＴＴＣＴＣＡＴＧＣＡＧＡＧ　ＴＣＣＡＧＧ　２６（２）配列番 号　１４の情報 （１）配列特徴 （Ａ）配列の長さ：２５塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー零値 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）配列、配列番号：１４ ＣＣＧＡＣＡＴＧＣＴ　ＧＧＴＡＡＧＴＧＴＧ　ＴＣＣＡＡ　２５（２）配列番 号：１５の情報 （ｉ）配列特徴 （Ａ）配列の長さ、１７塩基対 （Ｂ）配列の型、核酸 （Ｃ）鎖の数、−零値 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （ロ）配列の種類・　［ＩＮＡ （ｘｉ）配列：配列番号：１５ ＧＡＣＣＡＴＧＡＧＧ　ＴＧＣＣＡＡＧ　１７（２）配列番号：１６の情報 （ｉ）配列特徴； （Ａ）配列の長さ：１７塩基対 （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎖の数ニー零値 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｌ）配列・配列番号：１６ ＡＴＧＧＴＣＧＴＣＴ　ＣＴＧＣＴＧＧ　１７（２）配列番号：１７の情報 （１）配列特徴： （＾）配列の長さ＝１８塩基対 （Ｂ）配列の型、核酸 （Ｃ）鎖の数、−重鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （宜ｌ）配列の種類＝ＤＮＡ （ｘｉ）配列：配列番号・１７ ＴＴＣＡＣＣＣＴＧＣＧＣＴＧＣＣＡ＾（２）配列番号・１８の情報 （ｉ）配列特徴 （Ａ）配列の長さ：１８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数・−重鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （１１）配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｌ）配列：配列番号＝１８ ＡＡＡＧＧＧＧＣＴＣＣＧＴＧＧＴＣＧ（２）配列番号、１９の情報 （１）配列特徴 （Ａ）配列の長さ　１９塩基対 （Ｂ）配列の型、核酸 （Ｃ）鎖の数・−重鎖 （Ｄ）トポロン−直鎖状 （１１）配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）配列　配列番号・１９ ＣＣＧＧＴＴＣＴＴＧ　ＧＡＧＧＴＧＧＡＡ（２）配列番号、２０の情報 （ｉ）配列特徴・ （Ａ）配列の長さ＝２０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数、−重鎖 （Ｄ）トポロンー：直鎖状 ｌｓ　（ｉ　ｉ　）配列の種類：　ＤＮＡ（ｘｉ）配列・配列番号：２０ ＣＡＴＧＡＣＴＧＴＣＧＣＡＴＴＣＡＧＣ＾（２）配列番号：２１の情報 （１）配列特徴： （Ａ）配列の長さ：１８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 ｓ　ｓ　（ｉ　＋　）配列の種類・　ＤＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号：２１ ＧＣＡＡＧＡＡＣＣＴ　ＴＡＣＣＣＴＡＣ（２）配列番号：２２の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ：１９塩基対 （Ｂ）配列の型、核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （目）配列の種類　ＤＮＡ （ｘｉ）配列　配列番号　２２ ＧＡＡＡＴＴＧＧＣＴ　ＣＣＡＴＧＧＴＧＡ　１９（２）配列番号、２３の情報 （１）配列特徴。 （Ａ）配列の長さ　３１５塩基対 （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎖の数・−重鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （１１）配列の種類　ＤＮＡ　（ゲノミック）（ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：　１．．３１５ （ｘｉ）配列・配列番号　２３ ＣＣＧ　ＧＡＴ　ＣＧＧ　ＧＴＡ　ＧＡＧ　ＣＴＡ　ＧＴＧ　ＣＣＴ　ＣＴＧ　 ＣＣＴ　ＣＣＴ　ＴＧＧ　ＣＡＧ　ＣＣＴ　ＧＴＡ　ＧＧＴ@４８ Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｔ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　 Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｙｌ　５　１０　１５ ＧＡＧ　ＡＡＣＴＴＣＡＣＣＴＴＧ　ＡＧＣＴＧＣＡＧＧ　ＧＴＣＣＣＧ　ＧＧ Ｇ　ＧＣＡ　ＧＧＡ　ＣＣＣＣＧＡ　ＧＣＧ　９６Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｔ ｈｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｖａｔ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇ ｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　ＡｌａＡＧＣＣＴＣＡＣＡ　ＴＴＧ　ＡＣＣＴＴＧ　Ｃ ＴＧ　ＣＧＡ　ＧＧＣＧＧＡ　ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＡＴＴ　ＣＧＣＣＧＡ 　１４４Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　 Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　ｌｌｅ　Ａｒｇ　ＡｒｇＡＧＴ　Ｔ ＴＣＧＴＡ　ＧＧＣＧＡＧ　ＣＣＡ　ＣＣＣＣＧＡ　ＧＣＴ　ＣＧＧ　ＴＧＴ　 ＧＣＧ　ＡＴＧ　ＣＴＣＡＣＣＧＣＣ１９２Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　 Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　ＭｅＬ　 Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ＡｌａＡＣＧ　ＧＴＣＣＴＧ　ＧＣＧ　ＣＧＣＡＧＡ　ＧＡＧ 　ＧＡＴ　ＣＡＣ八ＧＧ　ＧＡＣＡＡＴ　ＴＴＣＴＣＡ　ＴＧＣＣＴＣ２４０Ｔ ｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ａ ｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　ＬｅｕＧＣＧ　ＧＡＧ　ＣＴ Ｔ　ＧＡＣＣＴＧ　ＣＧＧ　ＡＣＡ　ＣＡＣＧＧＣＴＴＧ　ＧＧＡ　ＣＴＧ　Ｔ ＴＴ　ＧＣＡ　ＡＡＣＡＧＣ２８８Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　 Ａｒｇ　Ｔｈｒ　ｆｌｉｓ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ＾ｌａ　 Ａｓｎ　５ｅｒＴＣＡ　ＧＣＣＣＣＣＡＧＡ　ＣＡＧ　ＣＴＣＣＧＣＡＣＧ　Ｔ ＴＴ　３１５Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｈ ｒ　Ｐｈｅｌｏｏ　１０５ （２）配列番号　２４の情報 （１）配列特徴： （Ａ）配列の長さ・　１０５アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｌ）配列：配列番号；２４ Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　 Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｙｌ　５　１０　１５ Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　 Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　ＡｌａＳｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔ ｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇ ｌｕ　Ｌｅｕ　ｌｌｅ　Ａｒｇ　ＡｒｇＳｅｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌ ｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｌｅ ｕ　Ｔｈｒ　ＡｌａＴｈｒ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ 　Ａｓｐ　ｌ１ｉｓ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｌｅ ■ Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　）Ｉｉｓ　Ｇｌｙ 　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｓｎ　５ｅ■ Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅｌ ｏｏ　１０５ （２）配列番号・２５の情報 （ｉ）配列特徴、 （＾）配列の長さ：　１２９５塩基対 （Ｂ）配列の型、核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎮 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （■）配列の種類・ｃＤＮＡ （ｘｌ）配列：配列番号：２５ ＮＧＡＡＴＴＣＣＧＧ　ＣＧＧＡＴＣＧＧＧＴ　ＡＧＡＧＣＴＡＧＴＧ　ＣＣＴ ＣＴＧＣＣＴＣＣＴＴＧＧＣＡＧＣＣＴＧＴＡＧＧＴＧＡＧ@６０ ＡＡＣＴＴＣＡＣＣＴ　ＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧ　ＧＧＴＣＣＣＧＧＧＧ　ＧＣＡ ＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＣＧＡＧＣＣＴ　ＣＡＣＡＴＴＧＡＣb１２０ ＴＴＧＣＴＧＣＧＡＧ　ＧＣＧＧＣＣＡＧＧＡ　ＧＣＴＧＡＴＴＣＧＣＣＧＡＡ ＧＴＴＴＣＧ　ＴＡＧＧＣＧＡＧＣＣＡＣＣＣＣＧＡＧＣＴ@１８０ ＣＧＧＧＧＴＧＣＧＡ　ＴＧＣＴＣＡＣＣＧＣＣＡＣＧＧＴＣＣＴＧ　ＧＣＧＣ ＧＣＡＧＡＧ　ＡＧＧＡＴＣＡＣＡＧ　ＧＧＣＣＡＡＴＴＴb２４０ ＴＣＡＴＧＣＣＴＣＧ　ＣＧＧＡＧＣＴＴＧＡ　ＣＣＴＧＣＧＧＣＣＡ　ＣＡＣ ＧＧＣＴＴＧＧ　ＧＡＣＴＧＴＴＴＧＣＡＡＡＣＡＧＣＴＣO　３００ ＧＣＣＣＣＣＡＧＡＣＡＧＣＴＣＣＧＣＡＣＧＴＴＴＧＣＣＡＴＧ　ＣＣＴＣＣ ＡＣＴＴＴ　ＣＣＣＣＧＡＧＣＣＴ　ＴＡＴＴＧＣＣＣＣＡ@３６０ ＣＧＡＴＴＣＴＴＡＧ　ＡＡＧＴＧＧＧＣＴＣＡＧＡＡＡＧＧＣＣＧ　ＧＴＧＡ ＣＴＴＧＣＡ　ＣＴＴＴＧＧＡＴＧＧ　ＡＣＴＧＴＴＴＣＣs　４２０ ＧＣＣＣＣＡＧＡＡＧ　ＣＣＧＧＧＧＴＴＴＡ　ＣＣＴＣＴＣＴＣＴＧ　ＧＧＡ ＧＡＴＣＡＧＡ　ＧＧＣＴＴＣＡＴＣＣＴＡＡＴＧＴＧＡＣb４８０ ＣＴＣＧＡＣＧＧＧＧ　ＡＧＡＧＣＣＴＴＧＴ　ＧＧＣＣＡＣＴＧＣＣＡＣＡＧ ＣＴＡＣＡＧ　ＣＡＡＧＴＧＡＡＧＡ　ＡＣＡＧＧＡＡＧＧb５４０ ＡＣＣＡＡＡＣＡＧＣＴＧＡＴＧＴＧＣＡＴ　ＣＧＴにＡＣＣＣＴＣＧＧＧＧＧ ＣＧＡＡＡ　ＧＣＡＧＧＧＡＧＡＣＣＣＡＧＧＡＡＡＡＣ６O０ ＣＴＧＡＣＴＧＴＣＴ　ＡＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＣＣＴＣＴＴ　ＣＴＧＡ ＣＴＴＴＡＡ　ＧＴＧＡＧＣＣＡＧＡ　ＡＧＣＣＣＣＣＧＡf　６６０ ＧＧＡＡＡＧＡＴＧＧ　ＴＧＡＣＣＧＴＡＡＧ　ＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡ　ＧＧＧ ＧＣＣＣＧＡＧ　ＣＣＣＴＴＧＴＣＡＣＣＴＴＧＧＡＧＧＧ`　７２０ ＡＴＴＣＣＡＡＧＧＡ　ＣＣＣＴＣＴＴＡＣＣＧＧＣＣＣＣＡＴＣＴ　ＴＴＡＡ ＣＣＴＴＡＴ　ＣＧＴＡＴＣＣＣＣＴ　ＣＴＧＣＣＴＣＡＴf　７８０ ＣＣＣＧＣＡＧＡＣＧ　ＣＡＣＣＴＣＧＧＣＴ　ＧＧＡＴＧＡＣＴＴＧ　ＧＡＣ ＴＧＴＣＣＣＡ　ＧＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＴＧＧＣＣＡＧＡf　８４０ ＧＧＴＣＣＡＧＡＧＣＡＧＡＣＣＣＴＣＣＡ　ＣＴＧＣＧＡＧＧＣＣＣＧＴＧＧ ＡＡＡＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＴＣＣＧＴＧＣＡＣＴＧＴ　９O０ ＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧ　ＡＣＧＧＴＧＧＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＧＣＧ　ＣＴＧＧ ＧＣＣＴＧＴ　ＴＧＧＧＴＣＣＡＧＴ　ＧＡＣＣＣＧＴＧＣb９６０ ＣＴＣＧＣＧＧＧＣＡ　ＣＴＴＡＣＣＧＡＴＧ　ＴＡＣＡＧＣＡＡＴＣＡＡＴＧ ＧＧＣＡＡＧ　ＧＣＣＡＧＧＣＧＧＴ　ＣＡＡＧＧＡＴＧＴf　１０２０ ＡＣＣＣＴＧＡＣＴＧ　ＴＧＧＡＡＴＡＴＧＣＣＣＣＡＧＣＧＣＴＧ　ＧＡＣＡ ＧＴＧＴＡＧ　ＧＣＴＧＣＣＣＡＧＡ　ＡＣＧＴＡＴＴＡＣs　１０８０ ＴＧＧＣＴＧＧＡＧＧ　ＧＧＡＣＡＧＡＧＧＣＡＴＣＧＣＴＴＡＧＣＴＧＴＧＴ ＧＧＣＡＣＡＣＧＧＧＧＴＣＣＣＡＣＣＡＣＣＴＡＧＣ１１S０ ＧＴＧＡＧＣＴＧＴＧ　ＴＧＣＧＣＴＣＴＧＧ　ＡＡＡＧＧＡＧＧＡＡ　ＧＴＣ ＡＴＧＧＡＡＧ　ＧＧＣＣＣＣＴＧＣＧ　ＴＴＴＴＧＧＣＣfＧ　１２００ ＧＡＧＣＡＣＧＣＴＧ　ＧＣＡＣＴＴＡＣＣＧ　ＡＴＧＣＧＡＡＧＣＣＡＴＣＡ ＡＣＧＣＣＡ　ＧＧＧＧＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＡＡ＾ＡＡＴ@１２６０ ＧＴＧＧＣＴＧＴＣＡ　ＣＧＧＴＧＧＡＡＴＡ　ＴＧＧＴＣＣＣＣＧＧ　ＡＡＴ ＴＣ１２９５（２）配列番号：２６の情報 （１）配列特徴： （Ａ）配列の長さ：　４９００塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （１１）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｘｉ）配列、配列番号、２６ ＣＣＧＡＡＣＧＣＴＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＴ　ＧＧＴＣＴＮＣＴＣＴ　ＧＧＮＣ ＣＴＧＧＧＧ　ＡＴＣＣＴＡＧＧＣＡ　ＴＣＴＣＡＧＧＴＡ`　６０ ＧＡＡＧＡＧＣＣＣＧ　ＣＣＣＧＴＧＧＡＧＣＮＡＧＧＴＧＧＡＴＡ　ＡＧＧＣ ＧＧＧＧＧＣＧＧＡＡＴＴＧＡＡＧ　ＧＡＣＣＡＧＡＧＡＧ@１２０ ＧＧＣＧＧＣＣＣＧＧ　ＧＴＧＴＣＣＣＣＣＴ　ＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧ　ＣＣＣ ＴＣＴＴＣＴＡ　ＧＣＴＴＣＣＣＡＣＧ　ＣＴＴＣＴＧＴＣ`Ｃ１８０ ＣＡＣＣＴＧＧＡＧＮ　ＴＣＧＧＧＧＣＴＴＣＴＣＣＣＣＧＴＣＣＴ　ＴＣＣＴ ＣＣＡＣＣＣＣＡＡＣＡＣＡＣＣＴ　ＣＡＡＴＣＴＴＴＣ＾@２４０ ＧＡＮＣＴＧＡＡＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＴＴ　ＴＣＴＧＧＡＮＴＮＧ　ＧＧＧＮ ＮＴＴＧＣＡ　ＣＣＴＡＡＣＣＴＧＴ　ＣＴＣＡＧＧＡＧＡm　３００ ＡＣＴＧＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＴＧ　ＴＮＡＴＧ ＣＣＣＴＡ　ＴＧＧＴＴＣＡＣＡＧ　ＡＣＴＧＧＣＡＴＣＡ@３６０ ＴＣＣＣＴＡＴＴＣＡ　ＴＧＡＴＣＣＴＣＡＡ　ＡＧＡＣＮＣＣＡＴＣＴＣＣＴ ＣＡＡＣＴＧ　ＴＣＡＴＡＡＣＴＣＡ　ＧＡＧＣＴＣＴＡＴs　４２０ ＣＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴ　ＧＧＡＡＡＣＣＧＧＣＴＴＴＣＴ ＡＧＧＧＣＴＴＴＴＣＴＣＣＧＣＧＧＴＴＣＴＴＴＣＣ４８O ＣＧＧＡＧＴＴＣＡＧ　ＣＧＴＴＧＴＧＧＣＴ　ＴＴＴＴＧＴＣＣＡＡ　ＧＴＴ ＡＣＴＣＡＡＧ　ＴＴＴＧＧＧＧＡＣＡ　ＡＴＣＴＣＣＴＴsＡ　５４０ ＡＧＣＣＴＴＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＡＴ　ＴＴＣＣＡＣＴＴＴＧ　ＣＴＴＴ ＴＧＣＣＣＣＡＡＧＣＣＴＣＴＧＴ　ＧＴＣＴＣＴＣＣＣＣU００ ＣＡＴＴＴＣＣＴＧＡ　ＣＧＡＴＣＴＧＴＣＡ　ＧＡＧＴＣＴＴＡＡＧ　ＡＧＴ ＧＡＴＴＴＧＧ　ＴＴＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＣＴＣＣＡＡb６６０ 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ＣＣＣＡＡＧＡＴＴＧ　ＮＡＴＡＧＣＡＡＣＣＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＴＧＴＣ ＴＣＴＣＴ　４９００（２）配列番号・２７の情報 （１）配列特徴。 （Ａ）配列の長さ・４５３３塩基対 （Ｂ）配列の型、核酸 （Ｃ）鎖の数、−重鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （１１）配列の種類＋ＤＮＡ（ゲノミック）（ｘｌ）配列、配列番号　２７ ＾ＡＧＣＴＴＧＣＡＴ　ＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴ　ＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡ　ＧＧＡ ＴＣＣＴＡＧＧ　ＣＡＴＣＴＣＡＧＧＴ　ＡＡＡＧＡＡＧＡmＣ６０ ＣＣＧＣＣＧＮＣＧＧ　ＡＧＣＣＡＧＧＴＧＧ　ＡＴＡＡＧＧＣＧＧＧ　ＧＧＣ ＧＧＡＡＴＴＧ　ＡＡＧＧＡＣＣＡＧＡ　ＧＡＧＧＧＣＧＧbＣ１２０ ＣＧＧＧＴＧＴＣＣＣＣＴＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＴＣＴＴＣＴＡＧＣＴＴ ＣＣＣＡ　ＣＧＣＴＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＧＡ　１W０ ＧＣＴＣＣＧＧＧＣＴ　ＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＡ ＣＡＣＡＣＣＴＣＧＡＴＣＴＴＴ　ＣＡＧＡＮＮＧＧＡＡ　Q４Ｏ ＮＣＣＡＧＣＡＣＣＴ　ＴＴＴＣＴＧＡＡＮＴ　ＮＧＧＧＧＴＮＴＴＧ　ＣＡＣ ＣＣＡＡＣＣＴ　ＧＧＣＴＣＡＧＧＡＧ　ＡＮＡＣＴＧＴＧfＣ３００ ＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＴＧＴＣＧＴＧＴＣＣＴＡＴＧＧＴ ＴＣＡＣＡＧＡＣＴＡＧＣＡＴ　ＣＡＴＣＣＣＴＡＴＴ　３U０ ＴＡＴＧＡＴＣＣＴＣＡＡＡＧＡＣＣＣＴＡ　ＴＣＴＣＣＴＣＡＡＣＴＧＴＣＡ ＴＡＡＣＴ　ＣＡＧＡＧＧＣＣＣＴ　ＧＴＴＴＣＣＣＣＴＣS２０ ＣＡＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＧＮＣＡＡＣＣＧＧＣＴＴＴＣＴＡＧ　ＧＧＣＴＴ ＴＣＣＴＣＡＮＧＧＴＴＣＣＴＴ　ＣＣＮＧＧ＾＾ＴＣＴ　S８０ ＡＡＣＣＴＴＧＴＧＧ　ＣＴＴＴＣＴＧＴＣＣＡＡＧＴＴＡＣＴＣ＾＾ＧＴＴＴ ＧＧＧＧＡ　ＣＡＡＴＣＴＣＣＴＴ　ＴＡＡＧＣＣＴＴＴＧ@５４０ ＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＴＣＡＴＴＴＣＴＡＣＴＴＴＧＣＴＴＴＣＧ　ＣＣＣＣＣ ＡＧＣＣＴ　ＮＧＧＴＧＴＣＴＣＴ　ＣＣＣＣＣＣＣＡＴＴ@６００ ＴＣＣＴＧＡＣＧＡＣＣＴＧＴＣＡＧＧＧＴ　ＣＴＴＡＡＧＡＧＴＧ　ＡＣＴＴ ＧＧＴＴＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＴＴＧＧＡＡＴ　U６０ ＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＡＣＴＡＴＴＧＡ　ＴＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＧＡＧＡ ＣＣＣＣＡ　ＴＣＮＣＴＧＣＮＣＣＧＡＧＣＴＴＣＣＣＣ７Q０ ＾ＴＣＴＣＴＮＣＣＡ　ＴＡＧＮＣＡＧＣＡＡ　ＧＧＣＴＴＣＣＡＧＡ　ＧＡＣ ＧＣＣＣＣＴＣＴＡＡＧＡＧＴＧＣＧ　ＴＣＡＧＴＣＣＣＧO　７８０ ＡＴＣＴＴＧＡＧＴＧ　ＧＧＡＴＧＣＧＧＧＡ　ＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴ　ＡＴＴ ＴＣＴＴＧＧＣＧＧＴＧＧＴＣＴＴＴ　ＣＣＴＣＧＴＣＣＴs　８４０ ＡＣＡＧＡＣＡＣＣＣＣＴＧＧＴＴＴＧＧＧ　ＡＧＡＴＧＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡ ＡＧＡＴＴ　ＴＣＡＧＡＧＡＴＧＧ　ＧＧＴＣＣＣＴＡＧＧ@９００ ＣＴＧＡＧＣＣＣＧＣＧＴＴＴＴＣＣＴＧＧ　ＧＣＡＧＣＧＧＴＣＧ　ＣＧＣＴ ＡＧＡＡＣＣＴＴＴＣＴＧＧＧＣＧ　ＧＡＣＣＴＴＣＡＲＣX６０ ＣＡＣＣＧＣＧＴＧＫ　ＣＧＣＴＣＧＴＧＧＡ　ＧＣＲＣＧＧＧＧＧＣＴＣＹＣ ＴＧＴＧＫＣＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧ　ＣＡＣＴＡＡＣＴＧＴ@１０２０ ＣＣＮＣＧＮＣＣＧＧ　ＡＧＣＲＣＧＧＴＧＫ　ＣＣＴＧＧＡＧＡＣＣＴＣＮＣ ＴＡＣＲＣＣＧＡＡＡＣＧＧＧＡＮ　ＣＣＡＧＡＧＧＧＧＴ@１０８０ ＣＴＮＣＫＣＴＧＮＣＴＧＮＣＴＣＧＮＣＡ　ＧＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＴＣＣＧ ＡＧＡＮＣＣＴＧＡＧＡＮＣＣＡ　ＮＣＮＧＧＴＣＴＧＣ１P４０ ＴＴＣＴＴＣＣＧＣＴ　ＧＣＧＣＧＣＧＣＣＫ　ＣＡＣＡＣＴＣＣＡＡ　ＧＣＧ ＣＧＴＧＧＡＣＴＣＡＴＣＣＧＡＡＣＴＴＴＣＣＧＴＧＡＧ@１２００ ＴＡＣＡＧＴＧＴＧＲＡＣＡＣＮＣＣＣＣＴ　ＴＧＧＮＴＧＣＣＣＴ　ＧＧＡＣ ＣＴＣＣＣＣＣＴＡＡＡＧＣＴＣＣＧＣＣＣＡＣＣＣＧＴ　P２６０ ＴＣＴＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＴＴＣＣＴＡＧ　ＧＣＴＴＧＴＮＣＴＧ　ＡＧＡＮ ＣＡＣＴＡＣＡＧＣＴＣＧＣＴＡＡ　ＡＧＣＣＣＡＧＧＴＴ@１３２０ ＴＴＧＧＴＣＣＣＴＴ　ＧＣＡＧＡＮＣＧＡＣＣＧＧＡＴＣＧＧＧＴ　ＡＧＡＮ ＣＴＧＧＴＮ　ＣＣＧＣＴＣＣＣＴＴ　ＣＴＴＧＧＣＡＧＣb１３８０ ＡＧＴＧＧＧＣＧＡＧ　ＡＡＣＴＴＣＡＣＣＴ　ＴＧＡＮＣＴＧＣＡＧ　ＧＫＹ ＣＣＮＧＧＫＡ　ＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＣＧＡＧＣＣs　１４４０ ＣＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧＧＧ　ＧＣＧＧＣＣＡＧＧＡ　ＧＣＴＧ ＡＴＴＣＧＣＣＧＣＡＧＴＴＴＣＧ　ＴＡＧＧＣＧＡＧＣＣP５００ ＡＣＣＣＣＧＡＧＣＧ　ＣＧＧＧＧＴＧＣＧＡ　ＴＧＣＴＣＡＣＣＧＣＣＡＧＧ ＧＴＣＣＴＧ　ＧＣＡＣＧＣＡＧＧＧ　ＡＧＧＡＣＣＡＣＡf　１５６０ ＧＧＴＣＡＡＴＴＴＣＴＣＡＴＧＣＮＴＣＧ　ＣＣＧＡＮＣＮＴＧＡ　ＧＣＴＮ ＮＮＮＮＮＮ　ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ　ＮＮＮＮＮＮＮＮＮm　１６２Ｏ ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ　ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ　ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ　ＮＮＮ ＮＮＮＮＮＮＮ　ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ　ＮＮＮＮＮＮＮＮmＮ　＋６８Ｏ ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ　ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ　ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ　ＮＮＮ ＡＣＡＣＴＧＴ　ＡＧＣＴＧＴＣＴＴＣＡＧＡＣＡＣＡＣＣ`　１７４０ ＧＡＡＧＡＧＧＧＣＧ　ＴＣＡＧＡＴＣＴＣＡ　ＴＮＡＣＡＧＡＴＧＧ　ＮＴＧ ＴＧＡＮＣＣＡ　ＣＣＡＴＧＴＧＧＮＴ　ＣＣＴＧＧＧＡＴsＴ　１８００ ＧＮＡＣＴＴＣＧＧＡ　ＣＣＴＮＣＧＳＡＡＧ　ＡＧＣＡＧＴＣＧＧＧ　ＴＧＣ ＴＣＴＴＡＣＣＣＡＣＴＴＧＡＧＣＣＡＴＣＴＣＴＣＣＡＧ@１８６Ｏ ＮＣＣＣＡＡＧＴＧＣＴＴＴＣＴＴＣＴＧＹ　ＧＧＴＣＴＴＹＴＴＣＴＴＴＡＴ ＧＣＡＴＴ　ＴＡＴＴＴＡＴＴＧＡ　ＧＡＧＡＡＡＡＡＧＡ@１９２０ ＧＡＧＴＧＴＧＴＧＴ　ＡＴＡＴＧＣＧＴＴＴ　ＡＴＧＣＡＣＡＴＧＣＣＡＣＡ ＧＴＧＣＡＴ　ＧＴＧＴＧＧＡＡＧＴ　ＴＡＡＡＧＧＡＴＡ`　１９８０ ＧＴＡＧＧＡＧＴＴＴ　ＡＧＴＴＣＴＣＴＣＴ　ＴＴＣＣＡＴＣＡＴＧ　ＴＡＧ ＧＴＣＣＴＧＧ　ＧＧＡＴＣＧＡＧＴＣＡＡＧＴＣＡＧＧＣs　２０４０ ＴＡＡＣＡＡＣＡＡＧ　ＣＡＣＣＴＡＡＡＣＴ　丁ＧＴにＧＴＧＣＣＡ　ＴＣＴ ＣＧＣＣＣＧＣＣＣＴＴＣＴＧＴＡＴ　ＴＴＴＴＡＧＧＡＴf　２１００ ＡＡＡＣＣＡＡＡＣＡ　ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＡ　ＡＴＴＧＧＣＴＴＧＴ　ＣＡＡ ＣＡＣＴＧＡＡ　ＴＧＣＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＡＡＣＴＣＡ`　２１６０ ＡＴＣＣＴＧＴＴＣＴ　ＴＴＧＴＣＣＧＣＣＣＣＡＧＣＣＡＴＧＣＣＴＣＣＡＣ ＡＴＴＮＣＣＣＣＧＡＧＴＣＴＴ　ＡＴＴＧＣＴＣＣＣＣ２Q２０ ＧＡＧＴＣＴＴＡＧＡ　ＡにＴＧＧＡＣＴＣＡ　ＧＡＡＡＧＮＣＣＧＧ　ＴＧＡ ＩＩＫＴＳＣＡＣＧＷＴＧにＡＴＧＧＡ　ＣＴＧＴＴＴＣＣsＧ　２２８０ ＣＣＣＣＡＧＡＡＧＣＣＧＧＧＧＴＴＴＡＣＣＴＣＴＣＴＣＴＧＧ　ＧＡＧＡＴ ＣＡＧＡＧ　ＧＣＴＣＣＡＡＴＣＣＴＡＡＴＧＴＧＡＣＣ２R４０ ＣＴＣＧＡＴＧＧＧＧ　ＡＣＡＧＮＣＫＫＧＣＴＧＮＣＣＡＣＴＧＣＮへＣＡＧ ＣＴＡＣＡ　ＣＣ八へＮＣＧＣＡＧ　ＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧ@２４００ ＣＡＣＣＡＣＮＣＡＮ　ＣＴＧＡＴＧＴＧＣＧ　ＴＣＧＴＧＡＣＣＣＴ　ＣＧＧ ＧＧＧＣＧ八Ａ　ＡＧＣへＧＧＧＡＧＡ　ＣＣＣＡＧＧＡＡ`Ａ　２４６０ ＣＣＴＧＮＣＴＧＴＴ　ＴＡＣＡＧＴＡＡＧＧ　ＧＧＡＡＴＣＣＡＧＧ　ＧＧＧ ＣＣＴＴＣＡＴ　ＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧＡＡＣＣＡＧ`　２５２０ ＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡ　ＧＧＣＧＧＡＧＣＣＡ　ＡＴＡＡＡＧＴＧＧＧ　ＮＧＧ ＧＧＣＧＴＣＴ　ＡＣＡＣＣＡＧ＾＾Ａ　ＡＡＧＣＡＧＧＧbＡ　２５８０ ＧＧＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＧＡＧ　ＣＡＧＧＴＡＧＡＡＧ　ＣＴＧＧ ＡＡＡＴＧＡ　ＡＴＡＡＡＴＡＧＡＡ　ＧＧＧＧＴＴＧＡＧs　２６４０ ＴＡＣＣＴＧＡＧＴＧ　ＧＧＧＡＧＴＧＡＡＣＣＣＣＡＣＣＣＡＡＴ　ＴＣＴＣ ＣＧＣＣＣＴ　ＣＡＧＧＣＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＣＣＴＣＴ@２７００ ＴＣＴＧＡＣＴＴＴＴ　ＧＡＧＴＧＡＧＣＣＡ　ＧＡＡＧＣＣＮＣＣＣＧＡＧＧ ＧＡＡＡＡＡ　ＡＴＧＧＴＧＡＣＣＡ　ＴＡＡＮＣＴＮＣＴf　２７６０ ＧＮＣＡＧＧＧＧＣＴ　ＣＧＡＮＣＣＣＴＴＧ　ＴＣＡＣＣＣＴＧＧＡ　ＧＧＧ ＡＡＴＴＣＣＡ　ＧＣＴＧＣＧＧＴＣＣＣＧＧＧＧＣＡＧＣb２８２０ ＣＮＣＴＧＡＧＣＴＣＣＡＧＮＴＡＡＡＴＧ　ＴＴＡＣＡＡＡＧＡＮ　ＣＧＡＴ ＧＡＣＡＡＮ　ＣＧＧＧＧＣＴＴＣＴ　ＴＣＴＮＣＧＡＣＮb２８８０ ＣＧＣＣＣＴＣＧＡＴ　ＧＴＧＧＴＲＣＧＧＧ　ＧＡＡＡＣＴＣＴＡＡ　ＧＡＡ ＡＡＡＡＣＣＡ　ＧＡＧＣＴＣＴＧＡＧ　ＣＴＴＣＧＴＧＴbＣ２９４０ ＴＧＴＧＴＧＡＧＴＧ　ＧＡＴＧＣＴＣＡＣＣＣＴＡＮＣＴＣＴＧＴ　ＧＡＣＣ ＴＣＣＡＡＡ　ＧＣＣＣＣＴＡＴＴＡ　ＣＣＴＧＣＴＣＣＡs　３０００ ＣＹＴＴＡＡＣＣＴＴ　ＡＴＣＴＡＴＣＴＣＣＴＣＴＧＣＣＴＣＧＴ　ＧＣＣＣ ＧＣＡＧＡＴ　ＧＣＡＣＣＴＣＮＣＣＴＧＧＡＴＧＡＣＴＴ@３０６０ ＧＧＡＴＴＧＴＣＣＣＡＧＡＡＮＣＴＧＧＡ　ＣＧＴＧＮＣＣＡＧＡ　ＧＧＧＴ ＣＣＡＧＡＧ　ＣＡＧＡＣＣＣＴＣＹ　ＷＣＴＧＳＧＮＧＮl　３１２Ｏ ＮＭＧＭＧＲＡＡＡＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＴ　ＣＧＧＴＧＣＡＣＴＧ　ＴＧＣＡ ＡＧＧＣＣＴ　ＧＡＧＧＮＣＧＧＧＮ　ＣＧＧＴＧＣＴＡＧb３１８０ ＲＳＴＧＧＳＣＧＣＴ　ＡＴＴＧＧＧＴＣＣＡ　ＧＴＧＡＣＣＣＧＴＧ　ＣＣＣ ＴＣＧＣＡＧＧ　ＣＡＣＴＴＡＣＣＧＡ　ＴＧＣＡＣＡＧＣ`Ｇ　３２４０ ＴＣＡＡＴＧＧＧＣＡ　ＡＧＧＣＣＡＧＧＣＧ　Ｇ丁ＣＡＡＡＧＡＴＧ　ＴＧＡ ＣＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＡＴＧＴ　ＧＡＧＴＣＧＧＧＡf　３３００ ＡＧＧＣＡＴＧＣＡＴ　ＧＣＣＣ＾＾ＧＴＴＣＡＣＣＧＡＧＴＴＡＧ　ＧＧＧＡ ＧＡＣＧＧＧ　ＣＣＴＡＴＡＣＧＧＡ　ＣＡＧＧＡＡＡＧＡ`　３３６０ ＧＣＴＧＧＡＴＴＣＴ　ＮＣＡＧＧＧＡＴＴＧ　ＧＧＡＡＡＡＣＡＣＴ　ＧＡＡ ＧＧＧＡＡＧＴ　ＧＴＡＧＧＴＧＧＧＡ　ＣＴＧＴＧＧＧＡbＴ　３４２０ ＧＧＧＴＡＣＡＧＴＣＴＧＮＣＡＡＡＡＡＣＡ（ＪＣＡＧＴＣＡＡ　ＧＡＧＡＧ ＴＧＴＡＣＣＧＧＧＧＡＧＴＧＣＴＴＴＧＴＧＧＧＧＷ　３S８０ ＴＣＡＧＴＣＡＧＣＡ　ＧＣＡＴＣＣＴＧＡＧ　ＡＣＣＴＣＡＧＧＡＡ　ＡＧＧ ＧＮＣＣＴＧＡ　ＴＣＡＣＣＴＧＡＡＧ　ＴＧＡＴＧＮＣＣ`Ｇ　３５４０ ＡＡＣＣＣＡＴＧＴＧ　ＡＡＧＧＴＧＧＧＡＧ　ＧＡＧＡＧＡＡＣＧＣＣＴＡＣ ＣＴＴＴＴＣＡＴＧＣＴＴＴＣＣＣＡＣＡＣＡＣＡＴＡＴ　R６００ ＣＧＴＡＣＡＧＡＧＴ　ＡＡＡＴＡＧＡＡＡＡ　ＧＴＡＡＡＡＴＧＧＴ　ＡＣＡ ＴＧＣＣＡＧＡ　ＧＴＧＡＧＡＡＧＣＴ　ＧＴＣＴＣＣＣＧ`Ａ　３６６０ ＧＧＣＡＴＡＧＡＡＣＡＧＴＧＧＴＡＡＴＮ　ＣＡＣＧＣＣＴＴＴＡ　ＡＴＣＣ ＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＴＡＧＳＣＡ　ＡＡＧＧＣＡＧＧＣＡ@３７２０ ＣＡＴＣＴＣＴＧＡＧ　ＴＴＴＧＡＧＧＣＣＡ　ＧＣＣＴＧＧＴＣＴＡ　ＣＡＧ ＡＧＣＡＡＧＴ　ＴＣＣＡＧＮＣＣＡＧ　ＣＣＴＧＮＴＣＴ`Ｃ３７８０ ＡＴＡＧＧＧＡＡＴＴ　ＣＣＴＧＴＣＴＣＡＡ　ＡＡＴＡＡＡＣＡＮＡ　ＣＡＮ ＮＡＡＮＣＣＡ　ＡＡＡＣＣＷＷＡＧＴ　Ｃ３ＡＴＹＣＮＡfＡ　３８４０ ＷＧＣＣＣＣＡＧＣＧ　ＣＴＧＧＡＣＡＧＴＧ　ＴＡＧＮＣＴＧＣＣＣＡＧＡＡ ＣＡＴＡＴＴ　ＡＣＴＴＧＮＣＴＧＧ　ＡＧＧＧＡＡＣＧＧ`　３９００ ＧＧＣＡＴＣＧＣＴＴ　ＡＮＣＴＧＴＧＴＧＧ　ＣＡＣＡＣＧＧＧＧＴ　ＣＣＣ 八ＣへＡＣＣＴ　ＡＧＣＧＴＧＡＧＴＴ　ＧＴＧＴＧＣＧＣsＣ３９６０ ＴＧＧＡＡＡＧＧＡＧ　ＧＡＡＧＴＣＡＴＧＧ　ＡＡＧＧＧＣＣＴＣＴ　ＧＣＧ ＣＧＴＧＧＣＣＣＧＧＧＡＧＣＡＣＧ　ＣＣＧＧＣＡＣＴＴ`　４０２０ ＣＣＧＡＴＧＣＧＡＡ　ＧＣＣＡＴＣＡＡＣＧ　ＣＣＡＧＡＧＧＡＴＣＡＧＣに ＮＣＣＡＡＡ　ＡＡＴＧＴＧＮＣＣＧ　ＴＣＡＣＧＧＴＧＧ`　４０８０ ＡＴＧＴＧＡＧＴＡＧ　ＧにＧＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡＧＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＣ ＣＣＧＣＡ　丁ＣＣＴＣＴＧＴＣＣＴＣＴＡＴＧＴＣＣＡ　S１４０ ＡＡＣＴＣＴＴＡＴＴ　ＴＮＣＣＴＧＮＴＴＣＣＫＡＧＡＴＧＧＫＳ　ＭＭＡＧ ＴＴＴＴＧＡ　ＧＧＡＧＴＴＧＧＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＡ@４２００ ＡＣＴＧＧＡＣＧＴＧ　ＧＧＴＡＧＡＧＧＧＡ　ＴＣＴＧＧＡＡＡＧＣＴＧＴＴ ＴＴＣＣＴＧ　ＴＧＡＡＧＴＴＧＡＴ　ＧＧＧＡＡＧＣＣＡf　４２６０ ＡＡＣＣＡＣＧＴＧＴ　ＧＧＡＧＴＧＣＧＴＡ　ＧＧＣＴＣＧＧＡＧＧ　ＧＴＧ ＣＡＡＧＣＧＡ　ＡＧＧＧＡＴＡＧＴＧ　ＴＴＧＣＣＣＴＴfＧ　４３２０ ＴＧＴＣＣＴＣＡＡＡ　ＣＴＣＴＧＧＴＣＣＴ　ＡＧ、ＡＡＡＣＴＣＴＡ　ＴＧ ＡＣＣＣＣＴＧＧ　ＴＡＡＣＣＴＧＴＣＡ　ＣＣＧＧＧＣＡsＴＴ　４３８０ ＡＣＣＴＣＴＧＣＡＡ　ＣＧＣＣＡＣＣＡＡＣＣＧＧＣＡＣＧＧＣＴ　ＣＣＡＣ ＡＧＴＣＡＡ　ＡＡＣＡＧＴＣＧＴＣＧＴＧＡＧＣＧＣＧＧ@４４４０ ＡＧＴＧＴＧＡＧＣＡ　ＧＧＧＧＣＣＣＡＧＧ　ＴＧＧＧＣＧＧＡＡＡ　ＧＴＡ ＣＣＧＧＧＴＧ　ＴＣＣＣＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣb４５００ ＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴ　ＴＣＧＣＣＣＴＡＴＡ　ＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡ　ＧＧＣ ４５３３（２）配列番号：２８の情報 （ｉ）配列特徴・ （＾）配列の長さ＝５アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類、ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号：２８ Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ（２）配列番号　２９の情報 （１）配列特徴： （Ａ）配列の長さ、５アミノ酸 （Ｂ）配列の型、アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （目）配列の種類　ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号：２９ Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ（２）配列番号　３０の情報 （ｉ）配列特徴。 （Ａ）配列の長さ：２８塩基対 （Ｂ）配列の型、核酸 （Ｃ）鎖の数　−重鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ （旧）配列：配列番号：３０ ＡＣＣＧＡＡＴＴＣＧ　ＴＴＴＣＴＧＧＧＣＧ　ＡＣＣＴＴＣＡＧ（２）配列番 号＝３１の情報 （１）配列特徴： （Ａ）配列の長さ　２７塩基対 （Ｂ）配列の型、核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１蔦）配列の種類・　ＤＮＡ （ｘｉ）配列：配列番号：３１ ＴＧＧＡＡＴＴＣＧＣＴＣＡＣＧＧＡ＾＾Ｇ　ＴＴＣＧＧＡＴ（２）配列番号： ３２の情報 （１）配列特徴。 （Ａ）配列の長さ：２８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）配列二配列番号＝３２ ＧＣＧＡＡＴＴＣＧＧ　ＧＴＡＧＡＧＣＴＡＧ　ＴＧＣＣＴＣＴＧ（２）配列番 号、３３の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ：２７塩基対 （、Ｂ　）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数、−重鎖 （Ｄ）トポロジー；直鎖状 ２ｇ　（ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）配列：配列番号・３３ ＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡ　ＡＡＣＧＴＧＣＧＧＡ　ＧＣＴＧＴＣＴ（２）配列番号 ：３４の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ＝２１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 ２−ｔ　（＋　ｉ　）配列の種類、ＤＮＡ（ｘｉ）配列：配列番号＝３４ ＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡ　ＡＴＣＡＣＣＣＴＣＧ　Ａ　２１（２）配列番号　３５ の情報 （ｉ）配列特徴 （Ａ）配列の長さ　１７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数　−重鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （１１）配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）配列・配列番号：３５ ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ　１７（２）配列番号：３６の情報 （１）配列特徴 （Ａ）配列の長さ、３３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数　−重鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （目）配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）配列　配列番号、３６ ＣＡＧＧＴＣＣＣＧＧ　ＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴ　ＣＡＴＣＡＴＣＡＴＴ　ＡＡＴ 　３３（２）配列番号　３７の情報 （１）配列特徴 （Ａ）配列の長さ＝４０塩基対 （Ｂ）配列の型、核酸 （Ｃ）鎖の数　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）配列：配列番号：３７ ＴＡＧＡＴＴＡＡＴＧ　ＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡ　ＴＧＡＴＧＡＣＣＧＧ　ＧＡＣ ＣＴＧＡＧＣＴ　４０（２）配列番号：３８の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ：ｌＯアミノ酸 ＣＢ）配列の型・アミノ酸 （Ｄ）トポロジー；直鎖状 （１１）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列、配列番号：３８ Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　 Ｖａｌｌ　５　１０ （２）配列番号＝３９の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ　１０アミノ酸 （Ｂ）配列の型、アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列、配列番号、３９ Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　 Ａｓｎ（２）配列番号＝４０の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ：３３塩基対 （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎮の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎮状 （１１）配列の種類：ＤＮＡ （ｘｉ）配列、配列番号：４０ ＡＧＡＧＧＧＧＡＧＧ　ＧＧＴＧＣＴＡＧＣＴ　ＣＣＡＣＣＣＧＴＴＣＴＧＧ（ ２）配列番号・４１の情報 （ｉ）配列特徴： （Ａ）配列の長さ：２７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数・−重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類・　ＤＮＡ （ｘｌ）配列：配列番号＝４１ ＧＡＧＣＧＴＧＴＧＧ　ＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＣＣＴＧＣＣＴ（２）配列番号： ４２の情報 （１）配列特徴： （Ａ）配列の長さ：２７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数、−重鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （１１）配列の種類：　ＤＮＡ （ｚｉ）配列：配列番号・４２ ＧＧＧＧＧＡＧＴＣＧ　ＣＴＡＧＣＡＧＧＡＣＡＡＡＧＧＴＣ（２）配列番号　 ４３の情報 （ｉ）配列特徴。 （＾）配列の長さ：３６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 ３３　（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ （ｘｌ）配列：配列番号＝４３ ＣＧＡＡＣＣＴＴＴＧ　ＴＣＣＴＧＣＴＡＧＣＧＡＣＣＣＣＣＣＣＧ　ＣＧＣＣ ＴＣ（２）配列番号：４４の情報 （ｉ）配列特徴： （＾）配列の長さ：３９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数・−重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 ２１　（ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｌ）配列、配列番号：４４ ＴＧＡＧＡＣＣＴＣＴ　ＧＧＣＴＴＣＣＴＴＡ＾ＧＡＴＣＡＣＧＴＴ　ＧＧＧＣ ＧＣＣＣＧ（２）配列番号：４５の情報 （１）配列特徴： （Ａ）配列の長さ＝３０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 ２７　（ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｌ）配列：配列番号＝４５ ＧＡＣＣＣＡＴＴＧＴ　ＧＡＡＣＴＴＡＡＧＣＧＡＧＣＣＣＡＣＣＧａ）　ロｔ 　ｃｏ　ｒ＋１　ロフ ー　〇 ０）　ｒｖ”）　ｆｚ　ＣｓＪ　１．０ｕ−）ｑコ　μコ　ｌ’−、、ｒ’−、 ０３区 区 区 図２Ａ 図２Ｂ 図３Ａ 図３Ｂ 細胞系 １）無刺激 口　抗ＣＤ１１ａ　（ＴＳ１／２２．１）口ＰＭＡ刺激 負の対照　ａ工ＣＡＭ−Ｒａ　ＩＣＡＭ４　ａ工ＣＡＭ−２蛍光強度□ 図７Ａ −一一　ハク 一曹ＩＦ製豐 図９Ｂ αＣＤ３　濃度（ｎｇ／ｍｌ） 慕里主迄■装 仔／　（、ＯＴ　Ｘ）碓犀↓ｇ （％９↓杯悶ゴ幻医　術 ３時間　５時間　７時間　７２時間 インキュベージ璽ン時間 ＣＤＪ÷ＣＤ４５Ｒ○十 塁里化込誂匁１ ＣＤ４．ＣＤ４５ＲＡ。 培養細胞 Ｚ　ＩｃＦ？−１，１ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／３９５　 ＡＢＡ ＡＥＤ　Ｄ　９２８４−４Ｃ ＣＯ７Ｋ　１４／７０５　ＺＮＡ　８３１８−４Ｈ１６／２８　８３１８−４Ｈ Ｃ１２Ｎ　１５１０９ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ９２８２−４８ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　７０５５ −２Ｊ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０８ Ｃ１２Ｒ１：９１） （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：９１） （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：１９） （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。 ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、ＣＡ、ＪＰ Ｉ[Detailed description of the invention] rlcAM-related protein” This application is filed under pending U.S. Patent Application No. 07/827 filed January 27, 1992. ．． No. 689, a pending U.S. patent application filed May 26, 1992, which is a continuation-in-part application Patent application cylinder 07/889. No. 724, a partial continuation application filed on June 5, 1992. Pending U.S. Patent Application No. 07/894. 1, which is a partial continuation application of No. 061. International Application No. PCT/US93100787 filed on January 26, 1993 and and pending U.S. Patent Application No. 081009. This is a continuation in part of No. 266. Technical field of invention The present invention relates generally to cell adhesion molecules, and specifically to the intercellular adhesion molecule ICAM. A new protein called ICAM-RJ that is structurally related to -1 and -2. The present invention relates to cloning and expression of DNA encoding the top polypeptide. Background of the invention Over the past 10 years, research has focused on phenomena related to interactions between cells in the body, especially , phenomena related to cell behavior and activation in the immune system have been elucidated. One Generally, Springer, Nature. 346:425-434 (1990). Cell surface protein , and in particular so-called cell adhesion molecules (“CAMs”), correspondingly, Intervening in the process of leukocyte extravasation and movement of leukocytes to different target tissues The aim was to become the subject of pharmaceutical research and development. cell adhesion molecule isolation and characterization, cloning and expression of DNA encoding such molecules; as well as therapeutic agents and diagnostics for inflammatory processes, viral infections and cancer metastasis. Drug development is also the subject of many US and foreign patent applications. Ed wards, Current 0pinion 1nTherapeutic Patents, 1(11):1617-1630 (1991) and its Please refer to the publications cited in ``Reference Patent Documents''. Important points in the technical background of the present invention are the specific mediators of cell adhesion, namely: B Heterodimers present on IJ lymphocytes 1928 cells, monocytes, and granulocytes “Integrins” form a subfamily of cell surface proteins [leucoin Tegrin”, LFA-1% MAC-1 Oyohi gp150. 95 (WHO<7) Nomenclature, CD18/CD1la, CD1B/CD1lb, and CD 18/CD11c) - prompt identification and characterization of . See, for example, Table 1 on page 429 of the Springer reference cited above.　 Furthermore, it also improves leukocyte activation, adhesion, and motility, which are phenomena observed in inflammatory processes. Other influencing single-stranded adhesion molecules (CAMs) are also important. For example, it is currently known that structural Activation of integrins expressed in the LFA-1) and ICAM- expressed on the surface of vascular endothelial cells and other leukocytes. There are two distinct intercellular adhesion molecules (ICAM-1 and ICAM-2), designated ICAM-1 and ICAM-2. a tight ligand/receptor interaction occurs with one or both of s) It is believed that. Other CAMs characterized to date (e.g., November 15, 1990) Vascular adhesion molecule (VCAM) disclosed in PCT WO90/13300 published in -1); and Newman et al., 5science, 247: 1219- 1222 (1990) and PCT WO9 issued on July 25, 1991. 1/10683 G: Disclosed platelet endothelial cell adhesion molecule (PECAM-1) ), as well as ICAM-1 and ICAM-2, other immunoglobulin genetically engineered from a succession of families and regions whose respective extracellular parts have similar carboxy terminal groups. They are structurally homologous in that they are A “typical” immunoglobulin-like region is , usually fixed by a disulfide bond between two cysteines at each end Contains a loop structure that is ICAM-1 is a combination of five immunoglobulins ICAM-2, which differs from ICAM-1 in terms of cell distribution, contains a similar region; PECAM-1 contains six areas; VCAM contains six or seven, depending on the variety of junctions, etc. moreover , CAMs are typically thought to be involved in the orientation of molecules on the cell surface. Contains a hydrophobic "transmembranous" region and a carboxy-terminal "cytoplasmic" region. C. Graphical models of the functional arrangement of AMs generally extend to the cytoplasm of the cell. An elongated cytoplasmic "tail" and one extending outward from the cell surface. Molecules fixed in the transmembrane region are recognized by the above immunoglobulin-like loops. I can't stand it. Applications premised on ICAM-1's ability to bind to human rhinoviruses Various therapeutic uses of intercellular adhesion molecules have been planned, including: For example, 1 European Patent Application Box 468257 A, issued on January 29, 1992, is filed by Riggan. receptor/receptor binding activity, especially for viral, lymphocyte-associated antigens and plasmid-associated antigens. Like Plasmodium falciparum. It was proposed that this would improve the binding activity when binding to the carp pathogen (full-length and Improvements in various conformations and forms of ICAM-1 (including truncated molecular forms) Says. Similarly, various uses of proteins immunologically related to intercellular adhesion molecules has been devised. For example, Wo 91 issued on November 14, 1991 /16928 contains a humanized chimeric anti-IcAM-1 antibody and a specific and its use in the treatment of non-specific inflammation, viral infections, and asthma. Says. Anti-ICAM-1 antibodies and fragments thereof can be used to treat bacterial placement shock. WO92104034 issued on March 19, 1992 states that It has been stated. By anti-ICAM-1 anti-idiotypic antibody and antibody fragment Inhibition of ICAM-1-dependent inflammatory responses was reported in Wo, published April 16, 1992. 92106119. I. Intercellular adhesion proteins such as CAM-1 and lymphoid proteins such as LFA-1 Cell adhesion phenomena obtained by identification and characterization of sphere-interacting integrins Despite these basic insights, the complete picture is far from clear. In general, inflammation The processes and in vivo behavior of labeled lymphocytes are affected by many (other) It is thought that proteins are involved. Very recently, for example, S. Pringer and his collaborators have developed a third counterreceiver for LFA-1. Predicting the existence of Pter [de Fougerolles et al., J., Exp., M. ed, 174:253-267 (1991)], then r ICAM We have successfully immunoprecipitated the “third J” ICAM ligand called -3J. reported [de Fougerolles et al., J. Exp. Med. 175:185-190 (1992) Ko. This molecule is a soluble LFA- 1 and is highly expressed by resting lymphocytes, monocytes, and neutrophils. However, unlike ICAM-1 and ICAM-2, this new ligand has not been shown to be expressed by endothelial cells. N-Grianer The molecular weight was reduced to about 87. 000, immunoprecipitated The total product was approximately 124. 000 and is highly glycosylated. It is clear. Even more recently, another research group has also developed rICAM-3J and The cDNA sequence of a counter receptor for LFA-1 called [Fawc See eLt et al., Nature, 360:481-484 (1992). Toko. More recently, the amino acid sequence of ICAM-3 has changed from that of ICAM-R. and the immunological reaction of antibodies specific to each protein. The identity of the differentiation antigens CDw50 and ICAM-3 based on their sexual patterns, respectively. Two documents written by C de Fougerolles et al., J. Exp, Med, 177: 1187-1192 (1993) and Ju an et al, Eur, J, Immunol, 23: 150 8-1512 (1993)) by Springer and his co-editors. It has been published. Therefore, the art is currently seeking to identify additional factors involved in human cell-cell interactions. Specifically identifying and characterizing proteins, particularly their amino acid sequences We would like to have information that will help you. Additionally, such molecules may be used as therapeutics and diagnostics. The DNA encoding them has been elucidated to the extent that it can form the basis for the development of drug withdrawal drugs. It is essential that the Such fundamental information is especially important for protein aids in mass production, facilitates the identification of cells that naturally produce the protein, and substances or other novel binding proteins that specifically bind to them and/or are other novel binding proteins that suppress the involved ligand/receptor binding reactions. allows for the preparation of Summary of the invention In one embodiment 1, the present invention provides a novel human polypeptide rICAM-RJ and one or more ligand/receptor binding biological activities specific for ICAM-H. variants thereof (including fragments and analogues) with sexual and/or immunological properties; A purified and isolated polynucleotide (e.g., a DNA sequence and its RNA transcript). ICAM-R specific ligand/receptor binding Biological activity involves both the ICAM-R extracellular and cytoplasmic domains. with other molecules (e.g. cell-cell adhesion and/or signal transduction) interaction (in the process of implementation). Preferred DNA sequence of the present invention includes genomic and cDNA sequences as well as fully or partially chemically synthesized Contains the DNA sequence that was created. Biological replica of the DNA sequence of the present invention That is, isolated DNA prepared in vivo or in vitro Copying arrays) is also intended. Furthermore, plasmid containing ICAM-R autonomously replicating recombinant constructs, such as vectors and viral vectors, especially I DNA encoding cAM-R or IcAM-R mutant is endogenous or Also provided are vectors operably linked to exogenous expression control DNA sequences. According to another aspect of the invention, in particular unicellular hosts such as prokaryotes and eukaryotes The principal cells are stabilized with the DNA sequences of the present invention so that they can express the desired polypeptides. is transformed. Production of such ICAM-R and IcAM-R mutants Host cells expressing the products serve a variety of useful purposes. The expressed product is the host Cells have ICAM-R and ICAM-R mutations to the extent that they appear on the surface of cells. They may constitute useful immunogens for the induction of antibody substances that specifically immunoreact with the body. The host cells of the present invention are grown in an appropriate culture medium to obtain the desired polypeptide. ICAM-R and It is very useful as a method for mass production of ICAM-R variants. The novel ICAM-R and ICAM-R variant products of the invention are derived from natural cellular sources. but preferably by recombinant manipulation involving the host cells of the present invention. produced by. Products may be produced through recombinant production and/or isolation/reproduction operations. fully or partially glycosylated depending on the host cell selected for deglycosylated, partially or fully deglycosylated, or glycosylated. Obtained in unpackaged form. The product of the present invention comprises amino acids from -29 to 518 of SEQ ID NO: 1 herein. Includes monomeric and multimeric polypeptides having a sequence of residues. Detailed explanation below As shown, this sequence precedes the "mature" protein sequence from -29 to -1 Contains a putative signal or leader sequence of residues spanning the sequence, followed by In turn, five putative immunoglobulin-like regions (residues ~l to 90, ~91, respectively) to 187, ~188 to 285, ~286 to 387, and ~388 to about 456), a hydrophobic “limbic” region extending from residues about 457 to about 481, and There is a "cytoplasmic" region that makes up the rest of the polypeptide at the carboxy terminus. Ami Based on amino acid composition, glycosylation or other post-translational modifications or lack of maturation The calculated molecular weight of the protein is approximately 52,417. ICAM- of the present invention The R variant includes all or part of the above-mentioned specific region, and, for example, The ability of ICAM-H to bind to its binding target and/or the natural binding of ICAM-R have biological or immunological properties of ICAM-R, including the ability to inhibit binding to a target; Water-soluble and insoluble ICAM-R fragments containing one or more of the regions described above including monomeric, multimeric, or cyclic ICAM-R fragments. ICAM of the present invention -R variants further include deletions or substitutions of one or more amino acids as described below. (1) without loss, preferably , one or more biological activities or immunological properties of ICAM-H are enhanced. or (2) specific ligand/receptor binding function is specifically disabled. ing. Additional amino acids (e.g. lysine or cysteine) that promote multimer formation ) residues are contemplated. Furthermore, the present invention provides antibodies against ICAM-R or ICAM-R mutants. quality (e.g. monoclonal and polyclonal antibodies, antibody fragments, wood fibers) antibodies, chimeric antibodies, CDR-grafted antibodies, etc.) and other binding proteins (e.g. different (i.e., ICAM-1 and IC, in which ICAM-R is structurally related) polypeptides and peptides) that are non-reactive with AM-2 intercellular adhesion molecules. It is intended. The antibody substance can be isolated natural or recombinant ICAM- R or ICAM-R mutants, or cells expressing such products on their surface. It is prepared using Antibodies particularly exemplified in the present invention are those with postal code 2 America, located at 12301 Rockville, Park Loran, Maryland 0852. In the Lycan Type Culture Collection (ATCC), June 2, 1992. accession numbers) IB11053, HB11054, HB11055, and H U.S. Patent Application No. 07/894, each filed as Bl1056. 26E3D-1, 26118F-2, 261108-2, 2 disclosed in 061 Hybridoma cell line designated 6H11C-2, ATCC, December 1992 U.S. patent application no. 081009,266, a hybridoma cell line designated 43H7C, Further, to the ATCC on January 15, 1993, accession number HB11235 and 42C5H and 42D9 disclosed in the same application filed as HB11236. A hybridoma cell line designated as B was entrusted to ATCC on January 7, 1993. No.) U.S. Patent Application N, filed as IB11232 and HB11231 o, 081009. 46D7B and 461128 disclosed in 266 hybridoma cell line: and was entrusted to ATCC on July 15, 1993. Number HB11405, HB11409, HB11408, HB11407, H In the present application, deposited as B11406 and HB11404, respectively. 63ElID, 63G4D, 63H4C, 63H6H, 6311C and and 63[6G], a monoclonal protein produced by a hybridoma cell line designated antibody. The diverse properties of the binding proteins of the invention have been revealed by these antibodies. The results are summarized in Table 11 of Example 21 of the present application. Such properties include CD18-dependence of ICAM-H on cells and cell surface molecules. ability to modulate sexual or CD18-independent binding, as well as SBA and/or CD18-independent binding. or the ability to modulate leukocyte activity by alloantigens. Combined tag of the present invention The protein has a binding site structure (e.g., an epitope of the ICAM-R amino acid sequence). and/or susceptibility of binding properties to modification). . Binding proteins can also be used in compositions for immunization as well as polypeptides of the invention. and to identify cells on whose surface this polypeptide appears. It is for use. These proteins also interact with ICAM-R-involved ligands/recipients. I involved in receptor-binding biological activities, particularly specific and non-specific immune system responses Modulate CAM-R effector function (i.e., block, inhibit, or stimulation). Anti-ID specific to anti-ICAM-R antibody substance type antibodies and such anti-idiotype antibody substances in the regulation of immune responses. It is also intended for use. ICAM on cell surfaces and in liquids such as serum Analysis for the detection and quantification of -R involves the use of single Single antibody substances or multi-antibody substances are included. Science of information provided by the disclosure of the DNA and amino acid sequences of the present invention The value is obvious. A series of examples include the knowledge of the cDNA sequence of ICAM-R. DNA/DNA fragmentation of the genomic DNA sequence encoding ICAM-R Isolation by hybridization and promoter, operator, etc. It becomes possible to identify the CAM-R expression control regulatory sequence. Using the DNA sequence of the present invention By DNA/DNA hybridization under stringent conditions, IcAM -Isolation of DNA encoding allelic variants of H, one or more specific for IcAM-R other structurally related proteins with which they share biological and/or immunological properties. Protein isolation and non-human species similar to ICAM-H (e.g. rodents) ) protein isolation is expected. The DNA of the present invention can be used to synthesize ICAM-R. useful for DNA/RNA hybridization analysis to detect the ability of cells to It is for use. Furthermore, according to the present invention, IcAM-H by cells that normally express ICAM-R Antisense polynucleotides related to the regulation of expression of Ru. Another series of examples include the DNA and amino acid sequences of ICAM-H. With knowledge, hybrid fusion proteins (sometimes referred to as This allows for the preparation of ICAM-R variants such as "adherents"). This mutation The body contains the ICAM-R protein sequence and the immunoglobulin L constant region and/or or characterized by the presence of a hinge region. Capon et al., Nature, 337:525-531 (1989); Ashkenazi et al., P, N. A, S, (USA), 88:10535-10539 (1991); and PCT WO89102922, published April 6, 1989. ICAM-R variant fusion proteins may also include, for example, selected ICAM-H contains the extracellular region of and parts of other intercellular adhesion molecules. With the DNA and amino acid sequence information provided by the present invention, ICAM- Systematic analysis of the structure and function of H and ICAM-R at extracellular and intracellular levels. This allows the definition of interacting molecules. Anti-ICAM-R mono of the present invention The idiotype of a clonal antibody is an example of such a molecule, which has a natural binding target. Proteins (peptides and polypeptides) can be reproduced. This natural binding tan ICAM-R intercellular and intracellular activities are regulated through protein, or The ICAM-R molecule regulates inter- and intracellular events through the protein.　 Alternatively, this protein may represent a new class of modulators of IcAM-R activity. − means. Anti-idiotypic antibodies also target biologically active ICAM- An example of a new class of R equivalents. Antibodies that regulate the activity of ICAM-H In vitro analysis to identify other elements, such as IcAM-R, Alternatively, immobilize the natural ligand that ICAM-R binds and immobilize the unimmobilized ligand. The binding target is detectably labeled, incubated with the binding target, and of the test compound in comparison to the amount of label bound under conditions lacking the test compound. a decrease in the amount of bound label in the presence of the test agent or an inhibitor of ICAM-R binding. The effect of the test compound on the amount of bound label is determined by means of demonstrating that Do it by deciding. The DNA sequence information provided by the present invention is , expression of functional ICAM-R protein, or mutant 1cAM-R protein Homologous recombination or “knockout” can also be used to create rodents that inhibit the expression of Law [Kapecchi, 5science, 244: 1288-1292] (1989)). Such rodents in vivo as a model for the study of the activity of ICAM-R and ICAM-R preparations. Useful. Brief description of the drawing Many other aspects and advantages of the present invention will be apparent from the following detailed description and drawings. It is obvious. Figure 1 (A to G) shows isolated samples derived from HL60 cells encoding ICAM-R. The cDNA clone insert (SEQ ID NO: 2) and the deduced amino acids of its open reading frame ( Sequence number=1) is shown. Figure 2 (A to B) shows the ICAM-R DNA probe Oyohi lcAM-I DN. Northern blot hybridization of transduced cells using A probe This is a bar graph showing the results of the simulation. Figure 3 (A to F) shows the ICAM-RRNA probe array. In situ hybridization of transduced cells using Frobes This is a photomicrograph showing the results of this analysis. Figure 4A shows soluble IcAM-R in the presence or absence of anti-CD18 antibody. PMA-stimulated or unstimulated phosphorus from patients with leukocyte adhesion deficiency to FIG. 4B is a bar graph showing the analysis results regarding adhesion of papoblast cells, and FIG. Soluble I in the presence or absence of -C018 or anti-CD11a antibodies Regarding the adhesion of various other PMA-stimulated or unstimulated cell lines to CAM-R. It is a bar graph showing the analysis results. Figure 5 shows monochromes specific for IcAM-R, ICAM-1, or ICAM-2. Results of FAC3 analysis of indirect fluorescent antibody staining of transduced cells using local antibodies is expressed in histogram format. Figure 6 maps the epitope of the anti-ICAM-R monoclonal antibody of the invention. Three chimeric ICAM-R proteins used for this purpose are shown. Figure 7 (A to B) shows the ICAM-R or ICAM-I DNA probe. Actin-standardized Northern culture cells from human leukocyte cell lines and calcar endothelial cells were used. A bar graph representing lot hybridization results is shown. Figure 8 (A to B) shows the results obtained using a monoclonal antibody specific for ICAM-H. Figure 2 is a photograph of a Western plot of immunoprecipitation of lysates from human cell lines. Figure 9 (A to G) shows various human studies using anti-ICAM-R monoclonal antibody. The figure represents a photomicrograph of immunohistological staining of the tissue. Figure 10 shows the anti-I CAM-R model for stimulation of leukocyte proliferation by anti-CD3 antibodies. It is a bar graph showing the effect of noclonal antibodies. Figure 11 (A to B) shows anti-ICA on superantigen-induced proliferation of human peripheral blood lymphocytes. FIG. 11C is a bar graph showing the effect of M-R monoclonal antibody, and FIG. Anti-ICAM-R monoclonal antibody related to superantigen-induced proliferation of peripheral blood lymphocytes 2 is a graph containing a logistic dose-response curve for the effects of Figure 12 shows anti-ICAM-R monoclonal antibody related to alloantigen-induced T cell proliferation. This is a bar graph showing the effect of Figure 13 shows the anti-ICAM-R monoclonal activity on superantigen-induced proliferation of memory JT cells. 1 is a bar graph showing the effect of a null antibody. Figure 14 shows the anti-ICAM-R monoclonal activity on superantigen-induced proliferation of resting JT cells 1 is a bar graph showing the effect of a null antibody. Figure 15 shows that separate ICAM-R epitopes were cross-linked to the ICAM-R cytoskeleton. This is a bar graph showing the individual influences on the combination of . detailed description Regarding the present invention, human HL60 promyelocyte cells (ATCCCCCL240) The full-length cDNA encoding IcAM-R obtained from the derived cDNA library Regarding the isolation of DNA clones and the expression of ICAM-H in L cells, the following This will be explained in examples. More specifically, in Example 1, PCR of ICAM-related DNA Describes the design and construction of oligonucleotide probes for amplification. . Example 2 is similar to the DNA encoding ICAM-1 and ICAM-2. also describes the use of probes to amplify DNA fragments of distinct genomes. There is. Example 3 shows how the genome was used to isolate additional ICAM-R coding sequences. describes the screening of cDNA libraries with fragments of . Example 4 was carried out to isolate the full-length human cDNA encoding ICAM-R. , further describes screening of cDNA libraries. Example 5 is the characterization of the DNA sequence and amino acid sequence information of ICAM-H. and correlated ICAM-1 and ICAM-2 with their structures. ing. Example 6 shows the DNA sequence encoding the rodent analog of ICAM-R. describes the isolation of Example 7 shows that mammalian cells expressing ICAM-R Concerning preparation of host cells. Example 8 shows CD18-dependent or CD18-independent Preliminary experiments on cell-cell adhesion phenomena related to the biological pathway are described. fruit Example 9 shows the inhibition of cell adhesion to ICAM-R by a peptide derived from ICAM-R. Experiments that showed harm are described. Example 10 is the odontozoan 1cAM-R Discloses the construction and expression of a population of /glutathione S-transferase fusion proteins. Example 11 relates to the construction and expression of soluble variants of ICAM-H. Example 12 discloses the construction and expression of ICAM-R mutants with point mutations in the extracellular region. There is. Example 13 describes the preparation and preliminary characterization of anti-ICAM-R antibody and its Discloses the preparation of Pab' antibodies. Example 14 shows the anti-1cAM-R of the present invention. Mapping of ICAM-R epitopes recognized by monoclonal antibodies related. Example 15. 16 and 17 encode the ICAM-R polypeptide and Distribution and biology of RNA in normal cells, tissues and various cell lines Regarding evaluation of characterization. Example 19 shows homotypic cell-cell adhesion. An analysis of the involvement of ICAM-R in this paper is described. Example 20 is , about preliminary experiments showing that ICAM-R is involved in immune cell activation/proliferation. It is stated that In Example 21, ICAM-R specific monoclonal of the present invention The following is a summary of the characteristics of these antibodies. Example 22 shows differences in the cytoplasmic region of ICAM-H. describes experiments demonstrating phosphorylation and cytoskeletal binding. Example 1 Nucleic acids and and amino acid sequences to identify common types of proteins for isolating related novel genes. Sufficient intermolecular conservation has not yet been determined to provide useful information for the design of It was. Therefore, an attempt was made to isolate an unknown DNA encoding an intercellular adhesion molecule. Central to the strategy is the generation of degenerate common oligos representing the putative DNA sequences of a variety of distinct known molecules. development of nucleotides, and (similar to, but not identical to, known DNA) Interbody gene sequence DNA? Polymerase chain reaction (PCR) amplification of J.J. including the use of these oligonucleotides as primers for Ta. The starting point for oligonucleotide primer design is the immunization of certain CAMs. How many amino acids are in the region surrounding cysteine that forms a globulin-like loop? I noticed that it had been preserved. The arrangement on the amino terminal side of the reaction site The row is; On the other hand, the carboxy-terminal sequence of the residue is found to be . is typical. [Hunkapiller et al., Nature, 323: 15-16 (1986); Williams et al., Ann, Rev. Immu. nol, 6:381-405 (1988) and Newman et al., supra. See literature. ] By themselves, these two amino acid sites are not common. too useful as a probe for unknown DNA that may have common sites. Construction of degenerate sets of oligonucleotides is not possible. trying to solve this problem In an attempt to The areas that will be displayed are categorized into sub-files. This subfile is for human tube attachment. Seven regions of human platelet endothelial cell adhesion molecule (PECAM-1) -1) six areas, ICAM-1 five areas, ICAM-2 two areas, Human myeloglobin-related glycoproteins and human fibroblast growth factor receptor three of the four regions of both neurons, and mouse neuronal cell adhesion molecule (NCAM). ) were prepared for each of the five regions. All subfiles are pooled. of sequences such that the consensus sequence surrounding the cysteine site can be ascertained. Provides tree diagrams [Corpet, Nucleic Ac1ds Re5ea rch, 16 (22): 10881-10890 (1988)] Multi-sequence homology termed 'talin' - using a computer algorithm, C It was isolated independently from the origin of AM.　Common indicating the amino-terminal cysteine site The array is , while the common sequence at the carboxy terminus was determined to be . In order to overcome the partial degeneration, we incorporated the human preferred fudon and added a putative amino terminal. To use top strand PCR primers to amplify from end sites A total of 1152 probes were generated using three different sets of degenerate oligonucleotides. was prepared. The specific degenerate sequences of the three pools are as follows, according to IUPAC nomenclature: It was. Each primer has a putative carboxy terminus that facilitates cloning of the amplified product. IUPAC designation as bottom strand primer for amplification from site The following 768 probes were designed using the method. Each of these primers is To facilitate cloning of the amplified product, the Xba I restriction endonucleus It contained a lyase recognition site (TCTAGA). Oligonucleotides were purchased from Applied Biosystems, Foster City, CA. A model 394 automatic DNA synthesizer made in California, California, was used. 2 micromoles -Synthesized by β-cyanoethyl action according to the scale synthesis program. Next, the protecting group was removed by heating at 55°C for 6 hours or more. Next, oligonu Lyophilize cleotide, TE (lomM TrisSpH7.0, lmm EDTA) and size excluded with G25-150 Sephadex. Desalted by chromatography in TE. Example 2 Regarding design and synthesis, the two sets of probes described in Example 1 were 1 and ICAM-2 immunoglobulin-like loop regions of similar size. The created fragment was isolated and put into Bluescript plasmid (StraLagen Co., Ltd., LaJolla, California) and distributed. directly by column determination as well as by sequential hybridization. Therefore, in order to examine the homology to IcAM-2 DNA, a human genomic DNA template was used. It was used for the operation of PCR amplification of the type. Approximately 50% of the fragment (of course, the degenerated primer ) was the same as ICAM-1 or ICAM-2. One subclone, designated 13-3C7, contains ICAM-1 and IcAM-2. It is recognized that the reading frame in the second area of each of Ta. It did not correspond to any known sequence present in the Gene databank. The operations leading up to the isolation of subclone 13-3C7 were as follows. Amplifying human genomic DNA obtained from peripheral blood leukocytes or He1a cells For this purpose, denatured oligonucleotides were added to a final concentration of 10 μg/ml using a PC. It was mixed with the R reaction solution. For DNA amplification, PCR buffer (2mM MgCl2. 2 2mM deoxynucleotide in 5mM KCI, 10mM Tris pH 8,3) It was carried out in the presence of After 4 minutes of denaturation at 94℃, 2 minutes of denaturation at 60℃ Includes annealing, extension at 72°C for 4 minutes, and denaturation at 94°C for 1 minute. Thirty cycles of PCH were performed. Approximately 0. The DNA band moved to 2kb , extracted by electroelution from a 6% polyacrylamide gel, Xba 1 and Digested with Psi I restriction enzyme and used the old uescripL vector (Strat ligation was performed in Agene Co., Ltd.). Transfer this plasmid to E. coli XL1 - Electroporation into blue strain (Stratagene) and colonies - were selected on X-gal IPTG, carpenicillin agar plates. M1 3Ko7 Helper Phage (Stratagene), carpenicillin, and After adding Kanamycin to 2 ml of culture of each colony, -zero template was added. Obtained from six white colonies. For sequence analysis, next, DNA automatic sequencing Equipment (Applied Biosystems) and Sequenase Kit (UCB Belgium) Sequencing of -zero-valued templates by Sanger method using both Fixed position. 184-185 base pairs (bp) long, ICAM-2 92%-95% Four homologous sequences (clone 1. 1. 1. 3. 1. 4. 1. 6) was obtained. . In addition, there is a 182 bp frame shift included in the reading frame of the ICAM-1-like region. long DNA sequence (clone 1. 5), which corresponds to the truncated immunoglobulin-like region. 66bp DNA (clone 1. 2) was obtained. Clone 1. 6. 1. 5. 1. 2 sequences to three oligonucleotides used in the next test. used to design leotide probes (RM16, RM15, RM12), Additional colonies containing DNA highly homologous to previously isolated clones are removed from consideration. Probes RM1G, RM15, and RM12 The arrangement is as follows. Probe RM16 (SEQ ID NO: 12) GAGACTCTGCACTATGAG ACCTTCG probe RM15 (SEQ ID NO: 13) CAGGTGATTCT CATGCAGAGTCCAGGCCGACATGCTGGTAAGTGTGT In the CCAA second round of testing, sources digested with Xba I and Pst I from the PCR product of and further processed by the Flenow fragment of polymerase I. Subcloning by blunt-end ligation is performed from the blunt-ended PCR product. A new colony was obtained by turning the colony into a new colony. Contains a vector with an insert Colonies were placed in carpenicillin L broth containing X-gal and 1PTG. Selected on galose plates. Next, each white colony was treated with 300μI M13KO7 Phage, carpenicillin, and kanamycin in L broth. In addition, -zero value templates were synthesized in 96-well plates by growing.　 Using a sharp instrument, each 10 μm mold was transferred to a nylon membrane, denatured, and exposed to ultraviolet light. Fixed it with a line light. (10 μl of each 96-well plate The templates were transferred to three different nylon membranes. ) Oligonucleotide RM16 , RM15, and RM12 were labeled by phosphorylation using [λ-”P]ATP. Keshita. Nylon membrane in 20% formamide, 5xssc, sx Denhardt's solution and 0. Prehybridize in 5% SDS at 42°C for 3 hours, then using different radioisotope-labeled oligonucleotide probes under different conditions. , - hybridized overnight. Next, the membrane was heated to 0. 2x 5SC10,5% SDS Wash three times for 15 minutes each at room temperature, then wash with the same buffer for 15 minutes at 37°C. and 2X SSC and exposed. that which did not hybridize to any of the three oligonucleotide probes Each template was further analyzed using automated DNA sequencing and sequencease kits. The sequence was determined by the Sanger method. Cloned using this method, A 170 bp DNA sequence designated 13-307 was determined. Example 3 The cDNA insert of subclone 13-3C7 isolated in Example 2 was hybridized. Human pancreas, human placenta (two libraries) were used as diization probes. ), and human leukocyte cell line U937 (ATCC CRL1593). used to screen four different lambda phage cDNA libraries. . To summarize briefly, 120 positive clones (approximately 1.6 million screen 13-3C7 probe) and subcloned the 13-3C7 probe. and re-screened positive clones, In analytical PCR, the plasmid DNA corresponding to the plasmid DNA located in the DNA insert is Inserts larger than approximately 500 bp were selected on the basis of size. . 1. derived from U937 cDNA called 19C. Sequenced 3kb clone and due to improper and incomplete mRNA splicing before cDNA formation. two immunoglobulin-like regions separated by intervening sequences (introns) etc. The coding DNA region has been revealed. The two areas are ICAM-1 areas Comparison of ICAM-2 and region 3 shows sufficient homology, but the results are different and ICAM-2 showed lower homology with region l and region 2. The procedure leading to the isolation of 19c is as follows. Lambda g [10 fuage (λ gtlO), U937 cell line, chronic myelomonocytic leukemia patient pancreas, and human Four libraries were constructed using cDNA obtained from placenta.　l　 Exactly matching oligonucleotides designated Hr-5' and 1)1r-3' subclone (including the bases involved in the binding of the degenerated primer of origin) It was designed to correspond to the 5' and 3' sides of the region-like region of 13-3C7. Bri? -IHr-5° (SEQ ID NO: 15) GACCATGAGGTGCCA AG These oligonucleotides were added to the 13-3C7 insert template and! 2p-dCTP When used in a PCR reaction with . The cDNA library was transferred to a plated nylon membrane. 40% of this film Formamide, 5x SSC, 5x Denhardt, 0. in 5% SDS at 42°C. Pre-bridize for at least 15 minutes, then probe in the same buffer. , and hybridized overnight at 42°C. Wash the membrane several times in 2x SSC at room temperature I was exposed to light. Most phage plaques that hybridized with the probe , was derived from the U937 cDNA library. These phages were further purified and analyzed by PCR (I Hr-5゛ and 1) using 1r-3' as a primer) regarding the presence of the region in the cDNA. It was tested. Phage also determines the length of the clone and the region within the cDNA fragment. To determine the location of (13-3C7-specific primers and PCR using a combination of primers similar to the dagtlo vector sequence) Therefore it was tested. Two clones were selected. Clone IF is 0. 7k b length, 19C is 1. It was 3 kb long. Digest these cDNAs with and subcloned into the Bluescript vector. moreover , the largest cDNA (clone 19c) was sonicated to obtain small fragments and arranged. Subcloned into Bluescript for column determination. By homology with the IcAM-1 molecule, clone 19C cDNA was isolated from IcAM-1, respectively. Intervening sequences of unrelated DNA with homology to regions 2 and 3 of CAM-1 It included two areas with . From now on, these DNA regions will be -R region 2 and region 3. Example 4 Next, immunoglobulins isolated in Example 3 and similar to regions 2 and 3 of ICAM-1 1 to 3 kb DNA (clone 19) containing a region encoding a brin-like loop C) in an attempt to isolate full-length cDNA clones. It was used to prepare probes for screening the A library. Simply put, regions 2 and 3 in clone 19c are Designed to fit amino terminal (5°) and carboxy (3') terminal portions. PCR amplification was performed using a unique probe. These amplified DNA is a protocol for screening cDNA libraries derived from: Provided as a tube: (1) HL60 myelomonocytic cell line; (2) ribopolysaccharide activity Sexualized human monocytes; (3) HUT-78T cells (ATCCTlB161) and (4) Activated peripheral blood leukocytes. From the latter two libraries, the screen No positive samples were obtained through testing. HL60 and monocyte cDNA library To exclude ICAM-1 clones, positives derived from Lee were then transferred to ICAM-1 to exclude ICAM-1 clones. A probe having region 2 of IDNA (GenBank, accession number 22634) It was screened on the website. One phagmid clone derived from Lambda 345 is , pVZ-147, a probe based on the DNA from which the positive body was isolated in Example 4. In hybridization with the ICAM-I DNA probe, the negative body is hybridization was tested repeatedly. Clone pVZ-147 Approximately 1. A 7kb insert was isolated and sequenced as shown in SEQ ID NO:2. A sequence similar to Eel 1781b was obtained. The polype encoded by this DNA The deduced amino acid sequence of peptide is shown in SEQ ID NO:1. This polypeptide is Ic Based on its structural relationship with AM~1 and ICAM-2, rlcAM-RJ It was named. The DNA and deduced amino acid sequence of IcAM-H are disclosed in this application. After the priority date of Vazeux et al., Nature, 360:485-488 (1992). After the priority date of this application, FawceLt et al. The open reading frame of the DNA sequence of ICAM-3 published in the literature is shown in Figure 1 of this specification. The coding region of the ICAM-R DNA sequence described in (A to G) and two nucleosols It differs depending on the position of the chido. (See nucleotides at positions 194 and 1275.) The operations performed for the isolation of loan pVZ147 are as follows. all cDNA libraries were constructed in lambda gt10 or HL60 live The rally was cloned in phage lambda 345. Library screen Oligonucleotides for use in leaning and rescreening are: It had the following sequence. Probe lHr 2-5' (SEQ ID NO: 17) TTCACCCTGCGCTG CCAA probe IHr 2-3° (SEQ ID NO: 18) AAAGGGGCTC CGTGGTCG probe IHr 3-5' (SEQ ID NO: 19) CCGGTT CTTGGAGGTGGAA probe [Hr 3-3' (SEQ ID NO: 20)C ATGACTGTCGCATTCAGCA probe lcam 1-5 (SEQ ID NO. No. 21) GCAAGAACCTTACCCTAC probe lHr 2-5' and It(r 2-3° is PC of clone 19c template using P-dCTP) Region 2-specific probe used for R amplification and cDNA screening was prepared. Similarly, probes IHr 3-5' and lHr 3-3' was used to create a region 3-specific probe. Finally, the professional The probe Icam 1-5 and the probe Icam 1-3 are ICAM-1 cDNA Bases 440 to 609 of the sequence (GenBank accession number 22634), e.g. That is, the ICAM-1 segment probe corresponding to the second region of ICAM-1 was used for amplification. Plate the cDNA library, transfer it to a nylon membrane, and add the region 2 probe (clamp). 19C), 40% formamide, 5x SSC, 5x Denhardt, 0. Hybridized in 5% SDS for 7 minutes and washed as above. Area 2 Pro All plaques that hybridize with monocytes and HL60 live It came from a rally. These phage plaques can be diluted, mounted, transferred and Purified by hybridization with region 2 probe. In addition, cDN To characterize the A clones, each hybridized with the region 2 probe. Three plaques were grown in sequence, transferred to a nitro membrane, and incubated under stringent conditions (50 % formamide, 5x SSC, 5x Denhardt, 0. 5%5DS), with three differences. Hybridized with a probe. The probes are area 2 probe, area 3 probe, and ICAM-1 second region probe. Area 2 and area 3 probes, and the second region probe of ICAM-1. Five clones that did not hybridize were found in the HL60 library and in the monocyte library. Two things were recognized by Lee. The sixth clone from the HL60 library hybridized only with region 2 probe, and with region 3 or ICAM-1 probe. It did not hybridize with the two regions. Six clusters derived from the HL60 library Lorne's cDNA was further analyzed. The phage detects the presence of properly spliced cDNA to the 5′ end of region 2. corresponding oligonucleotide primer (IHr2-5'), and 3 of region 3. ゛Using an oligonucleotide primer corresponding to the end (IHr3-3') Tested by PCH. Clones also depend on the length and length of the region within the clone. was tested by PCR to determine its location. The cDNA plasmid is By digestion with SfiI and self-ligation, phage lambda 3 45 and cyclized. - Create a zero-value template and sequence in both directions In order to perform (Stragene). Plasmid pVZ147 is It was determined that the entire ICAM-R coding sequence was contained in one reading frame. Figure 1 (A to G) shows the lambda phage clone p isolated in Example 4 above. FIG. 2 shows the sequence of the human cDNA insert of VZ147. The entire disclosed 1781b11 is shown in SEQ ID NO:2. Sequence number: Shown in 1 The deduced amino acid sequence of the ICAM-R polypeptide is shown in Figure 1 (A to G) and below. It is divided into areas in the figure. (1) A putative signal or leader sequence is expressed before the “mature” protein. and spans amino acids -29 to -1. The translation product is actually −29 Alternatively, determining whether to start at -26 is the amino acid of the intercellular expression product. By acid sequencing. The designation of the first residue of the mature protein is Amino acids (and corresponding base) based on generalized similarity of residues. The starting residue of the actual mature protein The conformation of the group can be determined by the secreted recombinant product or, e.g. Wait for product sequencing. (2) Five putative immunoglobulins in mature proteins ranging from +1 to 518 The similar loop region is shown (white text on black). This region is bound by cysteines in five putative immunoglobulin-like regions. There are (areas that are enclosed). In the first region (residues l to 91), loop formation Possible cysteine residues are present at positions 24, 28, 67 and 71 Be aware of what you are doing. Each of the remaining estimation loops has a single point at its end. It has two suitable cysteines. (3) Similarly, in the mature protein, after the fifth immunoglobulin-like region, the putative The hydrophobic “limbic” region of is indicated by a dash connecting residues 457 to 481. . The putative carboxy-terminal "cytoplasmic" region is residues 482-518. (4) Potential N-linked glycosylation sites [consensus sequence, asparagine -X- (serine or threonine)] is indicated by an asterisk. Possible 〇-Conclusion At the binding glycosylation site, a serine or threonine residue. Amino acid sequence of ICAM-H and published amino acid sequence of 537 residues of ICAM-1 Noic acid sequence (G6yIBank accession number 22634-1 interpretation, November 1, 1988) A comparison was made with FIG. 8) of European Patent Application No. 0289949 published on the 1st. this The comparison revealed 249 matches among the 537 matched residues, and these two It was found that there was an overall amino acid identity of 48% between the polypeptides. . The highest precision was found in regions 2 and 3 of ICAM-1 and IcAM-R. It was shown that it exists between constant regions 2 and 3. Similarly, sequence number: l and The published amino acid sequence of 295 residues of ICAM-2 (G (41Bank accession number No. 22635 No. 2 Store Rule, European Patent Application No. 038766 published September 19, 1990 When comparing Figure 2) of No. 8, we found that out of 282 residues, 78 were found to be compatible. Overall, 27% agreement was observed for one arrangement. in a certain way The cytoplasmic region of ICAM-H is 20% identical to that of ICAM-1. It was found that the cytoplasmic region of ICAM-2 is 34% identical to the cytoplasmic region of ICAM-2. Admitted. B. Characterization of ICAM-RDNA The human ICAM-R DNA sequence (SEQ ID NO: 2) was synthesized from the published ICAM-1 and and the DNA sequence of IcAM-2 described above. ICAM-R and ICAM Of the 1623 bases of -1, a total of 677 matches were found, with a total of 41%. It was a match. Between 1136 bases of ICAM-R and IcAM-2 DNA A 42% agreement (484 matches) was observed. Figure 1 (A to G) of “historical” significance for the isolation of the ICAM-R gene. DNA references include: (a) Base 420 corresponding to subclone 13-3C7 isolated in Example 2 From 567; (b) Corresponds to immunoglobulin-like region 2 located in clone 19c of Example 3 bases 373 to 663 (oligonucleotide probe for use in Example 4) The probe If( Bases 418 to 435 and corresponding to r2-5' and IHr2-3', respectively. and 561 to 578. );and (C) Corresponds to immunoglobulin-like region 3 located on clone 19c of Example 3 bases 664 to 957 (other oligonucleotide bases for use in Example 4) Probe I! was used for PCR amplification of region 3 to provide the lobe. (r bases 699 to 717 and corresponding to IHr3-5° and IHr3-3', respectively. and 800 to 819. ) C. Chromosomal location of the sequence encoding human ICAM-R Human ICAM-R encodes to determine that the sequence is localized in the short (p) region of chromosome 19. In, Cannlzzaro et al. Cancer Res, 51: 3818-3820 (1991) A DNA probe was prepared by the method described in . Example 6 The DNA sequence encoding the rodent homolog of human ICAM-R was specifically developed for ICAM-H. hybridization under low stringency conditions using different probes. I let go. Kanonari NA creates a rodent strain lacking ICAM-R expression For this purpose, homologous recombination or "knockout" methods can be used. In addition, the rodent 1cAM-R DNA clone was - Drugs that can be tested in rodent models for modulating the activity of R (e.g. monochrome Preparation of recombinant rodent ICAM-R protein useful for the production of natural antibodies) It can be used to A, Isolation of rat genomic ICAM-R region 2 clones Analogs of the same class were tested under low stringency conditions using ICAM-R specific probes. Isolated by redization. Adult Ba1b/c mouse PBL cDNA lambda phage library and Rat PBC cDNA lambda phage library (Clonetech, La Jolla, CA) and rat liver DNA and C6V Lambda phage rat genomic DNA prepared from L lymphoblast cell DNA Screen the library with the full-length human ICAM-R gene or its fragments. I clicked. Library plaque with Hybond N+ nylon membrane (Amers Ham Inc., ArliArlln Heights. moved to Illinois). All pre/\bridization and hives Redization was carried out in 40-50% formamide, 5x Denhardt at 42°C. , 5xSSPE and 1. It was carried out in a solution of 0% SDS. ! 2p radioisotope Elementally labeled probe/-IO5-10'cp of hybridization solution It was added at a concentration of m/ml. After hybridization, filters were heated in 2x SSPE10. 1%SD Washed thoroughly in S and then exposed to X-ray film. Positive clones were plaque purified by further hybridization. Lambda DNA was prepared from the lysate of each clone and or RsaI. Genomic DNA fragments were cloned into Seafence vectors for analysis. . Approximately 2.5 x 106 plaques derived from a rodent cDNA library and 2. derived from the genomic library. 0XIO' plaques as full-length human ICAM- Screened with R probe. I am addicted to clones related to ICAM-H It was not confirmed. Furthermore, 0.00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000-derived derived from odontian cDNA library. 5X 10' plaques and 1 from the odontodont genome library. OX 10' plaques with sequence number ICAM-R region 2-specific protein corresponding to nucleotides 372 to 663 of =2. Robed and screened. One rat-derived genome clone was IC It was identified as a candidate for the odontozoan homolog of region 2 of AM-R. Sequence number = 23 and 24 show the sequence data (341 bp) of rat region 2 clone. Table 1 below shows the rat clones, human IcAM-R, ICAM-1, and I DNA and amino acid sequence matches to regions corresponding to CAM-2 are shown. Mouse ICAM-25438 Isolation of B9 Partial Rat ICAM-R cDNA Rat Macrophages, PBL and pancreatic λgLlO cDNA library (Clonetech, La Jolla; rat ICAM-R region 2D to screen (California) NA (SEQ ID NO: 23) was used as a radiolabeled probe. live The screening conditions for the rally are as mentioned in A above. A single clone was isolated from the pancreatic λgtlo cDNA library.　 Sequence analysis of the clone revealed that it has an open reading frame that spans the entire insert (EcoR [including ends ) A 1294 bp insert was observed. From comparison with human ICAM-R sequence , rat region 2 clone, regions 2 to 5 with the 5′ end of region l deleted, and most of the nucleotides encoding the most marginal membrane regions and all 3° ends of the cytoplasmic end. It contained. The DNA sequence of partial rat ICAM-R cDNA is SEQ ID NO: 25 Other rat genomics substantially isolated by the procedure described in A. above. ICAM-R clone has ICAM-1 and ICAM-R genes on the same chromosome. It contained both ICAM-1 and ICAM-R sequences, indicating that the　 Ba1laLyne eL al,, Genomics, 3: 547 ( (1991) reported that the rat ICAM-1 gene is located on rat chromosome 9. are doing. The DNA sequences of the clones determined to date are based on the IUPAC order. It is designated as SEQ ID NO: 226 by nomenclature, and is a partial rat IcAM-R cDNA clone. The exon corresponding to the loan, as well as the upstream region of 1340 bp and 96 bp of the coding sequence. It also included a downstream region of 0 bp. D. Isolation of mouse genomic clones Mouse genomic clones were isolated from rat Using ICAM-R cDNA as a probe, follow the procedure described in A above. isolated. 1593 bp at the 5° end of the ICAM-R coding portion of the clone and I of the clone The 2820 bp nucleotide sequence at the 3° end of the CAM-R coding portion was c nomenclature, as SEQ ID NO: 27. The sequencing portion of the clone is By the approximately 120bp gap indicated by N in the DNA sequence at column number 227 Separated. Example 7 Human ICAM-R cDNA was added to LM (TK-) mouse cells (ATCCCCCL). 1. 3) Transducing and Northern blot and in situ hybridization Cells were analyzed for ICAM-H expression by dilation. It was. A, Transduction of ICAM-R DNA Full-length human IcAM-R cDNA insert of pVZ-147 (Example 4) and its A part of the phagmid vector on the 3° side of the cDNA was digested with restriction enzymes NotI and and Xba I, and cut with Not I and Xba I. Plasmid pCDNA 1-neo (lnvitrogen, SanDie Go, California). The obtained plasmid called pCDNA 1-neo ICAM-R was en et al., Molecular and Cellular Biology, 7 : 2745-2748 (1987) G: Calcium phosphate precipitation method described Therefore, mouse L cells were transduced. ICAM-I DNA (pCDN A-neo-1cAM-1 construct) was also transduced into mouse L cells as a control. I entered. Plasma cDNA fragment containing the complete ICAM-1 protein coding region Sumido pCDNA 1-ne. and transduced into L cells by calcium phosphate precipitation. Ta. Following selection for neomycin resistance (A), individual IcAM-R or IcAM-R The CAM-1 transductant was transferred to a cloning cylinder (Bellco Glass Vineland, N.D.). Ta. Next, express ICAM-R and ICAM-1 proteins at the highest level. The appearing clones were separated using a cell sorter. Constructs pCDNA-neo-ICAM-R and murine DNA-neo-ICAM- 1 was also transduced into CV-1 cells by calcium phosphate precipitation. . Clones expressing high levels of ICAM-R and ICAM-1 were Rice cell transductants were selected as described for. ICAM-R and ICAM- Based on FACs analysis with C.1-specific antibodies, the level of protein expression was It was higher for the V-1 transductant than for the mouse LTK transductant. B, Northern blot hybridization full-length ICAM-R or IC After transducing AM-1 cDNAs into mouse L cells, transduced and Specific expression of the corresponding mRNA5 in non-transduced cells was determined by 32 Nosa using p-labeled ICAM-R or ICAM-I DNA probe The transductants were examined by hybridization. When several growth phases were reached, the cells were centrifuged and washed twice with 150 mM NaCl. Precipitate 3. Resuspend in 5 ml of GIT (guanidium isothiocyanate) buffer. The mixture was turbid and crushed with a Polytron mixer for 20 seconds. 1. More than 7ml CsC1 buffer After addition to the centrifuge tube, the GIT/RNA mixture was layered on top. Sample at 35K (179,000 x g) at 20°C for 21 hours. all of the liquid was removed and the precipitated RNA was added to 300 μl of 0. 3M sodium acetate pH5 , 2 and then precipitated with 750 μl of ethanol at -20°C.　 The pellet was resuspended in water and treated with protease to remove all RNA5e. Excluded. After phenol-chloroform extraction, the RNA was reprecipitated, resuspended in water, and The absorbance of the sample was measured at 260 nm. Using a solution prepared with diethylpyrocarbonate (DBPC) treatment solution, RN A was electrophoresed in a 1% formaldehyde agarose gel. Total RNA sample 1 0 μg was loaded on each lane. Transfer RNA to buffer solution at 30V using a dynamic pump. Electrophoresis was carried out for about 18 hours without continuous circulation. Each obtained gel Soaked twice in 20xSSPH for 20 minutes each at room temperature. RNA Hybo nd-C film (Amersham, ArliArlln Heights, Inc. The transfer to Linois was carried out overnight in 20XSSPE using capillary action. Ta. Exposure to ultraviolet light using Stratagene's Stratalin RNA was stably cross-linked to each membrane by . To prepare ICAM-I DNA probe, 100-200 ng of template D NA (1. containing the entire ICAM-1 code sequence) bkb no 4/crazy fragment) water and random hexamers, 32P-dCTP and "P-dTTP. 10-'M dGTP/dATP 5IOX Klenow buffer (Boehring er Mannheim Biochemicals, Indianapolis s, Indiana) and Flenow enzyme, boil for 5 minutes, then boil for 5 minutes. Incubate on ice and leave the mixture at room temperature for 1 hour. Sample sample Pass through an ickspin G25 DNA column (Boehringer) and remove. The incorporated label was separated from the unincorporated label. Rutameni to create ICAM-RDNA probe, 200pg (7) DNA template (1. of clone pVZ-147, which was cut to remove the polyA tail. 4kb break ) was primed with oligonucleotides complementary to the 5' and 3' ends of region l. was amplified by PCR. "P-dCTP was added to the reaction mixture. Sample was maintained at 94°C for 4 minutes, followed by a temperature conversion step (94°C, 1 minute; 50°C, 2 minutes; 72° C., 4 minutes) (7) 30 cycles were performed. Next, transfer the sample to Quicksp in column and label uptake was monitored by 1 μm scintillation measurement. Beta. The DNA probe was denatured with 5M Na0)1 and then neutralized with IM Tris. Hybond n-C membrane was pretreated with 50% formamide at 50'C for 30 minutes. Prehybridized with hybridization mixture. The probe was added to each membrane at lXIO'cpm/ml hybridization. mixture (50% formamide, 5x Denhardt's solution, 5x SSPE, 1% 5DS) and the membranes were incubated overnight at 42°C. Next that Each membrane was 2 x 5SPE10. Wash 5 times for 10 minutes each in 1% SDS at room temperature. Purified. 10 minutes at 50℃, 0. 5XSSPE10. Wash once in 1% SDS and washed once in 2X SSPE. Hybridization with major RNA transcripts was performed using MolecularDyn amics (Sunnyvale, CA) model 400A phosphor -Quantitated using an imager. The Northern blot hybridization results are shown in Figure 2 (A to B) as bars. expressed in the form of a graph. Figure 2A shows the ICAM-R probe and ICAM-R transduction. This figure represents specific hybridization with RNA extracted from the inoculum.　 RNA from ICAM-1 transductants or non-transduced L cells It does not hybridize with RNA. On the contrary, Figure 2B shows the ICA, M-1 probe However, the RNA derived from ICAM-1 transductants hybridizes with ICAM-R transductant-derived RNA or parental L cell-derived RNA is highly This indicates that there is no hybridization. C, in situ hybridization L cells and ICAM-R or I Cells transduced as above with cAM-1 cDNA were transduced with IcAM-R. Alternatively, insert a radioisotope-labeled single-value RNA probe derived from ICAM-1. Hybridized with Ichu. - Zero value RNA probe is ICAM-R or corresponding to the first (i.e., N-terminal) immunoglobulin-like region of ICAM-1. by in vitro RNA transcription that incorporates 5-DTP from a DNA template containing It was prepared as follows. The probe was chemically hydrolyzed to approximately 200 bp. Transduced and untransduced cells were incubated with VecLabond (Vector LabOratOrieS, Burlingame, California). It was placed on an inverted slide and stored at -70°C. Before use, slide the slide It was removed from the oven and kept at 55°C for 5 minutes. Next, place the mounting area in 4% paraform. Fix in aldehyde, 70-95-100% ethanol for 20 min at 4 °C. The sample was dehydrated for 10 minutes at room temperature and air-dried for 30 minutes. Placement area at 70℃, 2 Denature in 70% formamide/2XSSC for min, wash in 2XSSC, and desorb. Water and air dry for 30 minutes. 50% formamide, 0. 3M NaCl, 20mM Tris pH 8, 0, 10% dextran sulfate, ■ × Denhardt's solution, 1 Mixture containing 00mM dithiothreitol (DTT) and 5mM EDTA Prehybridization was performed at 42°C for 2 hours. Hybridization was carried out overnight (12-16 hours) at 50°C in the same mixture. I did it. At this time, the mixture further contains 35S-labeled ICAM-1 or 35S-labeled ICAM-RRNA probe (6X 1105 cp/placement site) either was included. After hybridization, place the 2 mounting sites at 1 o'clock. in 4x SSC/10mM DTT at room temperature for 40 min at 60°C. for 30 minutes in 50% formamide 71x SSC/10mM DTT. at room temperature in 2X SSC and for 30 minutes at room temperature in O,l　X SSC. Washed. Dehydrate the mounting area with alcohol, air dry for 30 minutes (complete at 4℃) After storage in complete darkness), develop and counter with hematoxylin/eosin. Specific staining was carried out. Micrographs of in situ hybridization are shown in Figure 3 (A to F). It is. Here, micrograph 3A shows the parent probed with ICAM-RRNA. 3B is ICAM-R probed with ICAM-R RNA. Transduced cells; 3C is IC probed with IcAM-RRNA. Cells transduced with AM-1: 3D are probed with ICAM-I RNA. 3E is the parent cells probed with IcAM-I RNA; The cells were transduced with CAM-R, and 3F was transduced with ICAM-I RNA. Cells transfected with ICAM-1. Each micrograph is This RNA probe specifically interacted with cells transduced with a similar cDNA. It shows that it hybridizes. Example 8 to transduced cells expressing IcAM-R on their surface or in soluble form. Experiments testing the adhesion of leukocytes to ICAM-R (Example 11) revealed that ICA M-R is a ligand/receptor for adhesion molecules or molecules on leukocytes This suggests that. A, CD18-dependent cell adhesion In Dustin et al., Nature, 341:619-624 (1989) 5KW3 cells (TIJ tumor blast cells) were pretreated with phorbol ester as described. treatment, activate LFA-1-dependent adhesion, and induce IcAM-R and ICAM -1 transductants were analyzed for binding. Non-transduced cells or ICAM-R or ICAM-1 (Example Cells transduced with either 24-48 of the adhesive assay Inoculate 24-well tissue culture plates (3 x 10' cells per well) 1 hour in advance. cells). 5KW3 cells were incubated with serum-free RPMI (Gibco, Canada). Wash and apply Calcein-AM (Molecular Probes, Bug ene, Oregon) and 10 ng/ml phorbol myristyl acetate. (PMA) for 20 minutes at 37°C. Selected and inspired 5K W3 cells were then treated with anti-CD18 (TSI/18, ATCCHB203), anti- CD l la (TS 1/22, ATCCHB202) on hybridoma Purified anti-CD2 (ATCCHB195) monoclonal as supernatant or control prior to incubation with adherent transduced cells for 30 min with the transduced antibody. was pretreated at room temperature. Calcein-labeled 5K with or without antibody treatment W-3 cells were grown into confluent monolayers of ICAM-R or ICAM-1 transductants. Add (5 x 105 cells per well) and add RPMI/1% fetal bovine blood. Qing (Fe2. Hyclone Laboratories, Logan, (Utah) for 30 minutes at 37°C. Unbound cells were aspirated and wells filled with RPMI-Fe2. The plate was sealed, inverted, centrifuged at 20 rpm for 4 minutes, and aspirated. . The plate was then washed with RPMI-Fe3 and scanned with an automatic fluorescence reader. Ta. against both ICAM-R and ICAM-1 transductants in stimulated 5KW3 cells. Adhesion was inhibited with monoclonal antibodies. These monoclonal antibodies are It is directed against the a (CD11a) or β (CD18) chain of LFA-1. Ta. From this, ICAM-R is an intercellular protein that involves the β2 integrin pathway. It seems possible that it is involved in the adhesion phenomenon. Intracellular adhesion was determined by control anti-CD2 It was not affected by the reagent. B, CD18-independent cell adhesion CD18-negative phospho/metablastic cells from patients with leukocyte adhesion deficiency (LAD) bound to soluble 1cAM-H as described in Example 11. (The test control was 1% B See Figure 4A, binding of cells to SA-coated plates. ) In addition, IC Most of the binding of Jurkal T lymphoblastoid cell line to AM-R (80-90 %) of anti-C018 monoclonal antibody [BeaLy et al., J. 1mmuno1. , 131: 2913-2918 (1983). 0. 3) Or anti-CD11a monoclonal antibody (TSI/22) (Figure 4B) was not inhibited by. These results demonstrate that ICAM-H is effective against these cell lines. Binding is CD18-dependent, and LAD and Jurkat cells are This suggests that ICAM-H expresses a counterreceptor to ICAM-H, which is not a common receptor for ICAM-H. Example 9 Human sequence ICAM-R peptide was added to ICAM of 5KW3 and Jurkat cells. -Used to inhibit binding to R. The former type of adhesion is CD18 dependent whereas the latter is largely CD18-independent. Amino acid sequence ratio with known β1 integrin binding region in fibronectin anti-ICAM-R monoclonal antibody that blocks cell adhesion (Example ICA corresponding to the positive integrin binding site, based on Table 11 of 21. The M-R peptide was added to Macromolecular Resources (: IO Rad State University, Fort Collins, Colorado). Territory Four ICAM-R sequences lying between regions I and 3 or between the predicted β-strands was selected. Is it not the same or similar, the consideration of the β chain regarding IcAM-R is , 5tauton et al, , Ce1l, 61: 2437254 ( 1990). To plastic coated with soluble 1cAM-R Inhibition assays were performed using a system involving cell adhesion. Calcein mark cells (see section A above) were incubated with 1-2 mg/ml of peptide for 2 hours. Incubate for 20 minutes at 5°C and add pre-soluble ICAM-R (Example 11) and coated with phorbol 12-myristate at a final concentration of 10 μg/ml. Cells were transferred to wells of a 96-well plate containing 13-acetate (PMA). After 50 minutes, plates were placed in PBS for 10 minutes to remove unbound cells. combined Cells were quantified using a trend densitometer. The analysis results are shown in Table 2 below. In the table, the numbers of the peptide residues of IcAM-R are as follows: corresponds to the sequence number, ■, while the numbers of the peptide residues of ICAM-1 are The IcAM-1 amino acid shown in the above-mentioned literature of 5taunton et al. It corresponds to the acid sequence, and the abbreviation "rND" indicates "not determined". . 3 230-234 0% 36% 3 271-276 0% 11% 3 268-274 ND ND The ICAM-R peptide sequence from region 3 was transferred from Jurkat cells to ICAM-R. but not the binding of 5KW3 cells to ICAM-R. Region 3 peptides are more effective than region 1 peptides in inhibiting binding to Jurkat cells. This means that Jurka to AM-R is about twice as effective. This suggests that IcAM-R region 3 is involved in the binding of . Sequence number , ICAM-R region I peptide (NGSQI) corresponding to residues 72-76 of 1 is , inhibited the binding of 5KW3 to ICAM-R by 26%. The corresponding ICAM-1 peptide (DGQST: SEQ ID NO: 28) inhibits binding. did no harm. In contrast, corresponding to amino acids 230 to 234 of SEQ ID NO: l The IcAM-R region 3 peptide (GDQML) that binds to IcAM-R The highest inhibition (36%) was shown in binding of rkat. Corresponding ICAM-1 The peptide (GDQRL: SEQ ID NO: 29) inhibited JurkaL binding by 22%. harmed. Tripeptide RGD is an extracellular matrix component (β-1 integrin glue). For example, it is a recognition sequence common to fibronectin and vitronectin). . The cyclized RGD-containing peptide inhibits integrin binding to vitronectin. The inhibitory effect was improved by about 100 times [Pierschbacher and R uoslahti, J., Biol. Chem, 262(36): 17294-17298 (1987):l . ICAM corresponding to residues 72-77 of region 1 and residues 230-234 of region 3 -R peptide sequences were tested using the analytical methods outlined above. Cyclization was performed using acetic acid. Example 10 Population of rat ICAM-R/glutathione S-transferase (GST) fusion proteins , bacterial expression vector pGEX-27 (Pharmacia Biotech Generated for use as an immunogen using Ta. The plasmid vector is located upstream of GST encoding the DNA sequence Contains an IPTG-inducible promoter adjacent to the multiple cloning site. I'm here. A, fusion protein containing multiple regions of rat ICAM-H as described in Example 6. A partial clone of IcAM-H was isolated from the ICAM-R fragment, region 2. 3 first configuration Part, 36 N-terminal portions of region 4 (amino acids 1 to 240) of rat ICAM-H and the remaining 104 amino acids of region 4; A polynucleotide encoding all of region 5 (amino acids 240 to 430) was used to create the code. Position 718 of cDNA clone (SEQ ID NO: 25) One EcoR1 site located in the following was used to generate polynucleotide fragments.　 Each fragment was inserted into the -EcoR1 site upstream of pGEX-2T of GST encoding the sequence. E. coli was transformed with the inserted plasmid. Insertion direction and reading frame was confirmed by sequence analysis. Bacteria containing the recombinant plasmid - late growing Let it be 0. Expression of the fusion protein was induced with 1mM IPTG. IcAM- Both R and GST fusion proteins were tested by sonication of bacteria in PBS+5O3 (1%). It remained in the insoluble fraction after being decomposed by crushing. Insoluble protein is 10% preparative polyacrylamide SDS gel boiled in dye with SO3 applied to. Add gel to 0. Colored with 4M potassium chloride, fusion protein band I cut it out. The fusion protein was prepared using 25mM Tris/192mM glycine gel buffer. It was electroeluted from the polyacrylamide gel section using a dialysis tube. B, fusion protein rat ICAM-R region containing a single region of rat ICAM-H. Region-specific fusion proteins were also constructed in pGEX-2T. The following primers correspond to the 5' and 3' ends of regions 1 and 2, and correspond to the 5' and 3' ends of regions 1 and 2, and and 2, respectively, were used to generate DNA fragments by PCH. . The region 1-specific PCR primer is based on the sequence of the rat genomic clone. The region 2-specific PCR primers were based on the sequence of the rat cDNA clone. (see Example 6). PCR was carried out using 10mM Tris pH 8,3, 50mM potassium chloride, and 1 ．． A pair of plates in region 1 or 2 was placed in a buffer consisting of 5mM magnesium chloride. I7- (10Bg/ml), 4 dNTPs (0. 2mM) material, template DNA (1 ng rat ICAM-R genomic clone DNA), and Taq polymerase (1 unit/reaction) using a 50 μl reaction mixture containing I went. Cycle at 95°C for 2 minutes, 50°C for 2 minutes, and 72°C for 4 minutes. I did this 30 times. The obtained PCR fragment of region 1 or 2 was converted into pGf! X- 2T into the EcoR1 site and transformants with the appropriate molecular weight. It was applied to screen for the ability to produce fusion proteins. DNA arrangement Column analysis confirmed proper orientation and reading frame. Area 1 and 2/GST Isolation and purification of the fusion protein was performed as described in Section A above. Example 11 A water-soluble variant of ICAM-H was constructed and expressed as follows. The human cDNA of IcAM-R was synthesized using standard procedures for site-directed mutagenesis [e.g. Unkel et al., Proc, Na11. Acad, Sci, USA, 8 2:48B-492 (1985)] and the protein code The code sequence was inserted into the predetermined seam of its extracellular and membranous regions (address at position 457). (mino acid). This area is a field of computer science that predicts aqueous therapy. Algorithm [Kyte et al., J. Mo1. Biol. 157:105-132 (1982)]. DN of ICAM-H The A sequence was extracted from pVZ147C Example 4) with the restriction enzymes SatI and Not. Cut at I. The resulting fragment begins at the 5' end of the coding strand and The complete ICAM-R, including the 3' end of the short segment of the tycloning site. It contained a code sequence. Linearize this fragment with Sal I and Not I subcloned into the M138M21 vector (Boehringer) A molecule designated as M138M211CAM-R was obtained. Oligonucleotides for mutagenesis were synthesized as shown below. This oligonucleotide terminates the phenylalanine at position 457 of IcAM-R. Change to codon. The oligonucleotides were as described in Kunkel et al., supra. It was used as shown and finished in 457th place from M138M211CAM-R. Six M13 phage isolates encoding stop codons were prepared. [1M2 An isolate designated 11cAM-Rll was selected for further studies. This -zero value template was then primed using Freneau DNA polymerase as follows. mer extension into a double-stranded DNA molecule. 50ng of 10Bg of purified single-stranded M13BM211CAM-RL DNA LacZ universal-20 primer (GTAAAACGACGGCCAG T, SEQ ID NO: 35). Annealing is lXX Frenow DNA Polymerase solution (10mM Tris-C1pit) 7. 5. 5mM Mgc +2. 7. The mixture was incubated at 65°C for 5 min in 5mM dithiothreitol). The cells were incubated for 5 minutes at 25°C. Next, animate the following mixture. Added to the ring reaction: dATP at a final concentration of 33 μM. dGTP, dc’rP, dTTP; 4-Ll-y NA polymerase (Boehringer), and 1× Klenow buffer.　 Primer extension reactions were performed by one round of phenol/chloroform (1:1) extraction and Incubate at 37°C for 45 min until stopped by ethanol precipitation. This was done by A part of the cDNA insert was converted into M138M211C Restriction using restriction enzymes Eco RV and Nco I from AM-Rtl phage It was extracted by restriction digestion. The extracted DNA fragment is a truncated ICAM- The complete coding sequence of H, 3° untranslated region and M138M21 phage derived It contained a small segment of polylinker sequence. After agarose gel purification , this fragment was inserted into the linearized vector Bluebac III (Invit rogen, San Diego, California). The ETL promoter drives the expression of the E. coli β-galactosidase gene. Baculovirus sequences of the genome for homologous recombination located in, and in this case ICAM-RLI, a polyhedron promoter that drives the expression of the target gene It was used as a transfer vector containing -. Bluebac III vector was prepared as follows and then ligated. I turned on. 3μg of supercoiled plasmid DNA was added to 20 units of Hin Digested with D111 endonuclease (Boehringer). centre After ethanol/chloroform extraction and ethanol precipitation, the DNA precipitate was Klenow DNA polymerase buffer; final concentration 33 μM dATP, dGTP , dCTP, dTTP; 2 units of Frenow DNA polymerase (B oehringer) and incubated for 60 minutes at 37°C. Repaired the end of the molecule. This repair reaction is caused by phenol/chloroform extraction and and ethano were added and incubated at 37°C for 60 minutes. Part of the ligation reaction of ICAM-Rtl insert and linear plasmid. , transformation of electrocompetent XL-1 E. coli (Stratagene) Separately, individual colonies were plated on LB plates supplemented with 60μ/ml carpenicillin. I selected it. Twelve individual isolates were treated as Pst I or B for diagnostic purposes. The analysis was performed by digesting minipre-knob DNA using coR1. expected One isolate showing a similar banding pattern was identified as pBBIIl, ICAM-Rtl. I named it. pBBI! 1. ICAM-Rtl DNA transduction and infection 5 f-9 cells (Invitrogen) were incubated with TNM-PH in a spinner flask. [Added 10% heat-inactivated fetal bovine serum and 10 μg/ml gentamicin] Brace medium (Gibco, crand Island, =+L-E-ri) The cells were kept at 27°C in a forced-air incubator. Spinner hula The Sco Impeller rotates at 60 rpm on an insulated 5-place stir plate. It turned. 5f-9 cells (1,5-2. 5 x to'/ml) were subcultured regularly, twice a week. 5f-9 cells in logarithmic growth phase were placed in TNM-FH medium (2X 10' cells/ 60 mm dish) and incubated at 27°C for 1 hour. After this, kill the following mixture. Prepare in sterilized polystyrene tubes and incubate for 15 minutes at room temperature. + 1 ml TNM-PH medium, 1 μg linear AuLograha da lifornica nuclear polyhydrosis virus (ACNPV, vacu cJ virus) ) Genomic DNA (InviLrogen), pBBIIl of 31, IcAM -Rtl DNA and 20 μl of stock cationic liposome solution (Inv iLrogen). As a control, pBBITI ICAM-RLI DNA Instead, two separate mixtures (differentiated by the presence or absence of pBluebacll I ) was prepared. Remove the medium from the inoculated plate and add 2 ml of Brace medium. and incubated for 2 minutes. Remove all medium from plate remove and place one drop of the DNA/liposome mixture onto the cells of each plate. Added one by one. One plate contained TNM as a mock transduction control. - Only FH medium was added. Next, place the plate at 27°C, shaking it occasionally. Incubated for 4 hours. After this incubation, add 1 ml of TNM- PH medium was added to the plate. After further incubation for 48 hours, The transduction medium containing the viruses is removed and these virus stocks are added to the For marker identification, plates of 5f-9 cells were used to infect. S'-9 cells were placed in TNM-FH medium at 2 x 10' cells/60 mm dish. and allowed to attach for approximately 1 hour at 27°C. The medium was removed.　 Several ten-fold dilutions were made from each virus stock and each l Add μl of the dilution to one dish of adherent 5f-9 cells and at 27°C for 1 hour. Incubated for a while. After removing the virus inoculum, remove the cells from each dish. On top, 3 ml of TNM-FH medium, 0. 625% low melting point agarose CBRL Co., Ltd. Gaithersburg, Maryland) and 300 μg/+nl Halogenated hydryl-β-D-galactosidase (Bluo-gal, BRL Co., Ltd. ), which had been heated to about 30°C in advance, was layered and heated for 1 hour. It was allowed to solidify at room temperature. Next, wait until a blue color appears on the plate (typically 4 to 5 minutes). day) was incubated. Recombinant virus (β-galactosidase is expressed) The coloring substance Blue-gal converts into a blue precipitate in infected cells. 24 plaques (identified by -9 cells (2X 105/ml) were seeded into individual wells of a 24-well cell culture plate. Moved to Le. After 5 days at 27°C, the medium was collected and 1. At 000rpm, Microcentrifuge for 5 minutes at 4°C and transfer the resulting supernatant to a new tube. . These stocks are named BacR, P1 stocks, and each has an isolation number. given a number. BacR, PL stock was analyzed by antigen capture (BLISA) to identify ICAM-R. The production was analyzed. Anti-ICAM-R monoclonal antibody 26110E-2 (see Example 10) was biotinylated as follows. 1 mg /ml of monoclonal antibody 26110B, l/10 volume of LM NaC0, added. NH3-Biotin (Sigma Chemica 1, S [. Louis, MT) with dimethyl sulfoxide (DIIISO. (Mallinckrodt, Paris, KY) at 1 mg/ml. I understand. Add 180 μm biotin solution to 1 mg of each antibody and incubate at 4°C. Centrifuged in the evening. This biotinylation reaction was carried out at 4°C for 16 hours with three changes of PBS. It was stopped by dialysis. 96-well well for analysis of BacR, PL stock Each well of the plate was treated with monoclonal antibody 26E3D (10 μg/ml). 50 al) for either 2 hours at 37°C or 16 hours at 4°C. Ta. The coating was then aspirated and the wells washed twice with PBS. 20 wells Blocked with 0 μl of 1% BSA in PBS for 30 minutes at 37°C. Bac Two 10-fold serial dilutions of the R,PI stock were prepared in PBS. BacR, Take 50 μl from the PL stock (as is) or diluted solution and add to the wells. , and incubated for 30 minutes at 37°C. After washing twice with PBS, 50 μm of a l:250 dilution of biotinylated 26110E in 1% BSA/PBS. wells and incubated for 30 minutes at 37°C. 3 times by PBS After washing, bind to streptavidin and dilute at 1:4000 in 1% BSA/PBS. Add 50 μm/well of horseradish peroxidase diluted to 37 μm/well. Incubate at ℃ for 30 minutes. After washing twice with PBS, 200μm/ Add substrate buffer containing ABTS (Zymed) to the wells and incubate at room temperature. , and incubated until a color reaction appeared. Automatic plate re-installation Measurements were made using a radar at a wavelength of 410 ron. The highest expressing soluble ICAM-R as determined by the antigen capture assay described above. Four were selected for plaque purification. And the BacR of these isolates , PL stock was diluted by 10-fold serial dilution and plated with agar top layer.　 Isolate one blue plaque from the highest dilution and add 1 ml of TNM-F) 1 medium, vortex vigorously, and serially dilute for further plaque isolation. did. Select the final plaque isolate, excluding all wild-type baculovirus. T-25 cells were selected and seeded with 2X10'' 5f-9 cells in TNM-FH medium. collected in a flask. After incubation at 27°C for 5 days, the medium was Collected by centrifugation at 1200 rpm for 5 minutes and 4 ml supernatant (B ac-R, P2 stock) was seeded in 500ml with 2X10' cells/ml. of TNM-FH into a glass spinner flask. moreover After 5 days of incubation at 27°C, the infected medium was transferred to looorpm The mixture was centrifuged for 5 minutes and collected. Store the supernatant at 4°C and store BACR, P3 stock. It was cool. Calculate the titer of this BACR, P3 stock with a portion of the 10-fold serial dilution. Plate on adherent 5f-9 cells and add 300 μg/ml B Iuo-ga I (BRL) in TNM-FH. Top layer with 625% agarose. It was measured by After incubation at 27℃ for 4 days, the plaque The number of cells was counted and the titer was determined. Infection for expression of soluble ICAM-R protein: 1. 5L EX/Ce 1l 401 medium (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas) A 3L flask containing 5f-9 cells (2x BACR, P3 virus stock to 10'/ml) multiplicity of infection (moi) It was infected at 5. After 4 days, collect the medium and cleave the cells by centrifugation. It was separated from Soluble ICAM-R protein was extracted from insect cell culture as follows: It was purified as follows. 4ml of IMTris-CI pH 7,5 each at 200% +ol of insect cell supernatant and incubate with lentil at approximately 35 ml/hr at 4°C. ・Lectin Sepharose (Pharmacia, Uppsala, SW) 3. 5 ml or less of the solution was sent onto the column. This column is set to 2 in advance. 0mM Tris-CI pH 7,510, 1M NaCl (equilibration buffer) It was in equilibrium. After mounting, the column was washed with 25 ml of equilibration buffer. . Next, the column is 0. 11ml containing 2M methyl alpha-romanopyranoside Elution was carried out with equilibration buffer. The eluted solution contains soluble ICAM-R. there was. Partially purified soluble ICAM-R protein was purified by LF as described in Example 8. 5KW pretreated with phorbol ester to activate A-1-dependent adhesion. Binding to 3 cells was analyzed. After adjusting the lectin eluate to 25mM carbonate pH 9.6, ICAM-R Proteins were placed on a 96-well Imron 4 (Dynatech) plate. Coated and incubated overnight at 4°C. Wash the plate twice with PBS Clean and block with 200 μm/well PBS, ]% BSA for 30 min at 37°C. and washed again with PBS before adding cells. 5KW3 cells without serum Washed in RPM (Gi bco) and washed with Calcein-AM (Mol ecular (Probes) and stimulated with PMA. next, Cells were added to the plate and incubated for 1 hour at 37°C. plate Invert and incubate in prewarmed PBS, 1% BSA for 30 minutes. . Then, the plate was taken out and half of the volume in each well was aspirated. Next, Rates were scanned with a fluorescence microscope and an automatic fluorescence reader. The analysis results are ICAM-R Demonstrates adhesion of phorbol ester-activated leukocytes to protein-bound plates. I testified. Inv to identify antibodies or other components that modulate the activity of ICAM-H itro analysis can also utilize soluble ICAM-R. For example, such assays may be performed using IcAM-R or the natural protein to which ICAM-R binds. Immobilize the ligand, detectably label the unimmobilized binding target, and bind were incubated with the target and bound under conditions in the absence of test compound. A decrease in the amount of label bound in the presence of the test compound as compared to the amount of label binding by means indicating that the test agent is an inhibitor of ICAM-R binding. determining the effect of the test compound on the amount of labeled label. The above analysis Functional β2 leukocyte integrin that can be used in the method is described by Dustin et al. , C3HSymp, Qual, 54: 753-765 (1989) has been done. In the following preliminary experiments, purified soluble ICAM-R was transferred to polystyrene beads. Purified leukocyte integrins that can bind and coated on plastic surfaces and thus identify modulators of ICAM-R binding. The basis of the law is provided. Purified soluble ICAM-R according to the instructions for use. , - night, 6 μm fluorescent polystyrene beads (Polysciences, Inc. , Warrington, Pennsylvania), and Beads were blocked with BSA. The replica wells of the 96-well plate were The produced LFA-1 (CD18/CD11a), Mac-1 (CD18/CD11 b) or coated with a diluted solution of Gp 150,95 (CD1B/CD11c). Ta. After blocking the wells with BSA, plate the plate with buffer alone or with anti-CD18. Incubate with buffer containing antibody (60,3). Divide ICAM-R coated beads into wells and incubate for 1 hour at room temperature. and place in a PBS-D tank to remove unbound beads from the wells. there was. Fluorescence remaining in the wells was removed using Cytoflour 2300 (Milli pore, Bedford, MA). Parallel The leukocyte integrin preparations of LFA-1 or Mac-1 were coated with fluorescent polypropylene. ICAM-R was immobilized by coating on tyrene beads. Example 12 The functionality of point mutations in the IcAM-R extracellular immunoglobulin-like region (i.e., Point-mutated soluble ICA for rapid screening of receptor binding A system was employed in which M-R molecules were expressed and purified. This system is Polyhistidine moiety fused to the amine or carboxy terminus of the sample protein (Hochuli et al., Bio /Technology, 6: 1321-1325 (1988)).　 The utility of this system for protein purification under natural conditions has been demonstrated. (Janknecht et al, Proc, Na11. Aca d, Sci, USA, 88:8972-8976 (1991)). pcDNAlamp (InviLrogen), but pC365,1 0 contains Alast and Thr3g rather than wild-type GILI37 and Thr3g. 5ers *contains point mutations encoding each of them] for the initial study. Using. These DNAs contain the entire extracellular region of ICAM-R (amino acids -29 to + 454) was digested with 5ail and -EcoRI and the fragments were run on gel. I let go. Two complementary oligos encoding wild-type residues 5eras< and Ser<ss Nucleotides are synthesized, followed by an α-helix turn, followed by six histidine residues. GIY<ss, Pr04st, and GI to excite translation start and end codons. Y4ss was introduced. What is the oligonucleotide sequence? An oligonucleotide containing a 5ac1 site and an Xba1 site at the end is linked to the extracellular region. concluded. In a series of connections, 1/2 unit to phosphorylate the 5° end of synthetic NA This improves the ligation effect. Second In the eye ligation reaction, prephosphorylated oligonucleotides are used. Koro Restriction enzyme digestion analysis and ICAM-R specific oligonucleotide primer screened either by PCR using . DNA sequences were obtained for several clones. The obtained plasmid , p57. 1wL old S6 and pes, named 10E37THis6. CO5 cells were plated in 10 cm dishes, and 10 ttg of purified plasmid DNA was added per dish. The DEAE dextran method with serum-free DMEM was used to Proceed cell growth to a degree of approximately 50% where transformation or pseudo-transformation occurs. Melt. DMEM with fetal bovine serum added after a short DMSO shock Cells were incubated at . After 24 hours, change the medium and leave for 4 days. Cell aggregates were allowed to continue to form over a period of time. Add the final medium to the cells removed from the monolayer, centrifuged at 11,000 rpm to remove cells, and It was stored at 4°C until applied to column chromatography. Ni”-nitrilotriacetic acid (Ni”-NTA) agarose affinity column chromatography Ja This was carried out according to the method described in Knecht et al. Same as medium Amount of buffer A (830mM NaCl, 34% glycerol, 1. 6mM immi dazole) to the medium and mix the mixture for 10. 000Xg for 10 minutes at 4℃ Clarified by centrifugation. 1 ml Ni”-NTA agarose bead suspension per 16 ml buffered medium sample (50%) (Qiagen) was subjected to gentle vibration at 25°C for 30 minutes. By doing so, 3. 3ml of 0. It was pre-equilibrated with 5x buffer A. The beads were pelleted by centrifugation at 600 rpm and most of the supernatant was removed. Bi of a new 0.5ml volume with a total volume of 3ml. Resuspend in 5x buffer A and add 1 ml of it. Cleared, buffered media samples were dispensed. Subsequent preparations were performed at 4°C. Each culture medium was constantly stirred for 60 minutes. A disposable 10ml polypropylene column was used to enclose the sample and beads. (Biorad) and the column passages were collected. And Bee 0. 9 column volumes (4.5ml) of buffer D with 8mM imidazole added (10mM HEPES pH 7, 9, 5mM MgC1z, 0. 1mM ED TA, 50mM NaCl, lmM dithiothreitol, 17% glycerol Washed with water. Then, the beads were added to 9 column volumes with 8mM imidazole. twice with 5 column volumes of buffer containing 40 mM imidazole. and twice with 5 column volumes of buffer containing 80mM imidazole. did. 200 μl of each fraction was assayed for ICAM-R immunoreactivity according to the instructions for use (Pierce). ) according to enzyme-linked immunofiltration analysis (ELIFA) in 96 wells. analyzed. Purified monoclonal antibody ICR4,2 (5 μg/ml) (Example 13) as the first detection agent, and purified goat anti-mouse horseradish Biperoxidase (Boehringer Mannheim Biochem icals) (1:500) was used as the second antibody. Proceed with the analysis using the soluble substrate ABTS (Zymed) according to the instructions for use. , and a DynaLech plate equipped with a 410 nm test filter. Measurements were made using a reader. As a result, ICAM-R immunoreactivity or the first 40 It was significantly observed in the sample washed with mM imidazole. Peak fractions from wtHis6, E37His6 and pseudotransformants were Using a ntricon 30 (Amicon) centrifugation unit, about 6. It was concentrated 5 times. The obtained concentrate was divided into an equal volume (0.34 ml) using PBS-D. ) was adjusted. Add carbonate buffer pH 9,6 or 40mM imidazole Control soluble ICAM-R (15 Mg/ml) in buffer solution (Example 11) was prepared. Add 50 μl of protein solution to 96 wells to coat the wells. Divide into each well of a plate (Immulon 4, DynaLech) and untreated cells, PMA-treated cells, and anti-CD18 monoclonal anti- Cells treated with 5KW3 (60,3) were used to induce the binding of 5KW3 as described in Example 11. An analysis was conducted regarding the From the test results, wild-type histidine-tagged protein (wtHis6) It was found to function as an adhesion ligand for KW3 cells. Example 13 Ba immunized with NS-1 myeloma cells and a human cell line expressing IcAM-R. ICAM-H-specific monoclonal clones were obtained from fusions with pancreatic cells of 1b/c mice. A null antibody was prepared. Monoclonal antibody, fusion 26. 42. 43. 46 ．． Four different fusions were prepared, designated 56 and 63. A. Immunization of mice For fusion 26, five 6-12 week old Balb/c mice (Charle s River Biotechnical 5 services, Wilmi ngton? Sachusetts, IACUC #901103), HL-6 0 cells, and an anti-ICAM-R monoclonal antibody was prepared. Day 0 Blood was collected from the retroorbital region of two Ba1b/c mice for the collection of immune serum. It was. On the second day, each animal received 0. A total of 6 x 10' HL-60 cells in 5 ml ( 0.1ml s, c, and 0. 4 ml i, p,) was given. The second time, 9. Immunization with 5×10 HL-60 cells was also performed on day 28. Ta. Immune serum was collected, blood was collected from the retroorbital region on the 35th day, and FAC3 (F The ACS screen was tested with IcAM (described in detail in Section 0 below) The reactivity towards the -R transductants was investigated. Based on these results, both maps On day 51, mice were immunized for the third time with 6.5 x 10' HL-60 cells. , and pancreatic cells removed under sterile conditions from one animal (#764) on day 54. I performed the fusion. For fusion 42, blood was collected from five each mouse on day 0 and then intraperitoneally. from 0.0001 containing 50 Mg of adjuvant peptide (Sigma). 5ml P Immunizations were made with 5X10' 5KW3 cells in BS. Similarly to the mouse Booster immunizations were given on days 21 and 42. 10 days after the third injection, the mice Blood was collected from each patient and the immune serum was tested by FAC3. To mouse #843, A final boost was given on day 64 with 5KW3 cells. Sterilize the pancreas after 3 days I took it out in a state. For fusion 43, blood was collected from each of the five mice on day 0 and then intravenously. The red-white blood sputum cell line was immunized with 5×10' cells derived from 562.　 Each mouse was given 1.5 μm in 150 μm daily for the next 2 days. 5mg cyclophosph Amamide was injected intraperitoneally. On day 10, 5K with adjuvant peptide WIO cells were injected similarly to fusion 42. On day 30, mice were given an additional 5 62 cells were boosted and then injected with cyclophosphamide. On day 42, mice were boosted with 5KW3 cells containing adjuvant peptide. . Mice were bled on day 56 and immune sera were tested on FAC3. 7 On day 8, mouse #1021 was challenged with 5KW3 cells and adjuvant peptide. A final booster immunization was performed. Three days later, the pancreas was removed under sterile conditions. For fusion 46, mice (#900) were prepared as described for fusion 42. I was immunized like that. On day 128, mice received approximately 4XIO' Macaca ne A final boost of meSLrina spleen cells was given. Single cell suspension of monkey spleen The product was prepared as described in the next paragraph. Precipitate the monkey cells and perform the following Red blood cells were resuspended in hemolysis buffer of: 0. 15M N84CI2, IM KH CO, 0.1mM NaJDTA. pH7,2~7. 4゜ After hemolyzing the red blood cells, pancreatic cells were washed twice with RPMI and PB. Washed once with S. Finally, the cells were treated with 40 mg containing 50 Mg adjuvant peptide. It was resuspended in 0 μl of PBS and injected. After 3 days, the mouse pancreas was sterilized. I took it out. For fusions 56 and 63, mice (#845 and #844) were incubated on day 64. Same as described for fusion 42, except omitting immunization of 5KW3 cells. immunized against. Instead, these mice received supplementation on days 158 and 204. Boosting of 5KW3 cells in PBS with auxiliary peptides was carried out for 128 and 1 On day 77, 0.05 mg containing 50 Mg of supplementary peptide. Maca in 5 ml of PBS An intraperitoneal injection of Ca nemestrina was performed. For fusion 56, mouse Step #845, 2. 700 containing 24 μg of soluble ICAM-R (Example 11) μm of PBS was administered iooμm intravenously and the rest by intraperitoneal injection. . After 4 days, the pancreas was removed aseptically. For fusion 63, on day 226 , mouse #844 was isolated from Macaca as described for fusion 56. nemestrina and, on day 248, 50 Mg of soluble ICAM- Immunizations were made with 100 μl of complete Freund's adjuvant containing R.　66μg Mice were injected intravenously with 100 μM of PBS containing soluble ICAM-R. This was the final treatment. After 4 days, the pancreas was removed aseptically. B. Fusion Briefly, single cell suspensions were collected from two pancreases from each mouse pancreas. prepared by grinding between the white edges of a glass microscope slide. this Slides were prepared with 2mM glutamine, 1mM sodium pyruvate, 100 units. Ni-/ml penicillin, and 1100 t1/ml streptomycin (G in serum-free RPMI 1640 (Gibco) supplemented with Soak. This cell suspension was passed through a sterilized 70 mesh N1Lex cell filter (Bec Lon Dickinson Co., Parsippany 1 New Chassis) Filter and centrifuge at 200g for 5 minutes to remove the precipitate into a 20ml volume. Washed twice by resuspending in RPMI without serum. 3 animals Thymic lymphocytes from normal Ba1b/c mice were similarly prepared. For 3 days before fusion, 11% fetal bovine serum (FBS) or fetal clone (Hy N5-IE Elo maintained at logarithmic growth phase in RPMI containing (clone) The tumor cells were centrifuged at 200 g for 5 min and the precipitate was as described in the previous paragraph. Washed twice as described above. After washing, each cell suspension was diluted with serum. The final volume is 10ml with no RPMI, and 10μm with Igloo. diluted to Take 20 μl of each dilution and add 20 μl of 0. 85% physiological saline (Gib 0.co) Mix with 4% trypan bluestein and analyze with hemacytometer ( BaxLer Healthcare, Deerf 1eld, Illinois) ” and measured it. A sample of 2 x 10'' immune cells was combined with 4 x 107 N5-1 cells and centrifuged. Separate and aspirate the supernatant. Precipitate cells by tapping the tube Loosen and add 2 ml of 37°C PEG 1500 (75mM Hepes, pH 8.0). 0%) for 1 minute without stirring, then serum-free RPMI 14ml was added over 7 minutes. Add another 16 ml of RPMI and stir the cells. Centrifuged at 200g for 10 minutes. After discarding the supernatant, the precipitate was diluted with 15% FB. S or fetal clone, 100 μM hyboxanthin sodium, 0. 4μ M aminopterin, 16 μM thymidine (HAT) (G 1bco), 25 uni cut/ml IL-6 (Boehringer) and 1. 5 x 10' pieces Resuspend in 200ml RPMI containing thymocytes/ml. Suspension 10 200 μl/well was distributed into 96-well flat bottom tissue culture plates. Add it to the cells in the plate using an 18G needle (Beckon Dickinson). Take approximately 100 μl from each well and add 100 μl/well of plating medium ( As described above, except that it contains IL-6 (10 units)/ml and lacks thymocytes. After fusion, typically by adding 2. 4th and 6th The eyes were fed a total of three times. C. Screening When cell growth reaches 60-80% confluence (days 8-10), fusion 26 and Culture supernatants were taken from each well of 42 and 42, and pooled in columns or rows. The parent cells (fusion 26) or the parent cv-i cells (fusion 4) were then isolated by FAC3. 2); (negative control) and L cells transduced with ICAM-RDNA (fused Fusion 26) or CV-1 cells (fusion 42) were analyzed. To put it simply: , transduced and untransduced cells or CV-1 cells were treated with EDTA ( Versene) treatment and cells were removed from plastic tissue culture vessels. The cells were harvested from the culture by gentle scraping. Cells were treated with Ca2+ and Mg Wash twice in Dulbecco's PBS containing rFA buffer (D-PBS or or RPM11640, 1% BSA, 10mM NaN5). Wash once and plate 1. 5-2. 0x105 cells/1 Distributed at a ratio of 00 μl FA buffer/well. At this point, the analysis should be carried out at 4℃. continued. Cells were pelleted in a clinical centrifuge at 4°C.　Each well Carefully aspirate the supernatant from the plate and tap all parts of the analytical plate. The precipitate was broken by Add 100 μl of the hybridoma supernatant pool to 12 Add well by well using a channel pipetman. Monoclonal antibody 4 on both parental and transduced cells. Incubated for 1 hour at °C. Next, place the analysis plate as above. Washed twice with FA buffer. The final wash was prepared in FA buffer. F(ab’) of anti-mouse IgG (complete molecule)-FITC conjugate (Sigma) ) Two pieces were exchanged with 50 μl/well of a 1:1OO dilution. The analytical plates were incubated for 45 minutes at 4°C, protected from light. Next Then, prepare the analytical plate containing only NaN5 (i.e., no BSA). Wash twice with D-Pus in the same manner as above, and add 200 μl/wool of the final washing solution. EL D-1% paraformaldehyde in PBS. Next, the sample is Flow cytometry on Beclon Dickinson FACscan analyzer For tri-task analysis (FAC3), pipet with a multichannel pipetman. Transferred to a ethylene tube. Fusions 43 and 46 were first screened by antibody capture ELISA and Hybridoma supernatants were tested for the presence of mouse IgG. imsilon 4p Rate (Dynatech, Cambridge. Massachusetts) in 50mM carbonate buffer, pH 9.6 at 4°C. 50μI/well of goat anti-mouse IgAXIg diluted to 1:5000 G or IgM (Organon Teknika, Durham, Nord) Carolina). Plate 3 times, 0. 05% Tween 2 0 in PBS (PBST), and 50 μM culture supernatant was added. After incubation at 37°C for 30 minutes and washing as described above, PB 50μm horseradish peroxidase diluted l:3500 in ST goat anti-mouse IgG (fc) (Jackson 1mmunoRe search Inc., West Grove, PA). Pre cells were incubated as above, washed 4 times with PBST, and incubated with 1 m g/ml o-phenylenediamine (Sigma) and 100mM citrate, 0.0 in pH 4,5. 100μI of 30% hydrogen peroxide at 1uL/ml of substrate was added. The color reaction is stopped in 5 minutes by adding 50 μm of 15% sulfuric acid. I let it happen. A4911 was measured using an automatic plate reader. Fusions 56 and 63 were first screened by antigen capture ELISA. Ta. Imron 4 plate (DynaLech) with 50mM carbonate buffer Add each diluted well to 1100n of 2683D Fab' (see section F below). , coated overnight at 4°C. Prepare the plate at 100 μm/well containing 2% BSA. The cells were blocked with PBS for 1 hour at room temperature. After aspirating the plate, the soluble The culture supernatant containing ICAM-R was diluted with PBST for 1. diluted to 8 and 50 μI / well. After incubating for 1 hour at room temperature, the wells were washed three times with PBST and Add hybridoma culture supernatant at μI/well and as described above. , plates were incubated again. Wash the plate three times and rinse with PBST. : 50μI/well peroxidase conjugated goat diluted to 3500 Anti-mouse IgG was added. The subsequent analysis was performed as described in the previous section. D Subcloning Supernatants from individual wells at the intersection of positive columns and rows (fusions 26 and 42) ), or supernatants from individual wells producing IgG (fusions 43 and 46). ), or have reactivity with soluble ICAM-R (fusions 56 and 63) Wells were rescreened by FAC3 the next day. L cell or I Cells transduced with CAM-R DNA were screened for antibodies to fusion 26. CV-1 cells or CV-1 cells transduced with ICAM-R DNA Cell fusion 42. 43. 46. Screening for antibodies derived from 56 and 63 It was used to 29 wells (26E3D-1, 2623B, 26) 13G , 26H11C-2, 2618F-2, 261108-2, 26110P142 C5H, 42D9B, 43H7C, 46D7B, 56D3B, 5614E, 63A10B, 63C3F, 63C11A, 63E9G, 63E12C, 6303G, 63) 161L 631+98. 6311C, 6316G, 63 112F, 63G4D, 63EllD, 63H4C) compared to control cells. AM-R transductants stained well. These wells were filled with RPMI, 15% P BS, 100 μM hyboxanthin sodium, 16 μM thymidine, and lO nits/ml by 2-fold dilution in IL-6 (Boehringer) and subcloned 2-3 times in succession. After 4 days, subclone plate Visually assess the number of wells and note the number of colonies in the lowest density well. I recorded it. The wells selected for each cloning were subjected to FA after 7 to 10 days. Tested by C3. Activity was retained in nine systems [26F! 3D-1 (ATCCHB 11053), 26811C-2 (HB 11056), 2 618F-2 (HB 11054), 26110E-2 (ATCCHB 110 55), 42C5H (ATCCHB 11235), 4209B (ATCCH B 11236), 43H7C (ATCCHB 11221), 46D7E ( ATCCHB 11232), 46112H (ATCCHB 11231), 63 E11D (ATCC) IB 11405), 63G4D (ATCCHB 114) 09), 63H4C (ATCCHB 11408), 63H6H (ATCC) IB 11407), 6311C (ATCCHB 11406), and 6 3I6G (ATCCHB11404)]. In the final cloning, a single Positive wells containing Ronnie were expanded in RPMI containing 11% FBS. Hive Example 1 The names given to monoclonal antibodies produced by ridoma It is shown in Table 4 of 4. E, with characteristics The monoclonal antibodies produced by the above hybridomas were analyzed by ELISA. They were divided into types based on analysis. Imron 4 plate (DynaLech), Diluted 1:5000 in 50mM carbonate buffer, pH 9.6, 5 0 μl/well of goat anti-mouse IgAS IgG or IgM (organon protein). Kunica) at 4°C. Plates were blocked with 1% BSA in PBS for 30 minutes at 37°C and 0.5% BSA in PBS. 0 Wash 3 times with PBS containing 5% Tween 20 (PBST) and add 50μ 1 of culture supernatant (1=10 diluted in PBST) was added.　Ins like above After incubation and washing, 1:1 with PBST containing 1% normal goat serum. 50 μl horseradish periosidase conjugated rabbit diluted 1000 Added anti-mouse IgG+, G2a, czb or Gs (Zymed) . Plates were incubated as above, washed 4 times with PBST, lmg/ml o-phenylenediamine in 00mM citrate, pH 4,5 (Sigma) and 0. 100 μl of 30% hydrogen peroxide at 1 μm/ml Substrate was added. The color reaction was stopped in 5 minutes by adding 50 μl of 15% sulfuric acid. Ta. A49° was measured using a plate reader. Isotype of monoclonal antibody It is shown in Table 11 of Example 21. Monoclonal antibodies against ICAM-RSICAM-1 and ICAM-2 Control cells and IcAM-R or ICAM-I DNA using The cells transformed with FAC5 were analyzed by indirect fluorescent antibody staining. The dyeing is , performed as described for FAC3 analysis in Example 10c. At this time, per 5x105 cells, 0. 1 ml hybridoma culture supernatant (anti- 1cAM-R) or 1Mg of pure monoclonal antibody (anti-I CAM-1 Alternatively, ICAM-2) was used. The results of this analysis are shown in the histogram ( 10' cells analyzed). Anti-ICAM-R antibody 26H 1IC-2 specifically bound to cells transduced with ICAM-R cDNA. However, it did not bind to parental cells or ICAM-1 transduced cells. I CAM-R is an antibody against ICAM-1 (Edward C1ark, Wa against monoclonal antibody LB2) or ICAM-2 from Shington University. Antibody (IC2/2. Biosource Genetics, Vacav ille, California) did not react. In parallel experiments, anti- ICAM-R monoclonal antibodies 26E3D-1, 26110B-2, and 2 618F-2 was tested against transductants with monoclonal antibody 26811C-2. showed similar reactivity. Anti-ICAM-R antibodies 42C5H, 42DF9B, 43H7C, 46D7B and 46112B antibodies were also transduced with ICAM-R. It reacted specifically with the injected cells, but the parental CV-1 cells or ICAM-1 type It did not react with transfected CV-1 cells. Macaca fascicularis, pig or dog peripheral blood leukocytes PAC3 analysis of indirect fluorescent antibodies was performed using nine anti-1cAM-R monoclonal antibodies. It was done using 20ml heparinized Macaca fascicular Dilute 20ml of is or pig blood with 280ml of red blood cell lysis buffer. , incubated for 3-5 minutes at room temperature, and centrifuged at 200 g for 5 minutes. The supernatant was discarded. Wash the precipitate once with cold D-PBS containing 2% fetal bovine serum. , cells were counted with a hemacytometer. 20ml of heparinized dog blood , double the volume of waymouth with 2% non-essential amino acids (NEAA) culture medium (Gibco). Add 5 ml of blood solution to 4 ml of each It was layered on Histobark (Sigma) and incubated at 1000g for 20 minutes at room temperature. The heart was separated. Collect the cells from the middle surface and place them in Waymout containing 2% NEAA. h and counted as described above. Each population of cells was stained as described in Example 13C and FAC 5. Hybridoma cell line 26110E. Produced by 46112H, 63H4C15614E, and 63112F The anti-ICAM-R antibody specifically stained monkey PBL, but the other seven antibodies No specific staining was observed. Specific for pig or dog PBL There was no antibody that stained. Hybridoma cell lines 63AIOB, 63E9 Anti-IC produced by G, 63E12C, 63G3G, and 63H9H AM-R antibody was not tested. F, ha Hives containing anti-1cAM-R monoclonal antibodies listed in Table 11 of Example 21 1. Ridoma culture supernatant. 5M glycine, 3. 0M NaCl 5p88. at 9 and onto a protein A column (Sigma) with a head volume of 2 ml. I posted it. 1. 5M glycine, 3M NaCl, pl+8. After washing at 9. The column was washed with 100mM sodium citrate, p114. It eluted at 0.　1ml The fraction of 100ul of 1. Collected on 5M1-Lis, pH 8.8. A2*o Both fractions containing the determined antibodies were pooled and dialyzed against PBS. G, affinity Nine purified anti-ICAM-R monoclonal antibodies were serially diluted and ELI for binding to a defined amount of soluble ICAM-R (Example 11) coated on Analyzed by SA method. The analysis results are shown in Table 3 below. The highest binding at the monoclonal antibody concentration below or 50% is considered high affinity; and the highest binding of 50% at monoclonal antibody concentrations exceeding 1 μg/ml. were defined as having low affinity. Blackwell, Immunochemistry in Practi ce, Johnstone et in Oxford Press (1982) hybridoma 26E3D, 26 by the method described in al., p. 52. Monochromes produced by 110B, 42D9B, 43H7C, and 46D7B Fab' fragments were obtained from the local antibodies. Example I4 The ICAM-R specific monoclonal antibodies listed in Table 11 of Example 21 were assembled into Regarding inhibition of binding of JY cells (CD18'') to recombinant soluble human ICAM-R Tested. Adhesion analysis was performed as described in Example 12. cell was treated with PMA, and the antibody was added to a final concentration of 10 Mg/ml. 3 Two independent experiments were performed and data were collected in triplicate. Total CD18-dependent binding Anti-CD18 monoclonal antibody 60. Determined as adhesive I blocked by 3. Established. Below is the percentage of total CD18-dependent binding inhibited by each monoclonal antibody. Table 4 shows the monoclonal antibodies produced by each hybridoma in the table. The name given to it is used. The name of the monoclonal antibody will be used in the following examples instead of the hybridoma. and use it consistently. Human peripheral blood leukocytes or 5KW3 cells (both cells expressing IcAM-R) ), monoclonal antibody 1cR- 4,2 and ICR-1,1 are immunologically related to distant epitopes of ICAM-R. It was shown to be reactive. In the analysis, normal peripheral blood Ficoll-hyberk Human peripheral blood leukocytes (PBL) obtained by centrifugation were added to ice-cold FAC3 buffer. (PBS containing 0.1% sodium azide and 1% bovine serum albumin) Washed twice. Then, 5 2XIO cells were treated with 5 μg of ICR-4,2,I cR-1,1, and control isotype IgG (Sigma), respectively. They were incubated in triplicate in polypropylene tubes. First step antibody All tubes containing the tubes were then incubated for 30 minutes at 4°C and incubated with cold FAC8. Washed twice in buffer. To each of the three tubes, 5 μg of each of the second stage antibodies listed below was added: Biotinylated ICR-4,2, biotinylated ICR-1,1. Biotinylated anti-U1-CD4 (negative control). All second stage antibodies are Biotinylated according to standard procedures as described in Example 13 and all tubes , then incubated for an additional 30 minutes at 4°C and washed twice in FAC3 buffer. Purified. Next, streptavidin-phycoerythrin (Southern Biotechnology, Inc., Birmingham, AL) l:1 0 dilution into each tube containing 50711 FAC:S buffer. and all tubes were incubated for 30 minutes at 4°C.　 Finally, all tubes were washed twice in FAC3 buffer and flow-cycled. Analyzed by tometry (FAC3can, Becton-Dickson) . Monoclonal antibody ICR-4,2 was a biotinylated antibody against ICAM-H on PBL. monoclonal antibodies ICR-1, 1 binding was not blocked. Similarly, monoclonal antibody 1cR-1,1 blocked the binding of biotinylated ICR-1,1, whereas monoclonal antibody I It did not block CR-4,2 binding. From these results, the two antibodies , were shown to recognize different epitopes on ICAM-R. below Similar results were obtained when using the human cell line 5KW3. 5KW3 cells PAC was labeled with either μg of antibody 1cR-1,1 or ICR-4,2. Wash in 3 buffer and add 1 μg of biotinylated 1cR-1,1 or biotinylated 1cR-1,1. Incubated with cR-4,2. Next, all tubes are FAC3 buffered. Wash in solution and incubate with streptavidin-phycoerythrin for 30 minutes at 4°C. Incubated for minutes and analyzed by FAC3can. In the analysis, either unlabeled antibody (“blocking” antibody) or labeled antibody IcA If binding to M-H is inhibited, it is possible to combine unlabeled or labeled antibody with ICAM. -R and that the two antibodies are identical on ICAM-R. This indicates that the same epitope is recognized. The unlabeled antibody “competes” the binding of the labeled antibody. A modification of the competition assay used to "combine and separate" also allows two antibodies to match the same epitope. Used to determine whether or not to recognize a group. Specific IcAM-R genes recognized by the various monoclonal antibodies of the invention Pitopes were mapped to the ICAM-R specific antibodies of the present invention by three different methods. The first method of mapping primary epitopes recognized by the body is multibin Peptide synthesis system (Chiron Mimotopes PLy, Inc., Vi ctoria, Australia). In this system, Ten amino acid peptides representing overlapping segments of the protein of interest were It is placed on the surface of a series of plastic bottles. Conducted modified ELISA test Then, the binding of monoclonal antibodies to each peptide was determined. EL to determine the binding of monoclonal antibodies to ICAM-R peptides ISA was performed as follows. Blocking the bottle with 200μl/well Buffer (2% weight/volume BSA, 0. 1% volume/volume Tween20. 0 ．． Place in five 96-well plates containing OIM PBS (SpH 7,2) and incubate at 20°. The mixture was incubated for 1 hour at C with stirring. Fill the bottle with 175μl/well Transfer to a plate containing undiluted anti-ICAM-R monoclonal antibody Kamiura. , and incubated overnight at 4°C with stirring. Next, turn the bottle O, Washed 4 times with OLMPBS, pH 7.2 (10 minutes at 20°C with stirring) 1 wash/1 wash) and conjugation diluent (1% v/v sheep serum, 0.5% v/v sheep serum). 1% capacity /Capacity Tween 20. 0. 1% weight/volume casein sodium salt and 0. 175 μl/well of HRP-Ya diluted with 01M PBS) to an appropriate concentration. anti-mouse IgG (H+L) (Kirkegaard and PerryL) laboratory, Inc., GaiLhersburg, Maryland). I placed it in the rate. The plate was stirred at 20°C for 1 hour, and 0. OIM PBS Washed 4 times with Add the bottle to the ABTS substrate solution [substrate buffer (17.9 g/L N a2HPa, H, 0116, 8g citric acid monohydrate, pH 4,0) 0. 5mg/ml ABTs, 0. Play containing 01% weight/volume H2O2 Transfer to a plate and stir at 20°C for 45 minutes, then read the plate at 410/495 nm. I got it. Relative reactivity with individual bottles was determined for anti-ICAM-R and control hybridoma supernatants. Differences in immunoglobulin concentrations as well as differences in positive control reactivity between analytical experiments were The decision was made based on the standardized results. The mouse IgG level of each supernatant was detected by antibody capture. It was determined by ELISA as follows. Imron 4 plate, Example 10c and washed as described. 50μI/w diluted in PBST L culture supernatant [or known concentration (') doubled in PBST? 1g of rice G1 and IgGza (MOPC-21 and UPC-10) (Sigma) ] was added to the plate. Incubate for 1 hour at room temperature and wash 3 times with PBST. After cleaning, goat anti-mouse IgG conjugated to horseradish peroxidase ( fc) (Jackson ImmunoResearch, West Gro ve, Pennsylvania) was diluted to 1:2000 for mouse IgG, and gc2. For 1. : Diluted to 1000 and added 50 μl/well. After incubating the plate for 1 hour at room temperature and washing 4 times in PBST, The remaining analyzes were performed according to the method described in Example 1oc. Antibody 1 in culture supernatant The measurement is performed by fitting the measured optical density to a standard curve of isotype-matched controls. It was decided by. The strong reactivity of monoclonal antibody ICR-1,1 is shown below, amino acid 13 Two overlapping peptides spanning ~23 were observed. Sequence number: 37 VLSAGGSLFV The region reactive with anti-ICAM-R antibody was defined using the following method, and/or proven. Ebitope mapping with anti-ICAM-R antibody also ibrary Con5truction and Screening Sy stem (Novagen, Madison, WI) I went. This method can be used to identify small peptides derived from the protein of interest. A library of bacterial clones expressing the selected polypeptide was created.　 This library was then prepared using standard colony lift methods to create monoclonal antibodies. The body was used as a probe for screening. Double-stranded DNA encoding the external region of ICAM-H (480 amino acids from I) were incubated with different amounts of DNA5e in the presence of 10 mM manganese for 10 min at 21 °C. It was excised from pVZ147 (see Example 4) using 1. The reaction was stopped with EDTA, and 1,710 volumes of the reaction solution containing ethidium bromide was added. A 2% agarose gel with appropriate markers was electrophoresed.　50～15 Reactions containing fragments in the 0 bp range were pooled and electrophoresed on another 2% gel. did. A region between 50 and 150 bp is extracted and the fragments contained therein are subjected to dialysis. tube (SPBrand 5pectra/Por 2. MWCo 12-1 4. 000), followed by phenol/chloroform extraction and Tanol precipitated. 1 μg DNA, T4 DNA polymerase and all four dNTPs The ends were blunt-ended using the manufacturer's protocol. Reaction at 75°C , stopped by heating for 10 min, then one 3°dA residue was added to TthD The addition was made using NA polymerase (Novagen). Reaction, 70 C. for 15 minutes and extracted with chloroform. 1 If starting with μg of DNA, the final concentration was 11.5 μg in 85 μm. 8ng/μm Met. The fragment with dA detail was inserted into pTOPE T-vector (Novagen). Ligated. This vector converts the insert into a stable fusion protein. , T7 DNA polymerase (this structural gene is carried on a replicon in the host cell) It was designed to be expressed by 6ng 100bp DN The ligation reaction was carried out using A (0.2 pmol) at 16°C for 5 hours. became. 1 u of NovaBIue (DE3) (Novagen) cells I (1/10) was transformed with a reaction mixture of LB agar (carpenicillin). /tetracycline) plates and an initial count of transformants was obtained.　 The remaining ligation reaction was carried out for an additional 16 hours at 16°C. the first For mounting, transfer 2 μl of the ligation reaction to a 40 μm Combitene l-N It was used to transform ovaBlue (DE3) cells. The eight plates were then divided into approximately 1250 columns for antibody screening. Expanded to knee/plate density. Colonies were denatured by dissolving them on a nitrocellulose membrane in a chloroform vapor chamber. Screening was performed using a standard colony lift method. TBST Anti-1cAM-R anti-10 diluted in Lys buffer saline/Tween) Using 1cR-1,1 as the primary antibody, alkaline phosphatase-conjugated secondary Analysis was performed using the following reagents. The substrate mixture was incubated for 30 minutes . One isolated colony showed a strong positive reaction. Three other areas (isolation Colonies that had not been tested showed a weak positive reaction. For re-screening Next, streak cultures were performed from isolated colonies or stubs of colony areas. Streak culture from isolated colonies by reprobing for ICR-1,1 has a positive reactive area after 20 minutes of incubation with the substrate. there was. Samples from the other three colony areas were negative. ICAM-R reactivity The stubs from the area were once again streaked and partially incubated at 37°C. and reprobed by incubating with substrate for 10 minutes. many IcR-1,1-reactive colonies were obtained. The proteins obtained from these colonies Lasmid DNA can be sequenced and ICR-1,1-reactive epitopes The amino acid sequence corresponding to the sample can be determined. Epitope mapping chimeric ICAM-R molecule and deletion mutant by C0 region substitution Construction of the conformational epitope of ICAM-R recognized by the monoclonal antibody of the present invention The loops can be mapped by region permutation experiments. In these experiments, ICAM Chimeric mutants of -R are prepared. The chimeric mutant is a selected rcAM-R It is prepared by fusing the immunoglobulin-like region of ICAM-1 with a portion of ICAM-1. and , this mutant was tested for binding of the monoclonal antibody of the present invention by FAC3. analyse. Figure 7 is a diagram of the chimeric protein, the construction of which is described below. It is. The protein number l is the amino terminal immunoglobulin of IcAM-R. The similar region (residues 1 to 93) was fused to ICAM-1 (residues 117 to 532). including Protein number 2 is the first two amino terminus of ICAM-R. immunoglobulin-like region (residues 1 to 190) of ICAM-1 (residues 118 to 190) 532). Protein number 3 is the first protein of ICAM-R. The three immunoglobulin-like regions (residues 1 to 291) of ICAM-1 (residue 3) 17 to 532). Protein number 1 is its counterpart in the ICAM-R and ICAM-1 coding sequences. By creating a unique μ bile region at the border of each immunoglobulin-like region 1 and 2. It was prepared by The DNA sequence of ICAM-H was prepared as described in Example 12. was subcloned into the M138M21 vector (Boehringer). , a molecule designated as M138M211CAM-R was obtained. ICAM-1 entire code [51mm0flS et al., Nature, 331:624-627 (19 88) into plasmid pBssK(+) (InviLrogen). I turned it into a loan. The obtained possK (+) ICAM-1 was transferred to Sat I and and cut with KpnI and insert the fcAM-1]-coded sequence into the multiple cloning site. It was extracted along with a short segment and treated with restriction enzymes Sal I and Kpn I. It was ligated to M139M21 cut with M138M211cAM-1. We obtained a molecule called M13 phage isolates were confirmed by DNA sequence analysis. Oligonucleotide ICAM1 for mutagenesis having the following sequence: Di , Nhel (corresponding to nucleotides 426 to 393 of ICAM-1) and and ICAMR, DINhel (corresponding to nucleotides 367 to 393) was synthesized by standard laboratory methods. When complementary to each other or annealed with the NA sequence, they form mismatched base pairs. . Both oligonucleotides have a recognition site for endonuclease Nher Introducing rank. By site-directed mutagenesis using this oligonucleotide, The sequences of these oligos were compared to the ICAM-1 and IcAM-R target DNA sequences, respectively. Introduced into columns M138M211cAM-1 and M138M211CAM-H . Several phage isolates obtained from each mutagenesis reaction were sequenced. It was confirmed that the correct DNA sequence was present. These isolates are M1 38M211cAM-R, Nhel and M138M21 ICAM-1, Nh It was named el. IcAM-R signal peptide and immunoglobulin-like region 1 coding region, It was isolated from M138M211cAM-R, Nhel by the following method. 1 0 μg purified single-stranded M13BM211cAM-R, Nhel phage DNA was attached to 50 ng of LacZ universal-20 primer (SEQ ID NO: 35). Neil did. Annealing was performed using 1x Klenow DNA polymerase buffer (10mM Tris-C1p) I 7. 5. 5mM MgCLz, 7. 5mM Dithios The mixture was incubated for 5 minutes at 65°C and then for 5 minutes at 25°C in a This was done by incubating. The following mixture was then added to the annealing reaction: dAT at a final concentration of 33 μM. P, dGTPSdCTP, dTTP, 4 units of Frenow DNA poly merase (Boehringer), and lx Klenow buffer. Primer extension reactions were performed by incubating for 45 minutes at 37°C and Extracted with phenol/chloroform (1:l) and ethanolated. Ic comprising the coding sequence for the AM-R signal peptide and immunoglobulin-like region l; The 412 bp fragment was purified by agarose gel. Contains coding regions for immunoglobulin-like regions 2 to 5, membranous regions, and cytoplasmic regions. The DNA sequence of ICAM-1 was isolated by restriction enzyme digestion. 10μg The primer-extended M13BM211CAM-1゜Nhel was injected with Nhe I and and cut with NotI. As a result, the agarose gel purified 1476bp DNA fragments were extracted. 5μg of mammalian expression plasmid DNAIAmp (Invirogen) It was digested with Dan-Ku and Not I and purified by spin column chromatography. A 20 μm ligation mixture was prepared containing the following components: Linear DNA IAmp with ng Eco R1 and Not I ends, 1100n 412bp ICAM-R fragment, 1100n (7) 1476b ICAM-1 fragment of p, lx ligase buffer and 1 unit of DNA ligase (Boehringer). Incubate the reaction solution at 25°C for 16 hours. , and used to transform competent XL-1 cells (Biorad). Ta. Transformants were added to L containing carpenicillin at a final concentration of 100 μg/ml. Selected on B plate. Transformants were subjected to standard mini-DNA pretubation methods and endonuclease analysis for substantive analysis. The analysis was performed using enzyme digestion. pcDNAIAmp, RDI 102- An isolate designated 5 was selected for expression studies. A chimeric gene encoding protein number 1 was also created by the following method. -EcoRI-IcAM-R and M of about 375 bp of IcAM-R including region 1 Restriction enzyme digestion of double-stranded (replicated form) DNA from 138M211CAM-1, and the corresponding double-stranded plasmid DNA after agarose gel electrophoresis. Filtered. The two obtained DNA fragments were subjected to EC0RI-N (■I digestion and Expression vector pcDNAI/Amp treated with intestinal superphosphate (Invitroge Cloning was performed by three-way ligation into (Company n). E. coli XLI blue (SLr Atagene) strain was transformed with the ligation mixture and transformed into Transplants were selected on plates containing carpenicillin. Cloth containing the desired insert The genes were identified by restriction enzyme digestion of plasmid DNA preparations. For construction of protein 2 and protein 3 coding sequences, only Nhe 1 site, or created between immunoglobulin-like regions 2 and 3, or A unique Afl+1 site is created between immunoglobulin-like regions 3 and 4. The preparations of M138M211CAM-1 and M13BM211cAM-R , prepared in a similar manner to the above paragraph. Four ori with the following sequences nucleotides (IC corresponding to nucleotides 686 to 713 of IcAM-1) AM-1° was completed. 15 and 17, the oligonucleotides are complementary to each other or attached to the NA sequence. When they anneal, they form mismatched base pairs. Next, the appropriate coding sequences for ICAM-R and ICAM-1 (for protein 2 , I ICA fused to the sequence encoding CAM-1 residues 118 to 532 A sequence encoding an immunoglobulin-like region at the first two amine ends of M-H, etc. and protein 3 contains a sequence encoding ICAM-1 residues 317 to 532. The first three amino-terminal immunoglobulin-like regions of ICAM-H fused to The expression plasmid pcDNAIAmp (sequence encoding ICAM-R mutant protein 2 and ICAM-R mutant protein 2 and pcDNA Amp, RDI-2,03-5 and animal DNA encoding 3 Amp, RDI-3, 104-5 was created. Gene fusions encoding protein numbers 2 and 3 were also constructed by the following method. Built. ICAM-R and IcAM to generate protein 2 encoding sequence Directs in VitrO mutagenesis between regions 2 and 3 in both -1 Nhel was introduced by an oligonucleotide. Includes areas 1 and 2 Approximately 700 bp of ICAM-H R1-digested and phosphoric acid-treated pc Subcloning by three-way ligation to DNA l/Aml + urasmid DNA did. I containing regions 1 to 3 to produce protein 3 encoding sequence CAM-H plasmid [lNA restriction enzyme digestion and agarose gel electrophoresis It was purified by These two fragments were digested with Notl and treated with phosphoric acid. Cloned by three-way ligation into pcDNAI/Am11 urasmid DNA. Ta. Clones containing inserts with the desired orientation are extracted from plasmid DNA preparations. was identified by restriction enzyme digestion. Mutants in which the IcAM-R region was deleted were added to chimeric protein numbers 112 and 3. It was created using the same method as the oligonucleotide-based mutation method described above.　 Deletion mutation of region l lacking amino acids 2 to 90 of ICAM-R (SEQ ID NO: l) body, region l and 2 deletion mutants lacking amino acids 2 to 203, and 188 A deletion mutant of region 3 lacking ~285 amino acids was constructed. Control plasmid containing full-length ICAM-R or ICAM-1 cDNA sequence The gel-purified cDNA fragment was ligated into the plasmid pcDNAIAmp. Created by Two plasmids pcDNAIAmp IcA M-1 and 1lcDNAIAn+p ICAM-R are full-length ICA M-1 and ICAM-R proteins are expressed in equivalent cellular contents, and the native The binding of monoclonal antibodies to proteins could be evaluated. Plasmid DNA encoding IcAM-R chimera or deletion mutant protein or plasmid DNA pcDNAIAmplcAM-1, pcDN AIAmplcAM-R, or I) DEAE dex using CDNAIAmp CO3 cells were transformed by the Tran method. Generally, CO8 cells are Approximately 7.0cm for a 0cm diameter plate. Seed at a density of OX 105 cells, and 10% In Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing fetal bovine serum (FBS) - Grown in the evening. The next day, the cell monolayer was washed with DMEM, and 10 μg of DMEM was added. desired plasmid DNA, O, 1M chloroquine, and 5. 0mg DE 2. LOml transformation mixture containing AE-dextran at 37°C. 5 o'clock It was exposed for a while. After incubation, the transformation mixture is removed by suction and the monolayer is was treated with PBS containing 10% DMSO for 1 minute. Cells once in DMEM Washed and incubated in DMEM containing 10% FBS. The next day, add the medium It was replaced with fresh one and incubation was continued for three more days. All chimeras and deletion mutants 1c except for mutants deleted in regions 1 and 2. Expression of AM-R protein was observed. The mutant with deletion of region 1 and region 3 is , exhibiting a level of expression of 50-60% compared to wild-type ICAM-R protein. Ta. C(2), Epitope mapping by region replacement-monoclonal antibody binding analysis For anti-ICAM-R monoclonal antibody binding analysis, ICAM-R chimeratan CO3 cells transformed with constructs encoding protein or control constructs were transformed with E. ! removed from the plate by DTA treatment and placed in a 96 round well plate. 2 per each well. 5X 105 cells were sorted. Cells were cooled Washing buffer (1% BSA and 0. 3 in PBS containing 0.05% sodium azide) Washed twice. 5. Anti-1cAM-R monoclonal antibody in a final volume of 50 μl. 0μg/ It was used at a concentration of ml and incubated on ice for 30 minutes. The cells were then washed three times with chilled washing buffer and diluted at a dilution of 1:100. together with a PITC-labeled second antibody (sheep anti-mouse IgG(ab')z). , and incubated for 30 minutes in the dark at a final volume of 50 μM. Inc. After washing, cells were washed again three times with chilled washing buffer and incubated with 200 μl resuspended in 1% formaldehyde. The sample was Becton-Di Analysis was performed using a ckinson FAC8can device. The analysis results are shown in Table 5 below. In the table, MOPC21 (IgG1) and UPC 10 (IgG2a) is an isotype-competent control and 18E3D is an ICA1 ll-1 specific monoclonal antibody, and from ICR-1,1 to ICR -9,2 is an ICAM-R specific monoclonal antibody. Monoclonal anti The reactivity of body ICR-1,1 to ICR-9,2 was determined using monoclonal antibody 1cR- 12,1 to ICR-17,1 were analyzed in a different experiment. ICR-9, 22, 1266, 8446, 6450, 692, 39 The above results are IcR-1, 1, 2, 1, 3, 1, 5, 1, 7, 1, 8, 1, ■2. 1, ■3. l, 14. 1. 15. 1. 16. 1 and 17,1 antibodies are hybrid It recognizes molecules, among which only ICAM-1 region 1 or IcAM-R region 1 was replaced with. IcR-4, 2, 6, 2 and 9. 2 is ICAM-1 The smallest part of the two regions (regions 1 and 2) is placed with the corresponding region of ICAM-H. has been replaced. Based on these results, the antibody is region I-specific or region 2-specific. It will be classified as either specific. ICAM-R chimera and deletion mutant protein constructs were added to 10 μg of 2X CsCI. Calcium phosphate coprecipitation protocol using banded plasmid DNA was used for transduction of rat L cells. In this protocol, 48 hours after transduction, cells are treated with mild trypsinization. was removed from the dish. Separate the cells and add anti-ICAM-R module at a concentration of 10 μg/ml. Monoclonal antibodies or monoclonal antibodies that match the isotype of the control, or or in the absence of monoclonal antibodies, for 1 hour on ice. So The cells were then subjected to FAC3 analysis as previously described in Example 13C. D. Epitope mapping of the anti-1cAM-R antibody of the present invention by amino acid substitution The specific reactivity with the ICAM-R variant proteins as described above is due to the ICAM-R variant protein. This suggests reactivity with a specific region of R. A specific region is a specific anti-ICAM- Once it is confirmed that they react with the R monoclonal antibody, individual residues of those regions The group is changed by oligo-specific site-directed mutagenesis to enable monoclonal antibody binding. examine their relative influence on Protein bitorobacy and two Based on a computer algorithm (Kyte et al., supra) that predicts the next structure. Specific residues capable of interacting with the antibody are then targeted for mutagenesis. Mutations in ICAM-H were carried out according to the method of Kunkel et al. provided. E. coli strain Cj236 (dut ung) was transformed into plasmid pcDNA1 Transformation by electrotransfer using /Am111CAM-R (see section 0 above) did. Transformants were selected on plates containing carpenicillin. Transformation One of the bodies was infected with helper phage M13KO7 and allowed to grow overnight. Single-stranded DNA containing uracil was prepared from the culture supernatant and subjected to mutation. It was used for The oligonucleotide for mutation was pcDNAI/Amp-I. It was hybridized with lysyl containing single-stranded DNA of CAM-H. For mutation oligonucleotides were used as primers, and T7 DNA polymer DNA synthesis and binding reactions can be performed by using 74 DNA ligase and 74 DNA ligase. I did it. A part of the synthesis reaction solution was transferred to Escherichia coli XLI blue (Stratagene and the transformants containing carpenicillin. Selected by plate. The growth of uracil-containing plasmid DNA in this strain is , significantly reduces the proliferation of uracil-containing DNA (wild type) strands. The mutant, Selection was made by plasmid DNA preparation and diagnostic restriction enzyme digestion. array, Further verification was done by DNA sequence analysis. The created mutants are F2], V/ AS, 832/AS, K331/AL, E37T/AS. T38/A, L40/A, K42E/AS, E43/A, L4 4V/AL, W51A/AS. R64/Q, S68/A, Y70/A, N72/Q, Q751 /AS 5N81/Q. For example, the "F21v/AS" mutation is 2 of ICAM-R (SEQ ID NO: 1). Phenylalanine at position 1 and valine at position 22 become alanine and serine, respectively. On the other hand, the rT38/AJ mutation This means that the threonine at position 38 of (SEQ ID NO: 1) is converted to alanine. Ru. The effect of each mutation on anti-ICAM-R monoclonal antibody binding was evaluated using the above 0 Tested according to the procedure described in Section. Table 6 below summarizes the obtained results. The mutation that results in a “critical” effect is the , meaning that 0-20% antibody binding is observed, and a "significant" effect is obtained. The mutation means approximately 50% less antibody binding compared to wild-type 1cAM-R binding. and a small effect means that binding to wild-type 1cAM-R In comparison, this means that approximately 75% binding is observed. For binding to antibodies Mutations that have no effect are not listed in Table 6. Table 6 (continued) Mutations T38/A, T68/A and R64/Q were found among the nine antibodies tested. However, the E43/A mutation did not affect the binding of wild-type ICA. Compared to binding to M-R, 50% of the above nine monoclonal antibodies An increase in binding was observed. Mutation of F21V/AS dissociates binding of all antibodies. This is thought to have a large effect on the conformation of ICAM-R. Example 12 Distribution of ICAM-R protein and IcA in various cells and cell lines M-R RNA expression was determined by FAC5 analysis and Northern blot hives, respectively. Analyzed by redization. A, FAC8 analysis of ICAM-R protein distribution in leukocyte cell lines and normal leukocytes. During ~ On leukocyte cell lines, anti-ICAM-R monoclonal antibody 1cR-2,1, anti-IC AM-1 antibody (LB2) and anti-CD18 antibody (TSI/18, ATCCHB2 PAC3 analysis performed as described in Example 10C using et al., IcAM-R proliferated in major leukocyte lineages in vitro. Widely expressed in cell lines, namely 1923 cells, 8928 cells and bone marrow cells. Rukoto has been shown. The surface expression of ICAM-H is found on the early red-white blood sputum system. was not detected. Furthermore, ICAM-R can be used for cultured human humeral vein endothelial cells ( ) ltlVEcs), either before or after stimulation with tumor necrosis factor. However, there was no detectable expression in pigeons. This factor is responsible for the expression of ICAM-1 improved. This expression pattern is similar to that of ICAM-2 expressed on endothelial cells. It's different from what I've seen. Table 2 below shows the average of each cell sample. Fluorescence and the percentage of positive cells relative to the control in each cell sample are shown (e.g. For example, mean fluorescence 13/11% positive cells). Sac-2- B, FAC5AC of ICAM-R distribution in human and macaque leukocytes. 5 Analysis on normal human and macaque peripheral blood leukocytes as described in 10C. AC3 analysis was performed. As a result, anti-1cAM-R monoclonal antibody IC R-2,1 is associated with the three major human leukocyte lineages: lymphocytes, monocytes and granulocytes. I knew I would react. See the last six entries in Table 2. Furthermore, monoclonal antibody 26+1 08-2 and 46112H cross-reacted with macaque leukocytes (Table 2 and Example 13E). This allows these monoclonal antibodies to be Useful for monitoring the expression of ICAM-H in disease models performed It was shown that it can be obtained. Human bronchiolar lavage cells (primary macrophages) were treated with five anti-ICAM-R antibodies ( ICR-2,1, ICR-3,1, fcR-4,2, ICR-6,2 and Ic R-7,1) as described in Example 13 and analyzed by FAC3. did. None of the antibodies specifically stained these cells. Immunohistology test Other data obtained from ICAM-R or on macrophages in the interstitial spaces of the lungs This suggests that it is expressed in (Expression of ICAM-R in lung tissue has been described) See Example 18. ) No. of IcAM-RRNA expression in C0 leukocyte cell line and HUVEC5 Zamplot analysis RNA from human leukocyte cell line and dish VEC3, Example 7 Extracted as described in . And ICAM-R or ICAM-1cDN By contacting the probe with either A, the node (described in Example 7) Analysis was carried out by -zan hybridization. First hybridization After phosphor imaging of the Re-analyzed using Lobe. Actin standardized IcAM-R and ICA Northern results for plots probed with M-1 are shown in bar groups in Figure 7 (A to B). Represented as rough. At the JiNA level, ICAM-R Expressed in spherical cell types. ICAM-RRNA expression is not necessarily ICAM-RRNA expression. I RNA expression was not the same. For example, unstimulated HUVEC5 expressed low levels of ICAM-1, and expression increased after TNF stimulation (Fig. 7B). On the other hand, ICAM-R messages at a detectable level are It was not observed in the stimulated or stimulated HUVEC3 (Fig. 7A). Example 17 Surface activity of surface-biotinylated human cell lines KG1aSK562 and CEM Immunoprecipitation of the lysate solubilized with the agent was performed using four anti-ICAM-R monoclonal antibodies. (r(R-2,1, ICR-1,1, ICR-4,2, and ICR-3, ■) This was done using Cell surface proteins on human leukocyte cell lines KGI, K562, and C8M and sulfo-NO3-biotin (Pierce Chemical 1) as shown below. , Rockford, IL). For each reaction, 0. 5 to 1 x lO7 cells were incubated in phosphate buffered saline ( Wash twice in PBS), resuspend in 1 ml PBS, and dilute in PBS. Added 10ul of 100mM sulfo-N)Is-biotin. At 37℃ After incubating for 10 minutes, cells were washed once with PBS and 4 ml of 10mM Tris 11H8,4,0,25M sucrose was added. Then, the cells Incubate at 4°C for 30 minutes with medium mixing. Centrifuge the cells Aspirate the supernatant and add the precipitate to 300 μl of 10 mM Tris pH 8,50mM NaCl, 1% Triton X-100,]mM phenylmethyls Incubate on ice for 15 minutes with sulfonyl fluoride, lmM EDTA. It dissolved while The lysate was purified by centrifugation, and the supernatant was transferred to a 25 μm normal mouse Pretreatment was performed by adding serum and incubating for 1 hour at 4°C. After this step, 20 μg of affinity purified rabbit anti-mouse Protein that had been incubated with immunoglobulin (27m86) A 20 μm 50150 (v/v) solution of Sepharose beads (Sigma) was added. I got it. After incubation at 4°C for 30 minutes, cephalogram was removed by centrifugation. The base beads were removed. Next, rabbit anti-mouse immunoglobulin and anti-ICAM-R or control IgG1 or 1gG2. sequentially incubated with one of the monoclonal antibodies. 20 μl of Sepha, previously bound by incubation. Specific immunoprecipitation was performed by adding rose beads. Stir at 4°C After a partial incubation with stirring, the Sepharose beads were placed in a microcentrifuge. and 1 ml 10mM Hepes pH 7,3,150mM NaC l, 2 times with 1% l-lydon x-ioo, 0. 1M l-lith pH 8,0,5M LiCl, once with 1% β-mercaptoethanol; and 20 mM Tris pH 1 , 5, 50mM NaCl, 0. Washed sequentially once with 5% NP-40. Next, the beads were mixed with 50 μm of 150 mM l-lith pH 6,8, bromophenol. Blue, 20% β-mercaptoethanol, 4% SDS, and 20% glycerol The solution was eluted by boiling for 5 minutes and pelleted by centrifugation. Next, the obtained elution 35 μl of the solution was analyzed by 5DS-PAGE (10% acrylamide). electric After pneumophoresis, the proteins were transferred to an Imopilone P membrane (Millipore). Bedford? 0,2 2% bovine serum solution diluted in Tris-buffered saline containing % Tween-20. Incubated in rubumin for 20 minutes at 4°C. Then strept the plot horseradish pero 3F-cy';f bound to avidin (Vector) - and incubated in TBS-Tween for 20 minutes at room temperature. After washing 3 times in TBS-Tween, perform ECL Western blotting assay. (Amersham) and chemiluminescence bands were added to Kodak. Visualized on X-OMAT-AR film. Figure 8 (A to B) shows the results of Western blot. Immunoprecipitation with monoclonal antibody ICR-2,1 derived from KGI cells specifically A precipitated 120 kD band was observed, but it was not observed in the K562 cell-derived band. (See Figure 88). A 120 kD band was also observed in the immunoprecipitate of the T cell line CEM (Fig. 8B, Here, lane A is monoclonal antibody 26H11C-2; lane B is monoclonal antibody 26H11C-2; lane B is monoclonal antibody 26H11C-2; clonal antibody ICR-2,1; Lane C is monoclonal antibody 1cR-4. ,2: lane D is with monoclonal antibody ICR-1,1; and lane E is with monoclonal antibody ICR-1,1; and negative control antibody (17). ICAM- seen in other immunoprecipitations The size of the R band differed somewhat depending on the cell. One of the lymphoid cells Observe bands ranging from 16 kD or less to 140 kD or less for certain bone marrow cells. It was done. Based on the nucleotide sequence of the IcAM-R gene, the core peptide Based on the predicted size (approximately 52 kD) and these results, ICAM-R is highly It can be seen that the mature cell surface form of the protein is obtained. Example 18 Anti-ICAM-R model/reo--3-ol antibody ICR-4,2, ICR-1,1o , J1. Immunohistological staining with ICR-2, l, and control antibodies was performed on tonsils. , pancreas, liver, lungs, kidneys, heart, digestive system, skin, synovium, and brain (normal brain tissue) and brain tissue affected by multiple sclerosis). Different anti-ICAM-R antibodies and purified anti-ICAM-R monoclonal antibody I A similar staining pattern was obtained using CR-1,1 or hybridoma supernatant. It was. Sections (6 um) of various tissues were coated with Vectabond (Vector). mounted on inverted slides and stored at -70°C (some sections were (stored at 20°C). Before use, remove the slides from -70℃ and incubate them at 55℃ for 5 minutes. There was a separate device. Sections were then fixed in cold acetone for 10 minutes and air dried. Ta. Sections were prepared with 1% BSA, 60% normal human serum, and 6% normal horse serum. Blocked in solution for 30 minutes at room temperature. Primary antibody against ICAM-H, Negative control antibody, anti-1cAM-1 monoclonal antibody or anti-ICAM-2 monoclonal antibody Clonal antibodies were allowed to act on each section for 1 hour at room temperature. slide Wash away unbound antibodies by soaking in 1x PBsT three times for 5 minutes each. Dropped. Next, biotinylated anti-mouse immunoglobulin (Vector) was added to it. Each section was treated in the same manner. ABC-HPO (Avidin-Bi oLin complex (HPO) was used to detect the secondary antibody. 1+nl of 1% BSA /Dissolution of reagent A combined with reagent B (9uI) (Vector) in PBST. Apply solution (9 ul) (Vector) to each section for 30 minutes at room temperature. I let it happen. The slides were then washed three times in 1xPBsT. DAB substrate (3 '3 Diaminobenzidine-4 hydrochloride, Sigma) (Stock: 0. 05M Squirrel buffer, 1)87. 600mg/ml DAB diluted 1:10 in 6 , 3% hydrogen peroxide solution added to a final concentration of 1%) to each slice. The mixture was allowed to react for 8 minutes at room temperature. Wash the slides in water for 5-10 minutes at room temperature. then 1% osmic acid was added for 1 minute at room temperature (to promote coloration). . The slides were then washed in tap water for 5-10 minutes and incubated for 30 seconds at room temperature. Counterstained in % Nuclear Fast Red (NFR). lastly , the slides were alcohol dehydrated, hydrocleared, and histomounted. A cover glass was attached using a screwdriver. Representative results of staining with monoclonal antibodies are shown in Figure 9 (A to G) under a microscope. Shown as a mirror photo. Among these, Figure 9A. Tissues 9B and 9E are human tonsil; 9c and 9D are human liver; 9F is Brain from a human patient with multiple sclerosis; and 9G is a normal human brain. 9A, 9 Sections shown in C, 9F, and 9G are anti-ICAM-R monoclonal It was stained with antibody ICR-4,2. Sections shown in 9B and 9D are negative controls. The section shown in 9E was stained with anti-ICAM-1 antibody, while the section shown in 9E was stained with anti-ICAM-1 antibody. Ta. Staining shows that high levels of IcAM-R are expressed in lymphoid tissues such as tonsils. (9A) Expression was also detected on tissue leukocytes in other non-lymphoid organs such as the liver.　 For example, Kupfer cells (liver macrophages) were clearly stained (9 C). ICAM-1 and ICAM-R expression are differentially regulated in vivo Evidence of this was seen in the staining pattern in the tonsils and lymph nodes. I CAM-1 is commonly expressed on B cells in the germinal center of the second follicle and less expressed in the second follicle. do not. On the other hand, ICAM-R is expressed in cells in the first follicle and not in germinal centers ( 10A and l0E). Significantly, ICAM-R expression infiltrates the inflammatory site. It was also detected on moist white blood cells. For example, the expression of ICAM-H is It has also been detected on leukocytes infiltrating around the ducts in the brain tissue of individuals affected by sclerosis. Served (9F). Similar staining was not observed in anatomically equivalent locations in brain tissue from normal individuals. It was (9G). ICAM-R expression was also detected on leukocytes infiltrating joint synovial fluid. It was done. Furthermore, the expression of ICAM-1 and ICAM-2 is associated with endothelial lignin Although detected on tubes, ICAM-R is typically not found on tube endothelium. Ta. Expression of ICAM-H was detected on alveolar cells of the lung. More generally, cells expressing ICAM-R are found in all normal tissues and diseased tissues. detected in the tissues of These ICAM-R expressing cells are morphologically and were identified as leukocytes and antigen-presenting cells by comparison of a series of immunological stains. obtain. All CD3” T cells found in various tissues have high ICAM-R expressed at the level. On the other hand, the main small bubbles, B seen in the center of the embryonic cells, Only a subset of cells (IgD+) expressed ICAM-R at high levels.　 Among the cells where the antigen is present, Langerhans cells present in epithelial cells or ICA While M-R was expressed at high levels, one subset of other tissue macrophages Only 1.0% expressed ICAM-R. ICAM-R monoclonal antibodies ICR-1,1 and ICR-4,2 are also human For staining biopsy tissue sections of both breast cancer (ducts and lobes) and melanoma, A method similar to that described was used. In both tumor types, blood vessels (static Specific and prominent staining of the endothelium is seen in the areas of the blood vessels (pulses, arteries, and capillaries). It was. In corresponding normal tissues, no endothelial expression of ICAM-H was observed. Thus, typical expression of ICAM-H is not observed in the endothelium of common vasculature. However, there was a distinct development in a subset of vessels associated with the two types of solid tumors. I could see the reality. Considering this fluorescence, reagents for ICAM-H (e.g. monoclonal antibodies) that selectively attack tumors versus normal vasculature. Medical vehicles can also be provided. In short, the expression pattern of ICAM-R, ICAM-1, and ICAM-2 The contrast is stark. Essential expression of ICAM-2 is found in leukocytes and endothelium. It was seen in both cells. ICAM-1 in leukocytes, endothelial cells, and epithelial cells Although the basic expression of Its expression is induced in ro. ICAM-R is expressed at high levels in most leukocytes, but not in the endothelium. Rarely expressed in cell-associated tumors, and commonly expressed in endothelial cells of vascular organs. Not expressed. Example 19 In order to investigate whether ICAM-R is involved in the adhesion of cells of the same type, ICA Aggregation analysis was performed on some of the cell lines expressing M-R. These cell lines include the T lymphoblastoid cell line (SupTl, CEM). Mo1t4, Hut78, Jurkat, 5KW3), B lymphoblastoid cells system (Jijoye, Raji), monocytic cell line (0937, HL60), bone 562 is included in the pulp cell lineage (KG-1) and the erythroid cell lineage. ICA To investigate the function of M-R molecules, cells were incubated with various antibodies before analyzing aggregation. Incubated. Hybridoma ICR-2,1, ICR-1,1, IcR -4,2 and anti-1cAM-R supernatant prepared by IcR-3,1, and Antibody preparations known to block aggregation through the β2 integrin pathway product was used. These are CD18, which is the β subunit of LFA-1. child-specific TSI/18 (ALCCHB203), which is the α chain of LFA-1. TSI/22 (ATCCHB202) specific for the CDlla molecule; and M LM2/1 (ATC CHB204). Purified anti-ICAM-1 antibody and VLA-4 molecule Hybridoma for α chain (hybridoma clone 1631 (: Mich ael Longenecker, Alberta 1 Canada) The supernatant was used as a control. It was used as Aggregation analysis was performed on phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) ( The test was carried out in duplicate with or without the addition of 50 ng/ml). 3XlO' cells in RPM11640 containing 10% fetal calf serum were added to a flat bottom 9 into a 6-well microtest plate. When one antibody was tested in an experiment, 5 0 μl of purified antibody or hybridoma supernatant was added to the wells (selected (PMA was added to the wells at the same time). When two antibodies were tested in an experiment, the anti- Bodies were added sequentially to the cells at room temperature and incubated for 30 min each. The same results were obtained with a 15-minute incubation at 37°C) and Cells were incubated at 37°C. Before adding PMA or at the same time as PMA Incubation of antibodies with cells did not significantly change the agglutination results. Ta. After incubation with single or multiple antibodies, resuspend cells evenly. The ink was incubated for 4 to 24 hours at 37°C. Aggregation was evaluated using an inverted microscope. In each experiment, the effect of PMA stimulation was , Raji cells were stimulated with equal amounts of PMA and CD18, CD11a and I The amount of aggregation that can be reblocked by a monoclonal antibody against the cAM-1 molecule is Confirmed in parallel by measuring. Table 8 below shows the results of one representative flocculation experiment with PMA. Ru. The evaluation of aggregation is done on a scale of 0 to 5. Here, 0 is cell or not aggregated at all; l indicates that less than 10% of the cells are aggregated; 2 indicates that 10 to 50% of the cells are aggregated; 3 indicates that 50 to 50% of the cells are aggregated; 4 indicates that almost 100% of the cells are loosely aggregated; Indicates that it is an integral aggregate. Interestingly, three antibodies specific for IcAM-R (ICR-2,1, ICR -1,1 and ICR-3,1) stimulated aggregation between cells of the same type (ICR-1 81 and ICR-3,1 data not shown). The stimulus is phorbol ester This occurred both in the presence and absence of costimulatory agents such as (PMA). Fourth The anti-ICAM-R monoclonal antibody (ICR-4,2) stimulates cell aggregation. did not block aggregation stimulated by other anti-ICAM-R antibodies. At least a portion of the aggregation of PMA-treated cells stimulated with anti-1cAM-R antibody Blocking can be achieved by pretreatment with monoclonal antibodies against CD18 or CD11a. was checked. From this, it can be concluded that one or more leucointegrin or It was found that it may be involved in adhesion. Agglutination or anti-ICAM-R antibodies 1cR-2,15IcR-1,1 and ICR-3 , 1, the same anti-ICAM-R monoclonal Complete immunoglobulin (ICR-1, 1) purified from antibody (ICR-1, 1) 1-1g) and Fab' fragment (ICR-1,]-Fab') , aggregation analysis was performed. For production of Fab' fragments, JOhnStOnEj et al. Blackwell, 1mmunochemistry in Practical See p. 52 of Oxford Press (1982). Analysis ICR-1,1-1g and ICR-1,1-Fab' at lμg/ml 5KW3T cells according to the method described above. Anti-CD18 and anti-ICAM-RCICR-1,1-supernatant and ICR-4,2-supernatant) Ibridoma was used as a control. After 4 hours, for intact immunoglobulins, Fab' fragments or ICR-1 , 1 supernatant, an increase in cell aggregation was observed (see Table 9 below). Anti-CD18 supernatant or anti-ICAM-RIcR~4. No increase in aggregation was observed in the 2 supernatant. I couldn't. From these results, the reason for the enhanced aggregation is antibody-mediated cells. The obvious explanation was that it was caused by the bonding of cells. This place If the IcAM-R protein is bound by the selected antibody, the bound cell It transmits a signal that changes the adhesion force of the membrane. Example 20 The process of activation and proliferation of immune system cells can be recognized by the continuity of cellular events. It will be done. Certain cell surface cellular molecules (e.g. CD69 and transferrin) Elevation of mitogen receptors) is an early marker of cell activation. Similarly, cell aggregation Aggregation occurs early in the activation process. The rise in IL-2 receptors occurs in the late stage Occurs in the middle of the stage, cell proliferation is a later phenomenon. ICAM-R or immune cells Two types of experiments were performed to determine the extent to which Ta. In the first type, ICAM-H present on the surface of transduced cells , was investigated for its ability to stimulate lymphocyte proliferation. In the second type, ICA The antibodies of the present invention that recognize different epitopes on M-R can be used in the external region of ICAM-H. antibody binding alone or with other stimulants. We investigated the effects of this combination on lymphocyte activation and proliferation. 3rd tie In this experiment, we determined the effect of soluble ICAM-R protein on T cell proliferation. did. A, Stimulation of PBMC proliferation by IcAM-R type transformant ICAM-R cDNA Alternatively, mouse L cells transduced with ICAM-1 cDNA (Example 7) were analyzed. The ability to stimulate the proliferation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) was investigated. The measurement is , performed with 3H-thymidine incorporation analysis showing changes in the rate of DNA replication. traits Untransduced mouse L cells or transduced cells can be cultured in tissue culture. RPM obtained by trypsinization from a flask and containing 10% fetal bovine serum Washed in I-1640. 120ul tissue culture medium (10% fetal bovine blood 5XlO' L cells in RPMI-1640 containing supernatant were placed in a sterile 96-well plate. into individual wells of bottom tissue culture plates and incubate the plates for 24 hours at 37°C. Incubated for ~36 hours in a 5% CO2 incubator. Next, cultivate The cells were sterilely removed and 2X105 freshly isolated PBMCs (total volume (200 ul of tissue culture medium) was added to transduced mouse L cells or transduced cells. were added to each well containing uninfected mouse L cells. PBMC, L Control wells containing no cells were also added. PBMCs are hissed from a healthy donor. Confirmed and isolated by centrifugation on Tobark gradient (Sigma). . Fresh peripheral blood was mixed with an equal volume of PBS, layered on Histopaque, and Centrifuged at 0g for 20 minutes without braking. Collect the fraction containing PBMC, and 1 x 1011 viable cells/cells were washed in BS and added to the wells before adding to the wells. Adjusted to ml. Next, the tissue culture plate was treated with PM at a final concentration of 5 ng/ml. The cells were incubated either in the presence or absence of A for a total of 4 days. Next and 1 uCi of 3H-thymidine (NEN, Boston, ?SachuSet) Lymphocyte expansion was observed after adding 100% of lymphocytes to individual wells for the last 18-24 hours of culture. The breeding was evaluated. Next, PHD model blade harvester (Costar, Cambridge? in each well using Collect all cultures onto a piece of glass fiber filter. finished. Next, place each filter mat in 3ml of Ecorium Cinch. ration cocktail (ICN Biomedicals, Co5La Mes a, placed in Cali 7t Lunaia) and counted using a β-scintillation counter. did. LTK cells expressing IcAM-R were isolated from non-transduced control LT Stimulated PBMC proliferation compared to the absence of K cells or any stimulant ( indicated by increased DNA replication). LTK cells expressing ICAM-1 , induced PBMC proliferation to approximately the same extent. By binding to receptor(s) on PBMCs, IcA M-R transmits intercellular signals to PBMCs, which in this case results in cell proliferation. . B, PMBC activity by ICAM-R-specific monoclonal antibody anti-1c of the present invention AM-R antibody was also tested to examine its effect on immune cell activation and proliferation. Tested. First, the effect of anti-1cAM-R monoclonal antibody on the initial phenomenon of cell activation. A preliminary test was conducted on the ability to give. For these phenomena, flow cytometry is Cell surface molecule cD69, transfection, on target cells measured by tree analysis. Includes elevation of phosphorus receptors and IL-2 receptors. I'm not stimulated Lymphocytes express low levels of transferrin and IL-2 receptors are doing. Receptor expression increases significantly when lymphocytes are activated. Ta. Anti-ICAM-R mono/reactive antibodies ICR-1,1 and ICR-4,2 ( 7) The ability of each to induce PMBC activation in the absence of other inducing stimulants. was tested. Monoclonal antibody 1cR-1, 1 or ICR-4, 2 (or control monoclonal antibody) in individual 96-well flat-bottom tissue culture plates. wells (10 μg/well in PBS) and incubated with 5% CO2 at 37°C. Incubate for 3 hours in a cuvator. Place the plate in sterilized PBS Wash three times with In addition, the final concentration was 2×10′ cells/well in 200 μl of medium. Next, incubate the plate for either 1 or 3 days, and Cells cultured in the presence of different antibodies of 0. 01% sodium azide and in PBS containing 1% BSA (FAC3 buffer) as above; FITC (Becton Dickinson transferrin receptor and It was stained with either anti-IL-2 receptor antibody. Results of FAC3can analysis I got it. CD69 and transferrin receptors other than IL-2 receptor Expression of 1cR-1. When cultured on immobilized antibody ICR-4,2, it increased after 1 day. I didn't add it.　3 days on immobilized ICR-1, 1 or ICR-4, 2 Incubated PBMCs contain transferrin receptors and IL-2 receptors. Levels of cell surface expression of both receptors and CD69 were not increased. Ta. However, the increase in the expression of these lymphocyte activation markers continued for 1 day and and after 3 days, this increase in expression was driven by cell size. It was not something that could be done. From these results, anti-ICAM-R monoclonal antibody ICR-1,1 and IcR-4,2, in the absence of another exogenous stimulant, Whether the early events of MBC activation can be directly induced or whether this activation , did not result in embryonic transformation and associated cell size increase. ICAM-R specific monochrome for stimulation of PMBC activity by C11 anti-CD3 anti Effects of local antibodies Anti-ICAM-R monoclonal antibodies also inhibit immobilized washed CD3 Monoclonal antibody G 19 [Ledbetter et al., J. Immuno, , 135(4):2331-2336 (1985) stimulated by i. The ability to alter the early events of PMBC activation was tested. Monoclonal anti G19 binds to the CD3 complex (T cell receptor) on T cells and Activate cells. PBMC were treated with anti-CD3 antibody (0.05 μg/well) alone When cultured in wells pre-coated with It rose after a day. After 3 days, CD69, transferrin receptor and IL Cell surface expression of -2 was significantly increased. The increase in these activation markers is due to It was correlated with an increase in cyst size. 10 μg of anti-ICAM-R monoclonal antibody 1cR-1,1 or ICR- 4,2 (or HLA class I control monoclonal antibody; 5erO1eC . 0xford, England), 0. 025 ug/well of anti-CD3 anti of each of the 96-well flat-bottom tissue culture plates in which the bodies were initially present or absent. wells and then washed to remove unbound antibody. Newly obtained PBMC were added immediately (2 x io' cells/well). Next, fine Cells were incubated for a total of 16 hours or for 3 days, and incubated twice in ice-cold FAC3 buffer. Washed. 2X10' cells were then resuspended in 50 μl of ice-cold FAC3 buffer. resuspend and 5 μl of FITC-conjugated anti-CD69, anti-transferrin receptor -, 1 g of anti-IL-2 receptor antibody or anti-F[TC conjugated control was added. Fine Cells were incubated for 30 minutes at 4°C and then incubated at 0.5°C. 5IQ+ ice cold FAC 5AC5 buffer wash. After the final wash, cells were washed at 0. 5ml ice-cold FAC3 Resuspended in buffer and fluorescence measured with FAC5can analysis. PBMC, 0 ．． 025 gg/well of immobilized anti-CD-3 (alone or against HLA class I) Transferrin and IL -2 receptor expression is not elevated with such low amounts of immobilized anti-CD3. . On the other hand, 0. 025 gg/well of immobilized anti-CD3 and immobilized wash IC In the presence of either AM-R antibody ICR-1,1 or ICR-4,2, P When BMC were cultured, both transferrin and IL-2 receptors were detected. This resulted in a significant increase. For antibody ICR-1,1, the effect is more obvious. It was. Similar results were also obtained after 16 hours of culture. Fixed IC Due to low amounts of anti-CD3 in the presence of R-1,1 or ICR-4,2 antibodies, Expression of CD69 but not transferrin receptor was induced. Ta. On the other hand, lower amounts of anti-CD3 (0, 025 μg/well) is the expression of CD69 or transferrin receptor. did not induce an increase in From these results, these anti-1cAM-R antibodies , was found to be able to serve as a co-stimulatory molecule for early immune cell activation events. D. Stimulation of PMBC proliferation in the presence of IL-2 Second, anti-1cAM-R monochrome We again investigated whether local antibodies are involved in late phenomena of cell proliferation. Preliminary experiments were carried out in order to determine the determination by gin uptake analysis. A monoclonal antibody against ICAM-H was tested in the presence of human recombinant IL-2 or was tested for its ability to directly stimulate PMBC proliferation, either in the absence or in the presence of .　 This human recombinant IL-2 enhances but does not induce cell proliferation. In PBS 10 μg of ICAM-R monoclonal antibodies 261108-2 and 26E3D -1 (or control 1gG+ and 1gG2) antibodies) in a 96-well flat bottom tissue culture plate. into each well of the plate and the plate at 37°C for 3-4 hours. 5% CO. Incubated in an incubator. Incubation Afterwards, each well was washed three times with PBS and fresh PBL was added to a final concentration of 20 Add 2×10′ cells/well in 0 μl. Next, 10 units/ml of human recombinant IL-2 (Genz)++ne, 13 oston. Massachusetts) was added to selected wells. Plate for a total of 3 days, Incubated at 37°C in a 5% CO2 incubator. To PMBC 3H-thymidine incorporation was measured as described earlier in this example. Anti-IC AM-R antibodies ICR-1,1 and ICR-4,2, even in the presence of rlL2 , did not induce PBMC proliferation. A positive control for lymphocyte proliferation was immobilized anti- Contained CD3 and anti-LFA-1 (60,3) monoclonal antibodies. child These results show that immobilized anti-ICAM-R antibodies are effective against activated markers such as CD69. stimulate the expression of markers, but by themselves, large numbers of PBMCs are involved in the cell cycle. It can be seen that there is no direct stimulation of entering the 8th period. E, Costimulation of lymphocyte proliferation by ICAM-R-specific antibodies Anti-ICAM-R antibodies are , together with anti-CD3 antibody, anti-ICAM to stimulate the early PBMC activation phenomenon. -R antibody co-stimulates lymphocyte proliferation induced by immobilized anti-CD3 antibody tested for the ability to In addition, lack of anti-ICAM-R antibodies or accompanying cells To determine whether anti-ICAM- R antibodies were tested for their ability to co-stimulate proliferation of pure CD41 T lymphocytes and Isolated using a selective method. To isolate CD4+ cells, PBMC were cultured in tissue culture. Resuspend in nutrient medium and transfer to a 75 ml tissue culture flask (Corning). and incubated for 1 hour at 37°C, 5% CO2. stop Then, wash the flask slowly with PBS once to prevent it from adhering to the plastic. Cells that were not present were removed. Cells that did not adhere to plastic (10' cells/ ml) was added to 10% FBS-PBS (containing medium) with 1 μg/ml of anti- CD8 antibody (Pharmingen, San Diego, CA), l ug/ml anti-CD19 (Becton Dickinson), 1 μg Antibody fraction containing /ml anti-CD1lb (Beckon Dickinson) and incubated at 4°C for 1 hour. Coating unbound antibody It was removed by washing twice with medium. Then, the cells (107 cells/m1) were Goat anti-mouse Ig coated magnetic beads (45 μl/lo’ cells) (Advance ed Magnetjcs, Cambridge, Massachusetts) and incubated at 4° C. for 1 hour. Cells bound to magnetic beads were removed from the suspension using a strong magnet. This person The CD4+ population obtained using the method is >90% by flow cytometry analysis. It turned out that it was pure. PBMC or CD4+ cells were cultured in tissue culture medium at 1X10' viable cells. The concentration was adjusted to cells/ml. Place individual wells of a 96-well flat-bottom tissue culture plate at 0. ．． 001 μg of anti-CD3 monoclonal antibody G19/well. Ta. Incubate the plate for 3 hours in a 5% CD□ incubator at 37°C. and unbound antibody was removed by washing the wells three times in PBS. . After the final PBS wash, a monoclonal antibody against ICAM-H (ICR-4 , 2 or IcR-1, 1) or control antibody at a final concentration of 10 μg/well. I added it right away. Next, reincubate the plate for an additional 3 hours at 37°C. I turned on. Wash the wells again three times with PBS to remove unbound antibody, and Freshly isolated PBMC were immediately added to the wells (2 in a volume of 200μ/well). XIO' cells). Next, the plate was incubated for 3 days. lymphocytes Proliferation was measured by 3H-thymidine incorporation of PMBC or CD4+ cells. As shown in Figure 10, the immobilized washed ICR-1,1 antibody IcR-4,2 was Increased response of MC and purified CD4+ cells to anti-CD3. Fixed PBM induced by anti-CD3 monoclonal antibody of anti-ICAM-R antibody The effect on C aggregation, an earlier phenomenon than PBMC proliferation, was also investigated in this experiment. . Anti-CD3-stimulated aggregation was almost 100% inhibited by antibody 1cR-1,1 but not affected by immobilized ICR-4,2, and antibodies 1cR-2,1 and and antibody 1cR-4,]. The ability of anti-ICAM-R antibodies to affect the proliferation of cells expressing ICAM-R From the results of the analysis, it was found that the binding of the antibody of the present invention to ICAM-R directly Internal signals are transmitted to the 1923 bulb, which regulates cell proliferation. F, Co-stimulation of PBL with soluble ICAM-H were analyzed for their ability to co-stimulate activation of the paraglobules. Human peripheral blood lymphocytes (PBL ) were obtained by Ficoll-Hypaque centrifugation and 2 per well. X 10' cells were added to the plate with soluble ICAM-R bound to the plate. Bound anti-CD3 (OKT3) or soluble with plate-bound anti-CD3 The cells were incubated in the presence of either culture medium of ICAM-R. After 4 days and 17 hours from the start of culture, cells were removed and human lymphocytes were activated. It was stained with a monoclonal antibody to the antigen and analyzed by flow cytometry. Plate-bound anti-CD3 (0.5 μg/well) and soluble ICAM-R Human lymphocytes cultured for 4 days in the presence of anti-CD3 (1,00 ng/well) The activation antigen ICAM-ISIL- 2 receptors, and increased numbers of transferrin receptors.　 In contrast, cultured in the presence of soluble ICAM-R (100 ng/well) alone. Lymphocytes cultured with cultured media showed an increase in these activating antigens compared to cells cultured in medium alone. was not recognized. Finally, ICAM-R is an early manifestation of cell-cell contact-dependent T lymphocyte activation. We also conducted experiments to investigate whether or not it is related to elephants (e.g., Staphylococcus spp. Responses to terotoxin A and alloantigens). G, Effect of ICAM-R specific antibody on superantigen-induced proliferation of PBL The proliferation and aggregation of human peripheral blood lymphocytes (PBL) induced by the I Evaluation was made in the presence of cAM-R specific antibodies. Soluble and plate-bound ICAM-R antibody and anti-HLA class I control B The effects of -89 (SeroLec) antibody on proliferation and cell aggregation were investigated in humans. PBL was converted into staphylococcal enterotoxin A (SEA) (Toxin Te). Measured after 3 days of stimulation with did. The antibody bound to the plate was prepared as follows on the day of culture.　 Purified antibodies (10 μg in 0.1 ml PBs) were added to each of the 96-well flat bottom plates. wells. Next, the plate was incubated at 37°C for 4 hours. After incubation, aspirate each well to remove unbound antibody and freshly was removed by washing four times with clean PBS. Healthy Donna using PBL was isolated on a Histobark (Sigma) gradient. Fresh peripheral blood Mix with an equal volume of phosphate buffered saline (PBS) and layer on Histopaque. , and centrifuged at 450×g for 20 minutes without braking. Lymphocyte fraction 2 by adding fresh RPMI containing recovered flavor and lO% fetal bovine serum. Washed twice and centrifuged at 200×g for 8 minutes. PBL final capacity 10n Suspended in +1 RPMI-PBS. Eliminate living PAIL with biological pigments It was counted using the method. 20μl of 0. 4% Trivan blue staining (Gibco) ) was added to the hemacytometer chamber, and then Dye-excluded cells were counted using an inverted microscope. Next, 20% of the surviving tails PBLwo, 100. 10 or 1 μg of soluble or plate-bound IC R-1,15ICR-2,1, ICR-3,1, [CR-4,2, ICR-5, 1, ICR-6,2, ICR-7,1, ICR-8,15ICR-9,2, IC R-12,1゜ICR-13,1, ICR-14,1, ICR-15,1, IC R-16, 1SICR-17, 1SB-H9 or l0T2 (AMAC, West Plutsk, ME) was added to a 96-well flat-bottom tissue culture plate containing antibodies. . Finally, each culture was stimulated with SEA at 1000 or 100 g. /ml (3 times) and cultured in 5% COR at 37°C. After 3 days, increase the growth to 3 H-thymidine incorporation was measured, and aggregation was measured using an inverted microscope. Soluble anti-ICAM-R antibody altered PBL proliferation compared to soluble control antibody. I couldn't get over it. However, if the plate is joined (i.e. crossed) ) Antibody ICR-1,1, +cR-2:l. ICR-5,1, ICR-6,2, ICR-5,15ICR-6,2 and IC R-17,1 has 5EA (p<0. 05), significantly inhibiting the proliferation of Antibodies ICR-3, ICR-4,2, ICR-7,1, ICR-9, 2. Does not inhibit ICR-13,1, ICR-14,1 and ICR-15,1 (Figures 11A and 11B). Antibodies ICR-12,1 and IcR-16 ,1 slightly inhibited proliferation, whereas antibodies ICR-12,1, ICR-13,1, ICR-14,1, ICR-15,1 and ICR-16,1 have the lowest concentration An improvement in the inhibitory effect was seen. Antibodies ICR-1,1 and ICR-8,1 are , most significantly inhibited proliferation. Figure 11C shows the ratio of proliferation in the presence of control antibody. Monoclonal antibody ICR-1,1,I with respect to the rate of proliferation observed in Logis of CR-2,1, ICR-5,1, ICR-6,2 and ICR-8,1 Table 10 below shows the IC5, shows. Accompanying entry into the cell cycle is cell aggregation of SEA. Cell aggregation The effects of monoclonal antibodies ICR-1,1 and ICR-4,2 on Measurements were made using an upright microscope. Plate-bound ICR-1,1 is also plate-bound compared to B-H9 and ICR-4,2 antibodies bound to cells at both SEA concentrations. Cell aggregation was significantly inhibited. Inhibition of aggregation by plate-bound ICR-1,1 was almost complete. In contrast, the plate-bound ICR-4,2 antibody , only slightly inhibited aggregation compared to plate-bound B-H9.　 The aggregation of PBL induced by SEA was significantly different from that of soluble B-H99. Anti-ICAM-R antibodies ICR-1, 1 and ICR-4, 2 are not affected. I couldn't. Anti-ICAM-R bound to the plate is required to inhibit SEA-induced proliferation. The minimum time required was also determined. PBL is ICR-bound to the plate. 4,2, ICR-1,1, or isotype-matched anti-HLA-1 control antibody B-89 (IgG+) and IOT2 (IgGz) (AMAC, Westop) Lutsk, Maine) with (101) g/ml) or without SEA. 3. Incubate in advance for 5 and 7 hours. Next, PBL were transferred to clean wells and incubated in the presence of SEA (10 pg/ml) for 3 days. Cultured. The results of 3H-thymidine incorporation (proliferation) analysis are summarized in Figure 12. . Immobilized IcR-1,,1 antibodies and low levels of ICR-4,2 are After only 3 hours of incubation, compared to isotype-matched controls, significantly reduced proliferation. From this result, plate-bound ICR-1,]A Alternatively, the binding of ICR-4,2 to ICAM-H may be caused by an antibody on which cells are immobilized. After being removed from the cell, it transmits intracellular signals that can inhibit proliferation. This was shown. These results indicate that long-term IcAM-R-specific drugs ICAM without maintaining saturating levels of agents (e.g., monoclonal antibodies). This suggests that the therapeutic effect of -H can be maintained. Both T cells and companion cells express ICAM-R at high levels, so ICR-1, Inhibition of cell-cell contact-dependent T cell activation in response to SEA by T. mediated by IcR-1,1 binding to cells, accompanying cells, or both. Furthermore, ICAM-R and ICAM-1 have a similar expression ability in non-activated T cells. Anti-1cAM-1 and anti-ICAM-R have different activities, as significant differences were observed. It is possible to inhibit SEA responses by targeting T cell subsets in the inflammatory state. It is possible. Because the roles of ICAM-R in neoplastic cells and memory cells are different, CD4" CD45RO" (r memory j) cells or CD4" CD45RA Ability of anti-ICAM-R antibody to inhibit SEA that induced cell proliferation (“resting”) Tested the power. Plasmid non-adherent PBMCs (10” cells/ml) were placed in a coating medium. Anti-CD8, anti-CD19, anti-CD1lb, and anti-HLA-DR (Bec kon Dickinson) and (CD45RA” CD4+ cells) to obtain) anti-CD45RO (Amac) or (CD45RO”C) (for obtaining D4+ cells) containing either anti-CD45RA (Amac). Incubate for 1 hour at 4°C with a mixture of antibodies (1 Hg/ml each). I did it. Wash the cell suspension twice with coating medium to remove unbound antibodies and use goat anti- The cells were incubated with mouse IgG-coated magnetic beads. And magnetic Cells bound to the sex beads were removed from the suspension using a strong magnet. This method The CD45RO+ and CD45RA+ populations obtained in Therefore, it was found that the purity was over 95%. 20% memory T cells , resting T cells, or plastic adherent cells, immobilized ICR-1,1 , anti-ICAM-1 antibody LB-2, or anti-HLA-1 antibody p10. 1 (10μ g/ml) (Gerald Nepom, Virginia-7Nson Research Center) (Seattle, WA) for 3 hours. Antibody treatment Remove memory or resting T cells from clean wells and add 2XIO'+ mixed with tic adherent cells. Antibody-treated parasitic cells were transferred to untreated memory T cells. cells or untreated stopped T cells. Each prepared culture was stimulated with SEA (1011 g/ml). 3H-thymidine removal The results of the proliferation analysis method are summarized in Figure 13, where the abbreviation rAPCJ is An asterisk (0) means an ``antigen-providing cell,'' which is an accompanying cell in the analytical method. A population of cells pretreated is shown. “CD45RO” by ICR-1,1 Pretreatment of T cells or associated cells (APC???) with plO,l control antibody. In comparison, the proliferative response to SEA was blocked. Both cell collections The inhibitory effect when the group was treated with ICR-1,1 was additive. Adhesive thin cells are pretreated, and pretreatment of the mixed cells does not enhance the effect. Inhibition of proliferation by the anti-ICAM-1 antibody LB-2 occurs only when Figure 14 As shown in , pretreatment of CD45RA'' T cells with ICR-1,1 Did not affect EA response. Pretreatment of adherent cells with ICR-1, 1 or LB2 is effective for CD45RA+ cells. resulting in favorable inhibition of the growth of. Inhibition of lymphocyte proliferation against H1 allogeneic irradiated stimulated cellsModel for ICAM-R Noclonal antibodies also inhibit lymphocyte proliferation in response to stimulated cells exposed to alloantigens. (as measured by 3H-thymidine incorporation). Response Cells were harvested from standard donors using an old 5 topaque centrifuge as described above. PBMC were obtained and prepared. To prepare stimulator cells, add a second unrelated cell By simultaneously isolating PBMCs from the innermost nerve cells and exposing them to a gamma-emitting cesium source. Irradiation was performed at 1500R. 20M responder cells and 2X10' irradiated (medium) The stimulated cells (suspended in 2,1, ICR-3,1゜ICR-4,2, IcR-5,1, IcR-6,2, IcR-7,1, ICR-8,1, ICR-9,2, immobilized B-89, immobilized Contains converted plO, ■, or soluble 515F (anti-rat CD18) antibody were added to the wells and incubated at 37° C., 5% CO2 for 6 days.　Li Lymphocyte proliferation (measured by sl-thymidine incorporation) was measured between 18 and 24 h at the end of culture. It was measured between Immobilized monoclonal antibodies 1cR-1, 1, 2, 1, 6, 2 and 8. 1 is , compared to the control antibody - inhibited proliferation throughout. ICR-8,1 also inhibits alloantigen-stimulated proliferation when administered in soluble form did. Example 21 Table 11 below shows the ICAM-R specific monochromes of the present invention mentioned in the previous example. This is a summary of various properties of local antibodies. In Table 11, the abbreviation rNCJ means "not finally confirmed". , r　NDJ abbreviation means "undetermined". Marked with an asterisk (ne) in Table 11 Antibodies labeled with are those with improved activation even at low concentrations. Y2O, Q751. E32, K42B. Table 11 (continued) Antibodies specific for IcAM-H have been tested against various stimulants (e.g., SEA and alloantigens). One of the examples from the above example that modulates the response of lymphocytes to The inference is that binding of ICAM-R by the natural corresponding receptor or the antibodies of the invention is transmitting a signal to cells expressing ICAM-R. The phenomenon that produces a signal specific to ICAM-H involves the cytoplasmic region of ICAM-H. cellular enzyme components of one or more of the second messenger pathways (e.g., kinases, phosphorus) unique to ICAM-R for cytoskeletal components (fatase) and/or cytoskeletal components. Interactions may be involved. Preliminary experiments show that this concept and ICAM-R's integration with a second Metzenger system This is consistent with the idea that it differs from ICAM-1 in binding. below Extracts from unstimulated Raji cells were prepared, fractionated, and The kinase activity was analyzed. Wash 7XIO' cells once in PBS and 20mM Tris pH 7, 5, 0, 5mM EDTA, 1% Tris X-100 (Pierce), 10ug/ml pepstatin and Leupe Putin (Boehringer), 1% in a buffer containing 2mM PMSF. Thaw on ice for an hour. 14. Incubate the lysate in chilled microphages. Centrifuge for 15 minutes at 000 rpm. Separate and precipitate the resulting supernatant with 20mM Tris p) 17. 5. 0.5mM DEAE Sephacel column (Pharm) equilibrated with EDTA (buffer A) acia). Set the column to 0. flowed at 25 ml/min and in buffered MA from O to 0. Elution was done with a gradient of 35M NaCl over 60 minutes. These most In the first experiment, a fraction with enhanced protein kinase C (PKC) activity (flax - determined using a jam analysis kit according to the manufacturer's instructions) were examined. . The fractions with enhanced PKC activity are pooled and ICAM-1, ICAM-2, and ICAM-R Synthetic peptide of the complete cytoplasmic region of (SEQ ID NO: l) different phosphorylation of amino acids). The analysis was performed at a final concentration of 75 uM peptide according to the manufacturer's instructions.　 Boil 10 ul of reaction mixture in 30 ul of Laemml i sample buffer and add 1 2. Separated on a 5% 5O3-PAGE gel. 1. Place the gel on X-ray film. 5 After time exposure, phosphorylation of ICAM-R and ICAM-2 was detected, and ICAM-R and ICAM-2 phosphorylation was detected. CAM-1 was not detected. Is phosphorylation caused by PKC or both? It was not determined whether this was due to other kinases that were fractionated. Further analysis can be performed using column chromatography steps or Ca++, Mg++, cAMP, phosphatidylserine, cytoplasmic terminal peptide, and [32P]AT Relating to the reaction fraction obtained from any of the solubilized cell fractions in the presence of P.　 Specific peptide phosphorylation is assayed in subsequent analysis by gel electrophoresis. Separate Jurkat cells into subcellular fractions, and separate each fraction into cytoplasmic terminal peptides. The kinase activity related to tide was assayed. In these experiments, ICAM- Phosphorylation of 1 and ICAM-R has been detected. However, the cell membrane fraction A kinase that phosphorylates ICAM-1 related to Kinases that undergo oxidation are located within the membrane, but are the major cytoplasmic enzymes. These two The different kinases that act on ICAM have been studied to purify these kinases. Therefore, it is supported. 50mM Tris pH 8, level with 5mM EDTA Equilibrate and 0. Mono Q gradient over 30 minutes with 6M sodium chloride Jurkat cytotles subdivided into columns (Pharmacia) were A very extensive trajectory regarding the kinases acting on M-H has been drawn. Only a subset of these fractions had activity against ICAM-1. child This means that it specifically phosphorylates IcAM-R but has specificity for IcAM-1. This provides evidence for the existence of a cytoplasmic kinase that is not present. this From the binary phosphoamino acid analysis of phosphorylated peptides, serine was detected by ICAM-R. Only phosphorylation and phosphorylation of threonine in ICAM-1 was found. Preliminary experiments showed that the cytoplasmic region of ICAM-H specifically binds to cytoskeletal components. It was also shown that Non-competitive monoclonal antibodies ICR-1, 1 and I The binding of CR-4,2 to ICAM-H was investigated, and the binding of each antibody to ICAM-H was investigated. The potential effect on the association of Pakocyte ICAM-H with the cytoskeleton was evaluated. Anti The body uses different natural ICAM-Rs as cell surface receptors. It is possible to recreate the ligand and thereby elicit a modulated cellular response. Ru. Other researchers have previously shown that numerous human T proteins appear as cell surface transmembrane glycoproteins. lymphocyte surface antigens, if surface-bound antibodies specific for these antigens interact with a second antibody. found that Gep can be induced to bind to the cytoskeleton when pert et al., J. Im., Dan 6:3298 (1990)].　Many things These cell surface molecules are components of lymphocyte adhesion and/or activation pathways. That is clear. The phenomenon of inducible binding with the cytoskeleton occurs under determined conditions. Functionally revealed as resistance of cell surface immune complexes to detergent extraction under Become. Inducible surfactant tolerance requires no metabolic energy and is observed in cells maintained at 0°C to 4°C throughout the experiment. Experiments were carried out using freshly prepared PBL or human T lymphoblastoid cell line CBM-CC. It was carried out using RF (ATCCCCCLl19). Simply put, a healthy body Freshly drawn human blood from a Lantia donor was diluted 1:1 with PBS and It was overlaid on Guma Histopaque density separation medium.　Grade at 150 rpm for 30 minutes Centrifuge at 600×g) and collect the interphase mononuclear cell fraction and add to PBS. Washed 3 times. The cells were pelleted in complete RPMI-1640 medium (Gibco, L-glutamine, Penicillin/streptomycin, sodium pyruvate, 2-mercaptoeta resuspended in 10% FBS) and depleted of adherent cells. For this purpose, the cells were placed on tissue culture-treated Vetri dishes. Place the plate at 37℃ for 1 to 2 hours. During the incubation in 5% CO2. After that, collect the non-adhesive PBL, Washed twice with water-cooled PBS. Fluorescein isothiocyanate (FITC) For example, if the monoclonal antibody is purified using fluorescein ( O,IM picarbonate buffer p1 with the antibody and excess FITC (Sigma) 48. 1 for 90 minutes at 37°C, followed by Includes extensive dialysis with PBS as external fluid to remove FITC from the reaction. It is. PBL or washed OEM cell suspension (IXIO' cells) was transferred to Falco. Distribute into water-cooled PBS-5% FBS in a 12X75 mm tube, precipitate the and FITC-conjugated anti-1cAM-R monoclonal in 50 μl of the same buffer. Resuspend in antibody 26E3D-1 or 26110B-2 and adjust to saturating concentration. did. Antibody binding was allowed to occur for 30 minutes on ice, then the stock (undiluted) First 1 ml PBS-5% F through the lower cushion (0,7 ml) of FBS Unbound antibody was removed by pelleting the cells, which had been resuspended in BS. . For the group stained with FITC-conjugated monoclonal antibody alone, 1 ml of Divide the suspension into thirds, overlay each with FBS separately, centrifuge, and remove the supernatant. was removed by suction. The cell pellet was then mixed with 200ul of control buffer (13mM Tris pH 8, 0, 150mM NaCl, 2mM MgCh, 2mM E GTA, 2% FBS, 2. 5ug/ml aprotinin, 1mM PMS F, 10mM iodoacetamide) or surfactant buffer [control buffer 0 inside. 5% NP-40 (v/v) (US Biochemica 1, C1e veland, OH) for FAC8AC8 analysis at room temperature. 0 minutes or at 4°C. After the first antibody staining step, the cell surface For the group in which the monoclonal antibody bound to the monoclonal antibody was crossed with the second antibody, The purified cell pellet was diluted 1:100 in PBS-5% FC3, 50 ul. Resuspend in FITC-goat anti-mouse IgG (Sigma) for 30 minutes on ice. Incubated for a while. Next, resuspend the cells and separate the two tubes as described above. separated, precipitated, and treated with buffer in the presence or absence of surfactant. did. Next, FAC3 analysis was performed on these cells. The results obtained for CEM cells (see Figure 15) were similar to those seen for PBL. The results were similar. I with the cytoskeleton evaluated by detergent resistance analysis CAM-R binding is achieved using FITC-conjugated 1cR-4,2 or ICR-1,1 antibodies. When bound alone to cell surface ICAM-R, it was negligible. but However, when the ICR-4,2 antibody bound to the cell surface was crossed with a second antibody, , a slight increase in surfactant resistance was observed. Bind the second antibody to the cell surface In addition, ICR-4,2 recognizes an epitope of IcAM-R that is different from that of ICR-4,2. When used to cross with cR-1,1, it is larger (approximately twice as large in PBL and An increase in surfactant resistance (2- to 3-fold) in C8M was repeatedly observed. This is it Therefore, the interaction of ICAM-R ligands with respect to different structural regions of ICAM-H The effects appear to differentially affect the binding of ICAM-R to the cytoskeleton. The foregoing specific examples relate to presently preferred embodiments of the invention and are Modifications and changes will also be readily apparent to those skilled in the art. Apparently, polynucleotides encoding ICAM-R (e.g., DNA and RNA) is useful in ensuring expression of ICAM-R and modified polypeptides. In addition to expressing ICAM-R in normal or activated states. easily used to identify cells, especially cells involved in immunological processes. obtain. Typical detection methods using ICAM-RDNA include (appropriate labeling) DNA or RNA (detected by detection) hybridizes to RNA in the sample. Northern blot hybridization, RNA5e protection, and In situ hybridization and cytological analysis methods are included. ICAM-R ICAM-encoding DNA (especially than the DNA encoding regions 2 and 3) It has lower homology to the DNA encoding ICAM-1 and ICAM-2. DNA encoding the first, fourth and fifth regions) is ICAM-R DNA ICAM containing genomic DNA specifying endogenous expression control DNA sequences for It is useful for isolating genomic DNA encoding -R. As mentioned above, ICA Polynucleotide sequence encoding M-R and/or expression of IcAM-R Knowledge of the polynucleotide sequences that control ICAM-R may help regulate expression of ICAM-R. A variety of antisense polynucleotides are now available. According to the present invention, the ICAM-R polypeptide, and the five immune systems of ICAM-R A soluble fragment, such as a fragment containing one or more of the globulin-like regions, Variants including glycosylated, non-glycosylated, or deglycosylated You will be able to create variants. Pharmaceutical compositions comprising the protein products of the invention intercellular and intracellular ligands/receptors involving ICAM-R, e.g. Competitive inhibitors or stimulators of binding reactions may be used to regulate immune cell activation/proliferation. , which has therapeutic potential. Such therapeutic potential is particularly important for recombinant hives of the “immunoatohesin” type. Appears in lid fusion proteins. This protein has one or more amine terminals of ICAM-H and at least one immunoglobulin at the carboxy terminus. Contains the permanent area of the file. Such hybrid fusion proteins are homodimeric The 1g portion is usually available in the form of and the ICAM-R part is more ICAM-R than ICAM-R itself. It has high affinity for R-conjugates. Other multimeric forms of IcAM-H, which may have enhanced avidity, may also be used for therapeutic purposes. It is believed that the above possibilities exist. Antibody substances and binding proteins, especially monoclonal antibodies and polyclonal Monospecific antibodies, including antibodies, are made readily available by the present invention.　 This indicates that cells that naturally express ICAM-R, the polypeptide products of the present invention. The recombinant host cell in which the ICAM-R polypeptide is produced, the ICAM-R polypeptide product itself, and the intercellular A polypeptide of the invention bound to an IcAM-R-specific antibody that stimulates aggregation of product (i.e., a polypeptide product in a "high affinity" binding dosage form) Made by using the original. Such antibodies and other ICAM-R specific binding agents Synthetic proteins are used for immunopurification of ICAM-R and mutants, as well as for IC Blocking of ligand/receptor binding of AM-R and its soluble fragments and It can be used in pharmaceutical compositions for treatments based on stimulation and/or irritation. . For use as a pharmaceutical composition, ICAM-R specific antibodies and anti-idiolytic Type antibody material may be humanized (e.g., CD) by recombinant techniques known in the art. R-transplant). Multiple antibodies specific for different regions of ICAM-H were used in the ELISA system. It will be done. In this system, the amount of soluble ICAM-R polypeptide is monitors inflammatory processes characterized by an increase in body fluids such as Includes immunological “sandwiches” for Inflammatory conditions treated or monitored by ICAM-R related products include the following symptoms: Conditions resulting from a non-specific mammalian immune system response (e.g. For example, adult respiratory syndrome, sepsis-derived multiorgan failure syndrome, trauma-derived multiorgan dysfunction syndrome, tissue reperfusion failure, acute glomerulonephritis, reactive arthritis, Dermatitis with acute inflammatory components, seizures, heat disorders, hemodialysis, leucopheresis, ulcerative colitis, Crohn's disease, necrotizing enteritis, granulocyte transfusion-associated syndrome, and cytokines induced toxins) and conditions resulting from specific immune system responses in mammals (e.g. psoriasis, organ/tissue transplant rejection, and Raynaud's disease, autoimmune thyroiditis, EAE. Autoimmune diseases including multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, lupus erythematosus, etc. ). The IcAM-R products of the invention may also be used to treat asthma, tumor growth and/or metastasis. useful for monitoring and treating viral infections and viral infections (e.g., HIV infection). be. Accordingly, the scope of the invention should be limited only by the scope of the appended claims. It is. Arrangement table (1) General information (1) Applicant: Gallatin, Tablu, Michelve Ezeux, Rose May (ii) Name of the invention: IcAM-related protein (iii) Number of sequences: 45 (1v) Contact address: (A) Addressee: Marshall, O'Dour, Leustin, Murray & Baugh run (B) Address + 6300 Sears Tower, 233 South Warakah Dry B (C) City name: Chicago (D) State name: Illinois (E) Country name: United States (F) Postal code + 606 ()6 (v) Computer readable format: (A) Media: Floppy disk (B) Computer: IBM PC compatible (C) Operation system: PC-DOS /MS-DO3(D) software: Patent-in release gi, o, version - John 11. 25(vi) Current application data: (A) Application number (B) Application date/ (C) Classification: (vii) Prior application data. (A) Application number + US 07/827,689 (B) Application date: January 27- 1992 (vii) prior application data: (A) Application number: US 07/889. 724(B) Application date: May 26th 1992 (vii) Prior application data. (A) Application number: US 07/894. 061(B) Application date + 05-June- 1992 (vii) prior application data: (A) Application number: US 081009. 266(B) Application date: 22-January-1 993 (viii) Attorney/patent attorney information. (^) Name: Noland, Greta E (B) Registration number: 35. 302 (C) Reference/Case number: 31570 (ix) Communication information/ (A) Phone + (312) 474-6300 (B) Fax: (312) 474-0448 (C) Telex 25-3856 (2) Sequence number: information of l (i) Sequence characteristics: (A) Sequence length: 547 amino acids (B) Sequence type diamino acid (D) Toboronow: Straight chain (11) Sequence type, protein (ix) Sequence characteristics. (A) Symbol representing characteristics: protein (B) Location: 30. ．． 547 (xi) Sequence: SEQ ID NO: 1 Met Ala Thr Met Vat Pro Ser Vat Leu Trp Pro Arg Ala Cys Trp Thr-25-20~15 Leu Leu Val Cys Cys Leu Leu Thr Pr o Gly Val Gin Gly Gin Glu PheLeu Leu A rg Val Glu Pro Gln Asn Pro Val Leu S er Ala Gly Gly 5erLeu Phe Val Asn Cy s Ser Thr Asp Cys Pro Ser Ser Ser Glu Ly s lie AlaL eu Glu Thr Ser Leu Ser Lys Glu Leu Val Ala Ser Gly Met Gly Trp Ala Ala Phe Asn Leu Ser Asn Val Thr Gly Asn Ser Arg lle Leu CysSer Val Tyr Cys Asn Gly Ser Gln lle Thr Gly S er Ser Asn lie ThrVJII Tyr Gly Leu Pro Glu Arg Val Glu Leu Ala Pro Leu Pro Pro TrGin Pro Val Gly Gin Asn Phe Thr Leu Arg Cys Gin Val Glu Gly Glyloo 105, 110 115 Ser Pro Arg Thr Ser Leu Thr Val Vat Leu Leu Arg Trp Gl u Glu GluLeu Ser A rg Gin Pro Ala Val Glu Glu Pro Ala Glu Val Thr Ala ThrVal Leu Ala Ser Ar g Asp Asp His Gly Ala Pro Phe Ser Cy s Arg ThrGlu Leu Asp Met Gln Pro Gin Gly Leu Gly Leu Phe Val Asn Thr 5er Ala Pro＾rg Gln Leu Arg Thr Phe Val Leu Pro Vat Thr Pro Pro ArgLeu Va , I A la Pro Arg Phe Leu Glu Vat Glu Thr Ser Trp Pro Vat AsCys Thr Leu Asp Gly Leu Phe Pro Ala Ser Glu Ala Gin Val Tyr Le uAla Leu G ly Asp Gin Met Leu Asn 八la Thr Val Met Asn His Gly AsnTbr Leu Tbr^Ia Thr Ala Thr Ala Thr Ala Arg Ala Asp Gln Glu GlyAla Arg Glu Ile Vat Cys Asn Val Thr Leu Gly Gly Glu Ar g Arg GluA la Arg Glu Asn Leu Thr Val Phe Ser P he Leu Gly Pro Ile Val AsnLeu Ser Gl u Pro Thr Ala His Glu Gly Ser Thr Val Thr Vat Ser CysMet Ala Gly Ala Arg Val Gln Val Tbr Leu Asp Gly Vat Pro Ala AlaA la Pro Gly Gln Thr Ala Gln Leu Gin 'Leu Asn Ala Thr Glu Ser Asc Asp Gly Arg Ser Phe Phe Cys Ser Ala Thr Leu Glu Vat Asp Gly GluPhe Leu 1 lis Arg Asn Ser Ser Val Gln Leu Arg Val Leu Tyr Gly PrB Lys lie Asp Arg Ala Thr Cys Pro Gln His Leu Lys Trp Lys Asp LysThr Arg t (is Vat Leu Gln Cys Gin Ala Arg Gly Asn Pro Tyr Pro GlLeu Arg Cys Leu Lys Glu Gly Ser Ser Ser Arg Glu Vat Pro Val Gly 1iePro Phe Phe Val Asn Val Thr ) Iis Asn Gly Thr Tyr Gin Cys Gln AlSer Ser Ser Ser Arg Gly Lys Tyr Thr Leu Val Val Val Met Asp Ile GluAla Phe Ser Ser Ir1s Phe Val Pro Val Phe Vat Ala Val Leu Leu ThLeu Gly Val Val Thr Il e Vat Leu Ala Leu Met Tyr Val Phe Arg GluHis Gln A rg Ser Gly Ser Tyr His Val Ar , g Glu Glu Ser Thr Tyr LePro Leu Thr Ser MeL Gin Pro Thr Glu Ala Met Gly Glu Glu Pro 5erArg Ala G lu (2) Sequence number, information on 2 (Summer) Sequence characteristics (A) Sequence length: 1781 bases Pair (B) Sequence type: Nucleic acid (C) Number of strands, -zero value (D) Topology/Linear (ii) Sequence type: cDNA (xl) Sequence, SEQ ID NO: 2 CAGCTCTCTG TCAGAATGGCCACCATGGTA CCAT CCGTGT TGTGGCCCAG GGCCTGCTGf 60 ACTCTGCTGG TCTGCTGTCT GCTGACCCCA GGT GTCCAGG GGCAGGAGTT CCTTTTGCfG 120 GTGGAGCCCCAGAACCCTGT GCTCTCTGCT GGAG GGTCCCTGTTTGTGAA CTGCAGTACT@180 GATTGTCCCA GCTCTGAGAA AATCGCCTTG GAG ACGTCCCTATCAAGGA GCTGGTGGCb240 AGTGGCATGG GCTGGGCAGC CTTCAATCTCAGCAA CGTGA CTGGCAAACAG TCGGATCCTCR00 TGCTCAGGT ACTGCAATGG CTCCCAGATA ACA GGCTCCT CTAACATCACCGTGTACGGf 360 CTCCCG GAGCGTGTGGAGCT GGCACCCCTG CCTC CTTGGCAGCCGGTGGG CCAGAACTTCS20 ACCCTGCGCT GCCAAGTGGA GGGTGGGTCG CCC CGGACCA GCCTCACGGT GGTGC TGCsT 480 CGCTGGGAGG AGGAGCTGAG CCGGCAGCCCGCAG TGGAGG AGCCAGCGGA GGTCACTGCb540 ^CTGTGCTGG CCAGCAGAGGA CGACCACGGA GCC CCTTTCT CATGCCGCACAG^^CTGGAb600 ＾TGCAGCCCAGGGGCTGGG ACTGTTCGTG AACA CCTCAG CCCCCCGCCA GCTCCGAAACb660 TTTGTCCTGCCCGTGACCCCCCCGCGCCTCGTGGCC CCCCGGTTCTTGGA GGTGGAAACG 7Q0 TCGTGGCCGG TGGACTGCACCCTAGACGGG CTTT TTCCAG CCTCAGAGGCCCAGGTCTACV80 CTGGCGCTGG GGGACCAGAT GCTGAATGCG ACA GT CATGA ACCACGGGGA CACGCTAAbG 840 GCCACAGCCA CAGCCACGGCGCGCGCGAT CAGG AGGGTG CCCGGGAGAT CGTCTGCAAb900 GTGACCCTAG GGGGCGAGAG ACGGGAGGCCCGGG AGAACT TGACGGTCTT TAGCTTTCCT ` 960 ccAcccATTc TGAACCTCAG, CGAGCCCACCGCCC ATGAGG GGTCCACAGT GACCGTGAGs 1020 TGCATGGCTG GGGCTCGAGT CCAGGTCACG CTG GACGGAG TTCCGGCCGCGGCCCCGGGf 1080 CAGACAGCTCAACTTCAGCT AAATGCTACCGAGAG TGACG ACGGACGCAG CTTCTTCTGCP140 AGTGCACTCTCGAGGTGGA CGGCGA GTTCTTGCA CAGGA ACAGTAGCGT CCAGCTGCGA@1200 GTCCTGTATG GTCCCAAAT TGACCGAGCCACAT GCCCCCAGCACTTGAA ATGGAAAGAT@1260 AAAACGAGAC ACGTCCTGCA GTGCCAAGCCAGGGG CAACCCGTACCCCGA GCTGCGGTGT P320 TTGAAGGAAG GCTCCAGCCG GGAGGTGCCG GTG GGGATCCCGTTCTTTCGT CAACGTAAC` 1380 CATAATGGTA CTTATCAGTG CCAAGCGTCCAGCT CACGAG GCAAATACACCCTGGTCGTG@1440 GTGATGGACA TTGAGGCTGG GAGCTCCCACTTTG TCCCCG TCTTCGTGGCGGTGTTAC TG@1500 ACCCTGGGCG TGGTGACTAT CGTACTGGCCTTAA TGTACG TCTTCAGGGA GCACCAACGf 1560 AGCGGCAGTT ACCATGTTAG GGAGGAGAGCACCT ATCTGCC CCTCACGTCTATGCAGCCG P620 ACAGAAGCAA TGGGGGAAGA ACCGTCCAG GCT GAGTGACGCTGGGATCCGGGATCAAAG@1680 TTGGCGGGGG CTTGGCTGTG CCCTCAG ATT CCG CACCAAT AAAGCCTTCA AACTCCCA`A 1740 ^AAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1781 (2) Information on Sequence Number: 3 (i) Sequence characteristics. (A) Sequence length: 8 amino acids (B) Sequence type: diamino acids (D) Topology: Linear (ii) Sequence type: Peptide (ix) Sequence characteristics: (A) Symbol representing characteristics: Modification site (B) Location: 4 (D) Other information. The amino acid at this position is valine, leucine, or iso It is leucine. (ix) Sequence characteristics: (A) Characteristic symbol: Modification site CB) Location 26 (D) Other information Amino acids at this site are valine, leucine, or iso It is leucine. (xi) Sequence, sequence number: 3 Gly Xaa (D) Topology: Linear (11) Sequence type, peptide (ix) Sequence characteristics: (A) Symbol representing characteristics: Modification site (B) Location, 9 (D) Other information: At this site The amino acid is valine or alanine. (x i) Sequence: Sequence number, 4 Asp Xaa Gly Xaa Tyr Xaa Cys Xaa Xaa (2) Sequence number, information on 5 (i) Sequence characteristics (A) Sequence length 28 amino acids (B) Sequence type, Amino acid (D) Topolon - linear (ii) Sequence type: Peptide (ix) Sequence characteristics: (A) Symbols representing characteristics, modification site (B) Location, 3 (D) Other information This site The amino acid in is asparagine or serine. (1x) Array characteristics. (A) Symbol representing characteristics: Modification site (B) Location, 4 (D) Other information The amino acid at this site is lysine or phenylalanine. (1x) Sequence characteristics: (A) Characteristic symbol: Modification site (B) Position II: 6 (D) Other information: The amino acid at this site is linno or isoleucine. Ru. (1x) Sequence characteristics: (A) Symbol representing characteristics: Modification site (B) Location, 7 CD) Other information: The amino acid at this site is arginine or glutamic acid. (xi) Sequence, Sequence number 5 Gly Lys Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Cys (2) Sequence number, information on 6 (1) At the time of sequence @: (A) Sequence length, 9 amino acids (B) Sequence type Amino acids (D) Topology: Linear (11) Sequence type, peptide (1x) Sequence characteristics: (A) Symbol representing characteristics: Modification site (B) Location: 1 (D) Other information: At this site The amino acid is aspartic acid or glutamic acid. acid. (ix) Features of the sequence (A) Symbol representing the feature: Modification site (B) Location: 2 (D) Other information The amino acid at this site is histidine or asI acid. (ix) Sequence characteristics: (A) Symbol representing characteristics: Modification site (B) Location: 3 (D) Other information: The amino acid at this site is histidine or Gritsuji. Ru. (1x) Characteristics of the sequence (A) Symbols representing characteristics, modification site (B) Location [:4 (D) Other information・The amino acid at this site is glycidine or histidine. Ru. (ix) Characteristics of the array. (A) Characteristic symbol: Modification site (B) Position 11:5 (D) Other information: The amino acid at this site is alanine or arginine. Ru. (xl) Sequence: SEQ ID NO. 6 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Phe Ser Cys (2) Information on SEQ ID NO. 7 (i) Sequence characteristics (A) Sequence length: 31 base pairs (B) Sequence type: Nucleic acid (C) Number of strands (D) Topology: Linear (11) Sequence type: DNA (xi) Sequence, SEQ ID NO: 7 ATTCTGCAGG CAARAAYCTS ACIIMTBMGST G 31 (2) Information on SEQ ID NO: 28 ( i) Sequence characteristics: (A) Sequence length: 31 base pairs (B) Sequence type: Nucleic acid (C) Number of strands, zero value (D) Topology, linear (E) Sequence type: DNA ( xi) Sequence: Sequence number, 8 ATTCTGCAGG CAARAGYTTY ACHMTBGART G 3 1 (2) Information on SEQ ID NO: 9 (+) Sequence characteristics: (A) Sequence length = 31 base pairs (B) Sequence type: Nucleic acid (C ) Number of chains, zero value (D) Topology: Straight chain (ii) Sequence type + DNA (xi) Sequence: SEQ ID NO: -9 ATTCTGCAGG CAARTCYTTY ACHMTBGART G 3 1 (2) Information on SEQ ID NO: 10 (i) Sequence characteristics: (A) Sequence length: 30 base pairs CB) Sequence type: Nucleic acid (C) Number of strands, zero value (D) Topology, rectilinear (11) Sequence type: DNA (xl) Sequence : SEQ ID NO: 10 ATTTCTAGARAARTTRGC3CCRTGRTSRTC30 (2) arrangement Information on column number: 11 (1) Sequence characteristics: (A) Sequence length: 30 base pairs (C) Number of chains, -zero value (D) Topology: Linear (11) Sequence type: DNA ( Xl) Sequence: SEQ ID NO: 1l ATTTCTAGARAARTTSCKRT GSCCRTSKTC30 (2) Information on SEQ ID NO: 12 (i) Sequence characteristics; (A) Sequence length 25 base pairs (B) Sequence type/nucleic acid (C) Number of strands, - Zero value (D) Topology: Linear (ii) Sequence type: DNA (xi) Sequence: SEQ ID NO: 12 GAGACTCTGCACTATGAGACCTTCG 25 (2) Sequence number, information on 13 (1) Sequence characteristics: (A) Sequence Length: 26 base pairs (B) Sequence type: Nucleic acid (C) Number of strands, -zero value (D) Toboron: linear (E) Sequence type DNA (xi) Sequence, SEQ ID NO: 13 CAGGTGATTCTCATGCAGAG TCCAGG 26(2) Sequence number Information on No. 14 (1) Sequence characteristics (A) Sequence length: 25 base pairs (B) Sequence type: Nucleic acid (C) Number of strands (D) Topology/linearity (ii) Sequence Type: DNA (xi) sequence, Sequence number: 14 CCGACATGCT GGTAAGTGTG TCCAA 25 (2) Sequence number Information on No. 15 (i) Sequence characteristics (A) Sequence length, 17 base pairs (B) Sequence type, nucleic acid (C) Number of strands, -zero value (D) Topology, linear (B) Sequence type/[INA (xi) Sequence: SEQ ID NO: 15 GACCATGAGG TGCCAAG 17(2) SEQ ID NO: 16 information (i) Sequence characteristics; (A) Sequence length: 17 base pairs (B) Sequence type・Nucleic acid (C) Number of strands (D) Topology: Linear (11) Sequence type: DNA (xl) Sequence ・SEQ ID NO: 16 ATGGTCGTCT CTGCTGG 17 (2) Information on SEQ ID NO: 17 (1 ) Sequence characteristics: (^) Sequence length = 18 base pairs (B) Sequence type, nucleic acid (C) Number of chains, -heavy chain (D) Topology, linear (I) Sequence type = DNA (xi) Sequence: SEQ ID NO. 17 TTCACCCTGCGCTGCCA^ (2) Information on SEQ ID NO. 18 (i) Sequence characteristics (A) Sequence length: 18 base pairs (B) Sequence type: Nucleic acid (C) Number of strands・-Heavy chain (D) Topology/Linear (11) Sequence type: DNA (xl) Sequence: Sequence number = 18 AAAGGGGCTCCGTGGTCG (2) Sequence number, information on 19 (1) Sequence characteristics (A) Sequence length 19 base pairs (B) Sequence type, nucleic acid (C) Number of chains - heavy chain (D) Topolon - linear (11) Sequence type: DNA (xi) Sequence Sequence number 19 CCGGTTCTTG GAGGTGGAA (2 ) Sequence number, information on 20 (i) Sequence characteristics (A) Sequence length = 20 base pairs (B) Sequence type: Nucleic acid (C) Number of chains, -heavy chain (D) Topolon: linear ls (i i) Sequence type: DNA (xi) sequence/SEQ ID NO: 20 CATGACTGTCGCATTCAGC^(2) Information on SEQ ID NO: 21 (1) Sequence characteristics: (A) Sequence length: 18 base pairs (B) Sequence type: Nucleic acid (C) Number of chains knee heavy chain (D) Topology, linear s s (i + ) Sequence type DNA (xi) Sequence: SEQ ID NO: 21 GCAAGAACCT TACCCTAC (2) SEQ ID NO: 22 Information (i) Sequence characteristics: (A) Sequence length: 19 base pairs (B) Sequence type, nucleic acid (C) Number of chains, knee heavy chain (D) Topology: linear Type DNA (xi) Sequence Sequence number 22 GAAATTGGCT CCATGGTGA 19 (2) Sequence number, information on 23 (1) Sequence characteristics. (A) Sequence length 315 base pairs (B) Sequence type/Nucleic acid (C) Number of strands/-heavy chain (D) Topology Linear (11) Sequence type DNA (genomic) (ix) Sequence type Characteristics: (A) Symbol representing characteristics: CD5 (B) Location: 1. ．． 315 (xi) Sequence/Sequence number 23 CCG GAT CGG GTA GAG CTA GTG CCT CTG CCT CCT TGG CAG CCT GTA GGT@48 Pro Asp Arg Val Glu Leu Vat Pro Leu Pro Pro Trp Gin Pro Val Glyl 5 10 15 GAG AACTTCACCTTG AGCTGCAGG GTCCCG GG G GCA GGA CCCCGA GCG 96Glu Asn Phe T hr Leu Ser Cys Arg Vat Pro Gly Ala G ly　Pro　Arg　AlaAGCCTCACA　TTG　ACCTTG　C TG CGA GGCGGA CAG GAG CTG ATT CGCCGA 144Ser Leu Thr Leu Thr Leu Leu Arg Gly Gly Gln Glu Leu lle Arg ArgAGT T TCGTA GGCGAG CCA CCCCGA GCT CGG TGT GCG ATG CTCACCGCC192Ser Phe Val Gly Glu　Pro　Pro　Arg　Ala　Arg　Cys　Ala　MeL　 Leu Thr AlaACG GTCCTG GCG CGCAGA GAG GAT CAC8GG GACAAT TTCTCA TGCCTC240T hr Val Leu Ala Arg Arg Glu Asp His A rg Asp Asn Phe Ser Cys LeuGCG GAG CT T GACCTG CGG ACA CACGGCTTG GGA CTG T TT GCA AACAGC288Ala Glu Leu Asp Leu Arg Thr flis Gly Leu Gly Leu Phe^la Asn　5erTCA　GCCCCCAGA　CAG　CTCCGCACG　T TT 315Ser Ala Pro Arg Gin Leu Arg Th r　Pheloo　105 (2) Information on array number 24 (1) Array characteristics: (A) Sequence length: 105 amino acids (B) Sequence type diamino acid (D) Topology: linear (ii) Type of sequence: protein (xl) Sequence: Sequence number; 24 Pro Asp Arg Val Glu Leu Val Pro Leu Pro Pro Trp Gin Pro Val Glyl 5 10 15 Glu Asn Phe Thr Leu Ser Cys Arg Val Pro Gly Ala Gly Pro Arg AlaSer Leu T hr Leu Thr Leu Leu Arg Gly Gly Gin lu　Leu　le　Arg　ArgSer　Phe　Val　Gly　Gl u Pro Pro Arg Ala Arg Cys Ala Met Le u Thr Ala Thr Vat Leu Ala Arg Arg Glu Asp l1is Arg Asp Asn Phe Ser Cys Le ■ Ala Glu Leu Asp Leu Arg Thr) Iis Gly 　Leu　Gly　Leu　Phe　Ala　Asn　5e■ Ser Ala Pro Arg Gin Leu Arg Thr Phel oo　105 (2) Information on array number 25 (i) Sequence characteristics, (^) Sequence length: 1295 base pairs (B) Sequence type, nucleic acid (C) Chain number knee heavyweight (D) Topology, linear (■) Type of sequence/cDNA (xl) Sequence: Sequence number: 25 NGAATTCCGG　CGGATCGGGT　AGAGCTAGTG　CCT CTGCCTCCTTGGCAGCCTGTAGGTGAG@60 AACTTCACCT TGAGCTGCAG GGTCCCGGGG GCA GGACCCCGAGCGAGCCT CACATTGACb120 TTGCTGCGAGGCGGCCAGGAGCTGATTCGCCGAA GTTTCG　TAGGCGAGCCACCCCGAGCT@180 CGGGGTGCGA TGCTCACCGCCACGGTCCTG GCGC GCAGAG AGGATCACAG GGCCAATTTb240 TCATGCCTCG　CGGAGCTTGA　CCTGCGGCCA　CAC GGCTTGG GACTGTTTGCAAACAGCTCO 300 GCCCCCAGACAGCTCCGCACGTTTGCCCATG CCTCC ACTTT CCCCGAGCCT TATTGCCCCA@360 CGATTCTTAG AAGTGGGCTCAGAAAGGCCG GTGA CTTGCA CTTTGGATGG ACTGTTTCCs 420 GCCCCAGAAG CCGGGGTTTA CCTCTCTCTG GGA GATCAGA GGCTTCATCCTAATGTGACb480 CTCGACGGGG　AGAGCCTTGT　GGCCACTGCCACAG CTACAG CAAGTGAAGA ACAGGAAGGb540 ACCAAACAGCTGATGTGCAT ACCCTCGGGGG to CGT CGAAA GCAGGGAGACCCCAGGAAAAC6O0 CTGACTGTCT　ACAGCTTCCCGGCTCCTCT　CTGA CTTTAA GTGAGCCAGA AGCCCCCGAf 660 GGAAAGATGG TGACCGTAAG CTGCTGGGCA GGG GCCCGAG CCCTTGTCACCTTGGAGGG` 720 ATTCCAAGGA CCCTCTTACCGGCCCCATCTTTAA CCTTAT　CGTATCCCCT　CTGCCTCATf　780 CCCGCAGACG　CACCTCGGCT　GGATGACTTG　GAC TGTCCCA GGAGCTGGACGTGGCCAGAf 840 GGTCCAGAGCAGACCCTCCA CTGCGAGGCCCGTG AAACCCTGAGCCCTCCGTGCACTGT 9O0 GCAAGGCCTG ACGGTGGGGCGGTGCTAGCG CTGG GCCTGT TGGGTCCAGT GACCCGTGCb960 CTCGCGGGCA CTTACCGATG TACAGCAATCAATG GGCAAG GCCAGGCGGT CAAGGATGTf 1020 ACCCTGACTG TGGAATATGCCCCAGCGCTG GACA GTGTAG GCTGCCCAGA ACGTATTACs 1080 TGGCTGGAGG GGACAGAGGCATCGCTTAGCTGGTGT GGCACACGGGGGTCCCACCACCTAGC11S0 GTGAGCTGTG TGCGCTCTGG AAAGGAGGGAA GTC ATGGAAG GGCCCCTGCG TTTTGGCCfG 1200 GAGCACGCTG GCACTTACCG ATGCGAAGCCATCA ACGCCA GGGGATCAGCGGCCAA＾AAT@1260 GTGGCTGTCA　CGGTGGAATA　TGGTCCCCGG　AAT TC1295 (2) Sequence number: 26 information (1) Array characteristics: (A) Sequence length: 4900 base pairs (B) Sequence type: Nucleic acid (C) Number of chains knee heavy chain (D) Topology, linear (11) Type of sequence: DNA (genomic) (xi) sequence, sequence number, 26 CCGAACGCTCCTCGGCCTCTGGTCTNCTCTGGNC CTGGGG ATCCTAGGCA TCTCAGGTA` 60 GAAGAGCCCCGCCCGTGGAGCNAGGTGGATAAGGC GGGGGCGGAATTGAAG GACCAGAGAG@120 GGCGGCCCGG GTGTCCCCCT CCAGGCTCCG CCC TCTTCTA GCTTCCCACG CTTCTGTC`C180 CACCTGGAGN TCGGGGCTTCTCCCCGTCCT TCCT CCACCCCCAACACACCT CAATCTTTC＾@240 GANCTGAACCCAGCACCTTTTTCTGANTNG GGGN NTTGCA CCTAACCTGT CTCAGGAGAm 300 ACTGTGGCTCTCCTGTCCTCTCCTGCTCTG TNATG CCCTA　TGGTTCACAG　ACTGGCATCA@360 TCCCTATTCA TGATCCTCAA AGACNCCATTCTCCT CAACTG TCATAACTCA GAGCTCTATS 420 CCCCCTCCACCTGGAGCCCT GGAAACCGGCTTTCT AGGGCTTTTCTCCGCGGTTCTTCC48O CGGAGTTCAG　CGTTGTGGCT　TTTTGTCCAA　GTT ACTCAAG TTTGGGGACA ATCTCCTTsA 540 AGCCTTTGACTCAGTCTCAT TTCCACTTTG CTTT TGCCCCAAGCCTCTGT GTCTCTCCCCU00 CATTTCCTGA　CGATCTGTCA　GAGTCTTAAG　AGT GATTTGG TTCCCCCATCCCCCCTCCAAb660 TGGAGTCTCCTCCTCACTAT TGATGTG, TGCATCT GAGACCCCCATCCCCG CACCGAGTTT@720 CCCCATCTCT GTCAGTAAAG AGCAAGGCTT CCA GAGACA CCCTCTAATA GCGCGTCAfT 780 CCCGAATCTT GAGTGGGATG CGGGACTCCCGTGC TATTTCTTGGCGGAGGTCTTTCCTGG@840 TCCTTATGGA CACCCCTGGT TTGGGATATG GGG GCCGCTA AGATTTC 8GA G TGGGGTbC900 CTAGGCTGAG NCCGCGTTTT CCCGGGGCAGCGGTC GCGCTA　GAACCTTTTCT　GGGCGGACCs　960 TCAGCCCCGCGTGGCGCTCG TGGAGCGCGG GGGC TCGCTG　TGGCTCAACT　GCAGCACTA`　1020 CTGTCCGAGG CCGGAGCGCG GTGGCCTGGA GAC CTCGCTA　CGCCGAAACG　GGACCCAG`G　1080 GGGTCTGNACTGNCTGGCTCGACAGCTGGT GGACA TCCGA GANCCTGAAA CCCAGCCGGT@1140 CTGCTTCTTCCNCTGCGCGCGCCGACACT CCAAG CGCGT　GGGCTCCATCCGAACTTTCCG　P200 TGAGTTCAGGGTGGGCACNCCCCTTGGGTCTCTGG ACCTCCCCTCCAAGCTCCTCCCACC12U0 CGCCCTCTGA TCCTCCTGCT TGTTCTGAAA GTA CTACAGCTGGCTAGAGCGGAGTTTTTG@1320 GTCCCTTGCA GAGCGACCGG ATCGGGTAGA GCT AGTGCCT CTGCCTCCTT GGCAGCCTfT 1380 AGGTGAGAACTTCACCTTGA GCTGCAGGGTCCCG GGGGCA GGACCCCGAG CGAGCCTCAb1440 ATTGACCTTG CTGCGAGGCG GCCAGGAGCT GAT TCGCCGA AGTTTCGTAG GCGAGCCAbC1500 CCGAGCTCGG GGTGCGATGCTCACCGCCACGGTCC TGGCG CGCAGAGAGGG ATCACAGGGCP560 CAATTTCTCA TGCCTCGCGG AGCTTGACCT GCG NCCACACGGCTTGGGACTGTTTGCANA@1620 CAGCTCAGCCCCCAGACAGCTCCGCACGTTTGGTG AGTGT　GGACCCTAACTGACAGATTT　P680 TAAGAAGTTTT AGGGCAGCCA GGCGTGGTGG CAT GGTGTCG　TAGGCCCTAA　GTCCCAGCbC1740 AAGCAGANCT AAGNCGGATCTCTTGTGAAT TAAA AGTCTA GCTCGTCTACATAACGAGGN@1800 CTGCATAGTT AAATCCCCCA AAAGTCTAAG CAG CTAGCCCTTACTTCCAA CACAAGTACs 1860 AGCTTAAGTA CTTTCTCCTG TGAGCTTTTT CCT TTATGTA TTTACTCGTT GAGAGAAA`A 1920 GAGAGTGTGT GTACGTGCCT TTATGCACAT GCC GCAGTGCTTGTATGGAA GTTAAAGAAs +, 980 AAGGAGGCGTTCTGCCCTTCCATCCTGTGGTCC TAGGGG　TGGTATTAGCTCCTCAGGCT@2040 TTGTTAGTNA CAAGCGCCTA GGCTTGGGGA GCC ATCTCGCCCGCTCCTCT GTATCTTTAf 2100 GGTGAAACCA GACAATGCAT GCAAATTGGT TGA TCAACACTGAATGTTTA GTTCGTAAAs 2160 TCAAGCTCTG TTCTTTGTCT TCCTCAGCCA TGC CTCCACT　TTCCCCCGAG　CCTTATTGbC2220 CCACGATTCT TAGAAGTGGG CTCAGAAAGG CCG GTGACKT GCACTTTGGA TGGACTGTsT 2280 CCTGCCCCAG　AAGCCGGGGT　TTACTTCTCT　CTG GGAGATCAGAGGCTTCATCCTAATGTF 2340 ACCCTCGACG GGGAGAGCCT TGTGGCCACT GCC ACAGCTA CAGCAAGTGA AGAACAGG`A 2400 GGCACCAAACAGCTGATGTG CATCGTGACCCTCGG GGGCG　AAAGCAGGGA　GACCCAGGAA@2460 AACCTGACTG TCTACAGTAA GGGGAATCCA ACA AGACCTT CAATAGCTCA GACTGGGGbT 2520 GGGGCTGGGT CTGGGTCTGG GGCCAGAGTCTCAC AAAGGCGGAGCCTATA AAAGTGGGCGG@2580 GACCTCCCACA CCAGAACAAG CCGGGCGGGA GAG TTCCAGG GCAGGAGCAG ATAGAAGTsG 2640 GAAAATTAATA GATTGGGTTG AGTTCCCTGA GTG GGGAGTG　AACCCCACCC^^TTCTCTGs　2700 CCCCAGGCTT CCCGGCTCCT CTTCTGACTT TAA GTGAGCCAGAAGCCCCCGAGGGAAAGA@2760 TGGTGACCGT AAGCTGCTGG GCAGGGGCCCGAGC CCTTGT CACCTTGGAG GGAATTCCA` 2820 GGACCCTCT　ACCGGCCCCA　TCTTTAACCT　TAT CGTATCCCCTCTGCCTCATGCCCGCAG@2880 ACGCACCTCG GCTGGATGACTTGGACTGTCCCAGG AGCTG　GACGTGGCCA　GAGGGTCCAG@2940 AGCAGACCCT CCACTGCGAG GCCCGTGGAA ACC CTGAGCCCTCCGTGGCACTGTGCAAGGCR000 CTGACGGTGG GGCGGTGCTA GCGCTGGGCCTGTT GGGTCCAGTGACCCGT GCCCTCGCGG@3060 GCACTTACCG ATGTACAGCA ATCAATGGGCAAGG CCAGGCGGTCAAGGAT GTGACCCTGA@3120 CTGTGGAATG TGAGTAGGGG GAGGTGGGCA TGC TTATCCCTTTTAAGGTCA CGGAGTGTAb3180 TGGGAGACTG GCTATACGGA AAGGAAAGAA GCC TAGGTTCAGCAGGGATT GGGAAACAb3240 TGAAGGAAAG TGGTGTGGTG TTTACAAAACT TAA CGGTGGT　AACTGGGCACGGTCTGGCA`　3300 AAACAGACAG CCAAGAGAGT GTGCCTGGGA AGC TGCAATG GGGGCTTTGT GGGAATTGfT 3360 CAACAGCACCCTGAGATCTCAGGAAAGGGG CCTGA AGTTA　TCTCCAGAACCCATGTGAAG　R420 GCAGGAAGAG AGAACGCCCA CCTTTTCCTG CTC CCCCCAA CCCCCCCCCA CATATCAC`C3480 GGAGTATATA AATAAATAAA ATGGCTCCTG CCG GAGGGAG TGAGAAGCTG TCTCCTGC`G 3540 GCTCAGAGCA GTGGTAGTGCATGCCTTTAA TCCC AGCACT CGGTAGGC^^AGGCAGGCAG@3600 ATCTCTGTGA ATGTGGGGCCAGCCTGGTCT GTAC AGAGAA ATCCTGTCTCAAAAAACAAACCR660 AGCAAAGAAA CAAAACCAAA ATCAAATTCCA GAT GCCCCAG　CGCTGGACAG　TGTAGGCTfC3720 CCANGACGTA TTACTTGNCT GGAGGGGACA GAG GCATCGCTTAGCTGTGT GGCACACGGf 3780 GTCCACCACCTAGCGTGAGCTGTGTGCGCTCTGG AAAGG AGGAAGTCAT GGAAGGGGCCCR840 CTGCGTGTGG CCCGGGAGCA CGCTGGCACT TAC CGATGCG AAGCCATC^^CGCCAGGGGO 3900 TCAGCGGNCAAAAATGTGGCTGTCACGGTG GAAT GTGAGT AGGGGTGGCT ACGGAAATGs 3960 CCACACCTGCGTCCTCTGTCCTCAGTGTGAACTCC TATTTCCCTGCTTCCTAGATGGTCC4O20 CAGTTNTGAG GAGTTGGGCT GCCCCAGCAA CTG GACTTGG GTAGAAGGAT CTGGAAAAbT 4080 GTTTTCCTGT G^^GTTGATG GG^^GCCGGA ACC ACGCGTG GAGTGCGTGG GCTCGGAGfG 4140 TG(:AAGCGAAGGGGTAGTGTTGCCCCTGGTGT CCTCGAACTCTGGTTCCA GAAAACTCT`T 4200 G person CTCCTGGT ^^CCTGTCACCGGGTATTTA CCTC TGC^^CGCCACCAACCGGCATGGCTC4Q60 CACAGTCAAA ACAGTCGTCG TGAGCGCGGA ATG TGAGCAG GGGCCCAGGT GGGCGGAG`G 4320 TACCGGGTGTCCCAGGATCTTTTCTTTCCCTGAT GCCCCT CCTTATGGTG GCTGATCTGb4380 AGCACCGCCA CAGATGGATG AATCCAGTTG CCC GAGTCACCAGACATGGCTGGAAGGAGCS440 CGAGGCTACT GCGCTGGCCT GCAGTGACAG GGG NCGCCCCTCTCCACGCG TGCGCTGTTb4500 CAGGGAAGGT GCAGCCAGGCTGGAGAGGCT ACAG GTGTCCCGAGAGGATG CGGGGACCTA@4560 CCTGTGTGTG GCTACCAACG CGCATGGCACGGAT TCACGG ACCGTCACTG TGGGTGTGG` 4620 ATGTGAGTGA GGACAGCGCT GAATGAAGACGACT CAGACCGCCAGA^^^G TGCCTTGAGG@4680 CCTGGGATGT ATGATCCAGT GGGTAGAGTG CTC AATTAGCACTCACTAAA ATGTATATTb4740 TATTCCTAAT ACTCTTTTAAT TTTANCCTTT GGG AGGCAGA GACAGGCAGA TCTCTGTTbC4800 GGGATAACCT GCTCTCTGTCTAGGACAGCT TGGT CTACAG AGGGGNTACA GGCCCCCCs 4860 CCCAAGATTG NATAGCAACCCTCTGGCTCCCTGTC TCTCT 4900 (2) Information on sequence number 27 (1) Sequence characteristics. (A) Sequence length: 4533 base pairs (B) Sequence type, nucleic acid (C) Number of chains, - heavy chain (D) Topology linear (11) Type of sequence + DNA (genomic) (xl) sequence, sequence number 27 ＾AGCTTGCAT　GCCTGCAGGT　CGACTCTAGA　GGA TCCTAGG CATCTCAGGT AAAGAAGAmC60 CCGCCGNCGG AGCCAGGTGG ATAAGGCGGG GGC GGAATTG AAGGACCAGA GAGGGCGGbC120 CGGGTGTCCCCTCCAGGCTCCGCCCTCTTCTAGCTT CCCA　CGCTTCTGCCACCACCTGGA　1W0 GCTCCGGGCT　TCTCCCTGTCCTTCCTCCACCCCCAA CACACCTCGATCTTTT CAGANNGGAA Q4O NCCAGCACCT TTTCTGAANT NGGGGTNTTG CAC CCAAACCT GGCTCAGGAG ANACTGTGfC300 TCTCCTGTTCTCTCCTGCTCTGTCGTGTCCTATGGT TCACAGACTAGCAT CATCCCTATT 3U0 TATGATCCTCAAAGACCCTATCTCCTCAACTGTCA TAACT CAGAGGCCCT GTTTCCCCTCS20 CACCTGGAGCCCTGNCAACCGGCTTTCTAG GGCTT TCCTCANGGTTCCTT CCNGG^^TCT S80 AACCTTGTGG CTTTCTGTCCAAGTTACTC^^GTTT GGGGA CAATCTCCTT TAAGCCTTTG@540 ACTCAGTCTCTCATTTCTACTTTGCTTTCG CCCCC AGCCT　NGGTGTCTCT　CCCCCCCCATT@600 TCCTGACGACCTGTCAGGGTCTTAAGAGTGACTT GGTTCCCCATCCCCCCCAAATTGGAAT U60 CTCCTCCTCCTCACTATTGA TGTGTTCATCTGAGA CCCCA TCNCTGCNCCGAGCTTCCC7Q0 ^TCTCTNCCA TAGNCAGCAA GGCTTCCAGA GAC GCCCCTCTAAGAGTGCG TCAGTCCCGO 780 ATCTTGAGTG GGATGCGGGA CTCCCGTGCT ATT TCTTGGCGGTGGTCTT CCTCGTCCTs 840 ACAGACACCCCTGGTTTGGG AGATGGGGCCACTA AGATT　TCAGAGATGG　GGTCCCTAGG@900 CTGAGCCCGCGTTTTCCTGG GCAGCGGTCG CGCT AGAACCTTTCTGGGCG GACCTTCARCX60 CACCGCGTGK CGCTCGTGGA GCRCGGGGGCTCYC TGTGKCTCAACTGCAG CACTAACTGT@1020 CCNCGNCCGG AGCRCGGTGK CCTGGAGACCTCNC TACRCCGAAACGGGAN CCAGAGGGGT@1080 CTNCKCTGNCTGNCTCGNCA GCTGGTGGACATCCG AGANCCTGAGANCCA NCNGGTCTGC1P40 TTCTTCCGCT GCGCGCGCCK CACACTCCAA GCG CGTGGACTCATCCGAACTTTCCGTGAG@1200 TACAGTGTGRACACNCCCT　TGGNTGCCCT　GGAC CTCCCCCTAAAGCTCCGCCCCCCGT P260 TCTCTGGTCCTCCTTCCTAG GCTTGTNCTG AGAN CACTACAGCTCGCTAAAGCCCAGGTT@1320 TTGGTCCCTT GCAGANCGACCGGATCGGGT AGAN CTGGTN CCGCTCCCTT CTTGGCAGCb1380 AGTGGGCGAG AACTTCACCT TGANCTGCAG GKY CCNGGKA GCAGGACCCCGAGCGAGCCs 1440 CACATTGACCCTGCTGCGGGGCGGCCAGGAGCTG ATTCGCCGCAGTTTCG TAGGCGAGCCP500 ACCCCGAGCG　CGGGGTGCGA　TGCTCACCGCCAGG GTCCTG GCACGCAGGG AGGACCACAf 1560 GGTCAATTCTCATGCNTCG CCGANCNTGA GCTN NNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNm 162O NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNN NNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNmN +68O NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN ACACTGT AGCTGTCTTCAGACACACC` 1740 GAAGAGGGCG TCAGATCTCA TNACAGATGG NTG TGANCCA CCATGTGGNT CCTGGGATsT 1800 GNACTTCGGA CCTNCGSAAG AGCAGTCGGG TGC TCTTACCCACTTGAGCCCATCTCTCCAG@186O NCCCAAGTGCTTTCTTCTGYGGTCTTTYTTCTTTAT GCATT TATTTATTGA GAGAAAAAAGA@1920 GAGTGTGTGT ATATGCGTTT ATGCACATGCCACA GTGCAT GTGTGGAAGT TAAAGGATA` 1980 GTAGGAGTTT AGTTCTCTCT TTCCATCATG TAG GTCCTGG GGATCGAGTCAAGTCAGGCs 2040 TAACAACAAG CACCTAAAACT Ding GT to GTGCCA TCT CGCCCGCCCTTCTGTATTTTTAGGATf 2100 AAACCAAACA ATGCATGCAA ATTGGCTGT CAA CACTGAA TGCTTAGTTCATAAAACTCA` 2160 ATCCTGTTCTTTGTCCGCCCCAGCCATGCCTCCAC ATTNCCCCGAGTCTT ATTGCTCCCCC2Q20 GAGTCTTAG A to TGGACTCA GAAAGNCCGG TGA IIKTSCACGWTG ATGGA CTGTTTCCsG 2280 CCCCAGAAGCCGGGGTTTACCTCTCTCTGG GAGAT CAGAG GCTCCAATCCTAATGTGACC2R40 CTCGATGGGG ACAGNCKKGCTGNCCACTGCN CAG CTACA CC 8 NCGCAG AACAGGAAGG@2400 CACCACNCAN CTGATGTGCG TCGTGACCCT CGG GGGCG 8A To AGC GGGAGA CCCAGGAA`A 2460 CCTGNCTGTT TACAGTAAGG GGAATCCAGG GGG CCTTCAT　TGTCTGGGGCTGGAACCAG`　2520 GTCTCACAGA GGCGGAGCCA ATAAAGTGGG NGG GGCGTCT ACACCAG^^A AAGCAGGGbA 2580 GGAGAGTTCCAGGGCAGGAG CAGGTAGAAG CTGG AAATGA ATAAAATAGAA GGGGTTGAGs 2640 TACCTGAGTG GGGAGTGAACCCCACCCAAT TCTC CGCCCT　CAGGCTTCACCGACTCCTCT@2700 TCTGACTTT GAGTGAGCCA GAAGCCNCCCGAGG GAAAAAA ATGGTGACCA TAANCTNCTf 2760 GNCAGGGGCT CGANCCCTTG TCACCCTGGA GGG AATTCCA GCTGCGGTCCCGGGGCAGCb2820 CNCTGAGCTCCAGNTAAATGTTACAAAGANCGAT GACAAN CGGGGCTTCT TCTNCGACNb2880 CGCCCTCGAT GTGGTRCGGG GAAACTCTAA GAA AAAACCA GAGCTCTGAG CTTCGTGTbC2940 TGTGTGAGTG GATGCTCACCCTANCTCTGT GACC TCCAAA GCCCCTATTA CCTGCTCCAs 3000 CYTTAACCTT ATCTATCTCCTCTGCCTCGT GCCC GCAGAT GCACCTCNCCTGGATGACTT@3060 GGATTGTCCCAGAANCTGGA CGTGNCCAGA GGGT CCAGAG CAGACCCTCY WCTGSGNGNl 312O NMGMGRAAAACCCTGAGCCCT CGGTGCACTG TGCA AGGCCT GAGGNCGGGGN CGGTGCTAGb3180 RSTGGSCGCT ATTGGGTCCA GTGACCCGTG CCC TCGCAGG CACTTACCGA TGCACAGC`G 3240 TCAATGGGCA AGGCCAGGCG G-CAAAGATG TGA CCCTGACCGTGGAATGT GAGTCGGGAf 3300 AGGCATGCAT GCCC^^GTTCACCGAGTTAG GGGA GACGGG CCTATACGGA CAGGAAAGA` 3360 GCTGGATTCT NCAGGGATTG GGAAAACACT GAA GGGAAGT GTAGGTGGGA CTGTGGGAbT 3420 GGGTACAGTCTGNCAAAAAACA(JCAGTCAA GAGAG TGTACCGGGGAGTGCTTTGTGGGGGW 3S80 TCAGTCAGCA GCATCCTGAG ACCTCAGGAA AGG GNCCTGA TCACCTGAAG TGATGNCC`G 3540 AACCCATGTG AAGGTGGGAG GAGAGAACGCCTAC CTTTTCATGCTTTCCCACACACACATAT R600 CGTACAGAGT AAATAGAAAA GTAAAATGGT ACA TGCCAGA GTGAGAAGCT GTCTCCCG`A 3660 GGCATAGAACAGTGGTAATN CACGCCTTTA ATCC CAGCACCCTGTAGSCA AAGGCAGGCA@3720 CATCTCTGAG　TTTGAGGCCA　GCCTGGTCTA　CAG AGCAAGT　TCCAGNCCAG　CCTGNTCT`C3780 ATAGGGAATT CCTGTCTCAA AATAAAACANA CAN NAANCCA AAACCWWAGT C3ATYCNAfA 3840 WGCCCAGCG CTGGACAGTG TAGNCTGCCCAGAA CATATT ACTTGNCTGG AGGGAACGG` 3900 GGCATCGCT　ANCTGTGTGGG　CACACGGGGT　CCC ACCT to 8C AGCGTGAGTT GTGTGCGCsC3960 TGGAAAGGAG GAAGTCATGG AAAGGGCCTCT GCG CGTGGCCCGGGAGCACCG CCGGCACTT` 4020 CCGATGCGAA GCCATCAACG CCAGAGGATCAGC NCCAAA AAATGTGNCCG TCACGGTGG` 4080 ATGTGAGTAG G to GTGACTGCAGAGAAGTCCCGAC CCGCA dingCCTCTGTCCTCTATGTCCA S140 AACTCTTATT TNCCTGNTTCCKAGATGGKS MMAG TTTTGA　GGAGTTGGGCTGCCCCAGCA@4200 ACTGGACGTG GGTAGAGGGA TCTGGAAAGCTGTT TTCCTG　TGAAGTTGAT　GGGAAGCCAf　4260 AACCACGTGT GGAGTGCGTA GGCTCGGAGG GTG CAAGCGA AGGGATAGTG TTGCCCTTfG 4320 TGTCCTCAAA CTCTGGTCCT AG, AAAACTCTA TG ACCCCTGG TAACCTGTCA CCGGGCAsTT 4380 ACCTCTGCAA　CGCCACCAACCCGGCACGGCT　CCAC AGTCAA　AACAGTCGTCGTGAGCGCGG@4440 AGTGTGAGCA GGGGCCCAGG TGGGCGGAAA GTA CCGGGTG TCCCAGGATCCCCGGGGTACb4500 GAGCTCGAAT TCGCCCTATA GTGAGTCGTA GGC 4533 (2) Sequence number: 28 information (i) Sequence characteristics・ (^) Sequence length = 5 amino acids (B) Sequence type diamino acid (D) Topology: linear (ii) Type of sequence, peptide (xi) Sequence: Sequence number: 28 Asp Gly Gln Ser Thr (2) Information on sequence number 29 (1) Array characteristics: (A) Sequence length, 5 amino acids (B) Sequence type, amino acid (D) Topology linear (eye) Sequence type peptide (xi) Sequence: Sequence number: 29 Gly Asp Gln Arg Leu (2) Information on sequence number 30 (i) Sequence characteristics. (A) Sequence length: 28 base pairs (B) Sequence type, nucleic acid (C) Number of chains - heavy chain (D) Topology/linear (ii) Type of sequence: DNA (Old) Sequence: Sequence number: 30 ACCGAATTCG　TTTCTGGGCG　ACCTTTCAG(2) Sequence number Information on number = 31 (1) Array characteristics: (A) Sequence length: 27 base pairs (B) Sequence type, nucleic acid (C) Number of chains knee heavy chain (D) Topology: linear (1) Types of sequences/DNA (xi) Sequence: Sequence number: 31 TGGAATTCGCTCACGGA^^G TTCGGAT (2) Sequence number: 32 information (1) Sequence characteristics. (A) Sequence length: 28 base pairs (B) Sequence type: Nucleic acid (C) Number of chains knee heavy chain (D) Topology: linear (11) Type of sequence: DNA (xi) Sequence number 2 = 32 GCGAATTCGG GTAGAGCTAG TGCCTCTG (2) Sequence number No. 33 information (i) Sequence characteristics: (A) Sequence length: 27 base pairs (,B) Sequence type: Nucleic acid (C) Number of chains, - heavy chain (D) Topology; linear 2g (ii) Type of sequence: DNA (xi) Sequence: Sequence number 33 TGGAATTCGA AACGTGCGGA GCTGTCT (2) Sequence number :34 information (i) Sequence characteristics: (A) Sequence length = 21 base pairs (B) Sequence type: Nucleic acid (C) Number of chains knee heavy chain (D) Topology: linear 2-t (+i) sequence type, DNA (xi) sequence: Sequence number = 34 CTGCCCCTGA ATCACCCTCG A 21 (2) Sequence number 35 information (i) Sequence characteristics (A) Sequence length: 17 base pairs (B) Sequence type: Nucleic acid (C) Number of chains - heavy chain (D) Topology, linear (11) Type of sequence: DNA (xi) Sequence/Sequence number: 35 GTAAAACGACGGCCAGT 17(2) Information on sequence number: 36 (1) Array characteristics (A) Sequence length, 33 base pairs (B) Sequence type: Nucleic acid (C) Number of chains - heavy chain (D) Topology/linear (eye) Type of sequence: DNA (xi) Sequence Sequence number, 36 CAGGTCCCGG TCATCATCAT CATCATCATT AAT 33(2) Information on array number 37 (1) Array characteristics (A) Sequence length = 40 base pairs (B) Sequence type, nucleic acid (C) Number of chains - heavy chain (D) Topology: linear (11) Type of sequence: DNA (xi) Sequence: Sequence number: 37 TAGATTAATG ATGATGATGA TGATGACCGG GAC CTGAGCT 40 (2) Sequence number: 38 information (i) Sequence characteristics: (A) Sequence length: 10 amino acids CB) Sequence type/amino acid (D) Topology; linear (11) Type of sequence: peptide (xi) Sequence, sequence number: 38 Val Leu Ser Ala Gly Gly Ser Leu Phe Vall 5 10 (2) Information on array number = 39 (i) Sequence characteristics: (A) Sequence length: 10 amino acids (B) Sequence type, amino acid (D) Topology/linear (ii) Type of sequence: peptide (xi) Sequence, sequence number, 39 Leu Ser Ala Gly Gly Ser Leu Phe Val Asn(2) Sequence number = 40 information (i) Sequence characteristics: (A) Sequence length: 33 base pairs (B) Sequence type/nucleic acid (C) Number of knee heavy chains (D) Topology: vertical (11) Type of sequence: DNA (xi) Sequence, sequence number: 40 AGAGGGGAGG GGTGCTAGCT CCACCCGTTCTGG ( 2) Information on array number 41 (i) Sequence characteristics: (A) Sequence length: 27 base pairs (B) Sequence type: Nucleic acid (C) Number of chains - heavy chain (D) Topology: linear (ii) Type of sequence/DNA (xl) Sequence: Sequence number = 41 GAGCGTGTGG AGCTAGCCACCCTGCCT (2) Sequence number: 42 information (1) Array characteristics: (A) Sequence length: 27 base pairs (B) Sequence type: Nucleic acid (C) Number of chains, - heavy chain (D) Topology, linear (11) Type of sequence: DNA (zi) Sequence: Sequence number 42 GGGGGAGTCG CTAGCAGGACAAAGGTC (2) Sequence number 43 information (i) Sequence characteristics. (^) Sequence length: 36 base pairs (B) Sequence type: Nucleic acid (C) Number of chains knee heavy chain (D) Topology: linear 33 (ii) Type of sequence: DNA (xl) Sequence: Sequence number = 43 CGAACCTTTG　TCCTGCTAGCGACCCCCCCG　CGCC TC(2) Sequence number: 44 information (i) Sequence characteristics: (^) Sequence length: 39 base pairs (B) Sequence type: Nucleic acid (C) Number of chains - heavy chain (D) Topology: linear 21 (ii) Type of sequence: DNA (xl) Sequence, sequence number: 44 TGAGACCTCT GGCTTCCTTA＾GATCACGTT GGGC GCCCG (2) Sequence number: 45 information (1) Array characteristics: (A) Sequence length = 30 base pairs (B) Sequence type: Nucleic acid (C) Number of chains knee heavy chain (D) Topology: linear 27 (ii) Type of sequence: DNA (xl) Sequence: Sequence number = 45 GACCCATTGT GAACTTAAGCGAGCCCCACCGa) Lot cor+1 lof -〇 0)　rv”)　fz　CsJ　1. 0u-)q co　μco　l'-,, r'-, Ward 03 Ward Ward Figure 2A Figure 2B Figure 3A Figure 3B cell line 1) No stimulation Mouth anti-CD11a (TS1/22. 1) Mouth PMA stimulation Negative control a-tech CAM-Ra ICAM4 a-tech CAM-2 fluorescence intensity □ Figure 7A -11 Haku Isso IF made of bamboo Figure 9B αCD3 concentration (ng/ml) Dressed up to Lord Muri Child／(,OT　X) Usui↓g (%9↓Cup Agony Gophanist Technique 3 hours 5 hours 7 hours 72 hours Incubation time CDJ÷CD45R○10 Rui Nakagome's Momme 1 CD4. CD45RA. cultured cells Z　IcF? -1,1 Continuation of front page (51) Int, C1, 6 identification symbol Internal office reference number A61K 39/395 ABA AED D 9284-4C CO7K 14/705 ZNA 8318-4H16/28 8318-4H C12N 15109 C12P 21102 C9282-48GOIN 33153 D 7055 -2J//(C12P 21108 C12R1:91) (C12P 21102 C12R1:91) (C12P 21102 C12R1:19) (81) Specified times EP (AT, BE, CH, DE. DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE) , C.A., J.P. I

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有するＩＣＡＭ−Ｒに特異的に結合す るポリペプチドもしくはペプチド。 ２．請求の範囲第１項による抗体基質。 ３．請求の範囲第２項によるモノクローナル抗体。 ４．ＩＣＡＭ−Ｒに特異的に結合する、請求の範囲第３項に記載のモノクローナ ル抗体の断片。 ５．請求の範囲第３項に記載のモノクローナル抗体であって、（ａ）ＩＣＡＭ− Ｒの第一細胞外領域；（ｂ）ＩＣＡＭ−Ｒの第二細胞外領域；（ｃ）ＩＣＡＭ− Ｒの第三細胞外領域；（ｄ）ＩＣＡＭ−Ｒの第四細胞外領域；（ｅ）ＩＣＡＭ− Ｒの第五細胞外領域；および（ｆ）ＩＣＡＭ−Ｒの細胞質領域、 からなるグループから選択されたＩＣＡＭ−Ｒの領域のエピトープと特異的に結 合するモノクローナル抗体。 ６．請求の範囲第３項に記載のモノクローナル抗体であって、２６Ｅ３Ｄ−１（ ＡＴＣＣＨＢ１１０５３）、２６Ｉ１８Ｆ−２（ＡＴＣＣＨＢ１１０５４）、２ ６Ｉ１０Ｅ−２（ＡＴＣＣＨＢ１１０５５）、２６Ｈ１１Ｃ−２（ＡＴＣＣＨＢ １１０５６）、４２Ｃ５Ｈ（ＡＴＣＣＨＢ１１２３５）、４２Ｄ９Ｂ（ＡＴＣＣ ＨＢ１１２３６）、４３Ｈ７Ｃ（ＡＴＣＣＨＢ１１２２１）、４６Ｄ７Ｅ（ＡＴ ＣＣ１１２３２）、４６Ｉ１２Ｈ（ＡＴＣＣＨＢ１１２３１）、６３Ｅ１１Ｄ（ ＡＴＣＣＨＢ１１４０５）、６３Ｇ４Ｄ（ＡＴＣＣＨＢ１１４０９）、６３Ｈ４ Ｃ（ＡＴＣＣＨＢ１１４０８）、６３Ｈ６Ｈ（ＡＴＣＣＨＢ１１４０７）、６３ １１Ｃ（ＡＴＣＣＨＢ１１４０６）、および６３１６Ｇ（ＡＴＣＣＨＢ１１４０ ４）、からなるグループから選択されたハイプリドーマ細胞系によって産生され たモノクローナル抗体。 ７．ＩＣＡＭ−Ｒに結合する請求の範囲第６項に記載のモノクローナル抗体と拮 抗するモノクローナル抗体。 ８．ＩＣＡＭ−ＲのエピトープＶＬＳＡＧＧＳＬＦＶ（配列番号：２６）あるい はＬＳＡＧＧＳＬＦＶＮ（配列番号：２７）を認識するモノクローナル抗体。 ９．請求の範囲第３項に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細 胞系。 １０請求の範囲第１３項に記載のハイブリドーマ細胞系であって、２６Ｅ３Ｄ− １（ＡＴＣＣＨＢ１１０５３）、２６Ｉ１８Ｆ−２（ＡＴＣＣＨＢ１１０５４） 、２６Ｉ１０Ｅ−２（ＡＴＣＣＨＢ１１０５５）、２６Ｈ１１Ｃ−２（ＡＴＣＣ ＨＢ１１０５６）、４２Ｃ５Ｈ（ＡＴＣＣＨＢ１１２３５）、４２Ｄ９Ｂ（ＡＴ ＣＣ１１２３６）、４３Ｈ７Ｃ（ＡＴＣＣＨＢ１１２２１）、４６Ｄ７Ｅ（ＡＴ ＣＣ１１２３２）、４６Ｉ１２Ｈ（ＡＴＣＣＨＢ１１２３１）、６３Ｅ１１Ｄ（ ＡＴＣＣＨＢ１１４０５）、６３Ｇ４Ｄ（ＡＴＣＣＨＢ１１４０９）、６３Ｈ４ Ｃ（ＡＴＣＣＨＢ１１４０８）、６３Ｈ６Ｈ（ＡＴＣＣＨＢ１１４０７）、６３ Ｉ１Ｃ（ＡＴＣＣＨＢ１１４０６）、および６３１６Ｇ（ＡＴＣＣＨＢ１１４０ ４）、からなるグループから選択されたハイブリドーマ細胞系。 １１．ＩＣＡＭ−Ｒに特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法であって 、下記工程、すなわち； （ａ）２６Ｅ３Ｄ−１（ＡＴＣＣＨＢ１１０５３）、２６Ｉ１８Ｆ−２（ＡＴＣ ＣＨＢ１１０５４）、２６Ｉ１０Ｅ−２（ＡＴＣＣＨＢ１１０５５）、２６Ｈ１ １Ｃ−２（ＡＴＣＣＨＢ１１０５６）、４２Ｃ５Ｈ（ＡＴＣＣＨＢ１１２３５） 、４２Ｄ９Ｂ（ＡＴＣＣＨＢ１１２３６）、４３Ｈ７Ｃ（ＡＴＣＣＨＢ１１２２ １）、４６Ｄ７Ｅ（ＡＴＣＣ１１２３２）、４６Ｉ１２Ｈ（ＡＴＣＣＨＢ１１２ ３１）、６３Ｅ１１Ｄ（ＡＴＣＣＨＢ１１４０５）、６３Ｇ４Ｄ（ＡＴＣＣＨＢ １１４０９）、６３Ｈ４Ｃ（ＡＴＣＣＨＢ１１４０８）、６３Ｈ６Ｈ（ＡＴＣＣ ＨＢ１１４０７）６３Ｉ１Ｃ（ＡＴＣＣＨＢ１１４０６）、および６３１６Ｇ（ ＡＴＣＣＨＢ１１４０４）、からなるグループから選択されたハイブリドーマ細 胞系を培養し、および（ｂ）そこからモノクローナル抗体を単離する。 １２．請求の範囲第３項に記載のモノクローナル抗体基質に特異的な、抗イディ オタイプ抗体基質。 １３．請求の範囲第３項あるいは第１２項によるヒト型化抗体基質。 １４．ＩＣＡＭ−Ｒへの細胞のＣＤ１８依存性接着をブロックする請求の範囲第 ３項に記載のモノクローナル抗体。 １５．ＩＣＡＭ−Ｒへの細胞のＣＤ１８非依存性接着をブロックする請求の範囲 第３項に記載のモノクローナル抗体。 １６．ＳＥＡによるリンパ球活性化を調節する請求の範囲第３項に記載のモノク ローナル抗体。 １７．ＳＥＡによるリンパ球活性化をブロックする請求の範囲第３項に記載のモ ノクローナル抗体。 １８．同種抗原によるリンパ球活性化をブロックする請求の範囲第３項に記載の モノクローナル抗体。 １９．ＩＣＡＭ−Ｒへの細胞のＣＤ１８依存性接着をブロックし、およびＳＥＡ によるリンパ球活性化をブロックする請求の範囲第３項に記載のモノクローナル 抗体。 ２０．ＩＣＡＭ−Ｒへの細胞のＣＤ１８依存性接着をブロックし、および同種抗 原によるリンパ球活性化をブロックする請求の範囲第３項に記載のモノクローナ ル抗体。 ２１．ＳＥＡによるリンパ球活性化をブロックし、および同種抗原によるリンパ 球活性化をブロックする請求の範囲第３項に記載のモノクローナル抗体。 ２２．ＩＣＡＭ−Ｒへの細胞のＣＤ１８依存性接着をブロックし、ＳＥＡによる リンパ球活性化をブロックし、および同種抗原によるリンパ球活性化をブロック する請求の範囲第３項に記載のモノクローナル抗体。 ２３．請求の範囲第３項に記載のモノクローナル抗体であって、ＩＣＡＭ−Ｒへ 結合するモノクローナル抗体が；（ａ）Ｆ２１Ｖ／ＡＳ、Ｅ３２Ｋ／ＡＳ、Ｅ３ ７Ｔ／ＡＳ、Ｋ３３１／ＡＬ、Ｗ５１Ａ／ＡＳ、およびＹ７０／Ａから構成され るＩＣＡＭ−Ｒアミノ酸配列（配列番号：１）の修飾の影響を受け；および （ｂ）Ｔ３８／Ａ、Ｌ４０／Ａ、Ｋ４２Ｅ／ＡＳ、Ｅ４３／Ａ、Ｌ４４Ｖ／ＡＬ 、Ｒ６４／Ｑ、Ｓ６８／Ａ、Ｎ７２／Ｑ、Ｑ７５１／ＡＳ、およびＮ８１／Ｑか ら構成されるＩＣＡＭ−Ｒアミノ酸配列（配列番号：１）の修飾の影響を受けな いモノクローナル抗体。 ２４．請求の範囲第３項に記載のモノクローナル抗体であって、ＩＣＡＭ−Ｒへ 結合するモノクローナル抗体が；（ａ）Ｆ２１Ｖ／ＡＳ、Ｅ３２Ｋ／ＡＳ、Ｋ３ ３Ｉ／ＡＬ、Ｗ５１Ａ／ＡＳ、およびＹ７０／Ａから構成されるＩＣＡＭ−Ｒア ミノ酸配列（配列番号：１）の修飾の影響を受け；および （ｂ）Ｅ３２Ｋ／ＡＳ、Ｔ３８／Ａ、Ｌ４０／Ａ、Ｋ４２Ｅ／ＡＳ、Ｅ４３／Ａ 、Ｌ４４Ｖ／ＡＬ、Ｒ６４／Ｑ、Ａ６８／Ａ、Ｎ７２／Ｑ、Ｑ７５１／ＡＳ、お よびＮ８１／Ｑから構成されるＩＣＡＭ−Ｒアミノ酸配列（配列番号：１）の修 飾の影響を受けないモノクローナル抗体。 ２５．請求の範囲第３項に記載のモノクローナル抗体であって、ＩＣＡＭ−Ｒへ 結合するモノクローナル抗体が；（ａ）Ｐ２１Ｖ／ＡＳ、Ｅ３２Ｋ／ＡＳ、Ｅ３ ７Ｔ／ＡＳ、およびＹ７０／Ａから構成されるＩＣＡＭ−Ｒアミノ酸配列（配列 番号：１）の修飾の影響を受け；および （ｂ）Ｅ３３Ｉ／ＡＬ、Ｗ５１Ａ／ＡＳ、Ｔ３８／Ａ、Ｌ４０／Ａ、Ｋ４２Ｅ／ ＡＳ、Ｅ４３／Ａ、Ｌ４４Ｘ／ＡＬ、Ｒ６４／Ｑ、Ｓ６８／Ａ、Ｎ７２／Ｑ、Ｑ ７５Ｉ／ＡＳ、およびＮ８１／Ｑから構成されるＩＣＡＭ−Ｒアミノ酸配列（配 列番号：１）の修飾の影響を受けないモノクローナル抗体。 ２６．請求の範囲第３項に記載のモノクローナル抗体であって、ＩＣＡＭ−Ｒへ 結合するモノクローナル抗体が；（ａ）Ｆ２１Ｖ／ＡＳから構成されるＩＣＡＭ −Ｒアミノ酸配列（配列番号１）の修飾の影響を受け；および （ｂ）Ｅ３２Ｋ／ＡＳ、Ｅ３７Ｔ／ＡＳ、Ｋ３３１／ＡＬ、Ｔ３８／Ａ、Ｌ４０ ／Ａ、Ｋ４２Ｅ／ＡＳ、Ｅ４３／Ａ、Ｌ４４Ｖ／ＡＬ、Ｗ５１Ａ／ＡＳ、Ｒ６４ ／Ｑ、Ａ６８／Ａ、Ｙ７０／Ａ、Ｎ７２／Ｑ、Ｑ７５Ｉ／ＡＳおよびＮ８１／Ｑ から構成されるＩＣＡＭ−Ｒアミノ酸配列（配列番号：１）の修飾の影響を受け ないモノクローナル抗体。 ２７．請求の範囲第３項に記載のモノクローナル抗体であって、ＩＣＡＭ−Ｒへ 結合するモノクローナル抗体が；（ａ）Ｆ２１Ｖ／ＡＳ、Ｅ３７Ｔ／ＡＳ、Ｗ５ １Ａ／ＡＳ、およびｑ７５Ｉ／ＡＳから構成されるＩＣＡＭ−Ｒアミノ酸配列（ 配列番号：１）の修飾の影響を受け；および （ｂ）Ｅ３２Ｋ／ＡＳ、ｋ３３１／ＡＬ、Ｔ３８／Ａ、Ｌ４０／Ａ、Ｋ４２Ｅ／ ＡＳ、Ｅ４３／Ａ、Ｌ４４Ｖ／ＡＬ、Ｒ６４／Ｑ、Ｓ６８／Ａ、Ｙ７０／Ａ、Ｎ ７２／Ｑ、およびＮ８１／Ｑから構成されるＩＣＡＭ−Ｒアミノ酸配列（配列番 号１）の修飾の影響を受けないモノクローナル抗体。 ２８．請求の範囲第３項に記載のモノクローナル抗体であって、ＩＣＡＭ−Ｒへ 結合するモノクローナル抗体が；（ａ）Ｆ２１Ｖ／ＡＳ、およびＷ５１Ａ／ＡＳ から構成されるＩＣＡＭ−Ｒアミノ酸配列（配列番号：１）の修飾の影響を受け ；および（ｂ）Ｅ３２Ｋ／ＡＳ、Ｅ３７Ｔ／ＡＳ、Ｋ３３Ｉ／ＡＬ、Ｔ３８／Ａ 、Ｌ４０／Ａ、Ｋ４２Ｅ／ＡＳ、Ｅ４３／Ａ、Ｌ４４Ｖ／ＡＬ、Ｒ６４／Ｑ、Ｓ ６８／Ａ、Ｙ７０／Ａ、Ｎ７２／Ｑ、Ｑ７５Ｉ／ＡＳおよびＮ８１／Ｑから構成 されるＩＣＡＭ−Ｒアミノ酸配列（配列番号：１）の修飾の影響を受けないモノ クローナル抗体。 ２９．請求の範囲第３項に記載のモノクローナル抗体であって、ＩＣＡＭ−Ｒへ 結合するモノクローナル抗体が；（ａ）Ｆ２１Ｖ／ＡＳ、Ｅ３２Ｋ／ＡＳ、Ｅ３ ７Ｔ／ＡＳ、Ｋ４２Ｅ／ＡＳ、Ｌ４４Ｖ／ＡＬ、Ｗ５１Ａ／ＡＳ、Ｙ７０／Ａお よびＱ７５１／ＡＳから構成されるＩＣＡＭ−Ｒアミノ酸配列（配列番号：１） の修飾の影響を受け；および（ｂ）Ｋ３３Ｉ／ＡＬ、Ｔ３８／Ａ、Ｌ４０／Ａ、 Ｅ４３／Ａ、Ｒ６４／Ｑ、Ｓ６８／Ａ、Ｎ７２／Ｑ、およびＮ８１／Ｑから構成 されるＩＣＡＭ−Ｒアミノ酸配列（配列番号：１）の修飾の影響を受けないモノ クローナル抗体。 ３０．請求の範囲第３項に記載のモノクローナル抗体であって、ＩＣＡＭ−Ｒへ 結合するモノクローナル抗体が；（ａ）Ｆ２１Ｖ／ＡＳ、Ｅ３２Ｋ／ＡＳ、およ びＷ５１Ａ／ＡＳから構成されるＩＣＡＭ−Ｒアミノ酸配列（配列番号：１）の 修飾の影響を受け；および （ｂ）Ｋ３３Ｉ／ＡＬ、Ｅ３７Ｔ／ＡＳ、Ｔ３８／Ａ、Ｌ４０／Ａ、Ｋ４２Ｅ／ ＡＳＥ４３／Ａ、Ｌ４４Ｖ／ＡＬ、Ｒ６４／Ｑ、Ｓ６８／Ａ、Ｙ７０／Ａ、Ｎ７ ２／Ｑ、Ｑ７５Ｉ／ＡＳ、およびＮ８１／Ｑから構成されるＩＣＡＭ−Ｒアミノ 酸配列（配列番号：１）の修飾の影響を受けないモノクローナル抗体。 ３１．請求の範囲第３項に記載のモノクローナル抗体であって、ＩＣＡＭ−Ｒへ 結合するモノクローナル抗体が；（ａ）Ｆ２１Ｖ／ＡＳから構成されるＩＣＡＭ −Ｒアミノ酸配列（配列番号１）の修飾の影響を受け；および （ｂ）Ｅ３２Ｋ／ＡＳ、Ｅ３７Ｔ／ＡＳ、Ｋ３３Ｉ／ＡＬ、Ｔ３８／Ａ、Ｌ４０ ／Ａ、Ｋ４２Ｅ／ＡＳ、Ｅ４３／Ａ、Ｌ４４Ｖ／ＡＬ、Ｗ５１Ａ／ＡＳ、Ｒ６４ ／Ｑ、Ｓ６８／Ａ、Ｙ７０／Ａ、Ｎ７２／Ｑ、Ｑ７５Ｉ／ＡＳ、およびＮ８１／ Ｑから構成されるＩＣＡＭ−Ｒアミノ酸配列（配列番号：１）の修飾の影響を受 けないモノクローナル抗体。 ３２．請求の範囲第３項に記載のモノクローナル抗体であって、ＩＣＡＭ−Ｒへ 結合するモノクローナル抗体が；（ａ）ＩＣＡＭ−Ｒへの細胞のＣＤ１８依存性 接着をブロックし、ＳＥＡによるリンパ球活性化をブロックし、および同種抗原 によるリンパ球活性化をブロックし； （ｂ）Ｆ２１Ｖ／ＡＳ、Ｅ３２Ｋ／ＡＳ、Ｅ３７Ｔ／ＡＳ、Ｋ３３Ｉ／ＡＬ、Ｗ ５１Ａ／ＡＳ、およびＹ７０／Ａから構成されるＩＣＡＭ−Ｒアミノ酸配列（配 列番号：１）の修飾の影響を受け；および （ｃ）Ｔ３８／Ａ、Ｌ４０／Ａ、Ｋ４２Ｅ／ＡＳ、Ｅ４３／Ａ、Ｌ４４Ｖ／ＡＬ 、Ｒ６４／Ｑ、Ｓ６８／Ａ、Ｎ７２／Ｑ、Ｑ７５Ｉ／ＡＳ、およびＮ８１／Ｑか ら構成されるＩＣＡＭ−Ｒアミノ酸配列（配列番号：１）の修飾の影響を受けな いモノクローナル抗体。 ３３．請求の範囲第３項に記載のモノクローナル抗体であって、ＩＣＡＭ−Ｒへ 結合するモノクローナル抗体が；（ａ）ＳＥＡによるリンパ球活性化をブロック し、および同種抗原によるリンパ球活性化をブロックし；（ｂ）Ｅ２１Ｖ／ＡＳ 、Ｅ３２Ｋ／ＡＳ、Ｋ３３Ｉ／ＡＬ、Ｗ５１Ａ／ＡＳ、およびＹ７０／Ａから構 成されるＩＣＡＭ−アミノ酸配列（配列番号：１）の修飾の影響を受け；および （ｃ）Ｅ３２Ｋ／Ａｓ、Ｔ３８／Ａ、Ｌ４０／Ａ、Ｋ４２Ｅ／ＡＳ、Ｅ４３／Ａ 、Ｌ４４Ｖ／ＡＬ、Ｒ６４／Ｑ、Ｓ６８／Ａ、Ｎ７２／Ｑ、Ｑ７５Ｉ／ＡＳ、お よびＮ８１／Ｑから構成されるＩＣＡＭ−Ｒアミノ酸配列（配列番号：１）の修 飾の影響を受けないモノクローナル抗体。 ３４．請求の範囲第３項に記載のモノクローナル抗体であって、ＩＣＡＭ−Ｒへ 結合するモノクローナル抗体が；（ａ）ＩＣＡＭ−Ｒへの細胞のＣＤ１８依存性 接着をブロックし、およびＳＥＡによるリンパ球活性化をブロックし；（ｂ）Ｆ ２１Ｖ／ＡＳ、Ｅ３２Ｋ／ＡＳ、Ｅ３７Ｔ／ＡＳ、およびＹ７０／Ａから構成さ れるＩＣＡＭ−Ｒアミノ酸配列（配列番号：１）の修飾の影響を受け；および （ｃ）Ｋ３３Ｉ／ＡＬ、Ｗ５１Ａ／ＡＳ、Ｔ３８／Ａ、Ｌ４０／Ａ、Ｋ４２Ｅ／ ＡＳ、Ｅ４３／Ａ、Ｌ４４Ｖ／ＡＬ、Ｒ６４／Ｑ、Ｓ６８／Ａ、Ｎ７２／Ｑ、Ｑ ７５Ｉ／ＡＳ、およびＮ８１／Ｑから構成されるＩＣＡＭ−Ｒアミノ酸配列（配 列番号：１）の修飾の影響を受けないモノクローナル抗体。 ３５．請求の範囲第３項に記載のモノクローナル抗体であって、ＩＣＡＭ−Ｒへ 結合するモノクローナル抗体が；（ａ）ＩＣＡＭ−Ｒへの細胞のＣＤ１８依存性 接着をブロックし、およびＳＥＡによるリンパ球活性化をブロックし；（ｂ）Ｆ ２１Ｖ／ＡＳ、Ｅ３７Ｔ／ＡＳ、Ｗ５１Ａ／ＡＳ、およびＱ７５Ｉ／ＡＳから構 成されるＩＣＡＭ−Ｒアミノ酸配列（配列番号：１）の修飾の影響を受け；およ び （ｃ）Ｅ３２Ｋ／ＡＳ、Ｋ３３Ｉ／ＡＬ、Ｔ３８／Ａ、Ｌ４０／Ａ、Ｋ４２Ｅ／ ＡＳ、Ｅ４３／Ａ、Ｌ４４Ｖ／ＡＬ、Ｒ６４／Ｑ、Ｓ６８／Ａ、Ｙ７０／Ａ、Ｎ ７２／Ｑ、およびＮ８１／Ｑから構成されるＩＣＡＭ−Ｒアミノ酸配列（配列番 号：１）の修飾の影響を受けないモノクローナル抗体。 ３６．請求の範囲第３項に記載のモノクローナル抗体であって、ｌＣＡＭ−Ｒへ 結合するモノクローナル抗体が；（ａ）ＳＥＡによるリンパ球活性化をブロック し、および同種抗原によるリンパ球活性化をブロックし；（ｂ）Ｆ２１Ｖ／ＡＳ 、およびＷ５１Ａ／ＡＳから構成されるＩＣＡＭ−Ｒアミノ酸配列（配列番号： １）の修飾の影響を受け；および（ｃ）Ｅ３２Ｋ／ＡＳ、Ｅ３７Ｔ／ＡＳ、Ｋ３ ３Ｉ／ＡＬ、Ｔ３８／Ａ、Ｌ４０／Ａ、Ｋ４２Ｅ／ＡＳ、Ｅ４３／Ａ、Ｌ４４Ｖ ／ＡＬ、Ｒ６４／Ｑ、Ｓ６８／Ａ、Ｙ７０／Ａ、Ｎ７２／Ｑ、Ｑ７５Ｉ／ＡＳお よびＮ８１／Ｑから構成されるＩＣＡＭ−Ｒアミノ酸配列（配列番号：１）の修 飾の影響を受けないモノクローナル抗体。 ３７．請求の範囲第３項に記載のモノクローナル抗体であって、ＩＣＡＭ−Ｒへ 結合するモノクローナル抗体が；（ａ）ＩＣＡＭ−Ｒへの細胞のＣＤ１８依存性 接着をブロックし、ＳＥＡによるリンパ球活性化をブロックし、および同種抗原 によるリンパ球活性化をブロックし； （ｂ）Ｆ２１Ｖ／ＡＳ，Ｅ３２Ｋ／ＡＳおよびＷ５１Ａ／ＡＳから構成されるＩ ＣＡＭ−Ｒアミノ酸配列（配列番号：１）の修飾の影響を受け；および （ｃ）Ｋ３３Ｉ／ＡＬ、Ｅ３７／ＡＳ、Ｔ３８／Ａ、Ｌ４０／Ａ、Ｋ４２Ｅ／Ａ Ｓ、Ｅ４３／Ａ、Ｌ４４Ｖ／ＡＬ、Ｒ６４／Ｑ、Ｓ６８／Ａ、Ｙ７０／Ａ、Ｎ７ ２／Ｑ、Ｑ７５Ｉ／ＡＳおよびＮ８１／Ｑから構成されるＩＣＡＭ−Ｒアミノ酸 配列（配列番号：１）の修飾の影響を受けないモノクローナル抗体。 ３８．細胞へのＩＣＡＭ−ＲのＣＤ１８依存性結合を特異的に阻害するＩＣＡＭ −Ｒペプチド。 ３９．配列番号：１の７２〜７６の残基から構成される請求の範囲第３８項のＩ ＣＡＭ−Ｒペプチド。 ４０．細胞へのＩＣＡＭ−ＲのＣＤ１８非依存性結合を特異的に阻害するＩＣＡ Ｍ−Ｒペプチド。 ４１．配列番号：１の２３０〜２３４の残基から構成される請求の範囲第４０項 のＩＣＡＭ−Ｒペプチド。 ４２．請求の範囲第３９項もしくは第４１項による環状化ペプチド。 ４３．配列番号：２６に記載の配列を必須的に含むラットＩＣＡＭ−Ｒをコード する精製および単離したポリヌクレオチド。 ４４．配列番号：２７に記載の配列を必須的に含むマウスＩＣＡＭ−Ｒをコード する精製および単離したポリヌクレオチド。 ４５．機能性１ＣＡＭ−Ｒタンパク質を発現しない■歯動物。 ４６．様々なＩＣＡＭ−Ｒタンパク質を発現する■歯動物。 ４７．ＩＣＡＭ−ＲリガンドへのＩＣＡＭ−Ｒの結合を阻害する化合物を同定す る方法であって、下記工程、すなわち；（ａ）ＩＣＡＭ−Ｒを固定し； （ｂ）ＩＣＡＭ−Ｒリガンドを検出可能に標識付けし；（ｃ）試験化合物が無い 条件下で、工程（ａ）の固定したＩＣＡＭ−Ｒと工程（ｂ）の標識付けしたＩＣ ＡＭ−Ｒリガンドをインキュベートし、そして、固定化したＩＣＡＭ−Ｒへ結合 した標識に基づいてＩＣＡＭ−ＲリガンドへのＩＣＡＭ−Ｒの結合の程度を決定 し；（ｄ）試験化合物の存在下で、工程（ａ）の固定したＩＣＡＭ−Ｒと工程（ ｂ）の標識付したＩＣＡＭ−Ｒリガンドをインキュベートし、そして、固定化し たＩＣＡＭ−Ｒへ結合した標識に基づいてＩＣＡＭ−ＲリガンドへのＩＣＡＭ− Ｒの結合の程度を決定し；および（ｅ）工程（ｃ）にて結合した標識の量と、工 程（ｄ）にて結合した標識の量を比較する、工程を含み、 工程（ｃ）との比較における、工程（ｄ）にて結合した標識の量の減少は、試験 化合物がＩＣＡＭ−Ｒの結合の阻害を意味する。 ４８．ＩＣＡＭ−ＲリガンドへのＩＣＡＭ−Ｒの結合を阻害する化合物を同定す る方法であって、下記工程、すなわち；（ａ）ＩＣＡＭ−Ｒを検出可能に標識付 けし；（ｂ）ＩＣＡＭ−Ｒリガンドを固定し；（ｃ）試験化合物が無い条件下で 、工程（ａ）の標識付けしたＩＣＡＭ−Ｒと工程（ｂ）の固定化したＩＣＡＭ− Ｒリガンドをインキュベートし、そして、固定化したＩＣＡＭ−Ｒリガンドへ結 合した標識に基づいて、ＩＣＡＭ−ＲリガンドへのＩＣＡＭ−Ｒの結合の程度を 決定し； （ｄ）試験化合物の存在下で、工程（ａ）の標識付けしたＩＣＡＭ−Ｒと工程（ ｂ）の固定化したＩＣＡＭ−Ｒリガンドをインキュベートし、そして、固定化し たＩＣＡＭ−Ｒへ結合した標識に基づいてＩＣＡＭ−ＲリガンドへのＩＣＡＭ− Ｒの結合の程度を決定し；および（ｅ）工程（ｃ）にて結合した標識の量と、工 程（ｄ）にて結合した標識の量を比較する、工程を含み、 工程（ｃ）との比較における、工程（ｄ）にて結合した標識の量の減少は、試験 化合物がＩＣＡＭ−Ｒの結合の阻害を意味する。 [Claims] 1. Specifically binds to ICAM-R having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. polypeptide or peptide. 2. An antibody substrate according to claim 1. 3. Monoclonal antibody according to claim 2. 4. The monoclonal according to claim 3, which specifically binds to ICAM-R. antibody fragment. 5. The monoclonal antibody according to claim 3, comprising: (a) the first extracellular region of ICAM-R; (b) the second extracellular region of ICAM-R; (c) the third extracellular region of ICAM-R. (d) the fourth extracellular region of ICAM-R; (e) the fifth extracellular region of ICAM-R; and (f) the cytoplasmic region of ICAM-R. specifically binds to an epitope in the R region. Monoclonal antibodies that match. 6. The monoclonal antibody according to claim 3, 26E3D-1 (ATCCHB11053), 26I18F-2 (ATCCHB11054), 26I10E-2 (ATCCHB11055), 26H11C-2 (ATCCHB 11056), 42C5H (ATCCHB112 35), 42D9B (ATCC HB11236), 43H7C (ATCCHB11221), 46D7E (AT CC11232), 46I12H (ATCCHB11231), 63E11D (ATCCHB11405), 63G4D (ATCCHB11409), 63H4 C (ATCCHB11408), 63H6H (ATCCHB11407), 63 11C (ATCCHB11406), and 6316G (ATCCHB11404), a monoclonal antibody produced by a hybridoma cell line selected from the group consisting of: 7. Compatible with the monoclonal antibody according to claim 6, which binds to ICAM-R. Monoclonal antibody against. 8. ICAM-R epitope VLSAGGSLFV (SEQ ID NO: 26) or is a monoclonal antibody that recognizes LSAGGSLFVN (SEQ ID NO: 27). 9. Hybridoma cells producing the monoclonal antibody according to claim 3 Cell system. 10. The hybridoma cell line according to claim 13, comprising 26E3D-1 (ATCCHB11053), 26I18F-2 (ATCCHB11054), 26I10E-2 (ATCCHB11055), 26H11C-2 (ATCC HB11056), 42C5H (ATCC HB11235) , 42D9B (ATCCHB11236), 43H7C (ATCCHB11221), 46D7E (ATCC11232), 46I12H (ATCCHB11231), 63E11D (ATCCHB11405), 63G4D (ATCCHB11409), 63H4 C (ATCCHB11408), 63H6H (ATCCHB11407), 63 I1C (ATCCHB11406), and 6316G (ATCCHB1140 4). 11. A method for producing a monoclonal antibody that specifically binds to ICAM-R, comprising the following steps: (a) 26E3D-1 (ATCCHB11053), 26I18F-2 (ATC CHB11054), 26I10E-2 (ATCCHB11055), 26H1 1C -2 (ATCCHB11056), 42C5H (ATCCHB11235), 42D9B (ATCCHB11236), 43H7C (ATCCHB1122 1), 46D7E (ATCC11232), 46I12H (ATCCHB112 31), 63E11D (AT CCHB11405), 63G4D (ATCCHB 11409), 63H4C (ATCCHB11408), 63H6H (ATCC HB11407) 63I1C (ATCCHB11406), and 6316G (ATCCHB11404). culturing the cell line and (b) isolating monoclonal antibodies therefrom. 12. an anti-identifier specific for the monoclonal antibody substrate according to claim 3; Otype antibody substrate. 13. A humanized antibody substrate according to claim 3 or 12. 14. 4. The monoclonal antibody according to claim 3, which blocks CD18-dependent adhesion of cells to ICAM-R. 15. 4. The monoclonal antibody according to claim 3, which blocks CD18-independent adhesion of cells to ICAM-R. 16. The monochrome according to claim 3, which regulates lymphocyte activation by SEA. local antibodies. 17. The module according to claim 3, which blocks lymphocyte activation by SEA. Noclonal antibodies. 18. The monoclonal antibody according to claim 3, which blocks lymphocyte activation by alloantigen. 19. 4. The monoclonal antibody of claim 3, which blocks CD18-dependent adhesion of cells to ICAM-R and blocks lymphocyte activation by SEA. 20. Blocks CD18-dependent adhesion of cells to ICAM-R and The monoclonal according to claim 3, which blocks lymphocyte activation caused by antibody. 21. 4. The monoclonal antibody of claim 3, which blocks lymphocyte activation by SEA and blocks lymphocyte activation by alloantigen. 22. 4. The monoclonal antibody of claim 3, which blocks CD18-dependent adhesion of cells to ICAM-R, blocks lymphocyte activation by SEA, and blocks lymphocyte activation by alloantigen. 23. The monoclonal antibody according to claim 3, which binds to ICAM-R; (a) F21V/AS, E32K/AS, E37T/AS, K331/AL, W51A/AS, and Affected by modification of the ICAM-R amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) consisting of Y70/A; and (b) T38/A, L40/A, K42E/AS, E43/A, L44V/AL, R64 /Q, S68/A, N72/Q, Q751/AS, and N81/Q? It is not affected by modification of the ICAM-R amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) consisting of monoclonal antibody. 24. The monoclonal antibody according to claim 3, wherein the monoclonal antibody that binds to ICAM-R is; The configured ICAM-R (b) E32K/AS, T38/A, L40/A, K42E/AS, E43/A, L44V/AL, R64/Q, A68/ A, N72/Q, Q751/AS, Modification of the ICAM-R amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) consisting of A monoclonal antibody that is not affected by decoration. 25. The monoclonal antibody according to claim 3, wherein the monoclonal antibody that binds to ICAM-R is: (a) ICAM composed of P21V/AS, E32K/AS, E3 7T/AS, and Y70/A; - Affected by modification of the R amino acid sequence (SEQ ID NO: 1); and (b) E33I/AL, W51A/AS, T38/A, L40/A, K42E/AS, E43/A, L44X/AL, R64 ICAM-R amino acid sequence (sequence) consisting of /Q, S68/A, N72/Q, Q 75I/AS, and N81/Q. Column number: Monoclonal antibody not affected by the modification of 1). 26. The monoclonal antibody according to claim 3, wherein the monoclonal antibody that binds to ICAM-R has: and (b) E32K/AS, E37T/AS, K331/AL, T38/A, L40 /A, K42E/AS, E43/A, L44V/AL, W51A/AS, R64 /Q, A68/A, A monoclonal antibody that is not affected by modification of the ICAM-R amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) consisting of Y70/A, N72/Q, Q75I/AS and N81/Q. 27. The monoclonal antibody according to claim 3, wherein the monoclonal antibody that binds to ICAM-R is: (a) ICAM composed of F21V/AS, E37T/AS, W5 1A/AS, and q75I/AS; - Affected by modification of the R amino acid sequence (SEQ ID NO: 1); and (b) E32K/AS, k331/AL, T38/A, L40/A, K42E/AS, E43/A, L44V/AL, R64 /Q, S68/A, Y70/A, N72/Q, and N81/Q (SEQ ID NO: A monoclonal antibody that is not affected by the modification in item 1). 28. The monoclonal antibody according to claim 3, wherein the monoclonal antibody that binds to ICAM-R has an ICAM-R amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) consisting of (a) F21V/AS and W51A/AS. ); and (b) E32K/AS, E37T/AS, K33I/AL, T38/A, L40/A, K42E/AS, E43/A, L44V/AL, R64/Q, S68 /A, Y70/A, N72/Q, Q75I/AS and N81/Q that are not affected by modification of the ICAM-R amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) Clonal antibodies. 29. The monoclonal antibody according to claim 3, which binds to ICAM-R; (a) F21V/AS, E32K/AS, E37T/AS, K42E/AS, L44V/AL, W51A; /AS, Y70/A and (b) K33I/AL, T38/A, L40/A, E43/A, R64/Q, A compound that is not affected by modification of the ICAM-R amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) consisting of S68/A, N72/Q, and N81/Q Clonal antibodies. 30. The monoclonal antibody according to claim 3, wherein the monoclonal antibody that binds to ICAM-R is: (a) F21V/AS, E32K/AS, and and (b) K33I/AL, E37T/AS, T38/A, L40/A, K42E/ASE43/ ICAM-R amino consisting of A, L44V/AL, R64/Q, S68/A, Y70/A, N7 2/Q, Q75I/AS, and N81/Q A monoclonal antibody that is not affected by modification of the acid sequence (SEQ ID NO: 1). 31. The monoclonal antibody according to claim 3, wherein the monoclonal antibody that binds to ICAM-R has: and (b) E32K/AS, E37T/AS, K33I/AL, T38/A, L40 /A, K42E/AS, E43/A, L44V/AL, W51A/AS, R64 /Q, S68/A, Affected by modification of the ICAM-R amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) consisting of Y70/A, N72/Q, Q75I/AS, and N81/Q. monoclonal antibodies. 32. The monoclonal antibody according to claim 3, wherein the monoclonal antibody that binds to ICAM-R: (a) blocks CD18-dependent adhesion of cells to ICAM-R and inhibits lymphocyte activation by SEA. and block lymphocyte activation by alloantigen; (b) ICAM-R composed of F21V/AS, E32K/AS, E37T/AS, K33I/AL, W51A/AS, and Y70/A; Amino acid sequence Affected by the modification of column number: 1); and (c) T38/A, L40/A, K42E/AS, E43/A, L44V/AL, R64/Q, S68/A, N72/Q, Q75I/ AS, and N81/Q? It is not affected by modification of the ICAM-R amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) consisting of monoclonal antibody. 33. The monoclonal antibody according to claim 3, wherein the monoclonal antibody that binds to ICAM-R: (a) blocks lymphocyte activation by SEA and blocks lymphocyte activation by alloantigen; (b) Consists of E21V/AS, E32K/AS, K33I/AL, W51A/AS, and Y70/A. and (c) E32K/As, T38/A, L40/A, K42E/AS, E43/A, L44V/AL, R64/ Q, S68/A, N72/Q, Q75I/AS, Modification of the ICAM-R amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) consisting of A monoclonal antibody that is not affected by decoration. 34. The monoclonal antibody according to claim 3, wherein the monoclonal antibody that binds to ICAM-R: (a) blocks CD18-dependent adhesion of cells to ICAM-R and inhibits lymphocyte activation by SEA. (b) consisting of F 21V/AS, E32K/AS, E37T/AS, and Y70/A; (c) K33I/AL, W51A/AS, T38/A, L40/A, K42E/AS, E43/A, L44V/AL , R64/Q, S68/A, N72/Q, Q 75I/AS, and N81/Q. Column number: Monoclonal antibody not affected by the modification of 1). 35. The monoclonal antibody according to claim 3, wherein the monoclonal antibody that binds to ICAM-R: (a) blocks CD18-dependent adhesion of cells to ICAM-R and inhibits lymphocyte activation by SEA. (b) Constructed from F 21V/AS, E37T/AS, W51A/AS, and Q75I/AS. affected by the modification of the ICAM-R amino acid sequence (SEQ ID NO: 1); and and (c) E32K/AS, K33I/AL, T38/A, L40/A, K42E/AS, E43/A, L44V/AL, R64/Q, S68/A, Y70/A, N 72/Q, and ICAM-R amino acid sequence consisting of N81/Q (SEQ ID NO. No.: A monoclonal antibody that is not affected by the modification described in 1). 36. The monoclonal antibody according to claim 3, wherein the monoclonal antibody that binds to lCAM-R: (a) blocks lymphocyte activation by SEA and blocks lymphocyte activation by alloantigen; (b) Affected by modification of the ICAM-R amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) consisting of F21V/AS and W51A/AS; and (c) E32K/AS, E37T/AS, K3 3I/AL, T38/A, L40/A, K42E/AS, E43/A, L44V /AL, R64/Q, S68/A, Y70/A, N72/Q, Q75I/AS Modification of the ICAM-R amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) consisting of A monoclonal antibody that is not affected by decoration. 37. The monoclonal antibody according to claim 3, wherein the monoclonal antibody that binds to ICAM-R: (a) blocks CD18-dependent adhesion of cells to ICAM-R and inhibits lymphocyte activation by SEA. and blocking lymphocyte activation by alloantigen; (b) the effect of modification of the ICAM-R amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) consisting of F21V/AS, E32K/AS and W51A/AS; and (c) K33I/AL, E37/AS, T38/A, L40/A, K42E/A S, E43/A, L44V/AL, R64/Q, S68/A, Y70/A, N7 2/ A monoclonal antibody that is not affected by modification of the ICAM-R amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) consisting of Q, Q75I/AS and N81/Q. 38. An ICAM-R peptide that specifically inhibits CD18-dependent binding of ICAM-R to cells. 39. 39. The I CAM-R peptide of claim 38, consisting of residues 72-76 of SEQ ID NO:1. 40. An ICA M-R peptide that specifically inhibits CD18-independent binding of ICAM-R to cells. 41. 41. The ICAM-R peptide of claim 40, consisting of residues 230-234 of SEQ ID NO:1. 42. Cyclized peptide according to claim 39 or 41. 43. A purified and isolated polynucleotide encoding rat ICAM-R essentially comprising the sequence set forth in SEQ ID NO:26. 44. A purified and isolated polynucleotide encoding mouse ICAM-R essentially comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 27. 45. ■ Dentists that do not express functional 1CAM-R protein. 46. ■ Dentists expressing various ICAM-R proteins. 47. Identifying compounds that inhibit ICAM-R binding to ICAM-R ligand A method comprising the steps of: (a) immobilizing ICAM-R; (b) detectably labeling ICAM-R ligand; and (c) carrying out step (a) in the absence of a test compound. ) and the labeled ICAM-R ligand of step (b), and the ICAM-R is transferred to the ICAM-R ligand based on the label bound to the immobilized ICAM-R. determining the degree of binding; (d) incubating the immobilized ICAM-R of step (a) and the labeled ICAM-R ligand of step (b) in the presence of the test compound; determining the degree of binding of ICAM-R to the ICAM-R ligand based on the label bound to the ICAM-R; and (e) determining the amount of label bound in step (c) and comparing the amount of label bound in step (d), the decrease in the amount of label bound in step (d) as compared to step (c) is determined by the step of comparing the amount of label bound in step (d); means inhibition of binding. 48. Identifying compounds that inhibit ICAM-R binding to ICAM-R ligand A method comprising the following steps: (a) detectably labeling ICAM-R; poppy; (b) immobilizing the ICAM-R ligand; (c) incubating the labeled ICAM-R in step (a) and the immobilized ICAM-R ligand in step (b) in the absence of a test compound; and then bind to the immobilized ICAM-R ligand. (d) combining the labeled ICAM-R of step (a) with the labeled ICAM-R of step (b) in the presence of a test compound; immobilized ICAM-R ligand, and immobilized determining the degree of binding of ICAM-R to the ICAM-R ligand based on the label bound to the ICAM-R; and (e) determining the amount of label bound in step (c) and comparing the amount of label bound in step (d), the decrease in the amount of label bound in step (d) as compared to step (c) is determined by the step of comparing the amount of label bound in step (d); means inhibition of binding.
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