JPH07278190A - Recombinant mite allergen - Google Patents
Recombinant mite allergenInfo
- Publication number
- JPH07278190A JPH07278190A JP6088059A JP8805994A JPH07278190A JP H07278190 A JPH07278190 A JP H07278190A JP 6088059 A JP6088059 A JP 6088059A JP 8805994 A JP8805994 A JP 8805994A JP H07278190 A JPH07278190 A JP H07278190A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ser
- asp
- mite allergen
- gat
- asn
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、アレルゲン活性を有す
る組換えダニアレルゲン、その遺伝子、該遺伝子を発現
させ得る発現ベクター、発現ベクターで形質転換された
形質転換体、該組換えダニアレルゲンの製造方法、ダニ
アレルギー疾患治療剤、およびダニアレルギー疾患診断
薬に関するものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a recombinant mite allergen having an allergen activity, a gene thereof, an expression vector capable of expressing the gene, a transformant transformed with the expression vector, and the production of the recombinant mite allergen. The present invention relates to a method, a mite allergic disease therapeutic agent, and a mite allergic disease diagnostic agent.
【０００２】[0002]
【従来の技術】屋内塵性ダニは、アトピー性気管支喘息
等のアレルギー疾患の主要な原因として重要である。従
来、アレルギー疾患の治療剤としては、アレルギーの原
因物質である減感作療法が、最も重要な根本治療とさ
れ、特に花粉症を始め屋内塵、真菌アレルギー等の吸入
性アレルゲンである回避困難な抗原で引き起こされる疾
患においては、その評価は今や確立されたものといえ
る。しかしながら、この減感作療法では感作抗原による
アナフィラキシーの危険が伴う為、安全な治療用抗原の
投与が必要とされ、そのような感作抗原の研究が進めら
れている。2. Description of the Related Art Indoor dust mites are important as a major cause of allergic diseases such as atopic bronchial asthma. Conventionally, as a therapeutic agent for allergic diseases, hyposensitization therapy, which is a causative agent of allergy, has been regarded as the most important fundamental treatment, and it is an inhalable allergen such as hay fever, indoor dust, fungal allergy, etc. In the case of antigen-induced diseases, the evaluation is now established. However, since this hyposensitization therapy involves the risk of anaphylaxis due to the sensitizing antigen, it is necessary to administer a safe therapeutic antigen, and research on such a sensitizing antigen is underway.
【０００３】ダニアレルギー疾患については、ヤケヒョ
ウヒダニ（Dermatophagoides pteronyssinus）及びコナ
ヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae）の２種のダ
ニが、屋内塵中のアレルゲン源として重要であると報告
されている〔Allerg. Asthma, 10, 329 〜334 (1964);
J. Allergy, 42, 14〜 28 (1968)] 。これらのダニか
ら、主要ダニアレルゲンが分画され、それらはダニ排泄
物及び／又はダニ虫体中に含有されている分子量24-28k
D の糖蛋白（pI 4.6〜7.2)、及び／又は分子量14.5-20k
D の蛋白（pI 5〜7.2)であると報告されている〔J. Imm
unol.,125, 587〜592 (1980); J. Allergy Clin. Immun
ol.,76, 753 〜761 (1985); Immunol., 46, 679 〜687
(1982); Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 81, 214
〜223 (1986); J. Allergy Clin. Immunol.,75, 686 〜
692 (1985)等〕。しかし、減感作治療用抗原として有効
かつ安全なものは、未だ得られていないのが実情であ
る。Regarding mite allergic diseases, it has been reported that two kinds of mites, Dermatophagoides pteronyssinus and Dermatophagoides farinae , are important as sources of allergens in indoor dust [Allerg. Asthma, 10 , 329]. ~ 334 (1964);
J. Allergy, 42 , 14-28 (1968)]. From these mites, major mite allergens were fractionated, and they were contained in mite excrement and / or mite body and had a molecular weight of 24-28k.
D glycoprotein (pI 4.6-7.2) and / or molecular weight 14.5-20k
It is reported to be a D protein (pI 5 to 7.2) [J. Imm
unol., 125, 587 ~ 592 (1980); J. Allergy Clin. Immun
ol., 76 , 753-761 (1985); Immunol., 46 , 679-687.
(1982); Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 81, 214
~ 223 (1986); J. Allergy Clin. Immunol., 75 , 686 ~
692 (1985), etc.]. However, the fact is that an effective and safe antigen for treating desensitization has not been obtained yet.
【０００４】ダニアレルゲンの遺伝子クローニングとし
ては、ヤケヒョウヒダニの主要アレルゲンであるDer p
I (分子量：25,371) 及びDer p II (分子量：14,131)
について、また、コナヒョウヒダニの主要アレルゲンで
あるDer f I ( 分子量：25,191) 及びDer f II（分子
量：14,021）についても、それぞれの遺伝子がクローニ
ングされ塩基配列も決定されており〔Int. Arch. Aller
gy Appl. Immunol., 85,127〜129 (1988); J. Exp. Me
d., 167, 175 〜182 (1988); J. Exp. Med., 170, 145
7 〜1462 (1989); Int. Arch. Allergy Appl. Immuno
l., 91, 118 〜123(1990); Int. Arch. Allergy Appl.
Immunol., 91, 124〜129 (1990); Jpn. J.Allergol., 3
9, 557〜561 (1990); Clinical and Experimental Alle
rgy, 21, 25 〜32 (1991); Clinical and Experimental
Allergy, 21, 33 〜37 (1991) 〕、遺伝子組換え技術
によるダニアレルゲンの研究が試みられている。しかし
ながら、未だ感作抗原として使用し得るものは得られて
いない。As for the gene cloning of the mite allergen, Der p, which is the major allergen of Dermatophagoides farinae
I (Molecular weight: 25,371) and Der p II (Molecular weight: 14,131)
, And also for Der f I (molecular weight: 25,191) and Der f II (molecular weight: 14,021), which are the major allergens of Dermatophagoides farinae, the respective genes have been cloned and the nucleotide sequences have been determined [Int. Arch. Aller
gy Appl. Immunol., 85, 127-129 (1988); J. Exp. Me
d., 167 , 175-182 (1988); J. Exp. Med., 170, 145
7 ~ 1462 (1989); Int. Arch. Allergy Appl. Immuno
l., 91 , 118 〜 123 (1990); Int. Arch. Allergy Appl.
Immunol., 91, 124-129 (1990); Jpn. J. Allergol., 3
9, 557 ~ 561 (1990); Clinical and Experimental Alle
rgy, 21, 25 ~ 32 (1991); Clinical and Experimental
Allergy, 21, 33-37 (1991)], studies of mite allergens by genetic recombination techniques have been attempted. However, what has been used as a sensitizing antigen has not been obtained yet.
【０００５】一方、ダニアレルギー疾患の診断方法とし
ては、従来、問診を主体とし、屋内塵（ハウスダスト）
抽出物および／またはダニ虫体抽出物を用いる皮内反応
試験が殆どであり、まれに、RAST(radio allergosorbe
nt test)法による血清中のIgE 抗体価（相対値）の測
定、吸入誘発試験、鼻粘膜誘発試験を併用する程度であ
り、ダニアレルギー疾患を直接的に診断するのはかなり
困難であった。On the other hand, as a method for diagnosing a mite allergic disease, conventionally, an inquiry has been mainly made, and indoor dust (house dust) is used.
Most of the skin reaction tests using the extract and / or the mite body extract are rare, and rarely, RAST (radio allergosorbe
It was only to measure IgE antibody titer (relative value) in serum by nt test), inhalation induction test and nasal mucosa induction test, and it was quite difficult to directly diagnose mite allergic disease.
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】従来、屋内塵性ダニを
特異抗原とする気管支喘息の減感作治療法には、屋内塵
（ハウスダスト）抽出液が用いられてきているが、化学
的にはその組成が極めて不明確であり、しかも多種類の
不純物を含み、アナフィラキシー誘発の可能性があるた
めに投与量が極度に制限され、治療効果が極めて低いの
が現状である。したがって、有効性及び安全性の観点か
ら、有用な減感作治療用抗原の出現が望まれると同時に
そのような高品質減感作治療用抗原の安定供給が期待さ
れている。しかしながら、このような安全で確実に奏効
するに充分量のダニアレルゲンを安定供給するには、ダ
ニ飼育物からのダニアレルゲンの抽出、精製による方法
では、量産性がなく量的に限界があるので安定供給は困
難である。Conventionally, house dust extract has been used for the desensitizing treatment of bronchial asthma with indoor dust mites as a specific antigen. Its composition is extremely unclear, and since it contains many kinds of impurities and may induce anaphylaxis, its dose is extremely limited and the therapeutic effect is extremely low. Therefore, from the viewpoint of efficacy and safety, the emergence of a useful therapeutic antigen for desensitization is desired, and at the same time, a stable supply of such a high-quality therapeutic antigen for desensitization is expected. However, in order to stably supply a sufficient amount of mite allergen for such a safe and reliable response, the method of extracting and purifying mite allergen from a mite breeding product has no mass-producibility and there is a quantitative limit. A stable supply is difficult.
【０００７】本発明の目的は、まさにこの点にあり、ダ
ニアレルギー疾患の治療剤、診断薬としてアナフィラキ
シー誘発性不純物を含まない安全かつ有効な組換えダニ
アレルゲンを提供することにある。即ち、本発明の第１
の目的は、ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られ
るアレルゲン活性を有する新規なダニアレルゲンを提供
することにある。本発明の第２の目的は、該ダニアレル
ゲンをコードする遺伝子を提供することにある。本発明
の第３の目的は、本発明の遺伝子を発現させ得る発現ベ
クターを提供することにある。本発明の第４の目的は、
該遺伝子を発現させ得る発現ベクターで形質転換された
形質転換体を提供することにある。本発明の第５の目的
は、該組換えダニアレルゲンの製造方法を提供すること
にある。本発明の第６の目的は、本発明の組換えダニア
レルゲンを有効成分とする新規なダニアレルギー疾患治
療剤を提供することにある。本発明の第７の目的は、本
発明の組換えダニアレルゲンを有効成分とする新規なダ
ニアレルギー疾患診断薬を提供することにある。[0007] The object of the present invention lies in this point, and it is to provide a safe and effective recombinant mite allergen containing no anaphylaxis-inducing impurities as a therapeutic agent or diagnostic agent for mite allergic diseases. That is, the first aspect of the present invention
The purpose of is to provide a novel mite allergen having allergen activity obtained by expression of a gene derived from a mite body. The second object of the present invention is to provide a gene encoding the mite allergen. A third object of the present invention is to provide an expression vector capable of expressing the gene of the present invention. A fourth object of the present invention is to
It is to provide a transformant transformed with an expression vector capable of expressing the gene. A fifth object of the present invention is to provide a method for producing the recombinant mite allergen. A sixth object of the present invention is to provide a novel therapeutic agent for mite allergic diseases, which comprises the recombinant mite allergen of the present invention as an active ingredient. A seventh object of the present invention is to provide a novel diagnostic agent for mite allergic diseases, which comprises the recombinant mite allergen of the present invention as an active ingredient.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ダニ虫体から
強いアレルゲン活性を示すダニアレルゲンおよびそれを
コードする遺伝子を見出し、更に研究を重ねて本発明を
完成した。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found a mite allergen showing a strong allergen activity from a mite body and a gene encoding the mite allergen. The present invention has been completed through repeated research.
【０００９】即ち、本発明の要旨は、（１） ダニ虫体
由来の遺伝子の発現によって得られる、以下のアミノ酸
配列（配列番号：１）を含んでいる組換えダニアレルゲ
ン、 Asp Ala Ala Arg Thr Thr Ser Gln Ser Pro Thr Ala Ile Ile Asn Asp Pro Asp Met Asp Ile Lys Ser Ile Asp Ser Leu Glu Glu Ser Asp Gln Pro Thr Leu Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ala Thr Gly Ser Asn Gly Ser Asp Asp Phe Asp Asp Gln Leu Val Lys Ile Asp Ser Ser Ala Ala Gly Ser Ser Leu Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Thr Thr Thr Thr Pro Ile Arg Ser Ser Asn Val Asn Val Asn Asn Asn Asn Asn Leu Ser Asp Glu Gln Leu Ser Ser Leu Glu Met Ile Asp Asp Asp Asn Asn Phe Thr Thr Phe Asn Asn Asp Lys Gln Gln Gln Pro Lys Gln （２） 前記（１）記載の遺伝子がコナヒョウヒダニ虫
体由来の遺伝子である前記（１）記載の組換えダニアレ
ルゲン、（３） 分子量が約１５０００(SDS-PAGE)であ
る前記（１）又は（２）記載の組換えダニアレルゲン、
（４） 全塩基鎖長が約０．５ kbp（アガロース電気泳
動法）であって、図３の制限酵素地図を有する遺伝子の
発現によって得られるものである前記（１）〜（３）の
いずれかに記載の組換えダニアレルゲン、（５） 前記
（１）〜（４）のいずれかに記載の組換えダニアレルゲ
ンが他の蛋白質と融合していることを特徴とする融合組
換えダニアレルゲン、（６） 該他の蛋白質がグルタチ
オンＳ−トランスフェラーゼである前記（５）記載の融
合組換えダニアレルゲン、（７） 分子中に以下のアミ
ノ酸配列（配列番号：１）を含みかつアレルゲン活性を
有する蛋白質をコードしているダニ虫体由来の遺伝子、 Asp Ala Ala Arg Thr Thr Ser Gln Ser Pro Thr Ala Ile Ile Asn Asp Pro Asp Met Asp Ile Lys Ser Ile Asp Ser Leu Glu Glu Ser Asp Gln Pro Thr Leu Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ala Thr Gly Ser Asn Gly Ser Asp Asp Phe Asp Asp Gln Leu Val Lys Ile Asp Ser Ser Ala Ala Gly Ser Ser Leu Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Thr Thr Thr Thr Pro Ile Arg Ser Ser Asn Val Asn Val Asn Asn Asn Asn Asn Leu Ser Asp Glu Gln Leu Ser Ser Leu Glu Met Ile Asp Asp Asp Asn Asn Phe Thr Thr Phe Asn Asn Asp Lys Gln Gln Gln Pro Lys Gln （８） 以下のＤＮＡ配列（配列番号：１）を含むもの
である前記（７）記載のダニ虫体由来の遺伝子、 GAT GCT GCA CGT ACA ACA TCA CAA TCA CCA ACA GCA ATA ATC AAC GAT CCA GAT ATG GAT ATT AAG TCC ATT GAT TCA TTA GAA GAA AGT GAT CAG CCA ACT TTA GGC GGT AGT GGT GCT GGT GGT GGA TCT AGT TCG GCC ACC GGT TCC AAT GGA AGT GAT GAT TTT GAT GAT CAA TTG GTT AAA ATT GAT AGT AGC GCT GCT GGA TCG TCT CTT TCA TCT TCA AAC AAC AAT AAT ACA ACC ACC ACT CCA ATT AGA TCG TCG AAT GTG AAT GTT AAT AAC AAT AAT AAT TTA AGT GAT GAA CAA TTA AGC TCA TTA GAG ATG ATT GAT GAT GAT AAT AAT TTC ACT ACA TTC AAC AAT GAT AAA CAA CAA CAA CCC AAA CAG （９） 形質転換された細菌、酵母又は哺乳動物細胞中
において、前記（７）又は（８）記載の遺伝子を発現さ
せ得る発現ベクター、（１０） 前記（９）記載の発現
ベクターで形質転換された細菌、酵母又は哺乳動物細
胞、（１１） 前記（１０）記載の細菌、酵母又は哺乳
動物細胞を該遺伝子の発現可能な条件下で培養して、組
換えダニアレルゲンを産生させ、次いで該組換えダニア
レルゲンを回収することを特徴とする組換えダニアレル
ゲンの製造方法、（１２） 前記（１０）記載の細菌、
酵母又は哺乳動物細胞を該遺伝子の発現可能な条件下で
培養して、融合組換えダニアレルゲンを産生させ、該融
合組換えダニアレルゲンを回収し、次いで、融合してい
る他の蛋白質を脱離せしめることを特徴とする組換えダ
ニアレルゲンの製造方法、（１３） 前記（１）〜
（４）のいずれか１項に記載の組換えダニアレルゲンを
有効成分とするダニアレルギー疾患治療剤、（１４）
前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の組換えダニ
アレルゲンを有効成分とするダニアレルギー疾患診断
薬、に関する。That is, the gist of the present invention is (1) a recombinant mite allergen, Asp Ala Ala Arg Thr, containing the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) obtained by expression of a gene derived from a mite body: Thr Ser Gln Ser Pro Thr Ala Ile Ile Asn Asp Pro Asp Met Asp Ile Lys Ser Ile Asp Ser Leu Glu Glu Ser Asp Gln Pro Thr Leu Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ala Thr Gly Ser Asn Gly Ser Asp Asp Phe Asp Asp Gln Leu Val Lys Ile Asp Ser Ser Ala Ala Gly Ser Ser Leu Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Thr Thr Thr Thr Pro Pro Ile Arg Ser Ser Asn Val Asn Val Asn Asn Asn Asn Asn Leu Ser Asp Glu Gln Leu Ser Ser Leu Glu Met Ile Asp Asp Asp Asn Asn Phe Thr Thr Phe Asn Asn Asp Lys Gln Gln Gln Pro Lys Gln (2) Recombinant according to (1) above, wherein the gene described in (1) above is a gene derived from Dermatophagoides farinae. Mite allergen, (3) described in (1) or (2) above, which has a molecular weight of about 15,000 (SDS-PAGE) Recombinant mite allergen,
(4) Any of (1) to (3) above, which has a total base chain length of about 0.5 kbp (agarose electrophoresis method) and is obtained by expression of a gene having the restriction map of FIG. (5) A recombinant recombinant mite allergen, characterized in that the recombinant mite allergen according to any one of (1) to (4) above is fused with another protein, (6) The fusion recombinant mite allergen according to the above (5), wherein the other protein is glutathione S-transferase, (7) a protein containing the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) in the molecule and having allergen activity Asp Ala Ala Arg Thr Thr Ser Gln Ser Pro Thr Ala Ile Ile Asn Asp Pro Asp Met Asp Ile Lys Ser Ile Asp Ser Leu Glu Glu Ser Asp Gln Pro Thr Leu Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ala Thr Gly Ser Asn Gly Ser Asp Asp Phe Asp Asp Gln Leu Val Lys Ile Asp Ser Ser Ala Ala Gly Ser Ser Leu Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Thr Thr Thr Thr Pro Ile Arg Ser Ser Asn Val Asn Val Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Ser Asp Glu Gln Leu Ser Ser Leu Glu Met Ile Asp Asp Asp Asn Asn Phe Thr Thr Phe Asn Asn Asp Lys Gln Gln Gln Pron Gs (8) The following DNA sequence (SEQ ID NO: 1) is contained ((SEQ ID NO: 1)). 7) Genes derived from tick body, GAT GCT GCA CGT ACA ACA TCA CAA TCA CCA ACA GCA ATA ATC AAC GAT CCA GAT ATG GAT ATT AAG TCC ATT GAT TCA TTA GAA GAA AGT GAT CAG CCA ACT TTA GGC GGT AGT GGT GCT GGT GGT GGA TCT AGT TCG GCC ACC GGT TCC AAT GGA AGT GAT GAT TTT GAT GAT CAA TTG GTT AAA ATT GAT AGT AGC GCT GCT GGA TCG TCT CTT TCA TCT TCA AAC AAC AAT AAT ACA ACC ACC ACT CCA ATT AGA TCG TCG ACT GTG AAT GTT AAT AAC AAT AAT AAT TTA AGT GAT GAA CAA TTA AGC TCA TTA GAG ATG ATT GAT GAT GAT AAT AAT TTC ACT ACA TTC AAC AAT GAT AAA CAA CAA CAA CCC AAA CAG (9) Transformation An expression vector capable of expressing the gene according to (7) or (8) above in a selected bacterium, yeast or mammalian cell, (10) a bacterium, yeast transformed with the expression vector according to (9), or Mammalian cells, (11) The bacteria, yeasts or mammalian cells according to (10) above are cultured under conditions capable of expressing the gene to produce a recombinant mite allergen, and then the recombinant mite allergen is recovered. (12) The bacterium according to (10) above, which comprises:
Yeast or mammalian cells are cultivated under conditions in which the gene can be expressed to produce a fused recombinant mite allergen, the fused recombinant mite allergen is recovered, and then other fused proteins are eliminated. (13) A method for producing a recombinant mite allergen, characterized by comprising:
(14) A therapeutic agent for a mite allergic disease, which comprises the recombinant mite allergen according to any one of (4) as an active ingredient
A diagnostic agent for a mite allergic disease, which comprises the recombinant mite allergen according to any one of (1) to (4) above as an active ingredient.
【００１０】本発明の組換えダニアレルゲンは、ダニ虫
体由来の遺伝子の発現によって得られるものであり、こ
こで用いられるダニは特に限定されるものではないが、
屋内塵性ダニであるコナヒョウヒダニやヤケヒョウヒダ
ニ等が用いられる。The recombinant mite allergen of the present invention is obtained by expressing a gene derived from a mite body, and the mite used here is not particularly limited,
Indoor dust mites such as Dermatophagoides farinae and Dermatophagoides farinae are used.
【００１１】本発明の組換えダニアレルゲンは、アミノ
酸配列として以下の配列（配列番号：１）を含んでいる
蛋白質であって、アレルゲン活性を有するものである。The recombinant mite allergen of the present invention is a protein containing the following sequence (SEQ ID NO: 1) as an amino acid sequence and has allergen activity.
【００１２】 Asp Ala Ala Arg Thr Thr Ser Gln Ser Pro Thr Ala Ile Ile Asn Asp Pro Asp Met Asp Ile Lys Ser Ile Asp Ser Leu Glu Glu Ser Asp Gln Pro Thr Leu Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ala Thr Gly Ser Asn Gly Ser Asp Asp Phe Asp Asp Gln Leu Val Lys Ile Asp Ser Ser Ala Ala Gly Ser Ser Leu Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Thr Thr Thr Thr Pro Ile Arg Ser Ser Asn Val Asn Val Asn Asn Asn Asn Asn Leu Ser Asp Glu Gln Leu Ser Ser Leu Glu Met Ile Asp Asp Asp Asn Asn Phe Thr Thr Phe Asn Asn Asp Lys Gln Gln Gln Pro Lys Gln Asp Ala Ala Arg Thr Thr Ser Gln Ser Pro Thr Ala Ile Ile Asn Asp Pro Asp Met Asp Ile Lys Ser Ile Asp Ser Leu Glu Glu Ser Asp Gln Pro Thr Leu Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ala Thr Gly Ser Asn Gly Ser Asp Asp Phe Asp Asp Gln Leu Val Lys Ile Asp Ser Ser Ala Ala Gly Ser Ser Leu Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Thr Thr Thr Thr Pro Ile Arg Ser Ser Asn Val Asn Val Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Ser Asp Glu Gln Leu Ser Ser Leu Glu Met Ile Asp Asp Asp Asn Asn Phe Thr Thr Phe Asn Asn Asp Lys Gln Gln Gln Pro Lys Gln
【００１３】また、本発明の組換えダニアレルゲンは、
前記アミノ酸配列のうち１個又は複数のアミノ酸の置
換、欠失、付加又は転位によって種々変異されたもので
あっても、アレルゲン活性を有するものは本発明の組換
えダニアレルゲンに含まれる。このような変異体は、天
然のアレル変異体又は組換えＤＮＡ技術により、例えば
ＤＮＡの特定の部位に突然変異を誘発することにより得
られる。The recombinant mite allergen of the present invention is
Recombinant mite allergens of the present invention include those having various allergen activities even if they are variously mutated by substitution, deletion, addition or transposition of one or more amino acids in the amino acid sequence. Such variants are obtained by natural allelic variants or recombinant DNA technology, for example by mutagenizing specific sites in DNA.
【００１４】本発明の組換えダニアレルゲンには、他の
蛋白質との融合蛋白として発現されたものも含まれる。
本明細書では、他の蛋白質と融合して発現した組換えダ
ニアレルゲンを特に融合組換えダニアレルゲンという場
合がある。ここで、融合する他の蛋白質としては特に限
定されないが、例えば、β−ガラクトシダーゼ、グルタ
チオンＳ−トランスフェラーゼ、プロテインＡ、マルト
ース結合蛋白質等が挙げられる。The recombinant mite allergen of the present invention also includes those expressed as fusion proteins with other proteins.
In the present specification, a recombinant mite allergen expressed by fusing with another protein may be particularly referred to as a fused recombinant mite allergen. Here, other proteins to be fused are not particularly limited, and examples thereof include β-galactosidase, glutathione S-transferase, protein A, maltose binding protein and the like.
【００１５】本発明の組換えダニアレルゲンは、アレル
ゲン活性に必須な領域のみの蛋白質断片であってもよ
く、また、アレルゲン活性に必須なドメインからなるも
のであってもよい。また、ダニアレルゲン蛋白質のみを
発現させて得られたものの他に、融合蛋白質として発現
したものから他の蛋白質を脱離せしめて得られたもので
もよい。The recombinant mite allergen of the present invention may be a protein fragment only in the region essential for the allergen activity, or may be composed of a domain essential for the allergen activity. Further, in addition to those obtained by expressing only the mite allergen protein, those obtained by removing other proteins from those expressed as a fusion protein may be used.
【００１６】要約すれば、本発明の組換えダニアレルゲ
ンは、ダニ虫体由来の遺伝子の発現によって得られ、前
記のアミノ酸配列を実質的に含み、アレルゲン活性を有
する蛋白質である。[0016] In summary, the recombinant mite allergen of the present invention is a protein obtained by the expression of a gene derived from a mite body, which substantially contains the above amino acid sequence and has allergen activity.
【００１７】本発明の組換えダニアレルゲンとして、大
腸菌で発現されたグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ
との融合組換えダニアレルゲンが以下のように例示され
る。即ち、大腸菌で発現された融合組換えダニアレルゲ
ンは、グルタチオン固定化アフィニティクロマトグラフ
ィー及び抗ダニ虫体抗体固定化アフィニティクロマトグ
ラフィーで精製される。得られた組換えダニアレルゲン
として下記のような性質を持つ。As the recombinant mite allergen of the present invention, a fusion mite allergen fused with glutathione S-transferase expressed in Escherichia coli is exemplified as follows. That is, the fused recombinant mite allergen expressed in Escherichia coli is purified by glutathione-immobilized affinity chromatography and anti-mite body antibody-immobilized affinity chromatography. The obtained recombinant mite allergen has the following properties.
【００１８】 色及び性状：白色 水溶性 ：易溶性 分子量 ：約１５０００である。 SDS-PAGEで｛（融合蛋白質の分子量）−（グルタチオン
Ｓ−トランスフェラーゼの分子量）｝で見積もる。 アミノ酸配列（配列番号：１）として次のものを含
む。 Asp Ala Ala Arg Thr Thr Ser Gln Ser Pro Thr Ala Ile Ile Asn Asp Pro Asp Met Asp Ile Lys Ser Ile Asp Ser Leu Glu Glu Ser Asp Gln Pro Thr Leu Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ala Thr Gly Ser Asn Gly Ser Asp Asp Phe Asp Asp Gln Leu Val Lys Ile Asp Ser Ser Ala Ala Gly Ser Ser Leu Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Thr Thr Thr Thr Pro Ile Arg Ser Ser Asn Val Asn Val Asn Asn Asn Asn Asn Leu Ser Asp Glu Gln Leu Ser Ser Leu Glu Met Ile Asp Asp Asp Asn Asn Phe Thr Thr Phe Asn Asn Asp Lys Gln Gln Gln Pro Lys Gln 抗原性を有する。 ダニアレルギー患者プール血清中の特異IgG 、ウサギ抗
ダニ虫体血清、ウサギ抗Der f II血清とのELISA 反応性
及び発現蛋白のSDS-PAGE後、ニトロセルロース膜にブロ
ットし上記抗血清との反応性により判断する。なお、本
発明の組換えダニアレルゲンは、抗Der f II血清との交
差反応性を示す。 アレルゲン活性を有する。 HPLC(High performance liquid chromatography)を用い
たダニアレルギー患者白血球ヒスタミン遊離試験により
判断する。 アナフィラキシー反応を誘導しない。 常法により、融合蛋白質またはダニアレルゲン蛋白質で
モルモットを免疫し、追加免疫時にアナフィラキシー反
応について観察する。Color and properties: White Water solubility: Easy solubility Molecular weight: Approximately 15,000. Estimate by SDS-PAGE {(molecular weight of fusion protein)-(molecular weight of glutathione S-transferase)}. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) includes the following. Asp Ala Ala Arg Thr Thr Ser Gln Ser Pro Thr Ala Ile Ile Asn Asp Pro Asp Met Asp Ile Lys Ser Ile Asp Ser Leu Glu Glu Ser Asp Gln Pro Thr Leu Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ala Thr Gly Ser Asn Gly Ser Asp Asp Phe Asp Asp Gln Leu Val Lys Ile Asp Ser Ser Ala Ala Gly Ser Ser Leu Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Thr Thr Thr Thr Pro Ile Arg Ser Ser Asn Val Asn Val Asn Asn Asn Asn Asn Leu Ser Asp Glu Gln Leu Ser Ser Leu Glu Met Ile Asp Asp Asp Asn Asn Phe Thr Thr Phe Asn Asn Asp Lys Gln Gln Gln Pro Lys Gln Antigenicity. ELISA reactivity with specific IgG in mite allergic patient pool serum, rabbit anti-mite body serum, rabbit anti- Der f II serum and reactivity with the above anti-serum after SDS-PAGE of expressed protein and blotted on nitrocellulose membrane Judge by. The recombinant mite allergen of the present invention shows cross-reactivity with anti- Der f II serum. Has allergen activity. Judgment is carried out by a leukocyte histamine release test of mite allergy patients using HPLC (High performance liquid chromatography). Does not induce an anaphylactic reaction. Guinea pigs are immunized with the fusion protein or mite allergen protein by a conventional method, and the anaphylactic reaction is observed during the booster immunization.
【００１９】本発明のダニ虫体由来の遺伝子は、生ダニ
虫体からｍＲＮＡを調製し、そのｍＲＮＡを鋳型として
常法によりｃＤＮＡを合成することにより得られるが、
分子中に前記のアミノ酸配列を含むアレルゲン活性を有
する蛋白質をコードしているものであり、該アミノ酸配
列をコードしているＤＮＡとしては、具体的には配列番
号：１が例示される。このＤＮＡ配列は、前記のDer p
I 、Der p II、Der fI 及びDer f IIについて報告され
ているものと比較して相同性のないものである。特に、
本発明のダニ虫体由来の遺伝子は、抗Der f II血清と強
い交差反応性を有するにもかかわらず全く別の遺伝子で
あることが明らかである。The mite body-derived gene of the present invention can be obtained by preparing mRNA from a live mite body and synthesizing cDNA by a conventional method using the mRNA as a template.
It encodes a protein having the above-mentioned amino acid sequence and having an allergen activity in the molecule, and specific examples of the DNA encoding the amino acid sequence include SEQ ID NO: 1. This DNA sequence, wherein the Der p
There is no homology compared to those reported for I, Der p II, Der f I and Der f II. In particular,
It is clear that the mite-derived gene of the present invention is a completely different gene despite having strong cross-reactivity with anti- Der f II serum.
【００２０】本発明のダニ虫体由来の遺伝子は、ｃＤＮ
Ａの全塩基鎖長が約０．５ kbp（アガロース電気泳動
法) であるが、実際の発現では、その前の停止コドンで
終了するので、翻訳される塩基鎖長は、停止コドンを除
いて３８４bpであり、図３に示す制限酵素地図を有する
ものである。The mite body-derived gene of the present invention is cDNA
The total base chain length of A is about 0.5 kbp (agarose electrophoresis), but in actual expression, it ends at the stop codon in front of it, so the translated base chain length is excluding the stop codon. It is 384 bp and has the restriction enzyme map shown in FIG.
【００２１】本発明の発現ベクターは、形質転換された
細菌、酵母又は哺乳動物細胞中において、前記の本発明
の遺伝子を発現させ得るように結合している発現ベクタ
ーである。発現ベクターの構築に用いられるベクターＤ
ＮＡは、特に制限されず、広く普及した入手の容易なも
のが用いられる。例えば、ｐＵＣ18、ｐＴＶ118 Ｎ (宝
酒造社製）、ｐＵＥＸ２（Amersham社製）、ｐＧＥＸ−
２Ｔ、ｐＫＫ233-2(Pharmacia 社製）、ｐＭＡＭ−ｎｅ
ｏ（Clontech社製）等が挙げられる。The expression vector of the present invention is an expression vector ligated so that the gene of the present invention can be expressed in transformed bacteria, yeast or mammalian cells. Vector D used for construction of expression vector
The NA is not particularly limited, and one widely used and easily available is used. For example, pUC18, pTV118 N (manufactured by Takara Shuzo), pUEX2 (manufactured by Amersham), pGEX-
2T, pKK233-2 (Pharmacia), pMAM-ne
o (manufactured by Clontech) and the like.
【００２２】本発明の発現ベクターの構築方法は、特に
限定されるものではなく常法により行なうことができ
る。例えば、図１に示されるようにλｇｔ11ファージに
組み込まれたダニアレルゲンのｃＤＮＡを、Kpn I とSa
c I で消化し、プラスミドｐＵＣ18のKpn I とSac I 部
位に連結して得られたｐＴＣをNot I て消化した後、Kl
enow断片で平滑化し、プラスミドベクターｐＧＥＸ−２
Ｔ（Pharmacia 社製）のSma I 部位に連結して発現ベク
ターｐＴＥＸ１２４を得ることができる。The method for constructing the expression vector of the present invention is not particularly limited and can be carried out by a conventional method. For example, as shown in FIG. 1, the mite allergen cDNA integrated in λgt11 phage was cloned into Kpn I and Sa.
Digested with cI and ligated into the KpnI and SacI sites of plasmid pUC18, the resulting pTC was digested with NotI and then Kl
blunted with the enow fragment and plasmid vector pGEX-2
The expression vector pTEX124 can be obtained by ligating to the Sma I site of T (Pharmacia).
【００２３】本発明の発現ベクターで形質転換された細
菌、酵母又は哺乳動物細胞は、本発明の遺伝子を発現し
得るものであれば特に制限されないが、例えば、細菌と
しては大腸菌、枯草菌等が、酵母としてはサッカロマイ
セス・セレビィシエ等が、哺乳動物細胞としては、チャ
イニーズ・ハムスター・卵巣（ＣＨＯ）細胞、サルＣＯ
Ｓ細胞、マウス・フィブロプラスト等が挙げられる。The bacterium, yeast or mammalian cell transformed with the expression vector of the present invention is not particularly limited as long as it can express the gene of the present invention. Examples of bacteria include Escherichia coli and Bacillus subtilis. As yeast, Saccharomyces cerevisiae, etc., as mammalian cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, monkey CO
Examples include S cells and mouse fibroplast.
【００２４】本発明の組換えダニアレルゲンの製造方法
は、本発明の遺伝子を発現させ得る発現ベクターで形質
転換された細菌、酵母又は哺乳動物細胞を該遺伝子の発
現可能な条件下で培養して、組換えダニアレルゲンを産
生させ、次いで該組換えダニアレルゲンを回収すること
による。The method for producing the recombinant mite allergen of the present invention comprises the steps of culturing bacteria, yeast or mammalian cells transformed with an expression vector capable of expressing the gene of the present invention under conditions capable of expressing the gene. , Producing a recombinant mite allergen and then recovering the recombinant mite allergen.
【００２５】ダニ虫体から本発明の組換えダニアレルゲ
ンをコードしているｃＤＮＡを取得するには、後述の実
施例において詳述するように、全ＲＮＡ画分からpoly
(A)mＲＮＡ画分を回収し、市販のｃＤＮＡ合成キット等
を用いてｃＤＮＡを合成することができる。In order to obtain the cDNA encoding the recombinant mite allergen of the present invention from the mite body, as described in detail in the Examples below, the poly from the total RNA fraction is obtained.
(A) The mRNA fraction can be collected and cDNA can be synthesized using a commercially available cDNA synthesis kit or the like.
【００２６】また、ダニアレルゲンのｃＤＮＡが挿入さ
れた融合蛋白発現プラスミドを含有する大腸菌形質転換
株を用いての組換えダニアレルゲンの製造方法として、
次のような方法が例示される。まず、ダニアレルゲンの
ｃＤＮＡが挿入されたグルタチオンＳ−トランスフェラ
ーゼとの融合蛋白発現プラスミドを含有する大腸菌形質
転換株を常法により振盪培養し対数増殖させ、この対数
増殖期を維持させながらβ−ガラクトシダーゼ・インデ
ューサー添加で融合蛋白質を誘導合成させる。宿主細胞
として用いられる大腸菌としては、例えばE. coli JM10
5 （ファルマシア社製）が用いられ、発現ベクターで形
質転換された株をE. coli JM 105−OL124 と命名（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１４２５３）する。Further, as a method for producing a recombinant mite allergen using an Escherichia coli transformant containing a fusion protein expression plasmid having the mite allergen cDNA inserted,
The following method is exemplified. First, an Escherichia coli transformant containing a fusion protein expression plasmid with a glutathione S-transferase in which a mite allergen cDNA has been inserted is shake-cultured by a conventional method to grow logarithmically, and β-galactosidase. A fusion protein is induced and synthesized by adding an inducer. Examples of E. coli used as a host cell include E. coli JM10.
5 (manufactured by Pharmacia) was used, and the strain transformed with the expression vector was named E. coli JM 105-OL124 (FE
RM P-14253).
【００２７】培養終了後、集菌した菌体は、セリン・シ
ステイン・アスパラギン酸・金属プロテアーゼインヒビ
ターを含む緩衝液に懸濁して超音波処理で破壊される。
細胞デブリスにある膜局在性の蛋白をフェニルメタンス
ルフォニル・フルオリド、モノヨード酢酸、ペプスタチ
ンＡ、エチレンジアミン四酢酸等の蛋白分解酵素阻害剤
及びラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリトンＸ−
100 、ノニデットＰ40等の界面活性剤を含む緩衝液で抽
出する。その抽出液から、又は培養濃縮液から得られた
ダニアレルゲン・グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ
融合蛋白質を、例えばグルタチオン固定化アフィニティ
クロマトグラフィー及び抗ダニ虫体抗体固定化アフィニ
ティクロマトグラフィー等で精製する。なお、グルタチ
オン固定化担体は、Pharmacia 社製のものである。ま
た、抗ダニ虫体抗体固定化担体は、活性化されたトレシ
ル担体（例えば、トレシルＧＭゲル（栗田工業社製）、
トレシルトヨパール（東ソー社製）、トレシルセファロ
ース（Pharmacia 社製）等が用いられる）にウサギ抗ダ
ニ虫体抗体を共有結合させたものである。After the completion of the culture, the collected bacterial cells are suspended in a buffer solution containing serine / cysteine / aspartic acid / metalloprotease inhibitor and disrupted by ultrasonication.
Membrane-localized proteins in cell debris were identified as proteolytic enzyme inhibitors such as phenylmethanesulfonyl fluoride, monoiodoacetic acid, pepstatin A, ethylenediaminetetraacetic acid, sodium lauryl sulfate (SDS), and Triton X-.
Extract with a buffer containing a surfactant such as 100 and Nonidet P40. The mite allergen / glutathione S-transferase fusion protein obtained from the extract or from the culture concentrate is purified by, for example, glutathione-immobilized affinity chromatography and anti-mite body antibody-immobilized affinity chromatography. The glutathione-immobilized carrier is manufactured by Pharmacia. Further, the carrier for immobilizing anti-mite body antibody is an activated tresyl carrier (for example, tresyl GM gel (manufactured by Kurita Water Industries Ltd.),
A rabbit anti-mite body antibody is covalently bound to Tresyl Toyopearl (manufactured by Tosoh Corporation) and Tresyl Sepharose (manufactured by Pharmacia).
【００２８】精製された組換えダニアレルゲン融合蛋白
質は、プロテアーゼで消化し、ELISA 及びダニアレルギ
ー疾患患者白血球ヒスタミン遊離試験（アレルギー, 3
7, 725(1988) ）でモニター下に、例えばゲル濾過クロ
マトグラフィー、限外濾過、イオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水クロマト
グラフィー、クロマトフォカシング、焦点電気泳動法、
ゲル電気泳動法等の公知の精製法を単独又は組み合わせ
て分画する。The purified recombinant mite allergen fusion protein was digested with protease and subjected to ELISA and leukocyte histamine release test for patients with mite allergic disease (allergy, 3
7 , 725 (1988)), for example, gel filtration chromatography, ultrafiltration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, chromatofocusing, focus electrophoresis,
Fractionation is carried out individually or in combination with known purification methods such as gel electrophoresis.
【００２９】また、本発明の組換えダニアレルゲンの製
造方法は、ダニアレルゲン蛋白質の直接発現に加えて、
ダニアレルゲンが他の蛋白質と介在配列を介して融合し
た融合組換えダニアレルゲンとして発現したものを回収
し、次いで融合している他の蛋白質を脱離せしめること
により組換えダニアレルゲンを製造する方法も包含して
いる。融合させる他の蛋白質としては、例えばβ−ガラ
クトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラー
ゼ、プロテインＡ、マルトース結合蛋白質等、一般的に
融合蛋白とすることが知られているものが用いられる。In addition to the direct expression of the mite allergen protein, the method for producing the recombinant mite allergen of the present invention comprises:
A method of producing a recombinant mite allergen by recovering a fused recombinant mite allergen in which the mite allergen is fused with another protein via an intervening sequence and recovering the other fused protein Inclusive. As the other protein to be fused, for example, β-galactosidase, glutathione-S-transferase, protein A, maltose binding protein and the like which are generally known to be fused proteins are used.
【００３０】他の蛋白質を脱離せしめる方法も公知の方
法が用いられるが、例えば他の蛋白質がβ−ガラクトシ
ダーゼで、ダニアレルゲン蛋白質との間にコラーゲンや
フィブリノーゲン蛋白質の一部が介在している場合に
は、コラゲナーゼやトロンビンが用いられ、前記の方法
を単独または組み合わせることによって、ダニアレルゲ
ン蛋白質を精製する。また、他の蛋白質がグルタチオン
Ｓ−トランスフェラーゼの場合も同様に精製することが
できる。Known methods can also be used to release other proteins. For example, when the other protein is β-galactosidase and a part of collagen or fibrinogen protein intervenes with the mite allergen protein. Collagenase or thrombin is used as the enzyme, and the mite allergen protein is purified by the above methods alone or in combination. Further, when the other protein is glutathione S-transferase, it can be similarly purified.
【００３１】本発明のダニアレルギー疾患治療剤は前記
の精製された組換えダニアレルゲンを有効成分とするも
のであり、各種のダニアレルギー疾患の治療剤として用
いられる。ここでダニアレルギー疾患とは、アトピー性
気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、
アトピー性皮膚炎等、ダニの特異抗原が原因となるあら
ゆるアレルギー疾患をいう。The therapeutic agent for mite allergic disease of the present invention contains the purified recombinant mite allergen as an active ingredient and is used as a therapeutic agent for various mite allergic diseases. Here, mite allergic disease means atopic bronchial asthma, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis,
It refers to allergic diseases such as atopic dermatitis caused by a mite specific antigen.
【００３２】本発明のダニアレルギー疾患治療剤の調製
方法は、特に制限はないが、例えば、前記の方法により
精製された組換えダニアレルゲンを乾燥して粉末状で採
取し、ダニアレルギー疾患に対する減感作治療剤として
用いられる。本発明のダニアレルギー疾患治療剤は、減
感作治療剤として用いられる場合、そのままで、または
必要に応じて一般的に用いられるアジュバントや各種の
添加剤、例えば安定剤、賦形剤、溶解補助剤、乳濁化
剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、着色剤等を常法により
添加した配合剤として用いることができる。例えば、粉
末状の精製された組換えダニアレルゲンをフェノールを
添加した生理食塩水に溶解し、減感作治療用抗原の原液
として用いる。The method for preparing the therapeutic agent for mite allergic diseases of the present invention is not particularly limited. For example, the recombinant mite allergen purified by the above method is dried and collected in powder form to reduce the mite allergic disease. Used as a sensitizing agent. When the therapeutic agent for mite allergic disease of the present invention is used as a therapeutic agent for hyposensitization, the adjuvant or various additives generally used as they are or as necessary, for example, a stabilizer, an excipient, a solubilizing aid. It can be used as a compounding agent to which an agent, an emulsifying agent, a buffering agent, a soothing agent, a preservative, a coloring agent and the like are added by a conventional method. For example, powdered purified recombinant mite allergen is dissolved in physiological saline containing phenol and used as a stock solution of antigen for treating hyposensitization.
【００３３】本発明のダニアレルギー疾患治療剤は、通
常の投与経路例えば経皮、経口、皮内、皮下、筋肉内、
腹腔内等の投与方法により行なうことができる。更に、
例えば、トローチ、舌下錠、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パ
ップ剤、クリーム剤、ローション剤等の経皮、経粘膜薬
としても使用することができる。また、本発明のダニア
レルギー疾患治療剤の投与量及び投与回数は、投与経
路、症状などに応じて成人１回あたり約20μｇ以下の範
囲となるように適宜選択し、毎週１回程度投与される。The therapeutic agent for mite allergic disease of the present invention can be administered by a usual administration route such as transdermal, oral, intradermal, subcutaneous, intramuscular,
It can be performed by an administration method such as intraperitoneal administration. Furthermore,
For example, it can be used as a transdermal or transmucosal drug such as troches, sublingual tablets, eye drops, nasal sprays, poultices, creams, lotions and the like. Further, the dose and frequency of administration of the therapeutic agent for mite allergic disease of the present invention are appropriately selected so as to be in the range of about 20 μg or less per adult according to the administration route, symptoms, etc., and administered once a week. .
【００３４】また、本発明のダニアレルギー疾患治療剤
は、ダニアレルギー疾患に対する治療剤のみならず予防
剤としても有用である。また、アナフィラキシー誘発作
用もなく、人体に対して安全に用いることができる。Further, the therapeutic agent for mite allergic disease of the present invention is useful as a preventive agent as well as a therapeutic agent for mite allergic disease. Further, it has no anaphylaxis-inducing action and can be safely used for the human body.
【００３５】本発明のダニアレルギー疾患診断薬は、ダ
ニアレルギー疾患に対する皮内反応診断試薬及びダニア
レルギー診断用滴定試薬として用いられる。皮内反応診
断試薬として用いる場合は、前記の方法により精製され
た組換えダニアレルゲンを常法により調製して得るが、
例えば組換えダニアレルゲンを乾燥して粉末状とし、こ
れをフェノールを含む生理食塩水で溶解し、希釈して用
いる。皮内反応診断試薬として用いる方法は、常法に従
って用いられる。The diagnostic agent for mite allergic disease of the present invention is used as a reagent for diagnosing intracutaneous reaction against mite allergic disease and a titration reagent for diagnosing mite allergy. When used as an intradermal reaction diagnostic reagent, a recombinant mite allergen purified by the above method is prepared by a conventional method,
For example, the recombinant mite allergen is dried to give a powder, which is dissolved in a physiological saline solution containing phenol and diluted before use. The method used as an intradermal reaction diagnostic reagent is used according to a conventional method.
【００３６】また、ダニアレルギー診断用滴定試薬とし
て用いる場合も同様に常法により調製されるが、例え
ば、組換えダニアレルゲンをハンクス緩衝液で適当に溶
解し、希釈してヒスタミン遊離滴定用試薬として用い
る。この方法は通常、以下の操作手順によりなされる。
即ち、ダニアレルギー疾患患者の血液及びこの血液から
遠心分離により得られた血球画分を緩衝液に懸濁した血
球浮遊液の一定量を、組換えダニアレルゲンを滴定試薬
として用いて滴定し、アレルゲン刺激により好塩基球
（白血球の一種）から遊離するヒスタミン量をHPLCを用
いて測定する〔アレルギー，37, 725(1988) 〕。Similarly, when used as a titration reagent for diagnosing tick allergy, it is similarly prepared by a conventional method. For example, a recombinant mite allergen is appropriately dissolved in Hanks buffer and diluted to give a histamine-free titration reagent. To use. This method is usually performed by the following operating procedure.
That is, a fixed amount of a blood cell suspension obtained by suspending the blood of a tick allergic disease patient and the blood cell fraction obtained by centrifugation from this blood in a buffer solution was titrated using a recombinant mite allergen as a titration reagent, and the allergen The amount of histamine released from basophils (a type of white blood cell) upon stimulation is measured using HPLC [Allergy, 37 , 725 (1988)].
【００３７】このヒスタミン遊離滴定では、最大遊離量
の50％量（滴定曲線の変曲点）から遊離されるヒスタミ
ン量を求める。この滴定では、（１）血球浮遊液の滴定
値から患者のアレルゲン感受性を直接測定することにな
る。（２）血漿と組換えダニアレルゲンとを予め反応さ
せた後、その液で血球浮遊液を滴定して得られる値（血
液滴定曲線値）は、通常、組換えダニアレルゲンで血球
浮遊液を滴定して得られる値（血球浮遊液滴定曲線値）
より高い値が得られる。これは、血漿中にアレルゲン中
和能を持つIgG 抗体（遮断抗体）が存在するためであ
る。従って、対血液滴定曲線の、対血球浮遊液滴定曲線
からのシフトの大きさから、遮断抗体価が得られる。ア
レルゲン感受性とこの遮断抗体価から、ダニアレルギー
の正確な診断が可能となる。また、このヒスタミン遊離
滴定試験は減感作治療効果のモニターとしても有用であ
る。In this histamine release titration, the amount of histamine released from 50% of the maximum release amount (the inflection point of the titration curve) is determined. In this titration, (1) the allergen sensitivity of the patient is directly measured from the titrated value of the blood cell suspension. (2) The value (blood titration curve value) obtained by preliminarily reacting plasma with recombinant mite allergen and titrating the hemocyte suspension with the solution is usually titrated with recombinant mite allergen. Value obtained by (blood cell floating drop constant curve value)
Higher values are obtained. This is because there is an IgG antibody (blocking antibody) having an allergen neutralizing ability in plasma. Therefore, the blocking antibody titer can be obtained from the magnitude of the shift of the blood titration curve from the blood cell suspension titration curve. Accurate diagnosis of mite allergy is possible based on the allergen sensitivity and this blocking antibody titer. Moreover, this histamine free titration test is also useful as a monitor of the effect of desensitization treatment.
【００３８】[0038]
【実施例】以下に、実施例をあげて本発明を具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。尚、各実施例において使用した試薬はナカライテ
クス、片山工業、和光純薬などから購入した市販のもの
を使用した。また、制限酵素などの遺伝子工学用試薬は
宝酒造などから購入したものを使用した。また、ウサギ
抗Der f II血清は、国立相模原病院の安枝浩博士から恵
与された。EXAMPLES The present invention will be described in detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. The reagents used in each example were commercially available reagents purchased from Nacalai Techs, Katayama Kogyo, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. The genetic engineering reagents such as restriction enzymes used were those purchased from Takara Shuzo. In addition, rabbit anti- Der f II serum was a gift from Dr. Hiroshi Yasuda at the National Sagamihara Hospital.
【００３９】実施例１ ダニ全ＲＮＡの抽出とダニアレルゲンPoly(A)mＲＮＡの
分離：常法によりコナヒョウヒダニを培養増殖させて得
られる生ダニ虫体６g を200ｍｌの5.5 Ｍイソチアン酸
グアニジン (片山化学社製) 液中で石英砂10ｇとともに
乳鉢中ですりつぶし遠心分離(9000rpm、 10分間、４℃）
し、その上清を、18Ｇの注射針をつけた50ｍｌ容のシリ
ンジで吸入、射出を繰り返すことにより、ＤＮＡを部分
切断した。再度遠心分離した上清を、17ｍｌのトリフル
オロ酢酸セシウム溶液 (片山化学社製) に対して16ｍｌ
の割合で重層し、85,000×ｇで24時間 (15℃, HITACHI
SCP55H swing PRS-27-2)密度勾配遠心分離を行い、管底
にペレットを形成する全ＲＮＡ画分を回収した。次に、
Fast Track mRNA isolation kit(Invitrogen社製）を用
いて、得られた全ＲＮＡ画分からpoly(A)mＲＮＡ画分を
回収した。濃度既知のＲＮＡ溶液希釈系列とともにスポ
ットテストを行なって収量を測定したところ、約２０μ
ｇであった。Example 1 Extraction of mite total RNA and isolation of mite allergen Poly (A) mRNA: 6 g of live mite body obtained by culturing and propagating Dermatophagoides farinae by 200 ml of 5.5 M guanidine isothiocyanate (Katayama Chemical Co., Ltd.) (Made) Grind with 10 g of quartz sand in a mortar and centrifuge (9000 rpm, 10 minutes, 4 ° C)
Then, the supernatant was inhaled with a 50 ml syringe equipped with an 18 G injection needle and the injection was repeated to partially cut the DNA. The supernatant obtained by centrifugation again was added to 16 ml of 17 ml cesium trifluoroacetate solution (Katayama Chemical Co., Ltd.).
At 85,000 × g for 24 hours (15 ℃, HITACHI
SCP55H swing PRS-27-2) Density gradient centrifugation was performed to collect the total RNA fraction that forms a pellet at the bottom of the tube. next,
Using a Fast Track mRNA isolation kit (manufactured by Invitrogen), poly (A) mRNA fraction was recovered from the obtained total RNA fraction. When the yield was measured by performing a spot test with an RNA solution dilution series of known concentration, it was about 20μ.
It was g.
【００４０】実施例２ ダニアレルゲンｃＤＮＡの合成：次に、このpoly(A)mＲ
ＮＡのうち５μｇを鋳型とし、ｃＤＮＡ合成キット（Ph
armacia 社製) を用いてそのマニュアルに従ってｃＤＮ
Ａを合成し、その両端にNot I 部位を含んだ１３mer の
EcoRI リンカーを接続した。Example 2 Synthesis of mite allergen cDNA: This poly (A) mR
Using 5 μg of NA as a template, cDNA synthesis kit (Ph
(made by armacia) according to its manual
A of 13mer containing Not I sites at both ends
An EcoRI linker was connected.
【００４１】実施例３ ダニアレルゲンｃＤＮＡライブラリーの作製：このｃＤ
ＮＡのうちの１／１０量を、１μｇのEcoRI 消化λgtll
(StratageneCloning System 社製）と混合し、これを
エタノールで濃縮した後２００ unitsのT4 ＤＮＡ lig
ase を加えて12℃で15時間反応させることにより、ｃＤ
ＮＡをλgtllのEcoRI 部位に挿入した。この反応液か
ら、in vitroパッケージングキット (Gigapack PLUS, S
tratagene Cloning System社製) を用いてそのマニュア
ルにしたがって、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。こ
のライブラリー作製操作を７度行い、最終的に６．６μ
ｇのpoly(A)mＲＮＡから合計１３６，０００ pfu(plaqu
e forming unit) のｃＤＮＡライブラリーを得た。Example 3 Construction of mite allergen cDNA library: This cD
1/10 amount of NA was 1 μg of EcoRI digested λgtll
(Stratagene Cloning System) and mixed with ethanol, then 200 units of T4 DNA lig
By adding ase and reacting at 12 ℃ for 15 hours, cD
NA was inserted into the EcoRI site of λgtll. From this reaction mixture, use the in vitro packaging kit (Gigapack PLUS, S
A cDNA library was prepared by using tratagene Cloning System) according to the manual. This library preparation operation was performed 7 times, and finally 6.6μ
133,000 pfu (plaqu) from g of poly (A) mRNA
A cDNA library of e forming unit) was obtained.
【００４２】実施例４ ダニアレルゲンｃＤＮＡのクローニング：実施例３で得
られたｃＤＮＡライブラリーの１０００００個の組換え
体について、ウサギ抗Der f II血清を用いてスクリーニ
ングを行った。本実施例で行った免疫スクリーニングの
詳しいプロトコールを以下に記載する。このｃＤＮＡの
挿入されたλgtllファージを懸濁したSM (１Ｍ Tris-HC
l, pH7.5, 0.1Ｍ NaCl10mM MgSO4, ２％ gelatin)
液と一晩培養したE. coli Y1090 （Stratagene Cloning
System 社）とを37℃で30分間振盪培養することによ
り、宿主にファージを感染させ、これをLB寒天培地 (１
％ Bacto tryptone, 0.5％Bacto yeast extract, 1.5
％ Bacto agar (Difco社製), 0.5％ NaCl ，ｐＨ７．
６）上に、１プレート当り約2,000 個のプラークを形成
するように撒いた。42℃で３時間培養後、予め10mMイソ
プロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（IPTG) を
浸漬させて乾燥したニトロセルロースメンブレン (Hibo
nd−C, Amersham 社製) で培地表面を覆い、さらに37℃
で３時間培養して誘導合成されるβ−ガラクトシダーゼ
融合蛋白を転写した。Example 4 Cloning of mite allergen cDNA: 100,000 recombinants of the cDNA library obtained in Example 3 were screened using rabbit anti- Der f II serum. The detailed protocol of the immunoscreening performed in this example is described below. SM (1M Tris-HC
l, pH7.5, 0.1M NaCl10mM MgSO4 , 2% gelatin)
E. coli Y1090 (Stratagene Cloning
The system was infected with the phage by shaking culture at 37 ° C for 30 minutes with LB agar medium (1).
% Bacto tryptone, 0.5% Bacto yeast extract, 1.5
% Bacto agar (manufactured by Difco), 0.5% NaCl, pH 7.
6) Plated on top to form about 2,000 plaques per plate. After culturing at 42 ° C for 3 hours, 10 mM isopropyl-1-thio-β-D-galactoside (IPTG) was dipped in advance and dried to obtain a nitrocellulose membrane (Hibo).
nd-C, Amersham) and cover the medium surface at 37 ℃.
The β-galactosidase fusion protein, which was inductively synthesized, was transcribed by culturing for 3 hours.
【００４３】このニトロセルロースメンブレンを２％BS
A を含むTBS (10 mM Tris−HCl, pH 8.0, 0.9％ NaC
l) 溶液中で一晩ブロッキングした後、ウサギ抗Der f I
I血清(1000 倍TBS 希釈) 、さらにパーオキシダーゼ結
合ヤギ抗ウサギIgG 抗体 (Cappel社製, 4000倍TBS 希
釈) とそれぞれ１時間ずつ反応させ、発色は0.01％過酸
化水素の存在下、0.6 ｍｇ／ｍｌのジアミノベンジジン
四塩酸塩 0.3％ NiCl2を含むTBS 溶液中で行なった。黒
色を呈したシグナルの位置と合致するプラークをピック
アップしてSMに懸濁し、陽性クローンとして保存した。This nitrocellulose membrane is treated with 2% BS
TBS containing A (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.9% NaC
l) After blocking overnight in solution, rabbit anti- Der f I
I serum (diluted with 1000 times TBS) and peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody (Cappel, 4000 times diluted with TBS) were allowed to react for 1 hour each, and color was developed in the presence of 0.01% hydrogen peroxide at 0.6 mg / It was carried out in a TBS solution containing ml of diaminobenzidine tetrahydrochloride 0.3% NiCl 2 . Plaques that corresponded to the position of the black-colored signal were picked up, suspended in SM, and stored as a positive clone.
【００４４】その結果、一次スクリーニングで５６個の
クローンが陽性を示した。また、二次スクリーニングの
結果、新規ダニアレルゲンをコードすると思われる本発
明の遺伝子（ｍａ１２４クローン）を得た。As a result, 56 clones were positive in the primary screening. As a result of the secondary screening, the gene of the present invention (ma124 clone), which seems to encode a novel mite allergen, was obtained.
【００４５】実施例５ λgtllファージＤＮＡの調製：E.coli Y1090の一晩培養
物２００μｌおよびλgtllファージ溶解液（１０5 〜１
０7 pfu)１００μｌを３７℃で１５分間インキュベート
した。５ｍｌのＬＢ培養液を加えて振盪しながら３７℃
で６〜８時間インキュベートした後、４℃、１２，００
０ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行なった。ＤＮａｓｅ
ＩとＲＮａｓｅＡを最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるよう
に加えて３７℃で３０分間インキュベートした。等量の
２０％ＰＥＧ ６０００／２Ｍ ＮａＣｌを加えて４℃
で一晩冷却した後、４℃、１２，０００ｒｐｍにて１０
分間遠心分離を行なった。Example 5 Preparation of λgtll phage DNA: 200 μl of an overnight culture of E. coli Y1090 and λgtll phage lysate (10 5 -1
100 μl of 0 7 pfu) was incubated at 37 ° C. for 15 minutes. Add 5 ml of LB broth and shake at 37 ℃
After incubating for 6-8 hours at 4 ° C, 12,000
Centrifugation was performed at 0 rpm for 10 minutes. DNase
I and RNase A were added to a final concentration of 1 μg / ml and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Add equal volume of 20% PEG 6000 / 2M NaCl and add 4 ° C.
After cooling overnight at 4 ° C and 12,000 rpm for 10
Centrifuged for minutes.
【００４６】３５０μｌのＴＥ（１０ｍＭ トリス塩酸
バッファー（ｐＨ７．５）および１ｍＭ ＥＤＴＡ含
有）に溶解し、プロティナーゼＫ、ＳＤＳおよびＥＤＴ
Ａを各々の最終濃度が５０μｇ／ｍｌ、０．５％および
１２．５ｍＭとなるように加えて５５℃で１５分間イン
キュベートした後、フェノール／クロロホルム溶液にて
抽出し、エタノールで沈澱させた。次いでＴＥに溶解し
て、λgtllファージＤＮＡ溶液を調製した。Dissolved in 350 μl of TE (containing 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) and 1 mM EDTA), proteinase K, SDS and EDT
A was added so that the final concentration of each was 50 μg / ml, 0.5% and 12.5 mM and incubated at 55 ° C. for 15 minutes, followed by extraction with a phenol / chloroform solution and precipitation with ethanol. Then, it was dissolved in TE to prepare a λgtll phage DNA solution.
【００４７】実施例６ 組換えプラスミドの構築：抗Der f II血清と反応するダ
ニアレルゲン・β−ガラクトシダーゼ融合蛋白をコード
するｃＤＮＡの挿入されたλgtllファージ・クローンか
ら、そのＤＮＡを回収した後Kpn I −Sac I 消化し、そ
の断片（約２．６ｋｂｐ）をプラスミドベクターｐＵＣ
１８（宝酒造社製）のKpn I −Sac I 部位に連結し、Ｈ
ａｎａｈａｎの方法（ＤＮＡクローニング、ｖｏｌ．
１、ｐｐ．１０９−１３６、ＩＲＬＰｒｅｓｓ（１９８
５））に従って、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０５に形質転換し
た（図１）。得られた組換えプラスミドをｐＴＣと名付
けた。Example 6 Construction of Recombinant Plasmids: Kpn I after recovery of its DNA from a λgtll phage clone in which a cDNA encoding a mite allergen β-galactosidase fusion protein reactive with anti- Der f II serum was inserted. -Sac I digested and the fragment (about 2.6 kbp) was added to plasmid vector pUC
18 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) is ligated to the Kpn I-Sac I site, and H
anahan method (DNA cloning, vol.
1, pp. 109-136, IRLPress (198
5)) according to E. E. coli JM105 was transformed (FIG. 1). The obtained recombinant plasmid was named pTC.
【００４８】実施例７ プラスミドＤＮＡの調製：形質転換体の一夜培養物１０
０〜５００μｌを７，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離
を行ない、１００μｌのＳｏｌ．Ｉ（５０ｍＭのグルコ
ース、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ〔ｐＨ８．０〕、１０
ｍＭのＥＤＴＡ）に懸濁し、２００μｌのＳｏｌ．II
（０．２Ｎ ＮａＯＨ，１％ ＳＤＳ）を加え、氷上で
５分間冷却した。次に、１５０μｌの氷冷したＳｏｌ．
III(５ＭのＣＨ3 ＣＯＯＫ，ｐＨ４．８）を加えて氷上
に５分間静置し、１２，０００ｒｐｍにて４℃で１０分
間遠心分離を行なった。その上層をフェノール／クロロ
ホルム溶液で抽出し、エタノールで沈澱させてプラスミ
ドＤＮＡ溶液を得た。Example 7 Preparation of plasmid DNA: overnight culture of transformants 10
0-500 μl was centrifuged at 7,000 rpm for 5 minutes, and 100 μl of Sol. I (50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl [pH 8.0], 10
mM EDTA) and 200 μl of Sol. II
(0.2N NaOH, 1% SDS) was added and cooled on ice for 5 minutes. Next, 150 μl of ice-cold Sol.
III (5 M CH 3 COOK, pH 4.8) was added, the mixture was allowed to stand on ice for 5 minutes, and centrifuged at 12,000 rpm at 4 ° C. for 10 minutes. The upper layer was extracted with a phenol / chloroform solution and precipitated with ethanol to obtain a plasmid DNA solution.
【００４９】実施例８ 高発現ベクターpTEX124 による発現：ダニアレルゲン遺
伝子の転写産物の免疫化学的分析を行うために、ｐＴＣ
からNot I 部位で切り出しKlenowフラグメントで平滑末
端化後、高発現ベクターpGEX-2T のSma I 部位に転写方
向とフレームが合うように連結してpTEX124 を構築し、
E. coli JM105 の形質転換株を取得した（図１）。この
形質転換株を用いて、２８℃での培養し、ＩＰＴＧで誘
導発現後、ＳＤＳ可溶化全菌体をサンプルとした。Example 8 Expression by the high expression vector pTEX124: pTC was used for immunochemical analysis of the transcript of the mite allergen gene.
Was excised at the Not I site and blunted with a Klenow fragment, then ligated to the Sma I site of the high expression vector pGEX-2T so that the transcription direction and the frame would match to construct pTEX124.
A transformant of E. coli JM105 was obtained (Fig. 1). Using this transformant strain, culturing at 28 ° C., inducing expression with IPTG, and using SDS-solubilized whole cells as a sample.
【００５０】実施例９ 発現産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット
による免疫染色：菌体ペレットをＰＢ（ｐＨ７．４）蒸
留水に懸濁したものに、最終濃度６２．５ｍＭのトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％のＳＤＳ、２％の２−メ
ルカプトエタノールを加えて、１００℃にて３分間熱処
理した後、１２．５％アクリルアミドゲルを用いたスラ
ブゲル電気泳動を行なった。ウエスタンブロットは、セ
ミブロッティング装置（ＡＴＴＯ）を用いてＩｍｍｏｂ
ｉｌｏｎ−ＰTM（ミリポア社製）あるいはニトロセルロ
ースフィルター（アドバンテック社製）に転写し、以下
のプロトコールに従い免疫染色した。Example 9 Immunostaining of the expression product by SDS-PAGE and Western blot: A suspension of the bacterial cell pellet in PB (pH 7.4) distilled water was added to a final concentration of 62.5 mM Tris-HCl (pH 6. 8) 2% SDS and 2% 2-mercaptoethanol were added and heat-treated at 100 ° C. for 3 minutes, and then slab gel electrophoresis using 12.5% acrylamide gel was performed. Western blotting was performed by Immob using a semi-blotting apparatus (ATTO).
Ilon-P ™ (manufactured by Millipore) or nitrocellulose filter (manufactured by Advantech) was transferred and immunostained according to the following protocol.
【００５１】ウエスタンブロット法のプロトコール：得
られた転写膜をＴＢＳＴを用いて１０分間３回洗浄した
後、５％脱脂粉乳を含有するＴＢＳＴと共に室温で１時
間以上インキュベートした。これを、E.coliライセート
で前処理した希釈第一抗体と共にインキュベートした
後、ＴＢＳで１０分間、３回洗浄してから希釈第二抗体
とともに１時間インキュベートし、次いでＴＢＳで１０
分間、３回洗浄した。次に、０．６ｍｇ／ｍｌの３，
３’−diaminobenzidine tetrahydrochloride,0.3％のN
iCl2 および０．０１％のＨ2 Ｏ2 を含有するＴＢＳ中
で酵素反応を行ない、黒色のシグナルが得られたものを
回収した。Western blotting protocol: The obtained transfer membrane was washed with TBST three times for 10 minutes, and then incubated with TBST containing 5% skim milk powder at room temperature for 1 hour or more. It was incubated with diluted primary antibody pre-treated with E. coli lysate, washed 3 times for 10 minutes with TBS, then incubated with diluted secondary antibody for 1 hour, then with 10% TBS.
Wash 3 times a minute. Next, 0.6 mg / ml of 3,
3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride, 0.3% N
The enzyme reaction was carried out in TBS containing iCl 2 and 0.01% H 2 O 2, and a black signal was recovered.
【００５２】実施例１０ 抗Der f II血清による発現の確認：得られたｍａ１２４
クローンについて、前記と同様にして発現させ、SDS-PA
GEにかけた後、抗ダニ虫体血清および抗Der f II血清を
用いたWestern blotによる免疫染色を行った結果、抗原
性を保持した融合タンパクであることが確認された（図
２）。Example 10 Confirmation of expression by anti- Der f II serum: obtained ma124
The clone was expressed in the same manner as described above, and SDS-PA
After being subjected to GE, immunostaining by Western blot using anti-mite body serum and anti- Der f II serum confirmed that the fusion protein retained antigenicity (FIG. 2).
【００５３】実施例１１ ダニアレルゲン遺伝子（ｍａ１２４クローン）の制限酵
素地図の作製：ｍａ１２４クローンについて、そのcDNA
をpGEX-2T に挿入された状態でプラスミド DNAを調製し
（pTEX124)、種々の制限酵素で消化した。これをアガロ
ースゲル電気泳動にかけた結果を分析したところ、ｍａ
１２４クローンの制限酵素地図は図３に示したものであ
ると考えられた。Example 11 Construction of restriction enzyme map of mite allergen gene (ma124 clone): cDNA of ma124 clone
Was inserted into pGEX-2T to prepare plasmid DNA (pTEX124) and digested with various restriction enzymes. When the result of subjecting this to agarose gel electrophoresis was analyzed, ma
The restriction map of 124 clones was considered to be that shown in FIG.
【００５４】実施例１２ ダニアレルゲン遺伝子（ｍａ１２４クローン）の全塩基
配列の決定：前記の実施例１１において作製した制限酵
素地図をもとに、ジオキシターミネーション法により、
ｍａ１２４クローンについて全塩基配列を決定し、アミ
ノ酸配列を推定したところ、配列番号：１に示される塩
基配列およびアミノ酸配列が得られた。Example 12 Determination of the entire nucleotide sequence of mite allergen gene (ma124 clone): Based on the restriction enzyme map prepared in Example 11 above, by the dioxy termination method,
When the entire base sequence of the ma124 clone was determined and the amino acid sequence was estimated, the base sequence and amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 were obtained.
【００５５】[0055]
【発明の効果】本発明により、ダニアレルギー疾患の治
療剤、診断薬としてアナフィラキシー誘発性の不純物を
含まない安全かつ有効な組換えダニアレルゲンを提供す
ることが可能となった。Industrial Applicability According to the present invention, it is possible to provide a safe and effective recombinant mite allergen containing no anaphylaxis-inducing impurities as a therapeutic agent or diagnostic agent for mite allergic diseases.
【００５６】[0056]
配列番号：１ 配列の長さ：３８４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：コナヒョウヒダニ 組織の種類：虫体 配列 GAT GCT GCA CGT ACA ACA TCA CAA TCA CCA ACA GCA ATA ATC AAC GAT 48 Asp Ala Ala Arg Thr Thr Ser Gln Ser Pro Thr Ala Ile Ile Asn Asp 1 5 10 15 CCA GAT ATG GAT ATT AAG TCC ATT GAT TCA TTA GAA GAA AGT GAT CAG 96 Pro Asp Met Asp Ile Lys Ser Ile Asp Ser Leu Glu Glu Ser Asp Gln 20 25 30 CCA ACT TTA GGC GGT AGT GGT GCT GGT GGT GGA TCT AGT TCG GCC ACC 144 Pro Thr Leu Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ala Thr 35 40 45 GGT TCC AAT GGA AGT GAT GAT TTT GAT GAT CAA TTG GTT AAA ATT GAT 192 Gly Ser Asn Gly Ser Asp Asp Phe Asp Asp Gln Leu Val Lys Ile Asp 50 55 60 AGT AGC GCT GCT GGA TCG TCT CTT TCA TCT TCA AAC AAC AAT AAT ACA 240 Ser Ser Ala Ala Gly Ser Ser Leu Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Thr 65 70 75 80 ACC ACC ACT CCA ATT AGA TCG TCG AAT GTG AAT GTT AAT AAC AAT AAT 288 Thr Thr Thr Pro Ile Arg Ser Ser Asn Val Asn Val Asn Asn Asn Asn 85 90 95 AAT TTA AGT GAT GAA CAA TTA AGC TCA TTA GAG ATG ATT GAT GAT GAT 336 Asn Leu Ser Asp Glu Gln Leu Ser Ser Leu Glu Met Ile Asp Asp Asp 100 105 110 AAT AAT TTC ACT ACA TTC AAC AAT GAT AAA CAA CAA CAA CCC AAA CAG 384 Asn Asn Phe Thr Thr Phe Asn Asn Asp Lys Gln Gln Gln Pro Lys Gln 115 120 125 SEQ ID NO: 1 Sequence length: 384 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double strand Topology: Linear Sequence type: cDNA to mRNA Origin Organism name: Dermatophagoides farinae Tissue type: Insect body Sequence GAT GCT GCA CGT ACA ACA TCA CAA TCA CCA ACA GCA ATA ATC AAC GAT 48 Asp Ala Ala Arg Thr Thr Ser Gln Ser Pro Thr Ala Ile Ile Asn Asp 1 5 10 15 CCA GAT ATG GAT ATT AAG TCC ATT GAT TCA TTA GAA GAA AGT GAT CAG 96 Pro Asp Met Asp Ile Lys Ser Ile Asp Ser Leu Glu Glu Ser Asp Gln 20 25 30 CCA ACT TTA GGC GGT AGT GGT GCT GGT GGT GGA TCT AGT TCG GCC ACC 144 Pro Thr Leu Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ala Thr 35 40 45 GGT TCC AAT GGA AGT GAT GAT TTT GAT GAT CAA TTG GTT AAA ATT GAT 192 Gly Ser Asn Gly Ser Asp Asp Phe Asp Asp Gln Leu Val Lys Ile Asp 50 55 60 AGT AGC GCT GCT GGA TCG TCT CTT TCA TCT TCA AAC AAC AAT AAT ACA 240 Ser Ser Ala Ala Gly Ser Ser Leu Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Thr 65 70 75 80 ACC ACC ACT CCA ATT AGA TCG TCG AAT GTG AAT GTT AAT AAC AAT AAT 288 Thr Thr Thr Pro Ile Arg Ser Ser Asn Val Asn Val Asn Asn Asn Asn 85 90 95 AAT TTA AGT GAT GAA CAA TTA AGC TCA TTA GAG ATG ATT GAT GAT GAT 336 Asn Leu Ser Asp Glu Gln Leu Ser Ser Leu Glu Met Ile Asp Asp Asp 100 105 110 AAT AAT TTC ACT ACA TTC AAC AAT GAT AAA CAA CAA CAA CCC AAA CAG 384 Asn Asn Phe Thr Thr Phe Asn Asn Asp Lys Gln Gln Gln Pro Lys Gln 115 120 125
【図１】図１は、組換えプラスミドpTEX124 の構築を示
した図である。FIG. 1 is a diagram showing the construction of recombinant plasmid pTEX124.
【図２】図２は、pTEX124 の大腸菌での発現産物（レー
ン２）、pGEX-2T の大腸菌での発現産物（レーン３）、
発現産物をグルタチオンカラムで精製したもの（レーン
４）およびグルタチオンカラムで精製したものをトロン
ビンで消化し再びグルタチオンカラムで精製したもの
（レーン５）をSDS-PAGEにかけた後、抗Der f II血清を
用いたWestern blotによるクマージー染色、金染色（Ａ
のレーン１〜５およびＢのレーン１）または免疫染色
（Ｂのレーン２〜５）を行なった結果を示す。図中、レ
ーン１は分子量マーカーを示す。FIG. 2 shows the expression product of pTEX124 in E. coli (lane 2), the expression product of pGEX-2T in E. coli (lane 3),
The expression product purified by glutathione column (lane 4) and the product purified by glutathione column were digested with thrombin and purified again by glutathione column (lane 5). After SDS-PAGE, anti-Der f II serum was added. The Western blot used was used for the Kumagee stain and gold stain (A
1 lanes 1 to 5 and B 1) or immunostaining (lanes 2 to 5 B). In the figure, lane 1 shows a molecular weight marker.
【図３】図３は、ダニアレルゲン遺伝子（ｍａ１２４ク
ローン）の制限酵素地図を示した図である。FIG. 3 is a diagram showing a restriction enzyme map of a mite allergen gene (ma124 clone).
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Internal reference number FI Technical indication C12N 15/09 C12P 21/02 C 9282-4B // (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12P 21 / 02 C12R 1:19)
Claims (14)
られる、以下のアミノ酸配列（配列番号：１）を含んで
いる組換えダニアレルゲン。 Asp Ala Ala Arg Thr Thr Ser Gln Ser Pro Thr Ala Ile Ile Asn Asp Pro Asp Met Asp Ile Lys Ser Ile Asp Ser Leu Glu Glu Ser Asp Gln Pro Thr Leu Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ala Thr Gly Ser Asn Gly Ser Asp Asp Phe Asp Asp Gln Leu Val Lys Ile Asp Ser Ser Ala Ala Gly Ser Ser Leu Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Thr Thr Thr Thr Pro Ile Arg Ser Ser Asn Val Asn Val Asn Asn Asn Asn Asn Leu Ser Asp Glu Gln Leu Ser Ser Leu Glu Met Ile Asp Asp Asp Asn Asn Phe Thr Thr Phe Asn Asn Asp Lys Gln Gln Gln Pro Lys Gln 1. A recombinant mite allergen containing the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) obtained by expression of a gene derived from a mite body. Asp Ala Ala Arg Thr Thr Ser Gln Ser Pro Thr Ala Ile Ile Asn Asp Pro Asp Met Asp Ile Lys Ser Ile Asp Ser Leu Glu Glu Ser Asp Gln Pro Thr Leu Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ala Thr Gly Ser Asn Gly Ser Asp Asp Phe Asp Asp Gln Leu Val Lys Ile Asp Ser Ser Ala Ala Gly Ser Ser Leu Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Thr Thr Thr Thr Pro Ile Arg Ser Ser Asn Val Asn Val Asn Asn Asn Asn Asn Leu Ser Asp Glu Gln Leu Ser Ser Leu Glu Met Ile Asp Asp Asp Asn Asn Phe Thr Thr Phe Asn Asn Asp Lys Gln Gln Gln Pro Lys Gln
ニ虫体由来の遺伝子である請求項１記載の組換えダニア
レルゲン。2. The recombinant mite allergen according to claim 1, wherein the gene according to claim 1 is a gene derived from Dermatophagoides farinae.
請求項１又は２記載の組換えダニアレルゲン。3. The recombinant mite allergen according to claim 1, which has a molecular weight of about 15,000 (SDS-PAGE).
電気泳動法）であって、図３の制限酵素地図を有する遺
伝子の発現によって得られるものである請求項１〜３の
いずれか１項に記載の組換えダニアレルゲン。4. The whole base chain length is about 0.5 kbp (agarose electrophoresis method) and is obtained by expression of a gene having the restriction map of FIG. The recombinant mite allergen according to item 1.
換えダニアレルゲンが他の蛋白質と融合していることを
特徴とする融合組換えダニアレルゲン。5. A fused recombinant mite allergen, characterized in that the recombinant mite allergen according to any one of claims 1 to 4 is fused with another protein.
スフェラーゼである請求項５記載の融合組換えダニアレ
ルゲン。6. The fused recombinant mite allergen according to claim 5, wherein the other protein is glutathione S-transferase.
号：１）を含みかつアレルゲン活性を有する蛋白質をコ
ードしているダニ虫体由来の遺伝子。 Asp Ala Ala Arg Thr Thr Ser Gln Ser Pro Thr Ala Ile Ile Asn Asp Pro Asp Met Asp Ile Lys Ser Ile Asp Ser Leu Glu Glu Ser Asp Gln Pro Thr Leu Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ala Thr Gly Ser Asn Gly Ser Asp Asp Phe Asp Asp Gln Leu Val Lys Ile Asp Ser Ser Ala Ala Gly Ser Ser Leu Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Thr Thr Thr Thr Pro Ile Arg Ser Ser Asn Val Asn Val Asn Asn Asn Asn Asn Leu Ser Asp Glu Gln Leu Ser Ser Leu Glu Met Ile Asp Asp Asp Asn Asn Phe Thr Thr Phe Asn Asn Asp Lys Gln Gln Gln Pro Lys Gln 7. A mite body-derived gene encoding a protein having the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) in a molecule and having allergen activity. Asp Ala Ala Arg Thr Thr Ser Gln Ser Pro Thr Ala Ile Ile Asn Asp Pro Asp Met Asp Ile Lys Ser Ile Asp Ser Leu Glu Glu Ser Asp Gln Pro Thr Leu Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ala Thr Gly Ser Asn Gly Ser Asp Asp Phe Asp Asp Gln Leu Val Lys Ile Asp Ser Ser Ala Ala Gly Ser Ser Leu Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Thr Thr Thr Thr Pro Ile Arg Ser Ser Asn Val Asn Val Asn Asn Asn Asn Asn Leu Ser Asp Glu Gln Leu Ser Ser Leu Glu Met Ile Asp Asp Asp Asn Asn Phe Thr Thr Phe Asn Asn Asp Lys Gln Gln Gln Pro Lys Gln
むものである請求項７記載のダニ虫体由来の遺伝子。 GAT GCT GCA CGT ACA ACA TCA CAA TCA CCA ACA GCA ATA ATC AAC GAT CCA GAT ATG GAT ATT AAG TCC ATT GAT TCA TTA GAA GAA AGT GAT CAG CCA ACT TTA GGC GGT AGT GGT GCT GGT GGT GGA TCT AGT TCG GCC ACC GGT TCC AAT GGA AGT GAT GAT TTT GAT GAT CAA TTG GTT AAA ATT GAT AGT AGC GCT GCT GGA TCG TCT CTT TCA TCT TCA AAC AAC AAT AAT ACA ACC ACC ACT CCA ATT AGA TCG TCG AAT GTG AAT GTT AAT AAC AAT AAT AAT TTA AGT GAT GAA CAA TTA AGC TCA TTA GAG ATG ATT GAT GAT GAT AAT AAT TTC ACT ACA TTC AAC AAT GAT AAA CAA CAA CAA CCC AAA CAG 8. The mite body-derived gene according to claim 7, which comprises the following DNA sequence (SEQ ID NO: 1). GAT GCT GCA CGT ACA ACA TCA CAA TCA CCA ACA GCA ATA ATC AAC GAT CCA GAT ATG GAT ATT AAG TCC ATT GAT TCA TTA GAA GAA AGT GAT CAG CCA ACT TTA GGC GGT AGT GGT GCT GGT GGT GGA TCT AGT TCG GCC ACC GGT AAT GGA AGT GAT GAT TTT GAT GAT CAA TTG GTT AAA ATT GAT AGT AGC GCT GCT GGA TCG TCT CTT TCA TCT TCA AAC AAC AAT AAT ACA ACC ACC ACT CCA ATT AGA TCG TCG AAT GTG AAT GTT AAT AAC AAT AAT AAT TTA AGT GAA CAA TTA AGC TCA TTA GAG ATG ATT GAT GAT GAT AAT AAT TTC ACT ACA TTC AAC AAT GAT AAA CAA CAA CAA CCC AAA CAG
細胞中において、請求項７又は８記載の遺伝子を発現さ
せ得る発現ベクター。9. An expression vector capable of expressing the gene according to claim 7 or 8 in a transformed bacterium, yeast or mammalian cell.
換された細菌、酵母又は哺乳動物細胞。10. A bacterium, yeast or mammalian cell transformed with the expression vector of claim 9.
動物細胞を該遺伝子の発現可能な条件下で培養して、組
換えダニアレルゲンを産生させ、次いで該組換えダニア
レルゲンを回収することを特徴とする組換えダニアレル
ゲンの製造方法。11. A method for producing a recombinant mite allergen by culturing the bacterium, yeast or mammalian cell according to claim 10 under conditions capable of expressing the gene, and then recovering the recombinant mite allergen. A method for producing a recombinant mite allergen, which is characterized.
動物細胞を該遺伝子の発現可能な条件下で培養して、融
合組換えダニアレルゲンを産生させ、該融合組換えダニ
アレルゲンを回収し、次いで、融合している他の蛋白質
を脱離せしめることを特徴とする組換えダニアレルゲン
の製造方法。12. The bacterium, yeast or mammalian cell according to claim 10 is cultured under conditions capable of expressing the gene to produce a fused recombinant mite allergen, and the fused recombinant mite allergen is recovered. Next, a method for producing a recombinant mite allergen, which comprises releasing other fused proteins.
組換えダニアレルゲンを有効成分とするダニアレルギー
疾患治療剤。13. A therapeutic agent for mite allergic disease, which comprises the recombinant mite allergen according to any one of claims 1 to 4 as an active ingredient.
組換えダニアレルゲンを有効成分とするダニアレルギー
疾患診断薬。14. A tick allergic disease diagnostic agent comprising the recombinant mite allergen according to claim 1 as an active ingredient.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08805994A JP3533240B2 (en) | 1994-04-01 | 1994-04-01 | Recombinant mite allergen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08805994A JP3533240B2 (en) | 1994-04-01 | 1994-04-01 | Recombinant mite allergen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07278190A true JPH07278190A (en) | 1995-10-24 |
| JP3533240B2 JP3533240B2 (en) | 2004-05-31 |
Family
ID=13932282
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP08805994A Expired - Lifetime JP3533240B2 (en) | 1994-04-01 | 1994-04-01 | Recombinant mite allergen |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3533240B2 (en) |
-
1994
- 1994-04-01 JP JP08805994A patent/JP3533240B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3533240B2 (en) | 2004-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3139777B2 (en) | Recombinant mite allergen | |
| US6562349B1 (en) | Otitis media vaccine | |
| KR100260342B1 (en) | T cell epitopes of the major allergens from dermatophagoides | |
| Lee et al. | Cloning of the gene for phosphoglycerate kinase from Schistosoma mansoni and characterization of its gene product | |
| US20140080997A1 (en) | Novel mite allergen | |
| JPH06197768A (en) | Cedar pollen antigen and gene coding the same | |
| ES2260760T3 (en) | NUCLEIC ACIDS THAT CODIFY AN ALLERGEN CONTAINED IN DOMESTIC POWDER ACAROS (DER P III), AND ITS USES. | |
| JP3533240B2 (en) | Recombinant mite allergen | |
| ES2318077T3 (en) | HYPOALLERGENIC POLYPEPTIDES BASED ON FISH PARVALBUMINA. | |
| JP4446887B2 (en) | Hypoallergenic allergic vaccine based on Pseudomonas pollen allergen PhlP7 | |
| JP3325332B2 (en) | Recombinant mite allergen | |
| JP2011236217A (en) | NON-ANAPHYLACTIC FORMS OF GRASS POLLEN Phl p 6 ALLERGEN AND THEIR USE | |
| JP3588615B2 (en) | Recombinant mite allergen | |
| JP5172100B2 (en) | New mite allergen | |
| KR0152637B1 (en) | Recombinant mite allergen | |
| JPH1075783A (en) | Recombinant acarid allergen | |
| JP2001231563A (en) | Modified mite allergen (cysteine variant) and method for producing the same | |
| JPH06256390A (en) | Ige-binding peptide | |
| JPH11318475A (en) | Dna sequence substance specific to malaria, its expression product and use thereof | |
| KR20120080561A (en) | Novel mite allergen | |
| JPH08301788A (en) | Purified mite allergen |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20031205 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040203 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20040225 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20040308 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313115 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| R370 | Written measure of declining of transfer procedure |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R370 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313115 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| R370 | Written measure of declining of transfer procedure |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R370 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313115 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080312 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090312 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090312 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100312 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100312 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110312 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120312 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130312 Year of fee payment: 9 |