【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
発明の名称二非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスに対する抗体に免疫化学反応性を示すペプ
チド
本発明は、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）に対する抗体と免疫化学的に反応するペプチド及
び該ペプチドをコードする核酸配列に係わる。本発明は更に、検査液中のＨＣＶ
または抗ＨＣ■抗体の検出方法並びにかかる検出方法に使用し得る免疫化学試薬
及び検査キットに係わる。
ＨＣＶウィルスによって惹起される可能性が最も高い非Ａ非Ｂ型肝炎は、ウィル
ス誘発性であることが示されている伝播性疾患または疾患系である。非Ａ非Ｂ型
肝炎は、既知の肝炎ウィルス、即ちＡ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ） 、δ型肝炎ウ
ィルス（ＨＢＶ）、δ型肝炎ウィルス（ＨＤＶ）によって惹起されるもの、及び
サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）またはエプスタイン−バールウィルス（ＥＢＶ
）によって誘発される肝炎を含む他の形態のウィルス関連肝疾患とは区別され得
る。ＮＡＮＢＨは最初は輸血された個体において同定された。人からチンパンジ
ーへの伝播及びチンパンジーにおける連続継代は、ＮＡＮＢＨが伝播性感染物質
に起因することを立証するものである。疫学的証拠は、水系感染流行型；血液ま
たは注射針関与型；及び散発（集団獲得）型の３つの型のＮＡＮＢＨがあり得る
ことを示している。しかしながら、ＮＡＮＢＨを惹起し得る因子の数は未知であ
る。
ＮＡＮＢＨによる感染の種々の段階において信頼性のある診断を行ない得る特異
的且つ高感度の方法を開発するためには、この型の免疫優勢ウィルスエピトープ
を同定することが極めて重要である。本発明は、抗ＨＣＶ抗体に驚くほど予想外
の免疫化学反応性を示す新規のペプチドに係わる。
本発明の新規のペプチドは、抗ＨＣＶ抗体と免疫化学反応性を示し、アミノ酸配
列（１文字コードで示す）：Ａ−Ｘ、−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｌ−Ｘ５−Ｘ、−Ｅ
−Ｆ−Ｘ７−Ｘ８−ＸＩ−Ｂ （Ｉ）〔ここで、Ａは水素、アミノ酸またはポリ
ペプチドを表わし；ＸＩ、Ｘ２、Ｘ８、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ、及びＸ、
は任意のアミノ酸であり得；Ｂはヒドロキシ、アミノ酸またはポリペプチドであ
る〕
または、抗ＨＣＶ抗体と免疫学的反応性を示すそのフラグメントであるが、但し
、式Ａ−Ｄ−Ｒ−Ｅ−Ｖ−Ｌ−Ｙ−Ｒ−Ｅ−Ｆ −Ｄ −Ｅ −Ｍ−Ｂ （ここ
でＡ及びＢは前記定義の意味を有する〕を有するペプチドは除くことを特徴とす
る。
配列Ｄ−Ｒ−Ｅ−Ｖ−Ｌ−Ｙ−Ｒ−Ｅ−Ｆ−Ｄ−Ｅ−Ｍ （Ｉｆ）はＨＣｖ配列
の一部テアリ、ＳＯＤ／ＨＣＶ Ｃ１００−３り０−ンのＯＲＦ領域内に位置す
る。配列Ｄ−Ｒ−Ｅ−Ｖ−Ｌ−Ｙ−Ｒ−Ｅ −Ｆ −Ｄ−Ｅ−Ｍを含む特異的免
疫反応性ペプチドは優先日１９９１年１２月６日の同出願人名義の同時係属出願
に記載されている。
上述の配列（ＩＩ）において、抗ＨＣＶ抗体との免疫反応性に関してはただ３つ
のアミノ酸しか重要でない。驚くべきことに、他の全てのアミノ酸は、抗ＨＣＶ
抗体に対するペプチドの高反応性を維持しながら多数の他のアミノ酸で置換し得
る。従って本発明は、当業者によって容易に製造され得る、抗ＨＣＶ抗体に対し
て高免疫反応性を有するペプチドを提供する。上述の配列（Ｉ）においてアミノ
酸Ｌ１Ｅ及びＦのみが重要なアミノ酸である。これら３つのアミノ酸は、図１か
ら判るように、ペプチドの抗ＨＣＶ抗体に対する免疫反応性に影響することなく
他のアミノ酸で置換することはできない。
残りのアミノ酸Ｘ Ｉ−Ｘ ｅは、上記例外はあるが、任意のアミノ酸とし得る
。好ましい式Ｉのペプチドは、選択された１つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換
されている、式Ａ−Ｄ −Ｒ−Ｅ −Ｖ−Ｌ −Ｙ −Ｒ−Ｅ −Ｆ −Ｄ −
Ｅ−Ｍ−Ｂを有するペプチドとは異なるペプチドである。かかるペプチドは、図
１に示したように、抗ＨＣＶ抗体に対する高免疫反応性を有する。
上記ペプチドのほかに、かかるペプチドの機能的誘導体もまた本発明のペプチド
に属すると考えられる。ペプチドの機能的誘導体とは以下のものを含むとする：
ａ）ペプチドの酸付加塩；
ｂ）ペプチドのアミド、特にＣ末端アミド；Ｃ）エステル、特にＣ末端エステル
；及びｄ）Ｎ−アシル誘導体、特にＮ末端アシル誘導体、とりわけＮ−アセチル
誘導体。
本発明のペプチドは、検査液中のＨＣＶ抗原または抗ＨＣｖ抗体の存在を判定す
る診断方法に使用するのに特に適している。天然ＨＣＶと比較し、本発明のペプ
チドは、安全な非感染性起源のものであるという利点を有する。更に、本発明ペ
プチドは抗ＨＣＶ抗体に対して特に高い親和性を有しており、このことで本発明
ペプチドは前記診断試験法に使用するのに極めて適当となる。
式Ｉのペプチドのフラグメントは、１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換さ
れている、Ｄ −Ｒ−Ｅ −Ｖ −Ｌ −Ｙ −Ｒ−Ｅ −Ｆ −Ｄ −Ｅ−Ｍ
のフラグメントとは異なるフラグメントである。
本発明のペプチドの製造は、公知の有機化学的ペプチド合成方法のいずれかまた
は組換えＤＮＡ技術によって行ない得る。後者は、１つ以上の問題のペプチドを
コードする核酸配列を含む組換え核酸配列を、宿主として適当な微生物中で発現
させることにより、所望のペプチドを製造することを含む。有機化学的ペプチド
合成方法は、均一相中または所謂固相を用いた縮合反応によって必要なアミノ酸
を結合することを含むと考えられる。
縮合反応は以下のように実施し得る：
ａ）遊離カルボキシル基を有すると共に他の反応基は保護されている化合物（ア
ミノ酸、ペプチド）を、遊離アミノ基を有すると共に他の反応基は保護されてい
る（ここで保護基の１つは（誘導体化）固体支持体であってもよい）化合物（ア
ミノ酸、ペプチド）と、縮合剤の存在下に縮合させる、
ｂ）活性化カルボキシル基を有すると共に他の反応基は遊離または保護されてい
る化合物（アミノ酸、ペプチド）を、遊離アミノ基を有すると共に他の反応基は
遊離または保護されている（ここで保護基の１つは（誘導体化）固体支持体であ
ってもよい）化合物と縮合させる。
カルボキシル基の活性化は、特に、カルボキシル基を酸ハロゲン化物、アジ化物
、無水物、イミダゾリドまたは活性化エステル、例えば
Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ｐ−ニ
トロフェニル、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−
ベンゾトリアジン（ＯＤｈｂｔ）またはペンタフルオロフェニル（ＯＰｆｐ）エ
ステルに変換することにより行ない得る。
上記縮合反応の最も一般的な方法は、カルボジイミド法、ＢＯＰ法［ベンゾトリ
アゾリルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムへキサフルオロホスフェ
ート］、アジド法、混合酸無水物法、並びに、例えばＴｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ
、 Ａｎａｌｙｓｉｓ、 ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、 Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ、１
−３ （Ｇｒｏｓｓ、Ｅ、及びＭｅｔｅｎｈｏｆｅｒ、Ｊ、編） １９７９．
１９８０． １９８１ （＾ｃａｄｅａ＋ｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ。
）に記載のごとき活性化エステルを使用する方法である。
縮合反応に関与し得ない反応基は、上述したように、酸、塩基または還元による
加水分解によって極めて容易に再び除去し得る基によって効果的に保護される。
カルボキシル基は、例えばメタノール、エタノール、第三級ブタノール、ベンジ
ルアルコールまたはｐ−ニトロベンジルアルコールを用いたエステル化、アミン
を用いたアミド化によって、或いは固体支持体に結合させたアルコール及びアミ
ンの誘導体を用いて効果的に保護し得る。
アミノ基を効果的に保護し得る基は、エトキシカルボニル、ベンジルオキシカル
ボニル、ｔ−ブトキシ−カルボニル、９−フルオレニル−メトキシカルボニル（
Ｆｍｏ ｃ）もしくはｐ−メトキン−ベンジルオキシカルボニル基、またはスル
ホン酸から誘導される酸基、例えばｐ−トルエン−スルホニル、ペンタメチルベ
ンゼンスルホニル（Ｐｍｓ）、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルーベンゼ
ンスルホニル（Ｍｔｒ）もしくは１，２．５，７．８−ペンタメチルクロマン−
６−スルホニル（Ｐｍｃ）基であるが、置換もしくは未置換アリールもしくはア
ラルキル基、例えばベンジル及びトリフェニルメチル、またはオルト−ニトロフ
ェニル−スルフェニル及び２−ベンゾイル−１−メチルビニルのごとき他の基を
使用することもできる。使用可能な保護基のより広範な記述は、Ｔｈｅ ｐｅｐ
ｔｉｄｅｓ、 Ａｎａｌｙｓｉｓ、 ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖ
ｏｌ、１−９ （Ｇｒｏｓｓ編、Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈ
ｏｆｅｒ） １９７９−１９８７ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ、
）に見ることができる。
“固相”法を使用する上記本発明ペプチドの製造は例えばＪ、＾ｍ、 Ｃｈｅｗ
、 Ｓｏｃ、、 ８５．２１４９ （１９６３）及びＩｎｔ、Ｊ、 Ｐｅｐｔｉ
ｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ、、 ３５．１６１−２１４ （１９９０）に記
載されている。製造すべきペプチドのアミノ酸の結合は通常カルボキシル末端側
から開始する。この方法には、反応基がその上に存在するまたはかかる基を導入
し得る固相が必要とされる。これは例えば反応性クロロメチル基を有するベンゼ
ン及びジビニルベンゼンのコポリマー、またはヒドロキシメチルもしくはアミン
官能基に対して反応性にされたポリマー固相とし得る。
特に適した固相は、例えば、ｆａｎｇ （１９７４） Ｊ、＾ｍ、 ＣｈｅＩｌ
。
Ｓｏｃ、、 ９５．１３２８によって記載されているｐ−アルコキシベンジルア
ルコール樹脂（４−ヒドロキシメチル−フェノキシ−メチル−コポリスチレン−
１％ジビニルベンゼン樹脂）である。合成後、ペプチドをこの固相から緩和条件
下で分離し得る。他の適当な支持体としては、Ｇｅｙｓｅｎ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、、 ８１．３９９８ （１９８４）及びＰｒｏ
ｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。
導体化ポリエチレンまたはポリプロピレンロッドが挙げられる。
溶液中または固体支持体上に所望のアミノ酸配列を合成した後、例えばトリフル
オロ酢酸を用いたり、水素及び触媒、例えばパラジウムによる緩和還元によった
り、ピペラジンもしくは水酸化物イオンのごとき塩基または氷酢酸中のＨＢｒを
用いて処理するなど、特定の基の特性に従って種々の慣用方法によって保護基を
分離し得る。
ペプチドを固体支持体上に合成し、そこから引き離し得るとすれば、それは、リ
ンカ−のタイプに従って例えばトリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン
酸、または、トリフルオロ酢酸中に溶解したメタンスルホン酸を用いたり、低級
アルコール、好ましくはメタノールまたはエタノールを用いてエステル変換する
ことにより行ない得る。エステル変換の場合、ペプチドの低級アルキルエステル
が直接形成される。同様に、アンモニアによって分離すれば本発明のペプチドの
アミドが得られる。
上述したように、本発明のペプチドは組換えＤＮＡ技術によって製造することも
できる。この可能性は、ペプチドを（縦列）反復配列中に取込む場合や、ペプチ
ドを（はるかに大きい）タンパク質またはポリペプチドの必須成分として製造す
る場合に特に重要である。従ってこの種のペプチド製造も本発明の範囲内に含ま
れる。このためには、組換えＤＮＡの構成成分として、本発明のペプチドはコー
ドするが、天然ＨＣＶゲノムにおいて上述の核酸配列に隣接するポリヌクレオチ
ドセグメントを実質的に含まない核酸配列を使用する。
本発明のペプチドをコードする上記のごとき核酸配列、及びこの核酸配列が取込
まれた組換えＤＮＡも本発明の範囲内に含まれる。
本明細書において使用される“核酸配列”なる用語は、任意の長さのポリマー形
態のヌクレオチド、即ちリボ核酸配列及びデオキシリボ核酸配列の両方を指す。
原則としてこの用語は分子の一次構造を指す。従ってこの用語は、二本鎖及び−
重鎖ＤＮＡ、並びに二本鎖及び−重鎖ＲＮＡ。
更にこれらの変性体を含む。本発明の核酸配列は、実際には関連もないし連結も
していない種々の複製可能ＤＮＡ配列に連結し、適当な宿主の形質転換に使用し
得る所謂組換えベクター分子となり得る。有効な組換えベクター分子は、例えば
プラスミド、バクテリオファージ、コスミドまたはウィルスから誘導されるのが
好ましい。本発明の組換えベクター分子の構築に使用される方法は当業者には公
知であり、特に、Ｍａｎｉａｔｉｓ、 Ｔ、ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二板； Ｃｏ１ｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。
１９８９）に記載されている。例えば、本発明の核酸配列をクロ−ニグベクター
中に挿入することは、遺伝子及び所望のクローニングビヒクルの両方を、相補的
ＤＮＡ末端が生成されるのと同じ制限酵素で切断したならば容易に行ない得る。
発現ベクター中の本発明の核酸配列を発現させるためには、該配列を発現制御配
列に作動可能なように連結する。かかる制御配列は、プロモーター、エンハンサ
−、オペレーター、インデューサー、リポソーム結合部位などを含み得る。
勿論、クローニングベクターの選択部位に挿入されたヌクレオチド配列は、形質
転換宿主が少なくとも１つ以上の免疫原決定基を有するポリペプチドを産生ずる
限りは、本発明のペプチドをコードする全核酸配列のフラグメントしか含まなく
てよいことが理解される。
組換えベクター分子は更に、例えばｐＢＲ３２２におけるアンピシリン及びテト
ラサイクリン耐性、ｐＵＣ８におけるアンピシリン耐性及びβ−ガラクトシダー
ゼのα−ペプチドのごとき所望の形質転換体を選択するのに使用し得る１つ以上
のマーカー活性を含み得る。
上述のごとく製造されるペプチドまたはそのフラグメントを使用し、ポリクロー
ナル及びモノクローナルいずれの抗体をも生産し得る。本発明のペプチドに対す
るモノクローナル抗体は、当業者には容易に生産し得る。ハイブリドーマにより
モノクローナル抗体を生産することはよ（知られている。細胞融合により不死化
抗体産生細胞系を生成することもできるし、また、腫瘍原性ＤＮＡによるＢリン
パ球の直接的形質転換またはエプスタイン−バールウィルスによるトランスフェ
クションのごとき他の方法も使用し得る。本発明のペプチドに対するモノクロー
ナル及びポリクローナルの両抗体は診断に極めて適しており、中和性の抗体は受
動免疫療法に極めて有効である。特にモノクローナル抗体は、抗イデイオタイプ
抗体を誘導するために使用し得る。抗イデイオタイプ抗体を誘導する方法は当分
野において知られている。抗イデイオタイプ抗体は、非Ａ非Ｂ型肝炎の予防及び
／または治療、並びにＨＣＶ抗原の重要なエピトープ領域の解明にも有効である
。
本発明は更に、１種以上の本発明ペプチドを含む免疫化学試薬を提供する。本発
明の“免疫化学試薬“は通常１種以上の本発明ペプチドと、適当な支持体または
標識物質とを含む。この点で使用し得る支持体としては、例えば、ＢＳＡのごと
き担体タンパク質、微量試験ウェルまたはキュベツト、試験管もしくは毛細管の
内壁、膜、フィルター、試験ストリップまたは粒子（例えばラテックス粒子、赤
血球、染料ゾル、金属ゾル）、または金属化合物（例えばゾル粒子）が挙げられ
る。
使用し得る標識物質は、放射性同位元素、蛍光化合物、標識用タンパク質（例え
ば酵素）、酵素、染料ゾル、金属ゾル、または金属化合物（例えばゾル粒子）で
あり得る。
免疫化学試薬は、検査液中のＨＣＶに対する抗体の検出方法に必須の成分である
。免疫化学試薬を前記検査液と接触させると免疫化学反応が起こり、（本発明の
）ペプチドと抗ＨＣＶ抗体とで免疫複合体が形成される結果となる。免疫化学試
薬の特性及び更なる特徴に従って、起こる免疫化学反応は所謂サンドイッチ反応
、凝集反応、競合反応または阻害反応である。上記反応の結果形成される免疫複
合体は、検査液中の抗体の存在についての（直接または間接的な）尺度である。
本発明の免疫化学試薬は、検査液中のＨＣＶ抗原を検出するために使用すること
もできる。
本発明は更に、１種以上の本発明ペプチドを使用する、検査液中のＨＣＶに対す
る抗体を検出する方法をも提供する。本発明は更に、１種以上の本発明ペプチド
を使用する、検査液中のＨＣＶを検出する方法にも係わる。この検出方法におい
ては、検査液を抗ＨＣＶ及び本発明の免疫化学試薬と順次及び同時に接触させ得
る。
検査液中のＨＣＶを検出するのに特に適した方法は、標識物質が与えられた本発
明ペプチドと（検査液中に存在する）ＨＣＶ抗原との競合反応に基づいており、
本発明ペプチドと抗原とが、固体支持体に固定されたＨＣＶに対する抗体に関し
て競合する。
本発明は更に、少なくとも１種の本発明の免疫化学試薬を含む、イムノアッセイ
を実施するために使用される検査キットをも提供する。本発明の検査キットは必
須成分として上述の免疫化学試薬を含む。抗ＩイＣＶ抗体検出のためにサンドイ
ッチ反応を実施する際には、検査キットは、例えば、
１）固体支持体（例えば微量試験ウェルの内壁）に固定された本発明のペプチド
、及び
２）本発明の標識ペプチドまたは標識抗抗体のいずれかを含み得る。
ＨＣＶ抗体検出のために競合反応を実施する際には、検査キットは、
１）固体支持体に固定された本発明のペプチド、及び２）ＨＣＶに対する標識抗
体、好ましくは前記ペプチドに対するモノクローナル抗体
を含み得る。
凝集反応を実施する際には、検査キットは、粒子またはゾルに固定された本発明
のペプチドからなる免疫化学試薬を含む。
ＨＣＶ抗原検出のための検査キットは、例えば、本発明の標識ペプチドと、固体
支持体に固定されたＨＣＶに対する抗体とを含む。 Name of the Invention: 2. Peptide showing immunochemical reactivity with antibodies against non-A, non-B hepatitis viruses
The present invention provides peptides and antibodies that immunochemically react with antibodies against hepatitis C (HCV).
and the nucleic acid sequence encoding the peptide. The present invention further relates to a method for detecting HCV or anti-HC antibodies in a test solution, and immunochemical reagents and test kits that can be used in such a detection method. Non-A, non-B hepatitis, which is most likely caused by the HCV virus, is
It is a transmissible disease or disease system that has been shown to be pathogenic. Non-A, non-B hepatitis is caused by known hepatitis viruses, namely hepatitis A virus (HAV), hepatitis delta virus.
virus (HBV), hepatitis delta virus (HDV), and other forms of virus-associated liver disease, including hepatitis caused by cytomegalovirus (CMV) or Epstein-Barr virus (EBV). can be distinguished
Ru. NANBH was first identified in individuals who received blood transfusions. human to chimpanzee
Transmission to humans and serial passage in chimpanzees demonstrate that NANBH is caused by a transmissible infectious agent. Epidemiological evidence suggests that waterborne epidemics;
These results indicate that there are three possible types of NANBH: needle-related or needle-associated type; and sporadic (collectively acquired) type. However, the number of factors that can induce NANBH is unknown.
Ru. Identification of this type of immunodominant viral epitope is of critical importance in order to develop specific and sensitive methods capable of reliable diagnosis at various stages of infection by NANBH. The present invention relates to novel peptides that exhibit surprising and unexpected immunochemical reactivity with anti-HCV antibodies. The novel peptide of the present invention exhibits immunochemical reactivity with anti-HCV antibodies and has an amino acid sequence.
Column (indicated by one-letter code): A-X, -X2-X3-X4-L-X5-X, -E -F-X7-X8-XI-B (I) [Here, A is hydrogen, amino acid XI, X2, X8, X4, X5, X6, X7, X, and X can be any amino acid; B is hydroxy, an amino acid or a polypeptide;
or a fragment thereof that exhibits immunological reactivity with an anti-HCV antibody, provided that it has the formula A-D-R-E-V-L-Y-R-E-F-D-E-M- B (where A and B have the meanings as defined above) are excluded.
Ru. The sequence D-R-E-V-L-Y-R-E-F-D-E-M (If) is a part of the HCv sequence, and is located within the ORF region of SOD/HCV C100-3 located
Ru. A specific immune system containing the sequence D-R-E-V-L-Y-R-E-F-D-E-M.
Epidemiology-reactive peptides are described in a co-pending application in the name of the same applicant with a priority date of December 6, 1991. In the above sequence (II), there are only three types regarding immunoreactivity with anti-HCV antibodies.
Only 1 amino acid is important. Surprisingly, all other amino acids can be substituted with numerous other amino acids while maintaining high reactivity of the peptide towards anti-HCV antibodies.
Ru. Accordingly, the present invention provides peptides with high immunoreactivity to anti-HCV antibodies that can be easily produced by those skilled in the art. In the above sequence (I), amino
Acids L1E and F are the only important amino acids. These three amino acids are shown in Figure 1.
As can be seen, other amino acids cannot be substituted without affecting the immunoreactivity of the peptide to anti-HCV antibodies. The remaining amino acids XI-Xe may be any amino acids, with the exceptions noted above. Preferred peptides of formula I have the formula A-D-R-E-V-L-Y-R-E-F-D-E-M-, in which one selected amino acid is replaced with another amino acid. This is a different peptide from the peptide having B. Such peptides have high immunoreactivity with anti-HCV antibodies, as shown in Figure 1. In addition to the above-mentioned peptides, functional derivatives of such peptides are also considered to belong to the peptides of the invention. Functional derivatives of peptides are intended to include: a) acid addition salts of peptides; b) amides of peptides, especially C-terminal amides; C) esters, especially C-terminal esters; and d) N-acyl derivatives. , especially N-terminal acyl derivatives, especially N-acetyl derivatives. The peptide of the present invention can be used to determine the presence of HCV antigen or anti-HCv antibody in a test solution.
It is particularly suitable for use in diagnostic methods. Compared to natural HCV, the peptide of the present invention
Tido has the advantage of being of safe, non-infectious origin. Furthermore, the present invention
Peptides have a particularly high affinity for anti-HCV antibodies, which makes the peptides of the invention eminently suitable for use in said diagnostic test methods. Fragments of the peptide of formula I are those in which one or more amino acids are replaced with other amino acids.
This fragment is different from the fragment of D-R-E-V-L-Y-R-E-F-D-E-M, which is shown in FIG. The peptide of the present invention can be produced by any of the known organic chemical peptide synthesis methods.
can be performed by recombinant DNA technology. The latter involves producing the desired peptide by expressing a recombinant nucleic acid sequence comprising a nucleic acid sequence encoding one or more peptides of interest in a microorganism suitable as a host. Organic chemical peptide synthesis methods are believed to involve attaching the necessary amino acids by condensation reactions in a homogeneous phase or using a so-called solid phase. The condensation reaction may be carried out as follows: a) Compounds with free carboxyl groups and other reactive groups protected (a)
amino acids, peptides) that have a free amino group and other reactive groups are protected.
(where one of the protecting groups may be a (derivatized) solid support)
b) have an activated carboxyl group and other reactive groups are free or protected;
A compound (amino acid, peptide) with a free amino group and other reactive groups free or protected, where one of the protecting groups is (derivatized) on a solid support.
may be condensed with a compound. Activation of carboxyl groups can be carried out in particular by converting carboxyl groups to acid halides, azides, anhydrides, imidazolides or activated esters, such as N-hydroxy-succinimide, N-hydroxybenzotriazole, p-ni
Trophenyl, 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine (ODhbt) or pentafluorophenyl (OPfp)
This can be done by converting it to a steal. The most common methods for the above condensation reaction are the carbodiimide method, the BOP method [benzotri
Azolyloxytris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphene
1-3 (Gross, E. and Metenhofer, J., eds.) 1979.1980. 1981 (^cadea+ic Press, Inc.). Reactive groups which cannot participate in the condensation reaction are effectively protected by groups which can be very easily removed again by acid, base or reductive hydrolysis, as mentioned above. Carboxyl groups include, for example, methanol, ethanol, tertiary butanol, benzene
by esterification with alcohol or p-nitrobenzyl alcohol, amidation with amines, or by binding alcohols and amines to solid supports.
can be effectively protected using derivatives of Groups that can effectively protect amino groups include ethoxycarbonyl and benzyloxycarbonyl.
carbonyl, t-butoxy-carbonyl, 9-fluorenyl-methoxycarbonyl (Fmoc) or p-methquine-benzyloxycarbonyl group, or sulfur
Acid groups derived from fonic acid, such as p-toluene-sulfonyl, pentamethylbase
Benzenesulfonyl (Pms), 4-methoxy-2,3,6-trimethyl-benze
sulfonyl (Mtr) or 1,2.5,7.8-pentamethylchroman-6-sulfonyl (Pmc) group, but substituted or unsubstituted aryl or aryl
ralkyl groups, such as benzyl and triphenylmethyl, or ortho-nitrophs
Other groups such as phenyl-sulfenyl and 2-benzoyl-1-methylvinyl can also be used. A more extensive description of the protecting groups that can be used can be found in The Peptides, Analysis, 5 Synthesis, Biology Vol. 1-9 (ed. Gross, Udenfriend and Meienh of) 1979-1987 (Academic Press Inc., ) . The preparation of the peptides of the invention using the "solid phase" method is described, for example, in J. Chew, Soc, 85.2149 (1963) and Int. J. Peptide Protein Res, 35.161-214 (1990). )
It is listed. The amino acid linkage of the peptide to be produced usually starts from the carboxyl terminus. This method requires a solid phase on which reactive groups are present or into which such groups can be introduced. This is for example a benzene with a reactive chloromethyl group.
and divinylbenzene, or a polymeric solid phase made reactive towards hydroxymethyl or amine functional groups. Particularly suitable solid phases are, for example, Fang (1974) J, CheIl. p-alkoxybenzyl urethane as described by Soc.
alcohol resin (4-hydroxymethyl-phenoxy-methyl-copolystyrene-1% divinylbenzene resin). After synthesis, the peptide can be separated from this solid phase under mild conditions. Other suitable supports include Geysen, Proc, Natl, Acad, Sci, 81.3998 (1984) and Proc, Natl, Acad. Mention may be made of conductive polyethylene or polypropylene rods. After synthesizing the desired amino acid sequence in solution or on a solid support, e.g.
using oroacetic acid or by mild reduction with hydrogen and a catalyst such as palladium.
The protecting group may be separated by a variety of conventional methods depending on the nature of the particular group, such as treatment with a base such as piperazine or hydroxide ion, or HBr in glacial acetic acid. If a peptide can be synthesized on a solid support and detached from it, it is
Depending on the type of linker, this can be carried out, for example, using trifluoroacetic acid, trifluoromethanesulfonic acid or methanesulfonic acid dissolved in trifluoroacetic acid, or by transesterification using lower alcohols, preferably methanol or ethanol. In the case of esterification, the lower alkyl ester of the peptide is directly formed. Similarly, separation with ammonia provides the amides of the peptides of the invention. As mentioned above, the peptides of the invention can also be produced by recombinant DNA technology. This possibility is limited when peptides are incorporated into (tandem) repeats, and when peptides are
produced as an essential component of a (much larger) protein or polypeptide.
This is particularly important when Therefore, this type of peptide production is also included within the scope of the present invention. For this purpose, the peptide of the present invention must be used as a component of the recombinant DNA.
polynucleotides flanking the above-mentioned nucleic acid sequences in the natural HCV genome.
A nucleic acid sequence that is substantially free of code segments is used. Nucleic acid sequences such as those described above that encode the peptides of the present invention, and recombinant DNA into which this nucleic acid sequence has been incorporated, are also included within the scope of the present invention. As used herein, the term "nucleic acid sequence" refers to a polymeric form of any length.
nucleotides, both ribonucleic acid sequences and deoxyribonucleic acid sequences. As a rule, this term refers to the primary structure of the molecule. The term therefore includes double-stranded and heavy-stranded DNA, as well as double-stranded and heavy-stranded RNA. It also includes modified forms of these. The nucleic acid sequences of the invention are not related or linked in nature.
It can be ligated to various non-replicable DNA sequences to become a so-called recombinant vector molecule that can be used for transformation of a suitable host. Preferably, effective recombinant vector molecules are derived from, for example, plasmids, bacteriophages, cosmids or viruses. The methods used to construct the recombinant vector molecules of the invention are well known to those skilled in the art.
It is known and described in particular in Maniatis, T. et al. (Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd board; Cold Spring Harbor Laboratory. 1989). For example, inserting a nucleic acid sequence of the invention into a cloning vector can be readily accomplished if both the gene and the desired cloning vehicle are cut with the same restriction enzymes that will generate complementary DNA ends. . In order to express the nucleic acid sequence of the present invention in an expression vector, the sequence can be combined with an expression control sequence.
operatively coupled to the column. Such control sequences may include promoters, enhancers, operators, inducers, liposome binding sites, and the like. Of course, the nucleotide sequence inserted into the selected site of the cloning vector may be a fragment of the entire nucleic acid sequence encoding the peptide of the invention, so long as the transformed host produces a polypeptide having at least one immunogenic determinant. It is understood that it is only necessary to include only The recombinant vector molecule may further include, for example, ampicillin and tet in pBR322.
Lacycline resistance, ampicillin resistance and β-galactosidin in pUC8
may contain one or more marker activities that can be used to select desired transformants, such as the α-peptide of enzymes. Using the peptides or fragments thereof produced as described above, polyclonal
Both neutral and monoclonal antibodies can be produced. For the peptide of the present invention
Monoclonal antibodies can be easily produced by those skilled in the art. It is well known that monoclonal antibodies can be produced by hybridomas; immortalized antibody-producing cell lines can be generated by cell fusion, and B lymphocytes can be produced by oncogenic DNA.
direct transformation of cells or transfection with Epstein-Barr virus.
Other methods such as action may also be used. Monochrome against the peptide of the invention
Both neutral and polyclonal antibodies are highly suitable for diagnosis; neutralizing antibodies are
Extremely effective for dynamic immunotherapy. In particular, monoclonal antibodies can be used to induce anti-idiotypic antibodies. For the time being, there is no way to induce anti-idiotype antibodies.
known in the field. Anti-idiotypic antibodies are also effective in preventing and/or treating non-A, non-B hepatitis and elucidating important epitope regions of HCV antigens. The invention further provides immunochemical reagents comprising one or more peptides of the invention. Main departure
The "immunochemical reagent" of the invention usually contains one or more peptides of the present invention and a suitable support or labeling substance. Supports that can be used in this respect include, for example, BSA.
carrier proteins, the inner walls of microtest wells or cuvettes, test tubes or capillaries, membranes, filters, test strips or particles (e.g. latex particles, red
blood cells, dye sols, metal sols), or metal compounds (e.g. sol particles).
Ru. Labeling substances that can be used include radioactive isotopes, fluorescent compounds, and labeling proteins (e.g.
(such as enzymes), enzymes, dye sols, metal sols, or metal compounds (eg sol particles). Immunochemical reagents are essential components of the method for detecting antibodies against HCV in test solutions. When an immunochemical reagent is brought into contact with the test solution, an immunochemical reaction occurs, resulting in the formation of an immune complex between the peptide (of the invention) and the anti-HCV antibody. immunochemical assay
Depending on the properties and further characteristics of the drug, the immunochemical reactions that occur are so-called sandwich reactions, agglutination reactions, competitive reactions or inhibition reactions. The immune complex formed as a result of the above reaction
Coalescence is a measure (direct or indirect) of the presence of antibodies in the test fluid. The immunochemical reagent of the present invention can also be used to detect HCV antigens in test fluids. The present invention further provides a method for treating HCV in a test solution using one or more peptides of the present invention.
Also provided are methods for detecting antibodies. The invention further relates to a method for detecting HCV in a test fluid using one or more peptides of the invention. This detection method
In this case, the test solution can be brought into contact with anti-HCV and the immunochemical reagent of the present invention sequentially and simultaneously.
Ru. A particularly suitable method for detecting HCV in test fluids is to
It is based on a competitive reaction between a peptide of the present invention and an HCV antigen (present in a test solution), and the peptide of the present invention and the antigen are linked to antibodies against HCV immobilized on a solid support.
and compete. The present invention further provides test kits used to perform immunoassays, comprising at least one immunochemical reagent of the invention. The test kit of the present invention is
Contains the above-mentioned immunochemical reagent as an essential ingredient. sandwich for anti-ICV antibody detection
When carrying out a Hatch reaction, the test kit comprises, for example: 1) a peptide of the invention immobilized on a solid support (e.g. the inner wall of a microvolume test well); and 2) a labeled peptide or labeled anti-antibody of the invention. may include any of the following. When performing a competitive reaction for HCV antibody detection, the test kit comprises: 1) the peptide of the invention immobilized on a solid support; and 2) a labeled antibody against HCV.
peptides, preferably monoclonal antibodies against said peptides. When performing an agglutination reaction, the test kit contains an immunochemical reagent consisting of a peptide of the invention immobilized on a particle or sol. A test kit for HCV antigen detection includes, for example, the labeled peptide of the present invention and an antibody against HCV immobilized on a solid support.
【実施例】【Example】
以下の実施例によって本発明を更に説明する。
実施例：
１つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている、式Ｄ−Ｒ−Ｅ−Ｖ−Ｌ−Ｙ−
Ｒ−Ｅ−Ｆ−Ｄ−Ｅ−Ｍを有するペプチドとは異なるペプチドを合成した。上述
の配列の各アミノ酸が、Ａ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ，Ｉ、に、Ｌ、Ｍ、Ｎ１Ｐ
。
Ｑ、Ｒ，５ＳＴＳＶ、Ｗ及びＹからなる群から選択される任意のアミノ酸で置換
されたペプチドを合成した。得られたペプチドを、ヒト及びマウス抗ＨＣＶ血清
との免疫反応性について試験した。この試験結果を図１に示す。この図の２つの
グラフは、上記配列内の各アミノ酸について示している（一方はヒト抗ＨＣＶ血
清との免疫反応性を示しており、他方はマウス抗ＨＣＶ血涜との免疫反応性を示
している）。これらのグラフは、もとのアミノ酸（Ｄ、Ｒ，Ｅ、ＶＳＬ、ＹｌＲ
，Ｅ、ＦＳＤ、ＥまたはＭ）が上記群から選択された任意の他のアミノ酸で置換
されている全てのペプチドの免疫反応性を示している。各グラフの太実線は、式
Ｄ −Ｒ−Ｅ −Ｖ −Ｌ −Ｙ −Ｒ−Ｅ −Ｆ −Ｄ−Ｅ−Ｍを有するペプ
チドの免疫反応性を表わしている。この図から、はとんどのアミノ酸は、免疫反
応性に影響することなく任意の他のアミノ酸で容易に置換し得ることが判る。（
式Ｉに示した）アミノ酸り、Ｅ及びＦだけは、免疫反応性に悪影響を及ぼすこと
なく任意の他のアミノ酸で置換し得ない。
図１＝１つのアミノ酸が、Ａ、Ｃ，Ｄ４ Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ。
１、に、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ，Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ及びＹからなる群から選択さ
れる任意のアミノ酸で置換されている、式Ｄ−Ｒ−Ｅ−Ｖ−Ｌ−Ｙ−Ｒ−Ｅ−Ｆ
−Ｄ−Ｅ−Ｍを有するペプチドとは異なるペプチドのヒト及びマウス抗ＨＣＶ血
清との免疫反応性を示す。
Ｆ工ＧｔＪＲＥ ｌ
ヒト抗ＨＣＶ血清及びＭ ｏ Ａ ｂ ８ Ｎを用いて分析されｒ；Ｍ ｏ Ａ
ｂ ８ Ｎエピトープの置換ネットヒト
ＡＣＤＥＦＧＨＩ ＫＬＭＮＰＱＲ８ＴＶＷＹアミノ酸
位！１１
Ｆ工ＧＵＲＥ １ （つづき）
Ｒ
ヒト
ＡＣＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲ８ＴＶＷＹアミノ酸
位置２
Ｆ工ＧＵＲＥＩ（つづき）
ヒ
ト
ＡＣＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹアミノ酸
位置３
Ｆ工ＧＵＲＥ １ （つづき）
■
ヒト
ＡＣＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹアミノ酸
位置４
■
マウス（８Ｎ）
Ｆ工ＧＵＲＥ １ （つづき）
ヒト
］
位置５
マウス（８Ｎ）
Ｆ工ＧＵＲＥＩ （つづき）
Ｙ
ヒト
位置６
マウス（８Ｎ）
Ｆ工ＧＵＲＥ １ （つづき）
ヒト
ＡＣＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲ８ＴＶＷＹアミノ酸
位置７
マウス（８Ｎ）
Ｆ工ＧＵＲＥ １ （つづき）
ヒト
ＡＣＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲ８ＴＶＷＹアミノ酸
位［ｉ！８
マウス（８Ｎ）
Ｆ工ＧＯＲＥ ｌ （つづき）
ヒト
ＡＣＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲ８ＴＶＷＹアミノ酸
位置９
マウス（８Ｎ）
Ｆ工ＧＵＲＥ １ （つづき）
Ｄ
ヒト
」
ＡＣＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲ８ＴＶＷＹアミノ酸
位置１０
Ｆ工ＧＵＲＥＩ（つづき）
ヒト
ＡＣＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲ８ＴＶＷＹアミノ酸
位置１１
、、 ＰＣＴ／ＥＰ ９２１０２９９８
The invention is further illustrated by the following examples.
Example:
Formula D-R-E-V-L-Y-, where one amino acid is replaced with another amino acid
A peptide different from the peptide with R-E-F-D-E-M was synthesized. mentioned above
Each amino acid in the sequence is A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N1P
.
Substituted with any amino acid selected from the group consisting of Q, R, 5STSV, W and Y
The peptide was synthesized. The obtained peptide was added to human and mouse anti-HCV serum.
tested for immunoreactivity with The test results are shown in Figure 1. The two in this diagram
Graphs are shown for each amino acid in the above sequence (one for human anti-HCV blood
One shows immunoreactivity with mouse anti-HCV blood, and the other shows immunoreactivity with mouse anti-HCV blood.
are doing). These graphs show the original amino acids (D, R, E, VSL, YlR
, E, FSD, E or M) is replaced with any other amino acid selected from the above group.
Immunoreactivity of all peptides tested is shown. The thick solid line in each graph is the formula
Pep having D-R-E-V-L-Y-R-E-F-D-E-M
It represents the immunoreactivity of Tide. From this figure, most amino acids are
It will be appreciated that any other amino acid can be easily substituted without affecting the response. (
Only the amino acids E and F shown in formula I have a negative effect on immunoreactivity.
It cannot be substituted with any other amino acid.
Figure 1 = One amino acid is A, C, D4 E, F, G, H.
1, selected from the group consisting of L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y.
substituted with any amino acid of the formula D-R-E-V-L-Y-R-E-F
-Human and mouse anti-HCV blood of peptides different from peptides with D-E-M
Shows immunoreactivity with the serum.
F engineering GtJRE l
Analyzed using human anti-HCV serum and MoAb8N;
b 8 N epitope replacement net human
ACDEFGHI KLMNPQR8TVWY amino acid
Rank! 11
F Engineering GURE 1 (continued)
R
human
ACDEFGHIKLMNPQR8TVWY amino acid
position 2
F Engineering GUREI (continued)
Hi
to
ACDEFGHIKLMNPQRSTVWY Amino Acid
position 3
F Engineering GURE 1 (continued)
■
human
ACDEFGHIKLMNPQRSTVWY Amino Acid
position 4
■
Mouse (8N)
F Engineering GURE 1 (continued)
human
]
position 5
Mouse (8N)
F Engineering GUREI (continued)
Y
human
position 6
Mouse (8N)
F Engineering GURE 1 (continued)
human
ACDEFGHIKLMNPQR8TVWY amino acid
position 7
Mouse (8N)
F Engineering GURE 1 (continued)
human
ACDEFGHIKLMNPQR8TVWY amino acid
Place [i! 8
Mouse (8N)
F engineering GORE l (continued)
human
ACDEFGHIKLMNPQR8TVWY amino acid
position 9
Mouse (8N)
F Engineering GURE 1 (continued)
D
human
”
ACDEFGHIKLMNPQR8TVWY amino acid
position 10
F Engineering GUREI (continued)
human
ACDEFGHIKLMNPQR8TVWY amino acid
position 11
,, PCT/EP 92102998