JPH07502971A - 改良された血糖隆下剤 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 改良された血糖降下剤 背景 関連出願 この出願は、１９９０年８月１４日付けのアメリカ合衆国特許出願第０７１５６ ７９１９号の一部継続出願であり、それを引用して説明の一部とする。

発明の分野 本発明の分野は、薬剤、さらに特定すれば非インシュリン依存性または２型真性 糖尿病の処置を目的とする方法、化合物および組成物である。

関連技術の記載および発明への緒論 糖尿病は、ヒトかり患する深刻な代謝疾患のうちで最もよく見られる疾患である 。それは、インシュリン作用の相対的または絶対的不足の結果として生じる、慢 性高血糖状態、すなわち血液中での糖過剰状態として定義され得る。インシュリ ンは、すい臓のランゲルハンス島内のＢ細胞により産生および分泌されるペプチ ドホルモンである。インシュリンは、グルコース利用、蛋白質合成並びに中性脂 質の形成および貯蔵を促す。それは、一般にグルコースが筋肉へ入るのに必要と される。グルコースまたは「血糖」は、通常ｌリンドル当たり約０．８−１．２ グラム（４，０−７，０ミリモル）の濃度で人体に存在し、ヒトおよび多くの他 の生物体における炭水化物エネルギーの主たる供給源である。過剰のグルコース は、グリコゲン、すなわち本質的にポリマー化したグルコースである澱粉様物質 として体内（特に肝臓および筋肉）に貯蔵される。グリコゲンは、体の要求を満 たす必要に応じてグルコースへ代謝される。

グルコースは、通常インシュリンの分泌および生合成の両方を刺激する。しかし ながら、このグルコース刺激によるインシュリン分泌に加えて、基礎インシュリ ン分泌、すなわち「空腹時」または絶食レベルより高く上昇させるレベルのグル コース、またはインシュリン分泌を促進する他の作用因による刺激の非存在下で インシュリンが循環系へ放出される生物学的プロセスが存在する。約４．０〜５ ゜５ミリモル／Ｌの正常空腹時グルコース・レベル間で生じるインシュリンの正 常基礎〔または空腹時）レベルは、通常的１Ｏ−１６ＫＵ／ｍｌ（または４４０ −７００ピコモル／Ｌ）である。グルコースの正常空腹時レベルより高いグルコ ース量により刺激されるインシュリン分泌のレベルは、非糖尿病患者では３２０ μＵ／ｙＩｌ（または１４ナノモル／Ｌ）に達するか、またはそれを越え得る。

グリコゲンは、通常、基礎比率、すなわちグルコース刺激によるインシュリン分 泌の非存在下で進行する合成比率でグルコースから合成される。インシュリン分 泌の正常な基礎比率において、事実、全グリコゲン合成の約９０パーセントは、 恐らくインシュリンによる刺激を直接的には受けていないと思われる。勿論、イ ンシュリン刺激によるグリコゲン合成は正常な事象であり、最大グルコース刺激 によるインシュリン分泌比率では、全グリコゲン合成の約７０パーセントが直接 インシュリン刺激により誘発される。

糖尿病に伴う高血糖は、グルコースの不充分な利用およびインシュリン・レベル が比較的抑えられているかまたは存在しないことによる蛋白質からのグルコース の過剰生産の両方の結果である。いわゆる２型糖尿病では、例えば最大グルコー ス刺激インシュリン・レベルは、典型的には約９０μＵ／ｍ１（４，０ナノモル ／Ｌ）を越えることはない。

糖尿病は、一連のホルモン誘発性代謝異常だけでなく、目、神経、腎臓および血 管を巻き込む長期合併症並びに細胞基底膜の肥厚を含む病変を特徴とする。これ らの糖尿病合併症には、早発性アテローム性動脈硬化症、毛細管間糸球体硬化症 、網膜症および神経障害がある。糖尿病における主たる死因および廃疾は、冠動 脈疾患である。

ガルシア、マクナマラＰ、Ｍ、、ゴートンＴ９、キャンネルＷ、Ｅ、、ｒモービ ディティー・アンド・モータリティー・イン・ダイアベティックス・イン・ザ・ フラミンガム・ポピユレーション。シックスティーン・イヤー・７オロウ・アッ プ」、［ダイアベーラＪ１９７４．３４：１０５−１１１０この刊行物およびこ こに示された他の全ての参考文献を引用して説明の一部とする。

症候的真性糖尿病の診断は困難ではないが、無症状疾患の検出は若干の問題を生 じ得る。診断は、通常空腹特高血糖の立証により確認され得る。境界例では、よ く知られたグルコース寛容性試験が通常適用される。しかしながら、経口グルコ ース寛容性試験では、かなりの程度糖尿病の誤診が生じるという証拠も示されて おり、これは、恐らく様々な誘因による（ホルモンのエピネフリンの放出により 仲介される）ストレスが異常応答を誘発し得るためと思われる。

これらの問題点を明確にするため、ナショナル・インスティテユート・オブ・ヘ ルスのナショナル・ダイアベーラ・データ・グループは、経口グルコースによる 攻撃後の糖尿病の診断に関する基準を推奨している。ナショナル・ダイアベーラ ・データ・グループ：「クラ／フィケーンヨン・アンド・ダイアグツシス・オブ ・ダイアベーラ・メリタス・アンド・アザ−・カテゴリーズ・オブ・グルコース ・イントレランス」、「ダイアベーラ」、１９７９．２８：１０３９゜一般的集 団における真性糖尿病の頻度は確実には確かめにくいが、この疾患には１０００ 万人を越えるアメリカ人かり患していると考えられている。真性糖尿病は、一般 に完治し得ず、制御され得るだけである。近年、「真性糖尿病」という包括語に 含まれる一連の相異なる症候群が存在することが明らかとなった。これらの症候 群は、臨床的顕現およびそれらの遺伝パターンの両方が異なる。真性糖尿病とい う語は、上記特徴を呈する一連の高血糖状態に適用されると考えられる。

糖尿病は、−次および二次の２つの基本範ちゅうに分類されており、経口グルコ ース負荷後に異常に上昇した血糖レベルを伴う状態として定義され得るグルコー ス寛容性障害を含む。ただし、上昇程度は糖尿病の診断を下すには不充分である 。この範ちゅうに含まれる人は、グルコース寛容性が正常な人と比べて絶食特高 血糖または症候的糖尿病を発現する危険が高いが、その経過を個々の患者につい て予測するのは不可能である。事実、幾つかの大規模試験は、グルコース寛容性 が損なわれた患者でも大部分（約７５パーセント）は糖尿病を発現しないと示唆 している。ジャレットＡ、！、、キーンＨ３、フラーＪ、Ｈ，、マツカートニー Ｍ２、「ワースニング・トウ・ダイアベーラ・イン・メン・クイズ・インベアー ド・グルコース・トレランス（「ボーダーライン・ダイアベーラ」）」、「ダイ アベトロシア」、１９７９．１６：２５−３０参照。

−次真性糖尿病には、 ■、インシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭまたはｌ型）、２、非インシュリ ン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭまたは２型）、ａ、非肥満２型 す、肥満２型 Ｃ１若者の成人期発症糖尿病（ＭＯＤＹ）がある。

二次真性糖尿病には、 ■、すい臓疾患、 ２、イン／ニリン作用の一次欠如以外のホルモン異常（例、クツソング病、先端 巨大症、クロム親和性細胞腫）、３、薬剤または化学物質誘発、 ４、イン７ユリン・レセグター異常、 ５、遺伝的症候群、 ６、その他 に対して二次的な真性糖尿病がある。

ただし、二次真性糖尿病の範ちゅうは、少なくとも西側諸国ではり患した個体の 絶対数の点で一次真性糖尿病の場合よりも重要性はかなり劣るものとする。また 、多くの場合、軽い無症状性−次糖尿病は二次疾患により明白にされ得るが、上 記二次的誘因のいずれかと関連した異常な炭水化物代謝の出現は、根元的な糖尿 病の存在を必ずしも示すわけではない。

２型または非インシュリン依存性糖尿病が本発明における関心事である。インシ ュリン抵抗は、２型糖尿病の特徴であり、インシュリン作用に対する周辺組織の 正常な代謝応答の機能不全として定義され得る。言い替えれば、それは、インシ ュリンの存在によって正常より劣る生物応答が生じる状態である。臨床用語では 、正常または高い血糖レベルが、正常または高レベルのインシュリンにも拘わら ず存続するときに、インシュリン抵抗が存在する。それは本質的にグリコゲン合 成阻害を示し、これによって基礎またはインシュリン刺激によるグリコゲン合成 またはそれら両方が正常レベルより下に低減化される。２型糖尿病に存在する高 血糖が、明らかに、インシュリンに対する周辺組織の感受性を回復させるのに充 分な食餌療法または体重減少により打ち消され得る場合もあるという事実により 立証された通り、インシュリン抵抗は２型において主たる役割を演じている。２ 型糖尿病には、高血糖の少なくとも２つの誘因が存在する。

１、活性化されるグルコース貯蔵の不足。グリコゲンとしての炭水化物の貯蔵は 、各カロリー負荷か容易に即時代謝要求を越え得るため、間欠的炭水化物供給の 起こり得る結果であるということが知られている。簡単に述べると、貯蔵は血し ようからグルコースを一掃する手段を提供する。最近のデータは、即時グルコー ス処理部位が骨格筋であることを示唆している。カッツＬ、Ｄ、、グリツクマン Ｍ、Ｇ、、ラボポートＳ１、フエランニーニＥ９、デ・７０ンゾＲ，Ａ、、「ス ブランクニック・アンド・ペリフェラル・ディスポーザル・オブ・オーラル・グ ルコース・イン・マン」、「ダイアベーラＪ、１９８３．３２：６７５参照。炭 水化物投与中２型糖尿病において活性化されるグルコース貯蔵の不足は、グルコ ースの組織取り込みを低減化させるため、インシュリン抵抗を誘発する主たる欠 陥であり得る。リリオソハＳ０、モットＤ、Ｍ、、ザワズキ−Ｊ、に、、ヤング Ａ。

Ａ１、アボットＷ、Ｇ、、ポガルデュスＣ９、「グルコース・ストレージ・イズ ・ア・メジャー・デターミナント・オブ・インビボ・「インシュリン・レジスタ ンス」・イン・サブジエクツ・クイズ・ノーマル・グルコース・トレランス」、 「ジャーナルψオブ・クリニカル・エンドフライノロジー・アンド・メタポリズ ムＪ、１９８６．６２：９２２−９２７参照。

２、イン／ニリン作用における欠陥。しかしながら、インシュリン抵抗が著しい 高度肥満者でも通常は高血糖または真性糖尿病にり患していないｔ二め、インシ ュリン貯蔵または放出における欠陥も関与している。ワジンゴットＡ１、ローベ テＡ０等、「インシュリン・レジスタンス・アンド・デイクリーズド・インシュ リン・レスポンス・トウ・グルコース・イン・リーン・タイプ２・ダイアベテイ ツクス」、「プロンーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・ サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーク・オブ・アメリカ」、１９ ８２．７９：４４３２−４４３６参照。この発見は、正常なすい臓であれば肥満 または他の因子により余儀なくされたイン７ユリン抵抗を補うのに充分な貯えを もつが、２型対象のすい臓はそれをもたないことを示唆している。従って、この 意味では、異常性はイン７ユリン抵抗の追加的徴候を伴わない場合認められない が、−次欠陥は機能不全に陥った島Ｂ細胞であると考えられ得る。

非肥満２型患者はインシュリン放出においてさらに深刻な欠陥を有することがあ り得る。

２型糖尿病における島Ｂ細胞病変の性質は不明である。１型糖尿病の場合とは異 なり、２型Ｂ細胞は、これらの細胞および血しょう中で循環している両方でのイ ンシュリンおよびＣ−ペプチドの存在により立証された通り、インシュリンの合 成および分泌能力を保持している。利用可能な試験は、Ｂ細胞の数の適度の減少 が存在することを示唆しているが、これはインシュリン分泌の観察された低減化 を説明するのには不充分である。ステファンＹ１、オルシＬｌ、「ダイアベーラ 」、１９８２．３１：６９４−７００゜従って、恐らく残りのＢ細胞は、この疾 患の最も初期の検出可能な段階でさえ、グルコース負荷に応じたインシュリンの 初期分泌の遅延として、および２型糖尿病では、明白な糖尿病対象および臨床的 潜伏性形態の糖尿病対象の両方においていかなるグルコース濃度でも分泌される インシュリンは少ないという事実により示された、機能障害を有すると考えられ てきた。

全形態の真性糖尿病における処置の主目的は、ただ一つ、すなわち血糖レベルを 可能な限り正常値付近に低減化することにより、この病気の短期および長期合併 症の両方を最少限に抑えることである。

チョブロウツキーＧ９、「リレイション・オブ・ダイアベトロシア・コントロー ル・トウ・デベロソプメント・オブ・マイクロバスキュラー・コンブリケーショ ンズ」、「ダイアベトロシア」、１９７８．１５：Ｉ４３−１５２゜ ｌ型糖尿病の処置は、非経口経路により投与される、補充用量のインシュリンの 投与を必然的に含む。正確な食餌療法および自己血糖モニタリングを組み合わせ ると、１型患者の大部分は妥当な血糖値制御を達成し得る。２型の処置は、１型 の処置とは対照的に、インシュリンの使用を頻繁には必要としない。治療は食餌 療法および生活様式の変化に基づき得、経口血糖降下剤（スルホニル尿素または ビグアナイド）療法により増強される。

食餌療法および生活様式の修正は、２型における治療の最重要事項である。肥満 が存在する場合、体重を理想水準付近に減らすことも必要である。糖尿病食餌療 法の重要な特徴には、規定食による適度ではあるが過度ではない総カロリー摂取 、飽和脂肪含有量の制限、ポリ不飽和脂肪酸含有量の付随的増加、および結合炭 水化物（「食物繊維」）の摂取増加がある。第２の重要な生活様式修正は、体重 制御およびイン７ユリン抵抗度の低減化の両方を助ける手段としての規則正しい 運動の維持である。

すなわち、２型における治療を慣行する場合、通常、典型的には第一に６〜１２ 週間の食餌療法の試みが行なわれる。食餌療法８よび生活様式修正を適度に試み た後も絶食特高血糖状態が存続する場合、「−次食餌療法失敗」の診断が下され 得、血糖制御をすることにより、この病気の合併症を最少限にするためには経口 血糖降下剤療法またはインシュリン療法の直接的慣行が要求される。体重減少は 生活様式および食餌療法修正の目的ではあるが、勿論達成されないことが多いこ とに留意しなければならない。

食餌療法および体重減少に好反応を示し得ない２型糖尿病患者でも、スルホニル 尿素療法に好反応を示し得る。スルホニル尿素類は、本来スルホンアミド、ｐ− アミノベンゼン−スルホンアミドイソプロピルチアジアゾールから誘導された薬 剤の種類を含む。スルホニル尿素薬剤の種類には、アセトへキサミド、クロロプ ロパミド、トラザミド、トルブタミド、グリベンクラミント、グリポルヌリド、 グリクラシト、グリビジド、グリキドンおよびグリミジンがある。

これらの薬剤は、主として残りのすい臓ベータ細胞機能を増強することにより作 用し、比較的使用し易い。しかしながら、スルホニル尿素は全て、食後４または それ以上の時間で昏睡を含む低血糖反応を誘発し得ると理解することが重要であ る。事実、低血糖症状の発現は数日間続き得るため、延長または反復的グルコー ス投与が必要とされる。反応は、１回服用後、処置の数日後または薬剤投与の数 箇月後に起こった。大部分の反応は５０歳を越える年令の患者で観察され、それ らは肝臓または腎臓機能が損なわれた患者で多く生じ易い。過剰服用または不適 切もしくは不規則な食物摂取により低血糖状態が誘発され得る。他の薬剤は、他 の血糖降下剤、スルホンアミド、プロプラノロール、サリチレート、フェニルブ タシン、プロペネ／ド、ジクマロー／呟　クロラムフェニコール、モノアミンオ キシダーゼ阻害剤およびアルコールを含め、スルホニル尿素類による低血糖症の 危険度を増加させ得る。

さらに、スルホニル尿素の代謝における肝臓の役割並びに前記薬剤の排出および それらの代謝における腎臓の役割が重要であるため、肝臓または腎臓不全患者で はそれらの薬剤を使用すべきではないことも判る。さらに、肥満患者において理 想体重の１５パ一セント以内に体重を落としｔ；結果、患者の徴候および糖尿病 制御が改善された場合、体重増加が奨励される傾向があるため、前記患者ではこ れらの化合物を回避した方が良い。

スルホニル尿素は、冠動脈疾患にょろり患率および死亡率の増加を誘発し得るこ とも示唆された。ユニバージティー・グループ・ダイアベティック・プログラム 、「ア・スタディ・オン・ジ・エフェクツ・オン・ハイポグリセミック・エージ ェンッ・オン・パスキュラー・コンブリケーションズ・イン・ペイシャンッ・ウ ィズ・アダルトーオンセット・ダイアベーラ」、「ダイアベーラ」、１９７６． ２５：１１２０−１１５３参照。その試験は、治療厳守にも拘わらず患者が割り 当てられた処置群によるデータ分析について批判された。

批評家は、グルコース制御を最適化するために様々な用量でインシュリンが与え られた患者の場合心臓血管疾患による死亡が減少した可能性があること（キロＣ １、ウィリアムソンＪ、Ｒ，、チョイＳ、Ｃ，、ミラーＪ、Ｐ、、ｒレフユティ ーナ・ザ・ユニバージティー・グループ・ダイアベティック・プログラム・コン クルージョン・ザット・インシュリン・トリートメント・ダズ・ノット・プリベ ント・バスキュラー・コンブリケーノヨンズ・イン・ダイアベーラ」、「アドバ ンンーズ・イン・エクスペリメンタル・メディシン・アンド・バイオロジー」、 １９７９．１１９：３０７−３１１参照）、および絶食時血糖値が１１．１ミリ モル／Ｌより高いままの場合、トルブタミド薬剤が死亡率増加と関連し得るだけ であることを示唆した。キロＣ１、ミラーＪ、Ｐ、、ウィリアムソンＪ、Ｒ，、 「ザ・フラックス・オン・ザ・ユニバーンティー・グループ・ダイアベティック ・プログラム、スビュリアス・リザルツ・アンド・バイオロジーリー・イナプロ ープリエイト・データ・アナリシス」、「ダイアベトロシア」、１９８０．１９ ：１７９−１８５゜これにも拘わらず、また経口薬剤療法の利用可能性にも拘わ らず、２型集団における冠動脈疾患にょろり患率および死亡率は依然として非糖 尿病患者の場合よりもかなり高い。

別の群の化合物、すなわちビグアナイドは、スルホニル尿素とは関係無く開発さ れた。フェンホルミンを含む３種の抗糖尿病性ビグアナイドのうち、メトホルミ ンのみが、充分制御された投与法で適用された場合、副作用の危険も少なく２型 糖尿病の処置に有用である。シャファーＧ１、「ビグアナイズ：ア・レビュー・ オン・ヒストリー、ファーマコダイナミックス・アンド・セラピー」、「ダイア ベーラ・工・メタポリズム」、１９８３．９：１４８−１６３参照。メトホルミ ンは、インシュリン分泌の増加を誘発しないが、主として周辺グルコース利用を 高めることにより、その血糖降下作用を発揮すると考えられている。しかしなが ら、スルホニル尿素と同様、それは、ある程度の残留内在性インシュリン分泌を 示す糖尿病患者において有効なだけであり、従って、それは、恐らくインシュリ ンに対する周辺組織の感受性を高めることにより作用すると思われる。

その抗糖尿病作用に寄与すると考えられているメトホルミンの他の代謝作用には 、（１）グルコースおよび他の栄養素の腸内吸収不良の誘発、（２）肝臓および 腎臓糖新生増加の阻害、並びに（３）脂肪分解および遊離脂肪酸酸化の阻害があ る。しかしながら、インシュリンとは異なり、メトホルミンは脂肪生成を助長す ることは無い。それは、体重を減らし得ないか、または減さらない過剰体重糖尿 病患者において最も頻繁に使用される。メトホルミンは、非糖尿病対象では血糖 降下作用を発揮しない。

乳酸酸性症の致命的なことも多い合併症は現実的で予測できない危険を伴うため 、ビグアナイドの７エンホルミンの使用は中止された。しかしながら、メトホル ミンもこの危険を有するため、治療におけるその使用の決定は、−次食餌療法失 敗を被った患者および体重過剰であるかまたは同じく「二次スルホニル尿素療法 失敗」を被った（そして体重過剰である）患者においてのみ、慎重に行なわれな ければならない。腎臓病またはアルコール濫用歴のある患者にメトホルミンを与 えるべきではなく、吐き気、おう吐、下痢または何等かの併発症が現れた場合、 その使用を即時中止しなければならない。

注目すべきことに、上記の治療達成手段にも拘わらず、多くの２型糖尿病患者、 特に−次食餌療法失敗を被った肥満でない患者または一次食餌療法失敗および二 次経口血糖降下剤療法失敗の両方を被った患者にとって、インシュリン療法は依 然として一番に選択される処置である。しかしながら、インシュリン療法は、食 餌制限および生活様式修正に対する連続した努力と組み合わされなければならず 、決してこれらの代替策としては考えられ得ないことも同じく明白である。最適 の結果を得るためには、インシュリン療法は、自己血糖モニターおよびグリコジ ル化血液蛋白質の適当な評価を伴うべきである。インシュリンは、様々な投与方 法、すなわち短期、中間もしくは長期作用性インシュリンまたは複数タイプの混 合物の単独、２種または多種注射により投与され得る。患者にとって最善の投与 方法は、個々の患者のモニターされた応答に対してインシュリン療法を調整する プロセスにより決定されなければならない。

２型糖尿病におけるインシュリン療法の使用動向は、長期糖尿病合併症を回避す るには厳密な血糖症制御が重要であるという現認識に従い高まっている。しかし ながら、二次経口血糖降下剤療法が失敗した非肥満２型糖尿病患者において、イ ンシュリン療法は適当な制御の誘発には成功し得るが、良好な応答ｔま決して保 証されなｌ、Ｘｏ例えば、レンテルＭ９、スラビンＤ１、メルツＧ９、シンプソ ンＪ１、バーケラトＡ１、［ア・ケース・オン・マチュ１ノテイーーオンセット ・ダイアベーラ・メリタス・レジスタンド・トウ・インシュ１ノン・）（・メト ・レスポンシブ・トウ・トルブタミ向、「アナルス・オン・インターナル・メデ イシン」、１９７９．９０：１９５−９７参照。−試験では、最大用量の経口血 糖降下剤でも制御力；うまく為されな力１つだ５８名の非肥満患者のうち３１／ く−セントし力）、単純なイン・ンユリン投与療法による制御で客観的に立証し 得る改善を達成しな力）つた。ピーコック１０、夕・ツタ−ソールＲ，Ｂ、、ｒ ｑ・デイフイカルト・チョイス・オン・トリートメント・フォー・グア１ノー・ コンドロールド・マチユリティー−オンセット・ダイアベー′ノ：タブレ・ンツ ・オア・インシュリン」、［フリティ・ンシュ・メディカル・ジャーナル］、１ ９８４．２８８：１９５８−１９５９゜二次療法カζ失敗しＩこ月巴満糖尿病患 者では、この状況におし・てインシュ１ノン（ま体重を増加させる頻度が高く、 同時に制御の低下を伴うことが多ｂＸｔこめ、事態（よさらに不明快である。

従って、２型糖尿病治療に関する知識および実践の現状が決して満足すべきもの ではないことは明らかである。患者の大部分は時がたつにつれて一次食餌療法の 失敗を被り、肥満２型糖尿病患者の大部分は理想体重に到達できない。経口血糖 降下剤は一次食餌療法失敗の場合に血糖症の度合を低減化するのに成功すること も多いが、多くの権威者は、達成された血糖制御の度合が、長年にわたる２型糖 尿病に伴うアテローム性疾患、神経障害、ネ７０パシー、網膜症および末梢脈管 疾患の長期合併症の発生の回避に充分なものではないと考えている。この理由は 、５．５〜６．０ミリモル／Ｌの絶食時車しょうグルコースにほぼ相当する最少 グルコース非寛容値でも心臓血管による死亡率の危険増加を伴うという現行の理 解に鑑みて正しく認識され得る。アニーラーＪ　、Ｈ，、シップレイＭ、Ｊ、、 ローズＧ１、ジャレットＲ，Ｊ、、キーンＨ９、「コロナリー・ハート・ディシ ーズ・リスク・アンド・インベアード・グルコース・トレランス」、ザ・ホワイ トホール・スタディ、「ランセット」、１９８０、■＝１３７３−１３７８゜ま た、インシュリン療法が経口血糖降下剤による処置において長期結果に何等かの 改善をもＩ；らずことは明白ではない。すなわち、優れた処置方法が非常に有用 であるのは当然であり得る。かかる方法およびそれに有用な化合物は、本明細書 で記載および請求されている。

発明の要旨 本発明は、２型糖尿病患者から一般的に見出されるすい臓アミロイド塊から分離 されたホルモンであるアミリンの作用の調節に有用な薬剤と一緒に血糖降下剤を 用いた２を糖尿病の処置を目的とする化合物、医薬組成物および方法を提供する 。我々は、高い量のアミリンが異常なインシュリン放出および異常なグリコゲン 合成を誘導することを見出し、さらに我々は、アミリンが標準的血糖降下剤療法 により高められることを測定した。血糖降下剤療法と共に使用する場合、アミリ ン調節は、例えば、アミリンもしくはＣＧＲＰの置換または改変されたペプチド もしくはサブペプチドを含む阻害剤の使用、またはアミリンもしくはＣＧＲＰま たはその活性サブペプチドの発現または生成または放出の調節により、アミリン および／またはカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）および／または他 のアミリン・アゴニスト、またはアミリンもしくはＣＧＲＰの生物活性サブペプ チドの結合を遮断することにより達成され得る。

血糖降下剤、特に高いアミリンレベルを導く血糖降下剤による患者の処置と共に 、応答を誘発せずにアミリンレセプターに結合する対アミリン化学的きっ抗物質 を用いることにより、グルコースに対する体内基礎およびインシュリン刺激応答 の阻害またはインシュリン放出を伴う分子の干渉を妨害すべく作用するアミリン またはアミリン・アゴニスト（ＣＯＲＰを含む）またはその生物活性サブペプチ ドの作用を低下させることもできる。すなわち、非アミド化アミリン、アミリン ８−３７およびＣＧＲＰ８−３７を含め本明細書に記載および請求されているア ミリンおよびＣＧＲＰの置換５ｅｔ２．ｓｅｔ’ペプチドおよびサブペプチドは 、筋肉におけるインシュリン抵抗を改善し得る。他の競争的きっ抗物質には、架 橋アミリンアゴニスト（アミリン、ＣＧＲＰおよびその活性サブペプチドを含む ）および合成アミリンがある。アミリンレセプターの直接遮断はまた、モノクロ ーナル抗体および抗イデイオタイプ抗体により達成され得る。アミリンおよびア ミリンアゴニストに対する他の化学的きっ抗物質には、本明細書で開示された方 法により抗アミリン作用について検定および／またはスクリーニングされ得る有 機化合物が含まれる。また、アミリン分泌に作用する化合物の評価および同定を 可能にする検定およびスクリーニング方法も開示されている。非競争的アミリン きっ抗物質には、アミリンおよびＣＧＲＰの活性部位指向性抗体がある。

本発明は、特に患者における非インシユリン依存性または２型真性糖尿病の処置 方法であって、アミリンの血しょう濃度を高める血糖降下剤を前記患者に投与す ることを含み、前記血糖降下剤が治療有効量のアミリンきっ抗物質と共に投与さ れる方法を提供する。血糖降下剤には、同じくインシュリンの血しょう濃度も高 めるスルホニル尿素血糖降下剤を含む、スルホニル尿素血糖降下剤、例えばグリ ベンクラミドおよびトルブタミドを含む第一および第二世代スルホニル尿素剤が ある。本発明はまた、前記処置用に投与された場合、結果的にアミリンの循環レ ベルを増加させる血糖降下剤と共にアミリンきっ抗物質を投与することによる血 糖降下剤の血糖低下作用を促進する方法を提供する。血糖降下剤およびアミリン きっ抗物質は、−緒にまｔ；は別々に投与され得る。

また、本発明は、スルホニル尿素血糖降下剤によりアミリン血しよう濃度の上昇 が誘発される患者または患者のサブグループの決定方法であって、前記スルホニ ル尿素血糖降下剤の有効量を患者（複数も可）に投与し、予め定められた時点（ 複数も可）で前記患者（複数も可）における血しようアミリン濃度を評価するこ とを含む方法を提供する。この評価は、アミリン検定、例えば結合検定、生物学 的検定、化学的検定および他の分離検定の使用により行なわれ得る。さらに、血 糖降下剤療法による患者の処置のモニターまたは評価方法であって、予め定めら れた時点（複数も可）での前記患者における血しょうアミリン濃度の評価が、患 者に対する有効量の血糖降下剤の投与後におけるアミリン検定の使用により行な われる方法が提供される。その方法でモニターされ得る血糖降下剤には、スルホ ニル尿素血糖降下剤がある。この方法に有用なアミリン検定法は上述の検定法で あるが、特に好ましいのはアミリン免疫検定法である。使用されるアミリン免疫 検定法は、定性的、半定量的または定量的であり得る。血糖降下剤療法による患 者の処置をモニターまたは評価するこの方法は、アミリンレベルを高めない血糖 降下剤、例えばビグアナイド・メトホルミンに関して特に有利である。

また、アミリンおよびアミリンきっ抗物質の血しょう濃度を高める血糖降下剤の 治療有効量を含む医薬組成物も提供される。また、本発明は、低血糖症に関連し た状態の処置に有用であり得る薬剤に関する評価またはスクリーニング方法であ って、１種またはそれ以上のＭ記薬剤をアミリン・レベルがモニターできる生物 系と一緒に合わせ、アミリン・レベルに対する前記薬剤（複数も可）の効果を評 価する方法を提供する。適当な生物系には、総体動物、細胞培養物および潅流す い臓系がある。特に好ましい細胞培養物は、島ベータ細胞培養物、特にＨＩＴ　 Ｔ−１５細胞である。これらの方法を用いることにより推定的血糖降下剤をバッ チ・スクリーニングすることができ、ざらにスクリーニングの実施が望まれる薬 剤は、同一または異なる生物系で再び評価され得る。

本発明はまた、高アミリン血症と関連した状態の処置に有用であり得る薬剤に関 する評価またはスクリーニング方法であって、前記薬剤（複数も可）をアミリン ・レベルがモニターできる生物系と一緒に合わせ、アミリンの分泌に対する前記 薬剤（複数も可）の効果を測定する方法を提供する。さらに、この方法では、イ ンシュリン分泌に対する前記薬剤（複数も可）の効果の場合と同様、アミリンの 基礎および／または分泌促進物質刺激による分泌に対する作用が評価され得る。

アミリン分泌に作用する薬剤の評価に好ましい生物系は、細胞培養物、特に島ベ ータ細胞培養物、例えばＨＩＴ　Ｔ−１５細胞である。

図面の簡単な記載 図１は、インシュリン刺激による筋肉グリコゲン合成に対するアミリンの阻害作 用に対するアミリンきっ抗物質の効果を示す図であ図２は、ヒトアミリン（黒四 角）およびハムスターアミリン（白四角）の量を増すことによる１２５Ｉ−ヒト アミリンの置換を示すアミリン放射線免疫検定の結果を示す図である。各点は、 トリプリケイト（ヒト）またはデュプリケイト（ハムスター）測定値の平均を表 す。

図３は、ＨＩＴ細胞からの基礎およびグルコース刺激によるインシュリン放出に 対するメトホルミン、トルブタミドおよびグリブリドの作用を示す図である。

図４は、ＨＩＴ細胞からの基礎およびグルコース刺激によるアミリン放出に対す るメトホルミン、トルブタミドおよびグリブリドの作用を示す図である。

図５は、用量依存方法におけるＨＩＴ細胞からのグルコース刺激によるアミリン およびインシュリン分泌を示す図である。データは、グルコースの非存在下で行 なわれた基礎アミリン（黒四角）またはインシュリン（白四角）放出のパーセン トとして表されている。４反復実験の平均上ＳＥＭ、平均基礎アミリンおよびイ ンシュリン放出は、各々０．１２０±０．０２６および０．４４３±０．１７５ ピコモル／１０’細胞であった。

図６は、用量依存方法におけるＨＩＴ細胞からのアルギニン刺激によるアミリン およびインシュリン分泌を示す図である。アルギニン濃度を増加させなからＨＩ Ｔ細胞を６０分間インキュベーションした。データは、アルギニンの非存在下で 行なわれた基礎アミリン（黒四角）またはインシュリン（白四角）放出のパーセ ントとして表されている。７反復実験の平均上ＳＥＭ、平均基礎アミリンおよび インシュリン放出は、各々０．１４５±０．０３５および０．３６９±０．０７ ３ピコモル／１０６細胞であった。

図７は、ＨＩＴ細胞からのグルコース刺激によるアミリンおよびインシュリン分 泌のアルギニン強化を示す図である。ＨＩＴ細胞を６０分間グルコースまたはア ルギニン単独またはそれらを組み合わせた形でインキュベーションした。データ は、基礎アミリンまたはインシュリン放出（分泌促進物質の非存在下）のパーセ ントとして表されている。３反復実験の平均±ＳＥＭ、平均基礎アミリンおよび インシュリン放出は、各々０．１８４±０．０４７および０．４８９±０．０７ ０ピコモル／１０６細胞であった。

図８は、グルコースおよびアルギニンにより始動されたＨＩＴ細胞からのアミリ ンおよびインシュリン放出のグルカゴン強化を示す図である。データは、グリコ ゲンの非存在下におけるアミリン（黒四角）またはインシュリン（白四角）放出 のパーセントとして表されている。４反復実験の平均±ＳＥＭ、対照ウェル（１ ，２５ミリモルのグルコース＋１，２５ミリモルのアルギニン）における平均ア ミリンおよびインシュリン放出は、各々０．３６７±０．０９６および１゜０５ ８±０．３１６ピコモル／１０６細胞であった。

図９は、グルコースおよびアルギニンにより攻撃したＨＩＴ細胞からのアミリン およびインシュリン放出のソマトスタチン抑制を示す図である。データは、ソマ トスタチンの非存在下で行なわれた最大アミリン（黒四角）またはインシュリン （自四角）放出のパーセントとして表されている。３反復実験の平均±ＳＥＭ、 対照ウェル（ｌＯミリモルのグルコース＋１５ミリモルのアルギニン）における 平均アミリンおよびインシュリン放出は、各々０．５２８±０．２５４および１ ．６１７±０．８７７ピコモル／１０１細胞であった。

発明の詳細な記載 Ａ、すい臓アミロイド アミロイドは、同一ポリペプチド・サブユニットの逆平行ベータープリーツシー トから形成されたツイストーヘソックス対蛋白質フィラメントの細胞外沈澱物に 与えられた名称である。グレンナー〇。

Ｇｏ、「アミロイド・デノシッッ・アンド・アミロイドシス；ザ・ベーターフィ ブリローシス」、「ニューイングランド・ジャーナル・オン・メディンン」、１ ９８０．３０２：１２８３−１２９２参照。アミロイド物質、島アミロイドの沈 澱は、２型真性糖尿病患者のすい臓から頻繁に見出される。クラークＡ０、クー パーＧ、Ｊ、Ｓ、等、「アイレット・アミロイド・フォームド・７０ム・ダイア ベーツーアソーシエイティノド・ペプタイド・メイ・ビー・パンジェニック・イ ン・タイプＩＩダイアベーツ」、ｒランセット」、１９８７．２：２３１−２３ ４参照。２型糖尿病では、ランゲルハンス島、すなわちすい臓本体全体に散在し た内分泌性細胞のクラスターを含む塊の９０パーセントを越える部分における島 アミロイドの沈澱を報告した研究者もいる。これらの沈澱物は島の５分の４以下 を占め得、Ｂ細胞およびＢ細胞密度の喪失を伴う。ウェスターマークＰ１、ウィ ランダ−Ｗ、、「ダイアベトロシア」、１９７０．１５：４１７−４２１゜試験 は、り患した島の数およびアミロイド沈澱の範囲が、ヒト（ンユナイダーＨ，Ｍ 、、スト−ケルＳ８、ウィルＨ，Ｍ、、「シス・アミロイド・デル・ランゲルハ ンシエン・インスリン・ラント・ゼルネ・ベツレフング・ブム・ディアベテス・ メリツス」、「トイチェ・メディツイニツシェ・ポソヘンンユリフト」、１９８ ０．１０５：１１４３−１１４７参照）８よび２型Ｗｉ泳病マカカ・ブラ・モン キーにおいて高血糖症の度合と共に増加することを示しＩ；。ホワードＣ，Ｆ、 、「ロンギチューディナル・スタディーズ・オン・ザ・デベロップメント・オン ・ダイアベーラ・イン・インディビデュアル・マカカ・ニグラ」、「ダイアベト ロシア」、１９８６．２０：３０１−３０６参照。また、ヒトにおける島アミロ イドの量は、インシュリン療法の必要性から判断される通り、２型糖尿病の重症 度が増すに従い増加し、例えば一連のインシュリン処置２型糖尿病患者の１００ パーセントが顕著な島アミロイドを有することも示された。マロイ等、「ザ・リ レーション・オン・アイレット・アミロイド・トウ・ザ・クリニカル・タイプ・ オン・ダイアベーラ」、［ヒユーマン・バンロンー」、１９８１１１．２：９１ ７−９２２参照。２型糖尿病集団における島アミロイドのり患率は、非糖尿病集 団の場合よりも高い。ベルＥ。

Ｔ１、「ヒアリンゼーション・オン・ジ・アイレッツ・オン・ランゲルハンス・ イン・ノンダイアベティック・インディビデュアルズ」、「アメリカン・ジャー ナル・オン・バンロンーＪ、１９５９．３５：８０１−０５゜これによって、島 アミロイド自体が２型糖尿病において異常なインシュリン分泌を誘導する因子で あり得るという仮説が導かれた。クラーク等、「ランセット」、１９８７．２： ２３１−２３４参照。

島アミロイドの化学分析は、以前、全体としてすい臓におけるアミロイドが不溶 性かつ少量であるため頓挫した。最近、ランゲルハンス島のインシュリン発現性 腫よう（「インスリノーマ」）におけるアミロイド原線維に沈澱した不純ペプチ ドの部分描写が報告された。

ウェスターマークＰ０、ベルンステットＣ１、ライランｌ／−Ｅ、、スレラテン に９、「ア・ノーベル・ベプタイド・イン・ザ・カルシトニン−ジーン・リレイ テッド・ファミリー・アズ・アン・アミロイド・フィブリル・プロティン・イン ・ジ・エンドクライン・パンクレアス」、「バイオケミカル・アンド・バイオフ ィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ」、１９８６、ｌ　４０：８２７− ８３１参照。そこに記載されたペプチドは、非常に不純（約１０％以下の純度） であると思われ、事実、１８個の残基しか同定され得なかった。恐らくは同じ不 純な製品に関する後続の試験の結果、ペプチドの３７残基のうち３５残基が同定 された。、３６位の残基は同定され得す、第２の報告では２個の他の残基は先に 報告されたものとは異なることが示唆された。ウェスターマークＰ１、ベルンス テットＣ１、ウィランダーＥ０、ハイデンＤ　、Ｗ、、オンライエンＴ、Ｄ、お よびジョンソンに、Ｈ，、ｒアミロイド・フイプリルズ・イン・ヒユーマン・イ ンスリノーマ・アンド・アイレッッ・オン・ランゲルハンス・オン・ザ・ダイア ベティック・キャット・アー・ディライブト・フロム・ア・ニューロペプタイド ーライク・プロティン・オルソ−・プレゼント・イン・ノーマル拳アイレット・ セルズ」、［プロシーデインダスーオン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・ サイエンシーズ・オン・ザ・ユナイテッド・ステーク・オン・アメリカＪ、１９ ８７．８４：３８８１−３８８５参照。ウェスターマーク等は、このペプチドを 「インスリノーマ・アミロイド・ポリペプチド」またはＩＡＰ、および統いてＩ ＡＰＰ、ｒインスリノーマ（またはアイレット）・アミロイド・ポリペプチド」 と命名した。

Ｂ、アミリンホルモン クーパー等は、ヒト２型糖尿病性すい臓から抽出されたアミロイド塊から得られ たペプチドの精製および完全な特性検定を報告した。

３６位のアミノ酸は、２つの糖尿病性すい臓から得られたペプチドの別々の分離 物においてトレオニンとして明白に同定された。クーパーＧ、Ｊ、Ｓ、、ライリ スＡ、Ｃ，、クラークＡ０、ターナ−Ｒ，Ｃ，、ンムＲ，Ｂ、、レイドに、Ｂ、 Ｍ、、ｒピューリフィケーション・アンド・キャラクタリゼーション・オン・ア ・ペブタイド・フロム・ジ・アミロイド−リッチ・パンクレアス・オプ・タイプ ２・ダイアベティック・ペーンヤンツ」、「プロシーデインダス・オン・ザ・ナ ショナル・アカデミ−・オン・サイエンシーズ・オン・ザ・ユナイテッド・ステ ーク・オン・アメリカ」、１９８７．８４：８６２８−８６３２参照。このペプ チドは、精製ペプチド試料に関するシーケンサ−収量および定量蛋白質分析結果 間の比較に基づき高純度（９０％より高い純度）であることが示された。クーパ ー等は、このペプチドを、それが糖尿病対象からの抽出物に存在するが、非糖尿 病対象からの均等抽出物には存在しないことを示す、「糖尿病関連ペプチド」と 命名した。糖尿病関連ペプチド（「ＤＡＰ」）は、１９８７年４月２７日に出願 されたイギリス国特許出願第８７０９８７１、発明の名称「ペブタイズ」）およ び１９８８年４月２７日、１９８８年１１月２３日および１９８９年５月２日付 けの対応するアメリカ合衆国出願の対象であり、真性糖尿病の処置を目的とする 単独またはインシュリンと組み合わせたペプチドの使用は、Ｇ、Ｊ、ＳＪ−パー およびＭ、Ｓ。

キヤメロンによる１９８７年８月２６日付けのイギリス国特許出願第８７２０１ １５号（発明の名称「真性糖尿病の処置」）および１９８８年８月２６日付けの アメリカ合衆国出願の対象である。

ＤＡＰは、下記アミノ酸配列を有するペプチドを特徴とする。

Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｈｊｓ−３ｅｒ− ３ｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｇ　１ｙ−Ａ　ｌａ−１１ｅ−Ｌｅｕ−５ｅ ｒ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙ ｒ−ＮＨ。

クーパー等は、天然分子が、ＤＡＰの一次構造の２および７位に示されたＣｙｓ 残基間にジスルフィド橋を含み、３′末端がアミド化され、プロペプチド、すな わちアミリン＋ＴＰＩＥＳＨＱＶＥＫＲ（ただし、ＫＲはプロセッシング・シグ ナルである）を含むＮ−末端アミノ酸配列として形成されていることを立証した 。さらに、チョウおよび７アスマン並びにカイトおよびドゥーリトゥルの方法（ チョウＰ、Ｙ、、ファスマンＧ、Ｄ、、ｒアニュアル・レビュー・オン・ブラケ ム」、１９７８．４７：２５１−２７６、並びにカイトＪ１、ドゥーリトウルＲ ，Ｆ、Ｊ、、［モレキュラー・バイオロジー」、１９８２．１５７：１０５−１ ３２参照）による我々のアミノ酸配列の二次構造予測分析によると、分子の中間 部分、特に残基１８および２７間に位置する部分は、ハイドロパンツク（ｈｙｄ ｒｏｐａｔｈｉｃ）であり、強いベーターノート形成傾向を有するため、分子の この部分が島アミロイド塊の形成に関与し得ることが示されている。我々は、分 子の上記部分内におけるこの不溶性アミロイド形成傾向を実験的に確認した。ま た、我々は、さらに低い濃度でも正常すい臓組織からＤＡＰを検出した。

下記で検討されている通り、ＤＡＰはすい臓のアミロイド塊から単離されたため 、およびその役割はレセプター仲介ホルモンであるため、この発明の目的に関し て、ＤＡＰを本明細書では「アミリン」と称す。下記に示されたアミリン・サブ ペプチド［２〕は、アミロイド生成性（すなわち、それはアミロイド形成傾向を 有する）である。

１ｇ　２０　２５ ［２］　Ｈｉｓ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ− １１ｅ−Ｌｅｕさらに我々は、アミリンが少なくともによる二官能性であること 、並びに分子の生物学的作用のうちの２つは、（１）それが、アミリンの存在下 でランゲルハンス島内のＢ細胞（インシュリン産生細胞）に放出させるインシュ リンがアミリンの非存在下の場合よりも少ないこと、および（２）それが、筋肉 細胞にインシュリン・シグナルを無視させるにより、骨格筋における基礎および インシュリン刺激によるグリコゲン合成の両方の大きな低下を誘発することであ ることを発見した。

我々は、これらの活性が部分の異なる部分に存在することを発見した。我々は、 ペプチドの一活性部位が、完全なアミリン分子の上記配列図［１］の残基２７− ３７に下線を引くことにより示したペプチドの２７−３７位を占めるＣ−末端領 域に位置することを測定した。これは、アミリン・サブペプチド・アミリン２７ −３７による摘出されたランゲルハンス島の処置後のグルコース攻撃後における すい臓島Ｂ細胞によるインシュリン放出阻害により後記実施例４で立証された。

同実施例では、サブペプチドＣＧＲＰ２７−３７を用いた場合の同じ作用が示さ れており、我々は、完全ＣＧＲＰと同様、前記サブペプチドもアゴニストとして アミリン・レセプターに作用すると考えている。

また、我々は、アミリンのＮ−末端部分が、グルコースからグリコゲンへのプロ セッシング、すなわち通常はインシュリンにより著しく刺激されるプロセスを阻 止すべく働くことを発見した。これは、後記実施例１および２においてアミリン およびアミリンサブペプチドによる放射能的筋肉の取り込み量の低減化の立証に より測定された骨格筋酵素グリコゲンンンターゼ活性の阻害により立証された。

本質的に、我々は、正常濃度であれば、アミリンは、インシュリン濃度が循環し ているグルコースレベルに関して過剰となった場合の二次的高血糖症阻止効果に より、インシュリンの作用を低下させて骨格筋への炭水化物取り込み（従ってグ リコゲンへの貯蔵）を増加させる制御システムの一部分であると考えている。ク ーパーＧ、Ｊ。

Ｓｌ、キヤメロンＭ、Ｓ、、ｒトリートメント・オン・ダイアベーラ・メリタス 」、イギリス国特許出願第８７２０１１５号（１９８７年８月２６日）。アミリ ンの生物活性は、体が瞬時の要求に応じて炭水化物エネルギー（グルコースとし て）の分布を制御し得る新たに発見された内分泌ホメオスタシス機構である。

この機構は、最も適切には、骨格筋におけるグリコゲンとしてのグルコース貯蔵 のインシュリン仲介制御に対して相補的であると考えられ得る。アミリンは、恐 らくは二次細胞内メツセンジャー分子を通したインシュリン・レセプターの機能 と類似した方法で、グリコゲンシンターゼの活性を制御すべく働くレセプター仲 介機構を介して作用することにより（チェツチＭ、Ｐ、、ｒザ・ネイチャー・ア ンド・レギュレーシッン・オン・ジ・インシュリン・レセプター・ストラフチャ ー・アンド・ファンクンＢン」、［アニュアル・レビュー・オン・フィジオロジ ー」、１９８５．４７：３５７−３８１およびエスビナルｊ１、［メカニズムス ・オン・インシュリン・アクション」、［ネイチャーＪ％　１９８７．３２８： ５７４−５７５参照）、グルコースからグリコゲンへの取り込みを制御すると思 われる。

Ｃ，スルホニル尿素血糖降下剤およびアミリンいわゆる「第一旦代」スルホニル 尿素には、アメリカ合衆国で長年利用可能であり、似た作用機構、すなわち島組 織を刺激してインシュリンを分泌させる機構を有すると報告されている４種の化 合物が含まれる。［ジ町スリンズ・ダイアベー゛ハメリタス」、２１！（ｊＪ１ ２Ｌ　ｌ　９８５）、グツドマンおよびギルマン、「ザ・ファーマコロジカル・ ペーンス・オン・セラビューティックスＪ、１５０４頁（第７版、＋９８８）。

これら４種の化合物は、トルブタミド、クロロプロパミド、アセトへキサミドお よびトラザミドである。下記に示されている通り、スルホニル尿素化合物の基本 的官能部分は、ベンゼン環、スルホニル基および尿素であ乞Ｒ，−＋ＳＯ，＋Ｎ Ｈ−Ｃ−ＮＨ−Ｒ。

トルブタミドの場合、メチル基はベンゼン環のパラ位に付加し、ブタンは尿素基 に付加している。クロロプロパミドの場合、塩化物はベンゼン環のパラ位に結合 し、プロパン基は尿素に付加している。

アセトヘキサミドの場合、アセチル基はベンゼン環のパラ位に位置し、シクロヘ キサン基は尿素に付加している。トラザミドの場合、メチルはトルブタミドの場 合と同様パラ位にあるが、ブタンではなくヘキサヒドロアゼピニル基が尿素基に 付加している。有効なスルホニル尿素化合物は、ベンゼンおよび尿素基が置換さ れたアリールスルホニル尿素類である。

機能しているすい臓の島はこれらの化合物の有効性に必要とされるため、スルホ ニル尿素剤の一次作用はインシュリン放出を刺激することであると考えられてい る。インシュリン産生量が実際に増加しているか否かについては意見の相違があ るが、放出は少なくとも誘発される。「ジョスリンズ・ダイアベーラ・メリタス Ｊ、前出、４１９−４２０゜まｔ；、すい城外作用はこれらの薬剤の活性におい て重要であり得るが、これらの作用の正確な性質に関する知識は不完全である。

「第二世代」スルホニル尿素剤の定義は、最近、すなわち最初の化合物の約２５ 年後に開発された薬剤であり、それらは初期のスルホニル尿素剤と同じ全般的作 用形態を有すると報告されている。同書４３７゜しかしながら、第二世代化合物 は、より有効であり、より少ない量でも効果的であると言われている。この範ち ゅうには約１２の薬剤が存在し、それらにはグリベンクラミドおよびグリピジド 並びにグリクラシトがある。

近年、ランゲルハンス島内におけるアミリン含有アミロイド（島アミロイド）の 沈澱は、はとんどの２型糖尿病患者において島の代償不全を誘導する機構である ことが明らかとなった。クーパー等、「プロシーデインダス・才プ・ザ・ナショ ナル・アカデミ−・オン・サイエンシーズ・オン・ザ・ユナイテッド・ステーク ・オン・アメリカ」、１９８７、クーパー等、「プロシーデインダス・オン・ザ ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシーズ・オン・ザ拳ユナイテッド・ ステーク・オン・アメリカ」、１９８８、クーパー等、「ビオキミ力・工・ビオ フィシ力・アクタ」、１９８９゜また、島β細胞によるアミリンの過剰産生け、 島アミロイドとしてのこのペプチドの緩慢な蓄積を誘導する代謝事象であり、こ の結果、最後には島がグルコースに応じて適量のインシュリンを分泌し得なくな ると考えられている。すい臓によるアミリンの過剰産生はまた、グルコース寛容 性障害、肥満および初期２型真性糖尿病患者に見られるインシュリン抵抗に関与 する。クーパー等、［プロンーデインダス・オン・ザ・ナショナル・アカデミ− ・オン・サイエンシーズ・オン・ザ・ユナイテッド・ステーク・オン・アメリカ Ｊ、＋９８８、レイトンおよびクーパー、「ネイチャー］、１９８８、クーパー 等、「ビオキミ力・工・ビオフィン力・アクタ」、１９８９、モリナ等、「ダイ アベーラ」、１９９０参照。

既に示した通り、スルホニル尿素剤は２型糖尿病の治療で汎用されている経口薬 剤である。しかしながら、患者の４０％以下はこれらの薬剤に応答し得ない。ま た、それらの使用は、ある期間にわＩこってそれらの有効性が漸進的に減退する ことにより病気を悪化させることが多い。この問題（いわゆる「二次失敗」）は 、ＮＩＤＤＭのスルホニル尿素療法を面倒にする、以前には知られてｌ／）なか つＩこ因果関係に関する共通の問題である。シャファーＥ、１．（−グノンＭ３ 、フェリーヒＰ、、（１９８７）、ｒジ・エンドタリン・／くンクレアス：　ダ イアベーラ・メリタス」、「エンドフライノロジー・アンド・メタポリズム」中 、第２版、フェリーヒＰ１、／（クスターＪ、Ｄ、、ブローダスＡ、Ｅ、および フローマンＬ、Ａ、編、マクグロウーヒル、ニューヨーク、ニューヨーク。

さらに我々は、本明細書においてアミリンきっ抗物質療法と組み合わせたスルホ ニル尿素の有益な使用について開示してしする。連続島βセルラインを含む系並 びにアミリンおよびインシュリンに特異的な免疫検定法を用いることにより、我 々は、第１世代（例、トルブタミド）および第２世代（例、グリベンクラミド） スルホニル剤の両方が、０または１０３９モルのグルコースの存在下、用量依存 的に島β細胞からのアミリンの分泌を刺激することを発見した。

後記実施例７参照。同じ一連の実験において、メトホルミンは、実験濃度範囲全 部においてインシュリン（またはアミリン）分泌に影響しないことが示された。

この一連の実験では、インシュリン分泌に対するスルホニル尿素の観察された作 用は、類似系で先に観察された作用と一致していた。

これらの予想外の発見は、真性糖尿病治療におけるスルホニル尿素の使用に対し て基本的掛かり合いを有する。スルホニル尿素療法の二次失敗の現象は、その原 因は現在まで未知であるが、インシュリンの連続分泌を伴う療法に対する島β細 胞の漸進的応答不能と関連している。我々は、ＮＩＤＤＭにおけるインシュリン 応答の漸進的低下の原因は、β細胞塊の漸進的喪失を伴う島アミロイド沈澱と直 接関連していると考えている（クーパー等、「ピオキミ力・工・ビオフィシ力・ アクタ」、１９８９）。このプロセスは、インシュリン抵抗状態に存するアミリ ン分泌増加により刺激される。

さらに、そして重要なことに、我々は、スルホニル尿素処置が、グルコースの存 在または非存在下で摘出すい臓β細胞からのアミリン分泌の増加を誘発すること を示した。これらの発見は、ヒトのスルホニル尿素処置が、すい臓におけるアミ リン分泌割合の増加、従ってアミロイド沈澱を誘導し、その結果、すい臓β細胞 が喪失し、β細胞の機能不全が始まるという決定を支持している。アミリン（ま たはインシュリン）レベルが高い非インシユリン依存性患者は、アミロイド沈澱 速度の加速および島細胞機能不全によりスルホニル尿素療法に対して不利に反応 しがちである。従って、スルホニル尿素療法開始の前後に、この状態を伴う患者 を血液アミリンレベルについてモニターしなければならない。処置前アミリンレ ベルが高い場合、またはこれらのレベルがスルホニル尿素療法に過剰に応答する 場合、スルホニル尿素療法は禁忌を示され得るか、または別法としてアミリンき っ抗物質処置と共に行なわれるべきである。

対照的に、メトホルミンは島β細胞からのアミリン分泌速度には影響を与えない 。従って、メトホルミン療法は、ＮＩＤＤＭにおいて高インシュリンまたはアミ リンレベルの存在下で指示され得る。

メトホルミン療法は、スルホニル尿素はど急速にはすい臓代償不全の速度を加速 しないと予測される。

実施例８は、用量依存方式によるすい臓島ベータ細胞からのグルコースおよびア ルギニン刺激アミリンおよびインシュリン分泌の生理学的濃度を示す。２種のホ ルモンの分泌速度は強い相関関係を示した。またアルギニンは、ＨＩＴ細胞から のグルコース刺激によるアミリンおよびインシュリン分泌を強化した。グルカゴ ンは、用量依存的にアミリンおよびインシュリン分泌の両方を高めた。グルカゴ ン刺激分泌速度間の差異により、グルカゴン濃度の増加に伴うアミリン・インシ ュリンのモル比の減少が生じた。ソマトスタチンは、等位的用量依存方式でＨＩ Ｔ細胞からのアミリンおよびインシュリンの再放出を抑制した。これらの結果は 、ＨＩＴ島ベータ細胞が、典型的栄養素刺激および島ベータ細胞機能の既知バラ タリン変調に応じてアミリンおよびインシュリンを分泌するという予想外の事実 を立証しているため、記載された通り、アミリンおよび／またはインシュリン分 泌を変調する化合物に対する有用な評価および／またはスクリーニング方法が提 供される。

Ｄ、アミリン活性 インビトロ方法を用いることにより、我々は、インシュリンおよび放射性グルコ ースを与えた摘出ラット骨格筋組織が、アミリン化合物の存在しない対照実験の 場合と比較して、アミリンおよびある種のアミリン・サブペプチドの存在下、全 生理学的濃度でグリコゲン合成の減少を示すことを見出した。これらの予想外の 発見は、実施例１および２の記載に従い確認された（下記参照）。

ｌ）全合成アミリン（残基ｌ〜３７、非アミド化、バラニーおよびメリフィール ドの方法（１９７９）により化学的に合成。「ソリッド・フェーズ・ンンセシス 」、グラスＥ１、メレンハーターＪ１編、「ザ・ベンタイズ」、アカデミツク・ プレス、ニューヨーク、ニューヨーク）、 ２）糖尿病ヒトすい臓から抽出され、クーパーＧ、Ｊ、Ｓ、等の方法に従い精製 された全天然アミリン。クーパーＧ、Ｊ、Ｓ、、ウィリスＡ、Ｃ，等、「プロシ ーデインダス・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシーズ・オ ン・ザ・ユナイテッド・ステーク・オン・アメリカ」、前出参照、この場合、分 子の同定は、バージョン２．０ソフトウエアにおける０２ＣＰＴＨサイクル（ア プライド・バイオシステムズ、フォスター・シティ−、カリフォルニア）ヲ用い たアプライド・パイオンステムダ４フ０Ａ蛋白質ンーケンサー（ヘリツクＣ，Ｍ 、、ハンキャピラーＭ、Ｗ、、ドライヤーＷ、Ｊ、、「ジャーナル・オン・バイ オロジカル・ケミストリーＪ、１９８Ｌ　２５６＋７９９０−７９９７参照）に おけるエドマン方法によるアミノ酸配列決定法により決定された、および ３）最初の１６残基（２−７ジスルフイド橋のある場合および無い場合）および 残基８−３７（バラニーおよびメリフィールドの方法・従い全て化学的に合成さ れた）を含むアミリンのその部分に対応する様々なサブペプチド（下記サブペプ チド［３Ｌ−［５］として同定されＩこ）。

グリコゲンへの放射性グルコースの取り込みを低下させる活性が立証されたサブ ペプチド［３１および［４］は次の通りであった。

Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａ　１ａ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ［４］　Ｌｙｓ−Ｃｙｓ− Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎｌｌ　１５ Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕアミリンの第８〜第３７残基 に対応するサブペプチド［５］もまた、グリコゲンへの放射性グルコースの取り 込みを低下させた（下記に［５］　Ａｌａ−Ｔｎｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ− Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−５ｅｒ−Ｓｅｒ２５　３゜ Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｇｌｙ− ＴｈｒＡｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒインビトロ摘 出ラット骨格筋においてグリコゲンへの放射性グルコースのインシュリン刺激に よる取り込みの低下活性をもたないアミリン・ペプチドは、下記サブペプチド［ ６１および［７］、すなわちアミリン２７−３７およびｓｅｔ’、ｓｅｒ’アミ リン１−１６を含んだ。

［６］　２７　３０　３５ Ｌ　ｅｕ−Ｓ　ｅｒ−Ｓ　５ｒ−Ｔｈｒ−Ａ　５ｎ−Ｖａｌ−Ｇ　Ｉｙ−Ｓ　ｅ ｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ［７］　１　５　１０ Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ− ＧｉｎＡｒｇ−Ｌｅｕ−Ａ　１ａ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕサブペプチド［７］ において、２および７位のＳＨ−基含有Ｃｙｓ残基は、ヒドロキシル基含有Ｓｅ ｒ残基により置換された。

サブペプチド［３］−［７］による結果は、２および７位におけるＣｙｓ残基の 存在が分子の活性に必要であること、および完全なＣｙｓ（２）−Ｃｙｓ（７） ジスルフィド結合の非存在下で存在する残留活性があることを示した。

さらに我々は、下記実施例４で示されている通り、サブペプチド・アミリン２７ −３７およびＣＧＲＰ２７−３７が、標準グルコース攻撃に応じてランゲルハン ス島により産生されるインシュリンの量を低減化すべく作用し得ることを立証し た。

さらに下記実施例５に記載されている通り、我々はまた、アミリンが、静脈内注 射によりインビボ投与された場合、急速に糖尿病を発症させる（　１４０　ｍｇ ／ｄＬより大きい絶食特高血糖症）ことを示しｊこ。

Ｅ、アミリンきっ抗物質 重要なことに、アミリンペプチドそのものを用いることにより、例えばジスルフ ィドの還元、脱アミド化またはプロアミリンの使用によりその活性を中和または 妨害するため、２型糖尿病の処置に向いた化合物を製造することができる。一方 法では、アミリン分子の活性部位（複数も可）を同定し、次いで活性部位内のア ミノ酸を他のアミノ酸と置換することによりアミリンペプチド配列の前記活性部 位を改変する。その結果、ペプチドはレセプター部位に対するその結合親和力は 失わないが、結合時に活性を促進できないため、アミリンの作用は遮断される。

この方法は、アミリンおよびＣ０ＲＰのＣ−末端活性部位、すなわちアミリン２ ７−３７およびＣＧＲＰ２７−３７に適用され得、アミリンのＮ−末端活性部位 により既に立証された。分子のその部分は、筋肉における基礎およびインシュリ ン刺激によるグリコゲン合成速度の阻害誘発活性を示す。すなわち、我々は、下 記実施例３において、置換サブペプチドｓｅｔ”、ｓｅｔ’アミリン１−１６、 上記サブペプチド［６１が筋肉におけるアミリン作用を改善することを示した。

他の置換きっ抗物質には、ｓｅＳ、ｓｅｔ’アミリン、５ｅｒ２，５ｅｒ７ｃ　 Ｇ　ＲＰおよびｓｅｒ”、ｓｅｒ”ｃ　Ｇ　ＲＰ　ｌ　ｌ　６がある。また、ペ プチドまたはサブペプチドの活性領域内における化学的に改変されたアミノ酸残 基の置換により、活性を生じることなく結合親和力を維持するという目的が達成 される。置換に関する標的残基には、アミノ酸位置２−７．９．１１−１３．１ ５．１６．３０−３４８よび３７の残基がある。アミリンまたはＣＧＲＰ活性部 位への化学的に改変された残基の組み込みは、化学的に改変され、活性化された 残基を、本明細書に記載された合成プロトコールへ組み込むことにより達成され 得る。後記実施例６で示されている通り、非置換サブペプチドもまｌ；きっ抗作 用を示す。

また、アミリンきっ抗物質には、ペプチドＡ（アミリン、ラット）、ペプチドＢ （ＣＯＲＰ、ヒト）および／またはペプチドＣ（カルシトニン、さけ）の構造か ら誘導された修飾ペプチドがある（図１０参照）。これらの修飾ペプチドには、 （ｉ）切頭状ペプチド、（ｉｉ）共有交叉結合を有するペプチドおよび（ｉｉｉ ）天然ペプチド配列における１個またはそれ以上のアミノ酸に対する非通常（ま たは非天然）アミノ酸の置換を含むアミノ酸置換を有するペプチド、並びに修飾 （ｉ）、（ｉｌ）および／または（１目）の組み合わせを有するペプチドがある 。切頭状ペプチド群のアミリンきっ抗物質には、ペプチドＡ、ＢまたはＣのＮ− 末端配列の一部分が欠失し！；ペプチド、ペプチドＡ、ＢまたはＣのＣ−末端配 列の一部分が欠失したペプチド、欠失した内部アミノ酸配列の一部分、例えばペ プチドＡまたはＢにおける残基１９８よび２８間またはペプチドＣにおける残基 ９および２４間の欠失を有するペプチドまたは他方前記欠失の組み合わせを有す るペプチドがある。これらの切頭状ペプチドは、後記の共有交叉結合またはアミ ノ酸置換を有し得る。共有交叉結合を有するペプチドを含むアミリンきっ抗物質 には、ペプチドＡ、ＢまたはＣの残基８〜２４に対応する領域内における螺旋形 成に有利な共有交叉結合と組み合わせてアミノ酸置換（後記）を含むペプチドが ある。アミリンきっ抗物質の別の群は、ペプチドＡ％ＢまたはＣ（またはその切 頭状ペプチド）の２個のアミノ酸の側鎖間に共有結合的拘束を有するペプチドを 含み、この場合、共有結合的拘束がペプチドのトポグラフィ−を安定させること によりアミリンレセプターへの結合を促す。他のアミリンきっ抗物質には、天然 アミノ酸を、非通常（または非天然）アミノ酸で置換することにより安定性を高 めるか、または他のアミノ酸で置換してアミリンレセプターへの結合親和力を保 持すると同時にインビボ・アミリンアゴニスト活性を低下させる場合を含む、ペ プチドＡ、ＢもしくはＣのいずれかに基づいたペプチドまたはその切頭状ペプチ ドまたはその共有結合ペプチドがある。

切頭状ペプチドアミリンきっ抗物質は、下記に示された４つの種類に大別される 。これらには、Ｎ−末端欠失ペプチド、Ｃ−末端欠失ペプチド、内部欠失ペプチ ドおよびペプチドＡ、ＢおよびＣに基づいた欠失の組み合わせを有するペプチド がある。出発構造、ペプチドＡ、ＢおよびＣからのアミノ酸は、ペプチドの合成 中に脱落する。Ｎ−末端欠失化合物の場合のみ、名称により特定された残基が組 み立てられている。例えば、５−３７ペプチドＡは、出発化合物ペプチドＡのＣ −末端からの３０残基を含む。同様に、Ｃ−末端欠失ペプチドの一例、ａ−ｓｓ ペプチドＢは、２８残基を含み、Ｃ−末端の残基が２個少なく、Ｎ−末端の残基 が７個少ない点が出発化合物ペプチドＢとは異なる。「内部欠失」の種類に属す るペプチドは、基礎ペプチドに使用された番号付システムを用いて特定された残 基を含む。

この命名法はコンマにより分けられたペプチド配列の特定化を含み、前記配列は それらの間のペプチド結合により組み立てられている。

残基１ないし７および２４ないし２９の脱落を含むペプチドの場合、名称、　８ ４３．３０″□３７ペプチドが使用される。このペプチドは、Ｎ−末端の残基８ から始まり、残基２３および３０間のペプチド結合およびＣ＝末端の残基３７で 終わる直線形式で配列された２４残基を含む。

ペプチドＡに基づくアミリンきっ抗物質のこの範ちゅうは、ト３７ベブチドＡ１ および２ト３７ペプチドＡを含むその連続的単−Ｎ−末端アミノ酸の脱落を含む 。’Ａｌａは、Ｖａｌまたは他の疎水性残基、例えばＬｅｕまたはＮｌｅにより 置き換えられ得る。’　”　Ａ　ｒｇは、Ｈ４ｓ。

ＬｙｓまたはＰｈｅ残基と置き換えられ得る。”　Ｓ　ｅｒは、側鎖ヒドロキシ ル基を含む残基、例えばＴｈｒと置き換えられ得る。”Ｌｅｕは、別の疎水性残 基、例えばＰｈｅ、１−ナフチルアラニンまたは２−ナフチルアラニン（Ｎａｌ ）と置き換えられ得る。”Ｖａｌは、Ｉｌｅまたは他の疎水性残基、例えばＬｅ ｕ、　ＡｌａおよびＮｌｅと置き換えられ得る。

残基２’　Ｌ　ｅｕは、ＴｙｒまたはＮａｌと置き換えられ得る。

類似した一連のアミリン類縁体は、ペプチドＢに基づき、ト３７ペプチドＢおよ び２ｇ−３７ペプチドＢを含むその連続的単−Ｎ−末端アミノ酸欠失を含む。残 基”Ａｓｎは、Ａｓｐ、　ＧｌｕまたはＧｌｎにより置き換えられ得る。

ペプチドＣに由来するＮ−末端切頭状アミリン類縁体は、８−０ペプチド０１お よび２２−３！ペプチドＣを含むその連続的単−Ｎ−末端アミノ酸欠失を含む。

残基”Ａｓｎは、Ａ　Ｉａ、　Ａｓｐ、　Ｇ　ＩｎまたはＧｌｕにより置き換え られ得る。

ペプチドＡに基づくＣ−末端欠失ペプチドきっ抗物質は、ｌ−３６ペプチドＡ１ および６−２′ペプチドＡを含むその連続的単−Ｃ−末端アミノ酸欠失を含む。

ペプチドＢに由来する一連のきっ抗物質は、８−３＠ペプチドＢおよびａ−２９ ペプチドＢを含むその連続的単一〇−末端アミノ酸欠失を含む。

きっ抗物質であり、ペプチドＣに基づくＣ−末端切頭状ペプチドは、８−３１ペ プチドＣ１および８−２２ペプチドＣを含むその連続的単−Ｃ−末端アミノ酸欠 失を有するペプチドを含む。

ペプチドＡに基づく内部欠失ペプチドきっ抗物質には、残基１９および２９間に 欠失を含むペプチドがある。これは、ペプチドＡに由来する残基８ないし１８が ペプチド結合を介してペプチドＡの残基２０ないし３７へ結合している＠−＋ａ ＋　２°−３７ペプチドＡを含む。

領域１９ないし２９におけるＮ−末端残基の連続的除去は、このシリーズで最小 のペプチドである＠−１ａｌ　３°−３７ペプチドＡを含め適切である。同様に 、これは、ａ−２８′３０−３７ペプチドＡ１およびト１−′′０１７ペプチド Ａを含む領域１９ないし２９におけるＣ−末端残基の連続的除去を含む。

ペプチドＢに基づくこのシリーズのきっ抗物質は、ａ−１＠ｔ　ｘｏ−ｓ’ｒペ プチド８１および８−１ｆｉｌ　３０−３７ペプチドＢを含むこの領域での連続 的Ｎ−末端欠失を含む。同様に、これは、ａ−２８７１０−３７ペプチドＢ１お よびＭ−１１３０−３７ペプチドＢを含む連続的Ｃ−末端欠失を含む。

ペプチドＣに基づくこのンリーズのきっ抗物質は、残基１９および２４問および ／または前記残基を含む欠失を有するペプチドを含む。これは、Ａ−２３°２５ −１２ペプチド０１および連続的Ｎ−末端欠失ベブチド、例えばト１１２６−３ ２ペプチドＣを含む。また、５−ｚａ″２ト３２ペプチドＣおよび連続的Ｃ−末 端欠失ペプチド、例えばＡ−１１１２４−３２ペプチドＣも含まれる。

欠失の組み合わせを伴うペプチドアミリンきっ抗物質には、Ｎ−末端における残 基８および残基１０間並びにＣ−末端における同３０および３７間に欠失を有す るペプチドがある。例えば、これは、′−３６ペプチドＡ１および″−２′ペプ チドＡに対する単−Ｃ−末端欠失および同じ＜　ＩＱ−３１ペプチドＡから出発 および１ｏ−１ペプチドＡで終わる連続的欠失ペプチドおよび同じ（＋１−３＠ ペプチドＡから出発するものを含む。

ペプチドＢに基づくこれらのきっ抗物質には、Ｎ−末端における残基８および残 基１０間並びにＣ−末端における同３０および３７間に欠失を有するペプチドが ある（特定された残基は上記ボールドで示されている）。′−３６ペプチドＢお よび１−２９ペプチドＢに対する連続的単一〇−末端欠失および同じ（１０−３ ４ペプチドＢおよび■−３１ペプチドＢから出発するものが含まれる。

ペプチドＣに由来するこれらのきっ抗物質には、Ｎ−末端における残基８および 残基１０間並びにＣ−末端における同２５および３２間に欠失を伴うペプチドが ある（特定された残基は上記に示されている）。具体的には、これは、ト３１ペ プチドＣおよび１２′ペプチドＣに対する連続的単一〇−末端欠失および同じ＜ １ト３“ペプチドＣおよび１１−１８ペプチドＣから出発するものを含む。

交叉結合を有するペプチドアミリンきっ抗物質には、アミノ酸置換を単独または ペプチドＡ、ＢおよびＣに関して残基８−２４に対応する領域内における螺旋形 成に有利な共有交叉結合と組み合わせて含むペプチドがある。この種類のペプチ ドは、Ｎ−末端、Ｃ−末端または内部欠失ペプチドを含む上記化合物または交叉 結合化合物に基づいている。

塩橋を形成することにより螺旋を安定させ得るアミノ酸置換は、ペプチドＡ、Ｂ またはＣに基づくペプチドの８−２４領域内で１位におけるカルポキ／ル側鎖を 含む残基、例えばＧｌｕまたはＡ　ｓｐ、並びに１＋３または１＋４位における 正荷電側鎖を伴う残基、例えばＬｙｓ、Ａｒｇまたはオルニチンの使用を含む。

これには、次のペプチド：１５Ｇｌｕ、’畠Ｌ　ｙｓ　ト３　ＦペプチドＡ％　 １５Ａｓｐ、”Ｏｒｎ’−”ペプチドＡ１”Ｇｌｕ、”Ｌｙｓ”’ペプチドＡ１ ”Ｇｌｕ、”Ｌｙｓ８−３７ペプチドＢ１”Ａｓｐ、宜”Ｏｒｎ’−”ペプチド Ｂ、　”Ｇｌｕ、’易Ｌｙｓａ−３７ペプチドＢ、１６Ｇｌｕ、”Ｌｙｓトユ２ ペプチドＣｓ　”Ａｓｐ、”Ｏｒｎ’−３２ペプチドＣ，’Ｇｌｕ、１９Ｌｙｓ ト３２ペプチドＣがある。

また、両親媒性螺旋形成に有利なアミノ酸置換は、アミリンきっ抗物質として用 いられる。次の置換が単独または組み合わせた形で行なわれる：残基８はＬｅｕ であり得、残基１１はＧｉｎであり得、残基１２はＴｒｐであり得、残基１３は Ｇｌｎであり得、残基１４はＬｙｓであり得、残基１５はＬｅｕであり得、そし て残基１７はＧｉｎであり得る。

切頭状ペプチド範ちゅうに属する記載されたペプチドに基づく共有交叉結合。下 記残基置換対を用いると、これらの交叉結合が容易になるニー位置におけるＡｓ ｐまたはＧｌｕおよび別の位置におけるＬｙｓまたはオルニチン。これらの残基 は縮合してアミド結合を形成する。別法として、Ｃｙｓ残基は、残基対として使 用され、酸化されて分子内ジスルフィド結合を形成する。特に、共有交叉結合に 関与する残基がペプチドＡ、ＢまたはＣの領域８−２４の１および１＋４位に位 置するペプチドが請求されている。

この範ちゅうのペプチドはまた、ペプチドＡ、ＢまたはＣ単独または切頭状ペプ チド範ちゅうまたは他にこの範ちゅうに記載された修飾形のいずれかと組み合わ せた形で位置する２個のアミノ酸の側鎖間に共有結合的拘束を含むペプチドを含 む。この拘束は、単独または組み合わせた形で使用され得る。特に、残基１５ま たは１６は、残基３１または３２に共有結合している。次の残基置換対を用いる と、この結合は容易になるニー位置におけるＡｓｐまたはＧｌｕおよび他の位置 におけるＬｙｓまたはオルニチン。これらの残基は縮合してアミド結合を形成す る。

別法として、水硫基含有残基は、この位置での残基対として使用され、酸化され て分子内ジスルフィド結合を形成する。いずれかの組み合わせで使用され得る残 基には、Ｌ−Ｃｙｓ、　Ｄ−Ｃｙｓ、　Ｌ−ベニジルアミンおよびＤ−ベニジル アミンがある。Ｎ−末端位置で使用されることによりジスルフィド交叉結合に関 与し得る残基は、β−メルカプトプロピオン酸である。この種類には次のペプチ ドが含まれる。［シクロ＋　３　’　３２　］　ｌ　６　Ｌ　ｙｓ、　３２八ｓ 、８−１？ペプチドＢおよび１＠゛１１１Ｃｙｓ、訃３７ペプチドＢの閉環形態 、［シクロＩＩ＋−２１１］＋６１．ｙ、　２８Ａｓ、。

トコ２ペプチドＣおよび１５°２７Ｃｙ、５−３２ペプチドＣの閉環形態。

非天然アミノ酸を有するペプチドアミリンきっ抗物質は、生成されたペプチドが 酵素分解に抵抗を示すことにより、さらに高い活性およびさらに長い活性持続時 間を有するアミリンきっ抗物質を与えるように製造され得る。

ペプチド中のＬｙｓおよび／またはＡｒｇ残基を、（Ｄ）　−Ｌｙｓおよび／ま たは（Ｄ）　−Ａｒｇまたは別の塩基性アミノ酸もしくは非塩基性残基により置 換すると、より大きな血しょう安定性が与えられ得る。

また、個々のアミノ酸の立体配置が１つまたはそれ以上の特定部位で（Ｌ）／Ｓ から（Ｄ）／Ｒへと転化され得る上記配列の生物活性類縁体も含まれる。

また、Ａ　ｓｎ、Ｓ　ｅｒおよび／またはＴｈｒ残基のグリコジル化により修飾 された類縁体も含まれる。

ベグチド特性が少ない上記ペプチドに基づく生物活性アミリンきっ抗物質も含ま れる。それらのペプチド結合擬似形は、−Ｃｏ−ＮＨ−アミド結合に対する下記 置換のうちの一つまたはそれ以上を含み得る：デプンペプチド類［−〇〇−０１ 、イミノメチレン類［−ＣＨ。

−ＮＨ−］、］トランスーアルケン類−ＣＨ＝ＣＨ−］、ベーターエナナミノニ トリル類−Ｃ（＝ＣＨ−ＣＮ）−ＮＨ−］、チオアミド類［−Ｃ３−ＮＨ−］、 チオメチレン類［−３−ＣＨ，−または−ＣＨ２−５−］、ジメチレン類［ＣＨ ２ＣＨ２］、エポキシド類［−ＣＯＣＨ２］、ジオール類［ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ ＯＨ）］、ヒドロキシ二重結合［ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ−ＣＨＣＯＮＨ］、トリヒド ロキシ［ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＮＨ］、ヒドロキシエチレ ン類［ＣＨ（ＯＨ）ＣＨｚ］、ケトメチレン類［ＣＯＣＨ２］、メチレンヒドロ キンアミノ［ＣＨ２ＮＯＨ］、ｔｚ）Ｏ−アミド類［−ＮＨ−Ｃｏ−］および］ Ｎ−メチルペプチド類Ｃ０Ｎ（ＣＨＩ）］。

出発化合物の疎水性および／または立体配座を冑利に増加させる上記ペプチドに 基づく生物活性アミリンきっ抗物質も含まれる。下記の非天然アミノ酸置換が単 独または組み合わせた形で使用され得る：β−アラニン、３．４−デヒドロプロ リン、ホモプロリン、ヒドロキシプロリン、Ｌ−３−（２’−ナフチル）−アラ ニン、Ｄ−３−（２゛−ナフチル）−アラニン、シクロへキシルアラニン、ｌ− アミンーシクロペンタンカルポン酸、サルコシン、β−チェニル−し−アラニン 、β−チェニル−Ｄ−アラニン、Ｄ−３−（３−ピリジル）−アラニン、アミノ オクタン酸、アミノカプロン酸、７−アミノヘプタン酸、アミノ吉草酸、Ｓ−ア セトアミドメチル−Ｄ−システィン、Ｓ−アセトアミドメチル−Ｌ−システィン 、Ｔ−ブチル−Ｄ−システィン、ｔ−ブチル−し−システィン、Ｓ−エチル−Ｄ −システィン、Ｓ−エチル−Ｌ−システィン、Ｌ−アスパラギン酸（ベーターベ ンジルエステル）、Ｄ−アスパラギン酸（ベーターベンジル、エステル）、Ｌ− グルタミン酸（ガンマ−ベンジルエステル）、Ｄ−’／ルタミン酸（ガンマ−ベ ンジルエステル）、Ｎ−ニブシロン−２（１−クロロ−ＣＤＢＺ）−Ｌ−リジン 、Ｎ−ニブシロン−（ＣＢＺ）−Ｄ−リジン、ｐ−クロロ−Ｄ−フェニルアラニ ン、ｐ−ニトロ−し−フェニルアラニン、Ｌ−セリン（ＯＢｚｌ）、Ｄ−セリン （ＯＢｚｌ）、Ｄ−トレオニン（ＯＢｚｌ）、Ｌ−トレオニン（ＯＢｚｌ）、０ −（２，６−ジクロロベンジル）−Ｌ−チロノン、０−１−ブチル−し−チロシ ン、０−Ｌ−ブチル−Ｄ−チロシン、イソアスパラギンおよびイソグルタミン。

また、ペプチドＡ、ＢまたはＣに基づく生物活性アミリンきっ抗物質は、分子中 のシスティンに対するＳｅｒ、　Ａｌａ、　Ｓ−アセトアミドメチル−７ステイ ンによる置換を含むべく製造される。ジスルフィド結合場所にアルキル鎖を含む 生物活性アミリンきっ抗物質もまた製造され得る。また、ペプチドＡ％Ｂまたは Ｃのジスルフィド・ループ中の残基に対するアルキル鎖置換、具体的にはペプチ ドＡおよびＢにおける残基３−６およびペプチドＣにおける残基２−６内の置換 も何月である。この種類には次のペプチドが含まれる：残基４および５がアミノ 吉草酸により置換されている４″アミノ吉草酸−ペプチドＡ１および同じ＜５″ アミノ吉草酸−ペプチドＡ０複数の残基に対するアルキル鎖置換を含むペプチド Ａ、ＢまたはＣに基づく生物活性アミリンきっ抗物質も含まれる。これらには次 のペプチドが含まれる：残基１９−２１がアミノオクタン酸により置換されてい るｌｅ−１１アミノオクタン酸、５−ｓｔペプチドＣ１および同じく２″″″ア ミノオクタン酸、１！７ペプチドＢ０ペプチドＡ、ＢまたはＣまたは分枝鎖状で ある上記ペプチドに基づく生物活性アミリンきっ抗物質もまた有用である。分枝 鎖化は、スペイサ−随伴または非随伴のペプチド、スルフィドまたはジスルフィ ド結合を用いて行なわれ得る。これには次のペプチドが含まれる。２２−３２ペ プチドＣの２コピーが、分校点からＡｌａ残基による空間をおいたリジン分枝鎖 に存在するＣ−３２ペプチドＣ−Ａ　Ｉａ）、　−ＬｙｓＮ　ｌｅ　（Ｎ　Ｈｚ ）。同様に、２−３２ペプチドＣの４コピーを含む［Ｃ２−３２ペプチドＣ−Ａ 　１ａ）ｚ　−Ｌｙｓ］　！　−Ｌｙｓ　−Ｎ　Ｉｅ−（Ｎ　Ｈ２）。これらの 分子におけるＮｌｅ残基は、特性検定目的に対する内部標準としての役割を果た す。また、Ｎ−末端のスルフィド結合を介して分枝鎖状リンカ−に結合した２！ −３２ペプチドＣの２コピーを含む［（”Ｃｙｓ、”■ペプチドＣ（ＮＨ２）） 　５ＣＨ２ＣＯ−Ａｌａ］ｚ　Ｌｙｓ−Ｎｌｅ　（ＮＩ（、）も含まれる。

また、分枝鎖化は、ホモニ官能性交叉結合試薬、例え１ｆビスマレイミドヘキサ ン（ＢＭＨ）および唯一の水硫基含有残基を含むペプチドまたはペプチド混合物 を用いて達成され得る。［（”（Ｄ）３−（２’ナフチル）−アラ＝　７　、” Ｃｙｓ、”Ａ　ｌａ、”Ａｓｎ、”Ｔｙｒ、”−”ペプチドＣ−（Ｎ　Ｈ２）１ ２　ＢＭＷが含まれる。

アミリン、およびそのレセプターと共結晶化したアミ１ノンまｌこ］まそのレセ プターの一部分の構造の結晶学的分析により、アミ１ノンおよびそのレセプター 間の相互作用の分析が行なわれる。かめ）る分析によって、アミリンおよびその レセプター間の相互作用【こおし）で第一に重要な残基の決定が可能となり、さ らに有効なきっ抗物質を製造するためにはどの残基を変更すべきかが示される。

まｔこ、アミ１ノン−アミリンレセプター相互作用の構造分析により、似ｊこ分 子形状および有機阻害剤で必要な他の構造的特徴の測定が可能となる。例えばビ ョルクマンＰＪ、セイパーＭＡ、サムレウイ、ベネットＵＳ。

ストロミンガーＪＬ、ウィリーＤＣ，ｒストラフチャー・オン・ザ・ヒユーマン ・クラスＩ・ヒストコンパティビリティ−・アンティゲン、ＨＬＡ−Ａ２Ｊ、「 ネイチャー」、１９８７．４３９：５０６−５１２参照。また、ビョルクマンＰ Ｊ１セイパーＭＡ、サムレウイＢ１べ不ットＷＳ１　ストロミンガーＪＬ１ウィ リーＤＣ１ｒｆ・フォーリン・アンティゲン・パインディング・サイト・アンド ・Ｔセル・リコグニション・リージョンズ・オン・クラスＩ・ヒストコンパティ ビリティ−・アンティゲンズ」、「ネイチャー」、１９８７．３２９：５１２− ５１８も参照。

ランゲルハンス島によるアミリン産生の代謝制御は、次の要領で測定され得る。

後記実施例１で概説されている実験プロトコールを用い、また生物流体中におけ るアミリンの測定用に開発された標準ラジオイムノアッセイまたはイムノメトリ ックアッセイを用いることにより（ヤロウＲ５，バーソン５Ａ１「ジャーナル・ オン・クリニカル・インベスティゲーション」、１９６０．３９：１１５７参照 ）、アミリンの合成および放出を制御する代謝変数の決定が可能となる。

そこで、例えば、摘出した島を、様々な濃度の候補分子、中間代謝物質およびシ グナル分子の両方、例えば生物活性ペプチドとインキュベーションすることによ り、アミリンの合成および放出に対してどの分子が積極的な作用を示し、どの分 子が消極的な作用を示すかが測定され得る。様々なシグナルに対する島の応答は 、島をインキュベーションする媒質中へのアミリンの合成および放出の測定、お よびアミリン特異的ｍＲＮＡの合成速度の測定により測定され得る。

次いで、アミリンレセプター自体について後記で概説されている技術と同じ技術 を用いることにより、この機構に対する遮断性分子の作用が試験され得る。

アミリンレセプター部位の同定により、その活性の直接遮断が達成され得る。本 発明の一態様では、インシュリン抵抗を遮断するモノクローナル抗体が三方法の うちの一つにより得られる。アミリンレセプター部位の同定および所望ならば精 製後、公知技術を用いることにより、レセプターに対するモノクローナル抗体が 産生される。

例えばロスＲＡ、キャソセルＤＪ１つオンゾＫ　Ｙ、マデュックスＢ１ゴールド ファインＩＤ、ｒモノクローナル・アンティボディーズ・トウ・ザ・ヒユーマン ・インシュリン・レセプター・ブロック・インシュリン・パインディング・アン ド・インヒビット・インシュリン・アクション」、「ブロシーデインダス・オン ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシーズ・オン・ザ・ユナイテッ ド・ステーツ・オン・アメリカ」、１９８２．７９ニア３１２−７３１６参照。

アミリンレセプターに対する抗体は、アミリンレセプターの精製または部分精製 製剤またはアミリンレセプター濃度が高い細胞による免疫化により、Ｂ　Ａ　Ｌ 　Ｂ　／　ｃまたは他の類似系統のマウスにおいて産生され得る。これらのマウ スのび臓を摘出し、それらのリンパ球をマウス骨髄腫セルラインと融合させ得る 。公知技術によるハイブリッドのスクリーニング後、アミリンレセプターに対す る抗体を産生ずる安定したハイブリッドを分離する。この活性は、レセプターへ の放射性標識アミリン（例　１２１　ｊ−標識アミリン）の結合に対する抗体の 阻止能力により立証され得る。次いで、モノクローナル抗体は、後記実施例に記 載されている通り、摘出島におけるグルコース誘発性インシュリン分泌の阻害お よび骨格筋におけるインシュリン抵抗の発生に関するそのアミリン作用阻止能力 について試験され得る。さらに具体的には、アミリンのインシュリン抵抗または インシュリン放出阻害作用の阻止に関するモノクローナル抗体の分析は、後記実 施例１および２で概説されているスクリーニング試験を用い、後記実施例４と同 様の実験デザインで置換ペプチドの変わりにモノクローナル抗体を用いることに より遂行され得る。

さらに別の方法は、抗イデイオタイプ抗体の使用を含む。抗イデイオタイプ抗体 は、抗イデイオタイプが、勿論、アミリン結合に関連した活性促進を伴わずに、 アミリンレセプター部位に対する補体（Ｃ□ｍｐｌ　ｉｍｅｎｔａｒｙ）結合親 和力を有するように、アミリンに対して指向したモノクローナル抗体に対して産 生される。細胞へのウィルス結合を遮断するための抗イデイオタイプ抗体の使用 は、当業界では公知である。カウフマンＲ５，ノーズワーシーＪＨ，不ポムＪＴ 、フィンダーグＲ１フィールズＢＮ、グリースＨＩ、ｒセル・レセプターズ・フ ォー・ザ・ママリアン・レオビールス。モノクローナル・アンティーイディオテ ィピソク・アンティボディー・ブロックス・バイラル・パインディング・トウ・ セルズ」、「ジャーナル・オン・イムノロジー」、１９８３．１３１：２５３９ −２５４１参照。また、バープツチＳ１シュバルツＲ５，ｒカレント・コンセプ ツ：イムノロジーーイディオタイプス・アンド・イディオティピック・ネットワ ークス」、ｒＭｅｄ　ＩｎＬＪ、１９８７．３１７：２１９−２２４も参照。

アミリン活性はまた、二官能性交叉結合剤を含む技術の使用により阻止され得る 。この技術により、薬剤を用いた交叉結合アミリンおよび／またはアミリン・ア ゴニストによるレセプターの結合が可能となり、その結果アミリン活性は阻止さ れる。公知技術（例えば、ガラ−ディー等、「７オトアフイニテイー・ラベリン グ・オン・ペプタイド・ホーモン・パインディング・サイン」、「ジャーナル・ オン・バイオロジカル・ケミストリー」、１９７４．２４９：３５１０−３５１ ８およびウィップＣＣ，エユングＣＷ１モウルＭＬ、ｒフォトアフィニティー・ ラベリング・オン・インシュリン・レセプター・プロテインズ・オン・リバー・ プラズマ・メンプラン・プレパレーンヨンズ」、「バイオケミストリー」、１９ ８０．１９ニア０−７６参照）を用いて、例えばアミリン、ＣＧＲＰまたはそれ らのいずれかの生物活性サブペプチドへ前記標識薬剤を交叉結合させることによ り（架橋剤ｐ−アジド安息香酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、そ れらはアミリンレセプターへの結合に対する活性を阻止する。

化学的交叉結合剤、例えばジスクシニミジルスベラート、ｐ−アジド安息香酸の Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたは他の類似した化学的化合物は、文 献で報告された適当な標準的方法によりアミリンまたはアミリン分子のサブペプ チド、または他のアミリン・アゴニスト、例えばＣＧＲＰと共有結合する。次い で、誘導体を、ＧＭ−セルロースまたは別の適当な固定相におけるクロマトグラ フィーにより精製し、０．１または１％トリフルオロ酢酸の移動相およびアセト ニトリル勾配を用い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＣ−８もしくはＣ −１８カラムにおける逆相クロマトグラフィーにより純度を評価する。後記実施 例で概説されている実験プロトコールに従い、交叉結合した分子を、アミリンの イノシュリン阻害およびインシュリン抵抗生成作用に対するその阻止能力につい て生物検定する。交叉結合したアミリンを、そのアミリンレセプターへの結合能 力、その免疫反応性について評価し、例えばｌ！ｌ　１により標識すると、アミ リンレセプター検出用グローブとしての使用が可能となる。

適当なアミリン競争的阻害剤の別の構築方法は、合成的または他のきっ抗物質に 関する生物学的スクリーニングを含む。ここで、適当な競争的阻害剤はインビト ロ実験により決定され、その実験では、可能性のあるきっ抗物質を、インシュリ ンの存在または非存在下、摘出した筋肉または筋肉細胞および精製アミリンへ加 え、組織培養における細胞によるグルコース取り込みをモニターする。可能性の あるきっ抗物質の存在下での取り込み増加は、その化合物が必要とされる阻害特 性を有することを示す。この方法は、多数の可能性のある合成きっ抗物質の比較 的迅速なマイクロタイター・プレート分析を可能にする。また、摘出したランゲ ルハンス島または単離した島Ｂ細胞も、増加したインシュリン生産がその代わり にモニターされる類似プロトコールで使用され得る。

さらに、免疫検定スクリーニングも使用され得、その場合、マイクロタイター・ ウェルに固定されたモノクローナル抗体からアミリンまたは抗イデイオタイプ抗 体を置換させる合成または他のきっ抗物質は、それらのきっ抗物質が上記で検討 された生物学的スクリーニング・パラメーターのもとに評価されるべきであるこ とを示す。

試験される化合物またはアミリンもしくは抗イデイオタイプ抗体は標識され得る 。免疫検定スクリーニングは、様々な潜在的きっ抗物質に対する第−相スクリー ニング技術として使用され得る。これらのスクリーニング方法は、１種またはそ れ以上の陽性および／または陰性対照の使用を含み得る。

この発明の目的において、この発明の化合物および組成物は、血糖降下剤を機能 させ得、アミリンの能力に影響する手段により投与され得、そのレベルは前記薬 剤により高められ得、２型糖尿病で助長されてインシュリンのグルコース関連作 用を阻害する。例えば、投与は、慣用的な非毒性の医薬的に許容し得る担体、ア ジュバントおよび賦形剤を含む製剤で経口的、非経口的、吸入スプレーまたは直 腸経路により行なわれ得る。この明細書で使用されている非経口的という語は、 皮下、静脈内、筋肉内および動脈内注射および注入技術を含む。ここで使用され ている動脈内および静脈内注射は、カテーテルによる投与を含む。本発明の化合 物および組成物は、正常範囲内にアミリン機能を維持するのに充分な量で投与さ れるのが好ましい。しかしながら、本発明の範囲に含まれる組成物は、それらが 血糖降下剤を含もうと否と全ての組成物を包含し、それらの意図された目的達成 に有効な量でアミリンきっ抗物質（複数も可能）が含まれる。非注射方法（例、 経口投与）を使用する場合、有効成分の放出速度が制御される持効性製剤の使用 が好ましい。

有効成分（複数も可）を含む医薬組成物は、意図された投与方法に適した形態で あればよく、活性化合物を医薬的に使用され得る製剤へ加工処理し易くする賦形 剤および補助物質を含む適当な医薬的に許容し得る担体を含み得る。経口用に使 用される場合、例えば錠剤、トローチ、飴、水性もしくは油性懸濁液、水分散性 粉末もしくはか粒、エマルジョン、硬もしくは軟カプセル、シロップまたはエリ キンルが製造され得る。経口使用を意図した組成物は、医薬組成物の製造に関す る当業界公知の方法に従い製造され得、それらの組成物は、心地好い製剤を提供 するため甘味剤、調味剤、着色剤および保存剤から成る群から選ばれる１種また はそれ以上の薬剤を含み得る。

錠剤の製造に適した非毒性の医薬的に許容し得る賦形剤と混合した形で有効成分 （複数も可）を含む錠剤が許容され得る。これらの賦形剤は、例えば不活性希釈 剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、燐酸カルシウムまたは燐酸 ナトリウムであり、造粒および崩壊剤は例えばとうもろこし澱粉またはアルギン 酸であり、結合剤は例えば澱粉、ゼラチンまたはアラビアゴムであり、滑沢剤は 例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであり得る。錠剤 は、非コーテイング状であり得るか、または公知技術でコーティングすることに より、消化管での崩壊および吸着を遅らせ、それによってさらに長期間にわたっ て持続する作用が提供され得る。

例えば、時間遅延物質、例えばグリセリンモノステアレートまたはグリセリンジ ステアレートが単独または蝋と共に使用され得る。

また、経口用製剤は、有効成分（複数もあり得る）を不活性固体希釈剤、例えば 炭酸カルシウム、燐酸カルシウムまたはカオリンと混合したゼラチン硬カプセル として、または有効成分を水または油性媒質、例えば落花生油、液体パラフィン またはオリーブ油と混合したゼラチン軟カプセルとして製剤化され得る。

本発明の水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合した形で有効成 分を含有する。それらの賦形剤には、懸濁剤、例えばカルボキシメチルセルロー スナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アル ギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアラビアゴ ムがあり、分散もしくは湿潤剤には、例えば天然ホスファチド（例、レシチン） 、アルキレンオキシドと脂肪酸の縮合生成物（例、ポリオキシエチレンステアレ ート）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物（例、ヘプタデ カエチレンオキシトール、例、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート ）、またはエチレンオキシドと部分　の縮合生成物（例、ポリオキシエチレンソ ルビタンモノオレエ一ト）がある。水性懸濁液はまた、１種またはそれ以上の保 存剤、例えばエチルまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、１種また はそれ以上の着色剤、１種またはそれ以上の調味剤および１種またはそれ以上の 甘味剤、例えばしょ糖またはサッカリンを含み得る。

油性懸濁液は、有効成分を、植物油、例えば落花生油、オリーブ油、ごま油また はココヤシ油、または鉱油、例えば液体パラフィンに懸濁することにより製剤化 され得る。油性懸濁液は、増粘剤、例えば蜜蝋、硬パラフィンまたはセチルアル コールを含み得る。甘味剤、例えば上述の甘味剤および調味剤を加えることによ り、快適な経口製剤が提供され得る。これらの組成物は、酸化防止剤、例えばア スコルビン酸の添加により保存され得る。

水の添加による水性懸濁液の製造に適した本発明の水分散性粉末およびか粒は、 分散または湿潤剤、懸濁剤および１種またはそれ以上の保存剤と混合した形で有 効成分（複数もあり得る）を提供する。

適当な分散または湿潤剤および懸濁剤の具体例は上記で開示されている。追加的 賦形剤、例えば甘味、調味および着色剤もまた存在し得る。

本発明の医薬組成物はまた、水中油エマルジョン形態であり得る。

油性相は、植物油、例えばオリーブ油または落花生油、鉱油、例えば液体パラフ ィン、またはこれらの混合物であり得る。適当な乳化剤には、天然ゴム、例えば アラビアゴムおよびトラガカントゴム、天然ボス７アチド、例えば大豆レシチン 、脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来するエステルまたは部分エステル、例 えばソルビタンモノオレエート、およびこれらの部分エステルとエチレンオキシ ドとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートがある 。エマルジョンはまた、甘味および調味剤を含み得る。

シロップおよびエリキシルは、甘味剤、例えばグリセリン、ソルビトールまたは しょ糖を用いて製剤化され得る。それらの製剤はまた、保護剤、保存剤、調味剤 または着色剤を含み得る。

本発明の医薬組成物は、注射可能製剤形態、例えば滅菌注射可能水性または油性 懸濁液であり得る。この懸濁液は、適当な分散または湿潤剤および懸濁剤、例え ば上述した薬剤を用いる公知技術に従い製剤化され得る。連続注射可能製剤はま た、連続注射可能溶液または懸濁液、非毒性の非経口的に許容し得る希釈剤また は溶媒、例えば１，３−ブタンジオールに溶かした溶液であり得る。使用可能な 許容し得る賦形剤および溶媒には、水、リンゲル溶液および等優性塩化ナトリウ ム溶液がある。さらに、滅菌固定油は、溶媒または懸濁媒質として慣用的に使用 され得る。この目的のため、合成モノまたはジグリセリド類を含む低刺激性固定 油が使用され得る。さらに、脂肪酸、例えばオレイン酸もまた注射可能製剤の製 造に使用され得る。

また、この発明の化合物は、薬剤の直腸投与用坐剤形態で投与され得る。これら の組成物は、常温では固体であるが、直腸温度では液体であるため、直腸で溶け て薬剤を放出する適当な非刺激性賦形剤を薬剤と混合することにより製造され得 る。それらの物質は、コカバターおよびポリエチレングリコール類である。

担体物質と合わせることにより単一用量形態が製造され得る有効成分（複数もあ り得る）の量は、処置される主体および特定の投与方法により異なる。例えば、 ヒトへの経口投与を意図した持効性製剤は、組成物全体の約１〜約９５％の範囲 で変化し得る適当かつ慣用量の担体物質と調合された少なくとも最少量の有効物 質を含み得る。

投与用に容易に測定できる量を提供する医薬組成物を製造するのが好ましい。

しかしながら、特定患者に対する具体的用量レベルは、当業界の熟練者に熟知さ れている通り、使用される特定化合物の活性、処置される個体の年令、体重、全 般的健康状態、性別および食餌療法、投与の時間および経路、排出速度、以前に 投与された他の薬剤、同時処置の種類（もしあれば）および処置の頻度、所望さ れる作用の性質、並びに治療を受けている特定疾患の重症度を含む様々な因子に より異なるが判る。

下記実施例は、本発明に対する理解を助けるものであり、勿論、本明細書で記載 および請求されている本発明を具体的に限定するものとして見なされるべきでは ない。現在公知または後で開発されたあらゆる均等内容の置き換えを含め、当技 術分野の範囲内に含まれる本発明の上記変形は、後記請求の範囲で請求されてい る本発明の範囲内に含まれるものとする。

実施例１ これらの実験は、天然アミリンおよび合成非アミド化アミリンの両方が、基礎お よびインシュリン刺激の内形式でグリコゲン合成を低減化させるという事実を説 明している。最初の実験は、上記で概説された通り、Ｃｙｓ（２）およびＣｙｓ （７）間のジスルフィド架橋が再形成されている、バレイおよびメリフィールド の方法に従い合成されたアミリンペプチド１−３７により行なわれた。

−夜絶食させた後、ラットを殺し、先の記載に従いひらめ動片を製造した。クレ ッタツＭ１プレントキＭ１ザニネッティＤ１ジャンルノーＢ１「インシュリン・ レジスタンス・イン・ソリアス・マスル・７０ム・オビーズ・ズッカー・ランフ 」、「バイオケミカル・ジャーナル」、１９８０．１８６：５２５−５３４およ びエスピナルＪ１ドームＬ１ニューショルムＥＡ、ｒセンシティビティー・トウ ・インシュリン・オン・グリコリシス・アンド・グリコゲン・シンセシス・オン ・アイソレイティラド・ソリアス・マスル・ストリップス・クロム・セブンタリ ー、エクササイズド・アンド・エクササイズトレインド・ランフ」、「バイオケ ミカル・ジャーナルＪ、１９８３、２１２：４５３−４５８参照。

摘出した筋肉を、直ちに３７℃で次の組成（ミリモルで）：ＮａＣ１（１０４） 、Ｈｅｐｅｓ（６−７）、ＮａＨＣＯ３（２２）、ＫＣＩ（４）、ｃａｃｌｚ（ １，１）、Ｋ　Ｈ２ｐ　ｏ　（１）、Ｍｇ　Ｓ　Ｏ４（１）、ピルベート（５） 、スクシネート（５）、ｌ−グルタメート（５）、ｄ−グルコース（５，５）を 有するタレブスーリンゲル重炭酸緩衝液を含むシリコーン処理した２５Ｉ１１１ エルレンマイヤー・フラスコへ移し入れた。脱脂牛血清アルブミン（チェノＲ１ 「リムーバル・オン・ファ・ンテイ・アシ・ノズ・７０ム・シーラム・アルブミ ン・パイ・チャコール・トリートメント１１「ジャーナル・オン・バイオロジカ ル・ケミストリーＪ、１９６７．２４２：１７３−１８１参照）を加えて１．５ ％の最終濃度とし、ｐＨを７゜３１に調節した。製造中、媒質を０２／ＣＣｈ（ ９５１５）でガス処理した。インキュベーション中、フラスコをＯユ／ＣＯ２で 連続的にガス処理した。３０分のブレインキュベーション後、筋肉を、ＵＤＰ− １４ｃｍグルコース（０，５μＣｉ／ｍｌ）および様々な濃度のインシュリン（ １１０，１００およびｌｏｏｍＵ／Ｌ）を含む、ピルベート、スクシネートまた はｌ−グルタメートを用いた同じクレブス−リンゲル重炭酸緩衝液を含む他のフ ラスコへ移した。アミリンを実験の半分に加えて１２０ナノモル／Ｌの最終濃度 とした。６０分のインキュベーション後、筋肉を迅速に取り出し、プロットし、 液体Ｎ。

中で凍結クランプし、グリコゲンへのＵＤＰ−”Ｃ−グルコース取り込み程度の 測定用に処理した。ケンプツトＱ、ローテンＥ、ジェンレヌッドＢ１　レノルド Ａ１「ディクリ−スト・ベーサル・ノン−インシュリン・スティミュレイティッ ド・グルコース・アップティク・アンド・メタポライド・パイ・スケレタル・ソ リアス・マスル・アイソレイティラド・７０ム・オビーズーハイバーグリカスミ ック・マイク」、「ジャーナル・オン・クリニカル・インベスティゲーション」 、１９７９．５８：１０７８−１０８８参照。グルコースからラクテートへの変 換速度の測定により、グルコース輸送に対するインシュリンの作用を測定した。

レイトンＢ１チャリスＲＡＪ、ローズマンＦＪ、ニューショルムＥＡ、ｒエフエ クツ・オン・デキサメタゾーン・オン・インシュリソースティミュレイティッド ・レーン・オン・グリコリンス・アンド・グリコゲン・シンセシス・イン・アイ ソレイティラド・インキュベーティッド・スケレタル・マスルズ・オン・ザ・ラ ット」、「バイオケミカル・ジャーナル」、１９８７．２４６：５５１−５５４ 、およびエンゲルＰ、ジョーンズＪ、ｒコーズイーズ・アンド・エリミネーショ ン・オン・エラティック・ブランクス・イン・エンザイマティック・メタポライ ド・アッセイズ・インポルピング・ザ・ユース・オン・ＮＡＤ＋・イン・アルカ リン・ヒドラジン・バファース」、　「アナリティカル・バイオケミストリー」 、１９７８．８８：４７５−４８４参照。

結果は添付の表１に示されており、アミリンの存在および非存在下におけるイン シュリン濃度に対するグリコリン合成速度（グリコゲンへの目Ｃ−ＵＤＰ−グル コースの取り込み速度として測定された）を示す。実験は、１リツトル当たり１ ２０ナノモルのアミリンの存在下で行なわれた。］ｍＬ当たり１および１００ナ ノモルのインシュリン濃度での各結果は、１１反復実験の平均である。１ｍＬ当 たり１０および１０００マイクロ単位での各結果は、５反復実験の平均である。

結果は、インシュリンの全生理学的濃度（１ｍＬ当たり１〜１００マイクロ単位 ）で、グリコゲン合成がアミリンの存在下において緩慢になることを立証してい る。差異は統計的に有意である（ｐは、マン−ホウイツトニー口試験により１＋ ｎＬ当たりｌおよび１００マイクロ単位で０．０５未満である）。

表１ 用量応答ニアミリン対グリコゲン合成阻害。

様々なインシュリン濃度における合成アミリンの作用。

（一定アミリン濃度：１２０ナノモル／Ｌ）グリコゲン合成 （マイクロモル／時／ｇ）＊　相対グリインシュリン　反復　対照のみ　加えた アミリン　コゲン合濃度（μＵ／ｍｌ）　数　平均　誤差　平均　誤差　成阻害 １　１１　２．０９　０．１８　１．５４　０．１８　２６％１０　５　２．２ ５　０．５２　１．７２　０．２１　２４％１００　１１　５．３２　０．２６ 　４．３３　０．２８　１９％１０００　５　４．１０　０．７２　４．５０　 ０．３６　−−＊−一湿った筋肉組織１グラムに対する１時間当たりのグリコジ ル単位マイクロモル数。相対グリコゲン合成阻害は、グリコゲン合成が対照から 低減化されたパーセンテージに等しい。平均の標準誤差は、標準偏差を反復数の 平方根により割ったものとして定義される。

アミリンによるグリコゲン合成阻害は、低いインシュリン濃度、恐らくは濃度０ でも存続することが観察される。従って、アミリンは、インシュリンの作用とは 反対であるが、インシュリン作用の直接きっ抗によっては仲介されないと思われ るそれ自体の作用を有する。これの証拠として、我々は、アミリンが赤血球細胞 上のレセプターからインシュリンを著しくは転置させ得ないことを観察した。

これは、ラットの骨格筋細胞におけるペプチドアミリンのレセプターの存在を立 証している。勿論、この実験はヒト配列に従い合成されたアミリンにより行なわ れたものであり、まだ知られていないが、「ラット−アミリン」の配列はヒトア ミリンの配列とは異なると思われる。従って、このシステムにおけるラフトアミ リンの作用は、ヒトアミリンの作用よりも著しく大きいものであり得るとも思わ れる。

単離された天然アミリンはまた、下記実験が立証している通り、骨格筋における 基礎およびインシュリン刺激によるグリコゲン合成速度の生物学的阻害作用を有 する。実験は、クーパーＧＪＳ等、「プロシーデインダス・オン・ザ・ナショナ ル・アカデミ−・オン・サイエンシーズ・オン・ザ・ユナイテッド・ステーク・ オン・アメリカ」、１９８７．８４：８６２８−８６３２の方法に従い、ヒト２ 型糖尿病のすい臓から摘出および特性検定されたヒトアミリンにより行なわれた 。使用された試料は、Ｃ−１８カラムにおいて、１．０パーセントのトリフルオ ロ酢酸の移動相によるＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィーの最終単離段階の広いピ ーク領域から得られ、４５分間にわたる５〜８０パーセントのアセトニトリルに よる勾配溶離を用い、２８０ｎｍでの紫外線分光測光法によりペプチドが検出さ れた。

アミリンの正確な濃度は、定量的アミノ酸分析およびアミノ酸配列決定における 収量により確認された。アミリンの溶離プロフィールを示すグラフが構築され得 、Ｙ軸は０．０２または０．０５吸光度単位のＡＵＦＳｚｓ。（吸光度単位、実 物大屈折）を表し、Ｘ軸は勾配におけるアセトニトリル・パーセンテージを示す 。アミリンは、６７゜９パーセントのアセトニトリル・パーセンテージで溶離し た。

実験は後記実施例４に示された方法で行なわれたが、ただし、化学合成された物 質の代わりにヒト糖尿病すい臓から摘出したアミリンを使用した。「アミリン」 として示された試料は、示された濃度の天然アミリンおよび１０μＵ／ｍｌの基 礎濃度（表２）または１００μＵ／ｍｌの刺激レベル（表３）のインシュリンを 含んだ。これらの結果を下記表２８よび３に示す（ｎは各群における反復数を表 す）。ラクテート合成速度が示す通り、解糖速度は群間ではあまり相異しなかっ た。統計的分析はＬ−試験により行なわれ、有意性は、アミリン処置試料および 適当なインツユリン処置対照間の差異として評価されｔ二。

表２ ラット筋肉細胞におけるグリコケン合成阻害基礎イン／ニリン濃度での天然全ア ミリンの作用（インシュリン濃度：　ｌ　ＯｉｓＵ／ｍｌ）グリコゲン合成 アミリン濃度反復（μモル／時／ｇ）＊　相対インク（ナノモルル）数　平均値 　標準誤差ニリン抵抗無しく対照）　−−−４１，４３０，１００％アミリン、 分画２０．４　４　１．１２　０．０６　２２％アミリン、分画３０．４　３ 平均　１．１２　０．０６　２２％ アミリン、分画２２．０　４　０．８２　０．１２　４３％アミリン、分画３２ ．０　４ 平均　０．７２　０．１２　５０％ ＊−−湿った筋肉組織１グラムに対する１時間当たりのグリコジル単位マイクロ モル数。相対グリコゲン合成阻害は、グリコゲン合成が対照から低減化されたパ ーセンテージと等しい。平均の標準誤差は、標準偏差を反復数の平方根で割った ものとして定義される。グリコゲン合成の全測定値はＴ−試験により測定され、 どの場合でもｐ＜０．０２５であり対照値とは顕著に異なっていた。

表３ ラット筋肉細胞におけるグリコゲン合成阻害刺激性インシュリン濃度での天然全 アミリンの作用。

（インシュリン濃度：　ｌ　ＯＯｐ　Ｕ／ｍｌ）グリコゲン合成 アミリン濃度反復（μモル／時／ｇ）＊　相対インシ無しく対照）　−−−３２ ，８３０，１００％アミリン、分画２　０．４　４　２．卯　四箆　２９％哀吃 先Ａ 無しく対照）−−−４３，６９０，５７０％アミリン、分画２　２．０　５　１ ．互　岨矩　４７％＊−−説明については表２参照。

０．４ナノモル／Ｌ程度に低い抽出アミリンの濃度でも、摘出したラット筋肉に おいて基礎およびインシュリン刺激による両グリコゲン合成速度の著しい低減化 に有効であること、および２．０ナノモル／Ｌのアミリン濃度は、グリコゲン合 成の基礎速度を５０パーセント、およびインシュリン刺激速度を４７パーセント 低減化させることが判る。これは、同じ方法ではあるが、化学合成アミリンによ り行なわれｔ；以前の実験の結果とまさしく対照をなしており、この場合、グリ コゲン合成の顕著な低減化をもたらすには１２０ナノモル／Ｌの非アミド化合成 アミリン濃度が必要とされた。

これらの結果は、天然供給源から抽出されたアミリンが、少なくともｌ　２０／ ２または６０倍の係数により前記化学合成アミリンよりも強力であったことを立 証している。これは、合成物質によって完全には再生されない特徴の独立分子が 存在することを示す。これは、Ｃｙｓ（２）−Ｃｙｓ（７）ジスルフィド橋の再 形成が合成分子では不完全であるためであり得る。

実施例２ また、アミリンの合成サブペプチドによる実験を行った。その個々の構造は既に 本明細書でサブペプチド［３］−［５］として示されている。アミリンのグリコ ゲン合成阻害活性部位を局在させるため上記方法により行なわれた実験で使用さ れるアミリンサブペプチドには次のものがある：［３１アミリン１−１６、再形 成されたＣ　ｙｓ（２）−Ｃｙｓ（７）檎随伴、［４］アミリン１−１６、還元 、［５１アミリン８−３７、［６］アミリン２７−３７、および［７］アミリン １−１６、Ｃｙｓ残基２および７と置換されたＳｅｒ残基随伴。

ペプチドは全て、市販されているＰａｍ樹脂およびｔ−ブチルオキ７カルポニル 保護アミノ酸および試薬を用いて、アプライド・バイオンステムダ４３０Ａペプ チド合成装置で合成された。同時に、遊離ラジカル・トラップとしてアニソール を用いた無水フッ化水素酸処理により側鎖保護基からペプチドを開裂させ、次い でエーテルにより側鎖保護基を抽出し、１５パーセント酢酸にペプチドを溶解し 、樹脂からろ過し、アセトニトリル勾配で０．１％トリフルオロ酢酸水溶液の移 動相を用いたＣ−８逆相カラム（アクアポアＲＰ−３０００、ブラウンリー・ラ ボラトリーズ、サンタクララ、カリフォルニア）でのＨＰＬＣにより精製し、２ ０６ｎｍでの紫外線分光測光法によりペプチドを検出した。ペプチド［３１の２ および７位のシスティン残基を結合するジスルフィド橋は、次の方法により再形 成された。合成後、ペプチドを１２時間ｐＨ８，０の水希釈溶液に溶かし、次い で凍結乾燥により回収し、アセトニトリル−０，１％トリフルオロ酢酸水溶液系 中での逆相クロマトグラフィーによる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　 Ｃ）システムで再精製し、２０６ｎｍでの紫外線吸光度によりペプチドを検出し た。例えば、クーパーＧ、Ｊ、Ｓ。

等、「ブロンーデインダス・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエ ンシーズ・オン・ザ・ユナイテッド・ステーク・オプ・アメリカ」、１９８７． ８４：８６２６−８６３２参照。ペプチド［４］のジスルフィド結合は、合成後 の脱遮断処理後、ジチオトレイトールによる還元により還元形態で保持された。

結果は、重大な活性がサブペプチド［３１、［４１および［５１、すなわち、酸 化により再形成されたＣｙｓ（２）−Ｃｙｓ（７）を伴うアミリン１−１６、還 元されたアミリン１−１６およびアミリン８−３７に存在することを示した（デ ータは示さず）。活性は、サブペプチド［６］および［７］、すなわちアミリン ２７−３７およびシスティン残基の代わりにセリン残基を有するアミリン１−１ ６には存在しなかった。従って、骨格筋における基礎およびインシュリン刺激性 の両グリコゲン合成速度阻害におけるアミリンの活性は、アミリン分子のある種 の特徴： １、分子の２および７位におけるｃｙｓ残基の存在、２、残基７および１６間の 配列の他の部分により異なる。

実施例３ アミリン遮断剤として２および７位のンスティンをセリンと置き換えたアミリン ｌ　−１６（ｓｅｒ２．ｓｅｒ’アミリンｌ−１６）を用いた実験は、実施例２ の記載に従い行なわれた。我々は、システィンをセリンと置き換えた人工合成ペ プチドアミリン１−１６および抽出ヒトアミリンを用いた。実験は、２．０およ び０．２ナノモル／Ｌの両アミリン濃度、１００μＵ／ｎ＋１の刺激性インシュ リン濃度、および１０−’モル／Ｌのｓｅｒ”、ｓｅｔ’アミリン１−１６濃度 により行なわれた。これらの実験で得られた結果は下表４に包括されている。

表４ グリコゲン合成阻害のアミリンきっ抗物質による低減化ラット筋肉細胞における 修飾アミリンサブペプチド５ｅｔ２．Ｓｅｒ’アミリン１−１６の作用 （刺激性インシュリン濃度：　ｌ　００　Ｋ　Ｕ／ｍｌ）グリコゲン合成 １艮（μモル／時／ｇ）＊　相対イ　相対さくナノモル／ｍｌ）　ンシュ　っ抗 物 アミ　きっ抗　反復　平均　標準　リン　質作用茎Ｚ　灸夏−Ｌ　仇　乳籐　匪 披 無し く対照）　０．０　０　３　２．８３０．１０　０％　−アミリン 単独　０．２　０　４　２．０００．２９　２９％　０％つ抗物質　０．２　１ ００００　３　２．２２　０．７２　２２％　２４％実験＃２ 無し く対照’）　０．０　０　３　３．６９０．５７　０％アミリン 単独　２゜０　０　３　１．９７０．４５　４７％　０％つ抗物質　２．０　１ ００００　３　２．６３　０．２９　２０％　３８％＊−−湿った筋肉組織１グ ラムに対する１時間当たりのグリコジル単位のマイクロモル数。相対グリコゲン 合成阻害は、グリコゲン合成が対照から低減化されるパーセンテージに等しい。

相対きっ抗物質作用は、相対インシュリン抵抗がアミリン単独から低減化される パーセンテージに等しい。平均の標準誤差は、標準偏差を反復数の平方根で割っ たものとして定義される。

これらの結果は、２．０ナノモル／Ｌおよび０．２ナノモル／Ｌの画濃度で使用 されたアミリンが、グリコゲン合成阻害活性を示したこと、および両実験におけ る対照では活性が著しく減少したことを立証している。他方、ｓｅｒ　２　＋　 ｓｅｔ　７アミリン１−１６を加えた後、インシュリン、アミリンおよびｓｅＳ 、ｓｅｔ’アミリン１−１６処置筋肉による試料におけるグリコゲン合成のイン シュリン刺激速度間に顕著な差異は存在しなかった。５ｅｔ２．ｓｅｔ’アミリ ン１−１６の阻害作用は不完全であるが、グリコゲン合成速度は、２濃度（２， ０および０．２ナノモル／Ｌ）のアミリンでの両実験において非阻害速度へ後戻 りしたことが判る。

すなわち、アミリン作用の競争的阻害剤、この場合ｓｅｒ”、ｓｅｔ’アミリン ｌ−１６（ペプチドの活性部位内の重要な残基に対して異なるアミノ酸が置換さ れたタイプに属する）は、アミリン単独により誘発されるインシュリン抵抗を部 分的に改善させ得る。さらに、置換ペプチドｓｅｒ”、ｓｅｒ’アミリン１−１ ６は、摘出骨格筋におけるインシュリン刺激によるグリコゲン合成速度を阻害す るアミリンの作用の阻害剤、すなわち我々の考える競争的阻害剤である。

実施例４ 下記実験は、アミリンのサブペプチドが、標準グルコース攻撃に応じて摘出した ランゲルハンス島により産生されるインシュリンの量を減らすべく作用し得ると いう事実を説明している。全アミリンを用いても同様の結果が得られた。実験は 全て、実験の実施に使用される公知方法により行なわれた。例えば、レイシーＰ ＥおよびコスティアノフスキーＭ、「メソッド・フォー・ジ・アイソレーション ・オン・インタクト・アイレッツ・オン・ランゲルハンス・フロム・ザ・ナノ］ ・・パンクレアス」、「ダイアベーラＪ、１９６７．１６：３５−３９参照。

簡単に述べると、ラットを殺し、ランゲルハンス島をそれらのすい臓から摘出し た。実験は、摘出したばかりの島または３７℃で標準培養培地および条件で一夜 （２３時間）インキュベーションした後の島により行なわれた。合成アミリンペ プチド２７−３７または合成力ルントニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）を、 １．０ミリモル／Ｌのくえん酸／くえん酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３，０に溶か し、アミリン２７−３７の濃度を定量的アミノ酸分析により確認した。

例えば、クーパーＧＪＳ等、「ブロシーデインダス・オン・ザ・ナショナル・ア カデミ−・才ブ・サイエンシーズ・オン・ザ・ユナイテッド・ステー７・オン・ アメリカ」、１９８７．８４：８６２８−８６３２参照。これらの実験における 島のインキュベーションは、標準タレブスーヘインスレイト緩衝液中で行なわれ 、１．０ミリモル／Ｌ＜えん酸緩衝液を加えても、インキュベーション培地のｐ Ｈは何等影響を受けないことが立証された。島の刺激は、ｌＯミリモル／Ｌの標 準刺激性グルコース濃度で行なわれた。

インシュリンの産生を、μＵ／島／時として表す。実験は全て、■ポイント当た り５反復で行なった。高応答の完全さを、各々２およびｌＯミリモル／Ｌのグル コースにより異なるアリコートの島を刺激した後の応答を比較することにより評 価し、阻害応答の強度を、１μｇ／ｍ１（６５０ナノモル／Ｌ）ソマトスタチン により誘発された応答に対して判断した。ソマトスタチンは、グルコースに対す る島Ｂ細胞のイン／ニリン分泌性応答の強力な公知阻害剤である１４アミノ酸ペ プチドである。アリムラＡ１、バイオメゾカル・リサーチ１９８１．２：２３３ −２５７゜ＣＧＲＰもまた、グルコース刺激性インシュリン分泌の強力な阻害剤 であることが示された。ペソダーリンＭ１アーレンＢ１ボッチャーＧ１　スンド ラーＦ、「エンドフライノロジー」、１９８６．１　］　］９：８６５−８６９ 結果は下表５に示されており、結果は全て平均の標準誤差（ｓ、ｅ、ｍ。

）として表す。群の平均間の差異の有意性を【−試験により評価する。

ｌＯミリモル／Ｌグルコースによる刺激結果を、２ミリモル／Ｌグルコースでの 刺激結果と比較する。他の全実験条件でも、阻害作用の有意性を１０ミリモル／ Ｌグルコース単独の作用に対して測定する。

表５ ラット島細胞におけるインシュリン分泌合成部分アミリンおよび他のホルモンの 作用（刺ｆｆｉ性グルコース・レベル：ｌＯミリモル／Ｌ）グリコゲン生成　相 対イン （μＵ／島／時）　ンユリン 濃度（ナノ　平均　標準　分泌 阻害物質　モル／Ｌ）　区Ｍ　値、乳籐無しく対照）　−−−５８０１４０％ アミリン２７−３７　１０００　５　６５　１７　１９％アミリン２７−３７　 １００　５　４８　９　４０％アミリン２７−３７　１０　５　４５　７　４４ ％ソマトスタチン　６５０　５　４４　１２　４５％ＣＧＲＰ２７−３７　１０ ００　５　４６　１０　４２％ＣＧＲＰ２７−３７　１００　５　３６　８　５ ５％ＣＧＲＰ２７−３７　１０　５　３６　９　５５％相対インシュリン抑制は 、インシュリン産生が対照から低減化されるパーセンテージに等しい。ｒｃＧＲ ＰＪカルシトニン遺伝子関連ペプチド。平均の標準誤差は、標準偏差を反復数の 平方根で割ったものとして定義される。

これらの実験は、ペプチドアミリン２７−３７が、摘出ラット島からのグルコー ス刺激性インシュリン分泌の強力な阻害剤であることを示す。様々な濃度のアミ リン２７−３７により観察されたインシュリン分泌阻害およびインシュリン分泌 の強力な既知阻害剤であるソマトスタチン（ｌμｇ／ｍＬ、６５０ナノモル／Ｌ ）、または様々な濃度のペプチドＣＧＲＰ２７−３７によるインシュリン分泌阻 害間に顕著な差異は存在しなかった。ＣＧＲＰ２７−３７により誘発される阻害 は、アミリン２７−３７により誘発される阻害よりも僅かに大きい傾向が見られ たが、これは決して顕著にはならなかった。

グルコースに対する不充分なインシュリン応答は、２型糖尿病独特の病態生理学 的特徴の一つであり、その状態では過剰のアミリン産生が行なわれると思われる ｔ；め（大量のアミロイドの存在により示されている）、アミリンのこの作用は 非常に高い糖尿病誘発性（糖尿病を誘発させ易い性質）であり得る。

上記実施例３で提供された情報を用いることにより、アミリン２７−３７の配列 でアミノ酸の置換が行なわれた一つまたはそれ以上のアミリン・ペプチドは、グ ルコース刺激に対するインシュリン応答の阻害におけるアミリン２７−３７の作 用の阻害剤として製造され得る。上記の置換ペプチドおよび類似特性を有する他 の化合物は、２型真性糖尿病の処置において非常に有益である。

実施例５ また我々は、アミリンが、静脈内投与された場合、急激に糖尿病（１４０ｍｇ／ ｄＬより大きい絶食特高血糖症）を誘発することを示した。８匹の正常なラント に、１００μｇポーラスのアミリン（ラットアミリン、ベイケム、トランス、カ リフォルニア）を注射した。静脈内アミリン・ポーラスは、１５−３０分以内に 糖尿病レベル（通常２００ｍｇ／ｄＬ前後）に達する根深い高血糖症を発症させ た。この高血糖症は数時間存続する。高血糖症は、一部には肝臓（内在性）グル コース生産量の増加および一部には周辺グルコース処理妨害の増加によるものと 考えられる。それは、増加したグルコース分解的異常流出または筋肉もしくは肝 臓におけるグリコゲン分解に起因するものと考えられる、血しょう乳酸値の一時 的増加を誘発する。ソマトスタチンが存在せず、高血糖状態に応じてインシュリ ンを増加させた場合のみアミリンの後に呼吸商（ＲＱ）の増加が生じる。ソマト スタチン注入中（内在性インシュリン放出無し）、ＲＱの変化は無く、絶食動物 ではアミＩＪンに応じた脂質から炭水化物燃料消費への変化が無いことを示して いる。

実施例に の実験では、我々は、アミリン・アゴニストＣＧＲＰ８−３７が同じくアミリン 作用を部分的に弱めるべく機能することを示した。

インシュリンは、フミリンーＲ，ｌ　００Ｕ／ｍＬ、組換えヒトインシュリン（ イーライ・リリー、インディアナポリス、インディアナ）として得られた。ラッ トアミリン（ベイケム、トランス、カリフォルニア）として得られたアミリンお よび８−３７ヒトｃｃＲＰ（ペイケム、トランス、カリフォルニア）もまた使用 された。きっ抗物質検定は、ラントから摘出したひもめ筋を用いてインビトロで 行なわれた。その検定では、筋肉グリコゲンへの放射性標識グルコースの取り込 み割合を次の要領で測定した。（１）ホルモン不含有条件（インシュリンＯ、ア ミリン０、ｈＣＧ　ＲＰ　ａ−１ｙｃきっ抗物質）０）下、（２）インシュリン によるグリコゲン形成刺激条件（１０００μＵ／ｆｆ１Ｌのインシュリン、アミ リン０、きっ抗物質０）下、（３）グリコゲン形成のほぼ最大刺激がアミリンに より阻害された条件（１０００μＵ　／　ｍ　Ｌ　（７）　インシュリン、２０ ナノモルのアミリン、きっ抗物質０）下、および（４）アミリンによるグリコゲ ン形成の抑制がアミリン作用に対するきっ抗物質により脱抑制された条件（１０ ００μＵ　／ｒＩＩＬのインシュリン、２０ナノモルのアミリン、（０，１ナノ モル、ｌ０ナノモル、１００ナノモル、３００ナノモル、１マイクロモル、１０ マイクロモル）濃度範囲のきっ抗物質）下。従って、９処置グループ（条件１． ２．３および条件４の６サブグループ）が存在しＩ；。

４時間給食させたラットを断頭後、直ちに右および左ひらめ筋を取り出し、半分 に分け、一時的に生理食塩水中に入れた。各動物から得られた４筋肉片が異なる 検定条件を代表する９フラスコ間で公平に分配されるように、筋肉を異なる処置 群に割り当てた。各フラスコはＩＯ＋ｎＬのクレブス−リンゲル緩衝液＋５．５ ミリモルのグルコース浴中に浸した４筋肉片（複製）を含んでおり、それは、連 続撹はんして暖められた液体の表面上に９５％０□および５％ｃｏ２の気流を通 すことにより３７°Ｃでこの気体混合物により平衡状態にされていた。薬理活性 剤をｌＯｍＬの媒質へ加えることにより、上記濃度および混合物が得られた。３ ０分の「ブレインキュベーション」期１ＪＩｌ＆、０．５μＣ１のＵ−ＩＣ−グ ルコースを各フラスコへ加工、すらに６０分間インキュベーションした。次いで 、各筋肉片を迅速に取り出し、プロットし、液体Ｎ２中で凍結させ、秤量し、後 続の１１Ｃ−グリコゲン測定用に貯蔵した。

凍結筋肉試料を、７０℃で４５分間１ａ＋Ｌの６０％水酸化カリウム中で分解さ せた。３ｎ＋Ｌの無水エタノールを加え、−夜−２０℃に冷却することにより、 溶解したグリコゲンを沈澱させた。上清を吸引し、グリコゲンをエタノールで洗 浄し、吸引し、真空下乾燥した。残りのグリコゲンを水およびンンチレーション 流体に再溶解し、Ｉ′Ｃについて計数した。

インキュベーション媒質の５．５ミリモルのグルコースにおける１１Ｃ−グルコ ースの比活性、および各筋肉から抽出されたグリコゲンに残存する総目Ｃ数に関 する知識から、最後の６０分インキュベーション期間におけるグリコゲン合成の 正味速度を測定した。これを筋肉１塊に対して正規化し、筋肉１グラム当たり１ 時間にグリコゲン中へ取り込まれたグリコジル単位のマイクロモル数として表し た。最小二乗性反復ルーチン（オールフィツト、Ｖ２．７、ＮＩＨ。

メリーランド）を用いて、きっ抗物質用量／応答曲線を４パラメーターのロジス ティックモデルに適合させることにより、脱抑制に関するＥＣ，。を誘導した。

結果は、１０００μＵ　／　ｍ　Ｌインシュリンを媒質へ加えた後におけるグリ コゲン合成速度の３．７倍増加を示した。基礎レベル（０アミリン１０インシュ リン）未満まで２０ナノモルのアミリンを加えることにより、これは約８３％低 下した。この阻害レベルからは、インキュベーション培地へのＣＧ　ＲＰ　ａ− ｓｒ添加に伴ったＣＧＲＰ、−３７グリコゲン合成速度における用量依存リター ンが存在した。図１に示されている通り、グリコゲン合成速度は基礎レベルの約 ｌ１５％以下に増加し、１．２ナノモルのＣＧ　ＲＰ　ｌ−３１濃度では半最大 であった。すなわち、ペプチドＣＧ　ＲＰ　ｍ−５ｒは、インシュリン刺激性筋 肉グリコゲン合成に対するアミリンの阻害作用を部分的に打ち消すため、アミリ ンきっ抗物質として見なされ得る。円柱３〜９の下の数は、各場合とも２０ナノ モルのアミリンおよび１０００μＵ／ｍｌのインシュリンの存在下加えられた、 測定された８−３７濃度を示す。

実施例７ この実施例は、アミリンレベルに対するスルホニル尿素血糖降下剤の作用、およ びビグアナイド血糖降下剤メトホルミンのアミリンレベルに対する作用を示す。

ＨＩＴＴ−１５細胞（ＨＩＴ細胞、アメリカン・タイプ・ティッシュ−・コレク ション、ロックビル、メリーランド、Ｒ，Ｆ、サンテレ等、（１９８１）、「ブ ロシーデインダス・オン・ザ・す／ヨナル・アカデミ−・オン・サイエンシーズ ・オン・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オン・アメリカ」、７８．４３３９−４ ３４３）を、１０％うま血清（ジェミニ・バイオプロダクツ、カラバサス、カリ フォルニア）、２．５％胎児うし血清（Ｆ　Ｂ　Ｓ。

ジエミニ）、２ミリモルのし一グルタミンおよび１Ｏ００ミリモルのグルコース を含むハムのＦ−１２培地（アービン・サイエンティフィック、サンタアナ、カ リフォルニア）中で選録に継代培養した。細胞を３７°Ｃおよび５％ＣＯ２／９ ５％加湿空気中に維持し、培地を２〜３日毎に交換した。実験は全て、６６〜７ １継代の細胞により行なわれた。

特記しない場合は、分析用試薬を用いてアミリンおよびインシュリン分泌を測定 した。分泌媒質は、ｐＨ７，４で１１９ミリモルのＮａｃｌ、４．７４ミリモル のＫＣＩ、２．５４ミリモルのＣａＣ１，，１゜１９ミリモルのＭｇ５Ｏい　１ ．１９ミリモルのＫＨ，ＰＯい２５ミリモルのＮ　ａ　ＨＣＯｈ、１０ミリモル のＨＥＰＥＳおよび０．１％プロテアーゼ不含有うし血清アルブミン（コーン・ フラクション■、ングマ・ケミカル・カンパニー、セントルイス、ミズーリ）を 含むタレブスーリンゲル緩衝液（ＫＲＢ）であった。最初にグリベンクラミド（ ングマ）をエタノール（５０ｍｇ／ｍｌ）に溶かし、次いでＫＲＢ中で作業濃度 に希釈した。試験溶液中のエタノール濃度は０．０１％（Ｖ／ｖ）未満であり、 トリパン・ブルー排除により測定された通りグルコース誘発性分泌応答または細 胞生存能力に影響を与える濃度ではなかった。トルブタミド（シグマ）を最初に ジメチルスルホキシド（５０ｍｇ／ｍｌ）に溶かした。試験溶液中のＤＭＳＯ濃 度は０．０３％（ｖ／Ｖ）未満であり、分泌応答に影響を与える濃度ではなかっ た。メトホルミン（ングマ）をＫＲＢ中で希釈した。

各分泌試験の５日前、細胞を、２４ウ工ル組織培養プレート（コーニング・グラ ス・ワークス、コーニング、ニューヨーク）中０．２６Ｘ１０’細胞１０．８ｍ ｌ培地／ウェルの割合で継代培養した。培地を３日目に交換した。５日目に、細 胞を１．ｏｍｌのＫＲＢで２回洗浄し、次いで空気と平衡状態にある１、Ｏｍｌ のＫＲＢ中で（３０分、３７℃）インキュベーションした。指示濃度のグルコー ス、メトホルミン、トルブタミドおよびグリベンクラミドを含む０．５ｎ＋ｌの ＫＲＢを加える前に、細胞をさらに２回洗浄した。試験物質（複数もあり得る） との６０分インキュベーション後、上清を遠心分離（５分間、５００Ｘｇ、５° Ｃ，ＧＰＫＲ遠心分離、ベックマン・インスツルメント、インコーホレイテッド 、パロアルト、カリフォルニア）することにより、細胞層を除去し、次いで、ラ ジオイムノアッセイによる分析までポリプロピレン・マイクロ試験管（ブリンク マン・インスツルメント・カンパニー、ウェストバリー、ニューヨーク）中−２ ０°Ｃで貯蔵した。採集の１週間以内に上清をインシュリンおよびアミリン含有 量について分析した。１プレート当たり３ウエルを無作為に選択した。細胞を１ ５０μｌの規定食塩水中７５μｇトリプシンおよび３０μｇのＥＤＴＡとインキ ュベーション（８分、３７０Ｃ）シ、次いでクールター・カウンター（Ｚｆモデ ル、クールター・エレクトロニクス、ヒアリー、フロリダ）で計数した。

市販されているラジオイムノアッセイ（ＩＭ、７８、アマ−ジャム、アーリント ン・ハイツ、イリノイ）を用いて、上溝中の免疫反応性イン／ニリン含有量を測 定した。上溝中の７Ｘムスター・インシュリンを、０．５０〜１．７０ピコモル ／ｍｌの範囲のヒト標準物質と共希釈した。免疫反応性アミリンに関するラジオ イムノアッセイを次の要領で行った。検定希釈剤は、ｐＨ７，４で０．１％トリ トン−ＸＩｏｏ（ｖ／ｖ）、０．０１％ＮａＮ５（Ｗ／Ｖ）および０．１％ゼラ チン（ｖ／ｖ１テレオステアン、４５％水溶液、７グマ）を含む燐酸緩衝食塩水 （ＰＢＳ、１３７ミリモルのＮａＣｌ、２，６８ミリモルのＫＣＩ、１．４７ミ リモルのＫＨ２ＰＯ，，６，６５ミリモルのＮａ２ＨＰ　Ｏ＋）であった。イン キュベーションは全て、４°Ｃで行なわれた。１２″’　Ｉ　−［Ｔｙｒ３７］ −ヒト合成アミリントレーサーをクロラミン−下方法によりヨウ素化し、Ｃ１８ セプーバツク（ウォーターズ・アソーシエーツ、ミル７オード、マサチューセッ ツ）で精製した。比活性は約５００μＣｉ／μｇであつｔ二。

１００／７１のヒト合成アミリン標準（５０−１２００ｐｇ／ｍ１ＫＲＢ。

ベイケム、インコーホレイテッド、トランス、カリフォルニア）マたは未知の試 料を、アミリンに特異的なポリクローナルうさぎ抗血清（１：２００００、ペニ ンスラ・ラボラトリーズ、インコーホレイテッド、ベルセント、カリフォルニア ）と合わせた。ヒトインシュリン、グルカゴン、ソマトスタチン、すい臓ポリペ プチドまＩこはカルＶ′トニン遺伝子関連ペプチ白Ｉとの検出可能な交差反応性 は観察されなかった。１２Ｘ７５ｍｍポリスチレン管（サルステッド、ヘイワー ド、カリフォルニア）中ラット・カルシトニン遺伝子関連ペプチドＩ）との交差 反応性は≦０．１％であった。標準および未知物質を各々トリプリケイトまたは デュプリケイトで検定した。１８時間のインキュベーション後、１００μｌのト レーサー含を２００００ｄｐｍを加え、試料をさらに１８時間インキュベーショ ンした。アミリン：抗体複合体の完全な免疫沈澱を確保するため、１００μｌの うさぎガンマ・グロブリン（０，３５ｍｇ／＋ａｌ、スキャンティポディーズ・ ラボラトリ−・、サンティー、カリフォルニア）および１００μｍのやぎ抗うさ ぎガンマ・グロブリン（０，５０ｍｇ／ｎ＋１、精製品、スキャンティボディー ズ）を加えた。１５分のインキュベーション後、検定緩衝液中１．０ｍｌの２％ ポリエチレングリコール（ｗ／ｖ、　分子量８０００、ングマ）を加え、試料を 遠心分離（３０分、１５００Ｘｇ、５°Ｃ）シた。試料を傾け、沈澱物をガンマ 計癒管（モデル１２７７、ＬＫＢワラツク、ツルク、フィンランド）で計数した 。

図２は、非標識ヒトアミリンによる”Ｊ−［Ｔｙｒ３７］ヒトアミリンの置換に 関する典型的標準曲線を示す。アミリンのラジオイムノアッセイは、８Ｉ）ｇア ミリン／ｍｌの感度および２００〜８００　ｐｇ／ｍ１の直線範囲ををした。ハ ムスターアミリンを、直線範囲におけるヒトアミリンと共希釈した。ＨＩＴ細胞 上清に加えられたヒトアミリンの収率は、この範囲内では１００土１５％であっ た。グリベンクラミド（１マイクロモル）、メトホルミン（１００マイクロモル ）およびトルブタミド（１００マイクロモル）は、置換曲線に対して全く影響を 及ぼさなかった。

図３および４におけるデータは、４反復試料の平均±Ｓ、Ｄ、とじて示されてい る。非両側スチューデントのむ一検定を用いて、血糖降下剤の非存在および存在 下における分泌を比較した（スタットビュー５１２＋プログラム、ブレーン・パ ワー、インコーホレイテッド、カラバサス、カリフォルニア）。

図３は、０−グルコース（基礎放出）および１０ミリモルのグルコース（グルコ ース刺激性分泌）におけるＨＩＴ細胞からのインシュリン放出に対する、各々２ つの濃度でのメトホルミン、トルブタミドおよびグリベンクラミド（「グリブリ ド」として知られている場合もある）の作用を示す。各実験とも、対照（薬剤無 し）条件下、ｌ（Ｈリモルのグルコースは、インシュリン分泌の４〜５倍増加を 誘発し、すい臓インシュリン分泌に典型的なグルコース応答性を示した。図３ａ は、治療血しょう濃度範囲（クリップＡおよびリークーＬ、Ａ、、１９９０、「 ダイアベーラ」、１３：６９６−７０４）内における１０および１００マイクロ モルのメトホルミンが、インシュリン分泌に対して測定可能な影響を及ぼさなか ったことを示す。反対に、１００マイクロモルのトルブタミド並びに０．１およ び１．０マイクロモルのグリベンクラミドは、インシュリンの基礎およびグルコ ース刺激性の両分泌を顕著に増加させた。比例的増加は基礎放出に関する方が大 きく、グリベンクラミドの場合２倍より大きかったが、絶対的増加はグルコース 刺激性放出に関する方が大きかった。グリベンクラミドは、トルブタミドの場合 よりかなり低い濃度で作用を示し、ＮＩＤＤ〜１患者の処置においてトルブタミ ドがグリベンクラミドと比べてかなり高い用量を必要とすることと一致した。

図４は、アミリン分泌に対するメトホルミン、トルブタミドおよびグリベンクラ ミドの作用を調べた３つの独立した実験を示す。各実験とも、コントロール条件 下で、ｌＯミリモルのグルコースが２゜５〜４倍アミリン分泌を増加させたこと が示されている。これらの結果は、摘出したしん出すい臓に関して示された通り （小川等、１９９０、「ジャーナル・オン・クリニカル・インベスティゲーショ ン」、８５：９７３−９７６）、ＨＩＴ細胞がアミリンを分泌し、グルコースに 応じて分泌を増加させることを示している。図４ｂおよび４ｃは、スルホニル尿 素化合物、トルブタミドおよびグリベンクラミドが、図３においてそれらのイン シュリン分泌刺激作用が観察されたときと同じ濃度で、基礎およびグルコース刺 激性アミリン分泌の両方を顕著に高めることを示す。アミリン分泌の比例的増加 は基礎条件ではさらに大きく、グリベンクラミドの場合約２倍であった。すなわ ち、スルホニル尿素化合物は、血しょうインシュリン・レベルを高めることによ りそれらの主たる治療効果を生じるが、現在、インシュリン抵抗を誘発する血糖 上昇性ホルモンであるアミリンの分泌を増加させることが立証された。

実施例８ ＨＩＴＴ−１５細胞（ＨＩＴ細胞、アメリカン・タイプ・ティシュ−・コレクシ ョン、ロックビル、メリーランド）を、１０％うま血清（ジエミニ・バイオプロ ダクツ、カラバサス、カリフォルニア）、２．５％胎児うし血清（ＦＢＳ、ジェ ミニ）、２ミリモルのし−グルタミン、ｌｏ’［ＵのペニシリンＧ／Ｉ、ｌ　Ｏ Ｏｍｇのストレプトマイシン／１および１Ｏ１０ミリモルのグルコースを含むハ ムのＦ−１２培地（アービン・サイエンティフィック、サンタアナ、カリ７オル ニア）中で選録に継代培養した。細胞を３７°Ｃおよび５％ＣＯ２／９５％加湿 空気中に維持し、培地を２〜３日毎に交換した。実験は全て、６２〜７１継代の 細胞により行なわれた。

各分泌試験の５日前、細胞を、２４ウ工ル組織培養プレート中ｌウェルに対し培 地０．８ｍｌ当たり０．２６Ｘ１０’細胞の割合で継代培養した。３日目に培地 を交換した。５日目に、細胞を１．０プレートにより２回洗浄した。培地を３日 目に交換した。５日目に、細胞を、ｐＨ７，４で１１９ミリモルのＮａＣｌ、４ ．７４ミリモルのＫＣｌ、２．５４ミリモルのＣａＣ１□、■、１９ミリモルの ＫＨ２ＰＯ，，２５ミリモルのＮａＨＣＯ，，１０ミリモルのＨＥＰＥＳおよび ０゜１％のプロテアーゼ不含有うし血清アルブミン（コーン・フラクションｖ１ 　シグマ・ケミカル・カンパニー、セントルイス、ミズーリ）を含む１．Ｏｍ＋ のタレブスーリンゲル緩衝液（ＫＲＢ）により２回洗浄した。洗浄後、１．Ｏａ ＋ＩのＫＲＢを加え、プレートを、空気との平衡状態下３７°Ｃで３０分間イン キュベーションした。指示濃度のグルコース、アルギニン、ソマトスタチンまた はグルカゴン（シグマ）を含む０．５ｍｌのＫＲＢを加える前に、細胞をさらに ２回洗浄した。

グルカゴンのストック溶液は、３００ＴＩＵアプロチニン／ｌ（アフィニティー 精製、シグマ）を含んでいた。試験物質との６０分インキュベーション後、上溝 を遠心分離することにより細胞層を除去し、次いで一２０°Ｃで貯蔵した。上溝 に対し、採集の１週間以内にラジオイムノアッセイによりインシュリンおよびア ミリン含有量について分析した。■プレート当たり３つのウェルをトリプンン処 理し、クールター・カウンター（Ｚｆモデル、クールター・エレクトロニクス、 ヒアリー、フロリダ）を用いてｌウェル当たりの細胞を定量した。

データは、対照（試験物質が存在せず）に対する、放出されたホルモンのピコモ ル数／ｌＯ“細胞における変化パーセンテージとして、または放出されたアミリ ンのモル数／１モルのインシュリン／１０６細胞／時間（Ａ／Ｉ比）として表さ れる。

市販されているラジオイムノアッセイ（ＩＭ、７８、アマ−ジャム、アーリント ン・ハイツ、イリノイ）を用いて、上溝中の免疫反応性インシュリン含有量を測 定した。ヒトインシュリン標準物質をＫＲＢ中で製造した。上溝中のハムスター インシュリンを、０．５０〜１．７０ピコモル／ｍｌの範囲におけるヒト標準と 共希釈した。免疫反応性アミリンに関するラジオイムノアッセイは、上記実施例 ７の記載と同様であった。

アミリンのラジオイムノアッセイは、８ｐｇアミリン／ｍｌの感度および２００ 〜８００ｐｇ／ｍｌの直線範囲を有した。変動の検定内および検定間係数は、各 々５％および９％であった。ハムスターアミリンを、直線範囲においてヒトアミ リンと共希釈した。ＨＩＴ細胞上清に加えられた増量のヒトアミリンの収率は、 この範囲内で１００±１５％であっｊこ。グルカコ゛ン（５マイクロモル）およ びソマトスタチン（１００ナノモル）は、ハムスターアミリンの置換曲線に対す る影響を全く示さなかった。図５に示されている通り、グルコースは、用量依存 方式でＨＩＴ細胞からのアミリンおよびインシュリン分泌を刺激した。両ホルモ ンに関する半最大応答（ＥＣ，。）は、約２ミリモルのグルコースであった。最 大分泌は２０ミリモルのグルコースで行なわれた。グルコース増加に応じたアミ リンおよびインシュリン分泌の変化の間には強い相関関係が存在した（ｒ＝０． ９５２、ｐく０．０００１）。平均Ａ／Ｉ比は、試験されたアルギニン濃度範囲 において０．４４±０．０２であった。

アルギニンはまた、用量依存方式でアミリンおよびインシュリン分泌を刺激した （図６）。最大分泌応答は、これらの条件下では観察されなかった。アルギニン 増加に応じたアミリンおよびインシュリン分泌における傾向は同一であった（ｒ ＝０．９２６、ｐ＜０．０００１）。平均Ａ／Ｉ比は、試験されたアルギニン濃 度範囲において０゜４４±０．０２であった。アルギニンは、摘出した潅流ラッ トすい臓からのグルコース刺激性分泌を強化することが示された。さらに、この 強力な分泌促進物質の組み合わせは、グルコースまたはアルギニン単独に対して Ａ／Ｉ比を増加させた。グルコース→−アルギニンがＨＩＴ細胞からのアミリン およびインシュリンの分泌を分離し得るか否かを測定するため、１０３９モルの グルコースまたは１５ミリモルのアルギニン単独または組み合わせに対する分泌 応答を評価した（図７）。分泌促進物質の組み合わせに対する分泌応答は、アミ リンおよびインシュリンの両方に関する個々の応答の合計より多かった。しかし ながら、いずれかの分泌促進物質に対して単独グルコースおよびアルギニンのさ らに強力な組み合わせの場合でも、Ａ／１比は増加しなかった（グルコース：０ ．３２±ｏ、ｏ　ｉ、アルギニン：０．４１±０．０５、グルコース＋アルギニ ン：０．３４±０．０１．　ｎ＝３）。

アミリンおよびインシュリン放出のグルカゴンおよびソマトスタチ〉・による変 調。図８に示されている通り、グルカゴンは、１．２５ミリモルのグルコースお よび１．２５ミリモルのアルギニンにより始動されたＨＩＴ細胞からのアミリン およびインシュリン放出をともに促進した。しかしながら、促進性は用量依存的 であり、グルカゴンがさらに大きな分泌速度を誘発した結果、グルカゴンの増加 に伴いＡ／Ｉ比は適度に減少した（表１）。

ソマトスタチンは、１０３９モルのグルコース＋１５ミリモルのアルギニンによ り攻撃したＨＩＴ細胞からのアミリンおよびインシュリン放出をともに抑制した （図９）。アミリンおよびインシュリン分泌の減少は、ソマトスタチン増加と比 例しており（ｒ＝　０．９９１　ｓ　ｐ＜０．０００１）、Ａ／Ｉ比は、試験さ れたソマトスタチン濃度範囲において０．３６±０．０２で一定の状態であった 。

表１ 平均Ａ／Ｉ分泌比に対する漸増グルカゴン濃度の作用。

グルカゴン濃度（マイクロモル）　ｎ　Ａ／Ｔ比０．０　１４　０．３９±０． ０８ ０．０１　１５　０．３１０．１１ ０．１　１５　０．３５±０．１３ １．０　１５　０．３５±０６０９ ５．０　１６　０．２６土Ｏ，ＯＳ＋ Ａ／Ｉ比（平均上ＳＤ）は、ｎ個の個々のウェルについて測定された。データは 図５記載の実験から得られた。＋は対照（グルカゴンは存在せず）との顕著な差 異を示す、ＡＮＯＶＡ、デュ不ツトの試験、ｐ＜０．０５゜ 八３Ｓ　革陶／Ｅ／乍）が　双跡渭萼べＡ口（ＩＡ’保≠呈娶％ Ｆ／Ｇ、　３゜ グリブリド濃度ＰＭ 口０ｍＭグルコース ［］１０ｍＭグルコース Ｆ／Ｇ、　４゜ グリブリド濃度　ＰＭ 口Ｏｍ＃４グルコース ロｌ０ｍＭグルコース ★対照と顕著に相違　（血糖降下剤は存在せず）：Ｐ＜０．０２実験Ｎｏ、へＲ Ｑ’７３−’ｙ、斗　１’？ｔ？Ｑ４’７目３Ｃ）［３（％叩虜９準江：）鐙葺 ） 田専ζ士１ｆ宇 （％興虜９１校：；錯質） 田剪ｆ、士１ｆ宇 ホルモン放出（基礎に対する増加％） ロインシュリン ロアミリン （％圓組９革祥：！鐙胃） 用溝／ニー１−１を申 −ヱＵ Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｌτ−（Ｎ’Ｈ，）Ａｓ ｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−（ＮＨ２）Ｔｈｒ−Ｐ ｒｏ−（ＮＨ２） 国際調査報告 −轡−嚇−＾−−ｕｂ＠ａ　１４ａ、　ｐ（ゴΔｌ５９１１０５７６７！ｒ＋” −ｃａｒｎ＋ｔｉ＊ｎａｉ　５ｅａｒｃｈ　Ｒｅｐｏｒｔ　ｆｅｏｎｔｉｎｕｅ ｄ）Ｃ０ｒｊニーｕａｔｉＯｎ　りｆ　Ｖｍ、　０ｂ＝ｅｒｖｅｔｉｏｎｓ　Ｗ ｈｅｒｅ　Ｕｎｉｔ　Ｏｆ　ｒ＝′：＝ｒ九ヱフｉ　：＝鼠と江１ユニ ■、　Ｃ１ａｉｈ１１　１−８　ａｎｄ　１９−２フ、ｄｒｓｖｎ　ｔｏ　ａ　 ｗ＋ｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ａ　ｃりｍｐＯ＝＝＝二０ｎｆＣｒ　ｔｒｅｉｔｉｎ ｇ　ｎｃｎ−１ｒ＋＝ｕｌｉｎ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｄｉａｂｅｔｅｓ　＋５ ｅｌｌｉｔｕ（ＣＬａｇ＝ｉ？１＝■ Ｘ工、　ＣＬａ１ｍ５　ターｉａ、　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆ ｏｒ　ａｓ＋ｔａｙｉｎｇ　ａｍｙＬｉｎ＝ｏｎｅｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｉｎ 　ｖｉｖｏ、　ｃｌａｇｓｉｆｉｅｄ　ｉｎ　Ｃｌａｉｍ　４２４．　ｓｕｂｃ ｌｍｇｓ　９゜？！：、ＣＬａ１ｍ５　２４−コＢ、ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　＋ ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｇｅｎｔｓ　ｔＯｔｒｅａｔ　 ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｐｌａｇｍａ　ｃｏｎｅｅｎｔｒａｔｉｏｎａｗ　ｏｆ　− 一γ１工ｎ、ｅｉａｒｇｉ？ｉｅｄ　Ｌｒ。

Ｔｈｅ　１ｎｖｅｎｔｉｏｎＢ　ｌｉｇｔｅｄ　ａｓ　Ｇｒｏｕｐｓ　工Ｔ　Ｘ Ｍ、ａｎｄ　Ｘエエ　ｄｏ　ｎｏｔ　ｍｅｅ＋−ｔｈｅ　ｒｖｑｕｉｒｅｍｅｎ ｔｓ　ｆｏｒ　Ｌｌｎｉｔｙ　ｏｆ　ＸｎｖｅｒｔＬｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｆ ｏｌよａｗｉｎｇＴｈｅ　ｔｈｒｔＩｅ　ｍｅｔｈｏｄｇ　ａｒｅ　ａｐｐｌｉ ｅｄ　ｉｎ　ａ　＋５ａｔｅｒｉａｉｉｙ　ｄｉｆ工ｅｒ＝ｎｔｍａｎｎｅｒ　 ｔｏ　ＩＩｃｈｉｅｖｅ　ｍａｔｅｒｉａｌｌｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｅｓｕ ｉｔｍ、　Ｔｈｅ　ｔ？、：＊＝ｍｅｔｈｏｄｓ　ｈａｖｅ　ａｅｑｕｉｒｅｄ 　ａ　５ｅｐａｒａｔｅ　５ｔａｔｕｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｒｔ　ａｍ　ｓｈｏ ｗｎ　！＋ｙｔｈｅｉｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｅｌａｇｇｘｆｉｃａｔｉｏｎ 、　ＰＣＴ　Ｒｕ１ｅ　１コ　ｄｏｅｓ　ｎｏｔ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｆｏ■ ｐｌｕｒａｌ　ｄｉｓｔ４ｎｅ＋　ρｒｏｅｅｓｓｅ＊。

フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３８／２３ Ｉ

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. （１）患者における非インシュリン依存性または２型真性糖尿病の処置方法であ って、アミリンの血しょう濃度を高める血糖降下剤を前記患者に投与することを 含み、血糖降下剤が治療有効量のアミリンきっ抗物質と組み合わせて投与される 方法。
2. （２）アミリンの血しょう濃度を高める血糖降下剤がスルホニル尿素血糖降下剤 である、請求項１記載の方法。
3. （３）スルホニル尿素血糖降下剤が同じくインシュリンの血しょう濃度も高める 、請求項２記載の方法。
4. （４）スルホニル尿素血糖降下剤がグリベンクラミドである、請求項２記載の方 法。
5. （５）スルホニル尿素血糖降下剤がトルブタミドである、請求項２記載の方法。
6. （６）高血糖症の処置に有用であり、前記処置で投与された結果、循環している アミリンのレベルを増加させる血糖降下剤の血糖低下作用を高める方法であって 、血糖降下剤と共に治療有効量のアミリンきっ抗物質を投与することを含む方法 。
7. （７）血糖降下剤およびアミリンきっ抗物質が一緒に投与される、請求項１−５ または６のいずれか１項記載の方法。
8. （８）血糖降下剤およびアミリンきっ抗物質が一緒には投与されない、請求項１ −５または６のいずれか１項記載の方法。
9. （９）スルホニル尿素血糖降下剤によりアミリンの血しょう濃度の増加が誘発さ れる患者または患者のサブグループの決定方法であって、 （ａ）患者（複数もあり得る）に対する有効量のスルホニル尿素血糖降下剤の投 与、 （ｂ）予め定められた時点（複数もあり得る）での患者（複数もあり得る）にお ける血しょうアミリン濃度の評価であって、アミリン検定法の使用により行なわ れる評価 を含む方法。
10. （１０）血糖降下剤療法による患者の処置のモニターまたは評価方法であって、 予め定められた時点（複数もあり得る）での患者における血しょうアミリン濃度 の評価を含み、有効量の血糖降下剤を患者に投与後、アミリン検定法の使用によ り評価が行なわれる方法。
11. （１１）アミリン検定法がアミリン結合検定法である、請求項１０記載の方法。
12. （１２）アミリン結合検定法が免疫検定法である、請求項１１記載の方法。
13. （１３）血しょうアミリン濃度の評価が定性的である、請求項１２記載の方法。
14. （１４）血しょうアミリン濃度の評価が半定量的である、請求項１２記載の方法 。
15. （１５）血しょうアミリン濃度の評価が定量的である、請求項１２記載の方法。
16. （１６）血糖降下剤がスルホニル尿素血糖降下剤である、請求項１０−１４また は１５のいずれか１項記載の方法。
17. （１７）血糖降下剤がビグアナイド血糖降下剤である、請求項１０記載の方法。
18. （１８）ビグアナイド血糖降下剤がメトホルミンである、請求項１７記載の方法 。
19. （１９）医薬的に許容し得る担体中に、アミリンの血しょう濃度を高める血糖降 下剤およびアミリンきっ抗物質の治療有効量を含む組成物。
20. （２０）アミリンの血しょう濃度を高める血糖降下剤がスルホニル尿素血糖降下 剤である、請求項１９記載の組成物。
21. （２１）アミリンの血しょう濃度を高める血糖降下が同じくインシュリンの血し ょう濃度も高める、請求項１９記載の組成物。
22. （２２）スルホニル尿素血糖降下剤がグリベンクラミドである、請求項２０記載 の方法。
23. （２３）スルホニル尿素血糖降下剤がトルブタミドである、請求項２０記載の方 法。
24. （２４）高血糖症に関連した状態の処置に有用であり得る薬剤に関する評価また はスクリーニング方法であって、アミリンレベルがモニターされ得る第一生物系 と１種またはそれ以上の薬剤を一緒に合わせ、生物系におけるアミリンのレベル に対する薬剤（複数もあり得る）の作用を測定することを含む方法。
25. （２５）生物系が動物を含む、請求項２４記載の方法。
26. （２６）生物糸が細胞培養物を含む、請求項２４記載の方法。
27. （２７）細胞培養物が島ベータ細胞を含む、請求項２６記載の方法。
28. （２８）島ベータ細胞がＨＩＴＴ−１５細胞である、請求項２７記載の方法。
29. （２９）生物系が潅流したすい臓を含む、請求項２４記載の方法。
30. （３０）複数の薬剤を第一生物系と合わせ、生物系におけるアミリンのレベルに 対する作用を観察し、次いで、さらに１種またはそれ以上の薬剤をアミリンレベ ルが測定され得る第二生物系と合わせ、第二生物糸におけるアミリンのレベルに 対する薬剤（複数もあり得る）の作用を測定することを含む、請求項２４記載の 方法。
31. （３１）第一および第二生物系が同じである、請求項３０記載の方法。
32. （３２）アミリンレベルがアミリン結合検定法の使用により測定される、請求項 ２４−３０または３１のいずれか１項記載の方法。
33. （３３）高アミリン血症に関連した状態の処置に有用であり得る薬剤に関する評 価またはスクリーニング方法であって、アミリンレベルがモニターされ得る第一 生物系と１種またはそれ以上の薬剤を一緒に合わせ、生物系におけるアミリンの 分泌に対する薬剤（複数もあり得る）の作用を測定することを含む方法。
34. （３４）アミリンの基礎および／または分泌促進物質刺激性分泌に対する作用を 測定する、請求項３３記載の方法。
35. （３５）さらにインシュリンの分泌に対する薬剤（複数もあり得る）の作用の測 定を含む、請求項３４記載の方法。
36. （３６）生物糸が細胞培養物を含む、請求項３３記載の方法。
37. （３７）細胞培養物が島ベータ細胞を含む、請求項３６記載の方法。
38. （３８）島ベータ細胞がＨＩＴＴ−１５細胞である、請求項３７記載の方法。