JPH07502493A - Peptides corresponding to antigenic determinants of HTLV - Google Patents
Peptides corresponding to antigenic determinants of HTLVInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】 ＨＴＬＶの抗原決定基に対応するペプチド〔発明の背景〕 １、技術分野 本発明は、一般的には免疫性調整物に関し、より具体的には、Ｉ型または■型ヒ トＴ細胞白血病ウィルス（ＢＴＬＶ）のエンベロープ蛋白の抗原決定基に対応す るアミノ酸配列を具備した合成ペプチド及びこれを含む免疫性組成物に関する。[Detailed description of the invention] Peptides corresponding to antigenic determinants of HTLV [Background of the invention] 1. Technical field TECHNICAL FIELD This invention relates generally to immune modulators, and more specifically to immunomodulators for type I or type II humans. It corresponds to the antigenic determinant of the envelope protein of human T-cell leukemia virus (BTLV). The present invention relates to a synthetic peptide having an amino acid sequence and an immunological composition containing the same.
２、背景情報 ）ＩＴＬＶ−１，オヨび）ＩＴＬＶ−１１は、胸腺由来（７） （Ｔ）リンパ球 に選択的に感染する、外因性かつ天然に存在するヒトレトロウィルスである。Ｈ ＴＬＶ−１，およびＩＩＴＬＶ−１１は、成人Ｔ細胞白血病およびリンパ腫（Ａ ＴＬＬ） ｆＰｏｉｃｓｘ ｒｌ ａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａ口、Ａｃｘｄ。2. Background information ) ITLV-1, Oyobi) ITLV-11 is a thymus-derived (7) (T) lymphocyte. is an exogenous, naturally occurring human retrovirus that selectively infects humans. H TLV-1, and IITLV-11 are commonly used in adult T-cell leukemia and lymphoma (A TLL) fPoicsx rl al, Proc, Na mouth, Acxd.
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７７：７４１５． １９８０： Ｋａｌｙａｎａ＋ａｍａｎ ｓｆ ａｌ、 ５ｃｉｅｎｃｅ２１８：５７１． １９８２）（７）原因物質 である。人間におけル１１ＴＬＶ−１感染には“ｌ接状態”の前白血病状態が伴 っている。その状態は明かな進行性ＡＴＬＬに進むが、あるいは、何年も変化し ないままでいる（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｌ ａｌ、Ｂｌｏｏｄ ６２： ７５ ８． １９８３）。ＡＴＬＬ発病前のみかけ上の潜伏期間が長いことは、健康な りＴＬＶ−１陽性キヤリアによる感染の拡大、並びにウィルスに接触したキャリ アの確認を含む疫学上の重要な問題を提示する。ＩＩＴＬＶ−１は性交、静脈内 薬物投与器具の共同使用、乳房ミルクおよび子宮内もしくは分娩時（ｐｒｒｉｐ ａｒｌｕｍ）の接触によって伝染され得る（Ｗｏｎｇ−５…Ｉ ａｎｄ Ｇａ１ ｌｏ Ｎａｊｕｒｅ ３１７：３９５． １９８５） ｏ現在のところ、感染し たヒトからＩＩＴＬＶ−１を排除する方法、またはウィルス感染あるいは疾病の 進展を防御する方法はない。ＡＴＬＬに加えて、）ＩＴＬＶ−１は熱帯性症ψ性 不全対麻痺（Ｇｅｓｓａｉｎｅｌａｌ、Ｌａｎｃｅｔ ＩＩ：６９８． １９８ ６）、慢性進行性を髄障害（Ｏｓａｍ＊ ｅｌａｌ、 Ａｎｎ、 Ｎｅｕ＋ｏ１ ．２１；１１７． １９８７） 、多発性硬化症（Ｘｏｐ＋ｏｗｓｋｉ ｅｌ ａｔ、ＮａｔｕＩｅ ３］８： １５４１９８５） 、非ホジキンリンパ腫、１ ９８７）にも関連している。ＩＩＴＬＶ−１１はまた、ヘアリー〇セル白血病の Ｔ細胞変種と呼ばれる珍しい形態の慢性白血病（Ｋａｌｙａｎａｒａｍａｎｒｔ ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ、２１８：４７１． １９８２）にも関連している。Sci, USA 77:7415. 1980: Kalyana+aman sf al, 5science218:571. 1982) (7) Causative substance It is. Le11TLV-1 infection in humans is accompanied by a pre-leukemic state. ing. The condition progresses to frank progressive ATLL, or it changes over the years. It remains as it is (Yamaguchi el al, Blood 62: 75 8. 1983). The apparent long incubation period before the onset of ATLL suggests that the The spread of infection due to TLV-1 positive carriers and carriers who have come into contact with the virus. We present important epidemiological questions, including the confirmation of A. IITLV-1 is intercourse, intravenous Shared use of drug administration devices, breast milk and intrauterine or intrapartum (prip) arlum) can be transmitted by contact (Wong-5…I and Ga1 loNajure 317:395. 1985) Currently, there are no infections How to eliminate IITLV-1 from infected humans, or how to prevent viral infection or disease. There is no way to defend against progress. In addition to ATLL, ITLV-1 is a tropical disease. Paraplegia (Gessaineral, Lancet II:698.198 6), chronic progressive myelopathy (Osam*elal, Ann, Neu+o1 ．． 21;117. 1987), multiple sclerosis (Xop+owskiel) at, Natule 3] 8: 1541985), non-Hodgkin's lymphoma, 1 987). IITLV-11 is also used in hairy cell leukemia. A rare form of chronic leukemia called T-cell variant (Kalyanaramanrt al, 5science, 218:471. 1982).
ＨＴＬＶ−１は世界的な分布を有しているが、局在した風土病的１３４・２１５ ． １９８４）、および他の領域で確認されている。ＨＴＬＶ−１１の血清学的 陽性の広かりは増大しているか（Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔｅｌ ａｔ、Ｎｅｗ Ｅ ｎｇｌ、Ｊ、 Ｍｅｄ、３１５＋３７２． １９８６） 、ＨＴＬＶ−１ｆ （ ７）疫学はあまり知られていない。同様に、）ＩＴＬＶ−１の血清学的陽性の割 合は、ニューヨーク（９％、 Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆｆ ｅｆ ａｌ、Ｊ、 Ａｍ。HTLV-1 has a worldwide distribution, but localized endemicity134,215 ．． (1984), and other areas. Serology of HTLV-11 Is the prevalence of positivity increasing (Rosenblattel at New E ngl, J, Med, 315+372. 1986), HTLV-1f ( 7) Epidemiology is not well known. Similarly,) the percentage of serologically positive ITLV-1 New York (9%, Robert-Guroff, J. Am.
Ｍｅｄ、Ａｓ５ｏｃ、２５５： ３Ｎ３． １９８６） 、及びニューオーリン ズ（４９％、 ｔＷｅｉｓｓ ｅｌ ａｌ、Ｐｔｏｃ、Ａｍ、Ｓｏｃ、Ｃｌ１ｎ 、Ｏｎｅ、６：５． １９８７））では静脈内への薬物乱用者において増加して おり、また二ニーヨーク（９％、Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ、Ｊ 、 Ａｍ、 Ｍａｄ、 Ａｓ５ｏｃ、２５５；３１３３、 １９８６）、チャペ ルヒル、ノースキャロライナ（１３％（Ｈａｙｎｅｓ ｒｌ ａｌ、 Ｃｌ１ｎ Ｒｅｓ、 ３３：３４２Ａ、１９８５））では血液製剤の輸血を受けている患 者において増加している。Med, As5oc, 255:3N3. 1986), and New Orleans (49%, tWeiss el al, Ptoc, Am, Soc, Cl1n , One, 6:5. (1987)) showed an increase in intravenous drug abusers. Also, two knee yoke (9%, Robert-Guroll et al, J , Am, Mad, As5oc, 255; 3133, 1986), Chape Le Hill, North Carolina (13% (Haynes rl al, Cl1n Res, 33:342A, 1985)), patients receiving transfusions of blood products. It is increasing in the number of people.
最近、Ｒａｌｅｉｇｈ、 ＮＣからの６人の集団について、ＩＩＴＬＶ−１に対 する抗体を保持していることが確認された ｆＷｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ前白血病 徴候を示唆する異常な循環リンパ球を保持していた。Recently, a group of 6 people from Raleigh, NC were tested against IITLV-1. It was confirmed that patients with Weinberg et al. He had abnormal circulating lymphocytes suggestive of symptoms.
その後、−人の患者が成人Ｔ細胞白血病で死去しており、６人全員がＨＩＶにつ いては血清学的陰性であった。ニューヨークおよびニューオーリンズにおける血 清学的陽性率の増加と共に、この集団での知見は、ＨＴＬＶ−１についての信頼 できる診断試験、並びに未感染個体のための防御ワクチンが緊急に必要であるこ とを強調している。-0 patients have since died of adult T-cell leukemia, all six of whom died from HIV-related disease. All cases were serologically negative. Blood in New York and New Orleans The findings in this population, along with increasing serum positivity rates, increase confidence in HTLV-1. There is an urgent need for diagnostic tests and protective vaccines for uninfected individuals. It emphasizes that.
生産物を含むワクチンが防御的に有用であろうことが指摘されているが、現在の ところ、ＨＴＬＶ−１に対して使用可能なワクチンは存在しない。ＩＩＴＬＶ− １エンベロープ遺伝子は、６３〜６７キロダルトン（ｋｄ）の糖蛋白前駆体をコ ードしており、該前駆体は蛋白加水分解により加工されて、成熟ｇｐ４６外部エ ンベロープ糖蛋白および２１ｋｄのトランスメンブラン蛋白を生じる（Ｌｅｃｅ ｌ ａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、 ８１：３８５ ６． １９８４）。It has been pointed out that vaccines containing these products would be useful for protection, but the current However, there is no vaccine available for use against HTLV-1. IITLV- 1 envelope gene encodes a 63-67 kilodalton (kd) glycoprotein precursor. The precursor is processed by proteolysis to produce the mature gp46 external protein. produces an envelope glycoprotein and a 21 kd transmembrane protein (Lece l al, Proc, Natl, Acad, Sci, USA, 81:385 6. 1984).
Ｋｉｙｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ （Ｐｒｏｃ、Ｎａ１１． ＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、８１：６２０２゜１９８４）は、ＨＴＬＶ−１（７）全ｇｐ６３エンヘ ローフ前駆体分子ヲ、ｇｐ４６外部エンベロープ糖蛋白分子の１２アミノ酸以外 の全てを含むＮ末端部と、ｇｐ２１ ）ランスメンプラン分子のほとんど全てか らなるＣ末端部との二つの断片として、大腸菌中で発現させた。Ｋｉｙｏｋａｗ ａらは、ウサギＩＩＴＬＶ−１ｇｐ６３−？−ンベローブ前駆体のＮ末端および Ｃ末端部に対する抗血清を使用して、アメリカおよび日本のＢＴＬＶ−１の色性 型（ｐｓｅｕｄｏ１７ｐｅｓ）の両方を中和した。Ｂｏｓｈｉｎｏら （ｌｎ１ ． Ｊ、 Ｃｘｎｃｅ＋ ３６；７６］、 １９８５）は、この発見を抗−ｇｐ ２１抗血清によって確認した。要約すると、これらのデータは、ＩＩＴＬＶ−１ のエンベロープ上には少なくとも２つの中和部位がある事、即ち、第一は外部ｇ ｐ４６エンベロープ糖蛋白に関連し、第二はｇｐ２１ トランスメンブラン糖蛋 白に関連することを示している。さらに、大腸菌中で生産されるこれらＢＴＬ’ ／−１の組換蛋白はグルコシル化されていないので、糖鎖はこれらの中和部位の 必須成分ではない。Kiyokawa et al (Proc, Na11.^cad, Sci, USA, 81:6202°1984), HTLV-1(7) all gp63 enzymes. loaf precursor molecule, except for the 12 amino acids of the gp46 outer envelope glycoprotein molecule and almost all of the transmembrane molecule (gp21). It was expressed in E. coli as two fragments with a C-terminal end. Kiyokawa a et al. rabbit IITLV-1gp63-? - N-terminus of envelope precursor and Color properties of American and Japanese BTLV-1 using antiserum against the C-terminus. Both types (pseudo17pes) were neutralized. Boshino et al. (ln1 ．． J, Cxnce+ 36;76], 1985) confirmed this finding with anti-gp Confirmed by 21 antiserum. In summary, these data indicate that IITLV-1 There are at least two neutralization sites on the envelope of the g Related to p46 envelope glycoprotein, second is gp21 transmembrane glycoprotein Indicates that it is related to white. Furthermore, these BTL' produced in E. coli Since the recombinant protein /-1 is not glucosylated, the sugar chains are located at these neutralization sites. Not an essential ingredient.
従って、グリコジル化されていない構築物としての合成ペプチドが、ＢＴＬＶ− １のエンベロープに対する中和抗血清の産生に適しているように思える。日本お よびアメリカのＢＴＬＶ−１エンベロープに対するヒトまたは動物の抗血清は、 色性型分析において交差的に中和（ｃｒｏｓｓ−ｎｅｕｌ＋ａｌｉｘｅ）するで あろうから１１１１ＴＬＶ−１のエンベロープ抗原もまた世界的に単一血清型を 示すと思われる（Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ、Ｉｎ１． Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ ３２＋ ３２１． １９８３）。Therefore, if the synthetic peptide as a non-glycosylated construct is BTLV- It appears suitable for the production of neutralizing antisera against the envelope of 1. Japan Human or animal antisera against the and American BTLV-1 envelopes are cross-neutralize (cross-neul + alix) in chromotype analysis. Therefore, the envelope antigen of 1111TLV-1 also has a single serotype worldwide. (Nagy et al, In1. J, Cancer 32+ 321. 1983).
このように、ＨＩ Ｖの単離された特異的中和エピトープとは異なり、一つのＩ ＩＴＬＶ−Ｉ Ｌｌ離物に対する合成ワクチンは、他のＨＴＬＶ−１単離物に対 しても防御性を示すであろう。実際に、抗体または特異抗体を１（ＴＬＶ−１陽 性リンパ球の培養物に加えると、ウィルス抗原の発現を抑制できる事を実証し、 抗１１１ＴＬＶ−１抗体が１ｎ−ｖｉｖｏで防御を達成し得るメカニズムを示唆 した。Thus, unlike isolated specific neutralizing epitopes of HIV, one Synthetic vaccines against ITLV-I Ll isolates are effective against other HTLV-1 isolates. Even if it does, it will show defensiveness. In fact, one antibody or specific antibody (TLV-1 positive demonstrated that when added to a culture of sexual lymphocytes, it was possible to suppress the expression of viral antigens. Suggests a mechanism by which anti-111TLV-1 antibodies may achieve protection in 1n-vivo did.
これらのデータは、ＨＴＬＶ−１エンベロープ糖蛋白の一部分がヒトにおけるＨ ＴＬＶ−１への防御的な抗体価を誘導するワクチンとして使用され得るとの提案 を強力に支持するが、これらの研究では、重要なエピトープの配列は確認されて いない。These data indicate that a portion of the HTLV-1 envelope glycoprotein is Proposal that it could be used as a vaccine to induce protective antibody titers to TLV-1 However, in these studies, the sequences of important epitopes have not been confirmed. not present.
■ＴＬＶ−１とＩＩＴＬＶ−１１のエンベロープ糖蛋白間には配列の相同性か存 在するから、該配列を解明することはまた、ＨＴＬＶ−１１に対するワクチンに 含める重要なりＴＬＶ−１１エンベロープ糖蛋白のエピトープの確認を容易にす るであろう。■There is sequence homology between the envelope glycoproteins of TLV-1 and IITLV-11. Since it exists, elucidating the sequence could also lead to a vaccine against HTLV-11. It is important to include the TLV-11 envelope glycoprotein to facilitate identification of the epitope. There will be.
本発明の目的は、吐乳動物において、ＢＴＬＶ−１及びｌｌＴｌ、Ｖ−１１に対 する高力価中和抗体の産生を誘発することができる合成ペプチドであって、単独 もしくはキャリア分子に連結させた形で、および／またはポリマー化により形成 された分子凝集物の形で上記抗体の産生を誘発できる合成ポリペプチドを提供す ることである。 The purpose of the present invention is to suppress BTLV-1, llTl, and V-11 in mammals. A synthetic peptide capable of inducing the production of high titer neutralizing antibodies that or formed by linking to a carrier molecule and/or by polymerization. provide synthetic polypeptides capable of inducing the production of the above-mentioned antibodies in the form of molecular aggregates; Is Rukoto.
本発明のもう一つの目的は、哺乳類において■ＴＬＶ−１に対する防御的免疫を 誘発できるＩＩＴＬＶ−１エンベロープ蛋白の抗原決定基に対応したアミノ酸配 列を有するペプチドを含んだ、免疫原複合体を提供することである。Another object of the present invention is to develop protective immunity against TLV-1 in mammals. Amino acid sequences corresponding to antigenic determinants of the IITLV-1 envelope protein that can be induced An object of the present invention is to provide an immunogenic complex comprising a peptide having a sequence.
本発明の更なる目的は、哺乳類においてＴＩＴＬＶ−１１に対する防御的免疫を 誘発できるＨＴＬＶ−１１エンベロープ蛋白の抗原決定基に対応したアミノ酸配 列を有するペプチドを含んだ、免疫原調合体を提供するものである。A further object of the invention is to induce protective immunity against TITLV-11 in mammals. Amino acid sequences corresponding to antigenic determinants of the inducible HTLV-11 envelope protein The present invention provides an immunogenic formulation comprising a peptide having a sequence.
本発明の付加的な目的は、生物学的テスト試料中において、抗１１ＴＬＶ−１抗 体および抗）ＩＴＬｖ−１１抗体の存在を検出する方法を提供することである。An additional object of the present invention is to provide anti-11 TLV-1 anti- An object of the present invention is to provide a method for detecting the presence of anti-ITLv-11 antibodies.
これらのｌ」的、並びに以下の詳細な説明から当業者に明らかな他の目的は、ウ ィルス性原因物質ＩＩＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−１１にに・１する免疫反応を生 み出すのに有用な合成ペプチドを提供することによって達成された。These objectives, as well as other objectives that will be apparent to those skilled in the art from the detailed description below, are Generates a unique immune response to the viral causative agents IITLV-1 and HTLV-11. This was achieved by providing synthetic peptides useful for extraction.
本発明は、免疫原製剤および該製剤から作成されるワクチンに関する。ＩＩＴＬ Ｖ−１または）ＩＴＬＶ−１１の何れかのエンベロープ蛋白の抗原決定基に対応 するアミノ酸配列を持つ合成ペプチドは、直接またはスペーサ分子を介して適切 なキャリア分子に共有結合されることにより、免疫原１夏合体を形成する。−以 上のこれら複合体を合釘するワクチンか開示される。 The present invention relates to immunogenic formulations and vaccines made from the formulations. IITL Corresponds to the antigenic determinant of either envelope protein V-1 or ITLV-11 Synthetic peptides with amino acid sequences that The immunogen is covalently linked to a carrier molecule to form an immunogen complex. - Below A vaccine to dowel these complexes above is disclosed.
−ツ（７） ＱＱ 様１： ！６ Ｌ ’ で、本発明ハ、）ＩＴＬＶ−１（マ タハ１ｌＴＬＶ−！ｌ）のエンベロブ糖蛋白の抗原決定基に対応したアミノ酸配 列をもった合成ペプチドを具備し、該ペプチドは、単独またはキャリア分子と共 有結合した形で、哺乳類において、ＩＩＴｔＶ−１（またはＨＴＬＶ−１１）に 対する高力価の防御性抗体を誘発することカできる。本発明のペプチドは、ＨＴ ＬＶ−Ｉ（Ｓｅｉｋｉ ｅｆ ａｌ。-tsu (7) Mr. QQ 1: ! 6 L', the present invention C) ITLV-1 (Main) Taha1lTLV-! l) Amino acid sequence corresponding to the antigenic determinant of the envelope glycoprotein a synthetic peptide with a sequence, the peptide alone or in combination with a carrier molecule. In a bound form, IITtV-1 (or HTLV-11) in mammals. can induce high titers of protective antibodies against The peptide of the present invention is HT LV-I (Seiki ef al.
（Ｓｏｄｒｏｓｋｉ ｅｔ ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ ２２５：４２１． ＋９８ ４）におけるエンベＢｉｏ１． １５７：１０５． １９８２）に存在する抗原 決定基に対応する。(Sodroski et al, 5science 225:421. +98 4) Envelope Bio1. 157:105. 1982) corresponds to a determinant.
もう一つの態様において、本発明は削孔類中でＨＴＬＶ−１またはＩＩＴＬＶ− １１対する高力価の防御性抗体を誘発することができる免疫原調合体を具備し、 該１夏合体は、（ｉ）キャリア分子と、（１１）該キャリア分子に共有結合され た、ＩＩＴＬＶ−１（またはＩＩＴＬＶ−１１）のエンベロープ糖蛋白の抗原決 定基に対応したアミノ酸配列をもつ合成ペプチドとを具備する。In another embodiment, the invention provides HTLV-1 or IITLV- comprising an immunogenic formulation capable of inducing high titers of protective antibodies against 11; The 1 summer coalescence comprises (i) a carrier molecule and (11) covalently bonded to the carrier molecule. In addition, antigen determination of the envelope glycoprotein of IITLV-1 (or IITLV-11) A synthetic peptide having an amino acid sequence corresponding to the fixed group.
更に別の態様において、本発明は、上記ｎｒｔｖ−＋ （または１１ＴＬＶ−１ １）特異的複合体を免疫学的有効量で哺乳類に投与することを具備した、ＩＩＴ ＬＶ−１（またはＨＴＬＶ−１１）に対する免疫生じさせる方法を包含する。In yet another aspect, the present invention provides the above nrtv-+ (or 11TLV-1 1) IIT comprising administering an immunologically effective amount of a specific conjugate to a mammal. Includes methods of immunizing against LV-1 (or HTLV-11).
他の態様において、本発明は、生物学的テスト試料中における抗ＨＴＬＶ−１（ 抗ＨＴＬＶ−１１＞抗体の存在を検出する方法であって、該試料と本発明のペプ チドとを接触させることと、前記試料中の抗体と該ペプチドとの複合体を形成さ せることと、該複合体の形成を測定することとを具備した方法を包含する。In other embodiments, the invention provides anti-HTLV-1 ( A method for detecting the presence of anti-HTLV-11 antibodies, the method comprising: and forming a complex between the antibody in the sample and the peptide. and measuring the formation of the complex.
図１ ： ）ＩＴＬＶ−１陽性患者から１すた抗体の、ｇＮ６ｅｎｖにコードさ れた合成ペプチドに対する反応性。 Figure 1:) One antibody from an ITLV-1 positive patient encoded in gN6env. Reactivity to synthesized peptides.
図２ ： ＨＴＬＶ−１のエンベロープ糖蛋白ｇｐ４６およびｇｐ６３に対する 抗合成ペプチド抗血清の、イムノプロット分析における反 応性。Figure 2: HTLV-1 envelope glycoproteins gp46 and gp63 Anti-synthetic peptide antisera in immunoplot analysis. Responsiveness.
図３： イムノプロット分析における、抗ペプチド抗体のＢＴＬＶ−Ｉ ｇｐ４ ６に対する反応性の特異的阻害。Figure 3: Anti-peptide antibody BTLV-I gp4 in immunoplot analysis Specific inhibition of reactivity to 6.
図４Ａおよび４Ｂ 熱帯痙章性不全対麻痺（丁ＳＰ）に付随してＢＴＬＶ−１を もつ患者ＡからｆｊられたＦＩＬＤ−ＤＲ２制限細胞障害性Ｔ細胞系Ｐ−１０に ヨッテ認識すレル、ＢＴＬＶ−１ｇｐ４６（７）エピトープのマツピング。Figures 4A and 4B BTLV-1 associated with tropical spastic paraparesis (Ding SP) The FILD-DR2-restricted cytotoxic T cell line P-10 derived from patient A with Mapping of the BTLV-1gp46(7) epitope recognized by Yotte.
図５＝ 合成ペプチド５Ｐ−２を用いた、中和性抗ペプチド抗血清の吸収。Figure 5 = Absorption of neutralizing anti-peptide antiserum using synthetic peptide 5P-2.
図６ ＨＴＬＶ−１に対する中和抗体のペプチド吸収 図７ １１ＴＬＶ−ＩＴ細胞／Ｂ細胞ペプチド〔発明の詳細な説明〕 本発明は、ＢＴＬＶ−１の免疫原性エピトープに対応するペプチド、ＨＴＬＶ− １１の免疫原性エピトープに対応するペプチド、並びに、それらから作成される ＩＩＴＬＶ−１およびＢＴＬＶ−１１の夫々にり・１する合成ワクチンに関する 。これらの新規な免疫原製剤は、ＢＴＬＶ−１またはＩＩＴＬＶ−１１のｇｐ４ ６エンベローブ蛋白と共通の抗原決定基を有するペプチドを化学的に合成するこ とにより製造される。該ペプチドはキャリア分子に連結されて、免疫原性複合体 を形成（および／または高分子化される）することによって、ワクチンとして適 切なものになる。これらのワクチンは、例えば非経口的な投与経路で、その免疫 学的有効量が哺乳類に投与された場合に、ＢＴＬＶ−１またはＩＩＴＬＶ−１１ に関係した疾病に対して免疫感作を行なうために有効である。Figure 6 Peptide absorption of neutralizing antibody against HTLV-1 Figure 7 11TLV-IT cell/B cell peptide [Detailed description of the invention] The present invention provides a peptide corresponding to an immunogenic epitope of BTLV-1, HTLV- Peptides corresponding to 11 immunogenic epitopes and generated from them Concerning a synthetic vaccine containing IITLV-1 and BTLV-11, respectively . These novel immunogenic preparations are based on gp4 of BTLV-1 or IITLV-11. Chemical synthesis of peptides that share antigenic determinants with 6 envelope proteins Manufactured by. The peptide is linked to a carrier molecule to form an immunogenic complex. (and/or polymerized) to make it suitable as a vaccine. It becomes something painful. These vaccines can be administered via the parenteral route, for example, to BTLV-1 or IITLV-11 when administered to a mammal in a biologically effective amount It is effective for immunizing against diseases related to.
免疫原能を研究すべきペプチドには、ＩＩＴＬＶ−１およびＩＩＴＬＶ−１１ｇ ｐ４６エンベロープ糖蛋白の親水性荷電領域に対応したペプチドが含まれること が確定された。更に、これらのペプチドのうち、βターンをもっと推定されるペ プチドが特に重要であることがわかった。ペプチド内ジスルフィド結合の形成が 、本来の構造的決定因子を確立するのに有用であることが認められた。また、鏡 開ジスルフィド結合の形成は、ペプチドをポリマー化し、より大きく且つより免 疫原性の高いペプチド凝集物を形成するために有用であることが分かった。Peptides to be studied for immunogenicity include IITLV-1 and IITLV-11g. Contains a peptide corresponding to the hydrophilic charged region of p46 envelope glycoprotein has been confirmed. Furthermore, among these peptides, the β-turn is more likely to be predicted. Petide was found to be particularly important. Formation of intrapeptide disulfide bonds , was found to be useful in establishing the original structural determinants. Also, a mirror Formation of open disulfide bonds polymerizes the peptide, making it larger and more immunological. It was found to be useful for forming highly epidemiogenic peptide aggregates.
ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−１１エンベロープ蛋白の推定アミノ酸配列をコン ピュータ分析することにより、親水性領域の二次構造および位置が決定された。Construct the deduced amino acid sequences of HTLV-1 and HTLV-11 envelope proteins. The secondary structure and location of the hydrophilic regions were determined by computer analysis.
二次構造は、Ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｆｇｓｍａｎ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １ ３：２１１ ａｎｄ １３：２２２． １９７４；＾ｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅ ｎＢｍｏｌｏｇＦ ４７＋４５． １９７８）の方法を使用したコンピュータ分 析で決定された。βターンの可能性がありそうな領域の位置は、Ｒｏｓｅの方法 （Ｎａｔｕｒｅ ２７２：５８６． １９７８）を使用して決定された。The secondary structure was determined by Chou and Fgsman (Biochemistry 1 3:211 and 13:222. 1974;^dances in E nBmologF 47+45. 1978) using the method of determined by analysis. The location of the region where there is a possibility of β-turn is determined by Rose's method. (Nature 272:586. 1978).
エンベロープ蛋白の親水性領域は、Ｒｏｓｅ及びＲｏ７ （Ｐｒｏｃ、 Ｎａｊ ｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ？？＋４６４３． １９８０）の技術、 並びにＫｙ”＋ｅ及びＤｏｏｌｉｊｌｌｒ （Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、１５ ７：１０５−１３２． １９８２）の技術によって決定された。The hydrophilic regions of the envelope protein are Rose and Ro7 (Proc, Naj l, Acad, Sci, USA? ? +4643. 1980) technology, and Ky”+e and Doolijllr (J, Mo1. Biol, 15 7:105-132. (1982).
本発明のペプチドには、ＦＩＴＬＹ−１のｇｐ４６エンベローブ糖蛋白内に存在 するＢ細胞エピトープに対応するか、またはこれと相同であるペプチドが含まれ る。これらペプチドは、長さが約２５以下のアミノ酸（単位）であり、且つ親水 性である。該ペプチドは適当なキャリア分子と結合されると、哺乳類において、 ＨＴＩＶ−１の天然のｇｐ４６エンベロープ糖蛋白と反応できる高力価＋１＋１ ０００）の抗ペプチド抗体の産生を喚起する。本発明の他のペプチドは、）ＩＴ ＬＶ−１１のｇｐ４６エンベロープ糖蛋白内に存在するＢ細胞エピトープに対応 するか、またはこれに対して相同性を有する。これらペプチドは、長さか約２５ 以下のアミノ酸（中位）であり、且つ親水性である。また、適当なキャリア分子 と結合されると、哺乳類において、ＨＴＬＶ−１１の天然のｇｐ４６エンベロー プ糖蛋白と反応できる高力価（１＋１０００）の抗ペプチド抗体の産生を喚起す る。The peptides of the present invention include contains a peptide that corresponds to or is homologous to a B-cell epitope that Ru. These peptides are approximately 25 amino acids (units) or less in length and are hydrophilic. It is gender. When the peptide is combined with a suitable carrier molecule, in mammals, High titer +1+1 capable of reacting with the natural gp46 envelope glycoprotein of HTIV-1 000) stimulates the production of anti-peptide antibodies. Other peptides of the invention are )IT Corresponds to a B cell epitope present within the gp46 envelope glycoprotein of LV-11 or have homology thereto. These peptides are approximately 25 It has the following amino acids (moderate) and is hydrophilic. Also, suitable carrier molecules In mammals, the natural gp46 envelope of HTLV-11 stimulates the production of high titer (1+1000) anti-peptide antibodies that can react with glycoproteins. Ru.
本発明の合成ペプチドは、表１に示すアミノ酸配列、或いは、表に掲載された特 異的配列で表されるエピトープと結合する抗体によって同様に扱われるように、 表１に示す配列の一つと充分に近似した配列（即ち、免疫学的に同等の配列）ヲ ＃ Ｌ ｉ！％ ル。カカル同等ノ配列ノー例ハ、ＷＴＨＰＮＲＮＧＧＧ （Ｈ ＴＬＶ−１エンベロープのアミノ酸番号８８−９８： ｓｐ ２Ｌ−］ と記す ）である。以下、このような合成ペプチドを、ＢＴＬＶ−１特異性ペプチドとい う。The synthetic peptide of the present invention has the amino acid sequence shown in Table 1 or the characteristics listed in the table. so that they are treated similarly by antibodies that bind to epitopes represented by heterologous sequences. A sequence that is sufficiently similar to one of the sequences shown in Table 1 (i.e., an immunologically equivalent sequence) ＃ L i! % le. Kakar equivalent sequence no example ha, WTHPNRNGGG (H Amino acid number 88-98 of TLV-1 envelope: written as sp2L-] ). Hereinafter, such synthetic peptides will be referred to as BTLV-1 specific peptides. cormorant.
表１ 診断に使用される合成ペプチドおよび ！（ＴＬＶ−１に対するワクチン １ ３３−４７ ＶＳＳＹＨ５ＫＰＣＮＰＡＱＰＶ２ ８６−１０７ （Ｃ）Ｐ ＩＩＷＴＫＫＰＮＲＮＧＧＧＹＹＳＡＳＹＳＤＰ３ １７６−１８９ ＦＣ）Ｌ ＮＴＥＰＳＱＬＰＰＴＡＰＰ（Ｙ）４ １２９−１４９ ５ＳＰＹＷＫＦＱＨＤ ＶＮＦＴＱＥＶＳＲＬＮ（Ｃ）４Ａ １９０−２０９ （Ｃ）ＬＬＰＢＳＮＬＤ ＢＩＬＥＰＳＩＰＷＩＳＸ（Ｙ）５ ２６９−２８０ （Ｙ）ＬＰＦＮＷＴＨＣ ＦＤＰＱ（Ｃ）６ ２９６−３１２ （Ｃ）ＰＰＦＳＬＳＰＶＰＴＬＧＳＲＳＲ Ｒ７３７４−３９２ＹＡＡＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬ（Ｃ）８ ４００ −４］５ ＧＲＦＰＮＩＴＮＳＨＶＰＩＬＱＥ９ ４１１−４２２ （Ｃ）ＰＩ ＬＱＥＲｆ’ＰＬＥＮＲ１０４６２−４８０ＣＩＬＲＱＬＲＢＩＰＳＲＶＲＹＰ ＩＩＩＹＳ３６１８−３６２２． １９８３に従い、リーダー配列のＮ−末端メ チオニン＝１゜ ２、合成ペプチドの配列１−１１は、ペプチド４を除き、ＨＴＩＶ −Ｉ Ｈ１ ６３エンベロープ前駆分子のＮ末端からＣ末端へ順に掲載されている。ペプチド ７−１１の配列は、ｇｐ２＋のトランスメンブラン糖蛋白由来であるが、ペプチ ド１−６の配列はｇｐ４６の外部エンベロープ糖蛋白由来である。アミノ酸番号 は、開始メチオニン−１で始まる（Ｐａｌｋｅｒ ｅＩａｌ、、 Ｊ、Ｉｍｍｕ ｎｏ （１９８９） Ｖｏｌ、 １４２Ｆｔｂ、１．参照）。Table 1 Synthetic peptides used in diagnostics and ! (Vaccine against TLV-1 1 33-47 VSSYH5KPCNPAQPV2 86-107 (C)P IIWTKKPNRNGGGYYSASYSDP3 176-189 FC)L NTEPSQLPPTAPP(Y)4 129-149 5SPYWKFQHD VNFTQEVSRLN (C) 4A 190-209 (C) LLPBSNLD BILEPSIPWISX(Y)5 269-280(Y)LPFNWTHC FDPQ(C)6 296-312(C)PPFSLSPVPTLGSRSR R7374-392YAAQNRRGLDLLFWEQGGL(C)8 400 -4] 5 GRFPNITNSHVPILQE9 411-422 (C) PI LQERf’PLENR10462-480CILRQLRBIPSRVRYP IIIYS3618-3622. 1983, the N-terminal link of the leader sequence Thionine = 1° 2. Synthetic peptide sequences 1-11, except for peptide 4, are HTIV-I H1 63 Envelope precursor molecules are listed in order from the N-terminus to the C-terminus. peptide The sequence of 7-11 is derived from gp2+ transmembrane glycoprotein, but Sequences 1-6 are derived from the gp46 outer envelope glycoprotein. amino acid number begins with the initiator methionine-1 (Palker et al., J. Immu. no (1989) Vol, 142Ftb, 1. reference).
３、括弧内のアミノ酸は、キャリア蛋白（Ｃ） とのカップリングおよびペプチ ドのヨード化（Ｙｌ を促進するために添加された。ＣｙｓはＮ末端またはＣ末 端の何れかである。3. Amino acids in parentheses indicate coupling with carrier protein (C) and peptide Cys was added to promote iodination (Yl) at the N-terminus or C-terminus. It's either on the edge.
４、−文字コードによって表示される各アミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、アスパ ラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ） 、リジン（Ｋ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）および千ロジ ン（Ｙ）を除いて、その名前の頭文字である。4. - Each amino acid represented by a letter code is arginine (R), aspar Laginic acid (D), Asparagine (N), Glutamine (Q), Glutamic acid (E) , lysine (K), phenylalanine (F), tryptophan (W) and thousand These are the first letters of their names, except for the yen (Y).
同様に、本願の他の合成ペプチドは、表２に示されるようなアミノ酸配列、また は、表に掲載された特異的配列で表されるエピトープと結合する抗体によって同 様に扱われるように、表２に示される配列の一つと充分に近似した配列（即ち、 免疫学的に同等の配列）を有し得る。このような同等の配列の一例は、ＰＨＷＩ ＫＫＰＮＲＱＧＬＧＹＹＳ（Ｃ） （ＩＩＴＬＶ−１１エンベロープのアミノ酸 番号８２−９７． ＤＰ−９０と記す）である。以下、このような合成ペプチド を、ＢＴＬＶ−１１特異性ペプチドと言う。Similarly, other synthetic peptides of the present application have amino acid sequences as shown in Table 2, or is identified by an antibody that binds to the epitope represented by the specific sequence listed in the table. A sequence that is sufficiently similar to one of the sequences shown in Table 2 (i.e., immunologically equivalent sequences). An example of such an equivalent arrangement is PHWI KKPNRQGLGYYS (C) (IITLV-11 envelope amino acid Numbers 82-97. It is written as DP-90). Below, such synthetic peptides is called a BTLV-11 specific peptide.
嚢２ 診断に使用される合成ペプチドおよび ＢＴＬＶ−１１に対する予防接種 １ ３０−４４ ５ＳＹＨＳＳＰＣ５ＰＴＱＰＶＣ２４４−６３ＣＴＷＮＬＤＬ ＮＳＬＴＴＤＱＲＬＩＩＰＰＣ３８３−１０４ＢＷＩ［ＰＮＲＱＧＬＧＹＹＳＰ ＳＹＮＤＰＣ４１２５−１４０（Ｃ）ＳＳＰＳＷＫＦＩＩＳＤＶＮＦＴＱＥ５ １７４−１９４ ＦＣ）ＳＥＰＴＱＰＰＰＴＳＰＰＬＶＨＤＳＤＬＥＨる。リー ダー配列のメチオニン＝１゜ ２、括弧内のアミノ酸が、キャリア蛋白（ｃ）とのカップリングおよびペプチド のヨード（Ｙ）を促進するためニ添加された。ＣｙｓはＮ末端またはＣ末端の何 れがであり得る。sac 2 Synthetic peptides used in diagnostics and Vaccination against BTLV-11 1 30-44 5SYHSSPC5PTQPVC244-63CTWNLDL NSLTTDQRLIIPPC383-104BWI[PNRQGLGYYSP SYNDPC4125-140(C)SSPSWKFIISDVNFTQE5 174-194 FC) SEPTQPPPTSPPLVHDSDLEHru. Lee methionine in the sequence = 1° 2. Amino acids in parentheses indicate coupling with carrier protein (c) and peptide Ni was added to promote iodine (Y). Cys is either N-terminal or C-terminal It can be a real thing.
３、−文字コードによって表示される各アミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、アスパ ラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ） 、リジン（Ｋ）、フェニルアラニン（Ｆ） 、Ｉ−リプトファン（Ｗ）およびチ ロシン（Ｙ）を除いて、その名前の頭文字である。3. - Each amino acid represented by a letter code is arginine (R), aspar Laginic acid (D), Asparagine (N), Glutamine (Q), Glutamic acid (E) , lysine (K), phenylalanine (F), I-lyptophan (W) and thi Except for Rosin (Y), it is the first letter of the name.
本発明のペプチドか共有結合する（複合体を形成する）キャリア分子は、無毒で 、薬学的に使用可能であり、哺乳類において免疫反応を生じるのに十分な大きさ であるのが有利である。適切なキャリア分子の例としては、破傷風トキソイド及 びキーホールカサガイヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍ。The carrier molecule to which the peptide of the present invention is covalently attached (forming a complex) is non-toxic. , large enough to be pharmaceutically usable and to produce an immune response in mammals It is advantageous that Examples of suitable carrier molecules include tetanus toxoid and Keyhole limpet hemocyanin.
ｃｙａｎｉｎ ； ＫＬ）ｌ）がある。）ＩＴＬＶ−１特異性ペプチド及びＨＴ ＬＶ−１！特異性ペプチドが結合し得る他のキャリア分子には、ＨＴＬＶ−１ま たはＢＴＬＶ−１１ｇｐ６３エンベロープ糖蛋白またはＭａｒｇａＩｉｔ ｅｌ ａｌ、 （１，Ｉｍｍｕｎｏ１． １３８：２２１３． １９８７）のアルゴリ ズムによって推定される螺旋構造をもったＰ５５ ｇｊｇポリ蛋白の、Ｔ細胞エ ピトープに対応する配列を有するペプチドが含まれる。その具体例が表３に掲載 されている。アミノ酸ＬＡＳＧＸＳＬをｌ−ＴｌのＮ末端への付加すると、マウ スＴヘルパー細胞によって確二ごされるペプチドとなる。There is cyanin; KL)l). ) ITLV-1 specific peptide and HT LV-1! Other carrier molecules to which specific peptides can bind include HTLV-1 or or BTLV-11gp63 envelope glycoprotein or MargaIit el Al, (1, Immuno1. 138:2213. 1987) algorithm The P55gjg polyprotein, which has a helical structure predicted by the Included are peptides having sequences that correspond to pitopes. Specific examples are listed in Table 3. has been done. Addition of the amino acid LASGXSL to the N-terminus of l-Tl It becomes a peptide that is digested by T helper cells.
表３ ＥＴＬＶ−１，ＩＩＴＬＶ−１１（７）Ｔ細胞エピトープウィルス 遺伝子 ア ミノ酸 記号 配列ＦＩＴＬＹ−１ｘンベローブ ３４７−３６３ １−ＴＩ ＬＩＩＥＶＤＫＤＩＳＱＬＴＱＩＶＫＨＴＬＶ−１エンベロづ ６４−７４ １ −Ｔ２ ＱＰＰＣＰＮＬＶＳＹＳＧａｇ １８４−２００ Ｉ−Ｔ３ ＤＬＱＤ ＬＬＱＹＬＣ３ＳＬＶＡＳＬＧａｇ ７９−８７ １−Ｔ４ ＲＶＮＥＩＬＨＩ Ｌ）ＩＴＬＶ−１１エンベロープ ３４８−３６９’ ＩＩ−Ｔ４ ＫＤＩＳＢ ＬＴＱＡＩＶＫＮ）ＩＱＮＩＬＲＶｌ、両親媒性の螺旋二次構造を含むアミノ酸 配列を保護するために使用される、ＭａｒｇａＩｉｔ ｅｔ ａｔ、（Ｊ、１ｍ ｍｕｎｏｌ。Table 3 ETLV-1, IITLV-11 (7) T cell epitope virus gene a Mino acid symbol sequence FITLY-1x envelope 347-363 1-TI LIIEVDKDISQLTQIVKHTLV-1 Envelope 64-74 1 -T2 QPPCPNLVSYSGag 184-200 I-T3 DLQD LLQYLC3SLVASLGag 79-87 1-T4 RVNEILHI L) ITLV-11 envelope 348-369' II-T4 KDISB LTQAIVKN) IQNILRVl, an amino acid containing an amphipathic helical secondary structure MargaIit et at, (J, 1m munol.
＋３８：２２１３． １９８７）のアルゴリズム２、５ｅｉｋｉ ｅｔ ａｌｅ 、 Ｐｒｏｃ、Ｎａ１１． Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｉｔｓ＾８０：３６１８゜ １９８３からの）ＩＴＬＶ−］推定アミノ酸配列ＨＴＬＶ−１特異性ペプチドお よびＢＴＬＶ−１１特異性ペプチドはまた、薬学的に使用可能なアジュバント（ 例えば明春）と共に、または破傷風トキソイドよりも免疫原性の高い他のキャリ ア分子に結合して投与され１する。+38:2213. Algorithm 2, 5eiki et ale of 1987) , Proc, Na11. Acad, Sci, Its＾80:3618゜ (from 1983) ITLV-] deduced amino acid sequence HTLV-1 specific peptide and and BTLV-11 specific peptides can also be combined with pharmaceutically usable adjuvants ( e.g. Mingharu) or with other carriers that are more immunogenic than tetanus toxoid. It is administered by binding to a molecule.
キャリア分子と本発明のＨＴＬＹ−１またはＩＩＴＬＶ−１１特異性ペプチドと の連結は、直接またはスペーサ分子を介してなされる。A carrier molecule and the HTLY-1 or IITLV-11 specific peptide of the present invention The linkage can be made directly or via a spacer molecule.
スペーサ分子は、無毒性で且つ反応性であるのが有利である。Advantageously, the spacer molecule is non-toxic and reactive.
１１ＴＬＶ−１又は［１Ｖ−１１特異性ペプヂドのアミノ末端に付加される二つ のグリシン残基は、ペプチドとキャリア分子を連結するのに適切なスペーサ分子 を与える；或いは、ＨＴＬＶ−１または１１ＴＬＶ−１１特異性ペプチドは、例 えば表３に表示されている配列（またはその部分）のような他の免疫原性）ＩＴ ＬＶ−１，若しくはＢＴＬＶ−１１工ンベロープ配列に隣接して、直接合成する ことができる。キャリア分子と結合させるために、ＩＩＩＴＬＶ−１，またはＨ ＴＬＶ−１１特異的ペプチドのＮ末端またはＣ末端の何れかにシスティンを付加 するか、或いは、ジスルフィド結合の形成を介しての鏡開ポリメリゼーションを 促進し、より大きな分子凝集物を形成するために、システィンを両末端に付加す ることができる。11TLV-1 or [2 added to the amino terminus of the [1V-11 specific peptide] The glycine residue of is a suitable spacer molecule to link the peptide and the carrier molecule. Alternatively, the HTLV-1 or 11TLV-11 specific peptide is e.g. Other immunogenic (e.g. sequences (or parts thereof) listed in Table 3) IT Directly synthesized adjacent to the LV-1 or BTLV-11 envelope sequence be able to. IIITLV-1, or H Adding cysteine to either the N-terminus or C-terminus of the TLV-11-specific peptide or by microscopic polymerization via disulfide bond formation. addition of cysteine to both ends to promote and form larger molecular aggregates. can be done.
ＩＩＴＬＶ−１，またはＩＩＴＬＶ−１１特異性ペプチドに対するキャリア分子 の結合は、カップリング剤を用いて行なわれる。Ｇｒｅｅｎｅｌ ａｌ、（Ｃｅ ｌｌ ２８＋４７７、 １９８２）、およびＰａ１ｋｅ＋ ｅｌ ａｌ、 （Ｐ ｒｏｃ。Carrier molecule for IITLV-1 or IITLV-11 specific peptide The bonding is carried out using a coupling agent. Greenel al, (Ce ll 28+477, 1982), and Pa1ke+ el al, (P roc.
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８４：２４７９． １９８７＞に記載さ れているように、ヘテロ官能性のカップリング剤であるトマレイミドベンゾ・イ ルーＮ−ヒドロキジサクシンイミドナエステル（ＭＢＳ）、または、水溶性化合 物である０−マレイミドーベンゾイルスルフォサクシンイミド・エステ（Ｓｕｌ ｌｏ−Ｍ Ｂ Ｓ ）を使用するのが有利である。Natl, Acad, Sci, USA84:2479. 1987> The heterofunctional coupling agent tomaleimidobenzoyl -N-hydroxydisuccinimidonaester (MBS) or water-soluble compound 0-maleimidobenzoyl sulfosuccinimide (Sul It is advantageous to use lo-MBS).
本発明のワクチン（哺乳類に投与されると、１１ＴＬＶ−１に対して防御的免疫 反応を誘発する）は、一つ以上の免疫原複合体を合釘する。この夫々の複合体は Ｉ’１ＴＬＶ−１特異性ペプチドを含ンでオリ、各１１ＴＬＶ−１特異性ペプチ ドは、ＨＴＬＶ−１ｇｐ４６−ｒ−ンベロープ蛋白の異なる部分に対応している 。表１に掲載した一以上のＨＴＬＶ−１特異的ペプチドを、例えば表３に表示し たＨＴＬＶ−１エンベロープまたはｇａｇ蛋白の推定Ｔ細胞エピトープと結合す るか、或いはこれと共に合成するのが有利である。Vaccines of the invention (when administered to mammals, provide protective immunity against 11TLV-1) (eliciting a response) dowels one or more immunogen complexes. These respective complexes are I'1 TLV-1-specific peptides, each containing 11 TLV-1-specific peptides. The codes correspond to different parts of the HTLV-1gp46-r-envelope protein. . One or more HTLV-1 specific peptides listed in Table 1 may be listed in Table 3, for example. binding to putative T cell epitopes of the HTLV-1 envelope or gag protein. Advantageously, the compound is synthesized with or without the aid of the present invention.
このようなキメラの一例は、ＬＰＰＴＡＰＰＬＬＰＩＩＳＮＬＤＩＩＩＬＥＰＳ ＩＰＷＫＳＫＷＴＫＷＰＮＲＮＧＧＧ （ＨＴＬＶ−１エンベロープ蛋白のアミ ノ酸岳号１８３−２０９／８８−９８； ＤＰ−９１と記す）である。An example of such a chimera is LPPTAPPLLPIISNLDIIIILEPS IPWKSKWTKWPNRNGGG (HTLV-1 envelope protein amino acid) Noshidake number 183-209/88-98; written as DP-91).
同様に、）ＩＴＬＶ−１１対して防御的免疫反応を誘発てきる本発明のワクチン は、−以上の免疫原複合体を具倫する。その各々抱合体は、ＨＴＬＶ−１１特異 性ペプチドを含み、各ペプチドはＨＴＬＶ−Ｉｔ ｇｐ４６エンベローブ蛋白の 異なる部分に対応する。表２に掲載されている一つ以上のＨＴＬＶ−１１特異性 ペプチドは、例えば表３に表示される推定Ｔ細胞エピトープと結合され、または これと共に合成されることが有利である。Similarly,) the vaccine of the invention is capable of eliciting a protective immune response against ITLV-11. embodies - or more immunogen complexes. Each of the conjugates is HTLV-11 specific. each peptide contains the HTLV-It gp46 envelope protein. correspond to different parts. One or more HTLV-11 specificities listed in Table 2 The peptide is bound to a putative T cell epitope, e.g. as shown in Table 3, or Advantageously, it is synthesized with this.
更に、哺乳類によってＩＩＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−１１に対する防御抗体が 同時に生じるように、）ＩＴＬＶ−１および）ＩＴＬＶ−１１のエンベロープ蛋 白由来の合成ペプチドを含む上記の免疫原複合体を混合し、単一の接種物とする ことによって、二価のワクチンを構築することかできる。Furthermore, protective antibodies against IITLV-1 and HTLV-11 have been developed by mammals. The envelope proteins of ) ITLV-1 and ) ITLV-11 occur simultaneously. The above immunogen complexes containing synthetic peptides derived from white are mixed into a single inoculum. By doing so, bivalent vaccines can be constructed.
１（ＴＬＶ−１およびＩＩＴＬＶ・１１エンベロープの一部を反映する合成ペプ チド、又はヘルパーＴ細胞によって認識される２８２分子をキャリア分子として 使用することによって、破傷風トキソイド等の他のキャリア分子を用いる必要が なくなり、加えてＩＩＴＬＶ−１または）ＩＴＬＶ−１１に対するＢ細胞および Ｔ細胞の反応が特異的になるという利点か得られる。ＢＴＬＶ−１およびＨＴＩ 、Ｖ−１１特異性ペプチドは、単独または対応するＴ細胞エピトープと共に合成 されたものの何れであっても、酸化剤で処理してペプチド鎖のシスチン間におけ るジスルフィド結合形成を誘導され、高分子化されることによって、高い免疫原 性をもつ抗原となる。1 (synthetic peptide reflecting part of the TLV-1 and IITLV-11 envelopes) or 282 molecules recognized by helper T cells as carrier molecules. may necessitate the use of other carrier molecules such as tetanus toxoid. B cells against IITLV-1 or) ITLV-11 and This has the advantage that the T cell response becomes specific. BTLV-1 and HTI , V-11 specific peptides were synthesized alone or together with the corresponding T cell epitope. In any case, treatment with an oxidizing agent will remove the bonds between cystines in the peptide chain. By inducing disulfide bond formation and polymerization, it is highly immunogenic. It becomes a specific antigen.
本発明のＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−１１特異性ペプチドか、免疫感作に続い て中和抗体を産生ずる能力は、Ｎａｇｙ ｅｌ ａｌ、 （Ｉｎｌ、 Ｊ。Following immunization, the HTLV-1 and HTLV-11 specific peptides of the invention The ability to produce neutralizing antibodies has been described by Nagy El al. (Inl, J.).
Ｃａｎｃｅｒ ３２：３２１． １９８３）に記載されているようにして決定さ れる。Cancer 32:321. Determined as described in (1983) It will be done.
ＨＴＬＶ−１およびＩ（ＴＬＶ−１１特異性ペプチドをワクチンまたはワクチン 成分として使用することに加えて、これらのペプチドはまた、診断のためにも使 用することができる。生物学的試料中のＢＴＬＶ−１または）ＩＴＬＶ−１１エ ンベロープ蛋白に対する抗体の存在および力価は、固相ラジオインムノアッセイ （ＲＩＡ）において）ＩＴＬＶ−１および）ＩＴＬＶ−１１特異性ペプチドを用 いることにより検出することができる（Ｐａｌｋｅｒ ｅｔ ａｔ、Ｊ、Ｉｍｍ ｕｎｏｌ。HTLV-1 and I (TLV-11 specific peptides in vaccines or In addition to being used as ingredients, these peptides can also be used for diagnostics. can be used. BTLV-1 or) ITLV-11e in biological samples The presence and titer of antibodies against envelope proteins was determined by solid-phase radioimmunoassay. (RIA) using) ITLV-1 and) ITLV-11 specific peptides. (Palker et al., J. Imm. unol.
１３６・２３９３． １９８６−この報文の全内容が本明細書に参照として組み 込まれる； １ｂｉｄ、 Ｉ’ｒｏｃ、 Ｎａ１１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳ Ａ ８４：２４７９、＋９８７＋ 、本発明）ＨＴＬＶ−１オヨびＦＩＴＬＹ− Ｉ＋特異性ペプチトハまた、標準の酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）におい て、生物学的試料中のＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−１１エンベロープ糖蛋白に 対する抗体の存在を検出するためにの使用され１）る。136・2393. 1986 - The entire contents of this report are incorporated herein by reference. Included; 1 bid, I'roc, Na11. Acad, Sci, US A 84:2479, +987+, present invention) HTLV-1 Oyobi FITLY- I+ specific peptides also perform well in standard enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs). to HTLV-1 or HTLV-11 envelope glycoproteins in biological samples. 1) used to detect the presence of antibodies against
本発明のＩＩＴＬ’／−１診断試験の一つの態様においては、ＩＩＴＬＶ−１ｇ ｐ４６エンベロープ由来の合成ペプチドとＩＩＴＬｖ−１ｐ１９ ｇａｇ蛋白と の混合物が用いられる。好ましくは、表１のペプチド４Ａと、下％Ｆ３（７） ｔｌＴＬＶ−１ｐ１９ ノｈルボキシル末端配列： Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ− Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈ＋−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕを含むペプ チドが使用される。組み合せにおいて、これらの二つのペプチドは、ｐ１９また はｇｐ４６に対する抗体を有する）ＩＴＬＶ−１陽性被検者由来の血清の抗体に よって９５％で認識される（ Ｐａ１ｋｅｒ ｅｌａｌ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、 １３６：２３９３． １９８６． および表１）。これら二つのペプチドの組み 合わせは、ＥＬＩＳＡまたは旧Ａにおいて、１（ＴＬＶ−１陽性患者由来の血清 中の抗体を検出するために使用することができる。In one embodiment of the IITL'/-1 diagnostic test of the invention, IITLV-1g Synthetic peptide derived from p46 envelope and IITLv-1p19 gag protein A mixture of is used. Preferably, peptide 4A of Table 1 and lower %F3(7) tlTLV-1p19 norboxyl terminal sequence: Pro-Tyr-Val- Pep containing Glu-Pro-Th+-Ala-Pro-Gln-Val-Leu Tido is used. In combination, these two peptides can inhibit p19 or has antibodies against gp46) Therefore, it is recognized in 95% (Palker Elal, J. Immunol, 136:2393. 1986. and Table 1). The combination of these two peptides The combination is 1 (serum from TLV-1 positive patient) in ELISA or old A. can be used to detect antibodies in
以上述べたところを考慮すれば、ＥＬＩＳＡ ５ＲＩＡ 、間接蛍光イムノアッ セイ、およびウェスタンプロット分析等の検出手段を使用して、生物学的試料中 のＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−１１に対する抗体を検出するためにの、ＨＴＬ Ｖ−１およびＨＴ［、Ｖ−１１特異性テストキツトが構築できるということが当 業者には明らかであろう。Considering the above, ELISA 5RIA, indirect fluorescent immunoassay in biological samples using detection means such as HTL for detecting antibodies against HTLV-1 and HTLV-11. It is reasonable that a V-1 and HT[, V-11 specific test kit can be constructed. It will be obvious to business owners.
本発明のＢＴＬＶ−１またはＩＩＴＬＶ−１１特異的ペプチドによる免疫感作に 反応して産生される抗体が、標準的な技術を使用して、抗原診１１ｆｒ試験に使 用されるということもまた、当業者には明らかであろう。For immunization with BTLV-1 or IITLV-11 specific peptides of the present invention The antibodies produced in response can be used in the Antigen Diagnosis 11fr test using standard techniques. It will also be clear to those skilled in the art that
以下、実施例に従って本発明をより詳細に説明するが、これら実施例は本発明を 制限するものではない。Hereinafter, the present invention will be explained in more detail according to examples, but these examples will explain the present invention in more detail. It is not a restriction.
実施例Ｉ ＢＴＬＶ−１ｇｐ４６ （Ｓｅｉｋｉ ｅｌ ｘｉ；、Ｐｒｏｃ、Ｎｘ口、＾ｃ ！ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８０：３６１８−３６２２．１９８３）およびＢＴＬＶ− １ｔ ｇｐ４６（Ｓｏｄｏｒｓｋｉ ｅｔａｌ；、５ｃｉｅｎｃｅ、２２５：４ ２１−４２４．１９８４）由来の親水性アミノ酸配列を含む本質的に純粋な合成 ペプチドが、デュポン２１００ ペプチド合成機を用い、製造者により供給され た化学剤およびプログラムサイクルを使用して合成された。配列は表１および２ に掲載されている。Example I BTLV-1gp46 (Seiki el xi;, Proc, Nx mouth, ^c ! d, Sci, USA80:3618-3622.1983) and BTLV- 1tgp46 (Sodorski et al;, 5science, 225:4 21-424.1984) containing hydrophilic amino acid sequences derived from Peptides were supplied by the manufacturer using a DuPont 2100 peptide synthesizer. Synthesized using chemical agents and programmed cycles. Sequences are in Tables 1 and 2 Published in.
Ｇｒｅｅｎ ｅｌ ａｌ、（Ｃｒｌｌ ２８：４７７、１９８２）およびＰｇｌ ｋ！ｒ ｃｌ ａｌ。Greenel al, (Crll 28:477, 1982) and Pgl k! rcl al.
（？ｏｃ、 Ｎａ１ｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ８４：２４７９． １ ９８７）に記載されているようにして、ペプチドは、ＭＢＳを用いてキャリア分 子である破傷風トキソイド（ＴＴ）に結合された。カップリングの手順は次の通 りである。まず、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７，２）０．５ｍｌ中の２４ ｍ ｇの破傷風トキソイドを、ジメチルホルムアミド１００μｍ中に溶解させたｌ ｍｇのＭＢＳと共に、２３℃で１時間インキュベートした。次に、このＭＢＳで 処理した破傷風トキソイド（ＴＴ−ＭＢＳ）をＰＤ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ）カラム上での選別クロマトグラフィーにかけ、ＴＴ−ＭＢＳから未反応のＭＢ Ｓを除去すると共に、ＴＴ−ＭＢＳを含む分画が、光学密度２８０ ｎｍでのス ペクトロフォトメトリック分析で定量されたカラム空間容量で回収された。ＴＴ −ＭＢＳは、ＰＢＳ中の６−９ｍｇの合成ペプチド（カルボキン末端またはアミ ノ末端に還元されたシスチンを含む）と共に、２３℃で３時間、で振盪しながら インキュベートされた（ペプチド：キャリア蛋白の分子比率は３０：１）。こう して得られたＴＴ−ペプチド複合体は、４°Ｃで一晩、ＰＢＳで透析されるか又 はＰＤ−１０カラム上で再び脱塩され、免疫原として使用された。(?oc, Na1l, Acad, Sci, USA 84:2479.1 The peptides were separated from the carrier using MBS as described in (987). It was conjugated to the child tetanus toxoid (TT). The coupling procedure is as follows. It is. First, 24 m in 0.5 ml of phosphate buffered saline (pH 7,2) g of tetanus toxoid dissolved in 100 μm of dimethylformamide. Incubated with mg MBS for 1 hour at 23°C. Next, with this MBS The treated tetanus toxoid (TT-MBS) was added to PD-10 (Pharmacia ) to separate unreacted MB from TT-MBS by selective chromatography on a column. S was removed and the fraction containing TT-MBS was scanned at an optical density of 280 nm. The column space volume was recovered as determined by pectrophotometric analysis. TT -MBS consists of 6-9 mg of synthetic peptide (carboxine-terminated or amino-terminated) in PBS. containing reduced cystine at the terminal end) for 3 hours at 23°C with shaking. (Molecular ratio of peptide:carrier protein is 30:1). like this The resulting TT-peptide complex was dialyzed against PBS overnight at 4°C or was desalted again on a PD-10 column and used as immunogen.
ペプチドのキャリア分子トキソイドへの結合は、複合体を５ＯＳ−ポリアクリル アミドゲル電気泳動（５ＤＳ−ＰＡＧＥ）に供すして、キャリア分子ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動の分子量を越える見掛の分子量の増加を測定することによ り、およびＭＢＳ処理されたキャリア分子の分子量を凌ぐ見掛けの分子量増加を 測定することによりモニターされた。カップリング効率もまたペプチドの微量ヨ ウ素化によってモニターされたが、この効率はペプチドによって１０−３０％の 範囲で変化した。Coupling of the peptide to the carrier molecule toxoid converts the conjugate into a 5OS-polyacrylic The carrier molecule polyacrylate was subjected to amide gel electrophoresis (5DS-PAGE). by measuring the increase in apparent molecular weight over the molecular weight of polyamide gel electrophoresis. and an apparent increase in molecular weight that exceeds that of the MBS-treated carrier molecule. It was monitored by measuring. Coupling efficiency also depends on trace amounts of peptides. Monitored by urination, the efficiency was 10-30% depending on the peptide. It varied within a range.
実施例２ ＢＴＬＶ−１七ロポジティブ者由来の抗体のＨＴＬＶ−１ｇｐ４６合成ペプチド に対する反応性１１１ＴＬ／Ｖ−１ｇｐ４６ ノ親水性領域由来の合成ペプチド （ＨＴＬＶ−１合成ペプチド）を、０．１Ｍ Ｎａ）ＩｃＯ，ｐＨ９，６，の緩 衝液中に溶解させるか懸濁させ、Ｉｍｍｕｌｏｎ ２マイクロタイタウエル（Ｄ ７ｎｘｌｔｃｈ）を用いて、この溶液または懸濁液５０μｇ／ウェルを４℃で一 晩インキユベートした。ウェルを空にした後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ） 巾の５％の無脂肪乾燥ミルク（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）２００μｍと、０．１％ア ジ化ナトリウムとをウェルに添加して２時間インキュベートした。ウェルを空に し、５％の無脂肪乾燥ミルクおよび０．０５％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ） ２０ （洗浄緩衝液）を含むＰＢＳで一回洗浄し、更に、ＢＴＬＶ−１陽性患者また は通常人由来の血清の洗浄緩衝液による稀釈液（１１５０）と共に１時間インキ ュベートした。ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄し、更にウサギ抗ヒトＩｇＧ ｆ Ｈ＆ Ｌ鎖特異性、Ｃｏｏｐｅｒ Ｂｉｏｍｒｄｉｃａｌ。Example 2 HTLV-1gp46 synthetic peptide of antibody derived from BTLV-1 heptapositive person Synthetic peptide derived from the hydrophilic region of 111TL/V-1gp46 (HTLV-1 synthetic peptide) in 0.1M Na)IcO, pH 9.6. Dissolve or suspend in a buffer solution and place in an Immulon 2 micro titer well (D 7nxltch) at 4°C with 50 μg/well of this solution or suspension. Incubated in the evening. After emptying the wells, add phosphate buffered saline (PBS) 200μm of 5% non-fat dry milk (Carnation) and 0.1% aluminum. Sodium diide was added to the wells and incubated for 2 hours. empty the well and 5% non-fat dry milk and 0.05% Tween 20 Wash once with PBS containing (washing buffer), and further wash with BTLV-1 positive patients or The ink was incubated for 1 hour with a dilution of normal human serum in washing buffer (1150). It was incubated. Wash the wells three times with wash buffer and add rabbit anti-human IgG f H & L chain specificity, Cooper Biomrdical.
Ｍａｌｖｅｒｎ、 ＰＡ）全血清の洗浄緩衝液にょる］／１５０希釈液（５０μ ｍ）と共に３０分間インキュベートし、前記のように洗浄し、続イテ、洗浄緩衝 液５０μｍ中（７） 】２５Ｉ 標識ｍ白Ａ （Ｓｉｇｍａ）１０５ｃｐｍと共 に２３°Ｃで更に３０分間インキュベートした。ウェルを前記のように洗浄し、 ウェルに結合された放射活性をガンマ−計測器で測定した。図１に、１（ＴＬＶ −１陽性患者の血清（Ｅ）および通常人血清対照（Ｃ）の実験で得られた （Ｅ ／Ｃ）の平均ｃｐｍ値（二つのウェル）を示す。２．０より大きい比は陽性とみ なされた。Malvern, PA) total serum wash buffer]/150 dilution (50μ m) for 30 minutes, washed as above, and continued with wash buffer. (7) in solution 50μm with 25I labeled white A (Sigma) 105cpm The cells were incubated for an additional 30 minutes at 23°C. Wash wells as above; Radioactivity bound to the wells was measured with a gamma counter. In Figure 1, 1 (TLV -1 positive patient serum (E) and normal human serum control (C) obtained in experiments (E /C) average cpm values (two wells) are shown. A ratio greater than 2.0 is considered positive. It was done.
実施例３ １’１ＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−１１に対する抗体の検出ｐ１９のＣ末端に由 来した、ＩＩＴＬＶ−１にコードされる合成ペプチドである５Ｐ−７１（Ｐｒｏ −丁ｙｒ−ｖＢＩ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｂｒ−Ａｌｊ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ −Ｌｅｕ ）またはその部分と、表１に記載したｇｈ４６巾来の合成ペプチド５ Ｐ−４＾とが混合され、上記２１人におけるマイクロタイタウエル（ウェル当た りの各ペプチド量は１０−５０Ｉｇ）に添加されて、ＨＴＬＶ−１に対する抗体 を検出するために使用され１）る。また、ＨＴＬＶ−Ｉｉ ｐ＋９のＣ末端に由 来するアミノ酸配列を含むペプチド（？ｏ−Ｔｙｒ−Ｖａ １−Ｇｌｕ−Ｐ＋ｏ −Ｔｈｒ−Ｔｈｅ−Ｔｈｅ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ ）またはその部分は、マ イクロタイタウエル（ウェル当たり１０−５０Ｉｇ）に上記のように添加され、 ）ＩＴＬＶ−１１に対する抗体を検出するために使用され得る。Example 3 Detection of antibodies against 1'1 TLV-1 and HTLV-11 Derived from the C-terminus of p19 5P-71 (Pro -Tyr-vBI-Glu-Pro-Tbr-Alj-Pro-Gln-Val -Leu) or a portion thereof and the gh46-wide synthetic peptide 5 listed in Table 1. P-4^ was mixed with microtiter wells (per well) in the above 21 people. Each peptide amount (10-50 Ig) was added to prepare antibodies against HTLV-1. 1). Also, derived from the C-terminus of HTLV-Ii p+9. A peptide containing the following amino acid sequence (?o-Tyr-Va 1-Glu-P+o -Thr-The-The-Gln-Cys-Phe) or a portion thereof Icrotita wells (10-50 Ig per well) were added as above; ) can be used to detect antibodies against ITLV-11.
実施例４ 抗合成ペプチド抗血消の合成ペプチドおよび）ＩＴＬＶ−１エンベロープ糖蛋白 に対する反応性ＢＴＬＶ−Ｉ ｅｎｖにコードされた合成ペプチド（ＨＴＬＶ− １特異性ペプチド）が、上記のように破傷風トキソイド（ＴＴ）に共有結合され 、ウサギを免疫感作するために使用された。フロイント完全アジュバント中のペ プチド−ＴＴ複合体５ ｍｇで１回の免疫感作を行ない、続いて１週問おきにフ ロイント不完全アジュバント中の該複合体で２回の追加免疫を行なった後、血清 が採集され、該血清の免疫感作ペプチドに対する反応性がテストされた（表４） 。Example 4 Anti-Synthetic Peptide Anti-Hematopoietic Synthetic Peptide and) ITLV-1 Envelope Glycoprotein Synthetic peptide encoded by BTLV-I env (HTLV- 1 specificity peptide) was covalently linked to tetanus toxoid (TT) as described above. , was used to immunize rabbits. PE in complete Freund's adjuvant One immunization with 5 mg of Ptide-TT complex, followed by immunization every other week. After two boosts with the conjugate in Roint's incomplete adjuvant, serum were collected and the sera were tested for reactivity to immunizing peptides (Table 4). .
点迭 １１ＴＬＶ−１合成ペプチド（ＳＰ） １−６１．：対するウサギ血清の反応性 抗体 抗 原 ５Ｐ−Ｉ ５Ｐ−２５Ｐ−３５Ｐ−４５Ｐ−４Ａ ５Ｐ−５５Ｐ−６αｓｐ−］ ５８．１ ０．５ ２．１ ０．４ ０．９ １．３ ０．４抗ペプチド血清 の合成ペプチドに対する反応性がラジオイムノアッセイ（２ウエル）で測定され 、結果が免疫感作および免疫感作前の血清で得られた平均ｃｐｍ値の比として表 された。抗ペプチド血清は、免疫感作ペプチド（下線値）に対する高度の特異性 を持っていた。Dismissal 11TLV-1 synthetic peptide (SP) 1-61. :Reactivity of rabbit serum against Antibody Antigen 5P-I 5P-25P-35P-45P-4A 5P-55P-6αsp-] 58.1 0.5 2.1 0.4 0.9 1.3 0.4 Anti-peptide serum The reactivity to synthetic peptides was measured by radioimmunoassay (2 wells). , the results are expressed as the ratio of the mean cpm values obtained with immunization and pre-immunization serum. It was done. Anti-peptide serum is highly specific for the immunizing peptide (underlined value) I had.
ＥＴＬＶ−１合成ペプチドｉ６に対する抗血清は、ＲＩＡにおいて、１ ： ２ ０００の最小力価を有する免疫感作ペプチドに対して高い特異性で反応した。イ ムノプロットで試験すると、ペプチドＩ、３．４．４＾１６に対する抗血清（夫 々レーン２．４． ６．８、ＩＯ）はＨＴＬＶ−１ｇ９４６および／またはｇｐ ６３と反応したが、免疫感作１１１ｊの血清（夫々レーン１．３．５．８．９ ）では反応しなかった。陽性対照として使用された抗）ＩＴＬＶ−１工ンベロー プモノクローナル抗体１ｃｌｌは、ｇ、４６およびｇｐ６３ （ライン１２）と も反応したが、陰性対照の腹水（Ｐ３Ｘ６３）は反応しなかった（レーン１１） ；これらの結果は図２に示されている。イムノプロット分析において、ｇｐ４６ に対する抗ペプチド抗血清の反応性は、対応するペプチドによって先にインキュ ベートした抗血清によって特異的に阻害された（図３）。また、ｇＭ６に結合す る抗ペプチド抗体の特異性を評価するために、ＨＴＬＶ−１ｇｐ４６ペプチド５ Ｐ−６に対する抗血清が、２００μｇの５Ｐ−６（レーン１）または５Ｐ−５（ レーン２）の何れかと共に予めインキュベートされ、次いて、イムノプロット分 析においてｇｐＪ６と反応された。合成ペプチド５Ｐ−６は、ｇｐ４６と結合す る抗５Ｐ−６抗体を完全に阻害した（レーンｌ）が、５Ｐ−５は疎外しなかった （レーン２）。レーン３は、正常ウサギの血清抗体（プラスペプチド５Ｐ−６） にはｇｐ４６に対する反応性が欠如していることを示している。上記のデータに よって、ＩＩＴＬＶ−１ｇｐ４６由来のペプチド（ＢＴＬＶ−１特異性ペプチド ）は、キャリア分子と結合されると、１７Ｌ１／−１ｇｐ４６に対する抗体を産 生ずるために使用され得ることが示される。Antiserum against ETLV-1 synthetic peptide i6 was tested at RIA at a ratio of 1:2 It reacted with high specificity to the immunizing peptide with a minimum titer of 0.000. stomach When tested on Munoplot, antiserum against peptide I, 3.4.4^16 (husband Lane 2.4. 6.8, IO) is HTLV-1g946 and/or gp 63, but the serum of immunized 111j (lanes 1.3.5.8.9, respectively) ) did not respond. Anti-)ITLV-1 vector used as positive control monoclonal antibody 1cll has g, 46 and gp63 (line 12). also reacted, but the negative control ascites (P3X63) did not react (lane 11) ; these results are shown in Figure 2. In immunoplot analysis, gp46 The reactivity of anti-peptide antisera to was specifically inhibited by the baited antiserum (Fig. 3). In addition, binding to gM6 To evaluate the specificity of anti-peptide antibodies against HTLV-1gp46 peptide 5, Antiserum against P-6 was applied to 200 μg of 5P-6 (lane 1) or 5P-5 ( Lane 2) was pre-incubated with either lane 2) and then immunoplotted. It was reacted with gpJ6 in the analysis. Synthetic peptide 5P-6 binds to gp46. completely inhibited anti-5P-6 antibody (lane 1), but did not alienate 5P-5. (Lane 2). Lane 3 is normal rabbit serum antibody (plus peptide 5P-6) showed a lack of reactivity to gp46. to the above data Therefore, a peptide derived from IITLV-1gp46 (BTLV-1 specific peptide ) produces antibodies against 17L1/-1gp46 when combined with a carrier molecule. It is shown that it can be used to produce
実施例５ 図４Ａおよび図４Ｂに示される結果は、Ｊａｃｏｂｓｏｎ ｅｌ ａｌ。Example 5 The results shown in FIGS. 4A and 4B are from Jacobson el al.
（Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、 （１９８７／１９８８） ｌ：１５３−１６ ２）の方法を使用して１１られたものである。(Viral Immunol, (1987/1988) l:153-16 11 using method 2).
図４Ａ： 患者Ａから得たＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞が、ｔｌＴＬＶ−１ｅｎｖに コードされる合成ペプチド１−１１（表１）と共にインキュベートされ、５１Ｃ ［て標識され、自己のクローン化細胞障害性Ｔ細胞系Ｐ−１０によるペプチド特 異的殺生性を評価するためのターゲットとして使用された。ペプチド５Ｐ−４（ ムーム）て被覆されたＢｌｌ胞、およびＦＩＴＬＹ−１（・−・）に感染した自 己Ｔ細胞の両方が、患者へ由来の細胞障害性Ｔ細胞系Ｐ−１ｎによって殺生され た。未処理の自己Ｂ細胞（○−○）または残りの１１ペプチドの何れかで被覆さ れたＢ細胞（Δ−Δ）は殺生されなかった。Figure 4A: EBV-transformed B cells obtained from patient A were transformed into tlTLV-1 env. Incubated with the encoded synthetic peptide 1-11 (Table 1), 51C [labeled and peptide-specific by the autologous cloned cytotoxic T cell line P-10] It was used as a target to evaluate biocidal properties. Peptide 5P-4 ( Bll cells coated with FITLY-1 (...) and autologous cells infected with FITLY-1 ( Both autologous T cells were killed by the patient-derived cytotoxic T cell line P-1n. Ta. Coated with either untreated autologous B cells (○−○) or the remaining 11 peptides. B cells (Δ-Δ) were not killed.
図５ Ｂ ： ＩＩＬＡ−ＤＲ２において細胞障害性のＴ細胞系Ｐ−１０と適合 する二つの異種Ｂ細胞系（・−・、ムーム）と、ペプチド５Ｐ−４て被覆されて 上記のように細胞障害性試験でターゲットとして使用される、）ＩＬＡ−ＤＲ２ において不適合の一つのＢｍ 胞系（０−○）。ペプチド４Ａて被覆され１１つ ＩＬＡ−ＤＲ２Ｉ：おいて適合するＢ細胞は、Ｔ細胞系Ｐ−１０によって殺生さ れた。Figure 5 B: Compatible with cytotoxic T cell line P-10 in IILA-DR2 Two heterologous B cell lines (..., muum) coated with peptide 5P-4 ) ILA-DR2, used as a target in cytotoxicity tests as described above. One Bm cell line (0-○) that is incompatible. 11 coated with peptide 4A ILA-DR2I: Compatible B cells are killed by the T cell line P-10. It was.
しかるに、ペプチド５Ｐ−４Ａて１皮覆され１１つ）ＩＬＡ−ＤＲ２において不 適合のＢ細胞では、実質的に少しの殺生しか見られなかった。However, peptide 5P-4A (1 coated and 11 coated) was absent in ILA-DR2. Substantially little killing was seen in matched B cells.
これらの結果は、ペプチド５Ｐ−４八により規定されるＨＴＬＶ−１ｇｐ４６の 領域（アミノ酸１９８−２０９）に、ＩＬＡ−ＤＲ２制限細胞障害性Ｔ細胞系て ムｍ゛認されるエピトープが含まれることを示している。These results demonstrate that HTLV-1gp46, defined by peptide 5P-48, region (amino acids 198-209), the ILA-DR2 restricted cytotoxic T cell line This indicates that a commonly recognized epitope is included.
実施例６ Ａ、 合成ペプチド−破傷風トキソイド１９合体を用い、フロイント完全アジュ バント中の該１夏合体５ ｍｇを皮下注射（１０）することにより、並びにフロ イント不完全アジュ／〈シト中の該；夏合体を皮下注射（８，１５，２２，２９ ０）することにより、ウサギを免疫感作した。Example 6 A. Using synthetic peptide-tetanus toxoid 19 conjugate, Freund's complete adjuvant By subcutaneously injecting 5 mg of the 1 summer compound in bundt (10), and Subcutaneous injection of Into Incomplete Aju/〈Shito Incomplete Aju; Natsugitai (8, 15, 22, 29 Rabbits were immunized by 0).
ＨＴＬＶ−Ｉ Ｅｎｖ遺伝子にコードされる合成ペプチドのアミノ酸配列か、表 １に掲載されている。Amino acid sequence of synthetic peptide encoded by HTLV-I Env gene, table It is published in 1.
ＶＳＶ （）ＩＴＬＶ−１）誘導プラーク形成のパーセント阻害を示すデータか 与えられる。ｖＳｖゲノムおよび）ＩＴＬＶ−１エンベロープ糖蛋白を含む偽型 パーティクルの力価が測定され、−回の分析で、＋５０−２００のプラークを与 えた。この試験は、Ｃｌａｍｐｂａｍｅｔ ａｔ 、Ｐｒｏｃ、 Ｎａ１１．＾ ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳ＾８１：２８８６． ＋９８４の方法に従って、Ｄｒ 、Ｐａｕｌ Ｃｌａｐｈａｍによって行われた。この報文の全内容が、本明細書 中に参照として組み込まれる。Data showing percent inhibition of VSV ()ITLV-1) induced plaque formation Given. Pseudotypes containing the vSv genome and) ITLV-1 envelope glycoprotein Particle titers were determined and gave +50-200 plaques in - times analysis. I got it. This test was performed using Clampbamet, Proc, Na11. ^ cad, Sci, US^81:2886. According to +984 method, Dr. , by Paul Clapham. The entire contents of this report are included in this specification. included as a reference.
疫感作回数 １ ２ ３ ４ ４Ａ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１免疫感作 前の血清 ００ ０００ ００００００ ０４ ５０５０ ５００ ０ ０ ０ ＮＤＮＤＮＤＮＤ ＮＤＢ、 破傷風トキソイドに結合された合成ペプチド５ Ｐ−２（ＥＴＬＶ−１１ンベロープアミノ酸８６−１０７を含む）および５Ｐ− ３／４Ａ （ＩＩＴＬＶ−１エンベロープアミノ酸１７６−２０９を含む）に対 する抗ペプチド抗血清を、二匹のヤギ（１２０，２＋）に産生させた。両方のヤ ギから得た抗血清（免疫感作前の血清ではなく）が、ＩＩＴＬＶ−１で感染され た細胞の、非感染ヒトＴ細胞と融合する能力（シンシチウム形成）を阻害した。Number of immunizations 1 2 3 4 4A 5 6 7 8 9 10 11 Immunization Previous serum 00 000 000000 04 5050 500 0 0 0 NDNDNDNDND NDB, synthetic peptide 5 conjugated to tetanus toxoid P-2 (contains ETLV-11 envelope amino acids 86-107) and 5P- 3/4A (containing IITLV-1 envelope amino acids 176-209) Anti-peptide antiserum was raised in two goats (120,2+). both ya The antiserum obtained from the IITLV-1 infection (rather than the pre-immunization serum) The ability of these cells to fuse with uninfected human T cells (syncytium formation) was inhibited.
どのペプチドが、ヤギ２０． ２１においてＨＴＬＶ−１中和抗体の誘発に関係 しているかを確定するために、熱不活性化（５６°Ｃ１３０分）した抗血清が、 １０億分の１モル量のペプチド５Ｐ−２，５Ｐ−３／４＾または陰性対照ジペプ チド５Ｐ−７（ＨＴＩＪ−１エンベロープアミノ酸３７４−３９２を含む）の何 れかと共に、２３°Ｃで１時間、予めインキュベートされた。１０％の熱不活性 化した牛胎児の血清を含む９０１１１のＰＲＭ１１６４０培地中の、５ Ｋ １ ０’のＩＩＴＬＶ−１感染Ｃ９１ＰＬ細胞および５ ｘ １０’の非感染Ｃ８１ ６６ヒトＴ細胞を含んでいるマイクロタイタウエル内に、１０μｍの抗血清か添 加された。このマイクロタイタブレートを、３７°Ｃで一晩、５％ＣＯ２の湿潤 室内でインキュベートされた。次に、シンシテイア（ｓｙｎｃｙｔｉａ）の存在 について、オリンパス０Ｍ−２逆光顕微鏡を用い、２００倍の倍率でマイクロタ イタウエルを調べた。その結果、抗体プラス５Ｐ−２ペプチドをａむウェル中で シンシテイアが増加していることに）ミされるように、ペプチド５Ｐ−２（ＳＰ −３／４＾、または５Ｐ−７ではない）が、投−′ｊ、ｆｉ！Ｌに依存して、＃ ２０および２１抗血請由来の中和抗体の９０％以上を吸収した。ペプチド５Ｐ− ２自身は、Ｃ８１６６またはＣ９］ＰＬ細胞によるシンシティラム影成を誘導し なかった（表示せず）。上記の結果は、＃２０および２１抗血清中の中和抗体が 、ペプチド５Ｐ−２に対して作用することを示している（図５参照）。Which peptide is goat 20. Related to the induction of HTLV-1 neutralizing antibodies in 21 In order to determine whether the Peptide 5P-2, 5P-3/4^ or negative control dipep in a billionth molar amount What about Tido5P-7 (HTIJ-1 envelope amino acids 374-392)? The cells were pre-incubated for 1 hour at 23°C. 10% heat inert 5K1 in PRM11640 medium of 90111 containing fetal bovine serum 0' IITLV-1 infected C91PL cells and 5 x 10' uninfected C81 Add 10 μm of antiserum to microtiter wells containing 66 human T cells. added. The microtiter plate was incubated overnight at 37°C in a humidified 5% CO2 atmosphere. Incubated indoors. Next, the existence of syncytia microtameter at 200x magnification using an Olympus 0M-2 backlight microscope. I looked into Itauer. As a result, in the wells containing antibody plus 5P-2 peptide, Peptide 5P-2 (SP -3/4^, or 5P-7) is a throw-'j, fi! Depending on L, # More than 90% of the neutralizing antibodies derived from the 20 and 21 antibodies were absorbed. Peptide 5P- 2 itself induces syncytillum formation by C8166 or C9] PL cells. There was no (not shown). The above results indicate that the neutralizing antibodies in #20 and 21 antisera , has been shown to act on peptide 5P-2 (see Figure 5).
ＨＴＬＶ−１ペプチド５Ｐ−２（エンベロープアミノ酸８６−１０７ ＞の部分 アミノ酸配列を含む短縮ペプチドか合成され、上記のような吸収実験に用いられ た。）ＩＴＬＶ−１エンベロープアミノ酸８６−９８．８８−９８． ９０−９ ８を含むペプチドのみが、ヤギの抗血清＃２０および２１中の中和抗体を吸収す ることができた。HTLV-1 peptide 5P-2 (envelope amino acids 86-107) A truncated peptide containing the amino acid sequence is synthesized and used in absorption experiments such as those described above. Ta. ) ITLV-1 envelope amino acids 86-98.88-98. 90-9 Only peptides containing 8 absorbed neutralizing antibodies in goat antisera #20 and 21. I was able to
コノ研究によって、ＢＴＩ、Ｖ−１エンベロープアミノ酸９０−９８への中和部 位かマツピングされた（表６参照）。Kono research has shown that BTI, the neutralizing part of V-1 envelope amino acids 90-98, (See Table 6).
表６ ＳＰ−２ペプチドを用いた、ＩＩＴＬＶ−１に対する中和抗体の吸収 吸収され アミノ酸配列 （ａａ８６−１０７） た中和＾ｂＰＨＷＴＫＫＰＮＲＮＧＧＧ ＹＹＳＡＳＹＳＤＰ 十ＧＧＧＹＹＳＡＳＹＳＤＰ − ＰＨＷ、ＴＫＫＰＮＲＮＧＧＧ 十 ＷＴＫＫＰＮＲＮＧＧＧ ＋ ＫＫＰＮＲＮＧＧＧ ＋ ＫＰＮＲＮＧＧＧ −ｔｏ± 実施例７ アミノ末端１１ＴＬＶ−１中和ドメインの変異分析ＨＴＬＶ−１のエンベロープ アミノ酸８８−９８内のどのアミノ酸が、ＨＴＬＶ−１に対する中和抗ペプチド 抗体の吸収に必要とされるかを確定するために、配列アミノ酸の夫々をアラニン で置換した１１のペプチド（２Ｌ１．１から２Ｌ１．１１）が合成された。これ らの１１種の変異アミノ酸、および生のＢＴＬＶ−１配列を持つペプチド２Ｌ− １が、実施例６．Ｂ、で説明したようにして、３つのヤギの抗−５Ｐ−２血清（ ＃２０． ２＋および１２８）内の中和抗体を吸収するために使用された。表７ に示すように、９１位および９３位のアスパラギンをアラニンに置換したペプチ ド（ペプチド１．６および１．８）は、３つの血清の全てにおいてＢＴＬＶ−１ に対する中和抗体を吸収できなかった。Table 6 Absorption of neutralizing antibodies against IITLV-1 using SP-2 peptide absorbed Amino acid sequence (aa86-107) Neutralization^bPHWTKKPNRNGGG YYSASYSDP 10GGGYYSASYSDP - PHW, TKKPNRNGGG 10 WTKKPNRNGGG+ KKPNRNGGG+ KPNRNGGG -to± Example 7 Mutation analysis of the amino-terminal 11 TLV-1 neutralizing domain Envelope of HTLV-1 Which amino acids within amino acids 88-98 form a neutralizing anti-peptide against HTLV-1 To determine which amino acids are required for antibody absorption, each amino acid in the sequence is alanine. Eleven peptides (2L1.1 to 2L1.11) substituted with were synthesized. this Peptide 2L- with 11 kinds of mutant amino acids and the raw BTLV-1 sequence. 1 is Example 6. Three goat anti-5P-2 sera ( #20. 2+ and 128) were used to absorb neutralizing antibodies. Table 7 As shown in the figure, peptides in which asparagine at positions 91 and 93 are replaced with alanine (peptides 1.6 and 1.8) inhibited BTLV-1 in all three sera. could not absorb neutralizing antibodies against it.
また、９０位をアラニン置換したペプチド１．３は、血清＃２１および１２Ｂで 抗体を吸収できず、一方、ベプグード１．５ （９２位がアラニン）は血清＃２ ０中の中和抗体を吸収できなかった。In addition, peptide 1.3 with alanine substitution at position 90 was detected in serum #21 and 12B. Unable to absorb antibodies, on the other hand, Vepgood 1.5 (alanine at position 92) is serum #2 The neutralizing antibody in 0 could not be absorbed.
これらの結果によって、ＢＴＬＶ−１エンベロープアミノ酸のうちで、１９０（ Ｋ）、 ＃９２（Ｐ）、 ＄９３（Ｎ）、および１９５（Ｎ）がＩＩＴＬＶ−１ の中和に重要であることか確認された。These results indicate that among the BTLV-1 envelope amino acids, 190 ( K), #92(P), $93(N), and 195(N) are IITLV-1 It was confirmed that it is important for the neutralization of
図６に掲載されているのは、これが抗血清１２０．２１および１２８の各ペプチ ド吸収に対して得られたＨＴＬＶ−１誘導シンジチアの数を示している点を除き 、表７に要約しであるのと同じ実験の結果である。これらの結果は、１１２０． ２］抗血清で３回、＃１２８抗血請で２回行われた典型的な実験である。This is shown in Figure 6 for each peptide of antiserum 120.21 and 128. except that the numbers of HTLV-1-induced syndithia obtained relative to desorption are shown. , are the results of the same experiment summarized in Table 7. These results are 1120. 2] A typical experiment performed three times with antiserum and twice with #128 antiserum.
表７ ！！ＴＬＶ−１ペプチド変異 中和＾ｂ吸収 ２ＬＩ ＷＴＫＫＰＮＲＮＧＧＧ ＋ ＋ ＋２Ｌ−１，１ＡＴＫＫＰＮＲＮＧ ＧＣ＋ ＋ ＋１．２ ＷＡＫＫＰＮＲＮＧＧＧ 十 十 ＋１．３ ＷＴＡＫ ＰＮＲＮＧＧＧ ＋ −−１，４、ＷＴＫＡＰＮＲＮＧＧＧ ＋ ＋ ＋１．５ ＷＴＫＫＡＮＲＮＧＧＧ −＋ ＋１．６ ＷＴＫＫＰＡＲＮＧＧＧ −−− １，７ＷＴＫＫＰＮＡＮＧＧＧ ＋ ＋ ＋１．８ ＷＴＫＫＰＮＲＡＧＧＧ −−−１，９ＷＴＫＫＰＮＲＮＡＧＧ ± ＋ ＋］、１０ ＷＴＫＫＰＮＲＮ ＧＡＧ ± ＋ ＋１．１１ ＷＴＫＫＰＮＲＮＧＧＡ ± ＋ ＋１、重要な アミノ酸は、全３血清についてＮ （９３）およびＮ （９５＞である。Table 7 ! ! TLV-1 peptide mutations Neutralization^b absorption 2LI WTKKPNRNGGG + + +2L-1,1ATKKPNRNG GC+ + +1.2 WAKKPNRNGGG 10 +1.3 WTAK PNRNGGG + --1, 4, WTKAPNRNGGG + + +1.5 WTKKANRNGGG −+ +1.6 WTKKPARNGGG −−− 1,7WTKKPNANGGG + + +1.8 WTKKPNRAGGG ---1,9WTKKPNRNAGG ± + +], 10WTKKPNRN GAG ± + +1.11 WTKKPNRNGGA ± + +1, important Amino acids are N(93) and N(95> for all three sera.
２、吸収に必要な他のアミノ酸は、血清１２１および＃１２８ではＫ （９０） 、血清＃２０ではＰ （９２）である。2. Other amino acids necessary for absorption are K (90) in serum 121 and #128. , P (92) in serum #20.
３、Ｇ （９６−９８）は、血清＃２０の吸収では重要な働きはしない。3. G (96-98) does not play an important role in the absorption of serum #20.
実施例８ 抗ペプチド抗血清によるＨＴＬＶ−１の中和上記で確定されたＩＩＴＬＶ−１エ ンベロープの中和領域に対して相同な、ＨＴＬＶ−１１エンベロープのアミノ酸 配列（アミノ酸８２−９７）をもったペプチドに対する抗血清が、２匹のヤギで 産生された。このＨＴＬＶ−＋１ペプチド（ＤＰ−９０と称する）は破傷風トキ ソイドに結合され、該複合体がヤギ＃１２０および１３５の免疫感作に使用され た（表８参照）。ＩＩＴＬｖ−１感染Ｃ９１ＰＬ細胞をＢＴＬＶ−１１感染Ｍｏ −Ｔ細胞に置き換えた点を除き、実施例６、Ｂ、に記載したシンシチウム試験に よって７１ＰＩ定すると、これら両方のヤギから得た血清（予め免疫感作された 血清ではなイ）ハ、ＨＴＬＶ−１１を中和した。ＩＩＴＬＶ−１１ペプチドＤＰ −９０に対する抗体は、ＨＴＬＶ−１を中和しなかった。これは、ＢＴＬＶ−Ｉ ＋エンベロープのアミノ酸配列８２−９７が、ＨＴＬＶ−１１型に特異的な中和 部位を含んでいることを示している。Example 8 Neutralization of HTLV-1 with anti-peptide antiserum Amino acids of the HTLV-11 envelope that are homologous to the neutralizing region of the envelope. Antiserum against a peptide with the sequence (amino acids 82-97) was tested in two goats. produced. This HTLV-+1 peptide (referred to as DP-90) and the conjugate was used to immunize goats #120 and 135. (See Table 8). IITLv-1 infected C91PL cells were infected with BTLV-11 Mo - syncytial test as described in Example 6, B, except that T cells were substituted. Therefore, when determining 71PI, serum obtained from both goats (pre-immunized A) C) Serum neutralized HTLV-11. IITLV-11 peptide DP Antibodies against -90 did not neutralize HTLV-1. This is BTLV-I + Envelope amino acid sequence 82-97 is specific for neutralizing HTLV-11 type Indicates that the part is included.
表８ １１ＴＬＶ−１＋ペプチド（ａａ ８２−９７）ＤＰ−９０ＰＨＷＩＫＫＰＮＲ ＱＧＬＧＹＹＳ （Ｃ）ａ；シンシチウム阻害分析で実施 ｂ；９０％以上阻害された最終の血ｆｔ希釈実施例９ 先の研究（Ｐａｌｋｅｔ ｅｔ ａｌ、１． Ｉ＋ｔ＋ｍｕｎｏ！、１４２：３ ６１２−３６１９゜１９８９； Ｈａｒｔ ｅｔ ａｌ、 Ｉ、 Ｉｍｍｕｎｏ ｌ、１４５：２６７？ −２６８５，１９９０）において、Ｔヘルパー細胞によ って認識される部位およびヒト免疫不全ウィルス１型（ＨＩＶ−１）の（Ｂ細胞 ）中和部位を含む合成ペプチドが、ペプチドを破傷風トキソイド等のキャリア分 子に結合させる必要なくして、ＨＩＶ−１単離物に対する中和抗体を誘発てきる ことが実証された。ＩＩＴＬＶ−１ペプチドを破傷風トキソイド等のキャリア分 子に結合させる必要を回避することを目的として、ＨＴＬＶ−１エンベロープア ミノ酸＋８３−２０９に対してアミノ末端に合成された、ＨＴＬＶ−１エンベロ ープペプチドアミノ酸＋８３−２０９を含むキメラＨＴＩＶ−１ペプチドは、ネ ズミＴヘルパー細胞によって認識される部位（アミノ酸１９０−２０９、 Ｋｕ ＋ａｌａ ｅｌ ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４３：２０２４−２０３０． １９８９）と、中和モノクローナル抗体０．５アルフアによって認識される部 位（アミノ酸１８６−１９５． Ｒａ１ｓｔｏｎｅｔ ａｌ、１． Ｂｏｉｌ、 Ｃｂｅｍ、２６４：１６３４３−１６３４６． １９８９ ）及び中＋１＋ネズ ミモノクローナル抗体によって認識される部位（アミノ酸１９０−１９９． Ｔ ａｎａｋａ ｅｔ ａｌ、ｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４７：３５４−３６０ ）と 、更にＣＤ４＋、ヒト細胞障害性Ｔ細胞（Ｊａｃｏｂｓｏｎ ｅｌ ａｌ、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４６１１５５〜１１６２． １９９１ ）によって認識され る部位（アミノ酸１９６−２０９ ）とを含んでいる（図６を参照のこと）。二 匹のヤギを免疫感作するために用いると、）ＩＴＬＶ−１（力価＝ ］／２０） を中和する抗血清か得られた。中ｔｏ抗体はペプチド５Ｐ−２（アミノ酸８６− １０７）で吸収され１するか、ペプチド５Ｐ−３／４＾ （アミノ酸１７６−２ ０９ ）では吸収されなかった。これは、キャリア分子とカップリングさせる必 要なくして、該キメラペプチドか中ＦＩＪ抗体を誘発し１することを示している 。更に、このペプチドによって誘発される全てのＩＩＴＬＶ−１に対する中和抗 体は、上記の中和ドメインに肘して作用し、該ペプチド内に含まれる先に定義し た他の中和部位に対しては作用しなかった。Table 8 11TLV-1 + peptide (aa 82-97) DP-90PHWIKKPNR QGLGYYS (C)a; Performed by syncytial inhibition assay b; Final blood ft dilution with 90% or more inhibition Example 9 Previous research (Palket et al., 1. I+t+muno!, 142:3 612-3619゜1989; Hart et al, I, Immuno l, 145:267? -2685, 1990) by T helper cells. and the site recognized by human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) (B cells). ) A synthetic peptide containing a neutralizing moiety is used to transfer the peptide to a carrier such as tetanus toxoid. can induce neutralizing antibodies against HIV-1 isolates without the need for binding to children This has been proven. IITLV-1 peptide in a carrier such as tetanus toxoid In order to avoid the need to bind children, the HTLV-1 envelope handler HTLV-1 envelope synthesized at the amino terminus for amino acids +83-209 Chimeric HTIV-1 peptide containing amino acids +83-209 Site recognized by Zumi T helper cells (amino acids 190-209, Ku +ala el al,, J, Immunol, 143:2024-2030. 1989) and the region recognized by the neutralizing monoclonal antibody 0.5 alpha. position (amino acids 186-195. Ra1stonet al, 1. Boil, Cbem, 264:16343-16346. 1989) and medium+1+nezu Site recognized by monoclonal antibody (amino acids 190-199.T anaka et al., Immunol, 147:354-360) and , further CD4+, human cytotoxic T cells (Jacobson el al, J. Immunol, 1461155-1162. (1991) was recognized by (See Figure 6). two When used to immunize goats, )ITLV-1 (titer = ]/20) An antiserum was obtained that neutralized the The intermediate to antibody is peptide 5P-2 (amino acid 86- 107), or peptide 5P-3/4^ (amino acid 176-2 09) was not absorbed. This requires coupling with a carrier molecule. The results show that the chimeric peptide induces FIJ antibodies without the need for . Furthermore, all neutralizing anti-IITLV-1 antibodies induced by this peptide The body acts on the above-mentioned neutralizing domain and contains the previously defined It had no effect on other neutralized sites.
以上、明瞭化と理解を計る目的で、上述の発明を実施例に従って詳細に説明した 。当業者であれは、ここに開示した内容を読むことによって、）ＩＴＬＶ−１の ワクチンが更に、ＩＩＴＬＶ−１の膜通過蛋白の親水性エンベロープ領域に対応 する少なくとも一ツノ合成ヘフチド、好ましくは、ＹＡＡＱＩＩＲＲＧＩＤＬＩ ＦＷＥＱＧＧＦＬＣ（アミノ酸３７４−３８８ ） ； ＣＲＦＰＮＩＴＮＳ） ｌＶＰＩｔＱＥ （７ミ／Ｍ ３９９−４１５） １ＣＰＩＬＱＥＲＰＰＬＥＮ Ｒ（アミノ酸４１１−４２２） 、 ＣＩＬＲＱＬＲＩ’ＩＬＰＳＲＶＲＹＰＩ ＩＹＳ （７ミ／酸４６２−４８０）を具備し１７ることは明らかてあろう。ま た、本発明の範囲を逸脱することなく、形式および詳細における種々の組み合わ せがなされ得ることも明かであろう。The above-mentioned invention has been described in detail according to examples for the purpose of clarity and understanding. . Those skilled in the art, after reading the disclosure herein, will be able to understand the ITLV-1 The vaccine also addresses the hydrophilic envelope region of the transmembrane protein of IITLV-1. at least one synthetic heftide, preferably YAAQIIRRGIDLI FWEQGGFLC (amino acids 374-388); CRFPNITNS) lVPItQE (7mi/M 399-415) 1CPILQERPPLEN R (amino acids 411-422), CILRQLRI'ILPSRVRYPI IYS (7 mi/acid 462-480). Ma Various combinations in form and detail may also be made without departing from the scope of the invention. It is also clear that they can be harassed.
上記に引用した全文献の内容は、その全体が参考として本明細書に組み込まれ、 根拠とされる。The contents of all documents cited above are incorporated herein by reference in their entirety; It is considered as evidence.
ＦＩＧ、Ｉ Ｃ”ｌ／！ ｆｆ ＦＩＧ、２ ｍｌ リ、Ｏ く 廿 シンシティア＃ Ｆ Ｉ Ｇ、 ６Ａ アラニンに変化したアミノ酸 アラニンに変化したアミノ酸 アラニンに変化したアミノ酸 フロントページの続き （５１） Ｉｎｔ、 Ｃ１，６識別記号 庁内整理番号ＧＯＩＮ ３３１５３ Ｖ ８３１０−２Ｊ３３１５７４ Ｃ９０１５−２Ｊ ＩFIG.I C"l/! ff FIG.2 ml li, O Ku 廿 Cynthia# F I G, 6A Amino acid converted to alanine Amino acid converted to alanine Amino acid converted to alanine Continuation of front page (51) Int, C1, 6 identification symbol Internal reference number GOIN 33153 V8310-2J331574 C9015-2J I
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