JPH07231783A - Protein-free medium for culture of animal cell and culture method - Google Patents

Protein-free medium for culture of animal cell and culture method

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JPH07231783A
JPH07231783A JP6025125A JP2512594A JPH07231783A JP H07231783 A JPH07231783 A JP H07231783A JP 6025125 A JP6025125 A JP 6025125A JP 2512594 A JP2512594 A JP 2512594A JP H07231783 A JPH07231783 A JP H07231783A
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JP
Japan
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culture
protein
medium
lecithin
tocopherol
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JP6025125A
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Inventor
Masahide Kondo
雅英 近藤
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Tosoh Corp
Original Assignee
Tosoh Corp
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Publication date
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Abstract

PURPOSE:To obtain the subject medium containing tocopherol, retinol, lecithin and/or sodium pantothenate, useful for culture of not only a hybridoma but wider-ranging animal cells and suitable for along-term mass-culture in a cell culture equipment. CONSTITUTION:This medium contains one or more kinds of low-molecular substances selected from a group of tocopherol (tocopherol pcetate is included), retinol (retinol acetate is included), lecithin (yolk lecithin or soybean lecithin) and sodium pantothenate. An animal cell, e.g. a recombinant animal cell capable of manifesting an antibody gene or an animal fused cell capable of producing an antibody can be reproducibly cultured without requiring fetal bovine serum, etc.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【0001】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、モノクローナル抗体を
生産するための動物細胞培養用無蛋白質培地及び培養方
法に関するものである。
BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a protein-free medium for culturing animal cells and a culture method for producing a monoclonal antibody.

【0002】[0002]

【従来の技術】1975年にケ−ラ−とミルシュタイン
(Nature、256 巻、495 頁、1975年)によってモノクロ
ーナル抗体の作製技術が開発されて以来、様々な抗原に
対するモノクローナル抗体が多数作製されてきた。モノ
クローナル抗体は、体外診断薬、体内診断薬、治療薬、
親和精製用試薬への利用が進められており、あるものは
すでに実用化され、またあるもの実用化に向けての研究
開発が盛んである。
BACKGROUND OF THE INVENTION Since the technology for producing monoclonal antibodies was developed by Keller and Milstein (Nature, 256, 495, 1975) in 1975, many monoclonal antibodies against various antigens have been produced. It was Monoclonal antibodies are in vitro diagnostics, internal diagnostics, therapeutics,
It is being used as a reagent for affinity purification, and some have already been put to practical use, and research and development towards the practical use of some have been actively conducted.

【0003】従来は、マウス細胞同志の融合細胞(例え
ばハイブリドーマ)やラット細胞とマウス細胞の融合細
胞をマウスの腹水中で培養し、該腹水からモノクロ−ナ
ル抗体を得るというモノクロ−ナル抗体の製造方法が中
心であったが、近年は細胞培養による培養に移行しつつ
ある。また前記融合細胞以外のヒト細胞同志の融合細胞
又はマウス細胞とヒト細胞の融合細胞等、マウスの腹水
中での培養が困難な融合細胞や、遺伝子工学技術を用い
て抗体遺伝子を導入した組換え動物細胞については細胞
培養法による培養が行われている。
[0003] Conventionally, production of a monoclonal antibody in which a fused cell of mouse cells (for example, a hybridoma) or a fused cell of a rat cell and a mouse cell is cultured in ascites fluid of a mouse to obtain a monoclonal antibody from the ascites fluid. Although the method was the main focus, in recent years it is shifting to cell culture. Further, human cells other than the above fused cells, fused cells of mouse cells and human cells, such as fused cells of mouse cells and human cells, which are difficult to culture in ascites of mice, and recombinants in which an antibody gene has been introduced using genetic engineering technology Animal cells are cultured by the cell culture method.

【0004】[0004]

【発明が解決しようとする課題】細胞培養法による融合
細胞や組換え動物細胞等の動物細胞の培養は、これまで
のところアミノ酸、ビタミン類、糖質、塩類等からなる
基礎培地に動物の血清(多くの場合は牛胎児血清)又は
血清から精製した成分を添加した培地を使用するが、血
清、特に牛胎児血清は高価で、品質のばらつきが大きい
ため、培養のためにコストがかかり、しかも培養結果の
再現性に課題がある。ハイブリド−マに代表される融合
細胞や抗体遺伝子を発現し得る組換え動物細胞等を培養
してモノクロ−ナル抗体又は抗体活性を有する蛋白質を
製造する場合にも、前記コストの課題はもちろん、生産
性のばらつきが課題となる。
The culturing of animal cells such as fused cells and recombinant animal cells by the cell culturing method has hitherto been carried out by using animal serum in a basal medium composed of amino acids, vitamins, sugars and salts. (In most cases, fetal bovine serum) or a medium supplemented with components purified from serum is used. However, serum, especially fetal bovine serum, is expensive and has a large variation in quality. There is a problem in reproducibility of culture results. In the case of producing a monoclonal antibody or a protein having antibody activity by culturing a fused animal typified by a hybridoma or a recombinant animal cell capable of expressing an antibody gene, the above-mentioned cost problem is, of course, produced. The variation in sex becomes a problem.

【0005】また、血清中に含まれる既知又は未知の蛋
白質成分は、培養終了後に製造したモノクローナル抗体
等を精製する際に課題を生じる。製造したモノクロ−ナ
ル抗体等を体内診断薬や体内治療薬に用いる場合は、夾
雑物質、特に蛋白質成分を完全に除去する必要があるか
らである。このため、血清を含む培地で融合細胞や抗体
遺伝子を発現し得る組換え動物細胞等を培養してモノク
ロ−ナル抗体等を製造した場合には、通常使用される種
々の精製方法を組み合わせた、複雑な精製操作が必要と
なる。
Known or unknown protein components contained in serum pose a problem when purifying a monoclonal antibody or the like produced after completion of culture. This is because when the produced monoclonal antibody or the like is used as an in-vivo diagnostic agent or in-vivo therapeutic agent, it is necessary to completely remove contaminants, especially protein components. Therefore, in the case of producing a monoclonal antibody or the like by culturing a recombinant animal cell or the like capable of expressing a fused cell or an antibody gene in a medium containing serum, various purification methods usually used are combined, A complicated purification operation is required.

【0006】無血清培地としてインスリン、トランスフ
ェリン、2−エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウ
ム、アルブミン、細胞増殖因子等を添加したものが使用
される場合があるが、蛋白質成分が含まれていることに
変わりはなく、製造したモノクローナル抗体等の精製の
際には前記同様の課題が生じる。しかもインスリンや細
胞増殖因子等は非常に高価であるため、コスト面の課題
も生じる。
As a serum-free medium, a medium to which insulin, transferrin, 2-ethanolamine, sodium selenite, albumin, cell growth factor, etc. are added may be used, but it is changed to contain a protein component. However, the same problem as described above occurs when the manufactured monoclonal antibody or the like is purified. Moreover, since insulin and cell growth factors are very expensive, there is a cost problem.

【0007】近年、蛋白質成分を含まない培地が報告さ
れ(特開平4-91786 号公報、トヨダら、Agric.Biol.Che
m.、55巻、1631頁、1991年或いはシンモトら、Biotechn
ol.Lett. 、13巻、683 頁、1991年等参照)、蛋白質成
分を含む培地の課題を解決する試みが成されている。し
かし、これらの無蛋白質培地においても、動物細胞の種
類によっては培養が困難であり、血清又は蛋白質成分を
含む培地に比べて培養効率(動物細胞の成育)が悪く、
更に細胞培養装置を用いて長期大量培養を行う際に細胞
の生存率が次第に低下し、細胞数が減少する等の課題が
あった。
Recently, a medium containing no protein component has been reported (Japanese Patent Laid-Open No. 4-91786, Toyoda et al., Agric. Biol. Che.
m., 55, 1631, 1991 or Shinmoto et al., Biotechn.
ol. Lett., 13: 683, 1991, etc.), an attempt has been made to solve the problem of a medium containing a protein component. However, even in these protein-free media, it is difficult to culture depending on the type of animal cells, and the culture efficiency (growth of animal cells) is poor as compared with media containing serum or protein components,
Further, when performing long-term mass culture using a cell culture device, there were problems such as the cell viability gradually decreasing and the cell number decreasing.

【0008】更に改良すべき課題点があった。There is a problem to be further improved.

【0009】[0009]

【課題を解決するための手段】本発明者は、モノクロー
ナル抗体を生産するハイブリドーマを培養し、モノクロ
ーナル抗体を製造するため、従来報告されている無蛋白
質培地について鋭意研究を行った結果、従来の培地に更
にいくつかの低分子成分を加えることにより、蛋白質成
分を加える必要がなく、より多くの動物細胞の培養に適
用でき、かつ細胞培養装置を用いた長期大量培養に適し
た無蛋白質培地を見出だし、本発明を完成するに至っ
た。
Means for Solving the Problems The present inventor has conducted extensive studies on a protein-free medium previously reported for culturing a hybridoma producing a monoclonal antibody and producing the monoclonal antibody. By adding several low molecular weight components to the above, it is possible to apply to the culture of more animal cells without the need to add protein components, and to find a protein-free medium suitable for long-term mass culture using a cell culture device. The present invention was started and the present invention was completed.

【0010】即ち本発明は、トコフェロール、レチノー
ル、レシチン及びパントテン酸ナトリウムからなる群か
ら選ばれる一種以上の低分子物質を含有し、蛋白質成分
を含有しない動物細胞培養用無蛋白質培地である。また
本発明は、トコフェロール、レチノール、レシチン及び
パントテン酸ナトリウムからなる群から選ばれる一種以
上の低分子物質を含有し、蛋白質成分を含有しない無蛋
白質培地中で動物細胞を培養することを特徴とする動物
細胞の培養方法である。更に本発明は、トコフェロー
ル、レチノール、レシチン及びパントテン酸ナトリウム
からなる群から選ばれる一種以上の低分子物質を含有
し、蛋白質成分を含有しない無蛋白質培地中で動物細胞
を培養することを特徴とする動物細胞が生産する蛋白質
の製造方法である。以下本発明を詳細に説明する。
That is, the present invention is a protein-free medium for animal cell culture, which contains one or more low-molecular substances selected from the group consisting of tocopherol, retinol, lecithin and sodium pantothenate and does not contain a protein component. Further, the present invention is characterized by culturing animal cells in a protein-free medium containing at least one low-molecular substance selected from the group consisting of tocopherol, retinol, lecithin and sodium pantothenate, and containing no protein component. This is a method for culturing animal cells. The present invention further comprises tocopherol, retinol, lecithin and sodium pantothenate containing one or more low-molecular substances selected from the group consisting of culturing animal cells in a protein-free medium containing no protein component. It is a method for producing a protein produced by an animal cell. The present invention will be described in detail below.

【0011】本発明の培地は、トコフェロール(トコフ
ェロールアセテートを含む)、レチノール(レチノール
アセテートを含む)、レシチン(卵黄レシチン又は大豆
レシチン)及びパントテン酸ナトリウムからなる群から
選ばれる一種以上の低分子物質を含有し、蛋白質成分を
含有しない。前記低分子物質以外の成分は、蛋白質、細
胞成長因子、ホルモン及びステロイド等の蛋白質成分を
含有しない、ビタミン類、アミノ酸、糖質及び塩類等か
らなる基礎培地等の従来の無蛋白質培地の成分と同一で
良い。例えば市販のE−RDF培地(極東製薬製)、R
PMI−1640(GIBCO製)、DMEM(GIB
CO製)及びF−12(GIBCO製)を2:1:1の
比率で混合した培地、更にDMEMとF−12を1:1
の比率で混合した培地に、無蛋白質培地を構築するクエ
ン酸鉄や硫酸鉄等の鉄成分、2−エタノールアミン、亜
セレン酸ナトリウム、タウリン、リノール酸又はオレイ
ン酸などを添加したものが例示できるが、これらに限定
されない。
The medium of the present invention comprises one or more low molecular weight substances selected from the group consisting of tocopherol (including tocopherol acetate), retinol (including retinol acetate), lecithin (egg yolk lecithin or soybean lecithin) and sodium pantothenate. Contains and does not contain protein components. The components other than the low molecular weight substances are proteins, cell growth factors, hormones, steroids, and other protein-free components, and components of conventional protein-free media such as basal media consisting of vitamins, amino acids, sugars and salts. It can be the same. For example, commercially available E-RDF medium (manufactured by Kyokuto Pharmaceutical), R
PMI-1640 (manufactured by GIBCO), DMEM (GIB
CO) and F-12 (GIBCO) at a ratio of 2: 1: 1, and DMEM and F-12 at 1: 1.
In the medium mixed in the ratio of, iron components such as iron citrate and iron sulfate to construct a protein-free medium, 2-ethanolamine, sodium selenite, taurine, linoleic acid or oleic acid can be added. However, it is not limited to these.

【0012】より具体的には、本発明の無蛋白質培地の
含有成分は、例えば、トコフェロール(トコフェロール
アセテートを含む)、レチノール(レチノールアセテー
トを含む)、レシチン(卵黄レシチン又は大豆レシチ
ン)及びパントテン酸ナトリウムからなる群から選ばれ
る一種以上、好ましくは三種以上、そして特に好ましく
は四種の低分子物質の他に、クエン酸第二鉄、2−エタ
ノ−ルアミン、亜セレン酸ナトリウム、タウリン、L−
アラニン、L−アルギニン、L−アスパラギン、L−ア
スパラギン酸、L−システイン、L−グルタミン、L−
グルタミン酸グリシン、L−ヒスチジン、L−ヒドロキ
シプロリン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リ
ジン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−プ
ロリン、L−セリン、L−スレオニン、L−トリプトフ
ァン、L−チロシン、L−バリン、グルタチオン、パラ
アミノ安息香酸、ビオチン、パントテン酸カルシウム、
酒石酸コリン(又は塩化コリン)、葉酸、イノシト−
ル、ニコチン酸アミド、塩酸ピリドキサ−ル、塩酸ピリ
ドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、ビタミンB1
2、リポ酸、ヒポキサンチン、プトレッシン二塩酸塩、
チミジン、リノ−ル酸(又はオレイン酸)、塩化ナトリ
ウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウ
ム、リン酸一水素ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、
硫酸銅、D−グルコ−ス、硫酸第一鉄、硫酸亜鉛、HE
PES及び炭酸水素ナトリウムを含む培地を例示でき
る。なお、上記本発明の培地の好適例においては、スト
レプトマイシンやペニシリンGカリウム等の抗生物質
や、フェノ−ルレッド等のpH指示薬を含んでいても良
い。
More specifically, the components contained in the protein-free medium of the present invention include, for example, tocopherol (including tocopherol acetate), retinol (including retinol acetate), lecithin (egg yolk lecithin or soybean lecithin) and sodium pantothenate. In addition to one or more selected from the group consisting of, preferably three or more, and particularly preferably four low molecular weight substances, ferric citrate, 2-ethanolamine, sodium selenite, taurine, L-
Alanine, L-arginine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-cysteine, L-glutamine, L-
Glycine glutamate, L-histidine, L-hydroxyproline, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L- Tyrosine, L-valine, glutathione, para-aminobenzoic acid, biotin, calcium pantothenate,
Choline tartrate (or choline chloride), folic acid, inosito-
, Nicotinic acid amide, pyridoxal hydrochloride, pyridoxine hydrochloride, riboflavin, thiamine hydrochloride, vitamin B1
2, lipoic acid, hypoxanthine, putrescine dihydrochloride,
Thymidine, linoleic acid (or oleic acid), sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, magnesium sulfate, sodium monohydrogen phosphate, sodium pyruvate,
Copper sulfate, D-glucose, ferrous sulfate, zinc sulfate, HE
A medium containing PES and sodium hydrogen carbonate can be exemplified. The preferable examples of the medium of the present invention may contain antibiotics such as streptomycin and potassium penicillin G, and a pH indicator such as phenol red.

【0013】前記各低分子成分は、培地中でトコフェロ
ール(トコフェロールアセテートを含む)は0.1〜
1.0、好ましくは0.2〜0.5μg/ml程度、レ
チノ−ル(レチノールアセテートを含む)は0.01〜
0.2、好ましくは0.05〜0.2μg/mL程度、
レシチン(卵黄レシチン又は大豆レシチン)は0.1〜
2.0好ましくは0.3〜1.0μg/mL程度、パン
トテン酸ナトリウムは5〜50、好ましくは10〜20
μM程度の濃度となるように添加すれば良い。例えば、
トコフェロール(及び/又はトコフェロールアセテー
ト)、レチノール(及び/又はレチノールアセテー
ト)、レシチン(卵黄レシチン及び/又は大豆レシチ
ン)は、エタノール溶液等に、例えばトコフェロールア
セテート100mg/mL、レチノールアセテート10
mg/mL、卵黄レシチン100mg/mLを溶解して
高濃度添加剤溶液を調製し、一方パントテン酸ナトリウ
ムは300mM程度の高濃度水溶液として調製し、これ
らを前記濃度となるように添加するようにしても良い。
Each of the low molecular weight components contains 0.1 to 0.1 tocopherol (including tocopherol acetate) in the medium.
1.0, preferably about 0.2 to 0.5 μg / ml, retinal (including retinol acetate) 0.01 to
0.2, preferably about 0.05 to 0.2 μg / mL,
Lecithin (egg yolk lecithin or soy lecithin) is 0.1
2.0 preferably 0.3 to 1.0 μg / mL, sodium pantothenate 5 to 50, preferably 10 to 20
It may be added at a concentration of about μM. For example,
Tocopherol (and / or tocopherol acetate), retinol (and / or retinol acetate), lecithin (egg yolk lecithin and / or soybean lecithin) can be added to an ethanol solution, for example, tocopherol acetate 100 mg / mL, retinol acetate 10
mg / mL and egg yolk lecithin 100 mg / mL were dissolved to prepare a high-concentration additive solution, while sodium pantothenate was prepared as a high-concentration aqueous solution of about 300 mM, and these were added to the above concentrations. Is also good.

【0014】低分子物質は、トコフェロール、レチノー
ル、レシチン及びパントテン酸ナトリウムからなる群か
ら選ばれる一種以上が含有されていることで蛋白質成分
の欠損を補う効果を達成できるが、その効果は微弱にな
りやすく、しかも培養されるべき動物細胞が限定される
場合がある。従って、前記群から選ばれる三種類以上を
添加することがより好ましいが、より多種類の動物細胞
についてより高い効果を達成するには、前記群の全ての
低分子物質を添加することが最も好ましい。
The low molecular weight substance can achieve the effect of compensating for the deficiency of the protein component by containing one or more selected from the group consisting of tocopherol, retinol, lecithin and sodium pantothenate, but the effect becomes weak. It is easy, and the animal cells to be cultured may be limited. Therefore, it is more preferable to add three or more kinds selected from the above group, but it is most preferable to add all the low molecular weight substances of the above group to achieve a higher effect for a larger number of kinds of animal cells. .

【0015】本発明の無蛋白質培地によれば、特に制限
されることなく動物細胞を好適に培養することが可能で
ある。しかしながら、蛋白質生物を含有しないことによ
り培地中に分泌された蛋白質の精製を容易とする本発明
の効果を思慮すれば、本発明の無蛋白質培地は、蛋白質
を産生する目的で調製された動物細胞、例えば抗体遺伝
子を発現し得る組換え動物細胞や抗体を産生し得る動物
融合細胞に対して特に好適に使用される。動物細胞とし
て例えば、特殊な蛋白質を産生するヒトを初めとする動
物細胞、遺伝子工学的操作によりマウス−ヒトキメラ抗
体を暗号化する遺伝子を含むベクタ−でトランスフォ−
ムされたCOS細胞やCHO細胞、また例えばモノクロ
−ナル抗体を産生し得るマウス−ヒト、マウス−マウ
ス、マウス−ラット等のハイブリド−マに代表される融
合細胞を例示することができる。
According to the protein-free medium of the present invention, animal cells can be preferably cultivated without any particular limitation. However, considering the effect of the present invention that facilitates the purification of the protein secreted in the medium by not containing the protein organism, the protein-free medium of the present invention is the animal cell prepared for the purpose of producing the protein. It is particularly preferably used for recombinant animal cells capable of expressing antibody genes and animal fused cells capable of producing antibodies. As an animal cell, for example, an animal cell such as a human that produces a special protein, or a vector containing a gene encoding a mouse-human chimeric antibody by genetic engineering is transformed.
Examples thereof include fused COS cells and CHO cells, and fused cells represented by hybridomas such as mouse-human, mouse-mouse, mouse-rat, etc. capable of producing a monoclonal antibody.

【0016】本発明の無蛋白質培地に、前記の動物細胞
中、所望の細胞を入れ、適当な条件下に保持すること
で、該細胞を培養することが可能である。培養条件は、
いずれの細胞を培養するのかにより決定すれば良いが、
例えばマウス−ラットのハイブリド−マであれば通常3
7℃程度で保持することが例示できる。また、動物細胞
培養用の各種の培養装置、例えば発酵槽型タンク培養装
置、パーフュージョン式培養装置、マイクロキャリアー
型培養装置、ホローファイバー型培養装置等を用いてハ
イブリド−マ等を培養することもできる。
It is possible to culture the above-mentioned animal cells by placing the desired cells in the protein-free medium of the present invention and keeping them under appropriate conditions. The culture conditions are
It may be determined depending on which cell is to be cultured,
For example, in the case of a mouse-rat hybridoma, it is usually 3
It can be exemplified that the temperature is maintained at about 7 ° C. Further, it is also possible to culture hybridomas using various culturing devices for culturing animal cells, for example, fermenter-type tank culturing devices, perfusion-type culturing devices, microcarrier-type culturing devices, hollow fiber-type culturing devices, and the like. it can.

【0017】培養操作を実施することにより、動物細胞
により生産された蛋白質を培地中に得ることができる。
動物細胞の蛋白質の生産は、単にそれを培養するのみで
良いものや、特殊な操作を必要とするものも存在する
(例えばトランスフォ−マントにおける蛋白質発現の誘
導等)が、そのような操作又は条件等は培養する動物細
胞により適宜決定すれば良い。例えばマウス−ラットの
ハイブリド−マでは、前記のような条件下で培養を実施
することにより、5日後程度で所望の蛋白質を培地中に
得ることができる(諸条件により変動するが)。
By carrying out the culture operation, the protein produced by the animal cell can be obtained in the medium.
For production of protein in animal cells, there are some which require only a simple culture and those which require a special operation (for example, induction of protein expression in a transformant). The conditions and the like may be appropriately determined depending on the animal cell to be cultured. For example, in a mouse-rat hybridoma, the desired protein can be obtained in the medium in about 5 days by culturing under the conditions described above (although it varies depending on various conditions).

【0018】[0018]

【発明の効果】本発明の動物細胞用無蛋白質培地は、ト
コフェロール、レチノール、レシチン及びパントテン酸
ナトリウムからなる群から選ばれる一種以上の低分子物
質を含有することで、牛胎児血清等の高価で品質のばら
つきが大きい蛋白質成分を使用すること無く、動物細胞
を培養することが可能である。従って、牛胎児血清等の
蛋白質成分を含有する従来の培地と比較して、安価で、
しかも培養結果の再現性が良好な培地である。この結
果、本発明の培養方法では常に一定の培養結果の得られ
る、再現性の良い培養が可能である。また本発明の蛋白
質の製造方法においては、安価に、かつ一定の収率で所
望の蛋白質を得ることが可能となる。
The protein-free medium for animal cells of the present invention contains at least one low-molecular substance selected from the group consisting of tocopherol, retinol, lecithin and sodium pantothenate, so that it is expensive such as fetal bovine serum. It is possible to culture animal cells without using a protein component having a large variation in quality. Therefore, it is cheaper than conventional media containing protein components such as fetal bovine serum,
Moreover, the medium has good reproducibility of culture results. As a result, according to the culture method of the present invention, it is possible to perform culture with good reproducibility and to always obtain a constant culture result. In addition, the method for producing a protein of the present invention makes it possible to obtain a desired protein at a low yield and in a constant yield.

【0019】特に本発明の蛋白質の製造方法において
は、培養操作を実施した後、製造された蛋白質について
の精製操作を簡便にすることができる。例えば、製造し
たモノクロ−ナル抗体等を体内診断薬や体内治療薬に用
いる場合は、夾雑物質、特に蛋白質成分を完全に除去す
る必要があるが、本来蛋白質成分を含有しない本発明の
無蛋白質培地を使用した場合、比較的容易な精製操作で
夾雑物を除去し得る。
In particular, in the method for producing a protein of the present invention, after carrying out the culture operation, the purification operation for the produced protein can be simplified. For example, when the produced monoclonal antibody or the like is used as an in-vivo diagnostic agent or in-vivo therapeutic agent, it is necessary to completely remove contaminants, especially protein components, but the protein-free medium of the present invention that does not originally contain protein components If used, contaminants can be removed by a relatively easy purification operation.

【0020】本発明によれば、牛胎児血清等の蛋白質成
分やトコフェロール、レチノール、レシチン及びパント
テン酸ナトリウムからなる群から選ばれる一種以上の低
分子物質を含有していない従来の培地では培養すること
が困難だった動物細胞や、このような従来の培地では成
育が悪かったハイブリドーマ等の動物細胞について良好
な培養を達成できる。従って、ハイブリド−マ等を培養
した場合には、より高収率で、かつ、長期的に該収率を
維持しつつ、モノクロ−ナル抗体等を製造することが可
能になる。
According to the present invention, culturing is carried out in a conventional medium that does not contain protein components such as fetal bovine serum and one or more low molecular weight substances selected from the group consisting of tocopherol, retinol, lecithin and sodium pantothenate. It is possible to achieve good culturing of animal cells that have been difficult to grow and animal cells such as hybridomas that have been poorly grown in such conventional media. Therefore, when a hybridoma or the like is cultured, it becomes possible to produce a monoclonal antibody or the like with a higher yield and maintaining the yield for a long period of time.

【0021】また実施例に記載したように、細胞培養装
置を用いた連続培養によるモノクローナル抗体の生産に
おいても、トコフェロール、レチノール、レシチン及び
パントテン酸ナトリウムからなる群から選ばれる一種以
上の低分子物質を含有していない、従来の培地に比較し
て、長期間高い製造量を維持できる良好な培養結果を達
成することができる。
Further, as described in Examples, in the production of monoclonal antibodies by continuous culture using a cell culture device, one or more low molecular weight substances selected from the group consisting of tocopherol, retinol, lecithin and sodium pantothenate are used. It is possible to achieve a good culture result that can maintain a high production amount for a long period of time as compared with a conventional medium that does not contain it.

【0022】[0022]

【実施例】以下本発明を更に詳細に説明するために実施
例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。
EXAMPLES Examples will be shown below for illustrating the present invention further in detail, but the present invention is not limited to these examples.

【0023】実施例1 初めにトコフェロールアセテート、レチノールアセテー
ト、卵黄レシチン、パントテン酸ナトリウムの個々の成
分についての検討を行った。
Example 1 First, the individual components of tocopherol acetate, retinol acetate, egg yolk lecithin, and sodium pantothenate were examined.

【0024】8%牛胎児血清を含むE−RDF培地(極
東製薬製)で継代培養したマウス細胞同志のハイブリド
ーマP7及びH6を、10μMタウリン、50μMクエ
ン酸第2鉄、25nM亜セレン酸ナトリウム、100μ
M2−エタノールアミン及び0.5μg/mLリノール
酸を含むE−RDF培地(以下、培地Aとする)で7日
間培養した。トコフェロールアセテート(シグマ製)を
1mg/mlでエタノールに溶解した溶液を、表1に示
した最終濃度となるように培地Aに添加した培地で細胞
濃度5×104 cells/mLとした前記培養物を播
種し、37℃、5%CO2 のインキュベーター条件で培
養を開始し、4日間培養して生細胞濃度を測定した。結
果を表1に示す。表1から、トコフェロールアセテート
により良好な成育が実現されること及びその至的濃度が
0.5μg/mLであることが分かる。
Hybridomas P7 and H6 of mouse cells subcultured in E-RDF medium (manufactured by Kyokuto Pharmaceutical Co.) containing 8% fetal bovine serum were mixed with 10 μM taurine, 50 μM ferric citrate, 25 nM sodium selenite, 100μ
The cells were cultured in an E-RDF medium containing M2-ethanolamine and 0.5 μg / mL linoleic acid (hereinafter referred to as medium A) for 7 days. Tocopherol acetate (manufactured by Sigma) was dissolved in ethanol at 1 mg / ml and added to medium A so that the final concentration shown in Table 1 was obtained, and the culture was made to have a cell concentration of 5 × 10 4 cells / mL. Was inoculated, the culture was started under the incubator conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 , and the cells were cultured for 4 days to measure the viable cell concentration. The results are shown in Table 1. From Table 1 it can be seen that good growth is achieved with tocopherol acetate and its optimal concentration is 0.5 μg / mL.

【0025】[0025]

【表1】 [Table 1]

【0026】実施例2 レチノールアセテート(シグマ製)を1mg/mlでエ
タノールに溶解した溶液を表2に示した最終濃度となる
ように培地Aに添加した培地を使用した以外は実施例1
と同様の操作を行った。結果を表2に示す。表2から、
レチノールアセテートにより良好な成育が実現されるこ
と及びその至的濃度が0.05μg/mLであることが
分かる。
Example 2 Example 1 was repeated except that a medium prepared by dissolving retinol acetate (manufactured by Sigma) in ethanol at 1 mg / ml was added to the medium A to give the final concentration shown in Table 2.
The same operation was performed. The results are shown in Table 2. From Table 2,
It can be seen that good growth is achieved with retinol acetate and its optimal concentration is 0.05 μg / mL.

【0027】[0027]

【表2】 [Table 2]

【0028】実施例3 卵黄レシチン(シグマ製)を1mg/mlでエタノール
に溶解した溶液を表3に示した最終濃度となるように培
地Aに添加した培地を使用した以外は実施例1と同様の
操作を行った。結果を表3に示す。表3から、卵黄レシ
チンにより良好な成育が実現されること及びその至的濃
度が0.5μg/mLであることが分かる。
Example 3 Similar to Example 1 except that a solution prepared by dissolving egg yolk lecithin (manufactured by Sigma) in ethanol at 1 mg / ml was added to the medium A so that the final concentration shown in Table 3 was obtained. The operation was performed. The results are shown in Table 3. From Table 3, it can be seen that good growth is achieved by egg yolk lecithin and its optimum concentration is 0.5 μg / mL.

【0029】[0029]

【表3】 [Table 3]

【0030】実施例4 パントテン酸ナトリウム(東京化成)の100mM水溶
液を表4に示した最終濃度となるように培地Aに添加し
た培地を使用した以外は実施例1と同様の操作を行っ
た。結果を表4に示す。表4から、パントテン酸ナトリ
ウムより良好な成育が実現されること及びその至的濃度
が15μMであることが分かる。
Example 4 The same operation as in Example 1 was performed, except that a 100 mM aqueous solution of sodium pantothenate (Tokyo Kasei) was added to the medium A so that the final concentration shown in Table 4 was obtained. The results are shown in Table 4. From Table 4 it can be seen that better growth is achieved than sodium pantothenate and its optimal concentration is 15 μM.

【0031】[0031]

【表4】 [Table 4]

【0032】実施例5 8%牛胎児血清を含むE−RDF培地(極東製薬製)で
継代培養したマウス細胞同志のハイブリドーマQ5及び
C4を、実施例1で示した培地Aと、培地Aにトコフェ
ロールアセテート100mg/mL、レチノールアセテ
ート10mg/mL、卵黄レシチン100mg/mLの
濃度で含むエタノール溶液の1/200000容量と3
00mMパントテン酸ナトリウム水溶液の1/2000
0容量を添加し、0.5μg/mLトコフェロールアセ
テート、0.05μg/mLレチノールアセテート、
0.5μg/mL卵黄レシチン、15μMパントテン酸
ナトリウムとした培地(以下、培地Bとする)を用いて
培養した。細胞濃度5×104 cells/mLで培地
A又はBでディッシュに播種し、37℃、5%CO
インキュベーター条件で培養を開始し、7日の間培養し
て生細胞濃度を測定した。
Example 5 Hybridomas Q5 and C4 of mouse cells subcultured in E-RDF medium (manufactured by Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 8% fetal bovine serum were added to medium A and medium A shown in Example 1. 1/20000 volume and 3 of ethanol solution containing tocopherol acetate 100 mg / mL, retinol acetate 10 mg / mL, and egg yolk lecithin 100 mg / mL.
1/2000 of 00 mM sodium pantothenate solution
0 volume was added, 0.5 μg / mL tocopherol acetate, 0.05 μg / mL retinol acetate,
Culture was performed using a medium (hereinafter referred to as medium B) in which 0.5 μg / mL egg yolk lecithin and 15 μM sodium pantothenate were used. They were seeded in dishes in medium A or B at a cell concentration 5 × 10 4 cells / mL, 37 ℃, of 5% CO 2
Culturing was started under incubator conditions, and the cells were cultured for 7 days to measure the viable cell concentration.

【0033】ハイブリド−マQ5に関する結果を図1
に、C4に関する結果を図2にそれぞれ示す。図1及び
2から、ハイブリド−マQ5及びC4とも培地Aに比べ
て培地Bにおいて良好な成育を示すことが分かる。
Results for hybridoma Q5 are shown in FIG.
The results for C4 are shown in FIG. It can be seen from FIGS. 1 and 2 that hybridomas Q5 and C4 both showed better growth in medium B than medium A.

【0034】実施例6 培養装置を用いたモノクローナル抗体の連続製造を、ホ
ローファイバー型細胞培養装置を用いて試みた。
Example 6 Continuous production of a monoclonal antibody using a culture device was tried using a hollow fiber type cell culture device.

【0035】培養装置(カルチャーフローT/C−11
00、旭メディカル製)に、ホローファイバーバイオリ
アクター(セルファームBR1930、ユニシン・ファ
イバーテック製)を取り付け、実施例5で用いた培地A
及びBを用いてマウス細胞同志のハイブリドーマP7の
培養を行い、製造されたモノクローナル抗体の生産量を
比較した。
Culture device (Culture Flow T / C-11
00, manufactured by Asahi Medical Co., Ltd., and a hollow fiber bioreactor (Cellfirm BR1930, manufactured by Unisin Fibertech) was attached to the medium A used in Example 5.
Hybridomas P7 of mouse cells were cultured using B and B, and the production amounts of the produced monoclonal antibodies were compared.

【0036】詳しくは、それぞれ6×10個の細胞
をホローファイバーバイオリアクターに播種し、2日
間、3%牛胎児血清を含む培地Aで培養した後に、培地
A又は培地Bに切り替えて培養を継続した。培養は、3
7℃で、培地循環流量、培地供給量及び酸素供給量を徐
々に増やし、10日目からは培地循環流量を320mL
/分、培地供給量を3.2L/日、酸素供給量を40m
L/分、空気供給量を40mL/分とした。
More specifically, 6 × 10 8 cells each were seeded in a hollow fiber bioreactor, cultured for 2 days in medium A containing 3% fetal bovine serum, and then switched to medium A or medium B for culturing. Continued. Culture is 3
At 7 ° C, gradually increase the medium circulation flow rate, medium supply rate, and oxygen supply rate, and from the 10th day, increase the medium circulation rate to 320 mL.
/ Min, medium supply 3.2 L / day, oxygen supply 40 m
L / min, and air supply rate was 40 mL / min.

【0037】この結果、培地Aでは10日目ごろから1
60mg/日程度の製造量が達成できたものの、製造量
の変動が大きく、培養開始後35日目ぐらいから製造量
は徐々に低下した。それに対して培地Bでは、製造量は
安定しており、10〜62日に渡って160〜180m
g/日もの製造量が達成され、62日間の合計で約9.
6gのモノクロ−ナル抗体を製造することができた。ち
なみに培地Aを用いた場合の62日間での総製造量は、
約8.5gであった。このように、長期的培養におい
て、培地Bは、高い、一定の生産性を維持できることが
分かる。
As a result, in the medium A, about 1 day from 1
Although the production amount of about 60 mg / day was achieved, the production amount varied greatly, and the production amount gradually decreased from about 35 days after the start of the culture. On the other hand, in the medium B, the production amount is stable and 160 to 180 m over 10 to 62 days.
Production of as much as g / day was achieved, with a total of approximately 9.
It was possible to produce 6 g of monoclonal antibody. By the way, the total amount of production in 62 days using medium A is
It was about 8.5 g. Thus, it can be seen that medium B can maintain high and constant productivity in long-term culture.

【0038】培地Bを用いた場合の結果を図3に示す。The results obtained when the medium B was used are shown in FIG.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図1】実施例5における、ハイブリド−マQ5を培養
した時の結果を示す。図中縦軸は細胞数を、横軸は培地
A又はBを用いて培養を開始してからの培養日数をそれ
ぞれ示す。
FIG. 1 shows the results when hybridoma Q5 was cultured in Example 5. In the figure, the vertical axis represents the number of cells, and the horizontal axis represents the number of culture days since the culture was started using the medium A or B.

【図2】実施例5における、ハイブリド−マC4を培養
した時の結果を示す。図中縦軸は細胞数を、横軸は培地
A又はBを用いて培養を開始してからの培養日数をそれ
ぞれ示す。
FIG. 2 shows the results of culturing hybridoma C4 in Example 5. In the figure, the vertical axis represents the number of cells, and the horizontal axis represents the number of culture days since the culture was started using the medium A or B.

【図3】実施例6における、ハイブリド−マPを培地B
を用いて培養した時の結果を示す。図中縦軸は細胞数
を、横軸は培地Bを用いて培養を開始してからの培養日
数をそれぞれ示す。
FIG. 3 shows that the hybridoma P was added to medium B in Example 6.
The result when cultured using is shown. In the figure, the vertical axis represents the number of cells, and the horizontal axis represents the number of culture days since the culture was started using the medium B.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 //(C12N 5/10 C12R 1:91) (C12P 21/00 C12R 1:91) (C12P 21/08 C12R 1:91) C12R 1:91) ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Office reference number FI technical display location // (C12N 5/10 C12R 1:91) (C12P 21/00 C12R 1:91) (C12P 21 / 08 C12R 1:91) C12R 1:91)

Claims (13)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項1】 トコフェロール、レチノール、レシチン
及びパントテン酸ナトリウムからなる群から選ばれる一
種以上の低分子物質を含有し、蛋白質成分を含有しない
動物細胞培養用無蛋白質培地。
1. A protein-free medium for animal cell culture containing one or more low-molecular substances selected from the group consisting of tocopherol, retinol, lecithin and sodium pantothenate, and containing no protein component.
【請求項2】 動物細胞が抗体遺伝子を発現し得る組換
え動物細胞又は抗体を産生し得る動物融合細胞である請
求項1の動物細胞培養用無蛋白質培地。
2. The protein-free medium for animal cell culture according to claim 1, wherein the animal cell is a recombinant animal cell capable of expressing an antibody gene or an animal fused cell capable of producing an antibody.
【請求項3】 トコフェロール、レチノール、レシチン
及びパントテン酸ナトリウムからなる群から選ばれる三
種以上の低分子物質を含有することを特徴とする、請求
項1の培地。
3. The culture medium according to claim 1, which contains at least three kinds of low molecular weight substances selected from the group consisting of tocopherol, retinol, lecithin and sodium pantothenate.
【請求項4】 トコフェロール、レチノール、レシチン
及びパントテン酸ナトリウムを含有することを特徴とす
る請求項1の培地。
4. The medium according to claim 1, which contains tocopherol, retinol, lecithin and sodium pantothenate.
【請求項5】 トコフェロール、レチノール、レシチン
及びパントテン酸ナトリウムからなる群から選ばれる一
種以上の低分子物質を含有し、蛋白質成分を含有しない
無蛋白質培地中で動物細胞を培養することを特徴とする
動物細胞の培養方法。
5. A method for culturing animal cells in a protein-free medium containing at least one low-molecular substance selected from the group consisting of tocopherol, retinol, lecithin and sodium pantothenate and containing no protein component. Method for culturing animal cells.
【請求項6】 動物細胞が抗体遺伝子を発現し得る組換
え動物細胞又は抗体を産生し得る動物融合細胞である請
求項5の培養方法。
6. The culture method according to claim 5, wherein the animal cell is a recombinant animal cell capable of expressing an antibody gene or an animal fused cell capable of producing an antibody.
【請求項7】 培地が、トコフェロール、レチノール、
レシチン及びパントテン酸ナトリウムからなる群から選
ばれる三種以上の低分子物質を含有することを特徴とす
る請求項5の培養方法。
7. The medium is tocopherol, retinol,
The culture method according to claim 5, which comprises three or more low-molecular substances selected from the group consisting of lecithin and sodium pantothenate.
【請求項8】 培地が、トコフェロール、レチノール、
レシチン及びパントテン酸ナトリウムを含有することを
特徴とする請求項5の培養方法。
8. The medium is tocopherol, retinol,
The culture method according to claim 5, which comprises lecithin and sodium pantothenate.
【請求項9】 トコフェロール、レチノール、レシチン
及びパントテン酸ナトリウムからなる群から選ばれる一
種以上の低分子物質を含有し、蛋白質成分を含有しない
無蛋白質培地中で動物細胞を培養することを特徴とする
動物細胞が生産する蛋白質の製造方法。
9. A method for culturing animal cells in a protein-free medium containing at least one low-molecular substance selected from the group consisting of tocopherol, retinol, lecithin and sodium pantothenate and containing no protein component. A method for producing a protein produced by an animal cell.
【請求項10】 動物細胞が抗体遺伝子を発現し得る組
換え動物細胞であり、製造される蛋白質が抗体活性を有
する蛋白質であることを特徴とする請求項9の製造方
法。
10. The method according to claim 9, wherein the animal cell is a recombinant animal cell capable of expressing an antibody gene, and the protein produced is a protein having antibody activity.
【請求項11】 動物細胞が抗体を産生し得る融合動物
細胞であり、製造される蛋白質がモノクロ−ナル抗体で
あることを特徴とする請求項9の製造方法。
11. The method according to claim 9, wherein the animal cell is a fused animal cell capable of producing an antibody, and the protein produced is a monoclonal antibody.
【請求項12】 培地が、トコフェロール、レチノー
ル、レシチン及びパントテン酸ナトリウムからなる群か
ら選ばれる三種以上の低分子物質を含有するものである
ことを特徴とする、請求項9の製造方法。
12. The method according to claim 9, wherein the medium contains three or more low-molecular substances selected from the group consisting of tocopherol, retinol, lecithin and sodium pantothenate.
【請求項13】 培地がトコフェロール、レチノール、
レシチン及びパントテン酸ナトリウムを含有するもので
あることを特徴とする、請求項9の製造方法。
13. The medium is tocopherol, retinol,
The method according to claim 9, which comprises lecithin and sodium pantothenate.
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