JPH0723781A - Modified cgtase, its production and use - Google Patents

Modified cgtase, its production and use

Info

Publication number
JPH0723781A
JPH0723781A JP5155117A JP15511793A JPH0723781A JP H0723781 A JPH0723781 A JP H0723781A JP 5155117 A JP5155117 A JP 5155117A JP 15511793 A JP15511793 A JP 15511793A JP H0723781 A JPH0723781 A JP H0723781A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cgtase
residue
cyclodextrin
modified
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP5155117A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
Kunio Yamane
國男 山根
Kenji Kimura
憲司 木村
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Oji Corn Starch Co Ltd
Original Assignee
Oji Corn Starch Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oji Corn Starch Co Ltd filed Critical Oji Corn Starch Co Ltd
Priority to JP5155117A priority Critical patent/JPH0723781A/en
Publication of JPH0723781A publication Critical patent/JPH0723781A/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02PCLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

PURPOSE:To obtain the subject CGTase having high production ratio of gamma- cyclodextrin. CONSTITUTION:This modified CGTase is a cyclomaltodextrin glucanotransferase (CGTase) wherein the 56-site tyrosine residue or phenyl residue in the A region (the histidine residue is taken as the 1-site) is substituted with leucine residue or valine residue. The enzyme can be separated from the cultured product of a host cell transformed with an expression vector containing a DNA coding the modified CGTase.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【0001】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は改変されたCGTase遺伝
子、改変されたCGTase遺伝子を保持する組換え微生物、
改変されたCGTase、及び改変されたCGTaseを使用したサ
イクロデキストリンの製造方法に関する。
The present invention relates to a modified CGTase gene, a recombinant microorganism carrying the modified CGTase gene,
The present invention relates to a modified CGTase and a method for producing cyclodextrin using the modified CGTase.

【0002】[0002]

【従来の技術】シクロマルトデキストリングルカノトラ
ンスフェラーゼ(CGTase)(Cyclomaltodextrin glucan
otransferase)は澱粉からα−サイクロデキストリン、
β−サイクロデキストリン、及びγ−サイクロデキスト
リン等の各種のサイクロデキストリン混合物を生成する
酵素であり、EC2.4.1.16として転移酵素に分
類されている。現在までに、バシルス(Bacillus)属、ク
レブシーラ(Klebsiella)属、及びミクロコッカス(Micro
coccus) 属に属する細菌が、このCGTaseを生産する微生
物として報告されている。
PRIOR ART Cyclomaltodextrin glucan transferase (CGTase)
otransferase) is from starch to α-cyclodextrin,
It is an enzyme that produces a mixture of various cyclodextrins such as β-cyclodextrin and γ-cyclodextrin, and is classified as a transferase as EC 2.4.1.16. To date, Bacillus, Klebsiella, and Micrococcus
Bacteria belonging to the genus coccus) have been reported as microorganisms that produce this CGTase.

【0003】澱粉からの生成物であるα−サイクロデキ
ストリン、β−サイクロデキストリン、及びγ−サイク
ロデキストリンは、それぞれ6、7、及び8残基のグル
コースがα−1、4−結合により環状構造をとったホモ
・オリゴ糖であり、いずれのサイクロデキストリンも環
状構造の空隙にホストとなる疎水性の様々な物質を保持
して安定な抱接化合物を形成し、親水性を与える。サイ
クロデキストリンは、この抱接機能を持つため、食品・
薬品・その他の産業において有用で且つ生体に安全な物
質である。
The products from starch, α-cyclodextrin, β-cyclodextrin, and γ-cyclodextrin, have a cyclic structure in which glucose of 6, 7, and 8 residues is α-1,4-bonded, respectively. It is a homo-oligosaccharide taken, and any cyclodextrin retains various hydrophobic substances that serve as hosts in the voids of the cyclic structure to form a stable clathrate compound and imparts hydrophilicity. Since cyclodextrin has this hugging function,
It is a substance that is useful in medicine and other industries and is safe for the body.

【0004】代表的なα−、β−、及びγ−のサイクロ
デキストリンは、その環状構造の空隙の直径がそれぞれ
約6、7、及び8オングストロームと異なる。そのた
め、この3種類のサイクロデキストリンを比較した場
合、ホストとなる物質の多様性は空隙の直径が、より大
きい方が望ましく、また親水性の抱接化合物を形成する
為には水への溶解度の高いα−、及びγ−サイクロデキ
ストリンが適している。即ち、この3種類のサイクロデ
キストリンを比較した場合、γ−サイクロデキストリン
の機能が最も高い。
Typical α-, β-, and γ-cyclodextrins differ in the diameter of the voids in their cyclic structure by about 6, 7, and 8 angstroms, respectively. Therefore, when comparing these three types of cyclodextrins, it is desirable for the diversity of the host substance that the diameter of the voids is larger, and in order to form a hydrophilic clathrate, the solubility of the substance in water is different. High α- and γ-cyclodextrins are suitable. That is, when these three types of cyclodextrins are compared, the function of γ-cyclodextrin is the highest.

【0005】従来、この有用なγ−サイクロデキストリ
ンを製造するためには、CGTaseを基質である澱粉に作用
させて、各種のサイクロデキストリンの混合液を生成し
た後、晶出分離・クロマト分離等により、主生成物のα
−、またはβ−サイクロデキストリンを系外に除去し
て、高濃度のγ−サイクロデキストリンを調製してい
た。
Conventionally, in order to produce this useful γ-cyclodextrin, CGTase is allowed to act on starch as a substrate to produce a mixed solution of various cyclodextrins, and then crystallization separation, chromatographic separation, etc. are carried out. , The main product α
-Or β-cyclodextrin was removed outside the system to prepare a high concentration of γ-cyclodextrin.

【0006】この方法によりγ−サイクロデキストリン
を効率良く生産するには、例えば、特開昭52−790
39及び特開昭60−227693に開示された方法に
より、界面活性剤等を酵素反応系に添加して、各種のサ
イクロデキストリンの生成比率を変え、目的のサイクロ
デキストリンの収率を上げる方法がある。しかし、この
方法では、界面活性剤等の残留の可能性があるため、食
品等に使用されるサイクロデキストリンの生産に適さな
い。
To efficiently produce γ-cyclodextrin by this method, for example, JP-A-52-790 is used.
39 and the method disclosed in JP-A-60-227693, there is a method in which a surfactant or the like is added to an enzyme reaction system to change the production ratio of various cyclodextrins to increase the yield of the desired cyclodextrin. . However, this method is not suitable for the production of cyclodextrin used in foods, etc., since there is a possibility that surfactants and the like may remain.

【0007】また別の方法として、目的のγ−サイクロ
デキストリン生成比率がより高いCGTaseを使用して、γ
−サイクロデキストリンを効率良く生産する方法があ
る。即ち、γ−サイクロデキストリン生成比率が高いCG
Taseを生産する微生物を自然界より新たに分離する方法
である。この方法の一例は、『澱粉科学』33,137
−143(1986)に堀越等により報告されているバ
シルス・ブブチリス(Bacillus subtilis) No.313株
である。報告によれば、この微生物の生産するCGTaseは
澱粉を基質にしてγ−サイクロデキストリンのみを生成
するが、しかし澱粉からの生産効率は3%と低い。
As another method, a CGTase having a higher γ-cyclodextrin production ratio of interest is used to obtain γ
-There is a method for efficiently producing cyclodextrin. That is, CG with a high γ-cyclodextrin production ratio
This is a method for newly separating Tase-producing microorganisms from the natural world. An example of this method is "Starch Science" 33, 137.
-143 (1986) reported by Horikoshi et al., Bacillus subtilis No. 313 strain. According to the report, CGTase produced by this microorganism produces only γ-cyclodextrin using starch as a substrate, but the production efficiency from starch is as low as 3%.

【0008】[0008]

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、抱接化
合物に有用なγ−サイクロデキストリンを製造するた
め、上記の界面活性剤等の生体に危険な物質あるいは安
全である事が確認されていない物質を使用しない方法で
あり、且つ、γ−サイクロデキストリンの生成比率のよ
り高いCGTaseを生産する方法を鋭意研究した。その為
に、γ−サイクロデキストリンの生成比率が高いCGTase
を生産する微生物を土壌等より新たに分離する方法によ
らず、既に得られているCGTase遺伝子を遺伝子工学的に
改変してγ−サイクロデキストリンの生成比率が高いCG
Taseを生産する方法を研究した。
DISCLOSURE OF THE INVENTION Since the present inventors produce γ-cyclodextrin useful as a clathrate compound, it was confirmed that it is a substance dangerous to the living body such as the above-mentioned surfactants or it is safe. The present inventors have earnestly studied a method of producing CGTase which has a higher production ratio of γ-cyclodextrin, which is a method that does not use a substance that is not used. Therefore, CGTase with a high production ratio of γ-cyclodextrin
CG with a high production ratio of γ-cyclodextrin by genetically engineering the already obtained CGTase gene, regardless of the method of newly separating the microorganism that produces the
The method of producing Tase was studied.

【0009】現在までに報告されているCGTase遺伝子の
塩基配列及び推定アミノ酸配列を比較すると、構成する
アミノ酸残基数はいずれも700アミノ酸残基であり、
またアミノ酸レベルでいずれも互いに約70%の一致を
示している。また、CGTaseと澱粉基質との結合を支配す
る活性アミノ酸残基の配列と推定される領域は、A領
域、B領域、及びC領域と推定されている(特開平5−
41985参照)。それらの位置は、概ね成熟型酵素の
アミノ末端から140残基目付近、233残基目付近、
及び327残基目付近に存在し、これらの領域では高い
相同性が認められる。この位置は、イニシャル・メチオ
ニンから、概ね、169残基目付近、262残基目付
近、及び356残基目付近に存在する。
Comparing the nucleotide sequence of the CGTase gene reported up to now and the deduced amino acid sequence, the number of amino acid residues constituting each was 700 amino acid residues,
Also, at the amino acid level, they all show about 70% agreement with each other. Further, the regions presumed to be the sequences of active amino acid residues that control the binding between CGTase and the starch substrate are presumed to be the A region, the B region, and the C region (Japanese Patent Application Laid-Open No. HEI 5-1951).
41985). Their positions are generally around the 140th residue and the 233rd residue from the amino terminus of the mature enzyme,
It exists near residues 327 and 327, and high homology is observed in these regions. This position is present in the vicinity of the 169th residue, the 262th residue, and the 356th residue from the initial methionine.

【0010】CGTaseのそれぞれにより生成される各種の
サイクロデキストリンの比率は異なるが、いずれも3種
類のサイクロデキストリンの混合物を生成する。それ
故、CGTaseのアミノ酸残基の配列の一部を改変すること
により、γ−サイクロデキストリン生成比率が高いCGTa
seを創製する事が可能であり、この為にはCGTaseの遺伝
子のDNA配列を部分的に改変してγ−サイクロデキス
トリン生成比率がより高いCGTase遺伝子を創製すること
が可能であると考えた。
The ratios of various cyclodextrins produced by each of CGTases are different, but all produce a mixture of three types of cyclodextrins. Therefore, by modifying a part of the sequence of the amino acid residues of CGTase, CGTa with a high γ-cyclodextrin production ratio was obtained.
It was thought that it is possible to create se, and for this purpose, it is possible to partially modify the DNA sequence of the CGTase gene to create a CGTase gene having a higher γ-cyclodextrin production ratio.

【0011】[0011]

【課題を解決するための手段】[Means for Solving the Problems]

【0012】本発明者らはγ−サイクロデキストリンの
生成率が高いCGTaseを得るため種々検討した結果、種々
のCGTaseのA領域のヒスチジン残基を1位として56位
のチロシン残基またはフェニルアラニン残基をロイシン
残基またはバリン残基により置き換えることによりγ−
シクロデキストリンを特異的に生成するCGTase酵素が得
られることを見出した。従って本発明は、CGTaseにおい
てそのA領域のヒスチジン残基を1位として56位に存
在するチロシン残基またはフェニルアラニン残基がロイ
シン残基またはバリン残基により置き換えられている改
変されたCGTaseを提供する。
The present inventors have conducted various studies to obtain CGTase having a high production rate of γ-cyclodextrin. As a result, the 56-position tyrosine residue or phenylalanine residue is defined with the histidine residue in the A region of various CGTases as the 1-position. Is replaced by a leucine residue or a valine residue,
It was found that a CGTase enzyme that specifically produces cyclodextrin can be obtained. Accordingly, the present invention provides a modified CGTase in which a tyrosine residue or a phenylalanine residue present at position 56 in the CGTase with the histidine residue in the A region as position 1 is replaced by a leucine residue or a valine residue. .

【0013】本発明に使用するCGTase遺伝子の由来は、
バシルス(Bacillus)属、クレーブシーラ(Klebsiella)
属、あるいは、ミクロコッカス(Micrococcus) 属等のCG
Tase遺伝子を有する微生物なら、いずれでも可能である
が、ここでは好アルカリ性Bacillus属由来の遺伝子をと
りあげる。なお、種々のCGTaseが特開平5−41985
に記載されており、本発明をそれらのCGTaseに適用する
ことができる。
The origin of the CGTase gene used in the present invention is
Genus Bacillus, Klebsiella
CG of genus or Micrococcus genus
Any microorganism having a Tase gene can be used, but here, genes derived from the alkalophilic Bacillus genus are taken as examples. Various CGTases are disclosed in JP-A-5-41985.
And the invention can be applied to those CGTases.

【0014】本発明者等により土壌より分離された好ア
ルカリ性バシルス(Bacillus)sp. #1011(微工研菌
寄第8685号)は、CGTaseの高生産株であり、そのCG
Tase遺伝子は本発明者等により、既に染色体DNAより
大腸菌、あるいは枯草菌プラスミド上にクローニングさ
れ、塩基配列が決定されている[(Appl.Microbiol.Biot
echnol.26.149(1987) 、J.Bacteriol.169.4399(1987)、
及び特開昭62−208286]。その際に得られたプ
ラスミドpTUE217は、上記#1011株のCGTase
遺伝子を含むSaw3AI断片(5.6kb)が大腸菌プ
ラスミドpBR322のBamHIサイトへ挿入された
プラスミド(10.0kb、図1にその制限酵素地図を
示す。)であり、CGTase遺伝子は大腸菌内で安定に発現
される。
The alkalophilic Bacillus sp. # 1011 (Microtechnological Research Institute No. 8685) isolated from the soil by the present inventors is a high-producing strain of CGTase, and its CG
The Tase gene has already been cloned by the present inventors from chromosomal DNA on Escherichia coli or Bacillus subtilis plasmid and the nucleotide sequence has been determined [(Appl. Microbiol. Biot
echnol.26.149 (1987), J.Bacteriol.169.4399 (1987),
And JP-A-62-208286]. The plasmid pTUE217 obtained at that time was the CGTase of the above # 1011 strain.
A Saw3AI fragment (5.6 kb) containing the gene was inserted into the BamHI site of E. coli plasmid pBR322 (10.0 kb, its restriction enzyme map is shown in FIG. 1), and the CGTase gene was stably expressed in E. coli. To be done.

【0015】このCGTaseにより澱粉から生成される各種
のサイクロデキストリンの生成比率を変化させる目的
で、この酵素のアミノ末端から195残基目に存在する
チロシン残基を、ロイシン残基あるいはバリン残基にD
NAレベルで改変した。その結果、上記のチロシン残基
をロイシン残基あるいはバリン残基に改変することによ
り、γ−サイクロデキストリン生成比率が70%以上で
あるCGTaseを創製する事が可能となった。
In order to change the production ratio of various cyclodextrins produced from starch by this CGTase, the tyrosine residue at the 195th residue from the amino terminus of this enzyme was changed to a leucine residue or a valine residue. D
Modified at NA level. As a result, it was possible to create a CGTase having a γ-cyclodextrin production ratio of 70% or more by modifying the above-mentioned tyrosine residue into a leucine residue or a valine residue.

【0016】即ち、CGTaseの成熟型酵素のアミノ末端よ
り、195残基目近辺に存在するチロシン残基をロイシ
ン残基あるいはバリン残基に改変するDNA配列を有す
る改変CGTase遺伝子を部位特異的変異(Site-Directed M
utagenesis) により創製した。この195残基目近辺に
存在するチロシン残基は、CGTaseのA領域及びB領域の
間に存在する。
That is, a modified CGTase gene having a DNA sequence for modifying a tyrosine residue existing near the 195th residue to a leucine residue or a valine residue from the amino terminus of the mature enzyme of CGTase is subjected to site-specific mutation ( Site-Directed M
utagenesis). The tyrosine residue existing near the 195th residue exists between the A region and B region of CGTase.

【0017】以下に、改変の方法の一例をあげる。以下
の操作において形質転換株のプレート上での分離では、
1%澱粉を含む選択培地を使用して、コロニーの現われ
たプレートにヨウ素液を噴霧してハロー(透明環)を検
出したコロニーを選択した。その後、薄層クロマトグラ
フィー分析によりその株のCGTase活性の有無を確認し
た。
An example of the modification method will be given below. In the following operation, when the transformant is separated on a plate,
A selective medium containing 1% starch was used to spray the iodine solution on the plate showing the colonies to select the colonies in which the halo (clear ring) was detected. Then, the presence or absence of CGTase activity of the strain was confirmed by thin layer chromatography analysis.

【0018】プラスミド pTUE217(図1)を制限
酵素SphI及びSmaIにより切断して調製した1.
8kbのDNA断片には、CGTase構造遺伝子のA領域から
カルボキシ末端に至る1次構造を完全にコードする塩基
配列が含まれている。このDNA断片を、Messing,J に
より開発された大腸菌繊維状ファージ・プラスミドM1
3mp18(宝酒造(株)より購入。Methods Enzymol.
101.20(1983))のSphI−SmaIサイトへ導入し、
大腸菌BW313株(宝酒造(株)より購入。
1. Prepared by cutting plasmid pTUE217 (FIG. 1) with restriction enzymes SphI and SmaI.
The 8 kb DNA fragment contains a nucleotide sequence that completely encodes the primary structure from the A region of the CGTase structural gene to the carboxy terminus. This DNA fragment was used as an E. coli filamentous phage plasmid M1 developed by Messing, J.
3mp18 (Purchased from Takara Shuzo Co., Ltd. Methods Enzymol.
101.20 (1983)) SphI-SmaI site,
E. coli BW313 strain (purchased from Takara Shuzo Co., Ltd.

【0019】HfrKL16PO45[1syA(61-62) ] dut1
ung1 thi-1 relA1 ) を宿主としてDNA中にチミン
の代わりに一部ウラシルが混在しているssDNA(一重
鎖DNA、single stranded DNA)を調製した。この
ssDNAにKunkel.T.A. らの方法(Methods Enzymol.15
4.367(1987)に従って変異を導入した。
HfrKL16PO / 45 [1syA (61-62)] dut1
ung1 thi-1 relA1 ) was used as a host to prepare ssDNA (single stranded DNA) in which uracil was partially mixed in place of thymine in DNA. this
For ssDNA, the method of Kunkel. TA et al. (Methods Enzymol.
Mutations were introduced according to 4.367 (1987).

【0020】即ち、CGTaseのアミノ末端より195残基
目付近の推定アミノ酸配列はIle−Tyr−Lys−
Asn−Leu−Tyr−Asp−Leu−Ala−A
sp−Leu(配列番号:1)であり、そしてこの19
5残基目に存在するチロシン残基をロイシン残基、バリ
ン残基、フェニールアラニン残基、あるいはイソロイシ
ン残基に改変するDNA配列を有する改変遺伝子を部位
特異的変異により創製するために、以下に示すY195
L、Y195V、Y195F、Y195Iの4種類の合
成DNAを調製した。
That is, the deduced amino acid sequence near the 195th residue from the amino terminus of CGTase is Ile-Tyr-Lys-.
Asn-Leu- Tyr- Asp-Leu-Ala-A
sp-Leu (SEQ ID NO: 1), and this 19
In order to create a modified gene having a DNA sequence for modifying the tyrosine residue existing at the 5th residue into a leucine residue, a valine residue, a phenylalanine residue, or an isoleucine residue by site-directed mutation, Showing Y195
Four kinds of synthetic DNAs of L, Y195V, Y195F, and Y195I were prepared.

【0021】Y195L : 5′AAAAACCTGCTCGATCTG
GCT3′(配列番号:2) Y195V : 5′AAAAACCTGGTCGATCTGGCT3′(配列
番号:3) Y195F : 5′AAAAACCTGTTCGATCTGGCT3′(配列
番号:4) Y195I : 5′AAAAACCTGATCGATCTGGCT3′(配列
番号:5)
Y195L: 5'AAAAACCTGCTCGATCTG
GCT3 '(SEQ ID NO: 2) Y195V: 5'AAAAACCTGGTCGATCTGGCT3' (SEQ ID NO: 3) Y195F: 5'AAAAACCTGTTCGATCTGGCT3 '(SEQ ID NO: 4) Y195I: 5'AAAAACCTGATCGATCTGGCT3' (SEQ ID NO: 5)

【0022】DNAの合成はApplied Biosystems社のD
NA Synthesizer model 380A を使用し、固相β−シア
ノエチル法により合成した。合成DNAの精製にはAppl
iedBiosystems社のOligonucleotide Purification Gart
ridgeを使用した。これらの変異の導入の結果は、DN
Aシーケンスにより確認した。
DNA synthesis is carried out by Applied Biosystems D
NA Synthesizer model 380A was used and it synthesize | combined by the solid-phase (beta) -cyanoethyl method. Appl for purification of synthetic DNA
Oligonucleotide Purification Gart from ied Biosystems
I used a ridge. The result of introducing these mutations is DN
It was confirmed by the A sequence.

【0023】その後、これらの変異の導入された7種類
のファージのRF−DNA(replicative form−DN
A)をアルカリ−SDS法(Birnboim,H.C.& Doly,J. N
ucleicAcids Res. 7.1513(1979)により抽出し、その変
異を受けたDNA配列を含む4種類のSphI−AflII 断片
(1.8kb)を調製した。この1.8kbのDNA断片
(以下、変異DNA断片という。)には、いずれもCGTa
seのA領域からカルボキシ末端に至る1次構造に相当す
る領域を完全にコードする塩基配列が含まれており、但
し、この塩基配列では部位特異的変異により、それぞれ
の一か所のチロシン残基のコードが変異を受けている。
Then, the RF-DNA (replicative form-DN) of 7 kinds of phages introduced with these mutations was used.
A) is alkali-SDS method (Birnboim, HC & Doly, J.N.
nucleoic Acids Res. 7.1513 (1979), and 4 kinds of SphI-AflII fragments (1.8 kb) containing the mutated DNA sequence were prepared. The 1.8 kb DNA fragment (hereinafter referred to as the mutant DNA fragment) was CGTa.
It contains a base sequence that completely encodes the region corresponding to the primary structure from the A region of se to the carboxy terminus. However, this base sequence contains a tyrosine residue at each one of the bases due to site-specific mutation. Has been mutated.

【0024】次に、上記プラスミド pTUE217のHi
ndIII 断片(5.0kb)を調製する。このDNA断片に
は、CGTase遺伝子が完全に含まれている。このDNA断
片を、Messing,Jにより開発された大腸菌プラスミドp
UC13(宝酒造(株)より購入。Methods Enzymol.10
1.20(1983))のHindIII サイトへ、lac Z遺伝子とCGTa
se遺伝子の転写方向が同じになるように、挿入し、新た
なプラスミド pTUE254を構築した。このプラスミ
ド上のCGTase遺伝子は大腸菌内で安定に発現される。
Next, Hi of the above plasmid pTUE217
Prepare the ndIII fragment (5.0 kb). This DNA fragment completely contains the CGTase gene. This DNA fragment was used as an E. coli plasmid p developed by Messing, J.
UC13 (purchased from Takara Shuzo Co., Ltd. Methods Enzymol.10)
1.20 (1983)) HindIII site, lac Z gene and CGTa
A new plasmid pTUE254 was constructed by inserting so that the se gene had the same transcription direction. The CGTase gene on this plasmid is stably expressed in E. coli.

【0025】この新たなプラスミド pTUE254にお
いて、存在するCGTase遺伝子に含まれるSphIサイト及び
Afl IIサイトで囲まれるDNA領域(1.8kb。この領
域には、CGTaseのA領域からカルボキシ末端に至る1次
構造を完全にコードする塩基配列が含まれている。)を
消化した。そこへ上記の4種類の変異DNA断片をそれ
ぞれ挿入し、プラスミドを構築し、宿主である大腸菌M
E8417株に形質転換し、変異CGTase遺伝子を含む4
種類のプラスミドを分離した。
In this new plasmid pTUE254, the SphI site contained in the existing CGTase gene and
The DNA region surrounded by the Afl II site (1.8 kb. This region contains the nucleotide sequence completely encoding the primary structure from the A region of CGTase to the carboxy terminus) was digested. Each of the above four kinds of mutant DNA fragments was inserted therein to construct a plasmid, and E. coli M as a host was constructed.
Transformed into E8417 strain and containing mutant CGTase gene 4
Different types of plasmids were isolated.

【0026】これらの4種類のプラスミドを含む大腸菌
ME8417形質転換株において、変異CGTase遺伝子は
安定に発現されることを、SDS−ポリアクリルアミド
・ゲル電気泳動(分子量は#1011株のCGTaseと同様
で66kDであった。)、及びサザン・ブロッティング、
更に、薄層クロマトグラフィー分析によるサイクロデキ
ストリンの検出により確認した。この4種類のプラスミ
ドをそれぞれ pY195L、 pY195V、 pY195
F及び pY195Iと称する。
In the E. coli ME8417 transformant containing these four types of plasmids, the mutant CGTase gene was stably expressed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (the molecular weight is 66 kD, which is similar to that of the CGTase of the # 1011 strain). , And Southern blotting,
Furthermore, it was confirmed by detection of cyclodextrin by thin layer chromatography analysis. These four types of plasmids were designated as pY195L, pY195V and pY195, respectively.
F and pY195I.

【0027】この部位特異的変異により創製された変異
CGTase遺伝子は、ここで大腸菌形質転換株にクローン化
されたが、宿主は限定されず、枯草菌等の細菌、放線
菌、酵母等のいずれの微生物でも可能である。また、親
株を含めてこれらの微生物の染色体DNAにインテグレ
ートして発現することも可能である。
Mutations created by this site-specific mutation
The CGTase gene has been cloned here into an E. coli transformant, but the host is not limited, and any microorganism such as bacteria such as Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast can be used. It is also possible to integrate and express the chromosomal DNA of these microorganisms including the parent strain.

【0028】変異CGTaseの精製は、以下の手順によっ
た。上記の4種類の変異CGTase遺伝子をそれぞれ含むプ
ラスミド pY195L、 pY195V、 pY195F及
び pY195Iを安定して保持する4株の大腸菌ME8
417形質転換株を、 pY195L−E.coli ME8
417、 pY195V−E.coli ME8417、 pY
195F−E.coli ME8417、及び pY195I
−E.coli ME8417と称する。
Purification of mutant CGTase was carried out by the following procedure. Four strains of Escherichia coli ME8 stably retaining plasmids pY195L, pY195V, pY195F and pY195I containing the above-mentioned four types of mutant CGTase genes, respectively.
The 417 transformant was transformed into pY195L-E. coli ME8
417, pY195V-E. coli ME8417, pY
195F-E. coli ME8417, and pY195I
-E. coli ME8417.

【0029】この4株について、250μg /mlアンピ
シリン、20μg /テトラサイクリンを含むL−ブロス
培地(トリプトン1%、酵母エキス0.5%、NaC1
0.5 %)500mlで培養し、集菌し、オスモチック・
ショック法(Chan,S.J. et al. Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A. 78.5401(1981) )により、大腸菌ペリプラズム画
分を調製する。
For these 4 strains, L-broth medium containing 250 μg / ml ampicillin and 20 μg / tetracycline (tryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaC1
0.5%) Cultured in 500 ml, harvested, osmotic
Shock method (Chan, SJ et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.
SA 78.5401 (1981)) to prepare the E. coli periplasmic fraction.

【0030】低温にて25%硫安の塩析条件で1時間維
持した後、遠心上清をあらかじめpH8.0のトリス−
塩酸緩衝液、25%硫安で平衡化したToyopearl HW−55
F を充填したカラムでカラムクロマトグラフィー分析
し、CGTaseをカラムに吸着させた後、pH8.0のトリ
ス−塩酸緩衝液でCGTaseを溶出させた。酵素の澱粉分解
活性をFuwaの方法(Fuwa,H J.Biochem. 41.583(1954) に
よるヨウ素澱粉反応で分析し、活性フラクッションを集
め、pH8.0のトリス−塩酸緩衝液で透析し、4種類
の精製酵素標品をそれぞれ約30mg得た。
After maintaining the salting-out condition of 25% ammonium sulfate at low temperature for 1 hour, the centrifugation supernatant was preliminarily adjusted to pH 8.0 with Tris-.
Toyopearl HW-55 equilibrated with hydrochloric acid buffer and 25% ammonium sulfate
Column chromatography analysis was carried out on a column filled with F, CGTase was adsorbed on the column, and then CGTase was eluted with a Tris-hydrochloric acid buffer solution of pH 8.0. The starch degrading activity of the enzyme was analyzed by the iodine starch reaction according to Fuwa's method (Fuwa, H. J. Biochem. 41.583 (1954), and the active hula cushion was collected and dialyzed against Tris-hydrochloric acid buffer of pH 8.0 to obtain 4 types. About 30 mg of each purified enzyme preparation of

【0031】本研究における澱粉分解活性は、酵素溶液
50μl を0.3%澱粉溶液(10mM燐酸ナトリウム緩
衝液、pH6.0)100μl に加え、37℃にて10
分間維持した後、ヨウ素溶液(1.7mMヨウ化カリウ
ム、0.17mMヨウ素、0.5%塩酸)を3.75ml加
え、660nmにおける吸光度を測定した。澱粉分解活性
は、1分間に基質とした澱粉の吸光度を1%減少させる
活性を1ユニットと定義した。澱粉試薬は、メルク社製
可溶性澱粉(#1252)を使用した。得られた4種類
の改変CGTase、及び親株である#1011のCGTase(wil
d type) について澱粉分解活性の比活性を分析し、結果
を表1に示す。
The starch-degrading activity in this study was as follows: 50 μl of enzyme solution was added to 100 μl of 0.3% starch solution (10 mM sodium phosphate buffer, pH 6.0) at 37 ° C.
After maintaining for 3 minutes, 3.75 ml of an iodine solution (1.7 mM potassium iodide, 0.17 mM iodine, 0.5% hydrochloric acid) was added, and the absorbance at 660 nm was measured. The starch-degrading activity was defined as 1 unit, which is an activity that reduces the absorbance of starch used as a substrate by 1% for 1 minute. As the starch reagent, soluble starch (# 1252) manufactured by Merck was used. The four modified CGTases obtained and the parent strain # 1011 CGTase (wil
The specific activity of the starch degrading activity was analyzed for d type), and the results are shown in Table 1.

【0032】ここで使用した#1011のCGTaseについ
ては、好アルカリ性Bacillus sp.#1011(微工研菌寄第
8685号)をポリペプトン1.0%、酵母エキス0.
5%、澱粉2%、K2 HPO4 0.1%、MgSO4
7H2 O0.02%、Na2CO3 1%を含む培地(但
し、Na2 CO3 1%のみ別にオートクレーブした後に
添加する。)で、40℃、48時間好気的に培養して遠
心上清を得、低温にて25%硫安の塩析条件で1時間維
持した後、上記の変異CGTaseと同様の操作により精製酵
素標品を得て分析した。
As for the CGTase of # 1011 used here, alkalophilic Bacillus sp. # 1011 (Ministry of Industrial Science and Technology No. 8685) was used as polypeptone 1.0% and yeast extract 0.
5%, starch 2%, K 2 HPO 4 0.1%, MgSO 4 ·
7H 2 O 0.02%, Na 2 CO 3 1% in a medium (however, only Na 2 CO 3 1% is added after autoclaving separately), aerobically cultured at 40 ° C. for 48 hours, and centrifuged. After being purified and maintained at a low temperature under salting-out conditions of 25% ammonium sulfate for 1 hour, a purified enzyme preparation was obtained and analyzed by the same procedure as the above-mentioned mutant CGTase.

【0033】即ち、CGTaseのアミノ末端から、195残
基目に存在するチロシン残基が、ロイシン残基あるいは
バリン残基に改変された変異CGTaseの澱粉分解活性は、
親株である#1011のwild type のCGTaseと比較し
て、約3分の1に減少した。しかし、アミノ末端から1
95残基目に存在するチロシン残基がフェニールアラニ
ン残基あるいはイソロイシン残基に改変された変異CGTa
seの澱粉分解活性は、大幅な低下が認められなかった。
That is, the starch degrading activity of the mutant CGTase in which the tyrosine residue existing at the 195th residue from the amino terminus of CGTase was modified to a leucine residue or a valine residue was
Compared to the parent strain # 1011 wild type CGTase, it was reduced to about one-third. However, 1 from the amino terminus
Mutant CGTa in which the tyrosine residue existing at the 95th residue is modified to a phenylalanine residue or an isoleucine residue
No significant decrease was observed in the starch degrading activity of se.

【0034】次に、これらの変異CGTaseの生成するサイ
クロデキストリンの生成比率を分析した。本研究におけ
るサイクロデキストリンの生成比率は、平均重合度17
のアミロース(林原生化学研究所製)の1%の溶液(1
0mM酢酸カルシウム、pH6.0)を基質として、10
ユニット/mlの精製酵素を添加し、37℃にて10分〜
6時間反応した後、煮沸して酵素を失活する。その後、
生化学工業(株)製グルコアミラーゼ100ユニットを
加え、65℃にて1時間反応し、その一部をとり液体ク
ロマトグラフィー分析(メルク社製LiChrospher 100
NH2 (5μm)カラム(250mmL ×4.5mmD )、
及び70%アセトニトリル溶離液を使用)によりα−、
β−、及びγ−サイクロデキストリンを定量した。
Next, the production ratio of cyclodextrin produced by these mutant CGTases was analyzed. The ratio of cyclodextrin produced in this study was 17
Amylose (Hayashibara Biochemical Research Laboratories) 1% solution (1
Using 0 mM calcium acetate, pH 6.0) as a substrate, 10
Add purified enzyme at a unit of 1 ml / ml, and at 37 ℃ for 10 minutes ~
After reacting for 6 hours, the enzyme is inactivated by boiling. afterwards,
100 units of glucoamylase manufactured by Seikagaku Corporation was added, and the mixture was reacted at 65 ° C for 1 hour, and a part of the mixture was analyzed by liquid chromatography (LiChrospher 100 manufactured by Merck).
NH 2 (5 μm) column (250 mmL x 4.5 mmD),
And 70% acetonitrile eluent).
β- and γ-cyclodextrin were quantified.

【0035】得られた4種類の改変CGTase、及び親株で
ある#1011のCGTase(wild type) について、酵素反
応によるサイクロデキストリン生成量、及びサイクロデ
キストリン生成比率を分析し、結果をそれぞれ表2、及
び表3に示す。
With respect to the obtained four types of modified CGTases and the parent strain # 1011 CGTase (wild type), the amount of cyclodextrin produced by the enzymatic reaction and the cyclodextrin production ratio were analyzed, and the results are shown in Table 2 and, respectively. It shows in Table 3.

【0036】即ち、CGTaseにより澱粉から生成される各
種のサイクロデキストリンの生成比率を変化させる目的
で、この酵素のアミノ末端から195残基目に存在する
チロシン残基を、ロイシン残基、あるいはバリン残基に
DNAレベルで改変して得られた変異CGTaseは、親株で
ある#1011のwild type のCGTaseと比較して、澱粉
からのγ−サイクロデキストリンの生成比率が約20%
から約75%、あるいは約67%に増加した。換言すれ
ば、CGTaseのアミノ末端から195残基目近辺に存在す
るチロシン残基をロイシン残基、あるいはバリン残基に
DNAレベルで改変して得られた変異CGTase遺伝子を構
築することにより、γ−サイクロデキストリン生成比率
がより高いCGTase遺伝子を創製する事が可能となった。
That is, in order to change the production ratio of various cyclodextrins produced from starch by CGTase, the tyrosine residue at the 195th residue from the amino terminus of this enzyme was changed to a leucine residue or a valine residue. The mutant CGTase obtained by modifying the base at the DNA level has a production ratio of γ-cyclodextrin from starch of about 20% as compared with the parent type # 1011 wild type CGTase.
From about 75% to about 67%. In other words, by constructing a mutant CGTase gene obtained by modifying a tyrosine residue existing near the 195th residue from the amino terminus of CGTase to a leucine residue or a valine residue at the DNA level, γ- It has become possible to create a CGTase gene with a higher cyclodextrin production rate.

【0037】更に、上記の2株であるpY195L−
E.coli ME8417、及び pY195V−E.coli M
E8417の大腸菌形質転換株の生産する変異CGTaseを
使用して、澱粉を基質としてγ−サイクロデキストリン
の生成比率がより多い反応液を調製し、特開昭57−1
46600等に示される公知の分離精製法によりγ−サ
イクロデキストリンを得ることができる。
In addition, the above two strains, pY195L-
E. coli ME8417, and pY195V-E. Coli M
Using a mutant CGTase produced by an E. coli transformed strain of E8417, a reaction solution having a higher production ratio of γ-cyclodextrin was prepared using starch as a substrate.
Γ-Cyclodextrin can be obtained by a known separation and purification method shown in 46600 and the like.

【0038】即ち、pH6.0に調製した15%コーン
スターチ糊液130gに、形質転換株 pY195L−
E.coli ME8417から調製した5万ユニットの変異
CGTaseの精製酵素を添加し、65℃にて1時間反応した
後、煮沸して酵素を失活する。その後、グルコアミラー
ゼ処理し、この反応液を精製濃縮し、β−サイクロデキ
ストリンの結晶4.7gを分離した。
That is, the transformant pY195L- was added to 130 g of 15% corn starch paste solution adjusted to pH 6.0.
50,000 mutations prepared from E. coli ME8417
After adding purified enzyme of CGTase and reacting at 65 ° C for 1 hour, the enzyme is inactivated by boiling. Then, it was treated with glucoamylase, and the reaction solution was purified and concentrated to isolate 4.7 g of β-cyclodextrin crystals.

【0039】残った糖液を、あらかじめNa型にした強
酸性陽イオン交換樹脂カラムに通液し、水でクロマト分
画し、サイクロデキストリン画分、及びグルコース画分
を得た。次に、このサイクロデキストリン画分を濃縮
し、Toyopearl HW-40Sカラムに通液し、水でクロマト分
画し、6.0%濃度のγ−サイクロデキストリン画分を
500g得た。この画分を液体クロマトグラフィー法に
より分析した結果、γ−サイクロデキストリンの純度は
91.4%であった。
The remaining sugar solution was passed through a strongly acidic cation exchange resin column previously converted to Na type and chromatographed with water to obtain a cyclodextrin fraction and a glucose fraction. Next, this cyclodextrin fraction was concentrated, passed through a Toyopearl HW-40S column, and chromatographed with water to obtain 500 g of a γ-cyclodextrin fraction having a concentration of 6.0%. As a result of analyzing this fraction by liquid chromatography, the purity of γ-cyclodextrin was 91.4%.

【0040】以上、前記好アルカリ性Bcillus #101
1株を用いて本発明の効果を確認したが、既知のCGTase
がいずれも類似の構造を有し、類似の酵素的性質を有し
ていることから、CGTaseのアミノ末端から195残基目
近辺に存在するチロシン残基をロイシン残基、あるいは
バリン残基に改変したCGTaseはいずれも、上記具体的に
記載したのと同様の効果、即ち、γ−サイクロデキスト
リンの生成の増加をもたらすことが明らかである。
Above, the alkaliphilic Bcillus # 101
Although the effect of the present invention was confirmed using one strain, known CGTase
Have a similar structure and have similar enzymatic properties, the tyrosine residue near the 195th residue from the amino terminus of CGTase was changed to a leucine residue or a valine residue. It is clear that all of the above CGTases bring about the same effects as those specifically described above, that is, increase in the production of γ-cyclodextrin.

【0041】特に例えば、バシルス・サーキュランス
(B.circulans)〔Nishizawa,M.ら (1987)DNA 6.255-26
5〕、バシルス・マセランス (B.macerance)およびバシ
ルス・ステアロサーモフィルス(B.stearothermophilus)
〔Sakai,S.ら(1987)Denpun Kagaku 34.140-147〕、バシ
ルス・マセランス(B.macerans)〔Takano,T. ら(1986)J.
Bacteriol.166.1118-1122 〕、クレブシラ・ニューモニ
ア (Klebsiella pneumoniae)〔Binder,F. ら(1986)Gene
47.269-277 〕、バシルス(Bacillus)sp. #38−2
(Kaneko,T. ら (1988)J.General Microbiol.134.97-105
〕、バシルス(Bacillus)sp. #17−1〔Kaneko,T.
ら (1989) J.General Microbiol.135.3447-3457 〕、バ
シルス(Bacillus)sp. #1−1〔Schmid,G. ら(1988)Pr
oceedings 4th.Internat.Sympo.Cyclodextrins(Munich,
WestGermany) Kluwer Academic Publishers.pp7-17〕、
並びにバシルス・リケニホルミス (B.licheniformis)
〔Hill,D.ら (1990)Nucleic Acids Research 18.199〕
In particular, for example, Bacillus circulans
(B.circulans) 〔Nishizawa, M. et al. (1987) DNA 6.255-26
5], B. macerance and B. stearothermophilus
(Sakai, S. et al. (1987) Denpun Kagaku 34.140-147), B. macerans (Takano, T. et al. (1986) J.
Bacteriol.166.1118-1122], Klebsiella pneumoniae (Binder, F. et al. (1986) Gene
47.269-277], Bacillus sp. # 38-2
(Kaneko, T. et al. (1988) J. General Microbiol. 134.97-105
], Bacillus sp. # 17-1 [Kaneko, T.
(1989) J. General Microbiol. 135.3447-3457], Bacillus sp. # 1-1 [Schmid, G. et al. (1988) Pr.
oceedings 4th.Internat.Sympo.Cyclodextrins (Munich,
WestGermany) Kluwer Academic Publishers.pp7-17],
And Bacillus licheniformis
(Hill, D. et al. (1990) Nucleic Acids Research 18.199)

【0042】で代表される好アルカリ性バシルス(Bacil
lus)属又はクレブシラ (Klebsiella) 属により生産され
るCGTaseのA領域のヒスチジン残基を1位として56位
のチロシン残基またはフェニルアラニン残基が、#10
11株由来のCGTaseのアミノ末端から195残基目に存
在するアミノ酸残基のチロシン残基に相当し、その前後
のアミノ酸配列も前記バシルス(Bacillus)sp. #101
1株由来のCGTaseのそれと同一であるから、前記種々の
CGTaseについても、そのA領域のヒスチジン残基を1位
として56位のチロシン残基またはフェニルアラニン残
基を、バシルス(Bacillus)sp. #1011株由来のCGTa
seについて記載したのと同じ方法により改変して、本発
明の改変されたCGTaseを製造することができる。従って
本発明は、既知のCGTaseについて上記のようにアミノ酸
残基が改変された改変体をも包含する。なお、前記種々
のCGTase酵素のA領域からB領域までのアミノ酸配列を
表1及び2に示す。
Alkali bacillus represented by
lus) or Klebsiella ( Klebsiella ) genus CGTase A region histidine residue in position 1 position 56 tyrosine residue or phenylalanine residue is # 10
It corresponds to the tyrosine residue of the amino acid residue present at the 195th residue from the amino terminus of CGTase derived from 11 strains, and the amino acid sequences before and after it also correspond to the aforementioned Bacillus sp. # 101.
Since it is the same as that of CGTase derived from one strain,
Also for CGTase, the histidine residue in the A region is defined as the 1st position, and the 56th tyrosine residue or the phenylalanine residue is CGTa derived from the Bacillus sp. # 1011 strain.
Modifications can be made in the same manner as described for se to produce the modified CGTases of the invention. Therefore, the present invention also includes a modified product in which the amino acid residue of the known CGTase is modified as described above. The amino acid sequences of the various CGTase enzymes from the A region to the B region are shown in Tables 1 and 2.

【0043】[0043]

【表1】 [Table 1]

【0044】[0044]

【表2】 [Table 2]

【0045】[0045]

【実施例】以下、実施例を例示して説明する。実施例1. CGTase遺伝子DNAを含むプラスミドpTUE
217 のクローニング 本願の発明者等により土壌中より新たに分離された好ア
ルカリ性Bacillus sp.#1011(微工研菌寄第868
5号、以後、#1011株という。)は、CGTaseの高生
産株である。既に、このCGTase遺伝子のクローニング
は、本願の発明者等により特開昭62−208286号
において、並びに、Appl.Microbiol.Biotech.,26:149-
153(1987) 及び、J.Bacteriol.,169:4399-4402(1987)
において開示されている。
EXAMPLES Examples will be described below by way of example. Example 1. Plasmid pTUE containing CGTase gene DNA
Cloning of 217 Alkaliphilic Bacillus sp. # 1011 (Ministry of Industrial Science and Technology), which was newly isolated from the soil by the present inventors.
No. 5, hereinafter referred to as # 1011 strain. ) Is a high-producing strain of CGTase. Already, the cloning of this CGTase gene was carried out by the inventors of the present application in JP-A-62-208286, and Appl. Microbiol. Biotech., 26: 149-.
153 (1987) and J. Bacteriol., 169: 4399-4402 (1987).
Are disclosed in.

【0046】即ち、特開昭62−208286号におい
て記されたプラスミドpTUE202、並びに、Appl.M
icrobiol.Biotech.,26:149-153(1987) 及びJ.Bacterio
l.,169:4399-4402(1987) において記されたプラスミド
pTUE202、及び、プラスミドpTUE217は、
いずれも同じ方法により得られたものである。
That is, the plasmid pTUE202 described in JP-A-62-208286 and Appl.M
icrobiol.Biotech., 26: 149-153 (1987) and J. Bacterio.
l., 169: 4399-4402 (1987), plasmid pTUE202 and plasmid pTUE217 are
Both were obtained by the same method.

【0047】両プラスミドは、いずれも大腸菌ベクター
pBR322のBamHIサイトへ、#1011株(微
工研菌寄第8685号)のCGTase遺伝子DNAがクロー
ニングされたものであり、両者の差異は、#1011株
の染色体DNA上におけるCGTase遺伝子の近傍領域の長
さの違いのみである。その為に、プラスミドpTUE2
02は9.1kb、また、プラスミドpTUE217は、
10.0kbであった。第1図にプラスミドpTUE21
7の物理地図を示す。
Both plasmids were obtained by cloning the CGTase gene DNA of the # 1011 strain (Ministry of Industrial Science and Technology No. 8685) into the BamHI site of the Escherichia coli vector pBR322. The difference between the two was the # 1011 strain. The only difference is the length of the region near the CGTase gene on the chromosomal DNA of. Therefore, the plasmid pTUE2
02 is 9.1 kb, and the plasmid pTUE217 is
It was 10.0 kb. The plasmid pTUE21 is shown in FIG.
7 shows a physical map of 7.

【0048】本願の実施にはいずれのプラスミドも可能
であるが、実施例ではプラスミドpTUE217を使用
した。#1011株のCGTase遺伝子の塩基配列について
は、ダイデオキシ・チェイン・ターミネーション法によ
り決定された結果、その構造遺伝子としての2,139
bpからなるオープン・リーディリング・フレーム(71
3アミノ酸)、及びその上流側のプロモータ配列、並び
にSD配列が認められた。(前記J.Bacteriol.,169:43
99-4402(1987) 参照)。
Although any plasmid is possible for the practice of this application, plasmid pTUE217 was used in the examples. The nucleotide sequence of the CGTase gene of the # 1011 strain was determined by the dideoxy chain termination method, and as a result, its structural gene was 2,139.
Open reading frame consisting of bp (71
3 amino acids), its upstream promoter sequence, and SD sequence were observed. (J. Bacteriol., 169: 43 above.
99-4402 (1987)).

【0049】実施例2. 部位特異的変異 プラスミドpTUE217を制限酵素SphI及びSm
aIにより切断して調製した1.8kbのDNA断片を、
M13mp1(宝酒造(株)製)を宿主としてDNA中
にチミンの代わりに一部ウラシルが混在しているssDN
Aを調製した。このssDNAにKunkel,T.A. らの方法に
従い変異を導入した。
Example 2. Using the site-specific mutation plasmid pTUE217 with the restriction enzymes SphI and Sm
The 1.8 kb DNA fragment prepared by cleaving with aI was
SsDN with M13mp1 (Takara Shuzo Co., Ltd.) as a host and uracil partially mixed in the DNA instead of thymine
A was prepared. Mutations were introduced into this ssDNA according to the method of Kunkel, TA et al.

【0050】即ち、CGTaseのアミノ末端より195残基
目に存在するチロシン残基をロイシン残基、バリン残
基、フェニールアラニン残基、あるいはイソロイシン残
基に改変するDNA配列を有する改変遺伝子を部位特異
的変異により創製する為、以下にY195L、Y195
V、Y195F、及びY195Iとして示す4種類の合
成DNAを調製した。
That is, a site-specific modified gene having a DNA sequence that modifies a tyrosine residue existing at the 195th residue from the amino terminus of CGTase into a leucine residue, a valine residue, a phenylalanine residue, or an isoleucine residue is site-specific. Since it is created by dynamic mutation, Y195L, Y195
Four types of synthetic DNA designated V, Y195F, and Y195I were prepared.

【0051】Y195L : 5′AAAAACCTGCTCGATCTG
GCT3′(配列番号:2) Y195V : 5′AAAAACCTGGTCGATCTGGCT3′(配列
番号:3) Y195F : 5′AAAAACCTGTTCGATCTGGCT3′(配列
番号:4) Y195I : 5′AAAAACCTGATCGATCTGGCT3′(配列
番号:5)
Y195L: 5'AAAAACCTGCTCGATCTG
GCT3 '(SEQ ID NO: 2) Y195V: 5'AAAAACCTGGTCGATCTGGCT3' (SEQ ID NO: 3) Y195F: 5'AAAAACCTGTTCGATCTGGCT3 '(SEQ ID NO: 4) Y195I: 5'AAAAACCTGATCGATCTGGCT3' (SEQ ID NO: 5)

【0052】これらの変異の導入の結果は、DNAシー
ケンスにより確認した。その後、これらの変異の導入さ
れた4種類のファージのRF−DNAをアルカリ−SD
S法により抽出し、その変異を受けたDNA配列を含む
種類のSphI−AflII断片(1.8kb)を調製し
た。この1.8kbのDNA断片には、いずれもCGTaseの
A領域からカルボキシ末端に至る1次構造を完全にコー
ドする塩基配列が含まれており、但し、この塩基配列で
は部位特異的変異により、それぞれの一か所のチロシン
残基のコードが変異を受けている。
The results of introducing these mutations were confirmed by DNA sequencing. Then, the RF-DNAs of the four types of phages into which these mutations were introduced were subjected to alkali-SD.
The SphI-AflII fragment (1.8 kb) of the kind containing the DNA sequence subjected to the mutation was extracted by the S method. Each of the 1.8 kb DNA fragments contains a base sequence that completely encodes the primary structure from the A region of CGTase to the carboxy terminus. One tyrosine residue code is mutated.

【0053】実施例3. 変異CGTase遺伝子の構築、及
び精製変異CGTaseの調製 pTUE217のプラスミドDNAを制限酵素Hind
III (宝酒造(株)製)を使用して、CGTase遺伝子を完
全に含む約5.0kbのHindIII 断片を調製した。次
にシーケンス用ベクターpUC13(3.2kb、宝酒造
(株)製)のHindIII サイトへ挿入し、新たなプラ
スミドpTUE254を構築した。
Example 3. Construction of mutant CGTase gene, and
And preparation of purified mutant CGTase The plasmid DNA of pTUE217 was digested with the restriction enzyme Hind.
III (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was used to prepare an approximately 5.0 kb HindIII fragment completely containing the CGTase gene. Then, it was inserted into the HindIII site of the sequencing vector pUC13 (3.2 kb, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) to construct a new plasmid pTUE254.

【0054】この新たなプラスミドpTUE254にお
いて、存在するCGTase遺伝子に含まれるSphIサイト
及びAflIIサイトで囲まれるDNA領域を消化した。
そこへ上記の実施例2にて調製した4種類の変異DNA
断片をそれぞれ挿入し、プラスミドを構築し、宿主であ
る大腸菌ME8417株に形質転換し、変異CGTase遺伝
子を含む4種類のプラスミドを分離した。
In this new plasmid pTUE254, the DNA region surrounded by the SphI site and AflII site contained in the existing CGTase gene was digested.
There, four types of mutant DNAs prepared in Example 2 above
Each fragment was inserted to construct a plasmid, which was transformed into Escherichia coli ME8417 strain as a host, and four types of plasmids containing the mutant CGTase gene were separated.

【0055】この4種類のプラスミドをそれぞれ pY1
95L、 pY195V、pY195F、及びpY195
Iと称し、それらを安定して保持する4種類の大腸菌M
E8417形質転換株を、pY195L−E.coli ME
8417、pY195V−E.coli ME8417、pY
195F−E.coli ME8417、及びpY195I−
E.coli ME8417と称する。
Each of these four types of plasmids was designated as pY1.
95L, pY195V, pY195F, and pY195
4 kinds of Escherichia coli M, which are called I and stably hold them
The E8417 transformant was transformed with pY195L-E. Coli ME.
8417, pY195V-E.coli ME8417, pY
195F-E. Coli ME8417, and pY195I-
It is called E. coli ME8417.

【0056】この4株について、250μg アンピシリ
ン/ml、及び20μg テトラサイクリン/mlを含むL−
ブロス培地500mlで培養し、集菌し、オスモチック・
ショック法により、大腸菌ペリプラズム画分を調製す
る。25%硫安塩析、及びToyopearl HW-55Fのカラムク
ロマトグラフィー分析により変異CGTaseを精製して、4
種類の精製酵素標品を調製した。
For these 4 strains, L-containing 250 μg ampicillin / ml and 20 μg tetracycline / ml.
Incubate with 500 ml of Broth medium, collect the bacteria, and
The E. coli periplasmic fraction is prepared by the shock method. Mutant CGTase was purified by salting out with 25% ammonium sulfate and column chromatography analysis of Toyopearl HW-55F.
A variety of purified enzyme preparations were prepared.

【0057】実施例4. 変異CGTaseの比活性、及び酵
素反応生成物の分析 4種類の変異CGTaseの比活性を分析した結果を表3に示
す。
Example 4. Specific activity of mutant CGTase and fermentation
Analysis of elementary reaction products Table 3 shows the results of analysis of the specific activities of four types of mutant CGTases.

【表3】 [Table 3]

【0058】次に、これらの変異CGTaseの生成するサイ
クロデキストリンの生成比率を分析した。平均重合度1
7のアミロース(林原生化学研究所製)の1%溶液(1
0mM酢酸カルシウム、pH6.0)を基質として、10
ユニット/mlの精製酵素を添加し、37℃にて10分〜
6時間反応した後、煮沸して酵素を失活する。その後、
グルコアミラーゼ100ユニットを加え、65℃にて1
時間反応し、その一部をとり液体クロマトグラフィ分析
により、α−、β−、及びγ−サイクロデキストリンを
定量した。
Next, the production ratio of cyclodextrin produced by these mutant CGTases was analyzed. Average degree of polymerization 1
7% amylose (Hayashibara Biochemical Laboratories) 1% solution (1
Using 0 mM calcium acetate, pH 6.0) as a substrate, 10
Add purified enzyme at a unit of 1 ml / ml, and at 37 ℃ for 10 minutes ~
After reacting for 6 hours, the enzyme is inactivated by boiling. afterwards,
Add 100 units of glucoamylase and add 1 at 65 ° C.
After reacting for a period of time, a part of the reaction mixture was analyzed by liquid chromatography to quantify α-, β-, and γ-cyclodextrin.

【0059】得られた4種類の変異CGTase、及び親株で
ある#1011のCGTase(wild type) について、酵素反
応によるサイクロデキストリン生成量、及びサイクロデ
キストリン生成比率を分析し、結果を表4、及び表5に
示す。
With respect to the obtained four types of mutant CGTases and the parent strain # 1011 CGTase (wild type), the amount of cyclodextrin produced by the enzymatic reaction and the cyclodextrin production ratio were analyzed, and the results are shown in Table 4 and Table 4. 5 shows.

【0060】[0060]

【表4】 [Table 4]

【0061】[0061]

【表5】 [Table 5]

【0062】実施例5. 変異CGTaseを使用したγ−サ
イクロデキストリンの製造 上記の大腸菌形質転換株pY195L−E.coli ME8
417から調製した変異CGTase5万ユニットを、50mM
燐酸ナトリウム緩衝液にてpH6.0に調製した15%
コーンスターチ糊液130gに添加し、65℃にて1時
間反応した後、煮沸して酵素を失活する。その後、pH
5.0に調製し、グルコアミラーゼ処理した。この反応
液を精製濃縮し、β−サイクロデキストリンの結晶4.
7gを分離した。
Example 5. Γ-service using mutant CGTase
Production of iclodextrin E. coli transformant pY195L-E. Coli ME8 described above
50,000 units of mutant CGTase prepared from 417
15% adjusted to pH 6.0 with sodium phosphate buffer
It is added to 130 g of corn starch paste solution, reacted at 65 ° C for 1 hour, and then boiled to inactivate the enzyme. Then the pH
It was adjusted to 5.0 and treated with glucoamylase. This reaction solution was purified and concentrated, and crystals of β-cyclodextrin were obtained.
7 g was separated.

【0063】残った糖液を、あらかじめNa型にした強
酸性陽イオン交換樹脂(ダイヤイオンSK−IBS)カ
ラムに通液し、水でクロマト分画し、4%のサイクロデ
キストリン画分、及び3%のグルコース画分を得た。次
に、このサイクロデキストリン画分を20%に濃縮し、
Toyopearl HW-40Sカラムに通液し、水でクロマト分画
し、6.0%濃度のγ−サイクロデキストリン画分を5
00g得た。この画分を液体クロマトグラフィ法により
分析した結果、γ−サイクロデキストリンの純度は9
1.4%であった。
The remaining sugar solution was passed through a strongly acidic cation exchange resin (Diaion SK-IBS) column previously converted to Na type, and chromatographed with water to obtain a 4% cyclodextrin fraction and 3 % Glucose fraction was obtained. Then, concentrate the cyclodextrin fraction to 20%,
Pass through a Toyopearl HW-40S column and chromatograph with water to obtain 6.0% γ-cyclodextrin fraction.
00g was obtained. As a result of analyzing this fraction by liquid chromatography, the purity of γ-cyclodextrin was 9
It was 1.4%.

【0064】[0064]

【配列表】[Sequence list]

配列番号:1 配列の長さ:11 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド SEQ ID NO: 1 Sequence length: 11 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide

【0065】配列番号:2 配列の長さ:21 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 配列の種類:合成DNA 配列 AAAAACCTGC TCGATCTGGC T 21SEQ ID NO: 2 Sequence length: 21 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Sequence type: Synthetic DNA Sequence AAAAACCTGC TCGATCTGGC T 21

【0066】配列番号:3 配列の長さ:21 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 配列の種類:合成DNA 配列 AAAAACCTGG TCGATCTGGC T 21SEQ ID NO: 3 Sequence length: 21 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Sequence type: Synthetic DNA Sequence AAAAACCTGG TCGATCTGGC T 21

【0067】配列番号:4 配列の長さ:21 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 配列の種類:合成DNA 配列 AAAAACCTGT TCGATCTGGC T 21SEQ ID NO: 4 Sequence length: 21 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Sequence type: Synthetic DNA Sequence AAAAACCTGT TCGATCTGGC T 21

【0068】配列番号:5 配列の長さ:21 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 配列の種類:合成DNA 配列 AAAAACCTGA TCGATCTGGC T 21SEQ ID NO: 5 Sequence length: 21 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Sequence type: Synthetic DNA Sequence AAAAACCTGA TCGATCTGGC T 21

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図1】図1はプラスミドpTUE217の制限酵素地
図を示す図である。
FIG. 1 is a diagram showing a restriction enzyme map of plasmid pTUE217.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 (C12N 15/54 C12R 1:07) ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Office reference number FI technical display location (C12N 15/54 C12R 1:07)

Claims (5)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項1】 サイクロマルトデキストリングルカノト
ランスフェラーゼ(CGTase)において、A領域のヒスチ
ジン残基を1位として56位に存在するチロシン残基又
はフェニルアラニン残基がロイシン残基またはバリン残
基により置き換えられていることを特徴とする改変され
たCGTase。
1. In cyclomaltodextrin glucanotransferase (CGTase), the histidine residue in the A region is defined as position 1 and the tyrosine residue or phenylalanine residue at position 56 is replaced by a leucine residue or a valine residue. A modified CGTase characterized in that
【請求項2】 前記CGTaseがバシルス(Bacillus)sp. #
1011(微工研菌寄第8685号)由来のCGTaseであ
りそのアミノ末端から195番目のチロシン残基がロイ
シン残基またはバリン残基により置き換えられている、
請求項1に記載の改変されたCGTase。
2. The CGTase is Bacillus sp.
CGTase derived from 1011 (Microtechnology Research Institute No. 8685), in which the 195th tyrosine residue from the amino terminus is replaced with a leucine residue or a valine residue,
The modified CGTase according to claim 1.
【請求項3】 請求項1または2に記載の改変されたCG
Taseの製造方法であって、該改変されたCGTaseをコード
するDNAを含んで成る発現ベクターにより形質転換さ
れた宿主を培養し、該培養物から該改変されたCGTaseを
採取することを特徴とする方法。
3. The modified CG according to claim 1 or 2.
A method for producing Tase, comprising culturing a host transformed with an expression vector comprising a DNA encoding the modified CGTase, and collecting the modified CGTase from the culture. Method.
【請求項4】 請求項1または2に記載の改変されたCG
Taseをコードする遺伝子。
4. The modified CG according to claim 1 or 2.
Gene encoding Tase.
【請求項5】 請求項1または2に記載の改変されたCG
Taseを澱粉に作用せしめ、その反応液よりγ−サイクロ
デキストリンを分離することを特徴とするγ−サイクロ
デキストリンの製造方法。
5. The modified CG according to claim 1 or 2.
A method for producing γ-cyclodextrin, which comprises allowing Tase to act on starch and separating γ-cyclodextrin from the reaction solution.
JP5155117A 1993-06-25 1993-06-25 Modified cgtase, its production and use Pending JPH0723781A (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP5155117A JPH0723781A (en) 1993-06-25 1993-06-25 Modified cgtase, its production and use

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP5155117A JPH0723781A (en) 1993-06-25 1993-06-25 Modified cgtase, its production and use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH0723781A true JPH0723781A (en) 1995-01-27

Family

ID=15598954

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP5155117A Pending JPH0723781A (en) 1993-06-25 1993-06-25 Modified cgtase, its production and use

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JPH0723781A (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0802259A1 (en) * 1996-04-18 1997-10-22 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Cyclodextrin glucosyltransferases for the production of gamma-cyclodextrin
US6004790A (en) * 1995-04-21 1999-12-21 Novo Nordisk A/S Cyclomaltodextrin glucanotransferase variants

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6004790A (en) * 1995-04-21 1999-12-21 Novo Nordisk A/S Cyclomaltodextrin glucanotransferase variants
EP1632566A2 (en) * 1995-04-21 2006-03-08 Novozymes A/S Cyclomaltodextrin glucanotransferase variants
EP1632566A3 (en) * 1995-04-21 2006-08-16 Novozymes A/S Cyclomaltodextrin glucanotransferase variants
EP0802259A1 (en) * 1996-04-18 1997-10-22 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Cyclodextrin glucosyltransferases for the production of gamma-cyclodextrin

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Schmid Cyclodextrin glycosyltransferase production: yield enhancement by overexpression of cloned genes
US11203742B2 (en) Sucrose phosphorylase mutant with improved enzyme activity and construction method thereof and use thereof
Wind et al. Cyclodextrin formation by the thermostable alpha-amylase of Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes EM1 and reclassification of the enzyme as a cyclodextrin glycosyltransferase
EP0822982B1 (en) Cyclomaltodextrin glucanotransferase variants
US11566235B2 (en) Mutant of cyclodextrin glycosyltransferase
Kim et al. Production and selection of mutants of Leuconostoc mesenteroides constitutive for glucansucrases
KR910002852B1 (en) Cyclomaltodextrin glucanotransferase and preparing method thereof
Sin et al. Replacement of an amino acid residue of cyclodextrin glucanotransferase of Bacillus ohbensis doubles the production of γ-cyclodextrin
Kawamura et al. Purification and some properties of cycloinulo-oligosaccharide fructanotransferase from Bacillus circulans OKUMZ 31B
JP4235262B2 (en) Production of non-native bacterial exopolysaccharides in recombinant bacterial hosts
US5474917A (en) Modified cyclodextrin glycosyltransferases for producing γ-cyclodextrins
Rahman et al. Molecular cloning of a cyclodextrin glucanotransferase gene from alkalophilic Bacillus sp. TS1-1 and characterization of the recombinant enzyme
US5409824A (en) γ-CGTase
JPH0723781A (en) Modified cgtase, its production and use
JPH0541985A (en) Mutant cyclomaltodextrin glucanotransferase
WO2005003337A1 (en) Cgtase variants
Horikoshi Enzymology and molecular genetics of CD-forming enzymes
JP3155324B2 (en) Cyclodextrin glucanotransferase, method for producing the same, and gene encoding the enzyme
JP3105466B2 (en) Method for producing CGTase, mutant CGTase gene, DNA sequence encoding CGTase, method for producing γ-CGTase, method for producing γ-CD
US5804426A (en) Recombinant cyclodextran glucanotransferase mutants
KR940003652B1 (en) Method of preparing of polypeptide possessing cyclomaltodextrin glucano transferase activity
JP4989922B2 (en) Mutant and gene encoding the same
US6472192B1 (en) Cyclodextrin glycosyl transferases for producing γ-cyclodextrin
JP4060652B2 (en) Gene encoding cyclodextrin glucanotransferase mainly comprising γ-cyclodextrin and use thereof
JP4340107B2 (en) Substrate specificity modified chimeric enzyme