JPH07327686A - Variant type prex gene oligonucleotide of hepatitis b virus, polypeptide and method for detecting the same - Google Patents
Variant type prex gene oligonucleotide of hepatitis b virus, polypeptide and method for detecting the sameInfo
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- JPH07327686A JPH07327686A JP6155125A JP15512594A JPH07327686A JP H07327686 A JPH07327686 A JP H07327686A JP 6155125 A JP6155125 A JP 6155125A JP 15512594 A JP15512594 A JP 15512594A JP H07327686 A JPH07327686 A JP H07327686A
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、B型肝炎ウイルスの変
異型であるpreX遺伝子およびpreX遺伝子産物の
発明、抗preX遣伝子産物抗体を検出する方法の発
明、ならびにその検出に使用することのできるオリゴヌ
クレオチド、抗原性ポリペプチド、抗preX遺伝子産
物抗体に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to the invention of preX gene and preX gene product which are mutants of hepatitis B virus, invention of a method for detecting anti-preX gene product antibody, and use for detection thereof. The present invention relates to an oligonucleotide, an antigenic polypeptide and an anti-preX gene product antibody.
【0002】[0002]
【従来の技術】B型肝炎ウイルス(HBV)は、一過性
の感染による急性肝炎を引き起すだけではなく、ときに
は劇症肝炎として死をもたらし、また持続性の感染によ
り慢性肝炎、肝硬変、肝癌といった多様な病態の原因と
なるウイルスであることが知られている。HBVの感染
者は世界で2億人とも云われ、HBV感染による人的・
社会的被害は甚大である。2. Description of the Related Art Hepatitis B virus (HBV) not only causes acute hepatitis due to transient infection but sometimes causes death as fulminant hepatitis, and persistent infection causes chronic hepatitis, cirrhosis, and liver cancer. It is known to be a virus that causes various pathological conditions such as. It is said that there are 200 million people in the world who are infected with HBV.
The social damage is enormous.
【0003】HBVの感染を撲滅するためには、HBV
の外被蛋白質を利用したワクチン投与、あるいは汚染血
液の輸血防止を目的とした献血血液のHBs抗原検査、
抗HBs抗体検査、さらには抗HBc抗体検査が有効で
あり、わが国では日本赤十字社によって献血検査体制が
導入・整備された結果目覚ましい成果が挙げられた。In order to eradicate HBV infection, HBV
Administration of vaccination using the coat protein of the above, or HBs antigen test of donated blood for the purpose of preventing transfusion of contaminated blood,
The anti-HBs antibody test and also the anti-HBc antibody test are effective. In Japan, the blood donation test system was introduced and developed by the Japanese Red Cross Society, and the results were remarkable.
【0004】しかし、他方、HBV感染者に対する治療
方法については種々の研究が進められているものの、と
くに慢性肝炎から肝硬変を経て肝癌へ至る病態の深刻化
については、その原因および各段階の治療法が未だ確立
されておらず、その病態の変異を適切に把握し、かつ予
測する検査方法の開発が待たれていた。[0004] On the other hand, on the other hand, although various studies have been conducted on treatment methods for HBV-infected persons, the cause and the treatment method at each stage, especially regarding the seriousness of the pathological condition from chronic hepatitis to cirrhosis to liver cancer. Has not yet been established, and the development of a test method that appropriately grasps and predicts the mutation of the pathological condition has been awaited.
【0005】HBVの遺伝子は1979年にクローニン
グされ全塩基配列が決定されている。これによれば、約
3200塩基の環状の不完全2本鎖DNAであって、4
種類の蛋白質を規定する読取り枠が存在することが報告
されている。このうち、X遺伝子は、ウイルス遺伝子の
転写活性を活性化し、また宿主細胞が有する癌関連遺伝
子をトランスに活性化することが知られているため、発
癌を含む病態との関連が特に注目されている。The HBV gene was cloned in 1979 and the entire nucleotide sequence has been determined. According to this, a circular incomplete double-stranded DNA of about 3200 bases
It has been reported that there is an open reading frame that defines the type of protein. Of these, the X gene is known to activate the transcriptional activity of viral genes, and also to activate the cancer-related genes possessed by host cells in trans. Therefore, the relationship with pathological conditions including carcinogenesis has been particularly noted. There is.
【0006】さらに、最近に至ってX遺伝子の上流16
8塩基の位置に、新たな読み取り開始コドンがあるHB
V株が存在することが報告され、この開始コドンから読
み始められる遺伝子がpreX遺伝子と命名された。し
かし、preX遺伝子が実際に機能しているか否かは不
明であった。[0006] Furthermore, recently, the X gene upstream 16
HB with a new read start codon at 8 bases
It was reported that the V strain existed, and the gene started to read from this start codon was named preX gene. However, it was unclear whether the preX gene actually functions.
【0007】本発明者は、HBV感染患者血清中におけ
るX遺伝子産物の研究に従事した結果、従来知られてい
たX遺伝子の長さから推定されるX遺伝子産物よりも分
子的に大きなX遺伝子産物が存在していることを見い出
し、preX遺伝子が実際に発現し、かつその発現の実
態が従来推定されたものと異なることを見い出した。[0007] As a result of engaging in research on the X gene product in the serum of HBV-infected patients, the present inventor has found that the X gene product, which is molecularly larger than the X gene product estimated from the conventionally known length of the X gene. It was found that the preX gene was actually expressed, and that the actual state of the expression was different from that previously estimated.
【0008】すなわち、HBVには変異型preX遺伝
子を有するものがあり、この変異株においてはpreX
遺伝子開始コドンから43番目の位置にある停止コドン
が変異して、他のセンスコドンに変化し、その結果連続
した長い読み取り枠を形成することが判明した。この変
異型preX遺伝子が前記した大きな遺伝子産物を産生
することが確認された。That is, some HBVs have a mutant preX gene, and in this mutant strain, preX
It was found that the stop codon at the 43rd position from the gene start codon was mutated and changed to another sense codon, resulting in the formation of a continuous long open reading frame. It was confirmed that this mutant preX gene produces the large gene product described above.
【0009】本発明者らは、HBV無症候性キャリアと
慢性肝疾患患者から各々単離したHBV−DNAについ
て研究した結果、変異株の陽性瀕度が無症候性キャリア
に比して慢性B型肝疾患患者において有意に高いことを
確認した。The present inventors have studied HBV-asymptomatic carriers and HBV-DNA isolated from patients with chronic liver disease, respectively, and as a result, the positive strain level of the mutant strain was higher than that of asymptomatic carriers. It was confirmed to be significantly higher in patients with liver disease.
【0010】さらに、本発明者らは研究を進めた結果、
preX遺伝子の変異株(以下「変異型preX遺伝子
株」といい、この型特有のpreX遺伝子を「変異型p
reX遺伝子」という)の検出瀕度が慢性肝炎から肝硬
変、肝癌へと病態が深刻化するのに対応して増加するこ
とも確認した。Further, as a result of the research conducted by the present inventors,
A mutant strain of the preX gene (hereinafter referred to as "mutant preX gene strain", and this type-specific preX gene is referred to as "mutant pX gene strain".
It was also confirmed that the degree of detection of "reX gene") increases in response to the seriousness of the disease state from chronic hepatitis to cirrhosis and liver cancer.
【0011】以上の事実から、本発明者は、変異型pr
eX遺伝子の存在、ならびにその発現物の存否を検査す
ることが、HBVを原因とする疾病の病態を把握し、ま
たその推移を予測するうえて多大の貢献をなしうること
を確認し、本発明を完成した。From the above facts, the present inventor has found that the mutant pr
It was confirmed that examining the presence of the eX gene and the presence or absence of the expression product thereof can make a great contribution to grasping the pathological condition of a disease caused by HBV and predicting its transition, and the present invention Was completed.
【0012】[0012]
【発明が解決しようとする課題】前記したように、HB
Vの感染予防については、その検査体制が整備されたも
のの、HBV感染を原因とする病態を確認し、またその
変移を予測する方法の確立が待たれていた。本発明は変
異型preX遺伝子、およびその遺伝子産物を分子レベ
ルで特定するとともに、これらを使用して変異型HBV
preX遺伝子およびその遺伝子産物等の存否を検出
し、これによって上記課題を解決することを目的とする
ものである。As mentioned above, the HB
Regarding the prevention of V infection, although a test system has been established, the establishment of a method for confirming the pathological condition caused by HBV infection and predicting its transition has been awaited. The present invention identifies a mutant preX gene and its gene product at the molecular level, and uses these to identify mutant HBV
The purpose of the present invention is to detect the presence or absence of the preX gene and its gene product, and thereby solve the above problems.
【0013】[0013]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、無症候性
HBVキャリア、慢性肝炎患者、肝硬変患者、肝癌患者
らの血清よりHBV−DNAを単離し、preX領域を
含むウイルス遺伝子領域の塩基配列を決定した。その結
果、本発明者らは、一方で各ウイルス株に共通する保存
性の高いpreX遺伝子配列が存在するとともに、他方
では病態の推移とともに検出瀕度が増大する変異株が存
在することを確認し、その遺伝子配列を解明し特定する
ことによって本発明を完成させた。The present inventors have isolated HBV-DNA from the sera of asymptomatic HBV carriers, patients with chronic hepatitis, patients with cirrhosis, and patients with liver cancer, and have isolated the bases of the viral gene region including the preX region. The sequence was determined. As a result, the present inventors confirmed that, on the one hand, there is a highly conserved preX gene sequence common to each virus strain, and on the other hand, there is a mutant strain in which the degree of detection increases with the transition of pathological conditions. The present invention has been completed by elucidating and identifying the gene sequence.
【0014】本発明の要旨は、次のとおりである。すな
わち、本発明は、配列番号1ないし6記載のオリゴヌク
レオチド、配列番号7または8記載のポリペプチドの発
明であり、また、配列番号7または8記載の抗原性ペプ
チドと結合する抗preX抗体、配列番号3および配列
番号4記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプ
ライマーペアとして使用して遺伝子増幅を行うB型肝炎
変異型preX遺伝子の検出方法、配列番号1、配列番
号2記載のオリゴヌクレオチド、および/または配列番
号5、配列番号6記載のオリゴヌクレオチドをプライマ
ーペアとして第一段階のpreX遺伝子増幅を行ったの
ち、配列番号3、配列番号4記載のオリゴヌクレオチド
を使用して第二段階の遺伝子増幅を行うB型肝炎変異型
preX遺伝子の検出方法、配列番号1、配列番号2記
載のオリゴヌクレオチド、および/または配列番号5、
配列番号6記載のオリゴヌクレオチドをプライマーペア
として遺伝子増幅を行ったのちに、制限酵素BalIま
たはSau3AIで処理するB型肝炎変異型preX遺
伝子の検出方法、配列番号3および/または配列番号4
記載のオリゴヌクレオチドを標識プローブとして使用す
るB型肝炎変異型preX遺伝子の検出方法、配列番号
1ないし配列番号6記載のオリゴヌクレオチドのいずれ
かを捕捉プローブとして使用して変異型preX遺伝子
を捕捉するB型肝炎変異型preX遺伝子の検出方法、
配列番号7記載のポリペプチドを抗原として使用して抗
preX抗体を捕捉し、標識抗ヒト免疫グロブリン抗体
と結合させるB型肝炎変異型preX遺伝子の検出方
法、配列番号7または8記載のポリペプチドを抗原とし
て使用する、抗preX抗体の検出方法、抗preX抗
体を使用してpreX遺伝子産物を捕捉し、捕捉物を標
識抗preX遺伝子産物抗体と結合させるB型肝炎変異
型preX遺伝子の検出方法、配列番号7または8記載
のポリペプチドを動物に免疫して得る、B型肝炎ウイル
スpreX遺伝子産物ポリクローナル抗体またはモノク
ローナル抗体、請求項20記載のポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体を使用するB型肝炎preX遺
伝子産物の検出方法、の発明である。The gist of the present invention is as follows. That is, the present invention is the invention of the oligonucleotides shown in SEQ ID NOS: 1 to 6 or the polypeptide shown in SEQ ID NOS: 7 or 8, and an anti-preX antibody that binds to the antigenic peptide shown in SEQ ID NOS: 7 or A method for detecting a hepatitis B mutant preX gene, which comprises gene amplification using an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 as a primer pair, an oligonucleotide of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, and / or Alternatively, the oligonucleotides of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 are used as a primer pair to perform the first-stage preX gene amplification, and then the oligonucleotides of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 are used to perform the second-stage gene amplification. Method for detecting hepatitis B mutant preX gene to be carried out, oligonue according to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 Reochido, and / or SEQ ID NO: 5,
A method for detecting a hepatitis B mutant preX gene, which is treated with a restriction enzyme BalI or Sau3AI after gene amplification using the oligonucleotide of SEQ ID NO: 6 as a primer pair, SEQ ID NO: 3 and / or SEQ ID NO: 4
Method for detecting hepatitis B mutant preX gene using the described oligonucleotide as a labeling probe, and B capturing a mutant preX gene using any of the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 1 to 6 as a capture probe A method for detecting hepatitis B mutant preX gene,
A method for detecting a hepatitis B mutant preX gene, which comprises capturing an anti-preX antibody using the polypeptide of SEQ ID NO: 7 as an antigen and binding the labeled anti-human immunoglobulin antibody to the polypeptide of SEQ ID NO: 7 or 8. Method for detecting anti-preX antibody used as antigen, method for detecting hepatitis B mutant preX gene for capturing preX gene product using anti-preX antibody, and binding capture product with labeled anti-preX gene product antibody, sequence A hepatitis B virus preX gene product polyclonal antibody or monoclonal antibody obtained by immunizing an animal with the polypeptide of No. 7 or 8, and the detection of hepatitis B preX gene product using the polyclonal antibody or monoclonal antibody of claim 20. The invention of the method.
【0015】配列番号1ないし6記載のオリゴヌクレオ
チドは常法に従って化学合成によって得ることができ、
ポリメラーゼチェインリアクション法(以下「PCR
法」という)などの遺伝子増幅法におけるプライマーと
して、あるいは捕捉用のプローブとして利用することが
できる。また、酵素や放射性同位元素によって標識した
のち、標識プローブとして用いることもできる。配列番
号1記載のオリゴヌクレオチド#HX−1、配列番号2
記載のオリゴヌクレオチド#HX−2、は野生型・変異
型共通に用いることができ、とくに遺伝子増幅法におい
て、前者はセンスプライマーとして、後者はアンチセン
スプライマーとして利用することができる。The oligonucleotides shown in SEQ ID NOS: 1 to 6 can be obtained by chemical synthesis according to a conventional method,
Polymerase chain reaction method (hereinafter referred to as "PCR
Method)), etc., or as a probe for capture. Further, it can be used as a labeled probe after being labeled with an enzyme or a radioisotope. Oligonucleotide # HX-1 described in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2
The described oligonucleotide # HX-2 can be used for both wild type and mutant type. In particular, in the gene amplification method, the former can be used as a sense primer and the latter can be used as an antisense primer.
【0016】配列番号3記載のオリゴヌクレオチド#H
X−4、配列番号4記載のオリゴヌクレオチド#HX−
5は変異型に特異的に用いることができ、とくに遺伝子
増幅法において、前者はセンスプライマーとして、後者
はアンチセンスプライマーとして利用することができ
る。PCR法を利用する場合は#HX−1/#HX−2
のプライマーペアを利用して得られた増幅産物につい
て、第二段階PCRのプライマーペアとして用いると有
効である。該プライマーペアにより得られる増幅産物は
120bpの長さを有する。Oligonucleotide #H shown in SEQ ID NO: 3
X-4, oligonucleotide # HX- described in SEQ ID NO: 4
5 can be used specifically for the mutant type, and particularly in the gene amplification method, the former can be used as a sense primer and the latter as an antisense primer. # HX-1 / # HX-2 when using the PCR method
It is effective to use the amplification product obtained by using the primer pair of 2) as the primer pair of the second step PCR. The amplification product obtained by the primer pair has a length of 120 bp.
【0017】配列番号5記載のオリゴヌクレオチド$0
44、配列番号6記載のオリゴヌクレオチド$045は
野生型・変異型共通に用いることができ、とくに遺伝子
増幅法において、前者はセンスプライマーとして、後者
はアンチセンスプライマーとして利用することができ
る。PCR法を利用する場合は#HX−1/#HX−2
のプライマーペアを利用して得られた増幅産物につい
て、第二段階PCRのプライマーペアとして用いると有
効である。該プライマーペアーにより得られる増幅産物
は233bpの長さを有する。Oligonucleotide $ 0 described in SEQ ID NO: 5
44, the oligonucleotide $ 045 described in SEQ ID NO: 6 can be used commonly for wild type and mutant type, and particularly in the gene amplification method, the former can be used as a sense primer and the latter as an antisense primer. # HX-1 / # HX-2 when using the PCR method
It is effective to use the amplification product obtained by using the primer pair of 2) as the primer pair of the second step PCR. The amplification product obtained by the primer pair has a length of 233 bp.
【0018】本発明者らは、供血者、慢性肝疾患患者
(慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌疾患者)より血清を得
て、慣用方法に従ってDNAを抽出し、実施例に示すよ
うにpreX遺伝子領域を含む塩基配列を決定した。こ
れらのHBV−DNAの塩基配列を比較することによ
り、全ての型のpreX遺伝子に保存され、かつ遺伝子
増幅を伴う遺伝子検出法に適する性質を有するオリゴヌ
クレオチドを特定し、配列番号1、2および5、6記載
のオリゴヌクレオチドを得た。さらに肝疾患の病態別の
HBV−DNA塩基配列を相互に比較することにより、
変異株のpreX遺伝子の塩基配列を特定した。変異株
に特有のオリゴヌクレオチドである配列番号3および4
のオリゴヌクレオチドを特定し、これを得ることができ
た。これにより、本発明は変異株の検出に好適に利用す
ることができるオリゴヌクレオチド3および4を提供す
ることができることとなった。The present inventors obtained serum from blood donors and patients with chronic liver disease (chronic hepatitis, liver cirrhosis, hepatocellular carcinoma disease patients), extracted DNA according to a conventional method, and, as shown in Examples, preX gene. The base sequence containing the region was determined. By comparing the nucleotide sequences of these HBV-DNAs, oligonucleotides conserved in all types of preX genes and having properties suitable for gene detection methods involving gene amplification were identified, and SEQ ID NOS: 1, 2 and 5 were identified. , 6 were obtained. Furthermore, by comparing the HBV-DNA nucleotide sequences for each disease state of liver disease with each other,
The nucleotide sequence of the preX gene of the mutant strain was identified. Oligonucleotides unique to the mutants, SEQ ID NOS: 3 and 4
Was identified, and it was possible to obtain it. As a result, the present invention can provide oligonucleotides 3 and 4 that can be suitably used for detecting mutant strains.
【0019】したがって、配列番号3および4のオリゴ
ヌクレオチドをプライマーペアとして使用し、ポリメラ
ーゼチェインリアクションを実施すれば、遺伝子を増幅
することで目的遺伝子を検出することができる。さら
に、上記オリゴヌクレオチドが有する目的遺伝子に対す
る特異性の高さを利用し、該オリゴヌクレオチドを捕捉
プローブとして、および/または標識プローブとして使
用することによっても目的遺伝子を検出することができ
る。Therefore, if the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 3 and 4 are used as a primer pair and the polymerase chain reaction is carried out, the target gene can be detected by amplifying the gene. Furthermore, the target gene can also be detected by utilizing the high specificity of the above-mentioned oligonucleotide for the target gene and using the oligonucleotide as a capture probe and / or a labeled probe.
【0020】HBV−DNA量が少ない場合には、pr
eX領域を含む、広範囲の遺伝子配列を検索するのが好
ましい。このことから、本発明らはpreX領域を挟む
領域に高い保存性を有する配列番号5、6記載のオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして使用することを見い出
し、前記の遺伝子増幅法と組合わせることによって、D
NA量が低い場合であっても高感度にpreX遺伝子を
検出することができる方法を発明した。本発明者らは、
まず配列番号5、6記載のオリゴヌクレオチドをプライ
マーペアとして用いて第一段階の増幅を用い、つぎに前
記記載のpreX遺伝子特異増幅を行う、二段階遺伝子
増幅法を発明した。When the amount of HBV-DNA is small, pr
It is preferable to search a wide range of gene sequences, including the eX region. From this, the present inventors have found that the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 5 and 6 having high conservation in the region flanking the preX region are used as primers, and by combining with the gene amplification method described above, D
The inventors have invented a method capable of detecting the preX gene with high sensitivity even when the NA amount is low. We have
A two-step gene amplification method was invented, in which the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 5 and 6 were used as a primer pair to perform the first-step amplification, and then the above-described preX gene-specific amplification was performed.
【0021】遺伝子の検出法としては、遺伝子増幅後に
増幅遺伝子を電気泳動しDNAをバンドとして確認する
方法があるが、この他に、特異的オリゴヌクレオチド3
または4のいずれかを捕捉プローブとして使用し、もう
一方の特異的オリゴヌクレオチドに対して相補性を有す
るオリゴヌクレオチドを標識プローブとして使用して、
試料中のpreX遺伝子を捕捉したうえ、標識プローブ
と結合させてpreX遺伝子を検出する方法、あるいは
増幅遺伝子を適当なメンブレン上に物理的または化学的
に結合させ、その後に標識プローブと反応・結合し検出
する方法等がある。As a method for detecting a gene, there is a method in which the amplified gene is electrophoresed after gene amplification and DNA is confirmed as a band. In addition to this, specific oligonucleotide 3
Or using any of 4 as a capture probe and an oligonucleotide having complementarity to the other specific oligonucleotide as a labeled probe,
A method for detecting the preX gene by capturing the preX gene in the sample and then binding it to a labeled probe, or physically or chemically binding the amplified gene to an appropriate membrane and then reacting and binding with the labeled probe There are detection methods and the like.
【0022】また、本発明者らは、制限酵素を利用した
検出方法を発明した。すなわち、配列番号1、2および
/または配列番号5、6のオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして増幅したpreX遺伝子において、野生型に
は制限酵素BalIの切断部位が存在するが、変異型p
reXの遺伝子には該切断部位が存在しない。これによ
り変異型preX遺伝子を検出することができ、また混
合型の感染においては両型のウイルスの比率を検出する
ことができる(図3)。Further, the present inventors have invented a detection method using a restriction enzyme. That is, in the preX gene amplified using the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 1 and 2 and / or SEQ ID NOs: 5 and 6 as primers, the wild type has a cleavage site for the restriction enzyme BalI, but the mutant p
The cleavage site does not exist in the reX gene. As a result, the mutant preX gene can be detected, and the ratio of both types of virus can be detected in the mixed infection (FIG. 3).
【0023】同様に、制限酵素Sau3AI認識部分を
有するので、Sau3AI処理により変異型遺伝子を検
出し、また混合型感染における両型のウイルスの比率を
検出することができる(図3)。Similarly, since it has a restriction enzyme Sau3AI recognition site, it is possible to detect mutant genes by Sau3AI treatment and to detect the ratio of both types of viruses in mixed infection (FIG. 3).
【0024】さらに、発明者らは、変異株および野生株
の遺伝子配列にもとづき、配列番号7および8記載の抗
原性ペプチドを得た。ポリペプチドは常法により化学合
成によって得ることができ、また、適当なベクターを利
用して大腸菌、酵母等に組み込んで発現して得ることが
できる。Furthermore, the inventors obtained the antigenic peptides of SEQ ID NOS: 7 and 8 based on the gene sequences of the mutant strain and the wild strain. The polypeptide can be obtained by chemical synthesis by a conventional method, or can be obtained by incorporating it into Escherichia coli, yeast or the like using a suitable vector and expressing it.
【0025】配列番号7記載のポリペプチドは変異型p
reX遺伝子から翻訳されるアミノ酸配列を有してお
り、これを抗原として用いる免疫学的測定法によりサン
プル中の特異抗体を測定し、肝疾患の診断に用いること
ができる。また、配列番号8記載のポリペプチドは野生
型preX遺伝子において開始コドンから43番目の位
置にある停止コドンが変異し、連続して読み取りが行わ
れた場合に翻訳されるアミノ酸配列を有しており、これ
を抗原として用いる免疫学的測定法によりサンプル中の
特異抗体を測定し、肝疾患の診断に用いることができ
る。また上記2ペプチドに反応する特異抗体の反応性を
比較することも有用である。The polypeptide shown in SEQ ID NO: 7 is a mutant p
It has an amino acid sequence translated from the reX gene and can be used for diagnosing liver disease by measuring a specific antibody in a sample by an immunological assay using this as an antigen. The polypeptide of SEQ ID NO: 8 has an amino acid sequence that is translated when the stop codon at the 43rd position from the start codon in the wild-type preX gene is mutated and the reading is continuously performed. The specific antibody in a sample can be measured by an immunoassay using this as an antigen and used for diagnosis of liver disease. It is also useful to compare the reactivity of specific antibodies that react with the above two peptides.
【0026】また、配列番号7記載のポリペプチド、配
列番号8記載のポリペプチドをそれぞれ動物に免疫し、
常法に従ってポリクローナル抗体やモノクローナル抗体
を得ることができる。得られた抗変異型preX特異抗
体、もしくは抗野生型preX特異抗体は、特異抗体同
士の組み合わせや抗ヒト免疫グロブリン抗体との組み合
わせによって、サンドイッチEIA法やウェスタンブロ
ット法などの免疫学的測定法によりサンプル中の抗原を
測定するのに用いることがてきる。Further, animals are immunized with the polypeptide shown in SEQ ID NO: 7 and the polypeptide shown in SEQ ID NO: 8, respectively,
A polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be obtained according to a conventional method. The obtained anti-mutant preX-specific antibody or anti-wild-type preX-specific antibody is subjected to immunoassay such as sandwich EIA method or Western blotting method by combination of specific antibodies or combination with anti-human immunoglobulin antibody. It can be used to measure the antigen in a sample.
【0027】[0027]
【作用】本発明の方法は、変異型preX遺伝子を特異
的に検出することができ、HBVによる肝疾患の病態変
化を適切に把握することができる。本発明のオリゴヌク
レオチド、ポリペプチドは上記検出方法に供することが
できる。According to the method of the present invention, the mutant preX gene can be specifically detected, and the pathological change of liver disease due to HBV can be appropriately grasped. The oligonucleotide or polypeptide of the present invention can be used in the above detection method.
【0028】[0028]
【実施例】以下、本発明の実施例について述べるが、も
とより本発明がこれらの実施例に限定されるものではな
い。EXAMPLES Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to these examples.
【0029】[0029]
【実施例1】HBV無症候性キャリアおよび各種B型肝
疾患例に於けるHBVpreX遺伝子の塩基配列ならび
にアミノ酸配列は次のようにして決定した。 (1)DNA抽出 HBVの無症候性キャリア、慢性肝炎疾患者、肝硬変患
者、肝細胞癌患者の血清より本発明者らが既発表の方法
(Okamoto et al.,J.Virol.1
990:64:1298−1303)に従ってDNAを
抽出した。 (2)塩基配列の決定 (1)の方法に従って50μlの血清よりDNAを抽出
した後、これを50μlの蒸留水で溶解した。このDN
A溶液5μlに対し400nMの配列表1および2記載
のオリゴヌクレオチドをプライマーペアとして含む45
μlのポリメラーゼチェインリアクション反応溶液(D
NA amplification reagent
キット:Perkin−Elmer Cetus)DN
A thermal cycler(Perkin−E
lmer Cetus)を用い、通常の方法に従って遺
伝子増幅を行った(Saiki et al.,Sci
ence 239:487−491,1988)。反応
サイクルは変性(94℃、1分)、プライマーアニーリ
ング(55℃、1分30秒)、伸長(72℃、2分)よ
り構成され、このサイクルを35回繰り返し行い増幅し
た。増幅遺伝子はMicrocon 100(Amic
on.Inc)を用いて精製し、配列表1記載のオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして市販のキット(PRI
SM Ready Reaction Dye Ter
minator Cycle sequencing
Kit:Applied Biosystems,In
c)を用いて反応させ、373 DNA Sequen
cer(Applied Biosystems,In
c)を用いて配列決定した。更にウイルス量が少ないこ
とが予想されるHBe抗体陽性者より得た試料を対象と
する場合には、配列番号5または6記載のオリゴヌクレ
オチドをプライマーとして用いて、上記の方法をプライ
マーアニーリング工程を60℃1分、伸長工程を72℃
1分30秒に変更して行う遺伝子増幅作業を引き続いて
行った。この場合には配列決定に際しては配列表1記載
のオリゴヌクレオチドの代わりに配列表5記載のオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして用いて配列を決定し
た。これによってpreX−X領域を含む塩基配列が決
定された。 (3)preX遺伝子ならびに変異型preX遺伝子特
異配列の決定 以上の作業より57クローンのpreX−X遺伝子領域
の配列が決定され、得られた配列を比較することでpr
eXに保存的な、また愚者に特異的な変異型preX遺
伝子配列に特異的な配列を検索した。その結果、pre
X遺伝子保存的オリゴヌクレオチドとして配列番号1お
よび2の配列を有するオリゴヌクレオチドを、変異型p
reXに特異的なオリゴヌクレオチドとして配列番号3
および4記載のオリゴヌクレオチドを見い出した。Example 1 The nucleotide sequence and amino acid sequence of HBVpreX gene in HBV asymptomatic carriers and various cases of type B liver disease were determined as follows. (1) DNA extraction From the serum of asymptomatic carriers of HBV, patients with chronic hepatitis, patients with liver cirrhosis, and patients with hepatocellular carcinoma, the method previously published by the present inventors (Okamoto et al., J. Virol. 1).
DNA was extracted according to (990: 64: 1298-1303). (2) Determination of nucleotide sequence DNA was extracted from 50 μl of serum according to the method of (1) and then dissolved in 50 μl of distilled water. This DN
45 nl of 400 nM of the oligonucleotides shown in Sequence Listing 1 and 2 for 5 μl of solution A is contained as a primer pair 45
μl Polymerase chain reaction solution (D
NA amplification reagent
Kit: Perkin-Elmer Cetus) DN
A thermal cycler (Perkin-E
gene amplification was carried out according to the usual method using Lmer Cetus (Saiki et al., Sci).
ence 239: 487-491, 1988). The reaction cycle consisted of denaturation (94 ° C., 1 minute), primer annealing (55 ° C., 1 minute 30 seconds), extension (72 ° C., 2 minutes), and this cycle was repeated 35 times for amplification. The amplified gene is Microcon 100 (Amic
on. Inc.), and a commercially available kit (PRI
SM Ready Reaction Dye Ter
minator Cycle sequencing
Kit: Applied Biosystems, In
c) and react with 373 DNA Sequence.
cer (Applied Biosystems, In
Sequenced using c). Furthermore, when a sample obtained from an HBe antibody-positive person who is expected to have a low viral load is used, the oligonucleotide of SEQ ID NO: 5 or 6 is used as a primer, and the above method is followed by a primer annealing step. ℃ 1 minute, extension step 72 ℃
The gene amplification work carried out after changing to 1 minute and 30 seconds was carried out subsequently. In this case, upon sequencing, the oligonucleotides shown in Sequence Listing 5 were used as primers instead of the oligonucleotides shown in Sequence Listing 1 to determine the sequence. Thereby, the nucleotide sequence containing the preX-X region was determined. (3) Determination of preX gene and mutant preX gene-specific sequence The sequence of the preX-X gene region of 57 clones was determined by the above work, and the obtained sequences were compared to determine pr
A sequence specific to the mutant preX gene sequence, which is conserved in eX and specific to fools, was searched. As a result, pre
As the X gene conservative oligonucleotide, the oligonucleotides having the sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2 were used as mutant p
SEQ ID NO: 3 as an oligonucleotide specific to reX
And the oligonucleotides described in 4 were found.
【0030】[0030]
【実施例2】 (1)変異型preX遺伝子配列検出系の確立 上記の如く決定された変異型preX遺伝子特異オリゴ
ヌクレオチドをプライマーペアとして用いて、遺伝子増
幅法による変異型preX遺伝子検出法を確立した。Example 2 (1) Establishment of Mutant preX Gene Sequence Detection System Using the mutant preX gene-specific oligonucleotide determined as described above as a primer pair, a mutant preX gene detection method by gene amplification method was established. .
【0031】(1)DNA抽出 DNAは既記載の方法に従って実施した。 (2)遺伝子増幅 遺伝子増幅は配列番号1および2記載のオリゴヌクレオ
チドをプライマーセットとして、あるいは、同3および
4記載のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして
用い、既記載の反応条件、機器、試薬を用いて増幅し
た。 (3)増幅遺伝子の配列決定 増幅した遺伝子は、既記載の方法にて精製し、既記載の
方法に従って配列を決定した。その結果、配列番号3、
4のオリゴヌクレオチドをプライマーペアとして用いる
ことにより変異型preX遺伝子に特異的な配列のみが
増幅されることが判明した。従って、上記のオリゴヌク
レオチドは変異型preX遺伝子の検出に有用であり、
記載の方法により特異的に検出できることが確認され
た。(1) DNA extraction DNA was performed according to the method described above. (2) Gene amplification For gene amplification, the oligonucleotides shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 are used as a primer set, or the oligonucleotides shown in 3 and 4 are used as a primer set, and the reaction conditions, equipment, and reagents described above are used. Amplified. (3) Sequencing of amplified gene The amplified gene was purified by the method described above, and the sequence was determined according to the method described previously. As a result, SEQ ID NO: 3,
It was found that by using the oligonucleotide of 4 as a primer pair, only the sequence specific to the mutant preX gene was amplified. Therefore, the above-mentioned oligonucleotide is useful for detecting a mutant preX gene,
It was confirmed that it could be specifically detected by the method described.
【0032】[0032]
【実施例3】 選択したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた
preX遺伝子ならびに変異型preX遺伝子の検出 143例のHBs抗原陽性者(供血者44例、慢性肝炎
患者54例、肝硬変患者24例、肝細胞癌患者21例)
よりDNAを抽出し、配列番号1および2をプライマー
ペアとしてpreX遺伝子(233bp)を、配列番号
3および4記載のオリゴヌクレオチドをプライマーペア
ーとして変異型preX遺伝子(120bp)を検出し
た。使用試料の量、反応条件、ならびに使用試薬・機器
は前述の通りである。結果は表1に示す。Example 3 Detection of preX Gene and Mutant preX Gene Using Selected Oligonucleotides as Primers 143 HBsAg Positives (44 Donors, 54 Patients with Chronic Hepatitis, 24 Patients with Cirrhosis, Hepatocellular Carcinoma) 21 patients)
The DNA was extracted, and the preX gene (233 bp) was detected using SEQ ID NOs: 1 and 2 as a primer pair, and the mutant preX gene (120 bp) was detected using the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 3 and 4 as a primer pair. The amount of sample used, the reaction conditions, and the reagents and equipment used are as described above. The results are shown in Table 1.
【0033】[0033]
【表1】 [Table 1]
【0034】HBs抗原陽性者に於ける変異型のpre
X遺伝子陽性者は無症候性HBVキャリアでは極めて低
い(2.3%)のに対し、B型慢性肝疾患患者では有意
に高い(57.4−81%)ことがわかった。また、慢
性肝疾患群内では慢性肝炎から肝硬変、肝癌へと進行す
るに伴い陽性率が高くなることが示され(57.4%、
75%、81%)、本検出法がHBV無症候性HBVキ
ャリアと肝疾患例との識別およびB型慢性肝疾患の病態
推移の予測に有用であることが示された。Mutant pre in HBs antigen-positive individuals
It was found that X gene positive persons were extremely low in asymptomatic HBV carriers (2.3%), but significantly higher in type B chronic liver disease patients (57.4-81%). In the group of chronic liver diseases, the positive rate was shown to increase with progression from chronic hepatitis to cirrhosis and liver cancer (57.4%,
75%, 81%), it was shown that this detection method is useful for distinguishing HBV asymptomatic HBV carriers from liver disease cases and predicting the pathological transition of type B chronic liver disease.
【0035】[0035]
【実施例4】 HBe抗陽性HBV疾病患者、ならびにHBe抗体陽性
HBV疾病患者での変異型preX遺伝子の検出。 HBe抗原陽性あるいはHBe抗体陽性の無症候性キャ
リアと肝疾患患者についてTotal HBV DNA
のなかでの変異型preX遺伝子を調べた。Example 4 Detection of mutant preX gene in HBe anti-positive HBV disease patients and HBe antibody-positive HBV disease patients. About HBe antigen positive or HBe antibody positive asymptomatic carriers and liver disease patients Total HBV DNA
Among them, the mutant preX gene was examined.
【0036】上記のHBV−DNA陽性者から前述の方
法に従ってDNAを抽出し、これを適当な希釈液を用い
て10倍ずつ希釈し、希釈DNA系列を作成し、これよ
り増幅を行い検出可能な最低濃度より、希釈前の試料の
力価を求めた。具体的には、試料DNA溶液1μlに、
配列番号1および2記載のオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして40nM含む前述のポリメラーゼチェインリ
アクション反応液(DNA amplificatio
n reagent キット:Perkin−Elme
r Cetus)を加え、前述の機器を用いて変性(9
4℃、1分)、プライマーアニーリング(60℃、1分
30秒)、伸長(72℃、2分)より構成される反応サ
イクルを30回繰り返し行い第一段階増幅を行った。こ
の増幅産物Total HBV DNA検出の場合には
配列番号5および6記載のオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして、また変異型preX遺伝子検出の場合には
配列番号3および4記載のオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして400nM含むポリメラーゼチェインリアク
ション反応液(DNA amplificationr
eagent キットPerkin−Elmer Ce
tus)を加え、前述の機器を用いて変性(94℃、1
分)、プライマーアニーリング(60℃、1分30
秒)、伸長(72℃、2分)より構成される反応サイク
ルを30回繰り返し行い、第二段階増幅を行った。増幅
後、前述の方法に従って電気泳動を実施した。非変異型
preX遺伝子は233bp(塩基長)のバンドとし
て、変異型preX遺伝子は120bpのバンドとして
確認された。DNA is extracted from the above HBV-DNA positive individuals according to the above-mentioned method, and this is diluted 10-fold with an appropriate diluent to prepare a diluted DNA series, which can be amplified and detected. The titer of the sample before dilution was calculated from the lowest concentration. Specifically, in 1 μl of the sample DNA solution,
The above-mentioned polymerase chain reaction reaction solution containing 40 nM of the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 1 and 2 as a primer (DNA amplification
n reagent kit: Perkin-Elme
r Cetus) and denatured (9
A reaction cycle consisting of 4 ° C., 1 minute), primer annealing (60 ° C., 1 minute 30 seconds), and extension (72 ° C., 2 minutes) was repeated 30 times to perform the first stage amplification. A polymerase chain containing 400 nM of the oligonucleotides of SEQ ID NOS: 5 and 6 as a primer in the case of detecting the amplified product Total HBV DNA, and the oligonucleotides of SEQ ID NOS: 3 and 4 as a primer in the case of detecting the mutant preX gene. Reaction reaction solution (DNA amplification
eagent kit Perkin-Elmer Ce
tus) and denaturing (94 ° C, 1
Min), primer annealing (60 ° C, 1 min 30 min)
Second) and extension (72 ° C., 2 minutes), the reaction cycle was repeated 30 times to perform the second stage amplification. After amplification, electrophoresis was performed according to the method described above. The non-mutated preX gene was confirmed as a 233 bp (base length) band, and the mutant preX gene was confirmed as a 120 bp band.
【0037】上記の作業の結果、肝疾患例では変異型p
reX遺伝子がHBe抗原陽性、抗体陽性にかかわらず
total HBV DNAとパラレルに検出されるこ
とがわかった。変異型preX遺伝子の有無が病態の発
症に大きく関係していることが示され、この変異型pr
eX遺伝子が病態のマーカーとして有用であることが確
認された。(図2)As a result of the above work, in the case of liver disease, mutant p
It was found that the reX gene was detected in parallel with the total HBV DNA regardless of whether the HBe antigen was positive or the antibody was positive. It was shown that the presence or absence of the mutant preX gene is significantly related to the onset of pathological conditions.
It was confirmed that the eX gene is useful as a marker for pathological conditions. (Fig. 2)
【0038】[0038]
【発明の効果】本発明は、HBV遺伝子のなかの変異型
preX遺伝子ならびにその遺伝子産物および抗遺伝子
産物抗体を高感度に検出する方法ならびにそれに利用で
きるオリゴヌクレオチド、抗原性ペプチド、抗体を提供
できる。従って、B型肝炎患者にあって正確な診断、特
に病態の把握が可能であり、ウイルス肝炎における治療
上有用な情報を提供できる。INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can provide a method for detecting a mutant preX gene in the HBV gene and its gene product and anti-gene product antibody with high sensitivity, and an oligonucleotide, an antigenic peptide and an antibody which can be used for the method. Therefore, it is possible to accurately diagnose a hepatitis B patient, especially to grasp the pathological condition, and to provide useful information for treatment of viral hepatitis.
【0039】[0039]
【配列表】 [Sequence list]
【0040】 [0040]
【0041】 [0041]
【0042】 [0042]
【0043】 [0043]
【0044】 [0044]
【0045】 [0045]
【0046】 [0046]
【図1】無症候性キャリアおよび各種肝疾患患者より得
たHBV−DNAのpreX領域の塩基配列を示す。図
左に示した番号で(01)から(24)は無症候性キャ
リア、(25)から(57)は慢性肝疾患者、肝硬変患
者、肝細胞癌患者の血清より得られたクローンを示す。FIG. 1 shows the nucleotide sequences of the preX region of HBV-DNA obtained from asymptomatic carriers and patients with various liver diseases. In the numbers shown on the left side of the figure, (01) to (24) show asymptomatic carriers, and (25) to (57) show clones obtained from sera of patients with chronic liver disease, patients with liver cirrhosis, and patients with hepatocellular carcinoma.
【図2】HBe抗原陽性群ならびに抗HBe抗体陽性群
での無症候性キャリア(○)ならびに各種疾患患者
(●)の変異型preX遺伝子力価(縦軸)およびto
tal HBV DNA力価(横軸)を示す。[FIG. 2] Mutant preX gene titers (vertical axis) and to of asymptomatic carriers (○) and patients with various diseases (●) in the HBe antigen-positive group and the anti-HBe antibody-positive group.
Tal HBV DNA titer (horizontal axis) is shown.
【図3】野生型、変異型のそれぞれDNA配列のうちプ
ライマー#HX−4(配列番号1)、#HX−5(配列
番号2)に相当する領域における制限酵素BalI、S
au3AIによって認識される配列部分を示す。Bal
Iは野生型においてのみ、Sau3AIは変異型におい
てのみ作用される。FIG. 3 Restriction enzymes BalI and S in the regions corresponding to primers # HX-4 (SEQ ID NO: 1) and # HX-5 (SEQ ID NO: 2) in the wild-type and mutant-type DNA sequences, respectively.
The sequence part recognized by au3AI is shown. Bal
I acts only in the wild type and Sau3AI only in the mutant form.
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 G01N 33/566 33/576 B 33/577 B // A61K 39/395 S Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Office reference number FI technical display location G01N 33/566 33/576 B 33/577 B // A61K 39/395 S
Claims (20)
ヌクレオチド。1. An oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
ヌクレオチド。2. An oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
ヌクレオチド。3. An oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
ヌクレオチド。4. An oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
ヌクレオチド。5. An oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 5.
ヌクレオチド。6. An oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 6.
リペプチド。7. A polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
リペプチド。8. A polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
る抗preX抗体。9. An anti-preX antibody which binds to the antigenic peptide of SEQ ID NO: 7.
配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーペアとし
て使用して遺伝子増幅を行うB型肝炎変異型preX遺
伝子の検出方法。10. A method for detecting a hepatitis B mutant preX gene, which comprises gene amplification using an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 as a primer pair.
クレオチド、および/または配列番号5、配列番号6記
載のオリゴヌクレオチドをプライマーペアとして第一段
階のpreX遺伝子増幅を行ったのち、配列番号3、配
列番号4記載のオリゴヌクレオチドを使用して第二段階
の遺伝子増幅を行うB型肝炎変異型preX遺伝子の検
出方法。11. A first-step preX gene amplification using the oligonucleotides of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and / or the oligonucleotides of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 as a primer pair, and then SEQ ID NO: 3 A method for detecting a hepatitis B mutant preX gene, which comprises performing a second-stage gene amplification using the oligonucleotide of SEQ ID NO: 4.
クレオチド、および/または配列番号5、配列番号6記
載のオリゴヌクレオチドをプライマーペアとして遺伝子
増幅を行ったのちに、制限酵素BalIで処理するB型
肝炎変異型preX遺伝子の検出方法。(12) A gene which is amplified with the oligonucleotides of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and / or the oligonucleotides of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 as a primer pair and then treated with a restriction enzyme BalI. A method for detecting a hepatitis B mutant preX gene.
クレオチド、および/または配列番号5、配列番号6記
載のオリゴヌクレオチドをプライマーペアとして遺伝子
増幅を行ったのちに、制限酵素Sau3AIで処理する
B型肝炎変異型preX遺伝子の検出方法。13. A gene amplification using the oligonucleotides of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and / or the oligonucleotides of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 as a primer pair, followed by treatment with a restriction enzyme Sau3AI B A method for detecting a hepatitis B mutant preX gene.
載のオリゴヌクレオチドを標識プローブとして使用する
B型肝炎変異型preX遺伝子の検出方法。14. A method for detecting a hepatitis B mutant preX gene, which comprises using the oligonucleotide of SEQ ID NO: 3 and / or SEQ ID NO: 4 as a labeled probe.
ゴヌクレオチドのいずれかを捕捉プローブとして使用し
て変異型preX遺伝子を捕捉するB型肝炎変異型pr
eX遣伝子の検出方法。15. A hepatitis B mutant pr which captures a mutant preX gene by using any of the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 1 to 6 as a capture probe.
How to detect eX message.
を抗原として使用する、抗preX抗体の検出方法。16. A method for detecting an anti-preX antibody, which comprises using the polypeptide of SEQ ID NO: 7 or 8 as an antigen.
して使用して抗preX抗体を捕捉し、標識抗ヒト免疫
グロブリン抗体と結合させるB型肝炎変異型preX遺
伝子の検出方法。17. A method for detecting a hepatitis B mutant preX gene, which comprises capturing an anti-preX antibody using the polypeptide of SEQ ID NO: 7 as an antigen and binding it with a labeled anti-human immunoglobulin antibody.
子産物を捕捉し、捕捉物を標識抗preX遺伝子産物抗
体と結合させるB型肝炎変異型preX遺伝子の検出方
法。18. A method for detecting a hepatitis B mutant preX gene, which comprises capturing a preX gene product using an anti-preX antibody and binding the captured product to a labeled anti-preX gene product antibody.
を動物に免疫して得る、B型肝炎ウイルスpreX遺伝
子産物ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体。19. A hepatitis B virus preX gene product polyclonal antibody or monoclonal antibody obtained by immunizing an animal with the polypeptide of SEQ ID NO: 7 or 8.
たはモノクローナル抗体を使用するB型肝炎preX遺
伝子産物の検出方法。20. A method for detecting a hepatitis B preX gene product, which uses the polyclonal antibody or the monoclonal antibody according to claim 19.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6155125A JPH07327686A (en) | 1994-06-02 | 1994-06-02 | Variant type prex gene oligonucleotide of hepatitis b virus, polypeptide and method for detecting the same |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6155125A JPH07327686A (en) | 1994-06-02 | 1994-06-02 | Variant type prex gene oligonucleotide of hepatitis b virus, polypeptide and method for detecting the same |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH07327686A true JPH07327686A (en) | 1995-12-19 |
Family
ID=15599110
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP6155125A Pending JPH07327686A (en) | 1994-06-02 | 1994-06-02 | Variant type prex gene oligonucleotide of hepatitis b virus, polypeptide and method for detecting the same |
Country Status (1)
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JP (1) | JPH07327686A (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1544311A1 (en) * | 2003-12-16 | 2005-06-22 | Bio-Rad Pasteur | Oligonucleotides for the detection of hepatitis B virus |
-
1994
- 1994-06-02 JP JP6155125A patent/JPH07327686A/en active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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EP1544311A1 (en) * | 2003-12-16 | 2005-06-22 | Bio-Rad Pasteur | Oligonucleotides for the detection of hepatitis B virus |
WO2005061737A1 (en) * | 2003-12-16 | 2005-07-07 | Bio-Rad Pasteur | Oligonucleotides for the detection of hepatitis b virus |
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