JPH07231782A - Microorganism producing alkali-resistant cellulase - Google Patents
Microorganism producing alkali-resistant cellulaseInfo
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- JPH07231782A JPH07231782A JP23579794A JP23579794A JPH07231782A JP H07231782 A JPH07231782 A JP H07231782A JP 23579794 A JP23579794 A JP 23579794A JP 23579794 A JP23579794 A JP 23579794A JP H07231782 A JPH07231782 A JP H07231782A
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は新規なアルカリ耐性セル
ラーゼを産生する微生物に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a microorganism which produces a novel alkali-tolerant cellulase.
【0002】[0002]
【従来の技術】繊維素分解酵素セルラーゼの開発は、従
来、バイオマス資源、特にセルロース資源の有効利用を
一大目標として進められてきた。セルラーゼ生産菌とし
て分離されてきた菌株は多種類にわたり、アルペルギル
ス属、ペニシリウム属、トリコデルマ属、フザリウム
属、フミコーラ属、アクレモニウム属等の糸状菌を中心
に、シュードモナス属、セルロモナス属、ルミノコッカ
ス属、バチルス属等の細菌、更に、ストレプトマイセス
属、サーモアクチノマイセス属等の放線菌でも報告され
ている。しかしながら、現時点では、バイオマス用セル
ラーゼの工業的規模での利用は、多くはない。2. Description of the Related Art Development of cellulase, which is a fibrinolytic enzyme, has hitherto been promoted with the aim of effectively utilizing biomass resources, particularly cellulose resources. Strains that have been isolated as cellulase-producing bacteria are of a wide variety, mainly Algalilus genus, Penicillium genus, Trichoderma genus, Fusarium genus, Humicola genus, Acremonium and other filamentous fungi, Pseudomonas sp., Cellulomonas sp., Luminococcus sp., It has also been reported in bacteria such as Bacillus and actinomycetes such as Streptomyces and Thermoactinomyces. However, at present, the use of biomass cellulase on an industrial scale is not large.
【0003】一方、セルラーゼの新規な産業的用途とし
て、衣料用洗浄剤の配合成分としての利用が検討され注
目を集めている(特公昭59−49279号公報、特公
昭60−23158号公報、特公昭60−36240号
公報)。しかし、自然界において従来見出されたセルラ
ーゼのほとんどは、中性乃至酸性領域に於いて最大且つ
安定な酵素活性を示す、所謂中性若しくは酸性セルラー
ゼに分類されるものであって、衣料用洗浄剤配合成分と
しての必要条件である、アルカリ領域で最大活性を示す
か、あるいはアルカリ耐性を有するセルラーゼ、所謂ア
ルカリセルラーゼ及びアルカリ耐性セルラーゼの存在
は、極めて少ないのが実情である。On the other hand, as a novel industrial use of cellulase, its use as a blending component of a detergent for clothes has been studied and attracted attention (Japanese Patent Publication No. 59-49279, Japanese Patent Publication No. 23158/60). Kokoku 60-36240). However, most of the cellulases hitherto found in nature are classified into so-called neutral or acid cellulases that show the maximum and stable enzyme activity in the neutral or acidic region, and are detergents for clothes. In reality, the presence of cellulases that exhibit maximum activity in the alkaline region or that have alkali resistance, so-called alkali cellulases and alkali-tolerant cellulases, which is a necessary condition as a blending component, is extremely small.
【0004】ここで言うアルカリセルラーゼとは、至適
pHがアルカリ領域にあるものを言い、アルカリ耐性セル
ラーゼとは、至適pHは中性から酸性領域にあるが、アル
カリ領域に於いても至適pHに於ける活性に比較して充分
に活性を有し且つ安定性を保持するものを言う。The alkaline cellulase referred to here is optimum
Alkali-tolerant cellulase has a pH in the alkaline region, and the optimum pH is in the neutral to acidic region, but even in the alkaline region, it is sufficiently active as compared with the activity at the optimum pH. Those that have and retain stability.
【0005】また、中性とはpH6〜8の範囲を言い、ア
ルカリ性とはそれ以上のpH範囲を言う。即ち、従来、衣
料用洗浄剤組成物として使用し得るアルカリセルラーゼ
及びアルカリ耐性セルラーゼの生産方法としては、好ア
ルカリ性バチルス属細菌の培養によりセルラーゼAを採
取する方法(特公昭50−28515号公報)、セルロ
モナス属に属する好アルカリ性細菌を培養してアルカリ
セルラーゼ301−Aを生産する方法(特開昭58−2
24686号公報)、好アルカリ性バチルスNo.11
39を培養してカルボキシメチルセルラーゼを生産する
方法(Fukumori,F.,Kudo,T.and
Horikoshi,K.,J.Gen.Micro
biol.,131,3339,(1985))及びス
トレプトマイセス属の一種を用いてアルカリセルラーゼ
を生産する方法(特開昭61−19483号公報)が報
告されているに過ぎず、いずれも工業的発酵生産に適う
ものではなかった。The neutral means a pH range of 6 to 8, and the alkaline means a pH range higher than that. That is, as a conventional method for producing an alkaline cellulase and an alkaline-tolerant cellulase that can be used as a detergent composition for clothes, a method of collecting cellulase A by culturing an alkalophilic Bacillus bacterium (Japanese Patent Publication No. 50285/1975), A method for producing alkaline cellulase 301-A by culturing an alkalophilic bacterium belonging to the genus Cellulomonas (JP-A-58-2)
No. 24686), alkalophilic Bacillus No. 11
A method of culturing 39 to produce carboxymethylcellulase (Fukumori, F., Kudo, T. and
Horikoshi, K .; J. Gen. Micro
biol. , 131, 3339, (1985)) and a method of producing an alkaline cellulase using a kind of Streptomyces genus (Japanese Patent Laid-Open No. 61-19483), both of which are industrial fermentation productions. It was not suitable for.
【0006】ところが、最近、本発明者らは好アルカリ
性微生物の一種であるバチルス エスピー(Bacil
lus sp.)KSM−635(FERM P−88
72)が、衣料用洗浄剤組成物として適したアルカリセ
ルラーゼKを効率良く生産すること、及び更に培養条件
を選択することにより、より高収率で、アルカリセルラ
ーゼKが得られ、アルカリセルラーゼの工業的発酵生産
が可能となることを見出した。However, recently, the present inventors have found that Bacillus sp.
lus sp. ) KSM-635 (FERM P-88
72) efficiently produces alkaline cellulase K suitable as a detergent composition for clothes, and further selects culture conditions to obtain alkaline cellulase K in a higher yield. It has been found that the fermentative production can be achieved.
【0007】[0007]
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記バ
チルス エスピーKSM−635の培養条件は、必ずし
も工業的に有利なものと言えない。即ち、好アルカリ性
菌株は培養中、pHをアルカリ性に保ち続ける必要がある
が、現在までのところ、好アルカリ性菌株を用いる所謂
アルカリ性発酵法の歴史は浅く、通常の中性微生物と比
較するとこれら好アルカリ性微生物の生理、生化学につ
いての知見は充分に蓄積されておらず、工業的発酵生産
を行うにあたっての培地調製、培養方法が操作上の難点
となっていた。However, the culture conditions for Bacillus sp. KSM-635 described above are not necessarily industrially advantageous. That is, the alkalophilic strain needs to keep the pH alkaline during the culture, but so far, the so-called alkaline fermentation method using the alkalophilic strain has a short history, and compared with ordinary neutral microorganisms The knowledge about the physiology and biochemistry of microorganisms has not been sufficiently accumulated, and the medium preparation and culture methods for industrial fermentation production have become operational difficulties.
【0008】[0008]
【課題を解決するための手段】本発明者らはかかる問題
点を解決するためにアルカリ領域に至適pHを有するアル
カリセルラーゼ或いは、アルカリ領域に於いても、至適
pHに於ける最高活性に比較しても高活性を維持し得るア
ルカリ耐性セルラーゼを生産する中性細菌を得べく、中
性領域で生育する菌株を宿主として、該当するセルラー
ゼ遺伝子をクローニングする、所謂遺伝子組換えの手段
と併行し、自然界において該細菌の探索を続けてきた。In order to solve such problems, the present inventors have found that alkaline cellulase having an optimum pH in the alkaline region or even in the alkaline region
In order to obtain a neutral bacterium that produces an alkali-tolerant cellulase that can maintain a high activity even when compared to the highest activity at pH, a strain that grows in a neutral region is used as a host, and the corresponding cellulase gene is cloned. In parallel with the means of gene recombination, we have continued to search for the bacterium in nature.
【0009】そして、その結果、栃木県芳賀郡の土壌か
ら分離した菌株は、アルカリ側においても充分作用を有
し、且つ安定性を保持する、所謂アルカリ耐性セルラー
ゼを産生することを見出し、本発明を完成した。As a result, it was found that the strain isolated from the soil in Haga-gun, Tochigi Prefecture produces a so-called alkali-tolerant cellulase which has a sufficient action even on the alkaline side and retains stability. Was completed.
【0010】本発明の菌株は、次のような菌学的性質を
有する。なお、以下の分類同定において用いた培地は次
の通りである。The strain of the present invention has the following mycological properties. The media used in the classification and identification below are as follows.
【0011】培地 1. 肉エキス,1.0;バクトペ
プトン,1.0;NaCl,0.5;バクト寒天,1.
5(pH7.2)(表示は、重量%;以下同じ) 培地 2. 肉エキス,1.0;バクトペプトン,1.
0;NaCl,0.5(pH7.2) 培地 3. 肉エキス,1.0;バクトペプトン,1.
0;NaCl,0.5;ゼラチン,1.0(pH7.2) 培地 4. バクトリトマスミルク,10.0 培地 5. バクトペプトン,1.0;KNO3,0.
1 培地 6. バクトペプトン,1.0;NaNO3,
1.0 培地 7. バクトペプトン,0.7;NaCl,0.
5;ブドウ糖,0.5(pH7.0) 培地 8. バクトペプトン,1.0 培地 9. TSI寒天(栄研化学社製);指示量 培地10. 肉エキス,1.0;バクトペプトン,1.
0;NaCl,0.5;可溶性澱粉,0.2;寒天,
1.5Medium 1. Meat extract, 1.0; Bacto peptone, 1.0; NaCl, 0.5; Bacto agar, 1.
5 (pH 7.2) (indicated by weight%; the same applies hereinafter) Medium 2. Meat extract, 1.0; Bactopeptone, 1.
0; NaCl, 0.5 (pH 7.2) medium 3. Meat extract, 1.0; Bactopeptone, 1.
0; NaCl, 0.5; gelatin, 1.0 (pH 7.2) medium 4. Bactolithos milk, 10.0 medium 5. Bactopeptone, 1.0; KNO 3 , 0.
1 medium 6. Bactopeptone, 1.0; NaNO 3 ,
1.0 Medium 7. Bactopeptone, 0.7; NaCl, 0.
5; glucose, 0.5 (pH 7.0) medium 8. Bactopeptone, 1.0 medium 9. TSI agar (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.); indicated amount of medium 10. Meat extract, 1.0; Bactopeptone, 1.
0; NaCl, 0.5; soluble starch, 0.2; agar,
1.5
【0012】培地11. NaNH4HPO4・4H
2O,0.15;KH2PO4,0.1;MgSO4・7H
2O,0.02;クエン酸ナトリウム,0.25(pH
6.8) 培地12.クリステンセン培地(栄研化学社製);指示
量 培地13.ブドウ糖,1.0;KH2PO4,0.1;M
gSO4・7H2O,0.05;KCl,0.02;窒素
源,0.1(窒素源は、硝酸ナトリウム及び硫酸アンモ
ニウムを用いた)(pH7.2) 培地14.キングA培地“栄研”(栄研化学社製);指
示量 培地15.キングB培地“栄研”(栄研化学社製);指
示量 培地16.尿素培地“栄研”(栄研化学社製);指示量 培地17.チトクローム・オキシダーゼ試験用濾紙(日
水製薬製) 培地18.3%過酸化水素水 培地19.OF基礎培地(Difco社製);指示量 培地20.(NH4)2HPO4,0.1;KCl,0.
02;MgSO4・7H2O,0.02;酵母エキス,
0.02;バクト寒天,2.0;BCP(0.2%溶
液),0.4Medium 11. NaNH 4 HPO 4 · 4H
2 O, 0.15; KH 2 PO 4, 0.1; MgSO 4 · 7H
2 O, 0.02; sodium citrate, 0.25 (pH
6.8) Medium 12. Kristensen medium (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.); indicated amount of medium 13. Glucose, 1.0; KH 2 PO 4 , 0.1; M
gSO 4 · 7H 2 O, 0.05 ; KCl, 0.02; nitrogen source, 0.1 (nitrogen source, using sodium nitrate and ammonium sulfate) (pH 7.2) medium 14. King A medium "Eiken" (manufactured by Eiken Chemical Co.); indicated amount of medium 15. King B medium "Eiken" (manufactured by Eiken Chemical Co.); indicated amount of medium 16. Urea medium "Eiken" (manufactured by Eiken Chemical Co.); indicated amount of medium 17. Filter paper for cytochrome oxidase test (manufactured by Nissui Pharmaceutical) Medium 18.3% hydrogen peroxide solution Medium 19. OF basal medium (manufactured by Difco); indicated amount of medium 20. (NH 4 ) 2 HPO 4 , 0.1; KCl, 0.
02; MgSO 4 · 7H 2 O , 0.02; yeast extract,
0.02; Bacto agar, 2.0; BCP (0.2% solution), 0.4
【0013】培地21.バクト・サブロー・デキストロ
ース寒天培地(Difco社製);指示量 培地22.肉エキス,0.3;バクトペプトン,0.
5;酵母エキス,1.0;グリセリン,2.0 培地23.フェニルアラニン マロン酸塩培地(日水製
薬社製);指示量 培地24.スキムミルク,5.0;バクト寒天,1.5 培地25.肉エキス,0.3;バクトペプトン,0.
5;L−チロシン,0.5;バクト寒天,1.5Medium 21. Bacto Sabouraud Dextrose Agar Medium (manufactured by Difco); indicated amount Medium 22. Meat extract, 0.3; Bactopeptone, 0.
5; yeast extract, 1.0; glycerin, 2.0 medium 23. Phenylalanine malonate medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical); indicated amount of medium 24. Skim milk, 5.0; Bacto agar, 1.5 medium 25. Meat extract, 0.3; Bactopeptone, 0.
5; L-tyrosine, 0.5; Bacto agar, 1.5
【0014】(菌学的性質) (a)顕微鏡的観察結果 菌体の大きさは、0.4〜0.8μm×1.5〜6.5
μmの桿菌であり、菌体の中央に円柱形又は楕円形の内
生胞子(0.6〜0.8μm×1.0〜2.5μm)を
作る。周鞭毛を有し運動性がある。グラム染色は陽性。
抗酸性はない。(Mycological properties) (a) Microscopic observation results The size of the cells is 0.4 to 0.8 μm × 1.5 to 6.5.
It is a rod-shaped bacterium having a diameter of μm, and columnar or elliptical endospores (0.6 to 0.8 μm × 1.0 to 2.5 μm) are formed in the center of the bacterium. It has periflagellates and is motile. Gram stain is positive.
There is no acid resistance.
【0015】(b)各種培地に於ける生育状態 (1)肉汁寒天平板培養(培地1) 生育状態は弱い。集落の形状は円形であり、表面は円
滑、周縁は円滑である。また集落の色調は淡黄色半透明
で光沢がある。 (2)肉汁寒天斜面培養(培地1) 生育は弱く、その状態は拡布状で光沢が有り、淡黄色半
透明である。 (3)肉汁液体培養(培地2) 生育するが、その状態は弱い。 (4)肉汁ゼラチン穿刺培養(培地3) 表層部に生育し、ゼラチンの液化が認められる。 (5)リトマスミルス培地(培地4) ミルスの液化は認められるが、リトマス色素の明確な変
化はない。(B) Growth condition in various media (1) Meat agar plate culture (medium 1) Growth condition is weak. The shape of the settlement is circular, the surface is smooth and the periphery is smooth. In addition, the color tone of the village is light yellow, semi-transparent and glossy. (2) Meat broth agar slant culture (medium 1) Growth is weak, and the state is spread-like, glossy, and pale yellow and translucent. (3) Broth liquid culture (medium 2) It grows, but its condition is weak. (4) Meat broth gelatin stab culture (medium 3) Grows on the surface layer and liquefaction of gelatin is observed. (5) Litmus millus medium (medium 4) Liquefaction of mils is observed, but there is no clear change in litmus pigment.
【0016】(c)生理学的性質 (1)硝酸塩の還元及び脱窒反応(培地5,培地6) ともに、陰性。 (2)MRテスト(培地7) 陰性、陽性は、はっきりせず(pH5.2)。 (3)VPテスト(培地7) 陰性、陽性は、はっきりせず(pH5.2)。 (4)インドールの生成(培地8) 陰性。 (5)硫化水素の生成(培地9) 陰性。(C) Physiological properties (1) Nitrate reduction and denitrification reactions (medium 5, medium 6) are both negative. (2) MR test (medium 7) Negative and positive are not clear (pH 5.2). (3) VP test (medium 7) Negative and positive are not clear (pH 5.2). (4) Formation of indole (medium 8) Negative. (5) Generation of hydrogen sulfide (medium 9) Negative.
【0017】(6)澱粉の加水分解(培地10) 陽性。 (7)クエン酸の利用(培地11,培地12) コーサ培地及びクリステンセン培地で、ともに陽性。 (8)無機窒素源の利用(培地13) 硝酸塩、アンモニウム塩ともに利用する。 (9)色素の生成(培地14,培地15) 陰性。 (10)ウレアーゼ(培地16) 陰性。(6) Starch hydrolysis (medium 10) Positive. (7) Utilization of citric acid (medium 11 and medium 12) Both were positive in Qosa medium and Kristensen medium. (8) Use of inorganic nitrogen source (medium 13) Both nitrate and ammonium salt are used. (9) Formation of pigment (medium 14, medium 15) Negative. (10) Urease (medium 16) Negative.
【0018】(11)オキシダーゼ(培地17) 陽性。 (12)カタラーゼ(培地18) 陽性。 (13)生育の範囲(培地2) 生育の温度範囲は、15〜50℃、生育最適温度範囲は
25〜40℃ 生育のpH範囲は、pH5〜11、生育最適pH範囲はpH6〜
10であった。(11) Oxidase (medium 17) positive. (12) Catalase (medium 18) positive. (13) Growth range (medium 2) Growth temperature range is 15 to 50 ° C, growth optimum temperature range is 25 to 40 ° C Growth pH range is pH 5 to 11, growth optimum pH range is pH 6 to
It was 10.
【0019】(14)酸素に対する態度 通気嫌気性。 (15)O−Fテスト(培地19) 好気、嫌気ともに生育する。 (16)糖の利用性(培地20)(+:利用する、−:利
用しない)(14) Attitude toward oxygen Aeration anaerobic. (15) OF test (medium 19) Grows both aerobically and anaerobically. (16) Utilization of sugar (medium 20) (+: used, −: not used)
【0020】[0020]
【表1】1.L−アラビノース + 2.D−キシロース + 3.D−グルコース + 4.D−マンノース + 5.D−フラクトース + 6.D−ガラクトース − 7.麦芽糖 − 8.ショ糖 + 9.乳糖 + 10.トレハロース − 11.D−ソルビット + 12.D−マンニット + 13.イノシット + 14.グリセリン + 15.デンプン +[Table 1] 1. L-arabinose + 2. D-xylose + 3. D-glucose + 4. D-mannose + 5. D-fructose +6. D-galactose-7. Maltose-8. Sucrose + 9. Lactose + 10. Trehalose-11. D-Sorbit + 12. D-mannit +13. Inosit + 14. Glycerin + 15. Starch +
【0021】(17)VP培地に於けるpH(培地7) pH5.2 (18)食塩含有培地に於ける生育(改変培地1) 5%で生育する。 7%で生育する。 10%で生育せず。 (19)pH5.7に於ける生成(培地21) 生育する。(17) pH in VP medium (medium 7) pH 5.2 (18) Growth in medium containing salt (modified medium 1) Grow at 5%. Grows at 7%. It does not grow at 10%. (19) Production at pH 5.7 (medium 21) Grows.
【0022】(20)ジハイドロキシアセトンの生成(培
地22) 陰性。 (21)フェニルアラニンの脱アミノ化(培地23) 陰性。 (22)カゼインの分解(培地24) 陽性。 (23)チロシンの分解(培地25) 陰性。(20) Production of dihydroxyacetone (medium 22) Negative. (21) Deamination of phenylalanine (medium 23) Negative. (22) Casein degradation (medium 24) Positive. (23) Degradation of tyrosine (medium 25) Negative.
【0023】以上の菌学的性質について、バージーズ・
マニュアル・オブ・デイタミネイティブ・バクテリオロ
ジー(Bergey’s Mannual of De
terminative Bacteriology)
第8版及びザ・ジーナス・バチルス(“The Gen
us Bacillus”,Ruth,E.Gordo
n著 Agriculture Handbook N
o.427,Agricultural Resear
ch Service,U.S.Department
of Agriculture,Washingto
n D.C.(1973))を参照し比較、検索した結
果、本発明の菌株は、有胞子桿菌であるバチルス(Ba
cillus)属の一種であると認められる。そして本
菌株は、最近、掘越と秋葉(“Alkalophili
c Microorganism”,Japan Sc
ientific Society Press(To
kyo),1982年刊)の主張ている、所謂好アルカ
リ性(Alkalophilic)微生物がpH8以上の
アルカリ培地に於いて生育し、これ以下の中性pH領域で
は生育できないのに対し、弱酸性領域からアルカリ領域
(pH5〜11)に於いて生育が可能であることから、こ
の好アルカリ性微生物とは明らかに異なるものであり、
一般的な中性で生育可能なバチルス属微生物と判断でき
る。Regarding the above-mentioned mycological properties,
Manual of Date Native Bacteriology (Bergey's Manual of De)
terminating Bacteriology)
Eighth Edition and The Genus Bacillus ("The Gen
us Bacillus ", Ruth, E. Gordo
n by Agricultural Handbook N
o. 427, Agricultural Research
ch Service, U. S. Department
of Agricultural, Washingto
n D. C. (1973)), the strain of the present invention was found to be Bacillus (Ba) which is a spore bacillus.
It is recognized as a kind of genus (Cillus). And recently, this strain has been digged in Hikoshi and Akiba (“Alkalophili
c Microorganism ”, Japan Sc
Authentic Society Press (To
Kyo), published in 1982), the so-called alkalophilic microorganism grows in an alkaline medium having a pH of 8 or higher, and cannot grow in a neutral pH range lower than this, whereas from a weakly acidic range to an alkaline range. Since it can grow at (pH 5 to 11), it is clearly different from this alkalophilic microorganism,
It can be judged as a general neutral and viable Bacillus microorganism.
【0024】更に本菌株を他の公知のバチルス属の菌株
と比較すると、最も類縁の種としてバチルス・リケニホ
ルミス(Bacillus licheniformi
s)が挙げられる。しかしながら、公知のリケニホルミ
スに属する菌株と本菌株とを比較すると、硝酸塩の還元
能において相異する。更に上記リケニホルミスに属する
菌株は少なくともアルカリ耐性のセルラーゼを産生しな
いので本発明者らは本菌株を新菌株と判断し、バチルス
エスピー KSM−539と命名して工業技術院微生
物研究所に寄託した(FERM P−9011)。Further, when this strain is compared with other known strains of the genus Bacillus, Bacillus licheniformis is the most closely related species.
s). However, when comparing the known strains belonging to Liqueniformis and this strain, they differ in the reducing ability of nitrate. Furthermore, since the above-mentioned strains belonging to Licheniformis do not produce at least alkali-resistant cellulase, the present inventors determined that this strain is a new strain, and named it Bacillus sp. KSM-539, and deposited it at the Institute of Microbiology, Industrial Technology Institute (FERM. P-9011).
【0025】本発明の菌株を用いてアルカリ耐性セルラ
ーゼ、セルラーゼK−539を得るには、培地に該菌株
を接種し、常法に従って培養すれば良い。培地中には、
資化し得る炭素源及び窒素源を適当量含有せしめておく
ことが好ましい。この炭素源及び窒素源については特に
制限はないが、その例としては、窒素源として無機態の
硝安、硫安、塩安、リン酸アンモニウム、硝酸ソーダ
や、コーングルテンミール、大豆粉、コーンスチープリ
カー、カザミノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、イ
ワシミール、肉エキス、ペプトン、ハイプロ、アジパワ
ー、コーンソイビーンミール、コーヒー粕、綿実油粕、
カルチベータ、アミフレックス及びアジプロン、ゼス
ト、アジックスなどが挙げられる。また、炭素源として
は、籾殻、麸、濾紙、一般紙類、おが屑などの植物繊維
質、廃糖蜜、転化糖、カルボキシメチルセルロース(C
MC)、アビセル、セルロース綿、キシラン、ペクチン
に加え、資化し得る炭素源、例えば、アラビノース、キ
シロース、グルコース、マンノース、フラクトース、ガ
ラクトース、ショ糖、乳糖、ソルビトール、マンニトー
ル、イノシトール、グリセリン、可溶性デンプンや資化
し得る有機酸、例えば酢酸、クエン酸等が挙げられる。
また、その他、リン酸、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn
2+、Co2+、Na+、K+などの無機塩や、必要であれ
ば、無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加すること
もできる。In order to obtain the alkali-tolerant cellulase, cellulase K-539, using the strain of the present invention, a medium may be inoculated with the strain and cultured according to a conventional method. In the medium,
It is preferable that an appropriate amount of assimilable carbon source and nitrogen source be contained. The carbon source and the nitrogen source are not particularly limited, but examples thereof include inorganic ammonium nitrate, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, sodium nitrate as a nitrogen source, corn gluten meal, soybean powder, and corn steep liquor. , Casamino acid, yeast extract, pharma media, sardine meal, meat extract, peptone, hypro, ajpower, corn soybean meal, coffee meal, cottonseed meal,
Examples include cultivators, amiflex and adipron, zest, azix and the like. In addition, as carbon sources, rice husks, malt, filter paper, general papers, plant fiber such as sawdust, molasses, invert sugar, carboxymethyl cellulose (C
MC), Avicel, cellulose cotton, xylan, pectin, and assimilable carbon sources, for example, arabinose, xylose, glucose, mannose, fructose, galactose, sucrose, lactose, sorbitol, mannitol, inositol, glycerin, soluble starch and Examples thereof include organic acids that can be assimilated, such as acetic acid and citric acid.
In addition, phosphoric acid, Mg 2+ , Ca 2+ , Mn 2+ , Zn
Inorganic salts such as 2+ , Co 2+ , Na + , and K + , and if necessary, inorganic and organic micronutrient sources can be appropriately added to the medium.
【0026】斯くして得られた培養物中からの目的物質
であるセルラーゼK−539の採取及び精製は、一般の
酵素の採取及び精製の手段に準じて行うことができる。
即ち、遠心分離又は濾過等の通常の固液分離手段により
菌体を培養液から除去して粗酵素液を得ることができ
る。この粗酵素液は、そのまま使用することもできる
が、必要に応じて、塩析法、沈澱法、限外濾過法等の分
離手段により粗酵素を得、更に公知の方法により精製結
晶化して、精製酵素として使用することも可能である。Collection and purification of cellulase K-539, which is a target substance, from the thus obtained culture can be carried out according to a general enzyme collection and purification means.
That is, the crude enzyme solution can be obtained by removing the cells from the culture solution by a usual solid-liquid separation means such as centrifugation or filtration. This crude enzyme solution can be used as it is, but if necessary, a crude enzyme is obtained by a separation means such as a salting-out method, a precipitation method or an ultrafiltration method, and further purified and crystallized by a known method, It is also possible to use it as a purified enzyme.
【0027】斯くして得られたアルカリセルラーゼK−
539は、以下に示す酵素学的性質を有する。なお、酵
素活性の測定は、以下の方法に従って行い、また用いた
緩衝液は次の通りである。The thus obtained alkaline cellulase K-
539 has the enzymatic properties shown below. The enzyme activity was measured according to the following method, and the buffer solutions used were as follows.
【0028】pH3〜8 マクルベイン緩衝液 pH8〜11 グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液 pH12〜13 塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝
液PH 3-8 McClubain buffer solution pH 8-11 glycine-sodium hydroxide buffer solution pH 12-13 potassium chloride-sodium hydroxide buffer solution
【0029】酵素活性測定法: (1)CMCアーゼ活性 10mgCMC(A−01L,山陽国策パルプ社製)、1
00μmol 各種緩衝液(マクルベイン、リン酸、グリシ
ン−NaOH等)を含む基質溶液0.9mlに0.1mlの
酵素溶液を加え、30℃、20分反応した。反応後、
3,5−ジニトロ−サリチル酸(3,5−dinitr
o−salicylic acid(DNS))法にて
還元糖の定量を行った。即ち、反応液1.0mlにDNS
試薬1.0mlを加え、5分間、100℃で加熱発色さ
せ、冷却後、4.0mlの脱イオン水を加えて希釈した。
これを波長535nmで比色定量した。酵素力価は、上記
の条件下で1分間に1μmol のグルコースに相当する還
元糖を生成する酵素量を1単位とした。Enzyme activity assay method: (1) CMCase activity 10 mg CMC (A-01L, Sanyo Kokusaku Pulp Co., Ltd.), 1
00 μmol 0.1 ml of the enzyme solution was added to 0.9 ml of a substrate solution containing various buffers (McClubein, phosphoric acid, glycine-NaOH, etc.) and reacted at 30 ° C. for 20 minutes. After the reaction
3,5-dinitro-salicylic acid (3,5-dinitr
The reducing sugar was quantified by the o-salicyclic acid (DNS) method. That is, 1.0 ml of reaction solution
1.0 ml of the reagent was added, color was developed by heating at 100 ° C. for 5 minutes, and after cooling, 4.0 ml of deionized water was added to dilute.
This was colorimetrically determined at a wavelength of 535 nm. The enzyme titer was defined as 1 unit of the amount of enzyme that produced a reducing sugar corresponding to 1 μmol of glucose per minute under the above conditions.
【0030】(2)p−ニトロフェニルセロビオシド分
解活性 0.1μmol p−ニトロフェニルセロビオシド(シグマ
社製)、100μmolリン酸緩衝液(pH7.0)を含む
反応液1.0ml中に適当量の酵素液を30℃で作用させ
た後、1M Na2CO3を0.3ml、脱イオン水を1.
7ml順次加え、遊離するp−ニトロフェノールを400
nmで比色定量した。酵素力価は、上記の条件下で1分間
に1μmol のp−ニトロフェノールを遊離させる酵素量
を1単位とした。(2) p-Nitrophenyl cellobioside degrading activity 0.1 μmol of p-nitrophenyl cellobioside (manufactured by Sigma) and 100 μmol of phosphate buffer (pH 7.0) in 1.0 ml of reaction solution. After allowing an appropriate amount of enzyme solution to act at 30 ° C., 0.3 ml of 1M Na 2 CO 3 and 1.
Add 7 ml sequentially to release 400 parts of p-nitrophenol.
Colorimetric determination in nm. The enzyme titer was defined as 1 unit of the amount of enzyme that liberates 1 μmol of p-nitrophenol in 1 minute under the above conditions.
【0031】(3)アビセル、セルロース粉末、及び濾
紙分解活性 20mgアビセル(メルク社製)、200μmol リン酸緩
衝液(pH7.0)を含む反応液2.0ml中に適当量の酵
素液を加え、30℃、250rpm で振とうしながら作用
させた。反応後、冷却遠心分離(5℃、3000rpm 、
20分)を行い、その上清1.0mlを3,5−ジニトロ
−サリチル酸(3,5−dinitro−salicy
lic acid(DNS))法にて還元糖の定量を行
った。セルロース粉末分解活性はセルロース粉末(東洋
濾紙社製)を、濾紙分解活性は濾紙(セルラーゼ活性検
定用濾紙、東洋No.51−特)を用い、アビセラーゼ
活性の時と同様に行った。酵素力価は、上記の条件下で
1分間に1μmol のグルコースに相当する還元糖を生成
する酵素量を1単位とした。(3) Avicel, cellulose powder, and filter paper degrading activity 20 mg Avicel (manufactured by Merck & Co.), 2.0 ml of a reaction solution containing 200 μmol phosphate buffer (pH 7.0) was added with an appropriate amount of the enzyme solution, It was made to act while shaking at 30 ° C. and 250 rpm. After the reaction, cooling centrifugation (5 ° C., 3000 rpm,
20 minutes) and 1.0 ml of the supernatant was added to 3,5-dinitro-salicylic acid (3,5-dinitro-salicy).
The reducing sugar was quantified by the lic acid (DNS) method. Cellulose powder decomposition activity was measured using cellulose powder (manufactured by Toyo Roshi Kaisha, Ltd.), and filter paper decomposition activity was measured using filter paper (filterase for cellulase activity assay, Toyo No. 51-special) in the same manner as in the case of avicelase activity. The enzyme titer was defined as 1 unit of the amount of enzyme that produced a reducing sugar corresponding to 1 μmol of glucose per minute under the above conditions.
【0032】(4)セロビアーゼ活性 10mgセロビオース(関東化学社製)、100μmol リ
ン酸緩衝液(pH7.0)を含む反応液1.0ml中に適当
量の酵素液を30℃で作用させた後、100℃、2分処
理し酵素を失活させた後、生成グルコース量をムロター
ゼ・GOD法(Glucose C−Test、和光純
薬工業社製)で測定した。酵素力価は、上記の条件下で
1分間に2μmol のグルコースを生成する酵素量を1単
位とした。(4) Cellobiase activity A suitable amount of enzyme solution was allowed to act at 30 ° C. in 1.0 ml of a reaction solution containing 10 mg cellobiose (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.) and 100 μmol phosphate buffer (pH 7.0). After deactivating the enzyme by treating at 100 ° C. for 2 minutes, the amount of glucose produced was measured by the mulotase / GOD method (Glucose C-Test, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The enzyme titer was defined as 1 unit of the amount of enzyme that produced 2 μmol of glucose per minute under the above conditions.
【0033】(酵素学的性質) (1)作用 セルロース、濾紙、アビセル、CMC等の繊維素によく
作用し、これらを溶解せしめ、グルコース等の還元糖を
生成する。(Enzymatic properties) (1) Action It acts well on fibrin such as cellulose, filter paper, Avicel, CMC and the like to dissolve them to form reducing sugar such as glucose.
【0034】(2)基質特異性 本酵素はCMCの他にも、セルロース粉末、アビセル、
濾紙及びp−ニトロフェニルセロビオシドに対する活性
を有していた。(2) Substrate specificity In addition to CMC, this enzyme is used in addition to cellulose powder, Avicel,
It had activity on filter paper and p-nitrophenyl cellobioside.
【0035】(3)作用pH及び最適pH 作用pH範囲は、3〜12.5と極めて広範囲にわたる。
最適pHは、7であり、4〜11の範囲に於いても至適pH
に於ける活性の50%以上の相対活性を有しており、過
去に研究されたセルラーゼの中でも最もアルカリ側で作
用pH範囲が広い酵素と言える(図1)。(3) Working pH and optimum pH The working pH range is extremely wide ranging from 3 to 12.5.
The optimum pH is 7 and the optimum pH is in the range of 4-11.
It has a relative activity of 50% or more of the activity in Escherichia coli, and can be said to be the enzyme with the widest pH range of action on the alkaline side among the cellulases studied in the past (Fig. 1).
【0036】(4)pH安定性 各々のpHで30℃、1時間保持した後の残存活性を測定
し、pH安定性を調べた。その結果、pH5〜12で極めて
安定で失活せず、pH3.5〜12.5に於いても、約5
0%以上の活性を維持していた。本酵素は、このように
高アルカリ領域に於いても充分に安定である(図2)。(4) pH stability The pH stability was examined by measuring the residual activity after holding at 30 ° C for 1 hour at each pH. As a result, it was extremely stable at pH 5 to 12 and did not deactivate, and even at pH 3.5 to 12.5, it was about 5
The activity was maintained at 0% or more. The enzyme is sufficiently stable even in the highly alkaline region (Fig. 2).
【0037】(5)最適温度 作用温度は、15〜85℃の広範囲にわたり、その至適
温度は60℃であった。又、45〜75℃の範囲に於い
ても、至適温度での活性の50%以上を有していた(図
3)。(5) Optimum temperature The working temperature was in a wide range of 15 to 85 ° C, and the optimum temperature was 60 ° C. Further, it had 50% or more of the activity at the optimum temperature even in the range of 45 to 75 ° C (Fig. 3).
【0038】(6)温度安定性 至適pHに於いて、30分間各温度で処理した後、残存活
性を測定した結果、50℃では安定しており、60℃に
於いても約50%の残存活性を有していた(図4)。(6) Temperature stability After the treatment at the optimum pH for 30 minutes at each temperature, the residual activity was measured. As a result, the activity was stable at 50 ° C and about 50% even at 60 ° C. It had residual activity (Figure 4).
【0039】(7)分子量 本酵素をセファデックスG−100(“Sephade
x G−100”)によるゲル濾過法に基づき分子量を
測定したところ、約1.8万と約2.9万に主たるピー
クが観察された。(7) Molecular Weight This enzyme was prepared by using Sephadex G-100 (“Sephade”).
x G-100 ″), the molecular weight was measured based on the gel filtration method. As a result, major peaks at about 18,000 and about 29,000 were observed.
【0040】(8)金属イオンの影響 本酵素について、各種金属イオン(Al3+,Fe3+,B
a2+,Ca2+,Cd2+,Co2+,Cr2+,Cu2+,Fe
2+,Hg2+,Mn2+,Mo2+,Ni2+,Pd2+,Z
n2+,Li+,K+,Na+)を活性測定時に共存させ
て、その影響を検討した(各種金属イオン濃度は1mM,
K+,Na+は50mMである)。その結果、Hg2+で阻害
が、Co2+,Cd2+,Ba2+により活性化が認められ
た。(8) Effect of metal ion Regarding this enzyme, various metal ions (Al 3+ , Fe 3+ , B
a 2+ , Ca 2+ , Cd 2+ , Co 2+ , Cr 2+ , Cu 2+ , Fe
2+ , Hg 2+ , Mn 2+ , Mo 2+ , Ni 2+ , Pd 2+ , Z
(n 2+ , Li + , K + , Na + ) were made to coexist during the activity measurement, and the effect was examined (the concentration of each metal ion was 1 mM,
K + and Na + are 50 mM). As a result, inhibition was observed with Hg 2+ and activation with Co 2+ , Cd 2+ and Ba 2+ .
【0041】(9)界面活性剤の影響 各種界面活性剤(例えば、LAS、AS、ES、AO
S、α−SFE、SAS、石鹸、ポリオキシエチレンセ
カンダリーアルキルエーテル)の酵素活性に及ぼす影響
を調べた。界面活性剤0.05%溶液で30℃、15分
間処理後、活性測定を行った。その結果、何れの界面活
性剤によってもほとんど阻害を受けなかった。強力なデ
タージエントであるソディウム・ドデシルサルフェート
によっても活性の阻害は認められなかった。(9) Effects of surfactants Various surfactants (eg LAS, AS, ES, AO)
The effect of S, α-SFE, SAS, soap, polyoxyethylene secondary alkyl ether) on the enzyme activity was investigated. After treatment with a 0.05% solution of a surfactant at 30 ° C. for 15 minutes, the activity was measured. As a result, it was hardly inhibited by any of the surfactants. No inhibition of activity was observed even with the strong detergent Sodium dodecyl sulfate.
【0042】(10)プロテアーゼ耐性 洗剤用プロテアーゼ、例えばAPI−21(昭和電工社
製)、マクサターゼ(ギスト社製)及びアルカラーゼ
(ノボ社製)を、活性測定時に共存(0.1mg/ml)さ
せてその影響を調べたところ、何れのプロテアーゼに対
しても強い耐性を有することがわかった。(10) Protease resistance Detergent proteases such as API-21 (manufactured by Showa Denko KK), Maxatase (manufactured by Gist) and Alcalase (manufactured by Novo Co.) are allowed to coexist (0.1 mg / ml) during activity measurement. As a result of examining its effect, it was found to have strong resistance to any protease.
【0043】(11)キレート剤の影響 キレート剤であるEDTA、EGTA、クエン酸、ゼオ
ライト、トリポリリン酸ソーダを活性測定時に共存さ
せ、その影響を検討したが、ほとんど阻害は認められな
かった。(11) Effect of chelating agent Chelating agents such as EDTA, EGTA, citric acid, zeolite, and sodium tripolyphosphate were allowed to coexist during the activity measurement, and the effect was examined, but almost no inhibition was observed.
【0044】[0044]
【発明の効果】本発明の微生物より得られるセルラーゼ
K−539は、至適pHを7に有するにもかかわらず高ア
ルカリのpH10に於いても最適pHの80%以上、pH11
に於いても60%以上の相対活性を有し、pH5〜12に
於いて極めて安定である。また、界面活性剤、プロテア
ーゼ、キレート剤等の洗浄剤配合成分によってもほとん
ど阻害を受けない。従って、本酵素は洗浄剤組成物の配
合成分として有利に使用することができるものである。EFFECT OF THE INVENTION Cellulase K-539 obtained from the microorganism of the present invention has an optimum pH of 7 and is 80% or more of the optimum pH even at a high alkaline pH of 10, and a pH of 11
Also has a relative activity of 60% or more and is extremely stable at pH 5-12. Further, it is hardly affected by detergent-containing components such as surfactants, proteases and chelating agents. Therefore, the present enzyme can be advantageously used as a blending component of a detergent composition.
【0045】また、本発明の菌株、バチルス エスピー
KSM−539は中性で生育する菌株であるので、好
アルカリ性細菌と比べ容易にアルカリ耐性セルラーゼを
工業的に生産することができる。Since the strain of the present invention, Bacillus sp. KSM-539, is a strain that grows neutrally, it is possible to industrially produce an alkali-resistant cellulase more easily than an alkaliphilic bacterium.
【0046】[0046]
【実施例】以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説
明する。EXAMPLES The present invention will be described in more detail below with reference to examples.
【0047】実施例1 栃木県芳賀郡市貝町の土壌を薬匙一杯(約0.5g)を
滅菌生理食塩水に懸濁し、80℃で10分間熱処理し
た。この熱処理液の上清を適当に希釈して、分離用寒天
培地(培地1)に塗布した。次いで、これを30℃にて
3日間培養し、集落を形成させた。集落の周囲にCMC
の溶解に基づく透明帯を形成するものを選出し、CMC
アーゼ生産菌を取得した。更に、取得菌を培地2の液体
培地に接種し、30℃で3日間振とう培養した。培養
後、遠心分離した上清液についてCMCアーゼ活性を、
pH3〜13にて測定し、アルカリ耐性セルラーゼ生産菌
をスクリーニングした。上述の方法により、本発明のバ
チルス エスピー KSM−539株(FERM P−
9011)を取得することができた。Example 1 One teaspoonful (about 0.5 g) of the soil of Kai Town, Haga-gun, Tochigi Prefecture was suspended in sterilized physiological saline and heat-treated at 80 ° C. for 10 minutes. The supernatant of this heat treatment solution was appropriately diluted and applied to a separation agar medium (medium 1). Then, this was cultured at 30 ° C. for 3 days to form a colony. CMC around the village
Those that form a transparent zone based on the dissolution of
Acquired ase-producing bacteria. Further, the obtained bacteria were inoculated into the liquid medium of Medium 2 and shake-cultured at 30 ° C. for 3 days. After culturing, the CMCase activity of the supernatant obtained by centrifugation was
The measurement was carried out at pH 3 to 13 to screen alkali-resistant cellulase-producing bacteria. By the method described above, the Bacillus sp. KSM-539 strain (FERM P-
9011) could be obtained.
【0048】[0048]
【表2】 培地1.CMC 2% ポリペプトン 0.5% 酵母エキス 0.05% KH2PO4 0.1% Na2HPO4・12H2O 0.25% MgSO4・7H2O 0.02% 寒天 0.75% pH6.8[Table 2] Medium 1. CMC 2% Polypeptone 0.5% Yeast extract 0.05% KH 2 PO 4 0.1% Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 0.25% MgSO 4 / 7H 2 O 0.02% Agar 0.75% pH 6 .8
【0049】[0049]
【表3】 培地2.CMC 1% ポリペプトン 1% 酵母エキス 0.5% KH2PO4 0.1% Na2HPO4・12H2O 0.25% MgSO4・7H2O 0.02% pH6.8[Table 3] Medium 2. CMC 1% polypeptone 1% yeast extract 0.5% KH 2 PO 4 0.1% Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 0.25% MgSO 4 · 7H 2 O 0.02% pH6.8
【0050】参考例1 実施例1で得たバチルス エスピー KSM−539を
実施例1の液体培地2に接種し、30℃で3日間振とう
培養した。培養後、菌体を遠心分離して除き、粗酵素液
を得た。この粗酵素液1リットルに対して、ドライアイ
ス−エタノール中で3リットルのエタノールを加え、生
じた沈澱を遠心分離し更に凍結乾燥を行い乾燥粉末とし
てセルラーゼK−539 9g(比活性26単位/g;
pH9における測定値以下同じ)を得た。Reference Example 1 The Bacillus sp. KSM-539 obtained in Example 1 was inoculated into the liquid medium 2 of Example 1 and cultured at 30 ° C. for 3 days with shaking. After culturing, the bacterial cells were removed by centrifugation to obtain a crude enzyme solution. To 1 liter of this crude enzyme solution, 3 liters of ethanol was added in dry ice-ethanol, and the resulting precipitate was centrifuged and freeze-dried to obtain 9 g of cellulase K-5399 as a dry powder (specific activity: 26 units / g). ;
The same applies for the measured values at pH 9).
【0051】参考例2 液体培地2に於いてCMCを1%ショ糖に、ポリペプト
ンを7%CSL(コーン・スチープ・リカー)に代えた
培地を用い、参考例1に準じて30℃で2日間振とう培
養した。得られた培養液の遠心分離上清についてそのC
MCアーゼ活性を測定したところ40単位/lであっ
た。Reference Example 2 Using a medium in which CMC was changed to 1% sucrose and polypeptone was changed to 7% CSL (corn steep liquor) in liquid medium 2, the same procedure as in Reference Example 1 was performed at 30 ° C. for 2 days. Shake culture was performed. Regarding the supernatant obtained by centrifugation of the obtained culture broth, C
When the MCase activity was measured, it was 40 units / l.
【図1】酵素反応pHと相対活性の関係を示す図面であ
る。FIG. 1 is a drawing showing the relationship between enzyme reaction pH and relative activity.
【図2】酵素処理pHと相対活性の関係を示す図面であ
る。FIG. 2 is a drawing showing the relationship between enzyme-treated pH and relative activity.
【図3】酵素反応温度と相対活性の関係を示す図面であ
る。FIG. 3 is a drawing showing the relationship between enzyme reaction temperature and relative activity.
【図4】酵素処理温度と相対活性の関係を示す図面であ
る。FIG. 4 is a drawing showing the relationship between enzyme treatment temperature and relative activity.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 (C12N 9/42 C12R 1:07) (72)発明者 岡本 暉公彦 埼玉県越谷市七左町1−229−8 (72)発明者 森 啓 栃木県宇都宮市峰町396−12─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Reference number within the agency FI technical display location (C12N 9/42 C12R 1:07) (72) Inventor Akihiko Okamoto Nanashiza Town, Koshigaya City, Saitama Prefecture 1-229-8 (72) Inventor Kei Mori 396-12 Minemachi, Utsunomiya City, Tochigi Prefecture
Claims (1)
産する能力を有し、微工研菌寄第9011号として寄託
されたバチルス エスピー(Bacillus s
p.)KSM−539。1. Bacillus sp. Which has the ability to produce alkali-tolerant cellulase K-539 and has been deposited as Microindustrial Research Institute No. 9011.
p. ) KSM-539.
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Cited By (1)
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CN115594542A (en) * | 2022-08-16 | 2023-01-13 | 南京农业大学(Cn) | Bacillus sp.za microbial inoculum protective agent and application thereof |
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1994
- 1994-09-30 JP JP23579794A patent/JP2509534B2/en not_active Expired - Lifetime
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN115594542A (en) * | 2022-08-16 | 2023-01-13 | 南京农业大学(Cn) | Bacillus sp.za microbial inoculum protective agent and application thereof |
CN115594542B (en) * | 2022-08-16 | 2024-03-12 | 南京农业大学 | Bacillus sp.za microbial inoculum protective agent and application thereof |
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