JPH07502016A - Isolation of charged particles from fluids - Google Patents
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Classifications
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- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】 流体からの荷電粒子の単離 本発明は、イオン交換体を用いた流体からの荷電粒子の分離方法に関する。詳細 には、本発明は、乳および乳製品のごとき生物学的流体からの蛋白成分の抽出に 適する。特に乳および乳製品からの蛋白成分の抽出に関して本発明を以下に記載 するのが便利であるが、本発明は、それに限定されないことを理解すべきである 。[Detailed description of the invention] Isolation of charged particles from fluids The present invention relates to a method for separating charged particles from a fluid using an ion exchanger. detail The invention relates to the extraction of protein components from biological fluids such as milk and dairy products. Suitable. The invention is described below with particular reference to the extraction of protein components from milk and milk products. Although it is convenient to do so, it should be understood that the present invention is not limited thereto. .
乳は、栄養を供給するために、すべての種の哺乳動物により分泌され、子供に免 疫性および非免疫性の保護を与える。乳は水、脂肪、炭水化物、塩類、ビタミン および種々雑多な成分からなる。子供および成人は、多量の牛乳を消費しており 、したがって、該流体は栄養的にも商業的にも重要である。広義には、牛乳蛋白 （３０〜３５ｇ／Ｌ）は、カゼイン（約８０％）、乳清蛋白（約２０％）および 多種の主要でない蛋白／酵素成分からなる。商業的規模で使用できる迅速かつ効 率の良い分離法がないために、連続的かつ拡張的な乳蛋白フラクションの利用が 妨げられている。Milk is secreted by all species of mammals to provide nutrition and to provide immunity to children. Provides epizootic and non-immune protection. Milk is water, fat, carbohydrates, salts, and vitamins. and various miscellaneous ingredients. Children and adults consume large amounts of milk. , thus the fluid is of nutritional and commercial importance. In a broad sense, milk protein (30-35g/L) contains casein (about 80%), whey protein (about 20%) and Consists of a variety of minor protein/enzyme components. Fast and effective for use on a commercial scale Continuous and expanded utilization of milk protein fractions is hampered by the lack of efficient separation methods. hindered.
チーズおよび酸カゼインの製造過程においてカードから分離する乳清（黄緑色液 体）は、長い間、乳製品工業における不要副産物であると考えられてきた。乳清 中の蛋白は、牛乳蛋白全体の約２０％になる。乳清の主要な蛋白性成分は、β− ラクトグロブリンおよびα−ラクトアルブミンてあり、これら２種の小型の球状 蛋白は、乳清蛋白全体の７０〜８０％になる。主要でない蛋白成分は、グリコマ クロペプチド、血清アルブミン、ラクトフェリン、免疫グロブリン、ホスホリポ 蛋白および多種の酵素（ラクトペルオキ／ダーゼを含む）を含む。噴霧乾燥乳清 粉末および乳清蛋白濃縮物（ＷＰＣ）の製造は、これらの蛋白の潜在能力のほん の一部を現実のものとしているに過ぎない。個々の乳清蛋白が、食品および池の 工業において栄養的、機能的生物学的に大きな価値のある製品を生み出すと信じ られているため、個々の乳清蛋白を単離することは有利であろう。例えば、ラク トフェリンおよびラクトペルオキ／ダーゼのごとき主要でない成分は、天然型の 抗菌剤として役立つ可能性があり、したがって、ヒトの医薬および獣医分野の医 薬の領域に属するっさらに、ラクトフェリンはヒトの乳中において高濃度（約２ ｇ／Ｌ）であることが分かっているので、精製ウソ・ラクトフェリンの供給は、 新世代の乳幼児用処方物の調製を容易ならしめるであろう。Whey (yellow-green liquid) separated from curd during the production of cheese and acid casein body) has long been considered an unnecessary by-product of the dairy industry. whey The protein in it is about 20% of the total milk protein. The main protein component of whey is β- Lactoglobulin and α-lactalbumin, two small, spherical Protein accounts for 70-80% of the total whey protein. The non-major protein component is glycoma Clopeptide, serum albumin, lactoferrin, immunoglobulin, phospholipo Contains proteins and various enzymes (including lactoperoxidase/dase). spray dried whey The production of powders and whey protein concentrates (WPC) is only a fraction of the potential of these proteins. It is only a part of reality. Individual whey proteins are present in foods and ponds. We believe in producing products of great nutritional, functional and biological value in industry. It would be advantageous to isolate individual whey proteins because of their For example, easy Minor components such as toferin and lactoperoxidase/dase are present in their natural form. It has the potential to serve as an antimicrobial agent and is therefore useful in human medicine and veterinary medicine. Furthermore, lactoferrin belongs to the field of medicine and has a high concentration (approximately 2 g/L), the supply of purified bogus lactoferrin is It will facilitate the preparation of a new generation of infant formulations.
主要でない乳清蛋白成分は低濃度であるため、その単離は相変わらず多量の乳清 または乳の加工を要する。過去において、該加工においてはカラムまたはバッチ 式クロマトグラフィー的方法が通常用いられていた。ラクトフェリンおよびラク トペルオキ／ダーゼ双方の等電点（ｐｉ）は９．０よりも大きいが、その一方て 乳清蛋白の大部分は５．１ないし５．４付近の等電点を有する。カゼインの等電 点は４．６である。チーズ乳清からの主要でない蛋白／ペプチド成分（主として ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼ）の単離に関して、カチオン交換 クロマトグラフィー法が記載されている。この方法は、通常、伝統的なカラム充 填型ベッドに属する適当なカチオン交換樹脂による蛋白成分の吸着に依存してい る。Due to the low concentration of minor whey protein components, their isolation remains a challenge for large amounts of whey. Or milk must be processed. In the past, the process used column or batch Formula chromatographic methods were commonly used. Lactoferrin and Lactoferrin The isoelectric points (pi) of both topelox/dase are greater than 9.0; Most whey proteins have an isoelectric point around 5.1 to 5.4. Isoelectricity of casein The score is 4.6. Minor protein/peptide components from cheese whey (mainly Cation exchange for the isolation of lactoferrin and lactoperoxidase) A chromatographic method is described. This method typically uses traditional column packing. It relies on the adsorption of protein components by a suitable cation exchange resin belonging to the packed bed. Ru.
ペルキー国特許明細書第９０１６７２号には、ジルコン、チタン、珪素（水晶） またはアルミニウムの酸化物混合物によりイオン交換能を付与されたアルギン酸 カル／ウム媒体によるイオン交換法の別法が記載されている。撹拌タンク内で、 乳または乳清をイオン交換体を混合し、それにより７５以上の等電点を有する蛋 白をイオン交換体に吸着させる。平衡化後、乳または乳清から該イオン交換ゲル を機械的に分離し、塩化カルシウムで洗浄し、希釈する。慣用的なイオン交換カ ラムは乳製品を供給すると汚れ易いため、該ベルギー国特許の方法は、この一般 的でない方法論を取り入れている。バストリゼーンヨン／分離された乳清中に通 常見られる脂肪、カゼインおりおよび他の微粒子成分が、カラム汚染物質として 作用し、樹脂の能力および生成物の回収率双方を低下させるため、クロマトグラ フィー的方法による伝統的なカラムにおいて問題を生じる。Pelky National Patent Specification No. 901672 contains zircon, titanium, silicon (crystal) or alginic acid endowed with ion exchange capacity by an aluminum oxide mixture An alternative method of ion exchange with Cal/M media has been described. In the stirring tank, Milk or whey is mixed with an ion exchanger to produce proteins with an isoelectric point of 75 or higher. Adsorb white onto an ion exchanger. After equilibration, the ion exchange gel is extracted from milk or whey. Mechanically separate, wash and dilute with calcium chloride. Conventional ion exchanger Since lamb is easily contaminated when fed with dairy products, the method of the Belgian patent is based on this general method. Incorporating unconventional methodology. Vast concentration/passed into the separated whey Commonly found fats, casein and other particulate components are column contaminants. chromatography, reducing both resin performance and product recovery. This creates problems in traditional columns using fee-based methods.
伝統的なイオン交換カラムが詰まるという問題は、国際特許出願ＰＣＴ／５Ｅ８ ８１００６４３ （Ｗ０８９１０４６０８）において述べられており、その中で 、強力チオン交換ベッドを用いた乳清からのラクトペルオキシダーゼおよびラク ト７エリンの純粋なフラクンタンの抽出が記載されている。目詰まりの問題を避 けるために、この特許出願は、乳副産物をイオン交換ベッドと接触させる前に、 これをクロスフロー精密濾過することを必要とする。使用するクロスフロー精密 濾過膜は１４ミクロンの孔サイズを有している。The problem of clogging of traditional ion exchange columns has been addressed in international patent application PCT/5E8. 8100643 (W089104608), in which , lactoperoxidase and lactoperoxidase from whey using a strong thione exchange bed Extraction of pure frucuntane of to7erin is described. Avoid clogging problems In order to ensure that the milk by-product is This requires cross-flow microfiltration. Crossflow precision used The filtration membrane has a pore size of 14 microns.
精密濾過工程が、カチオン交換ベッドの目詰まりを避けるのを助けるのであるが 、ＰＣＴ、／５Ｅ８８１００６４３記載の方法は、カラム式イオン交換クロマト グラフィーの欠点（すなわち高画なカラム機材およびイオン交換樹脂を要すこと 、樹脂の調製および洗浄に時間がかがること、およびカラムが乾燥しないように する必要があること）を解決できていない。さらなるクロスフロー精密濾過工程 もまた、さらなる設備および操作時間を要する。Although the microfiltration process helps avoid clogging of the cation exchange bed. , PCT, /5E88100643 is a method using column ion exchange chromatography. Disadvantages of graphography (i.e., the need for sophisticated column equipment and ion exchange resins) , the time required to prepare and wash the resin, and to prevent the column from drying out. (what needs to be done) has not been resolved. Further cross-flow microfiltration process also requires additional equipment and operating time.
ついに、イオン交換体の担体どして役立つ多孔性膜に流体を通す単一工程におい て、イオン交換クロマトグラフィーの利点が見い出されるに至った。Finally, in a single step, the fluid is passed through a porous membrane that serves as a carrier for the ion exchanger. As a result, the advantages of ion exchange chromatography were discovered.
本発明によれば、 多孔性膜１に配置されたイオン交換体を用侍し、流体を膜に通し、荷電分そを優 先的にイオン交換体に吸着させ、吸着しまた分子をイオン交換体から溶離させる ことを特徴とする、流体がらの荷電分子の分離方法が提供される。According to the invention, An ion exchanger placed in the porous membrane 1 is used to pass the fluid through the membrane and to selectively separate the charges. First adsorb onto an ion exchanger, then adsorb and elute the molecules from the ion exchanger. Provided is a method for separating charged molecules from a fluid, characterized in that:
上記方法を、流体からのいがなる荷電分子の分離に用いてもよい。本明細書中、 「分子」なる語はかかる分子のν集物をも包含する。詳細には、該方法は、乳ま たは乳製品、血液または血漿のごとき生物学的流体、あるいは発酵液、細胞培養 液のごとき他の形態の流体等の処理に適するつ本明細書中、「乳または乳製品」 なる語は、スキムミルク、乳清、発羽等のごとき乳製品を包含する。該方法を用 いてラクトフェリン、ラクトペルオキシダーゼ、増殖促進因子および１１ゾチー ムのごときカチオン性蛋白成分を乳または乳製品から単離してもよい。該方法を 用いてα−ラクトアルブミ゛／、グリコマクロペプチド、血清アルブミン、免疫 グロブリンおよび酵素のごとき他の荷電分子を単離してもよい。The above method may be used to separate charged molecules from a fluid. In this specification, The term "molecule" also encompasses v collections of such molecules. In particular, the method or dairy products, biological fluids such as blood or plasma, or fermentation fluids, cell culture In this specification, "milk or dairy products" suitable for processing other forms of fluids such as liquids, etc. The term encompasses dairy products such as skim milk, whey, whey, etc. using this method lactoferrin, lactoperoxidase, growth-promoting factors and Cationic protein components such as milk may be isolated from milk or milk products. the method Used for α-lactalbumin/, glycomacropeptide, serum albumin, immunity Other charged molecules such as globulins and enzymes may also be isolated.
また、本発明方法を、池の生物学的流体（例えば、血液および血漿のごとき血液 産物）からの荷電分子の単離に用いてもよい。例えば、凝血因子、血清アルブミ ンおよび免疫グロブリンを血液または血漿がら単離してもよい。The method of the present invention can also be applied to pond biological fluids (e.g., blood, such as blood and plasma). may be used to isolate charged molecules from products). For example, clotting factors, serum albumin The immunoglobulins and immunoglobulins may be isolated from blood or plasma.
本発明を、医薬品、ビタミン、ホルモンあるいは治療用蛋白を単離するための発 酵液または細胞培養液のごとき他の流体を処理するのに用いてもよい。The invention can be used to develop pharmaceuticals, vitamins, hormones or therapeutic proteins for isolation. It may also be used to treat other fluids such as fermentation fluids or cell culture fluids.
本発明方法を用いて、乳または乳製品のごとき大量の流体を効率良く濾過し、伝 統的クロマトグラフィー的方法を用いたのでは単離困難な主要でない蛋白種を単 一操作で抽出してもよい。伝統的なイオン交換体を詰まらせる脂肪球および蛋白 性凝集物が該多孔性膜を通過しないようにし、膜の保持液側に保持しておいて、 イオン交換体がラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼのごとき有用蛋白 種をトラップできるようにする。The method of the present invention can be used to efficiently filter and transport large volumes of fluids such as milk or dairy products. Isolates non-major protein species that are difficult to isolate using standard chromatographic methods. It may be extracted in one operation. Fat globules and proteins that clog traditional ion exchangers Preventing the sexual aggregate from passing through the porous membrane and retaining it on the retentate side of the membrane, Ion exchangers are useful proteins such as lactoferrin and lactoperoxidase. Enables trapping of seeds.
膜上にミクロンまたはミリター・ターのオーダーの厚さで配置されたイオン交換 体により、乳のごとき流体からある種の蛋白種を効率良く高収率で抽出できるこ とが見いだされている。過去においては、かかる種を効率良（高収率で得るには 、長いイオン交換カラムおよび長い滞留時間が必要であると考えられていた。Ion exchange placed on a membrane with a thickness on the order of a micron or millimeter The body can efficiently extract certain protein species from fluids such as milk with high yields. It has been found that In the past, it was difficult to obtain such seeds efficiently (high yields). , long ion exchange columns and long residence times were thought to be necessary.
イオン交換膜に適する孔サイズは、約１１から約１２ミクロンまでであり、好ま しくは約０２ないし約０６ミクロン、最も好ましくは０．４ミクロンであるっ本 発明方法は、簡単に汚れるイオン交換カラムを用いるのではなく、本発明方法で 用いる膜は、膜でもってすべての微粒子物質を排除することが重要でないという 理由で、ＰＣＴ／５Ｅ８８１００６４３に用いられたクロスフロー精密濾過法に 用いるものよりもやや大きい孔の膜である。やや大きな孔は、本発明において、 高い透過流速を達成することを助ける。所望であれば、流体を該膜に通す前に、 精密＃過工程に付してもよい。Suitable pore sizes for ion exchange membranes are from about 11 to about 12 microns, with preferred or about 0.02 to about 0.6 microns, most preferably 0.4 microns. The inventive method does not use an ion exchange column that is easily contaminated. It is important that the membrane used excludes all particulate matter. For this reason, the cross-flow microfiltration method used in PCT/5E88100643 This is a membrane with slightly larger pores than the one used. In the present invention, a rather large hole is Helps achieve high permeate flow rates. If desired, before passing the fluid through the membrane, It may also be subjected to a precision overstep.
デノドエント濾過法あるいはクロスフロー濾過法いずれによっても流体を膜に廼 寸ことができる。慣用的なデソドエントまたは静圧濾過は、フィルターに垂直に 物質を供給する力を要するが、クロスフロー濾過は、平行な２枚のフィルター間 の狭い隙間に供給物質を、大きな線速度でフィルター表面を横切るように通過さ せることを要する。Fluid is directed to the membrane by either denodent filtration or cross-flow filtration. It can be measured. Conventional desodont or hydrostatic filtration is carried out perpendicularly to the filter. Cross-flow filtration requires a force to supply the substance, but cross-flow filtration is performed between two parallel filters. The feed material is passed across the filter surface at high linear velocity through a narrow gap in the filter. It is necessary to
他のイオン交換体の場合と同様に、連続的に高い塩濃度の溶液を用いて／あるい は溶離液のｐＨを連続的に変化させて、イオン交換体のｐＨを蛋白のごとき所望 の荷電分子の等電点以上もしくは以下にシフトさせることにより、本発明に使用 できる膜から定量的に溶離させる。したがって、種々の荷電分子間のｐ＋または 池の結合パラメーターの相違を利用して、例えばＰＣＴ／５Ｅ８８１００６４３ 記載のごとく、相対的に純粋なそれぞれの荷電分子のフラクションを得ることが できる。As with other ion exchangers, continuous high salt concentration solutions/or Continuously changes the pH of the eluent to adjust the pH of the ion exchanger to the desired Used in the present invention by shifting the isoelectric point of the charged molecules of quantitatively elute from the resulting membrane. Therefore, p+ or For example, PCT/5E88100643 As described, it is possible to obtain relatively pure fractions of each charged molecule. can.
特定の蛋白の優先的結合を用いて、他の蛋白に優先して流体から１種の蛋白を単 離してもよい。例えば、ラクトフェリンは、ラクトペルオキシダーゼよりも固く 膜に結合するので、ラクトペルオキシダーゼを膜から追い出して入れ代わる。Preferential binding of specific proteins is used to isolate one protein from a fluid in preference to other proteins. You can let go. For example, lactoferrin is more rigid than lactoperoxidase. It binds to the membrane, displacing lactoperoxidase from the membrane.
したがって、膜をラクトフェリンで飽和させて、ラクトフェリンおよびラクトペ ルオキシダーゼ双方を含む乳製品から相対的に純粋なラクトフェリンのフラクシ ョンを単離し、でもよい。Therefore, by saturating the membrane with lactoferrin, lactoferrin and lactopene Relatively pure lactoferrin flux from dairy products containing both oxidase and It is also possible to isolate the
流体を膜に通過させた直後（すなわち膜の上流側の表面に付いた脂肪球および蛋 白性残渣をクリーニングする前）から荷電分子の溶出を開始することができる。Immediately after fluid passes through the membrane (i.e., fat globules and proteins attached to the upstream surface of the membrane) The elution of charged molecules can begin before cleaning the white residue.
別法として、例えば、溶離溶媒を供給する前に、かかる物質を膜からクリーニン グすることができる。Alternatively, such materials may be cleaned from the membrane, e.g., before supplying the elution solvent. You can
伝統的なイオン交換カラムとは異なり、本発明で用いられる膜は、交換体の膨潤 またはパラキンクの問題がなく、維持がより簡単である。例えば、もしイオン交 換膜が乾いた場合でも詰め直す必要がない。さらに、衛生化または滅菌法がより 多様で、蒸気処理、界面活性剤あるいは水酸化ナトリウムのごときアルカリ溶液 のごとき乳製品工業で用いられている現存法が適用できる。Unlike traditional ion exchange columns, the membrane used in this invention Or no parakink issues and easier to maintain. For example, if ion exchange Even if the membrane dries out, there is no need to refill it. In addition, sanitization or sterilization methods are more Variety, steam treatment, surfactants or alkaline solutions such as sodium hydroxide Existing methods used in the dairy industry, such as:
強または弱あるいはカチオンまたはアニオン交換体いずれをを用いてもよい。Either strong or weak, cation or anion exchangers may be used.
「強」および「弱」なる語は、イオン交換体の官能基のｐＨによるイオン化の程 度を言う。強イオン交換官能基は広いｐＨ範囲にわたり総体的にイオン化する。The terms "strong" and "weak" refer to the extent to which the functional groups of the ion exchanger are ionized by pH. Say the degree. Strong ion exchange functionalities are globally ionized over a wide pH range.
強力チオン交換官能基（例えばスルホプロピル）は、ｐＨ２以上で総体的にイオ ン化（脱プロトン化）する。交換体を選択して所望の荷電分子の結合を確実にし てもよい。例えば、ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼのｐ＋が９゜ ５付近であり、一方乳清蛋白の大部分が５．４以下のｐＴを有するので、強力チ オン交換体を用いて高いｐｉ値を有する蛋白種の結合を確実にしてもよい。この 場合、適当な強力チオン交換体は、対称的なポリアミド担体上に配列したスルホ ン酸官能基からなる。Strong thione-exchanging functional groups (e.g. sulfopropyl) have an overall ionic effect at pH 2 and above. (deprotonation). Select the exchanger to ensure binding of the desired charged molecule It's okay. For example, p+ of lactoferrin and lactoperoxidase is 9° 5, while the majority of whey proteins have a pT of 5.4 or less, making it a strong titer. On-exchangers may be used to ensure binding of protein species with high pi values. this In the case of It consists of an acid functional group.
ポリマーを不活性多孔性膜上に付け、ついで所望のカチオンまたはアニオン性官 能基を導入することによる２段階法でかかる膜を調製してもよい。したがって、 広い範囲の孔サイズおよびポリマー量が利用できることが明らかである。本発明 に用いられる膜を、慣用的なりロスフローカートリッジ（モジュール）またはデ ッドエンドフィルターの形態で提供することがてきる。The polymer is applied onto an inert porous membrane and then the desired cationic or anionic functionality is applied. Such membranes may be prepared in a two-step process by introducing functional groups. therefore, It is clear that a wide range of pore sizes and polymer amounts can be utilized. present invention membranes used in conventional loss-flow cartridges (modules) or devices. It can be provided in the form of a head-end filter.
本発明の産物として得られる流出物もまた有利な特性を有している。例えば、チ ーズ乳清からのカチオン性蛋白であるラクトフェリンおよびラクトペルオキシダ ーゼの抽出は、これらのカチオン性蛋白が乳清蛋白全体の３％未満であるという 理由で、供給物質として用いたのと本質的に変わらない乳清製品を生じる。さら に、該方法はまた、この乳清製品中には微粒子がなく、微生物および脂肪もごく 僅かしかないことを保証する。したがって、この乳清製品をさらに、高い溶解度 をはじめとする利点を伴った低脂肪乳清蛋白濃縮粉末に加工してもよい。The effluent obtained as a product of the invention also has advantageous properties. For example, chi lactoferrin and lactoperoxidase, cationic proteins from milk whey These cationic proteins account for less than 3% of the total whey protein. This results in a whey product that is essentially the same as that used as feed material. Sara Additionally, the method also ensures that the whey product is free of particulates and has very little microorganisms and fat. I guarantee there will be very little. Therefore, this whey product can be further enhanced with high solubility. It may be processed into a low-fat whey protein concentrate powder with benefits such as:
本発明方法の好ましい具体例を、添付図面を参照にして実施例により説明する。Preferred embodiments of the method of the invention will be explained by way of example with reference to the accompanying drawings.
図１：精製蛋白および牛乳由来の製品双方を用いたクロスフロー膜イオン交換法 の実験装置の模式図である。本明細書に示すデータのパラメーターを以下のごと （定義する 結合容ＩＩ （ｍｇ／Ｃｍ２）＝ Ｉ （Ｃ９ＸＶＩ）＋ （ｃ、 ｘｖ、）ｌ 、、。Figure 1: Cross-flow membrane ion exchange method using both purified protein and milk-derived products FIG. 2 is a schematic diagram of the experimental apparatus. The parameters of the data shown in this specification are as follows. (Define binding capacity II (mg/Cm2) = I (C9XVI) + (c, xv,)l,,.
／′モノニール表面積（ｃｍ２）；ここにＣ＝溶液濃度（ｍｇ／Ｌ）、ｖ＝体積 （Ｌ）。/'Mononyl surface area (cm2); where C=solution concentration (mg/L), v=volume (L).
回収率（％）＝ ［Ｉ （ｃｃｘｖｏ）＋ （Ｃ，ＸＶＴ）ｌ 負、＋ ［（ｃ 、ｘｖ、） ＋（ｃ。Recovery rate (%) = [I (ccxvo) + (C, XVT)l negative, + [(c , xv, ) + (c.
Ｘｖ、）ｌ、、］ Ｘ１００／ （ｃ：ｘｖ：）：ここにＣ＝溶質濃度（ラクト ペルオキシダーゼについては活性、ラクトフェリンについてはＨＰＬＣ分析）、 ■＝体積（Ｌ）、１）”透過液、ｒ＝保持液、ｌ＝初発供給物質。Xv,)l,,]X100/(c:xv:): where C=solute concentration (lacto activity for peroxidase, HPLC analysis for lactoferrin), ■=volume (L), 1)"permeate, r=retentate, l=initial feed material.
図２ 精製蛋白および牛乳由来の製品双方を用いたデッドエンド膜イオン交換法 の実験装置の模式図である。ここに示すデータのパラメーターを以下のごとく定 義する：結合容量（ｍｇ／ｃｍ２）＝ （ｃ−ＸｖＪ ／フィルター表面積（ｃ ｍ’）：ここにＣ＝溶質濃度（ｍｇ／ｍＬ） 、ｖ＝体積（ｍＬ）。溶出率（％ ）＝ｆ（ｃ、ｘｖ、） Ｘ１００／ （（ｃ：ｘｖ＝） −（ｃ＋ｘｖ＋） − （ｃ、ｘｖ−） Ｉ 、回収率（％）＝ ｌ （ｃ＋Ｘｖ＋）＋ （ｃ、ｘｖ、 ）＋ （ｃ、ｘｖ、）Ｉ Ｘ１００／（ｃ：Ｘｖ＋）：ここにＣ＝溶質濃度（ラ クトペルオキ／ダーゼについては活性、ラクトフェリンについてはＩ（Ｐ Ｌ Ｃ分析）、■＝体積（ｍＬ）、ｆ＝濾液、Ｗ＝洗液、ｅ＝溶出液、！＝初発供給 物質。Figure 2 Dead-end membrane ion exchange method using both purified protein and milk-derived products FIG. 2 is a schematic diagram of the experimental apparatus. Define the parameters of the data shown here as follows. Definition: Binding capacity (mg/cm2) = (c-XvJ/filter surface area (c m'): where C = solute concentration (mg/mL), v = volume (mL). Elution rate (% )=f(c, xv,) X100/((c:xv=)-(c+xv+)- (c, xv-) I, recovery rate (%) = l (c+Xv+) + (c, xv, ) + (c, xv,) I X100/(c:Xv+): where C = solute concentration activity for cutoperox/dase, and I(PL) for lactoferrin. C analysis), ■ = volume (mL), f = filtrate, W = washing liquid, e = eluate, ! = initial supply material.
図３ りん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，７）中の純粋蛋白のクロスフロー膜イ オン交換１１！遇における透過流束（ム）、ラクトペルオキ／ダーゼ活性（・） およびラクトフェリン濃度（■）。供給物質中の初発レベル・ラクトペルオキ／ ダーゼ５．３ １Ｕ／ｍＬ＋ラクトフェリン１００．０ｍｇ／Ｌ０図４：りん酸 ナトリウム緩衝Ｗ！ （ｐＨ６，７）中の純粋蛋白のクロスフロー膜イオン交換 濾過により得られた試料のＨＰＬＣクロマトグラム。ａ、供給物質：ｂ、１０７ Ｌ操作後の透過液： ｃ、０．２Ｍ ＮａＣＩでの溶出液（１：２４希釈）。Figure 3 Cross-flow membrane diagram of pure protein in sodium phosphate buffer (pH 6, 7) On exchange 11! Permeation flux (mu), lactoperoxydase activity (・) and lactoferrin concentration (■). Initial level of lactoperoxygen in feed material/ Dase 5.3 1U/mL + Lactoferrin 100.0mg/L0 Figure 4: Phosphoric acid Sodium buffer W! Cross-flow membrane ion exchange of pure protein in (pH 6, 7) HPLC chromatogram of sample obtained by filtration. a, feed material: b, 107 Permeate after L operation: c, eluate with 0.2M NaCI (1:24 dilution).
図５・りん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，７）中の純粋蛋白のクロスフロー膜イ オン交換濾過により得られた試料の５ＤＳ−ＰＡＧＥｆｌｔ気泳動。レーン１、 初発供給物？Ｉ：レーン２．負μｆ中の保持液、レーン３．負荷中の透過液、レ ーン４゜０゜２ＭＮａＣ１ての溶出液：レーン５．０．４ＭＮａＣｌでの溶出液 、レーン６、］、ＯＭ ＮａＣＩでの溶出液：レーン７．低分子量蛋白マーカー 。Figure 5: Cross-flow membrane diagram of pure protein in sodium phosphate buffer (pH 6, 7) 5DS-PAGE flt electrophoresis of samples obtained by on-exchange filtration. lane 1, Initial supplies? I: Lane 2. Retentate in negative μf, lane 3. permeate during loading, Lane 4. Eluate at 2M NaCl: Lane 5. Eluate at 0.4M NaCl. , lane 6, ], eluate with OM NaCI: lane 7. low molecular weight protein marker .
図６．精密濾過されたチェダーチーズ乳清（ｐＨ６，０）のクロスフロー膜イオ ン交換濾過における透過流束（ム）、ラクトペルオキシダーゼ活性（・）および ラクトフェリン濃度（■）。乳清供給物質中の初発レベル：ラクトペルオキ／ダ ーゼ７．８ １Ｕ／ｍｌ７．ラクトフェリン８１．４ｍｇ／Ｌ。Figure 6. Cross-flow membrane ionization of microfiltered cheddar cheese whey (pH 6.0) permeation flux (mu), lactoperoxidase activity (・) and Lactoferrin concentration (■). Initial levels in whey feed: Lactoperox/Da 7.8 1U/ml7. Lactoferrin 81.4 mg/L.
図７．精密濾過されたチェダーチーズ乳清（ｐＨ６，０）のクロスフロー膜イオ ン交換濾過により得られた試料のＨＰ Ｌ Ｃクロマトグラム。ａ、供給物質、 ｂ。Figure 7. Cross-flow membrane ionization of microfiltered cheddar cheese whey (pH 6.0) HPLC chromatogram of a sample obtained by exchange filtration. a. Feed material; b.
３７Ｌ操作１漫の透過液：ｃ、ＩＭＮａＣＩでの溶出液（１：９希釈）。Permeate of one 37L run: c, eluate with IMNaCI (1:9 dilution).
図８：精密濾過されたチェダーチーズ乳ｍ（ｐＨ６，０）のクロスフロー膜イオ ン交換濾過により得られた試料の５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動。レーン１．初発供 給物′Ｎ：レーン２．負荷中の保持液：レーン３．負荷中の透過液：レーン４お よび５．１Ｍ ＮａＣ１での溶出液、レーン１０．低分子量蛋白マーカー。Figure 8: Cross-flow membrane iodine of microfiltered cheddar cheese milk m (pH 6,0) 5DS-PAGE electrophoresis of samples obtained by exchange filtration. Lane 1. first offering Supply 'N: Lane 2. Retentate during loading: lane 3. Permeate during loading: Lane 4 and eluate with 5.1 M NaCl, lane 10. Low molecular weight protein marker.
図９．精密濾過されたチェダーチーズ乳清（ｐＨ６，９）のクロス７０−膜イオ ン交換濾過における透過流束（ム）、ラクトペルオキ／ダーゼ活性（・）および ラクトフェリン濃度（■）。乳清供給物質中の初発レベル：ラクトペルオキシダ ーゼ３．４ １Ｕ／ｍＬ＋ラクトフェリン４０．０ｍｇ／Ｌ０図１０＝精密濾過 されたチェダーチーズ乳清（ｐＨ６，９）のクロスフロー膜イオン交換濾過によ り得られた試料のＨＰＬＣクロマトグラム。ａ、供給物質：ｂ、５３Ｌ操作後の 透過液；ｃ、ＩＭＮａｃＩでの溶出液（１，：１２希釈）。Figure 9. Microfiltered cheddar cheese whey (pH 6,9) cross-70-membrane ion permeation flux (mu), lactoperoxidase activity (・) and Lactoferrin concentration (■). Initial levels in whey feed: Lactoperoxida -se 3.4 1U/mL + lactoferrin 40.0mg/L0 Figure 10 = Microfiltration Cheddar cheese whey (pH 6,9) was filtered by cross-flow membrane ion exchange filtration. HPLC chromatogram of the sample obtained. a. Feed material: b. After 53L operation Permeate; c, eluate with IMNacI (1:12 dilution).
図１１：精密濾過されたチェダーチーズ乳清（ｐＨ６，９）のクロスフロー膜イ オン交換濾過により得られた試料の５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動。レーン６、初発 供給物質；レーン７、負荷中の透過液、レーン８．負荷中の保持液：レーン９゜ １、ＯＭ ＮａＣｌでの溶出液：レーン１０．低分子量蛋白マーカー。Figure 11: Cross-flow membrane diagram of microfiltered cheddar cheese whey (pH 6,9) 5DS-PAGE electrophoresis of samples obtained by on-exchange filtration. Lane 6, first shot Feed material; lane 7, permeate during loading, lane 8. Retentate during loading: Lane 9° 1. Eluate with OM NaCl: lane 10. Low molecular weight protein marker.
図１２ 精密濾過されていないチェダーチーズ乳清（ｐＨ６，２）のクロスフロ ー膜イオン交換濾過における透過流束（ム）、ラクトペルオキシダーゼ活性（・ ）およびラクトフェリン濃度（■）。表面積０．６ｍ”のクロスフローモジュー ルを用いた。供給物質の初発レベル ラクトペルオキ／ダーゼ１１．ＯＩＵ／ｍ Ｌ、ラクトフェリン１１６．０ｍｇ／Ｌ０図１３：精密濾過されていないチェダ ーチーズ乳清（ｐＨ６，２）のクロスフロー膜イオン交換濾過により得られた試 料のＨＰＬＣクロマトグラム。ａ、供給物質；ｂ、２５Ｌ操作後の透過液；ｃ、 ＩＭＮａＣｌでの溶出液（１：１５希釈）ロー膜イオン交換濾過により得られた 試料の５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳電気泳動−ン１．初発供給物質：レーン２．負荷 中の保持液；レーン３．負荷中の透過液；レーン４および５．１ＭＮａＣｌでの 溶出液：レーン１０．低分子量蛋白マーカー。Figure 12 Crossflow of non-microfiltered cheddar cheese whey (pH 6,2) - Permeation flux (mu) in membrane ion exchange filtration, lactoperoxidase activity (・ ) and lactoferrin concentration (■). Crossflow module with surface area of 0.6m” I used the file. Initial level of feed substance Lactoperoxidase/dase 11. OIU/m L, Lactoferrin 116.0 mg/L0 Figure 13: Chedda not microfiltered - Sample obtained by cross-flow membrane ion exchange filtration of cheese whey (pH 6.2) HPLC chromatogram of the sample. a, feed material; b, permeate after 25L operation; c, Eluate (1:15 dilution) with IMNaCl obtained by low membrane ion exchange filtration 5DS-PAGE electrophoresis of the sample1. Initial feed material: lane 2. load Retentate in lane 3. Permeate during loading; lane 4 and at 5.1M NaCl Eluate: lane 10. Low molecular weight protein marker.
図１５：精密濾過されていないチェダーチーズ乳清（ｐＨ６，２）のクロスフロ ー膜イオン交換濾過における透過流束（ム）、ラクトペルオキ／ダーゼ活性（・ ）およびラクトフェリン濃度（−）。表面積０．５ｍ２のクロスフローモジュー ルを用いた。供給物質の初発レベル・ラクトペルオキ／ダーゼ１１．２１Ｕ／ｍ Ｌ：ラクトフエリン１１６．０ｍｇ／Ｌ０図１６ 精密濾過されていないチェダ ーチーズ乳清（ｐＨ６，２）のクロスフロー膜イオン交換＃過により得られた試 料のＨＰ Ｌ Ｃクロマトグラム。ａ、供給物質：ｂ、２６Ｌ操作後の透過液： ｃ、ＩＭ ＮａＣｌでの溶出液（１：５希釈）。Figure 15: Crossflow of non-microfiltered cheddar cheese whey (pH 6.2) - Permeation flux (mu) in membrane ion exchange filtration, lactoperoxidase/dase activity (・ ) and lactoferrin concentration (−). Crossflow module with a surface area of 0.5m2 I used the file. Initial level of feed material Lactoperoxidase/dase 11.21U/m L: Lactoferrin 116.0mg/L0 Figure 16 Chedda not microfiltered - Sample obtained by cross-flow membrane ion exchange of cheese whey (pH 6.2) HP L C chromatogram of the material. a. Feed material: b. Permeate after 26L operation: c, IM eluate with NaCl (1:5 dilution).
図１７・精密濾過されていないチェダーチーズ乳清（ｐＨ６，２）のクロスフロ ー膜イオン交換濾過により得られｔコ試料の電気泳動図。レーン１．初発供給物 質、レーン６、負荷中の保持液、レーン７、負荷中の透過液：レーン８および９ ゜１ＭＮａＣｌでの溶出液、レーン１０ 低分子量蛋白マーカー。Figure 17: Cross-flow of non-microfiltered cheddar cheese whey (pH 6.2) - Electropherogram of a sample obtained by membrane ion exchange filtration. Lane 1. initial supply quality, lane 6, retentate during loading, lane 7, permeate during loading: lanes 8 and 9 Eluate with 1M NaCl, lane 10. Low molecular weight protein marker.
図１８ 精密濾過されたチェダーチーズ乳清（ｐＨ６，２）のデ・ノドエンド膜 イオン交換濾過により得られた試料のＨＰ Ｌ Ｃクロマトグラム。ａ、供給物 質。Figure 18 De nodoendo membrane of microfiltered cheddar cheese whey (pH 6.2) HP L C chromatogram of a sample obtained by ion exchange filtration. a. Supplies quality.
ｂ、５０ｍＬ操作後の透過液： ｃ、ＩＭ ＮａＣｌての溶出液（１，３希釈） 。b, Permeate after 50 mL operation: c, IM NaCl eluate (1,3 dilution) .
図１９・精密濾過されたチェダーチーズ乳清（ｐＨ６，２）のデ・ノドエンド膜 イオン交換濾過により得られた試料の５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳電気泳動−ン１゜ 低分子量蛋白マーカー、レーン４．初発供給物質、レーン５．負荷中の濾液（透 過液）：シー２６．１．０Ｍ ＮａＣｌでの溶出液。Figure 19 De nodoendo membrane of microfiltered cheddar cheese whey (pH 6.2) 5DS-PAGE electrophoresis of sample obtained by ion exchange filtration - 1° Low molecular weight protein marker, lane 4. Initial feed material, lane 5. Filtrate during loading (filtrate): eluate with C26.1.0M NaCl.
図２０．精密濾過されたチェダーチーズ乳清（ｐＨ７，０）のデ・ノドエンド膜 イオン交換濾過により得られた試料のＨＰ Ｌ Ｃクロマトグラム。ａ、供給物 質。Figure 20. De nodoendo membrane of microfiltered cheddar cheese whey (pH 7.0) HP L C chromatogram of a sample obtained by ion exchange filtration. a. Supplies quality.
ｂ、ＩＭＮａｃＩての溶出液（１３希釈）。b, IMNacl eluate (13 dilutions).
図２１ 精密濾過されたチェダーチーズ乳ｉ’１ｌ（ｐＨ７，０）のデッドエン ド膜イオン交換濾過により得られた試料の５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳電気泳動−ン １゜低分子量蛋白マーカー、レーン２．負荷中の濾液（透過液）、レーン３．１ ．０ＭＮａＣ１ての溶出液、レーン４．初発供給物質。Figure 21 Dead end of microfiltered cheddar cheese milk i'1l (pH 7,0) 5DS-PAGE electrophoresis of samples obtained by membrane ion exchange filtration 1° low molecular weight protein marker, lane 2. Filtrate (permeate) during loading, lane 3.1 ．． Eluate with 0M NaCl, lane 4. Initial feed material.
図２２．透析され、精密濾過されたチェダーチーズ乳清ＣｐＨ７，０）のデッド エンド膜イオン交換濾過により得られた試料のＨＰ Ｌ Ｃクロマトグラムラミ 。Figure 22. Dead Dialyzed and Microfiltered Cheddar Cheese Whey CpH 7,0) HP L C chromatogram of sample obtained by end membrane ion exchange filtration .
供給物質：ｂ、３０ｍＬ濾過後の透過液：ｃ、１ＭＮａＣｌての溶出液（１，３ 希釈）。Feed material: b, permeate after 30 mL filtration: c, eluate with 1M NaCl (1,3 dilution).
図２３：透析され、精密濾過されたチェダーチーズ乳清（ｐＨ７，０）のデ・ノ ドエンド膜イオン交換濾過により得られた試料の５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳電気泳 動−ン１．低分子量蛋白マーカー、レーン２．負荷中の濾液（透過液）；レーン ３゜１．０ＭＮａＣｌでの溶出液、レーン６、初発供給物質。Figure 23: De novo of dialyzed and microfiltered cheddar cheese whey (pH 7.0) 5DS-PAGE electrophoresis of samples obtained by endo-membrane ion-exchange filtration Movement 1. Low molecular weight protein marker, lane 2. Filtrate (permeate) during loading; lane Eluate at 3° 1.0 M NaCl, lane 6, starting feed material.
図２４．精密濾過されたチェダーチーズ乳清（ｐＨ６，５）（Ａ）および精密濾 過されていないチェダーチーズ乳ｍ（ｐＨ６，５）（Ｂ）の、サルトビンド（Ｓ ａｒ＋ｏｂｊｎｄ） Ｓフィルター（５，４ｃｍ？、０．４５μｍ孔）（釦また は慣用なミニザルト（Ｍｉｎｉｓａｒｔ） Ｎフィルター（■）を用いたデ・ソ ドエンド濾過における濾過（透過）流束。流束を５０ ｋ Ｐ ａ定圧下５０℃ にて測定した。Figure 24. Microfiltered cheddar cheese whey (pH 6,5) (A) and microfiltered Saltvind (S) of unfiltered cheddar cheese milk (pH 6,5) (B) ar+objnd) S filter (5.4cm?, 0.45μm pore) (button is a de-so using the conventional Minisart N filter (■). Filtration (permeation) flux in end-end filtration. Flux: 50 kP a 50℃ under constant pressure Measured at
実施例 一般的方法論 原材料 乳清はチェダーチーズの副産物であり、商業的チーズ生産者から、また１まシー ニスアイ・ディリー・リサーチ・ラボラトリ−（Ｃ３Ｉ Ｄａｉｒｙ Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）において「室内的」に調製するかのいずれか により、新鮮な状態で得た。使用前に該乳清を分離しく４０°Ｃ）、ノクストリ ゼーノヨン（７２’Ｃ，１５秒）した。Example General methodology raw materials Whey is a byproduct of cheddar cheese and is also available from commercial cheese producers. Nis-I Dairy Research Laboratory (C3I Dairy Re5e Either prepared “indoor” at the arch Laboratory. obtained in fresh condition. Before use, separate the whey at 40°C). Zenoyon (72'C, 15 seconds).
無脂肪乳を、分離（３５〜４０℃）およびノくストリゼーンヨン（７２℃、１５ 秒）により調製した。純粋蛋白での試験を行うために、チトクロームＣ（ウマ・ ｌ仁〜臓）をベーリンカー・マンノ１イム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈ ｅｉｍ）社力＼ら得、ウノ・ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼを、 本質的に以前に記載されてＬする方法（ロー・ヒ’＝Ｌイ（ｌａｗ、Ｂ＾、）お よびレイター・ビー（Ｒｅｉｔｅｒ、 Ｂ、 ） （１９７７年）ザ・アイ゛ル ーンヨン・アンド・ノくクテリオスタテイ・ツク・プロ、＜−ティース・オフ・ ラクトフェリン・フロム・ホエくイン・ミルり・ホエー（ＴｈｅＩｓｏｌａｔｉ ｏｎ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ １ａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ｆｒｏｍ ｂｏｖ奄獅■@ｍ１ｌｋ ｔｈｅｙ） 、 ン＋−す／Ｌ／・オフ・ディリー・１け−チ（Ｊ、 Ｄａｉｒ ｙ Ｒｅｓ、 ） 、第４４巻、５９５〜５９９頁）で単離した。牛乳限外濾過 物を、無脂肪乳を５０℃で限外濾過（分子量ｉｓ、ｏｏｏてカントオフする膜を 使用）しな力くら得ｔこ透過液を集めることにより調製した。Non-fat milk was separated (35-40°C) and boiled (72°C, 15°C). Sec.). To perform tests on pure protein, cytochrome C (horse Boehringer Mannh eim) Sheryoku\Ratoku, Uno-lactoferrin and lactoperoxidase, Essentially the previously described method of L (law, B^,) Reiter, B. (1977) The Isle Teeth Off Lactoferrin from whey in milk (TheIsolati) on and bacterial properties of 1actoferrin from bov Amashi ■@m1lk They y Res, ), Vol. 44, pp. 595-599). milk ultrafiltration Ultrafiltration of non-fat milk at 50°C (using a membrane that cant off the molecular weight is, ooo) (Use) Prepared by collecting the permeate obtained from Shinagawa.
膜処理 前処理 いくつかの実施例については、指示する箇所て、チーズ乳清および無脂 肪乳の原材料を、膜イオン交換する前に精密濾過を用いて前処理した。クロスフ ロー型の膜イオン交換を包含する実験については、はじめにチーズ乳清を、４５ ℃においてザルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）社の三酢酸セルロースクロスフ ローモジュール（０，６ｍ”＝６ Ｘ １０３ｃｍ２．０．４５μｍ孔）を用い て精密濾過した。Membrane treatment Pretreatment For some examples, cheese whey and non-fat The fatty milk raw material was pretreated using microfiltration before membrane ion exchange. crossf For experiments involving low-type membrane ion exchange, start with cheese whey, cellulose triacetate cloth from Sartorius at Using a low module (0.6m" = 6 x 103cm2.0.45μm hole) and microfiltered.
デッドエンド型の膜イオン交換を包含する実験については、はじめにチーズ乳清 を、ザルトリウス社のミニサルｉＮ （５，３ｃｍ２．０．２１℃ｍ孔）を用い て精密濾過し、無脂肪乳については六ルケ／（Ｎａｌｇｅｎｅ） ？１の酢酸セ ルロース（３８ｃｍ２゜０．１５μｍ孔）を用いて、２０°℃で精密ｔ！遇した 。For experiments involving dead-end membrane ion exchange, start with cheese whey. using Sartorius' Mini Monkey iN (5.3 cm 2.0.21°C m hole). For non-fat milk, use Rokuluke/(Nalgene)? 1 acetic acid Precision t! at 20°C using lurose (38cm2゜0.15μm hole)! met .
膜イオン交換（クロスフロー型） セルトリウス社のＳＣＸ］ポリスルホン膜材料（強力子オン交換体）（０２１１ ｍ孔）を用いて作られたサルｉ・コシＩＩ （Ｓａｒｔｏｃｏｎｌｌ）ブラント 設置型の受注生産されたクロスフローＥツユ〜ル（２種−広チヤンネル（０，５ ｍ２＝５Ｘ１０３ｃ ｍ２）および狭チャンネル（０，６ｍ２＝６Ｘ１０’ｃｍ ”））を用いて実験を行った。、他の一般的操作条件は１°ノ丁のことし 圧力 ２０（１ｋＰａ（入［１）および１０（ｌｋＰａ（出口）：ＡＫ度４：）で（Ｐ Ｉ荷および洗浄）および２（１℃（溶離）。個々の実施例において、断らないか ぎり、使用前にクロスフローモノニールを平衡化しておき、］ ＱｍＭ ＮａＣ ｌ （＝Ｉ５Ｌ）にて洗浄し、結合蛋白を］ＭＮａＣｉ（２０１、）にて溶離さ せた、膜のクリーニングおよび衛生化を、１５％（Ｗ／ｖ）Ｐ：３−ウルトラフ ル（Ｕｌｔｒａｓｊｌ） ５３ （１０Ｌ）にて３７℃で行い、膜をＩＭＮａＣ １含有２０％（Ｖ／Ｖ）エタノール中１．４℃で保存した。該クロスフロー型実 験装置の概略図を、用語の定義およびデータベラメーターとともに図１に示す。Membrane ion exchange (cross flow type) Sertorius SCX] polysulfone membrane material (strong electron exchanger) (0211 Sartoconll blunt made using M hole) Installed cross-flow E-tube made to order (2 types - wide channel (0,5 m2 = 5X103c m2) and narrow channel (0,6m2 = 6X10’cm ”)).Other general operating conditions were a pressure of 1° this year. (P loading and washing) and 2 (1°C (elution). Before use, equilibrate the cross-flow monoyl, and 1 (=I5L), and bound proteins were eluted with ]MNaCi (201,). 15% (w/v) P:3-Ultrafil It was carried out at 37°C in an Ultrasjl 53 (10L), and the membrane was coated with IMNaC. 1 in 20% (V/V) ethanol at 1.4°C. The cross flow type fruit A schematic diagram of the test equipment is shown in Figure 1, along with definitions of terms and data meters.
膜イオン交換（プントエンド型） ミニザルト型のサルトリウス社のサルトヒンドＳフィルターユニット（５，４ｃ ｍ２＝、４，５ｘｌＱ−’ｍ２．０．４５／１ｍ孔）を用いて実験を行った。１ ０ｍＬ／分に流速を調節して、結合および回収のデータを室温および５０℃にお いて集めた。一定圧力（５０ｋＰａ）において、流束のデータを５０℃にて集め た。使用前にフィルターを平衡化させておき、１０ｍＭりん酸ナトリウム（ｐＨ ７，０，１０ｍＬ）て洗浄し、結合蛋白を、１０ｍＭりん酸すｌ・リウム（１０ ｍＬ）中ＩＭＮａＣＩて溶離させた。ＩＭ ＮａＯＨ（１０ｍＬ）で膜をクリー ニング、衛生化し、該サルトヒンドフィルターを１．ＭＮａＣＩ含有２０％（Ｖ ／Ｖ）エタノール中、４°Ｃて保存した。該デッドエンド型実験装置の概略図を 、用語の定義およびデータパラメーターとともに図２に示す。Membrane ion exchange (Puntoendo type) Mini Sarto type Sartorius Sartohind S filter unit (5,4c The experiment was conducted using m2=,4,5xlQ-'m2.0.45/1 m hole). 1 Binding and recovery data were collected at room temperature and 50°C by adjusting the flow rate to 0 mL/min. I collected them. Flux data was collected at 50°C at constant pressure (50kPa). Ta. Equilibrate the filter before use and add 10mM sodium phosphate (pH 7,0,10 mL), and the bound proteins were washed with 10 mM sulfur phosphate (10 mL). mL). Clean the membrane with IM NaOH (10 mL). 1. Sanitize and sanitize the salt hind filter. MNaCI content 20% (V /V) Stored in ethanol at 4°C. A schematic diagram of the dead-end experimental apparatus , along with definitions of terms and data parameters, are shown in Figure 2.
分析方法 高品質液体クロマトグラフィー 原材料および膜イオン交換工程後の試料中の蛋 白成分の定性的および定量的分析を、ウォーターズ（ｆａｔｅｒｓ）社のシステ ムを用いた高品質液体クロマトクラフィー（ＨＰＬＣ）により行った。５０ｍＭ りん酸すトリウム（ｐｊ−１７，５）で平衡化したモノＳ （ＭｏｎｏＳ）ＨＲ ５１５カラム（ファルマンア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製）に試料（］、００μ Ｌ）を負荷し、１４分かけて同緩衝液中て直線的に塩濃度を上昇（０〜１０〜１ 、 Ｎ ａ Ｃｌ ）させるグラジェント法（流速１．０ｍＬ／分）により溶 離を行った。２２０ｎｍにおいて、カラ１．溶出物を連続的にモニターした。対 象とする蛋白（例えばラクトフェリン、ラクトペルオキシダーゼ）を表すピーク 面積を、デルタ・ジュニア・データ・アナ＋１シス・ソフトウェア・ハンゲー／ （Ｄｅｌｔａ Ｊｕｎｉｏｒ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ） （オーストラリア国デン・タル・ソリュー／ヨンズ・ピーテ ィーワイ（Ｄｉｇｉｔａｌ ５ｏｌＪｔｉｏｎｓ Ｐｔｙ） ＞を製）を用いた 電子式積分により測定した。上記条件にて、標準ラクトペルオキ／ダーゼおよび ラクトフェリンは、それぞれ保持時間９７分および１８．９分てカラムから溶出 した。Analysis method High quality liquid chromatography Proteins in raw materials and samples after membrane ion exchange process Qualitative and quantitative analysis of white components is performed using the Faters system. This was performed by high quality liquid chromatography (HPLC) using a chromatography system. 50mM MonoS HR equilibrated with thorium phosphate (pj-17,5) 515 column (manufactured by Pharmacia) was loaded with a sample (], 00μ L) was loaded, and the salt concentration was increased linearly (0-10-1) in the same buffer over 14 minutes. , N a Cl ) by the gradient method (flow rate 1.0 mL/min). I left. At 220 nm, color 1. The eluate was continuously monitored. versus Peak representing the protein of interest (e.g. lactoferrin, lactoperoxidase) area, Delta Junior Data Ana + 1 System Software Hunger/ (Delta Junior data analysis software package) (Australia Dental Solyu/Yons Pete (manufactured by Digital 5olJtions Pty) Measured by electronic integration. Under the above conditions, standard lactoperoxidase/dase and Lactoferrin eluted from the column with retention times of 97 and 18.9 minutes, respectively. did.
ポリアクリルアミドゲル電気泳動 原材料および膜イオン交換工程後の試料中の 蛋白成分の同一性、純度および分子サイズの決定を、以前に記載されている垂直 スラブゲル装置（レムリ、ニー・ケイ（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ、に、） （１９７ ０年）クリーニング・オフ・ストラクチャル・プロテインズ・デユーリング・ザ ・アセンブリー・オフ・ザ・ヘンド・オフ・ザ・バクテリオファーン・ティーフ ォー（Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄ ｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａп@ｏｆ ｔｈ ｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４） 、ネイチャー （Ｎａｔｕｒｅ）第２２ ７巻、 ６８０〜６８５頁）を用いて、トデンル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）存在 下（変性条件）におけるポリアクリルアミドケル電気泳動により行った。試料（ ５０／／Ｌ）中の蛋白を、直線的勾配ケル（１０〜１５％）中で分離し、クーマ ノ−・ブリリアント・ブルーＲ（Ｃｏｏｍａｓｉｅ Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ Ｂｌ ｕｅ Ｒ）にて蛋白バンドを染色した。低分子１１７−カー蛋白（ファルマ／ア 社製）を用いてゲルをキャリブレーションした。マーカーは、ホスホリラーゼｂ （９４ｋＤａ） 、ウノ・血清アルブミン（６７ｋＤａ）、オバルブミン（４ ，３ｋ Ｄ ａ ） 、カルホニノク・アンンヒトラーセ（３０ｋＤａ） 、大 豆・トリプシンインヒヒター（２０，ｌ ｋＤａ）およびα−ラクトアルブミン （１４，４ｋＤａ）を含む。用いた条件下で、ラクトフェリンおよびラクトペル オキシダーゼは、ゲル上８０ｋＤａの分子量に相当する場所に現れた。Polyacrylamide gel electrophoresis raw materials and membranes in samples after ion exchange process Determination of identity, purity and molecular size of protein components was performed using a vertical method as previously described. Slab gel apparatus (Laemmli, N. K.) (197 0 Year) Cleaning Off Structural Proteins Dueling The ・Assembly off the hend off the bacteriophane teaf (Cleavage of 5 structural proteins d uring the assembly of the heaп@of th e bacteriophage T4), Nature No. 22 7, pp. 680-685) in the presence of sodium todenle sulfate (SDS). (denaturing conditions) by polyacrylamide gel electrophoresis. sample( Proteins in 50//L) were separated in a linear gradient Kel (10-15%) and No-Brilliant Blue R (Coomasie Br1lliant Bl The protein band was stained with UE R). Low molecular weight 117-car protein (Pharma/A The gel was calibrated using a commercially available standard. The marker is phosphorylase b (94kDa), Uno serum albumin (67kDa), ovalbumin (4 , 3k D a ), Kalhoninoch Annetlerse (30kDa), large Beans, trypsin inhibitor (20,1 kDa) and α-lactalbumin (14,4kDa). Under the conditions used, lactoferrin and lactoper Oxidase appeared on the gel at a location corresponding to a molecular weight of 80 kDa.
分光学的分析 ラクトペルオキシダーゼの酵素活性を、以前に記載（バッター、 ノエイ（Ｐｕｔｔｅｒ、 Ｊ、 ）および八ツカー。アール（Ｂｅａｋｅｒ、 Ｒ，） （１９８３年）。Spectroscopic analysis of the enzymatic activity of lactoperoxidase as previously described (batter, Noei (Putter, J.) and Yatsukar. Earl (Beaker, R, ) (1983).
メツ゛ノズ・オフ・エンザイマティソク・アナリンス（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ＾ｎａｌｙｓｊｓ） （ベルシマイヤー。エイチー ニー（ Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ、 Ｉｔ、 Ｌｌ）編、ペルオキシダーゼス（Ｐｅｒｏｘｙ ｄａｓｅｓ）第３巻（第３版）２８６〜２９３頁、ワインハイム（Ｗｅｉｎｈｅ ｉｍ）のフエアラーク・ヘミ−（Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ） ）されている 人工基質２．２° −アント−ヒス（３−エチル−ベンズチアゾリン−６−スル ホンＢＴＳ）を用いた連続的分析において分光学的に測定した。測定用混合液（ ２。Methods of enzyme analysis Enzymatic＾nalysjs) (Bershimeyer. H.N. Bergmeyer, It, Ll), Peroxidase volume 3 (3rd edition) pages 286-293, Weinhe im)'s Verlag Chemie) Artificial substrate 2.2°-ant-his(3-ethyl-benzthiazoline-6-sul) It was measured spectroscopically in a continuous analysis using the Hong Kong BTS). Mixed liquid for measurement ( 2.
３８ｍＬ）は、１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）中、ＡＢＴＳ１．６７ ｍＭおよび８２０２０．１８ｍＭを含有する。酵素含有溶液（２０μＬ）を添加 することにより反応を開始し、４０５ｎｍの吸光度変化の速度を、記録計付き分 光光度計て２５℃にて測定した。酵素活性１単位（ＩＵ）は、上記条件にて１分 間に１マイクロモルのＡＢＴＳの酸化を触媒する。純粋蛋白で試験を行う場合に は、供給、洗浄および溶出フラクション中の蛋白含量を、２８０ｎｍにおける吸 光度から計算した。38 mL) is ABTS 1.67 in 100 mM citrate buffer (pH 5.5). Contains 82020.18mM and 82020.18mM. Add enzyme-containing solution (20 μL) The reaction was started by Measurement was performed at 25°C using a photophotometer. 1 unit (IU) of enzyme activity is 1 minute under the above conditions. During this time, the oxidation of 1 micromole of ABTS is catalyzed. When testing pure protein The protein content in the feed, wash and elution fractions was determined by absorbance at 280 nm. Calculated from luminosity.
膜イオン交換の実施例 純粋蛋白のクロスフロー濾過 実施例］ 純粋蛋白に対する膜イオン交換体（クロスフロー型）の結合容量を測 定する試験において、３０ｍｇ／Ｌのラクトペルオキシダーゼおよび１００ｍｇ ／Ｌのラクトフェリンを含有する２００Ｌの１０ｍＭりん酸ナトリウム（ｐＨ６ ７）を供給物質として用いた。保持液流れをリサイクルするようにザルトコン ＩＩプラントを構成した。負荷中の透過液および保持液の試料を、後のＨＰＬＣ ＳＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび活性測定による分析のために集めた。負荷後、膜を１ ＯＬの１０ｍＭりん酸ナトリウム（ｐＨ６．７）で洗浄し、ＮａＣｌ含有りん酸 ナトリウム緩衝液の３回（各１ＯＬ）のバッチ（すなわちＮａＣｌ含有度を０。Example of membrane ion exchange Cross-flow filtration of pure proteins Example] Measuring the binding capacity of a membrane ion exchanger (cross-flow type) for pure protein lactoperoxidase at 30 mg/L and 100 mg/L. 200L of 10mM sodium phosphate (pH 6) containing /L of lactoferrin. 7) was used as the feed material. Zaltocon to recycle retentate flow II plant was constructed. Samples of the permeate and retentate during loading were analyzed for subsequent HPLC Collected for analysis by SSDS-PAGE and activity measurements. After loading, the membrane is Wash with 10mM sodium phosphate (pH 6.7) in OL and phosphoric acid containing NaCl. Three (1 OL each) batches of sodium buffer (i.e. 0 NaCl content).
２Ｍ．０．４Ｍおよび１．０Ｍと増加させる）で、蛋白の溶離を行った。溶離中 は、保持液流れをリサイクルさせなかった。溶離中、透過液および保持液フラク ションから引き続いて行ｐ分析用に試料を集めた。膜に負荷している間の透過流 束測定結果およびラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼに関する透過液 の分析を図３に示す。試験により得られたＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析 結果をそれぞれ図４および図５に示す。ラクトフェリンおよびラクトペルオキシ ダーゼに対する膜の結合容量および溶離後のこれらの蛋白の回収率を示すデータ を、表１に示す。2M. Protein elution was performed at 0.4M and increasing to 1.0M). Elution in progress did not recycle the retentate stream. During elution, permeate and retentate fraction Samples were subsequently collected for row p analysis. Permeate flow during membrane loading Flux measurement results and permeate for lactoferrin and lactoperoxidase The analysis is shown in Figure 3. HPLC and SDS-PAGE analysis obtained from the test The results are shown in FIGS. 4 and 5, respectively. Lactoferrin and lactoperoxy Data showing the binding capacity of membranes for Dase and the recovery of these proteins after elution. are shown in Table 1.
表１：ｐＨ６．７の緩衝溶液中、強力チオン交換クロスフロー膜に一緒に適用し た場合の精製ラン・ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼの結合容量お よおび回収率 °精製蛋白を１０ｍＭりん酸ナトリウム（ｐＨ６．７）に溶解し、４５℃で狭チ ヤンネル膜（０．６ｍ２）に供した。′定義を図１に示す。Table 1: Co-applied to a strong thione exchange crossflow membrane in a buffer solution of pH 6.7. The binding capacity and binding capacity of purified orchid lactoferrin and lactoperoxidase when and recovery rate °Dissolve the purified protein in 10mM sodium phosphate (pH 6.7) and store in a narrow tube at 45°C. It was applied to a Jannel membrane (0.6 m2). ' definition is shown in Figure 1.
チェダーチーズ乳清を用いたクロスフロー濾過実施例２ この試験において、ｐ Ｈ６．０のチェダーチーズ乳清を膜イオン交換の前に精密濾過した。精密濾過し た乳清（１２ＯＬ）を、保持液をリサイクルするように構成されｔ：ザルトコン ＩＩプラントを用いて狭チャンネルクロスフロ−モジュール（０，６ｍ”）に供 した。試験中に透過液および保持液の試料を集めておいて、引き続き行うＨＰＬ Ｃ，５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび活性測定によるラクトフェリンおよびラクトペルオ キシダーゼ含量の測定を可能にした。該乳清供給物質の負荷に続いて、４５Ｌの １０ｍＭ ＮａＣ１で膜を洗浄した。ついで、保持液流れをリサイクルしないや り方にして、２０ＬのＩＭ ＮａＣ１で２０℃において溶離を行った。溶離工種 の完結後、ついで行う分析のために、溜めておいた透過液および保持液から試料 を集めた。試験中の透過液流束および透過液中の対象とする蛋白の「ブレイクス ルー（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ） Ｊを示すデータを図６に示す。試験により 得られた試料のＨＰＬＣおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を、それぞれ図７お よび８に示す。ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼに対する膜の結合 容量および溶離後のこれらの蛋白の回収率を表２に示す。Cross-flow filtration example 2 using cheddar cheese whey In this test, p H6.0 cheddar cheese whey was microfiltered before membrane ion exchange. precision filtration The whey (12OL) was configured to recycle the retentate. Narrow channel cross flow module (0,6m”) using II plant. did. Samples of permeate and retentate are collected during the test and subsequent HPL is performed. Lactoferrin and lactoperol by C,5DS-PAGE and activity measurement This enabled the measurement of oxidase content. Following loading of the whey feed material, 45 L of The membrane was washed with 10mM NaCl. Then, if you do not recycle the retentate stream, Elution was carried out with 20 L of IM NaCl at 20° C. as described above. Elution type After completion of the process, sample from the pooled permeate and retentate for subsequent analysis. Collected. The permeate flux during the test and the “breaks” of the protein of interest in the permeate. Data showing breakthrough J is shown in FIG. by test The results of HPLC and 5DS-PAGE analysis of the obtained samples are shown in Figures 7 and 7, respectively. and 8. Membrane binding to lactoferrin and lactoperoxidase The volumes and recoveries of these proteins after elution are shown in Table 2.
表２：強カチオン交換クロス７０−膜に適用した場合のｐＨ６，０における分離 ／パストリゼーンヨンしたチェダーチーズ乳清（前以て精密濾過した）からのウ ノ・ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼの結合容量および回収率°ラ クトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼを含有する乳清（ｐＨ６，０）を、 ４５℃て狭チヤンネル膜（０，６ｍ”）に供した。５定義を図１に示す。Table 2: Separation at pH 6.0 when applied to strong cation exchange cloth 70-membrane / Pasteurized cheddar cheese whey (previously microfiltered) Binding capacity and recovery rate of lactoferrin and lactoperoxidase Whey (pH 6.0) containing topoferrin and lactoperoxidase, Narrow channel films (0.6 m'') were prepared at 45° C. 5 definitions are shown in FIG.
実施例３ この試験において、膜イオン交換の前に、濃ＮａＯＨ溶液で、乳清の ｐＨを６．９に合わせた以外は、実験条件は上記実施例２と同じであった。Example 3 In this test, whey was purified with concentrated NaOH solution before membrane ion exchange. The experimental conditions were the same as in Example 2 above, except that the pH was adjusted to 6.9.
ｐＨ調節に続いて、該乳清（９７Ｌ）を精密濾過し、ついで、２０℃において１ ０ＬのＬＭ ＮａＣ］で溶離を行うこと以外は実施例２記載のごとくクロスフロ ー膜イオン交換に供した。試験中の透過液流束および透過液中の対象とする蛋白 の「ブレイクスルー（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ） Ｊを示すデータを図９に示 す。試験により得られた試料のＨＰＬＣおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を、 それぞれ図１０および１１に示す。ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダー ゼに対する膜の結合容量および溶離後のこれらの蛋白の回収率を表３に示す。Following pH adjustment, the whey (97 L) was microfiltered and then incubated at 20°C for 1 Cross flow was carried out as described in Example 2, except that the elution was carried out with 0 L of LM NaC]. - subjected to membrane ion exchange. Permeate flux during the test and protein of interest in the permeate Figure 9 shows the data showing the “breakthrough” of vinegar. The results of HPLC and 5DS-PAGE analysis of the samples obtained in the test, Shown in FIGS. 10 and 11, respectively. Lactoferrin and lactoperoxidizer The binding capacity of the membrane for proteins and the recovery of these proteins after elution are shown in Table 3.
表３ 強力チオン交換クロスフロー膜に適用した場合のｐＨ６，９における分離 ／パストリゼーンヨンしたチェダーチーズ乳清（前以て精密濾過した）からのウ ノ・ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼの結合容量および回収率１ラ クトフエリンおよびラクトペルオキシダーゼを含有する乳清（ｐＨ６，９）を、 ４５℃で狭チヤンネル膜（０，６ｍ２）に供した。′定義を図１に示す。Table 3 Separation at pH 6 and 9 when applied to strong ion exchange crossflow membrane / Pasteurized cheddar cheese whey (previously microfiltered) Binding capacity and recovery rate of lactoferrin and lactoperoxidase Whey (pH 6,9) containing cutopherin and lactoperoxidase, Narrow channel membranes (0.6 m2) were applied at 45°C. ' definition is shown in Figure 1.
実施例４ この試験において、乳清を膜イオン交換の前に精密濾過しないこと以 外は、上記実施例２と同様にして、ｐＨ６，２のチェダーチーズ乳清を用いた。Example 4 In this test, the whey was not microfiltered before membrane ion exchange. For the outside, cheddar cheese whey having a pH of 6.2 was used in the same manner as in Example 2 above.
該乳清（８０Ｌ）を、保持液をリサイクルするように構成されたザルトコンＩＩ プラントを用いた狭チヤンネルクロスフローモジュール（０，６ｍりに供した。The whey (80 L) was transferred to a Zaltocon II, which was configured to recycle the retentate. A narrow channel cross flow module using a plant (0.6 m) was used.
池の操作条件は、２０℃においてＩＯＬのＩＭ ＮａＣ１で溶離を行うこと以外 は実施例２に関して記載したのと同じであった。試験中の透過液流束および透過 液中の対象とする蛋白の［ブレイクスルー（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ） Ｊを 示すデータを図１２に示す。試験により得られた試料のＨＰＬＣおよび５ＤＳ− ＰＡＧＥ分析の結果を、それぞれ図１３および１４に示す。ラクトフェリンおよ びラクトペルオキシダーゼに対する膜の結合容量および溶離後のこれらの蛋白の 回収率を表４に示す。The operating conditions for the pond were other than elution with IOL IM NaCl at 20°C. was the same as described for Example 2. Permeate flux and permeation during the test Breakthrough of target protein in liquid The data shown are shown in FIG. HPLC and 5DS- of the samples obtained by the test The results of the PAGE analysis are shown in Figures 13 and 14, respectively. Lactoferrin and The binding capacity of the membrane for lactoperoxidase and lactoperoxidase and the retention of these proteins after elution. The recovery rate is shown in Table 4.
表４ 強力チオン交換クロスフロー膜に適用した場合のＩ）Ｈ６，２における分 離／バストリゼーションしたチェダーチーズ乳清（精密濾過せず）からのウシ・ ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼの結合容量および回収率°ラクト フェリンおよびラクトペルオキシダーゼを含有する乳清を、４５℃で狭チヤンネ ル膜（０，６ｍ２）に供した。６定義を図１に示す。Table 4 I) Minutes in H6,2 when applied to a strong ion exchange crossflow membrane Bovine/Bastrized Cheddar Cheese Whey (Not Microfiltered) Lactoferrin and lactoperoxidase binding capacity and recovery °Lact Whey containing ferrin and lactoperoxidase was strained in a narrow channel at 45°C. The sample was applied to a membrane (0.6 m2). 6 definitions are shown in Figure 1.
実施例５ 乳Ｍ （ｐＨ６，２，７６１−、実施例４で使用したのと同じバッチ ）を、広チャンネルクロスフローモジュール（０，５ｍ２）に供した以外は、実 施例４記載の試験の繰り返しであった。他の操作条件は、２０℃におてＩＯＬの ＩＭＮａＣｌで溶離を行う以外は、実施例２について記載したのと同様であった 。Example 5 Milk M (pH 6,2,761-, same batch used in Example 4) ) was applied to a wide channel cross flow module (0.5 m2). The test described in Example 4 was repeated. Other operating conditions were IOL at 20°C. Same as described for example 2 except elution with IMNaCl .
試験中の透過液流束および透過液中の対象とする蛋白の「ブレイクスルー（ｂｒ ｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ） ｊを示すデータを図１５に示す。試験により得られた 試料のＨＰＬＣおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を、それぞれ図１６および１ ７に示す。The permeate flux during the test and the “breakthrough” of the protein of interest in the permeate. FIG. 15 shows the data showing eakthrough)j. obtained by testing The results of HPLC and 5DS-PAGE analysis of the samples are shown in Figures 16 and 1, respectively. 7.
ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼに対する膜の結合容量および溶離 後のこれらの蛋白の回収率を表５に示す。Membrane binding capacity and elution for lactoferrin and lactoperoxidase The subsequent recovery rates of these proteins are shown in Table 5.
表５ 強力チオン交換クロスフロー膜に適用した場合のｐＨ６，２における分離 ／パストリゼーノヨンしたチェダーチーズ乳清（精密濾過＋！ｉ）からのウシ・ ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼの結合容量および回収率′ラクト フェリンおよびラクトペルオキシダーゼを含有する乳清を、４５℃て広チャンネ ル膜（０，５ｍ”）に供した。゛定義を図１に示す。Table 5 Separation at pH 6.2 when applied to strong ion exchange crossflow membrane / Beef from pastryized cheddar cheese whey (microfiltration +!i) Binding capacity and recovery rate of lactoferrin and lactoperoxidase Whey containing ferrin and lactoperoxidase was poured into a wide channel at 45°C. The definition is shown in Figure 1.
純粋蛋白を用いたデッドエンド濾過 実施例６ 純粋蛋白に対する膜イオン交換体（プントエンド型、すｌレトヒンド Ｓ、 ５．４ ｃｍ２）の結合容量を測定する試験において、０．６ｍｇ／ｍＬ のチトクロムＣまたは０．６ｍｇ／ｍＬのラクトペルオキシダーゼあるいは０． ６ｍｇ／ｍＬのラクトフェリンを含有する２０ｍＬの１０ｍＭりん酸ナトリウム （ｐＨ７０）を供給物質として用いた。実験を２０℃で行った。供給液、濾液、 洗浄液および溶出液の試料を、後のＨＰＬＣおよび分光学的分析のために集めた 。チトクロムＣおよびラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼに対する膜 の結合容量、溶離後のこれらの蛋白の回収率を表すデータを表６に示す。Dead-end filtration using pure protein Example 6 Membrane ion exchanger for pure protein (Puntoendo type, Slethind) In a test to measure the binding capacity of S, 5.4 cm2), 0.6 mg/mL of cytochrome C or 0.6 mg/mL lactoperoxidase or 0.6 mg/mL of lactoperoxidase. 20 mL of 10 mM sodium phosphate containing 6 mg/mL lactoferrin (pH 70) was used as feed material. Experiments were conducted at 20°C. Feed liquid, filtrate, Wash and eluate samples were collected for later HPLC and spectroscopic analysis. . Membrane against cytochrome C and lactoferrin and lactoperoxidase Data representing the binding capacity of and the recovery rate of these proteins after elution are shown in Table 6.
表６＋ｐ）１７．０の緩衝液中、強イオン交換デッドエンド膜に別々に適用した 場合の、精製ウマ・チトクロムＣおよびウノ・ラクトフェリンならびにラクトペ ルオキシダーゼの結合容量、溶出率および回収率°精製蛋白をｌＱｍＭりん酸ナ トリウム（ｐＨ７，０）に溶解し、２０℃でザルトビノドＳフィルター（５，４ ｃｍ２）に供した。１定義を図２に示す。゛データは、４回の試験の平均値およ び標準偏差を表す。１データは、８回の試験の平均値および標準偏差を表す。Table 6+p) Applied separately to strong ion exchange dead-end membranes in buffer of 17.0 Purified Equine Cytochrome C and Uno Lactoferrin and Lactope Binding capacity, elution rate and recovery rate of oxidase Dissolved in thorium (pH 7,0) and filtered at 20°C with Zarutovinod S filter (5,4 cm2). 1 definition is shown in Figure 2.゛Data is the average value of 4 tests and and standard deviation. 1 Data represent the mean and standard deviation of 8 tests.
実施例７ この試験において、牛乳限外濾過物に溶解した純粋蛋白（ラクトフェ リンおよびラクトペルオキシダーゼ）に対する膜イオン交換体（デッドエンド型 、ザルトビンドＳ、 ５．４ ｃｍ２）の結合容量を２０°Ｃおよび５０℃で測 定した。Example 7 In this test, pure protein (lactoferne) dissolved in milk ultrafiltrate was Membrane ion exchanger (dead-end type) for phosphorus and lactoperoxidase) , Zaltovind S, 5.4 cm2) was measured at 20°C and 50°C. Established.
供給物質が、０．６ｍｇ／ｍＬのラクトペルオキシダーゼを左１ｔｏ、６ｍｇ／ ｍＬのラクトフェリンを含有する無脂肪乳限外濾過物であることを除き、実験を 実施例６記載のごとく行った。ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼに 対する膜の結合容量ならびに溶離後のこれらの蛋白の回収率を表７に示す。The feed material is 0.6 mg/mL lactoperoxidase, 6 mg/mL The experiment was carried out with the exception that the non-fat milk ultrafiltrate containing mL of lactoferrin. It was carried out as described in Example 6. to lactoferrin and lactoperoxidase Table 7 shows the binding capacity of the membrane and the recovery rate of these proteins after elution.
表７：ｐＨ６，７の牛乳限外濾過物中、強イオン交換デッドエンド膜に別々に適 用した場合の、精製つ戸ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼの結合容 量、溶出率および回収率 １ ラクト７エリ７゛ ２０ １．１±０２ ６０±１７ ９６±２１ルν一（ ５，４ｃｍ”）に供した。′定義を図２に示１゛。゛データは、４回（２０℃） または２回（５０℃）の試験の平均値および標準偏差を表す。Table 7: Separately suitable for strong ion exchange dead-end membranes in milk ultrafiltrate at pH 6,7 Binding capacity of purified lactoferrin and lactoperoxidase when used Amount, dissolution rate and recovery rate 1 lacto 7 eri 7゛ 20 1.1±02 60±17 96±21 le ν1 ( 5.4cm"). The definition is shown in Figure 2.1".The data is 4 times (20℃) Or represents the average value and standard deviation of two tests (50°C).
実施例８ この試験において、１０ｍＭのりん酸ナトリウム（ｐＨ７，０）に溶 解したラクトフェリンおよびラクトペルオキ／ダーゼ（両方の蛋白を含有する溶 液として膜に供した）に対する膜イオン交換体（デッドエンド型、ザルトビンド Ｓ、 ５．４ ｃｍ２）の結合容量を、２０℃および５０℃両方て測定した。供 給物Ｍ （６０ｍＬ）が、０．０３ｍｇ／’ｒｎＬのラクトペルオキ／ダーゼお よび０．１５ｍｇ／ｍＬのラクトフェリン（牛乳および乳清における濃度に似ぜ た）を含有していること以外は実施例６記載のごと（実験を行ったうラクトフェ リンおよびラクトペルオキ／ダーゼに対する膜の結合容量ならびに溶離後のこれ らの蛋白の回収率を表８に示す。Example 8 In this test, the lactoferrin and lactoperoxidase (a solution containing both proteins) membrane ion exchanger (dead-end type, Zaltvind The binding capacity of S, 5.4 cm2) was measured at both 20°C and 50°C. Supplement Feed M (60 mL) contains 0.03 mg/'rnL of lactoperoxidase/dase. and 0.15 mg/mL lactoferrin (similar to concentrations in milk and whey). The same method as described in Example 6 was used except that the lactofergic acid used in the experiment Membrane binding capacity for phosphorus and lactoperoxidase and this after elution Table 8 shows the recovery rates of the proteins.
表８：ｐＨ７，０の緩衝液中、強イオン交換デッドエンド膜に同時に適用した場 合の、精製ウマ・チトクロムＣおよびウシ・ラクトフェリンならびにラクトペル オキ／ダーゼの結合容量、溶出率および回収率゛精製蛋白を１０ｍＭりん酸ナト リウム（ｐＨ７，０）に溶解し、２０℃または５０℃で一緒にづルトビンドＳフ ィルター＜５．４ｃｍ２）に供した。５定義を図２に示す。Table 8: Simultaneous application to strong ion exchange dead-end membrane in pH 7.0 buffer Purified equine cytochrome C and bovine lactoferrin and lactoper Binding capacity, elution rate and recovery rate of oxidase/purified protein in 10mM sodium phosphate (pH 7.0) and mixed together at 20°C or 50°C. filter <5.4 cm2). 5 definitions are shown in Figure 2.
チェダーチーズ乳清を用いたデッドエンド濾過実施例９ この試験において、精 密濾過したｐＨ６，２のチェダーチーズ乳清（１５０ｍＬ）を、膜イオン交換フ ィルターに２０℃にて供した。供給液、濾液および溶出液の試料を、後のＨＰＬ Ｃ，５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび分光学的分析用に集めた。試験により得られたＨ Ｐ Ｌ Ｃおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を、それぞれ図１８および１９に 示す。ラクトフェリンおよびラクトペルオキ／ダーゼに対する膜の結合容量およ び溶離後のこれらの蛋白の回収率を表すデータを表９に示す。Dead-end filtration example 9 using cheddar cheese whey In this test, Microfiltered cheddar cheese whey (150 mL) with a pH of 6.2 was passed through a membrane ion exchange filter. It was subjected to a filter at 20°C. Samples of the feed, filtrate and eluate were subjected to subsequent HPL C, 5DS-PAGE and collected for spectroscopic analysis. H obtained by the test The results of PLC and 5DS-PAGE analysis are shown in Figures 18 and 19, respectively. show. Membrane binding capacity and capacity for lactoferrin and lactoperoxidase Data representing the recovery of these proteins after elution and elution are shown in Table 9.
表９二強カチオン交換デッドエンド膜に適用した場合の、ｐＨ６，２における分 離／バストリゼーンヨンされたチェダーチーズ乳清（精密濾過済み）からのウシ ・ラフ）・フェリンおよびラクトペルオキシダーゼの結合容量、溶出率および回 収率°ラクトフェリン（６３，１ｍｇ／Ｌ）およびラクトペルオキシダーゼ（２ ，４１Ｕ ／ ｍ Ｌ ）を含有する乳清を、２０℃でザルトビノドＳデッドエ ンドフィルター（５，４ｃｍ２）に供した。Table 9 Minutes at pH 6.2 when applied to two strong cation exchange dead-end membranes Beef from processed cheddar cheese whey (microfiltered) ・Rough) ・Binding capacity, elution rate and rotation of ferrin and lactoperoxidase Yield ° Lactoferrin (63,1 mg/L) and lactoperoxidase (2 , 41 U/mL) was added to Zarutovinod S dead yeast at 20°C. and filtered (5.4 cm2).
１゛定義を図２に示す。1' definition is shown in Figure 2.
実施例１０ この試験は、膜イオン交換の前に、乳清のｐＨをＩＭ ＮａＯＨて ７．０に合わせること以外は実施例９記載の試験の繰り返しであった。試験によ り得られたＨＰＬＣおよびＳ Ｄ ’Ｓ −Ｐ Ａ Ｇ Ｅ分析の結果を、それ ぞれ図２０および２１に示す。ラクトフェリンおよびラクトペルオキ／ダーゼに 対する膜の結合容量および溶離後のこれらの蛋白の回収率を表すデータを表１０ に示す。Example 10 This test was conducted by adjusting the pH of whey with IM NaOH before membrane ion exchange. The test described in Example 9 was repeated except that the test was adjusted to 7.0. according to the exam The results of HPLC and SD'S-PAGE analysis obtained by Shown in FIGS. 20 and 21, respectively. For lactoferrin and lactoperoxidase/dase Table 10 shows the data representing the binding capacity of the membrane and the recovery rate of these proteins after elution. Shown below.
表１０ 強力チオン交換デッドエンド膜に適用した場合の、ｐＨ７，０における 分離／バストリセーションされたチェダーチーズ乳清（精密濾過済み）からのウ シ・ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼの結合容量、溶出率および回 収率 ”ラクトフェリン（６１，４ｍｇ／′Ｌ）およびラクトペルオキ／ダーゼ（４， ６１Ｕ ／ ｍ Ｉ−）を含有する乳清を、２０℃でザルトビノドＳデッドエン ドフィルター＜５．４ ｃ ｍ２）に供した。Table 10 At pH 7.0 when applied to strong ion exchange dead-end membrane Urine from separated/bustrated cheddar cheese whey (microfiltered) Binding capacity, elution rate and circulation of lactoferrin and lactoperoxidase yield "Lactoferrin (61,4 mg/'L) and lactoperoxidase/dase (4,4 mg/'L) Whey containing 61U/mI-) was added to Zarutobinod S dead end at 20℃. It was subjected to a defilter <5.4 c m2).
５定義を図２に示す。5 definitions are shown in Figure 2.
実施例１１・ この試験は、膜イオン交換の前に乳清（５０ｍＬ）を１０ｍＭり ん酸ナトリウム（ｐＨ７，０）に対して透析する以外は実施例９記載の試験の繰 り返してあった。試験により得られたＨ Ｐ Ｌ ＣおよびＳ Ｉ）Ｓ−Ｐ、Ａ Ｇ Ｅ分析の結果を、それぞれ図２２および２３に示す。ラクトフェリンおよ びラクトペルオキ／ダーゼに対する膜の結合容量および溶離後のこれらの蛋白の 回収率を表すデータを表１１に示す。Example 11 This test consisted of using a 10mM dilution of whey (50mL) before membrane ion exchange. Repeat the test described in Example 9 except for dialysis against sodium phosphate (pH 7.0). It was repeated. H P L C and S I) S-P, A obtained by the test The results of the GE analysis are shown in FIGS. 22 and 23, respectively. Lactoferrin and The binding capacity of the membrane for and lactoperoxidase and the retention of these proteins after elution. Data representing recovery rates are shown in Table 11.
表１１１強イオンカチオン交換デッドエンド膜に適用した場合の、ｐＨ７，０に おける分離／バストリゼーンヨンされたチェダーチーズ乳清（透析および精密濾 過済み）からのつ／・ラクトフェリンおよびラクトペルオキシダーゼの結合容量 、°ラクトフェリン（５５，８ｍｇ／Ｌ）およびラクトペルオキシダーゼ（５６ ＩＵ／ｍＬ’）を含有する乳清を、２０°ＣでザルトビノドＳデッドエンドフィ ルター（５，４ｃｍ２）に供した。Table 111 When applied to strong ion cation exchange dead-end membrane, at pH 7.0 Separation/basis of cheddar cheese whey (dialysis and microfiltration) Binding capacity of lactoferrin and lactoperoxidase from , °lactoferrin (55,8 mg/L) and lactoperoxidase (56 Whey containing IU/mL') was added to Zarutovinod S dead end fibres at 20°C. Luther (5.4 cm2).
５定義を図２に示す。5 definitions are shown in Figure 2.
実施例１２ この試験において、デッドエンド膜イオン交換濾過（ザルトビンド Ｓ、 ５．４ ｃｍ”、 ０．４５μｍ孔）の濾過（透過）流速を、精密濾過済 みのチェダーチーズ乳清および精密濾過していないチェダーチーズ乳清の両方（ ｐＨ６゜５）を用いｔこ慣用的な濾過（ミニザルトＮ、 ５．３ ｃｍ２．０． ２μｍ孔）の流速と比較した。該実験を、３０ｋＰａ定圧て５０°Ｃにて行った 。結果を図２４に示す。Example 12 In this test, dead-end membrane ion exchange filtration (Zaltvind S, 5.4 cm", 0.45 μm pore) filtration (permeation) flow rate, microfiltered Both pure cheddar cheese whey and non-microfiltered cheddar cheese whey ( (pH 6.5) using conventional filtration (Minisarto N, 5.3 cm 2.0. 2 μm hole). The experiment was conducted at a constant pressure of 30 kPa and at 50°C. . The results are shown in FIG.
無脂肪乳を用いたデッドエンド濾過 実施例１３ 二の試験において、牛乳中のラクトフェリンおよびラクトペルオキ ／ダーゼに対する膜イオン交換体の結合容量を測定した。精密濾過したｐＨ６， ７の無脂肪乳（６０ｍＬ）を、２０℃にてデッドエンド膜イオン交換フィルター （ザルトビンドＳ、 ５．４ ｃｍ２．０．４５μｍ孔）に供した。他の条件は 実施例６について記載したのと同じであった。ラクトフェリンおよびラクトペル オキ／ダーゼに対する膜の結合容量および溶離後のこれらの蛋白の回収率を表す データを表１２に示す。Dead-end filtration using non-fat milk Example 13 In the second test, lactoferrin and lactoperoxia in milk The binding capacity of the membrane ion exchanger for /dase was measured. Microfiltered pH 6, 7 non-fat milk (60 mL) was passed through a dead-end membrane ion exchange filter at 20°C. (Saltvind S, 5.4 cm2.0.45 μm hole). Other conditions are Same as described for Example 6. Lactoferrin and Lactopel Represents the binding capacity of the membrane for oxidases and the recovery of these proteins after elution. The data are shown in Table 12.
表１２ 強力チオン交換デッドエンド膜に適用した場合の、ｐＨ６，７における 分離／バストリゼーションされ精密濾過された牛乳からのウシ・ラクトフェリン Ｕ／ｍＬ）を含有する無脂肪乳を、２０℃でサルトビンドＳデ・ソドエンドフイ ルタ−（５，４ｃｍりに供した。Table 12 At pH 6 and 7 when applied to strong ion exchange dead-end membrane Bovine lactoferrin from separated/bustorized and microfiltered milk Non-fat milk containing 20% of salt (U/mL) was added to Saltvind S de Luther (5.4 cm).
５定義を図２に示す。5 definitions are shown in Figure 2.
本発明を、上記した特別なザルトリウス社の膜に関して説明した力（、他の膜構 造、官能基および多孔性度の使用は本発明の精神の範囲内であること力（容易１ ＝理解されよう。The present invention can be applied to the forces described above with respect to the particular Sartorius membrane (as well as to other membrane constructions). The use of structure, functionality, and porosity is within the spirit of the invention. = be understood.
ここに記載の本発明は、特別に記載された以外の変法および改変を許容すること を当業者は容易に認識するであろう。本発明は、その精神および範囲内の変法お よび改変を包含することが理解されるべきである。The invention described herein is susceptible to variations and modifications other than those specifically described. Those skilled in the art will readily recognize this. This invention contemplates modifications and variations within its spirit and scope. It should be understood that this includes modifications and alterations.
保持液の「リサイクル」 透過液（ｐ） １’ｌＧ、１ 洗浄液（Ｗ） ＦＩＧ、 ２ 透過液体積（Ｌ） ＦＩＧ、３ ０．００ ５．００ １０．００ ＋５．００ ２０．（Ｘ）分 ＦＩＧ、’１ 旦１ｊ ２５０ 、５０ −＝ １５ ＦＩ６．９ ０．０Ｏ５ｊ）０ １α℃０ １５℃）０ ２０．００分 ＦＩＧ、 １０ ＦＩＧ、 １２ ＦＩＧ、 １３ ＦＩＧ。１５ ＦＩＧ、 １６ ＦｌＧ、 １８ ＦＩＧ、 ２０ ０．００ ５．００ １０．００ １５．００ ２０．ＣＸ）分 ＦＩＧ、２２ 時間（分） ＦＩＧ、２１４ 国際調査報告 ｌｌｍｍ息１□Ｎ。“Recycling” of retentate Permeate (p) 1'lG, 1 Cleaning liquid (W) FIG. 2 Permeate volume (L) FIG.3 0.00 5.00 10.00 +5.00 20. (X) minutes FIG,’1 Dan 1j 250, 50 -= 15 FI6.9 0.0O5j) 0 1α℃ 0 15℃) 0 20.00 minutes FIG. 10 FIG. 12 FIG. 13 FIG. 15 FIG. 16 FlG, 18 FIG. 20 0.00 5.00 10.00 15.00 20. CX) minutes FIG. 22 Time (minutes) FIG. 214 International investigation report llmm breath 1□N.
ＦｅｒｍＰＣＴｎ５Ａｎ１０ｆｅ口ｆ武馴り關−屹一り陀ｅｌＧｒｇｍｍｍｌｆ ｌ＃１９１−！ｌｏｏｐｌｐ国際調査報告 ＋′−１１暑−Ｎａ ＫＪＩＡＩＭ＆＋３１１１ Ｆｏｒｍ ＰＣ７ｎｓＮ２＋ｏ ｔｗｍ＋＋ｕａｂａｅ ｎｒ −刻−ｒｈｅｍ ｙｒｕ＋ｙ ＋ ｗ■ａｐｈフロントページの続き （５１） Ｉｎｔ、Ｃ１，’ 識別記号 庁内整理番号Ｃ０７Ｋ １４／７４５ ８３１８−４Ｈ１４／７９ ８３１８−４Ｈ ｌ６１００ ８３１８−４Ｈ （７ｌ）出願人 クイーンズランド州 オーストラリア連邦 ４０００ クィーンズランド、ブリスベン、アシ・ストリ ート６２−８０番 （７２）発明者 ミッチェル、イアン・ロバートオーストラリア連邦 ３８０５ ビクトリア、ナーレ・ウォーレン、キルガーロン・コート８番 （７２）発明者 スミザーズ、ジェフリー・ウェルスフオード オーストラリア連邦 ３１９２ ビクトリア、チェルチンハム、ローナ・ストリ ート６３番Ｉ （７２）発明者 ダイアニジヤス、ディピッド・アランオーストラリア連邦 ４ ０１４ クイーンズランド、ナラジー、オーバーリー・ストリート７番 （７２）発明者 グリープ、ポール・アンソニーオーストラリア連邦 ４１２７ クィーンズランド、スプリングウッド、ジャールディン・ドライブ３番 （７２）発明者 リジェスター、ジェフリー・オウインオーストラリア連邦 ３ ０５６ ビクトリア、ファーントゥリー・ガリイ、パンフィールド・コート１番 （７２）発明者 ジェイムズ、エリツク・アーノルドオーストラリア連邦 ４０ ６７ クィーンズランド、セント・ルシア、スワン・ロード２９潜FermPCTn5An10femouthf l#191-! looplp international investigation report +'-11 heat-Na KJIAIM&+3111 Form PC7nsN2+o twm++uabae nr -koku-rhem yru+y + w■aph front page continuation (51) Int, C1,' Identification symbol Internal office reference number C07K 14/745 8318-4H14/79 8318-4H l6100 8318-4H (7l) Applicant: Queensland Commonwealth of Australia 4000 Queensland, Brisbane, Australia #62-80 (72) Inventor Mitchell, Ian Robert Commonwealth of Australia 3805 8 Kilgarron Court, Narre Warren, Victoria (72) Inventor Smithers, Jeffrey Wellsford Commonwealth of Australia 3192 Victoria, Chelchingham, Lorna Stoli Route 63 I (72) Inventor Dianisias, Dipid Allan Commonwealth of Australia 4 014 7 Overley Street, Nulragey, Queensland (72) Inventor Griep, Paul Anthony Commonwealth of Australia 4127 3 Jardine Drive, Springwood, Queensland (72) Inventor Regester, Geoffrey Owin Commonwealth of Australia 3 056 1 Panfield Court, Ferntree Gully, Victoria (72) Inventor James and Eric Arnold Commonwealth of Australia 40 67 Swan Road 29, St. Lucia, Queensland
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| EP0595993A4 (en) | 1994-08-17 |
| NZ243727A (en) | 1995-03-28 |
| WO1993002098A1 (en) | 1993-02-04 |
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