JPH07191027A - Method for separately measuring glycoprotein - Google Patents
Method for separately measuring glycoproteinInfo
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- JPH07191027A JPH07191027A JP6305445A JP30544594A JPH07191027A JP H07191027 A JPH07191027 A JP H07191027A JP 6305445 A JP6305445 A JP 6305445A JP 30544594 A JP30544594 A JP 30544594A JP H07191027 A JPH07191027 A JP H07191027A
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明の利用分野】本発明は、糖鎖構造が異なる2種以
上の糖蛋白質の分別測定法に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a method for differentially measuring two or more glycoproteins having different sugar chain structures.
【0002】[0002]
【発明の背景】ヒトに限らず殆どの動物に於いて、体液
中に含まれる蛋白質の多くは糖鎖を有する糖蛋白質であ
る。その糖鎖部分は構造の多様性等から、生体内に関す
る何らかの「情報」を担う物質として最近特に注目さ
れ、国内外を問わず多くの大学・研究機関でその研究が
行われている。BACKGROUND OF THE INVENTION In most animals, not only humans, most of the proteins contained in body fluids are glycoproteins having sugar chains. The sugar chain portion has recently received a great deal of attention as a substance that bears some "information" about the living body due to its structural diversity, etc., and its research is being conducted by many universities and research institutes both in Japan and abroad.
【0003】その研究過程に於いて、何らかの疾病によ
り特定の糖蛋白質の糖鎖構造の変化が起こることが数多
く観察されている。例えば、ヒトα−フェトプロテイン
(AFP)の場合は、肝細胞癌の進行に伴い、AFP糖
鎖へのα−L−フコース残基やN-アセチルグルコサミン
残基(バイセクティング N-アセチルグルコサミン)の
付加が高頻度で観察されることが確認されている。しか
も、このような糖鎖構造変化の程度は血清中AFP濃度
とは無関係で、肝細胞癌の初期の段階から確認されるこ
とから、その変化の程度を調べることにより癌診断が可
能になると考えられ注目されている。During the course of the research, it has been observed that changes in the sugar chain structure of specific glycoproteins are caused by some diseases. For example, in the case of human α-fetoprotein (AFP), addition of α-L-fucose residue or N-acetylglucosamine residue (bisecting N-acetylglucosamine) to AFP sugar chain is accompanied by the progress of hepatocellular carcinoma. It has been confirmed that is frequently observed. Moreover, since the degree of such sugar chain structure change is independent of serum AFP concentration and is confirmed from the early stage of hepatocellular carcinoma, it is considered that cancer diagnosis can be made by examining the degree of change. Has been attracting attention.
【0004】糖蛋白質の糖鎖構造変化の程度の測定は、
主としてレクチンを用いた分析法、例えばレクチンカラ
ム法、レクチン電気泳動法等により行われている。糖鎖
構造変化の程度の測定が主としてレクチンを利用して行
われている理由としては、レクチンが安価であることの
みならず、糖蛋白質の蛋白質骨格部分に比べて、糖鎖部
分の免疫原性が低いため、非還元末端構造の一部を除け
ば有効な抗糖蛋白質糖鎖抗体が得られないこと、即ち糖
蛋白質糖鎖に対する抗体の作製が極めて困難であること
等が挙げられる。The degree of sugar chain structure change of glycoprotein can be measured by
It is mainly performed by an analysis method using a lectin, for example, a lectin column method, a lectin electrophoresis method and the like. The reason why the degree of sugar chain structure change is mainly measured by using lectins is that not only are lectins inexpensive, but the immunogenicity of sugar chains is higher than that of the protein skeleton of glycoproteins. Therefore, an effective anti-glycoprotein sugar chain antibody cannot be obtained except for a part of the non-reducing end structure, that is, it is extremely difficult to prepare an antibody against the glycoprotein sugar chain.
【0005】しかし、レクチンは糖鎖構造の認識特異性
は高いものの、その糖鎖への結合力(結合定数)は抗体
のそれと比べて数千から数万分の一であるため、レクチ
ンと糖鎖とで、抗原抗体反応の如き強固な複合体を形成
させることは難しい。そのため、固相化抗体を使用する
酵素免疫測定法(ELISA)のような、固相上での複
合体形成後の洗浄操作を必要とする分析法に於いて抗体
の代りにレクチンを利用すると、洗浄時に測定対象の糖
蛋白質とレクチンとの複合体が再度解離する現象が生じ
て、測定感度が顕著に低下する等の問題が生ずるため、
このような方法は臨床診断法としては実用的な方法とは
言い難い。また、上記した如きレクチンの性質のため、
レクチンと測定対象の糖蛋白質との反応を利用して糖蛋
白質の測定を行うためには、レクチン固定化カラムやレ
クチン含有アガロースゲル等を使用して、レクチンが測
定対象の糖蛋白質に比べて著しく過剰の条件下で行わな
ければなければならないという制約があった。However, although the lectin has a high recognition specificity of sugar chain structure, the binding force (binding constant) to the sugar chain is several thousand to tens of thousands times lower than that of the antibody, so that the lectin and the sugar are bound. It is difficult to form a strong complex with the chain such as an antigen-antibody reaction. Therefore, when the lectin is used instead of the antibody in an analysis method such as an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) that uses a solid-phased antibody, which requires a washing operation after complex formation on the solid phase, The phenomenon of the dissociation of the complex of the glycoprotein to be measured and the lectin again occurs during washing, which causes problems such as a marked decrease in measurement sensitivity.
Such a method cannot be said to be a practical method as a clinical diagnostic method. Further, because of the properties of the lectin as described above,
To measure glycoprotein by utilizing the reaction between lectin and glycoprotein to be measured, use a lectin-immobilized column, lectin-containing agarose gel, etc. There was a constraint that it had to be done under excessive conditions.
【0006】そのため、レクチンの糖認識特異性と酵素
免疫測定法の高感度を兼ね備え、迅速且つ簡便な糖蛋白
質糖鎖分別測定法の開発が望まれている現状にある。Therefore, under the present circumstances, it is desired to develop a rapid and simple assay method for glycoprotein sugar chain fractionation, which has both sugar recognition specificity of lectin and high sensitivity of enzyme immunoassay.
【0007】[0007]
【発明の目的】本発明は、上記した如き状況に鑑みなさ
れたもので、レクチンと抗体とを利用した、高感度で、
迅速且つ簡便な糖蛋白質の分別測定法を提供することを
その目的とする。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above-mentioned situation, and utilizes lectin and an antibody with high sensitivity,
It is an object of the present invention to provide a rapid and simple method for differentially measuring glycoprotein.
【0008】[0008]
【発明の構成】本発明は、糖鎖構造は異なるが蛋白質構
造は実質的に同一な糖蛋白質を測定対象とする分別測定
法であって、測定対象の糖蛋白質の少なくとも1つの特
定の糖鎖構造を認識するレクチンと、測定対象の糖蛋白
質全てに結合する性質を有するが該レクチンが結合した
測定対象の糖蛋白質への結合が妨げられる性質を有する
抗体(以下、第1抗体と略記する。)とを組み合わせて
用い、第1抗体が結合した糖蛋白質と、第1抗体が結合
していない糖蛋白質とを、これらの性質の差を利用して
分別測定することを特徴とする分別測定法、の発明であ
る。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present invention is a differential measurement method for measuring glycoproteins having different sugar chain structures but substantially the same protein structure, wherein at least one specific sugar chain of the measurement target glycoprotein is used. An antibody having the property of binding to a lectin that recognizes a structure and all of the glycoproteins to be measured, but having the property of preventing the binding to the glycoprotein of the measurement target bound by the lectin (hereinafter, abbreviated as a first antibody). ) Is used in combination, the glycoprotein bound to the first antibody and the glycoprotein not bound to the first antibody are fractionally measured by utilizing the difference in these properties, and the differential measurement method is characterized. Is the invention of.
【0009】即ち、本発明者らは、レクチンの糖認識特
異性と酵素免疫測定法の高感度を兼ね備え、迅速且つ簡
便な糖蛋白質の分別測定法を開発すべく鋭意研究の途
上、糖蛋白質に対する抗体の中に、レクチンの共存下で
抗原抗体反応が妨げられる性質を有するもの(第1抗
体)が存在することを見出した。そこで、この抗体を利
用する糖蛋白質の分別測定法を開発すべく更に研究を行
ったところ、糖蛋白質糖鎖の疾病による構造変化を識別
し得るレクチンと、上記した如き性質を有する抗体(第
1抗体)とを組み合わせて用いることにより、糖蛋白質
の糖鎖構造変化の程度を高感度に測定することが可能で
あることを見出し、本発明を完成するに至った。[0009] That is, the present inventors have been earnestly researching to develop a rapid and simple fractionation assay method for glycoproteins, which has both the sugar recognition specificity of lectin and the high sensitivity of enzyme immunoassay, and is currently conducting research on glycoproteins. It was found that among antibodies, there is an antibody (primary antibody) having the property of preventing an antigen-antibody reaction in the presence of a lectin. Therefore, further research was conducted to develop a method for differentially measuring glycoproteins using this antibody. As a result, a lectin capable of discriminating a structural change of glycoprotein sugar chains due to a disease and an antibody having the above-mentioned properties (first It was found that it is possible to measure the degree of sugar chain structure change of a glycoprotein with high sensitivity by using it in combination with an antibody), and completed the present invention.
【0010】本発明を実施するには例えば以下の如くし
て行えばよい。即ち、先ず、測定対象の糖蛋白質を含む
生体由来の試料と、測定対象の糖蛋白質の少なくとも1
つの特定の糖鎖構造を認識するレクチンと、第1抗体と
を反応させた後、測定対象の糖蛋白質と第1抗体との複
合体と、第1抗体が結合していない測定対象の糖蛋白質
とを、これらの性質の差、例えば分子量の差、等電点の
差、電荷の強弱、疎水性の強弱等を利用して分別した
後、夫々を夫々の性質に応じた方法で測定することによ
り実施できる。To carry out the present invention, for example, the following may be carried out. That is, first, a biological sample containing the glycoprotein to be measured and at least one of the glycoprotein to be measured
After reacting a lectin that recognizes one specific sugar chain structure with the first antibody, a complex of the measurement target glycoprotein and the first antibody, and the measurement target glycoprotein to which the first antibody is not bound And, using the difference in these properties, such as the difference in molecular weight, the difference in isoelectric point, the strength of electric charge, the strength of hydrophobicity, etc., and then measuring each by a method according to each property. Can be implemented by
【0011】尚、測定対象の糖蛋白質を、レクチンと第
1抗体に反応させるに当たっては、これらを同時に反応
させてもよいが、レクチンを先きに反応させた後に第1
抗体を反応させる方が、レクチンと糖蛋白質との反応が
確実に起こり測定精度が向上するので望ましい。When reacting the glycoprotein to be measured with the lectin and the first antibody, they may be reacted simultaneously, but after reacting the lectin first,
Reacting an antibody is preferable because the reaction between the lectin and the glycoprotein is surely caused and the measurement accuracy is improved.
【0012】また、上記の本発明による分別測定に当
り、測定対象の糖蛋白質の検出を容易にするためには、
第1抗体に、測定対象の糖蛋白質と抗体との複合体の性
質を変化させ得る物質(以下、分離向上能物質と略記す
る。)又は標識物質を結合させておくことが望ましい。Further, in order to facilitate the detection of the glycoprotein to be measured in the above-described fractional measurement according to the present invention,
It is desirable to bind to the first antibody a substance capable of changing the properties of the complex of the glycoprotein to be measured and the antibody (hereinafter abbreviated as separation enhancing substance) or a labeling substance.
【0013】更にまた、測定対象の糖蛋白質の検出を容
易にし、且つ糖蛋白質の総量を併せて測定したいのであ
れば、該レクチンが結合した測定対象の糖蛋白質を含む
測定対象の糖蛋白質全てに結合し得る性質を有し、且つ
標識物質が結合した抗体(以下、第2抗体と略記す
る。)を更に組み合わせて用いることが望ましい。第2
抗体を用いる本発明を実施するには例えば以下の如くし
て行えばよい。即ち、先ず、測定対象の糖蛋白質を含む
生体由来の試料と、第2抗体と、測定対象の糖蛋白質の
少なくとも1つの特定の糖鎖構造を認識するレクチン
と、第1抗体とを反応させる。その後、測定対象の糖蛋
白質と第1抗体との複合体と、第1抗体が結合していな
い測定対象の糖蛋白質とを、これらの性質の差、例えば
分子量の差、等電点の差、電荷の強弱、疎水性の強弱等
を利用して分別した後、第2抗体に結合された標識物質
の性質を利用して夫々を測定することにより実施でき
る。Furthermore, if it is desired to facilitate the detection of the glycoprotein to be measured and also to measure the total amount of glycoprotein together, all glycoproteins to be measured including the glycoprotein to be measured to which the lectin has bound are measured. It is desirable to further combine and use an antibody (hereinafter, abbreviated as a second antibody) having a property of being capable of binding and having a labeling substance bound thereto. Second
To carry out the present invention using an antibody, for example, the following may be carried out. That is, first, a biological sample containing a glycoprotein to be measured, a second antibody, a lectin that recognizes at least one specific sugar chain structure of the glycoprotein to be measured, and the first antibody are reacted. Thereafter, the complex of the glycoprotein to be measured and the first antibody and the glycoprotein to be measured to which the first antibody is not bound are subjected to a difference in these properties, for example, a difference in molecular weight, a difference in isoelectric point, It can be carried out by separating each of them by using the strength of electric charge, the strength of hydrophobicity and the like, and then measuring each by using the property of the labeling substance bound to the second antibody.
【0014】尚、測定対象の糖蛋白質を、第2抗体とレ
クチンと第1抗体に反応させるに当たっては、これらを
同時に反応させてもよいが、レクチン(及び第2抗体)
を先きに反応させた後に第1抗体を反応させる方が、レ
クチンと糖蛋白質との反応が確実に起こり測定精度が向
上するので望ましい。測定対象の糖蛋白質に、レクチ
ン、第1抗体或は第2抗体を反応させる際に(或は反応
させる前に)、該糖蛋白質をグリコシダーゼ処理する方
が目的の分別測定をより精度良く実施し得る場合があ
る。即ち、測定対象の糖蛋白質の糖鎖末端は疾病の種類
により種々の構造変化を起こすが、該糖鎖の非還元末端
側に結合した糖残基の種類によっては、使用するレクチ
ン、第1抗体或は第2抗体等が本来結合すべき構造を有
する糖鎖であってもその結合が妨げられたり、結合でき
なくなる場合があるからである。このような場合、測定
対象の糖蛋白質をレクチン、第1抗体或は第2抗体と反
応させる際に(或はこれらと反応させる前に予め)適当
なグリコシダーゼで処理して糖蛋白質糖鎖の非還元末端
側の糖残基を適宜除去してレクチン、第1抗体或は第2
抗体が目的の構造を有する糖蛋白質に結合し易くするこ
とによって、目的の分別測定の精度を向上させることが
できるようになるからである。このような目的に用いら
れるグリコシダーゼとしては、糖加水分解酵素としての
作用を有するものであれば特に限定されないが、例えば
シアリダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−N−アセチ
ルグルコサミニダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マン
ノシダーゼ、α−フコシダーゼ等が好ましく挙げられ
る。また、これらグリコシダーゼの由来は特に限定され
ない。上記した如き場合に於いて、グリコシダーゼを反
応させる際の例えば温度、pH等の条件は使用するグリ
コシダーゼの種類に応じて適宜選択すれば良いが、反応
温度としては、通常0〜50℃、好ましくは1〜40℃、よ
り好ましくは25〜37℃の範囲が、また、反応時のpHと
しては、通常2〜10、好ましくは4〜9の範囲が挙げら
れる。また、グリコシダーゼの使用濃度としては、使用
するグリコシダーゼの種類によって異なり、目的の糖加
水分解反応が生じる濃度以上であればよく特に限定され
ないが、糖加水分解反応を行う場合、薄いグリコシダー
ゼ濃度の溶液中で長時間行うよりも、比較的濃いグリコ
シダーゼ濃度の溶液中で短時間行う方が、不必要な糖鎖
の脱離を防ぐことができるので望ましく、反応液中の総
量が通常10〜1000mU(ユニット)、好ましくは50〜500
mUの範囲となるように選択され、また反応時間として
は通常1分間〜1昼夜、好ましくは3分間〜1時間の範
囲が挙げられる。尚、グリコシダーゼによる反応を、レ
クチン、第1抗体或は第2抗体による反応と同時に行う
場合には、上記した反応条件は、レクチン等を反応させ
る場合の反応条件によりある程度の制約を受けることは
いうまでもない。When reacting the glycoprotein to be measured with the second antibody, the lectin and the first antibody, these may be reacted simultaneously, but the lectin (and the second antibody)
It is preferable that the first antibody is first reacted with the first antibody because the reaction between the lectin and the glycoprotein is surely caused and the measurement accuracy is improved. When reacting (or before reacting) the lectin, the first antibody, or the second antibody with the glycoprotein to be measured, the glycosidase treatment of the glycoprotein enables the target differential measurement to be performed more accurately. You may get it. That is, the sugar chain end of the glycoprotein to be measured causes various structural changes depending on the type of disease, but depending on the type of sugar residue bound to the non-reducing end side of the sugar chain, the lectin or the first antibody used. Alternatively, even if the second antibody or the like is a sugar chain having a structure to be originally bound, the binding may be hindered or unable to bind. In such a case, when the glycoprotein to be measured is reacted with the lectin, the first antibody or the second antibody (or before reacting with these), it is treated with an appropriate glycosidase to remove non-glycans of the glycoprotein. The lectin, the first antibody, or the second antibody by appropriately removing the sugar residue on the reducing end side
By facilitating the binding of the antibody to the glycoprotein having the target structure, the accuracy of the target differential measurement can be improved. The glycosidase used for such purpose is not particularly limited as long as it has an action as a sugar hydrolase, and for example, sialidase, β-galactosidase, β-N-acetylglucosaminidase, α-mannosidase, β-mannosidase. , Α-fucosidase and the like are preferable. The origin of these glycosidases is not particularly limited. In the case as described above, conditions such as temperature and pH when reacting glycosidase may be appropriately selected according to the type of glycosidase used, but the reaction temperature is usually 0 to 50 ° C., preferably The range of 1 to 40 ° C., more preferably 25 to 37 ° C., and the pH during the reaction are usually 2 to 10 and preferably 4 to 9. The concentration of glycosidase used varies depending on the type of glycosidase used, and is not particularly limited as long as it is at a concentration at which the desired sugar hydrolysis reaction occurs or higher, but when performing the sugar hydrolysis reaction, in a solution with a thin glycosidase concentration. It is desirable to carry out the reaction in a solution with a relatively high concentration of glycosidase for a short time rather than for a long time in order to prevent unnecessary elimination of sugar chains, and the total amount in the reaction solution is usually 10 to 1000 mU (unit ), Preferably 50-500
The reaction time is usually 1 minute to 1 day and night, preferably 3 minutes to 1 hour. When the reaction with glycosidase is carried out simultaneously with the reaction with lectin, the first antibody or the second antibody, the reaction conditions described above are to some extent restricted by the reaction conditions when reacting with lectin or the like. There is no end.
【0015】本発明に於いて用いられるレクチンとして
は、種々のレクチン、例えばコンカナバリンA,レンズ
マメレクチン,インゲンマメレクチン,ダツラレクチ
ン,小麦胚芽レクチン等の中から目的の糖鎖構造を認識
し得る性質を有するものを適宜選択して用いればよく、
特に限定されない。The lectin used in the present invention has a property of recognizing a target sugar chain structure from various lectins such as concanavalin A, lentil lectin, kidney bean lectin, datsura lectin, wheat germ lectin and the like. You can select and use the appropriate one,
There is no particular limitation.
【0016】本発明に用いられる上記した如き性質を有
する第1抗体(又は第2抗体を調製するために用いられ
る抗体)としては、上記した如き性質を有する抗体であ
れば、常法、例えば「免疫実験学入門、第2刷、松橋直
ら、(株)学会出版センター、1981」等に記載の方法に
準じて、例えば馬、牛、羊、兎、山羊、ラット、マウス
等の動物に測定対象を免疫して作製されるポリクローナ
ル性抗体でも、或はまた常法、即ちケラーとミルスタイ
ン(Nature,256巻,495頁,1975)により確立された細胞
融合法に従い、マウスの腫瘍ラインからの細胞と測定対
象物で予め免疫されたマウスの脾細胞とを融合させて得
られるハイブリドーマが産生する単クローン性抗体でも
何れにてもよく、これらを単独で或はこれらを適宜組み
合わせて用いる等は任意である。As the first antibody (or the antibody used for preparing the second antibody) having the above-mentioned properties used in the present invention, an antibody having the above-mentioned properties can be prepared by a conventional method, for example, " According to the method described in "Introduction to Immunological Experiments, 2nd edition, Nao Matsuhashi et al., Academic Society Publishing Center, 1981", etc., for example, for animals such as horses, cows, sheep, rabbits, goats, rats, mice, etc. Cells produced from a tumor line of a mouse according to a conventional method, that is, a cell fusion method established by Keller and Milstein (Nature, 256, 495, 1975). The monoclonal antibody produced by the hybridoma obtained by fusing the spleen cells of a mouse previously immunized with the measurement target may be any antibody, and these may be used alone or in appropriate combination. so That.
【0017】本発明を利用して分別測定可能な糖蛋白質
の具体例としては、例えば血清,血液,血漿,尿等の生
体体液、リンパ球、血球、各種細胞類等の生体由来の試
料中に含まれる、糖鎖構造は異なるが蛋白質構造は実質
的に同一な糖蛋白質が存在するものであって、測定対象
の糖蛋白質の少なくとも1つの特定の糖鎖構造を認識す
るレクチンと第1抗体とが存在するものであれば、特に
限定されることなく挙げられるが、例えばアミラーゼ,
アルカリホスファターゼ,酸性ホスファターゼ,γ-グ
ルタミルトランスフェラーゼ(γ−GTP),リパー
ゼ,クレアチンキナーゼ(CK),乳酸脱水素酵素(L
DH),グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ
(GOT),グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナー
ゼ(GPT),レニン,プロテインキナーゼ,チロシン
キナーゼ等の酵素類、例えばヒト絨毛性ゴナドトロピン
(hCG),甲状腺刺激ホルモン(TSH),黄体形成
ホルモン(LH)等の生理活性物質、例えば前立腺特異
抗原(PSA),α2-マクログロブリン,癌胎児性抗原
(CEA),α-フェトプロテイン等の癌関連抗原、例
えばCA19−9,CA125等の糖鎖抗原等が好まし
く挙げられる。Specific examples of glycoproteins that can be separately measured using the present invention include biological fluids such as serum, blood, plasma and urine, and biological samples such as lymphocytes, blood cells and various cells. A lectin that recognizes at least one specific sugar chain structure of a glycoprotein to be measured, and a first antibody, which include glycoproteins having different sugar chain structures but substantially the same protein structure Are not particularly limited as long as they exist, for example, amylase,
Alkaline phosphatase, acid phosphatase, γ-glutamyl transferase (γ-GTP), lipase, creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (L
DH), glutamate oxaloacetate transaminase (GOT), glutamate pyruvate transaminase (GPT), renin, protein kinase, tyrosine kinase, and other enzymes such as human chorionic gonadotropin (hCG), thyroid stimulating hormone (TSH), luteinizing hormone. (LH) and other physiologically active substances, such as prostate specific antigen (PSA), α 2 -macroglobulin, carcinoembryonic antigen (CEA), α-fetoprotein and other cancer-related antigens, such as sugar chains such as CA19-9 and CA125 Antigens and the like are preferable.
【0018】本発明の分別測定法に於て、使用するレク
チンの濃度は、使用するレクチンの種類、測定対象の糖
蛋白質の性質等により変動するが、設定された測定対象
糖蛋白質の検出限界濃度の通常10倍以上、好ましくは10
0倍以上、より好ましくは1000倍以上の濃度で反応時に
共存させておくことが望ましい。In the differential assay method of the present invention, the concentration of the lectin used varies depending on the type of lectin used, the properties of the glycoprotein to be measured, etc., but the set detection limit concentration of the glycoprotein to be measured is set. Usually 10 times or more, preferably 10
It is desirable to coexist at a concentration of 0 times or more, more preferably 1000 times or more during the reaction.
【0019】また、第1抗体の使用濃度は、測定対象糖
蛋白質の検出限界をどの程度に設定するかによっても変
動するが、レクチンと第1抗体の測定対象糖蛋白質に対
する結合定数の違いを考慮した上で設定することが望ま
しい。例えば、測定対象糖蛋白質、レクチンの種類やそ
の物性、第1抗体の物性等により変動するものの、下記
に示す一般式等を利用して設定することが望ましい。第
1抗体濃度≦(レクチンの結合定数)/(第1抗体の結合定
数)×(レクチン濃度)尚、上記の一般式に係わる結合定数
とは、下記(1)式の如き平衡反応に於ける結合定数を
示し、下記(2)式により求められる定数である。 [A]+[B]←→[A・B] (1) 結合定数=[A・B]/([A]×[B]) (2) [A]:平衡状態に於けるレクチン又は第1抗体の濃度
(M)。 [B]:平衡状態に於ける遊離の測定対象糖蛋白質濃度
(M)。 [A・B]:レクチン(又は第1抗体)と測定対象糖蛋
白質との複合体の濃度(M)。 より具体的に述べれば、例えばレクチンの測定対象糖蛋
白質への結合定数が1×106Mー1で、第1抗体の測定対
象糖蛋白質への結合定数が1×108Mー1である場合に
は、第1抗体濃度はレクチン濃度の100分の1以下、好
ましくは1000分の1以下ということになる。尚、第1抗
体の使用濃度は、設定した検出限界濃度の測定対象糖蛋
白質の全てと結合し得る濃度以上である方が望ましい
が、それ以下(例えば1/10程度)であってもよい。The concentration of the first antibody used varies depending on how much the detection limit of the glycoprotein to be measured is set, but the difference in binding constant between the lectin and the first antibody to the glycoprotein to be measured is taken into consideration. It is desirable to set it after doing so. For example, although it varies depending on the glycoprotein to be measured, the type of lectin and its physical properties, the physical properties of the first antibody, etc., it is desirable to set using the general formula shown below. Concentration of first antibody ≤ (binding constant of lectin) / (binding constant of first antibody) x (concentration of lectin) The binding constant relating to the above general formula means the equilibrium reaction as shown in the following formula (1). A coupling constant is shown and is a constant calculated by the following equation (2). [A] + [B] ← → [A · B] (1) Binding constant = [A · B] / ([A] × [B]) (2) [A]: Lectin or the lectin in the equilibrium state 1 Antibody concentration (M). [B]: Free measurement target glycoprotein concentration (M) in the equilibrium state. [AB]: Concentration (M) of the complex of the lectin (or the first antibody) and the glycoprotein to be measured. More specifically, for example, the binding constant of the lectin to the glycoprotein to be measured is 1 × 10 6 M -1 , and the binding constant of the first antibody to the glycoprotein to be measured is 1 × 10 8 M -1 . In this case, the concentration of the first antibody will be 1/100 or less, preferably 1/1000 or less, of the lectin concentration. The concentration of the first antibody used is preferably a concentration at which the set detection limit concentration can bind to all of the glycoproteins to be measured, but may be lower than that (for example, about 1/10).
【0020】また、第2抗体の使用濃度は、測定対象糖
蛋白質の検出限界をどの程度に設定するかによって変動
するが、反応液中の濃度として、設定した検出限界濃度
の測定対象糖蛋白質の全てと結合し得る濃度以上、好ま
しくはその2倍濃度以上、より好ましくは、その5倍濃
度以上としておくことが望ましい。The concentration of the second antibody used varies depending on how much the detection limit of the glycoprotein to be measured is set, but the concentration in the reaction solution of the glycoprotein to be measured at the set detection limit It is desirable that the concentration is not less than the concentration capable of binding to all, preferably not less than twice the concentration thereof, and more preferably not less than five times the concentration thereof.
【0021】本発明の分別測定法に於て、測定対象の糖
蛋白質と、レクチン及び第1抗体、更に要すれば第2抗
体とを反応させて、レクチンと糖蛋白質との複合体、第
1抗体と糖蛋白質との複合体等(或はこれら複合体と第
2抗体との複合体)を形成させる際の反応条件として
は、これら複合体の形成反応を妨げる様な条件でなけれ
ば特に限定されないが、常法、例えば酵素免疫測定法
(EIA),ラジオイムノアッセイ(RIA),蛍光免
疫測定法(FIA),アフィニティクロマトグラフィー
等の自体公知の方法に於いて複合体等を形成させる際の
反応条件に準じて行えばよい。例えば、反応時に緩衝液
を用いる場合には、使用される緩衝剤やその他の試薬は
これら自体公知の方法に於いて用いられるものを適宜選
択して用いればよい。また、反応時のpHとしては、こ
れら複合体の形成反応を妨げない範囲であれば特に限定
されるものではないが、通常2〜10、好ましくは5〜9
の範囲が挙げられる。反応時の温度も、複合体の形成反
応を妨げない範囲であれば特に限定されるものではない
が、通常0〜50℃、好ましくは0〜40℃、より好ましく
は0〜10℃の範囲が挙げられる。反応時間は、これら複
合体が形成されるのに要する時間が、測定対象の糖蛋白
質と、レクチン、第1抗体及び第2抗体との反応性によ
り異なるので、各々の性質に応じて数秒間乃至数時間適
宜反応させればよい。In the differential assay method of the present invention, the glycoprotein to be assayed is allowed to react with the lectin and the first antibody, and further with the second antibody to form a complex of the lectin and the glycoprotein, the first antibody. The reaction conditions for forming a complex or the like of the antibody and glycoprotein (or a complex of the complex and the second antibody) are not particularly limited as long as they do not interfere with the formation reaction of these complexes. Although not carried out, a reaction for forming a complex or the like in a conventional method such as enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA), fluorescence immunoassay (FIA), affinity chromatography, etc. It may be performed according to the conditions. For example, when a buffer solution is used in the reaction, the buffer agent and other reagents to be used may be appropriately selected from those used in the methods known per se. The pH during the reaction is not particularly limited as long as it does not interfere with the complex formation reaction, but is usually 2 to 10, preferably 5 to 9
The range of is mentioned. The temperature during the reaction is not particularly limited as long as it does not hinder the complex-forming reaction, but is usually 0 to 50 ° C, preferably 0 to 40 ° C, more preferably 0 to 10 ° C. Can be mentioned. The reaction time depends on the reactivity of the glycoprotein to be measured with the lectin, the first antibody and the second antibody, and therefore the time required for the formation of these complexes may vary from several seconds to several seconds depending on each property. The reaction may be appropriately performed for several hours.
【0022】第1抗体に結合させる為に用いられる分離
向上物質としては、測定対象の糖蛋白質と第1抗体との
複合体の例えば分子量、疎水性、等電点等の性質を変化
させ得る物質であれば特に限定されることなく挙げられ
るが、具体的には例えばα−キモトリプシノーゲン,β
−ガラクトシダーゼ,リゾチーム,チトクロームC,ト
リプシンインヒビター等のタンパク質、例えばフェニル
アラニン,プロリン,アルギニン,リジン,アスパラギ
ン酸,グルタミン酸等のアミノ酸を含むペプチド、例え
ば臭素,塩素,沃素等のハロゲン原子、例えばポリエチ
レングリコール等の合成高分子、例えばポリグルタミン
酸,ポリアスパラギン酸,ポリリジン,ポリアルギニ
ン,ポリフェニルアラニン,ポリチロシン等のポリアミ
ノ酸、炭素数3〜10のアルキル鎖、例えばパルミチン
酸,オレイン酸,ステアリン酸等の脂肪酸、例えばN-
(ε-マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド[N-
(ε-maleimidocaproyloxy)succinimide](EMCS),
N-スクシンイミヂル-6-マレイミドヘキサノエイト(N-S
uccinimidyl-6-maleimidohexanoate),ビスマレイミド
ヘキサン(Bismaleimidohexane)(BMH),オクチル
アミン等の第1抗体に結合し得る反応基を有し且つ疎水
性若しくはイオン性を有する化学物質等が好ましく挙げ
られる。尚、本発明に係る分離向上物質は、測定対象の
糖蛋白質や第1抗体の性質(例えばpH安定性,疎水
度,水溶液への溶解度,等電点等)を考慮した上で適宜
選択して用いれば足りる。As the separation-improving substance used for binding to the first antibody, a substance capable of changing properties such as molecular weight, hydrophobicity and isoelectric point of the complex of the glycoprotein to be measured and the first antibody There is no particular limitation so long as it is, but specifically, for example, α-chymotrypsinogen, β
Proteins such as galactosidase, lysozyme, cytochrome C, trypsin inhibitor, peptides containing amino acids such as phenylalanine, proline, arginine, lysine, aspartic acid, glutamic acid, halogen atoms such as bromine, chlorine, iodine, such as polyethylene glycol Synthetic polymers such as polyamino acids such as polyglutamic acid, polyaspartic acid, polylysine, polyarginine, polyphenylalanine and polytyrosine, alkyl chains having 3 to 10 carbon atoms, such as fatty acids such as palmitic acid, oleic acid and stearic acid, for example N-
(ε-maleimidocaproyloxy) succinimide [N-
(ε-maleimidocaproyloxy) succinimide] (EMCS),
N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoate (NS
Preferred examples include chemical substances having a reactive group capable of binding to the first antibody, such as uccinimidyl-6-maleimidohexanoate), bismaleimidohexane (BMH), and octylamine, and having hydrophobicity or ionicity. The separation-improving substance according to the present invention is appropriately selected in consideration of the properties of the glycoprotein to be measured and the first antibody (eg pH stability, hydrophobicity, solubility in aqueous solution, isoelectric point, etc.). It is enough to use.
【0023】本発明に係る第1抗体と分離向上物質の結
合方法は、第1抗体の特定反応基と分離向上物質の特定
反応基とを結合させる方法、第1抗体の特定反応基を分
離向上物質で置換する方法、第1抗体に対して結合能の
ある物質(例えば抗体、レクチン、抗原、インヒビタ
ー、DNA等)を介して第1抗体と分離向上物質とを結
合させる方法等が挙げられる。より具体的には、例えば
1)自体公知のEIA、RIA或いはFIA等において
一般に行われている自体公知の標識物質と抗体との結合
方法(例えば、医学実験口座、第8巻、山村雄一監修、
第1版、中山書店、1971;図説 蛍光抗体、川生明著、
第1版、(株)ソフトサイエンス社、1983;酵素免疫測定
法、石川栄治、河合忠、宮井潔編、第2版、医学書院、
1982、等)、2)自体公知の物質の修飾および結合方法
(例えば、蛋白質の化学修飾〈上〉〈下〉、瓜谷郁三、
志村憲助、中村道徳、船津勝編集、第1版、(株)学会出
版センター、1981;ポリエチレングリコール修飾タンパ
ク質、稲田祐二他、生化学、第62巻、第11号、P1351ー13
62、(社)日本生化学会、1990;DNA PROBES, GeorgeH.
K. and Mark M.M. STOCKTON PRESS,1989 、等)等が何
れも例外なく挙げられ、これらの方法に準じて行えばよ
い。The method for binding the first antibody and the separation-improving substance according to the present invention includes a method for binding a specific reactive group of the first antibody and a specific reactive group of the separation-improving substance, and a separation-improving specific reactive group of the first antibody. Examples thereof include a method of substituting with a substance, a method of binding the first antibody and the separation improving substance through a substance capable of binding to the first antibody (eg, antibody, lectin, antigen, inhibitor, DNA, etc.). More specifically, for example, 1) a method for binding an antibody known per se to an antibody generally known in EIA, RIA, FIA or the like known per se (for example, Medical Experiment Account, Volume 8, supervised by Yuichi Yamamura,
First edition, Nakayama Shoten, 1971; Illustrated fluorescent antibody, Akira Kawao,
1st edition, Soft Science Co., Ltd., 1983; Enzyme Immunoassay, Eiji Ishikawa, Tadashi Kawai, Kiyoshi Miyai, 2nd edition, Medical Institute,
1982, etc.), 2) Modification of substances known per se and binding method (for example, chemical modification of protein <up><down>, Ikuzo Uraya,
Kensuke Shimura, Michinori Nakamura, Masaru Funatsu, 1st Edition, Academic Publishing Center, 1981; Polyethylene glycol modified protein, Yuji Inada et al., Biochemistry, Vol. 62, No. 11, P1351-13
62, Japan Biochemical Society, 1990; DNA PROBES, George H.
K. and Mark MM STOCKTON PRESS, 1989, etc.) can be mentioned without exception, and the method may be carried out according to these methods.
【0024】本発明に係わる第1抗体に標識される(又
は第2抗体を調製するために使用される)標識物質とし
ては、例えばEIAに於いて用いられるアルカリホスフ
ァターゼ,β-ガラクトシダーゼ,ペルオキシダーゼ,
マイクロペルオキシダーゼ,グルコースオキシダーゼ,
グルコース-6-リン酸脱水素酵素,アセチルコリンエス
テラーゼ,リンゴ酸脱水素酵素,ルシフェラーゼ等の酵
素類、例えばRIAで用いられる99mTc,131I,
125I,14C,3H等の放射性同位元素、例えばFIAで
用いられるフルオレセイン,ダンシル,フルオレスカミ
ン,クマリン,ナフチルアミン或はこれらの誘導体等の
蛍光性物質、例えばルシフェリン,イソルミノール,ル
ミノール,ビス(2,4,6-トリフロロフェニル)オキザレー
ト等の発光性物質、例えばフェノール,ナフトール,ア
ントラセン或はこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有す
る物質、例えば4-アミノ-2,2,6,6-テトラメチルピペリ
ジン-1-オキシル,3-アミノ-2,2,5,5-テトラメチルピロ
リジン-1-オキシル,2,6-ジ-t-ブチル-α-(3,5-ジ-t-ブ
チル-4-オキソ-2,5-シクロヘキサジエン-1-イリデン)-p
-トリルオキシル等のオキシル基を有する化合物に代表
されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等が
挙げられるが、これらに限定されるものではないことは
言うまでもない。Examples of the labeling substance to be labeled on the first antibody (or used to prepare the second antibody) according to the present invention include alkaline phosphatase, β-galactosidase, peroxidase, used in EIA.
Microperoxidase, glucose oxidase,
Enzymes such as glucose-6-phosphate dehydrogenase, acetylcholinesterase, malate dehydrogenase and luciferase, for example 99m Tc, 131 I used in RIA,
Radioisotopes such as 125 I, 14 C and 3 H, for example, fluorescent substances such as fluorescein, dansyl, fluorescamine, coumarin, naphthylamine or their derivatives used in FIA, such as luciferin, isoluminol, luminol, bis. Luminescent substances such as (2,4,6-trifluorophenyl) oxalate, such as phenol, naphthol, anthracene or derivatives thereof having absorption in the ultraviolet, such as 4-amino-2,2,6, 6-tetramethylpiperidine-1-oxyl, 3-amino-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine-1-oxyl, 2,6-di-t-butyl-α- (3,5-di-t -Butyl-4-oxo-2,5-cyclohexadiene-1-ylidene) -p
Examples thereof include substances having a property as a spin labeling agent represented by a compound having an oxyl group such as -tolyloxyl, but it goes without saying that the substance is not limited thereto.
【0025】第1抗体に(又は第2抗体を調製するため
に)、上記した如き標識物質を第1抗体等に標識する方
法としては、自体公知のEIA、RIA或はFIA等に
於いて一般に行われている自体公知の標識方法(例え
ば、医化学実験講座、第8巻、山村雄一監修、第1版、
中山書店、1971;図説 蛍光抗体、川生明著、第1版、
(株)ソフトサイエンス社、1983;酵素免疫測定法、石川
栄治、河合忠、宮井潔編、第2版、医学書院、1982等)
が何れも例外なく挙げられ、これらに準じて行えばよ
い。また、標識方法として、アビジン(又はストレプト
アビジン)とビオチンの反応を利用した常法を利用して
も良いことは言うまでもない。As a method for labeling the first antibody or the like with the above-mentioned labeling substance on the first antibody (or for preparing the second antibody), generally known EIA, RIA or FIA is known. Known labeling methods that are used (for example, Medical Chemistry Laboratory Course, Volume 8, edited by Yuichi Yamamura, 1st edition,
Nakayama Shoten, 1971; Illustrated fluorescent antibody, Akira Kawao, first edition,
Soft Science Co., Ltd., 1983; Enzyme-linked immunosorbent assay, Eiji Ishikawa, Tadashi Kawai, Kiyoshi Miyai, 2nd edition, Medical School, 1982, etc.)
Can be mentioned without exception, and it may be carried out according to these. Further, it goes without saying that a conventional method utilizing the reaction of avidin (or streptavidin) and biotin may be used as the labeling method.
【0026】本発明の測定対象である糖蛋白質が、それ
自身何らかの方法により測定(検出)可能なもの、例え
ば酵素である場合には、糖蛋白質自身のそのような性質
を利用して、測定対象の糖蛋白質と第1抗体(又は/及
び第2抗体)との複合体と第1抗体が結合していない測
定対象の糖蛋白質の測定(検出)を行い得ることは言う
までもない。尚、その際の測定は、自体公知の酵素活性
測定法に準じて行えばよいことは言うまでもない。When the glycoprotein to be measured according to the present invention is one that can be measured (detected) by some method itself, for example, an enzyme, such a property of the glycoprotein itself is used to measure the object. It goes without saying that it is possible to measure (detect) the glycoprotein to be measured in which the complex of the glycoprotein of 1) and the first antibody (or / and the second antibody) and the first antibody are not bound. Needless to say, the measurement at that time may be carried out according to a method for measuring enzyme activity known per se.
【0027】測定対象の糖蛋白質と第1抗体(又は/及
び第2抗体)との複合体と第1抗体が結合していない測
定対象の糖蛋白質とを、これらの性質の差を利用して分
別、測定するに当っては、通常のカラムクロマトグラフ
ィー法や電気泳動法を利用して行ってもよいが、高速液
体クロマトグラフィー(HPLC)法、キャピラリー電
気泳動法等を利用すればより短時間に且つ精度良く分別
測定が可能となるので望ましい。The complex of the glycoprotein to be measured and the first antibody (or / and the second antibody) and the glycoprotein to be measured to which the first antibody is not bound are utilized by utilizing the difference in these properties. The fractionation and measurement may be carried out by using an ordinary column chromatography method or electrophoresis method, but if using a high performance liquid chromatography (HPLC) method, a capillary electrophoresis method or the like, a shorter time is obtained. In addition, it is desirable because it enables accurate and precise measurement.
【0028】これら複合体の分別、測定をHPLCによ
り行う場合には、測定対象の糖蛋白質と第1抗体(又は
/及び第2抗体)との複合体と第1抗体が結合していな
い測定対象の糖蛋白質との性質の違いに応じて、或は第
1抗体に分離向上物質が結合されている場合にはその性
質に応じて選択された充填剤を充填したカラムを装着し
たHPLCにより分離する。次いで、分離されたこれら
複合体等をこれらの性質に応じた適当な測定方法、或は
第2抗体を使用している場合には第2抗体中の標識物質
が保有する性質に応じた測定方法により測定することに
より、試料中の測定対象の糖蛋白質の何れかの量が求め
られる。When the separation and measurement of these complexes are performed by HPLC, the complex of the glycoprotein to be measured and the first antibody (or / and the second antibody) and the measurement target in which the first antibody is not bound Separation by means of HPLC equipped with a column packed with a packing material selected depending on the difference in properties from the glycoprotein, or when the separation-improving substance is bound to the first antibody. . Then, an appropriate measuring method for the separated complexes or the like depending on their properties, or, if a second antibody is used, a measuring method according to the property of the labeling substance in the second antibody The amount of any of the glycoproteins to be measured in the sample can be determined by measuring with.
【0029】また、HPLCで使用されるカラムの充填
剤の種類も、測定対象の糖蛋白質と第1抗体(又は/及
び第2抗体)との複合体と第1抗体が結合していない測
定対象の糖蛋白質との性質の違いや分離向上物質の性質
に応じて適宜選択すれば足りる。以下に、測定対象の糖
蛋白質と第1抗体(又は/及び第2抗体)との複合体と
第1抗体が結合していない測定対象の糖蛋白質との性質
の違いや分離向上物質の性質に応じた、充填剤の選択方
法について更に詳細に説明する。Further, the type of the packing material of the column used in HPLC is also determined by the complex of the glycoprotein to be measured and the first antibody (or / and the second antibody) and the measurement object in which the first antibody is not bound. It may be appropriately selected depending on the difference in properties from the glycoprotein and the properties of the separation enhancing substance. The differences in the properties between the complex of the glycoprotein to be measured and the first antibody (or / and the second antibody) and the glycoprotein to be measured to which the first antibody is not bound, and the properties of the separation improving substance are described below. The method of selecting the filler in accordance with the method will be described in more detail.
【0030】ゲル瀘過用充填剤を用いる場合 分子量の差を利用して目的物とその他の共存物質とを分
離する性質を有する充填剤であるので、測定対象の糖蛋
白質と第1抗体(又は/及び第2抗体)との複合体の分
子量が第1抗体が結合していない測定対象の糖蛋白質の
分子量の1.2倍以上、好ましくは1.5倍以上、さらに好ま
しくは2倍以上であるか、或は分離向上物質としてはタ
ンパク質、ポリエチレングリコール等の合成高分子、ポ
リアミノ酸等の高分子物質を用いることにより、これら
の分子量比が上記した如く成る場合であれば、高分離能
が得られるので好ましく用いられる。上記の原理に基づ
く分離向上物質を使用する分離方法は、測定対象物質を
含む試料が、例えば血清の如く分析に影響を与える物質
を種々含んでおり、且つそれらの分子量に幅がある場合
に特に有効である。即ち、このような試料において共存
物質による影響を回避するには、分析に影響を与える物
質の分子量の最大値よりも、複合体の分子量を大きくす
れば良いのであるから、分離向上物質としてこの条件を
満足し得る分子量を有するものを選択して用いれば足り
る。また、分離向上物質を使用する分離方法を利用する
場合、ゲル瀘過用充填剤の分画分子量より大きい分子量
の分離向上物質を結合させた場合には、測定対象物質を
含む複合体はカラムのボイド部分に溶出するので、最も
短時間で分析できることになる。尚、この場合、分離向
上物質は単一分子量の物質ではなくてもよいこと、即ち
ゲル瀘過用充填剤の分画分子量より大きい分子量を有す
る物質であればよいことは言うまでもない。また、ゲル
瀘過用充填剤としては、例えばYMC-パック Diol-200
((株)ワイエムシー商品名)、YMC-パック Diol-300
((株)ワイエムシー商品名)、TSKゲル(東ソー(株)商品
名)等が挙げられる。When a gel filtration filler is used Since the filler has a property of separating the target substance from other coexisting substances by utilizing the difference in molecular weight, the glycoprotein to be measured and the first antibody (or And / or the second antibody) has a molecular weight of 1.2 times or more, preferably 1.5 times or more, more preferably 2 times or more the molecular weight of the glycoprotein to be measured to which the first antibody is not bound, or Is preferably a polymer, a synthetic polymer such as polyethylene glycol, or a polymeric substance such as polyamino acid as the separation-improving substance, because high separation ability can be obtained when the molecular weight ratio of these is as described above. Used. The separation method using the separation-enhancing substance based on the above principle is particularly effective when the sample containing the substance to be measured contains various substances such as serum that affect the analysis and the molecular weights thereof are wide. It is valid. That is, in order to avoid the influence of coexisting substances in such a sample, the molecular weight of the complex should be made larger than the maximum value of the molecular weight of the substance that affects the analysis. It is sufficient to select and use those having a molecular weight that satisfies Further, when utilizing a separation method using a separation improving substance, when a separation improving substance having a molecular weight larger than the cut-off molecular weight of the gel filtration filler is bound, the complex containing the substance to be measured is Since it elutes in the void portion, the analysis can be performed in the shortest time. In this case, it goes without saying that the separation improving substance does not have to be a substance having a single molecular weight, that is, a substance having a molecular weight higher than the molecular weight cut-off of the filler for gel filtration. Further, as the gel filtration filler, for example, YMC-pack Diol-200
(YMC Co., Ltd. product name), YMC-Pack Diol-300
(YMC product name), TSK gel (Toso Co., Ltd. product name) and the like.
【0031】疎水クロマトグラフィー用充填剤を用い
る場合 疎水性の差を利用して目的物とその他の共存物質とを分
離する性質を有する充填剤であるので、測定対象の糖蛋
白質と第1抗体(又は/及び第2抗体)との複合体の疎
水性が第1抗体が結合していない測定対象の糖蛋白質の
それと差があるか、或は分離向上物質として例えばα−
キモトリプシノーゲン,β−ガラクトシダーゼ等の疎水
度が高いタンパク質、例えばフェニルアラニン,プロリ
ン等の疎水性が高いアミノ酸を含むペプチド、例えばポ
リフェニルアラニン,ポリチロシン等の疎水性アミノ酸
のホモポリマー、炭素数3〜10のアルキル鎖、例えば臭
素,塩素,沃素等のハロゲン原子、例えばオクチルアミ
ン,EMCS,BMH等の疎水性の高い化学物質、例え
ばパルミチン酸,オレイン酸,ステアリン酸等の脂肪酸
等の複合体等の疎水度を適宜設定することができる物質
を使用した場合に利用可能である。尚、分離向上物質と
してペプチドを用いる場合は、疎水性の高いアミノ酸を
含むペプチドが好ましく、その鎖長の選択により疎水性
を調節すればよい。また、疎水性アミノ酸のみで構成さ
れたペプチド及びポリアミノ酸ではアミノ酸の数が15個
以上になると水への溶解度が低下するので2〜15個が好
ましい。分離向上物質がハロゲン原子の場合、第1抗体
を直接ハロゲン化すれば容易に得ることができ、導入ハ
ロゲン量を変えることにより適宜疎水性を調節できる。
疎水性の高い化学物質としては、上記したもの以外にも
アルキル鎖が長い物質が挙げられ、アルキル鎖長を適宜
選択することにより疎水性を調節することができる。ま
た、疎水性があまりにも高い分離向上物質は水への溶解
度が低いので、第1抗体と分離向上物質との結合反応時
に有機溶媒を用いる必要が生じ、得られる修飾された第
1抗体の変性や活性の低下が起こったり、或は、得られ
た修飾された第1抗体が水に不溶となる等の問題が生じ
る場合があるので、分離向上物質として好ましいものと
は言い難い。また、疎水クロマトグラフィー用充填剤と
しては、例えばブチル-NPR(東ソー(株)商品名)、ブチル
MCIゲル(三菱化成(株)商品名)、フェニル MCIゲル(三
菱化成(株)商品名)等が挙げられる。When a packing material for hydrophobic chromatography is used Since the packing material has a property of separating the target substance and other coexisting substances by utilizing the difference in hydrophobicity, the glycoprotein to be measured and the first antibody ( Or / and the hydrophobicity of the complex with the second antibody is different from that of the glycoprotein to be measured to which the first antibody is not bound, or as a separation enhancing substance, for example, α-
Proteins with high hydrophobicity such as chymotrypsinogen and β-galactosidase, for example, peptides containing highly hydrophobic amino acids such as phenylalanine and proline, homopolymers of hydrophobic amino acids such as polyphenylalanine and polytyrosine, having 3 to 10 carbon atoms Hydrophobicity of alkyl chains, for example, halogen atoms such as bromine, chlorine, iodine, etc., and highly hydrophobic chemical substances such as octylamine, EMCS, BMH, etc., such as complex of fatty acids such as palmitic acid, oleic acid, stearic acid, etc. It is available when a substance that can be set appropriately is used. When a peptide is used as the separation-improving substance, a peptide containing highly hydrophobic amino acids is preferable, and the hydrophobicity may be adjusted by selecting its chain length. Further, in the case of peptides and polyamino acids composed of only hydrophobic amino acids, when the number of amino acids is 15 or more, the solubility in water decreases, so 2 to 15 are preferable. When the separation improving substance is a halogen atom, it can be easily obtained by directly halogenating the first antibody, and the hydrophobicity can be appropriately adjusted by changing the amount of introduced halogen.
Examples of highly hydrophobic chemical substances include substances having a long alkyl chain in addition to those mentioned above, and the hydrophobicity can be adjusted by appropriately selecting the alkyl chain length. In addition, since the separation enhancing substance having too high hydrophobicity has low solubility in water, it is necessary to use an organic solvent during the binding reaction between the first antibody and the separation enhancing substance, which results in denaturation of the resulting modified first antibody. It may be difficult to say that it is preferable as a separation improving substance because it may cause a problem such as a decrease in the activity, or the obtained modified first antibody becomes insoluble in water. Further, as the packing material for hydrophobic chromatography, for example, butyl-NPR (Toso Co., Ltd. trade name), butyl
Examples include MCI gel (trade name of Mitsubishi Kasei Co., Ltd.) and phenyl MCI gel (trade name of Mitsubishi Kasei Co., Ltd.).
【0032】イオン交換クロマトグフィー用充填剤を
用いる場合 イオン性の差を利用して目的物とその他の共存物質とを
分離するので、測定対象の糖蛋白質と第1抗体(又は/
及び第2抗体)との複合体のイオン性が第1抗体が結合
していない測定対象の糖蛋白質のそれと差があるか、或
は分離向上物質として例えばリゾチーム,チトクローム
C等の塩基性タンパク質、例えばトリプシンインヒビタ
ー等の酸性タンパク質、例えばアルギニン,リジン等の
塩基性アミノ酸の残基又は、アスパラギン酸,グルタミ
ン酸等の酸性アミノ酸の残基を含むペプチド、上記した
如きアミノ酸残基を50個以上含むポリアミノ酸、例えば
パルミチン酸,オレイン酸,ステアリン酸等の脂肪酸等
を利用する場合に使用できる。尚、イオン交換クロマト
グラフィーに於ては、一般に、測定対象物をカラムに一
度吸着してから溶出するほうが、高分離能と高特異性が
得られることから、カチオン性分離向上物質を使用する
場合にはカチオン交換クロマトグラフィー用充填剤を、
アニオン性分離向上物質を使用する場合にはアニオン交
換クロマトグラフィー用充填剤を使用することが好まし
い。分離向上物質として塩基性アミノ酸残基(又は酸性
アミノ酸残基)のみで構成されたペプチドやポリアミノ
酸を使用する場合には、アミノ酸残基数を調節すること
により複合体の溶出時間を自由に調節できるが、アミノ
酸残基数として通常5個以上、好ましくは50個以上、更
に好ましくは100個以上から成るペプチド又はポリアミ
ノ酸を用いると、複合体の溶出位置が血清や尿中の生体
成分のそれと完全に分離できるので望ましい。また、上
記ペプチドやポリアミノ酸が合成ペプチド又は合成ポリ
アミノ酸の場合、ペプチド(又はポリアミノ酸)の長さ
とイオン性は比例関係にあるので、合成する際にペプチ
ド(又はポリアミノ酸)の長さを適宜調節して分離向上
物質として用いることにより、複合体等の溶出位置を容
易に調節することができる。また、測定に影響を与える
血清成分が複数の場合でも、分離向上物質を用いて複合
体等のイオン性をこれら血清成分が有するイオン性より
も大きくすることによりこれらの影響を回避することが
できる。尚、この場合に測定に要する時間を短縮したい
のであれば、リニアグラジエント法よりもステップワイ
ズグラジエント法を利用する方が望ましい。尚、イオン
交換クロマトグラフィーにより、測定対象の糖蛋白質と
第1抗体(又は/及び第2抗体)との複合体と、第1抗
体が結合していない測定対象の糖蛋白質とを分別する場
合には、測定対象の糖蛋白質を予めシアリダーゼで処理
しておいた方がよい場合もある。即ち、測定対象の糖蛋
白質の糖鎖の末端にシアル酸残基が結合している場合、
特に糖鎖が3〜4本に枝分かれしており且つその末端に
シアル酸残基が結合している場合には、シアル酸残基の
カルボキシル基の影響により、測定対象の糖蛋白質と第
1抗体(又は/及び第2抗体)との複合体と、第1抗体
が結合していない測定対象の糖蛋白質との分離が不充分
となる場合が有り得るので、これを防止するためであ
る。イオン交換クロマトグラフィー用の充填剤は、一般
に交換能(イオン性物質の絶対吸着能)が高いので血清
等の生体由来試料の如くイオン性の共存物質の絶対量が
多い試料の分析を行う場合であっても、分離向上物質の
結合した複合体等を全て吸着することができるので、該
複合体を共存物質による影響を殆ど回避できる位置に溶
出させることが可能である。また、本方法に利用できる
分離向上物質は、水に対する溶解度が高いので、これが
結合した複合体の水溶性は結合前のそれよりも高くなる
ので、本方法に於いては、分離向上物質が結合した複合
体の形成反応時に測定対象物の変性、失活が起こる可能
性は殆どない。イオン交換クロマトグラフィー用充填剤
としては、例えばDEAE-MCIゲル(三菱化成(株)商品
名)、QAE MCIゲル(三菱化成(株)商品名)、ワコービ
ーズDEAEゲル (和光純薬工業(株)商品名)、Poros Q
(Perseptive社製)、Poros PI(Perseptive社製)等の
アニオン交換クロマトグフィ用充填剤、或は例えばSP M
CIゲル(三菱化成(株)商品名)、CM MCIゲル(三菱化成
(株)商品名)、ワコービーズCMゲル(和光純薬工業(株)
商品名)、Poros S(Perseptive社製)、Poros CM(Per
septive社製)等のカチオン交換クロマトグラフィー用
充填剤等が挙げられる。When using a packing material for ion exchange chromatography: Since the target substance and other coexisting substances are separated by utilizing the difference in ionicity, the glycoprotein to be measured and the first antibody (or //
And a second antibody) has an ionicity different from that of the glycoprotein to be measured to which the first antibody is not bound, or a basic protein such as lysozyme or cytochrome C as a separation enhancing substance, For example, a peptide containing an acidic protein such as trypsin inhibitor, a residue of a basic amino acid such as arginine and lysine, or a residue of an acidic amino acid such as aspartic acid and glutamic acid, a polyamino acid containing 50 or more amino acid residues as described above. , For example, when fatty acids such as palmitic acid, oleic acid and stearic acid are used. In ion exchange chromatography, in general, it is better to adsorb the measurement target once on the column and then to elute, so that high resolution and high specificity can be obtained. Is a packing material for cation exchange chromatography,
When using an anionic separation enhancing substance, it is preferable to use a packing material for anion exchange chromatography. When using a peptide or polyamino acid composed of only basic amino acid residues (or acidic amino acid residues) as a separation improving substance, the elution time of the complex can be freely adjusted by adjusting the number of amino acid residues. However, if a peptide or polyamino acid consisting of 5 or more, preferably 50 or more, and more preferably 100 or more amino acid residues is used, the elution position of the complex is the same as that of biological components in serum or urine. It is desirable because it can be completely separated. Further, when the peptide or polyamino acid is a synthetic peptide or a synthetic polyamino acid, the length of the peptide (or polyamino acid) and the ionicity are in a proportional relationship. By adjusting and using it as a separation improving substance, the elution position of the complex or the like can be easily adjusted. Even when there are multiple serum components that affect the measurement, these effects can be avoided by using a separation-enhancing substance to make the ionicity of the complex or the like larger than the ionicity of these serum components. . In this case, if it is desired to reduce the time required for measurement, it is preferable to use the stepwise gradient method rather than the linear gradient method. When the complex of the glycoprotein to be measured and the first antibody (or / and the second antibody) and the glycoprotein to be measured to which the first antibody is not bound are separated by ion exchange chromatography, In some cases, it may be better to treat the glycoprotein to be measured with sialidase in advance. That is, when a sialic acid residue is bound to the end of the sugar chain of the glycoprotein to be measured,
In particular, when the sugar chain is branched into 3 to 4 and a sialic acid residue is bound to the end thereof, the glycoprotein to be measured and the first antibody are affected by the carboxyl group of the sialic acid residue. This is to prevent this because the separation between the complex with (or / and the second antibody) and the glycoprotein to be measured to which the first antibody is not bound may be insufficient. Since the packing material for ion exchange chromatography generally has a high exchange capacity (absolute adsorption capacity for ionic substances), it can be used when analyzing samples with a large absolute amount of ionic coexisting substances such as biological samples such as serum. Even if there is any, it is possible to adsorb all the complex or the like to which the separation improving substance is bound, so that the complex can be eluted at a position where the influence of the coexisting substance can be almost avoided. In addition, since the separation-enhancing substance that can be used in this method has high solubility in water, the water solubility of the complex to which it is bound is higher than that before the binding. There is almost no possibility of denaturation or deactivation of the measurement object during the reaction for forming the complex. Examples of the packing material for ion exchange chromatography include DEAE-MCI gel (trade name of Mitsubishi Kasei Co., Ltd.), QAE MCI gel (trade name of Mitsubishi Kasei Co., Ltd.), Wako beads DEAE gel (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Product name), Poros Q
(Perseptive), Poros PI (Perseptive), and other anion-exchange chromatographic fillers, or for example SP M
CI gel (trade name of Mitsubishi Kasei), CM MCI gel (Mitsubishi Kasei)
(Trade name), Wako beads CM gel (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
Product name), Poros S (manufactured by Perseptive), Poros CM (Per
and a packing material for cation exchange chromatography such as septive).
【0033】本発明の分別測定法に於ける、測定対象の
糖蛋白質と第1抗体(又は/及び第2抗体)との複合体
と第1抗体が結合していない測定対象の糖蛋白質との分
別、測定は上記した何れのクロマトグラフィーを利用し
たHPLCによっても実施可能であるが、中でもイオン
交換クロマトグラフィーの利用が本発明にとって最も好
ましい。その理由としては例えば以下のような点が挙げ
られる。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーを利用し
て分別、測定を実施するためには適当な長さのカラムを
用いることが必要であるので、ゲル濾過クロマトグラフ
ィーを利用した場合には、イオン交換クロマトグラフィ
ーを利用する場合に比較して分離時間が長くなるという
欠点がある。それ故、分離時間の短縮が要求されるとき
にはイオン交換クロマトグラフィーを利用する方が好ま
しい。さらに、ゲル濾過クロマトグラフィーには、非常
に高い分子量(分子の大きさが約1000オングストローム
以上)を持つ物質の分離には適していない、という欠点
もある。また、疎水クロマトグラフィーの場合、分離操
作の際に使用する有機溶媒により糖蛋白質の高次元構造
が破壊されて複合体中の測定対象の糖蛋白質の活性が失
われるという問題が生じる場合がある。このような理由
から、分離向上物質として高い疎水性を持つ物質を使用
することは好ましくない。さらに、分離向上物質として
疎水性物質が結合した第1抗体が結合した複合体の水溶
性が低下して沈澱し易くなるため分離が難しくなるとい
う問題もある。一方、イオン交換クロマトグラフィー
は、イオン性の微妙な違いに基づいて、より効果的に分
別、測定を行うことができる。更に、イオン交換クロマ
トグラフィーによれば、様々なイオン性を持つ分離向上
物質を任意に選択することができるので、最適pH条件
下で測定対象の糖蛋白質の分別、測定を行うことができ
る。更にまた、イオン交換クロマトグラフィーに於いて
用いられる分離向上物質は、それ自体高い水溶性を持つ
ので、分離向上物質を測定対象物質に結合させても、測
定対象物質の沈澱が起こる恐れは殆どなく、安定な状態
で分離操作を実行することが可能になる。In the differential measurement method of the present invention, the complex of the glycoprotein to be measured and the first antibody (or / and the second antibody) and the glycoprotein to be measured to which the first antibody is not bound Fractionation and measurement can be performed by HPLC using any of the above-mentioned chromatographies, but of these, the use of ion-exchange chromatography is most preferable for the present invention. The reason is as follows, for example. For example, in order to carry out fractionation and measurement using gel filtration chromatography, it is necessary to use a column of an appropriate length. Therefore, when gel filtration chromatography is used, ion exchange chromatography should be used. There is a drawback in that the separation time is longer than when using it. Therefore, it is preferable to utilize ion exchange chromatography when shortening the separation time is required. Further, gel filtration chromatography has a drawback that it is not suitable for separating substances having a very high molecular weight (molecular size is about 1000 angstrom or more). Further, in the case of hydrophobic chromatography, there may be a problem that the organic solvent used in the separation operation destroys the high-dimensional structure of the glycoprotein and the activity of the glycoprotein to be measured in the complex is lost. For this reason, it is not preferable to use a substance having high hydrophobicity as the separation improving substance. Further, there is a problem that the complex becomes difficult to separate because the water solubility of the complex bound with the first antibody bound with the hydrophobic substance as the separation-improving substance is lowered and the complex is easily precipitated. On the other hand, ion-exchange chromatography can more effectively perform separation and measurement based on the subtle difference in ionicity. Furthermore, according to ion exchange chromatography, a separation-improving substance having various ionic properties can be arbitrarily selected, so that the glycoprotein to be measured can be fractionated and measured under optimum pH conditions. Furthermore, since the separation-improving substance used in ion exchange chromatography has a high water solubility itself, even if the separation-improving substance is bound to the measurement target substance, there is almost no risk of precipitation of the measurement target substance. , It becomes possible to execute the separation operation in a stable state.
【0034】分離向上物質を使用して本発明の分別測定
法を実施した場合には、目的の測定対象糖蛋白質のピー
クを血清や尿等の成分の影響を受けない位置に移動させ
ることができる。そればかりか、測定対象に応じて適宜
分離向上物質を選択して用いることにより、種々の測定
対象に係わる複合体の溶出位置を一致させることができ
るので、特定分析条件下のHPLCを用いて、多種の測
定対象物質の測定を行うことができるという効果も生ず
る。When the fractionation-measuring method of the present invention is carried out using a separation-enhancing substance, the peak of the target glycoprotein to be measured can be moved to a position that is not affected by components such as serum and urine. . Not only that, by appropriately selecting and using a separation-enhancing substance according to the measurement target, it is possible to match the elution position of the complex relating to various measurement targets, so using HPLC under specific analysis conditions, The effect that various kinds of substances to be measured can be measured is also produced.
【0035】標識物質が結合された第1抗体(又は/及
び第2抗体)を使用する本発明の分別測定法に於いて、
HPLCにより分離された、測定対象の糖蛋白質と第1
抗体(又は/及び第2抗体)との複合体と第1抗体が結
合していない測定対象の糖蛋白質(第2抗体が結合して
いるものも含む。)中に含まれる標識物質(測定対象の
糖蛋白質自身が何らかの方法により測定可能である場合
にはそれ自身)の量の測定は、標識物質(又は測定対象
の糖蛋白質自身)が有している、何らかの方法により測
定(検出)し得る性質に応じて夫々所定の方法に従って
実施される。例えば、その性質が酵素活性の場合にはE
IAの常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質 核酸 酵
素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮
治編集、51〜63頁、共立出版(株)、1987年9月10日発
行」等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、標
識物質が放射性物質の場合にはRIAの常法に従い、該
放射性物質の出す放射線の種類及び強さに応じて液浸型
GMカウンター,液体シンチレーションカウンター,井
戸型シンチレーションカウンター,HPLC用カウンタ
ー等の測定機器を適宜選択して使用し、測定を行えばよ
い(例えば医化学実験講座、第8巻、山村雄一監修、第
1版、中山書店、1971等参照。)。また、その性質が蛍
光性の場合には蛍光光度計等の測定機器を用いるFIA
の常法、例えば「図説 蛍光抗体、川生明著、第1版、
(株)ソフトサイエンス社、1983」等に記載された方法に
準じて測定を行えばよく、その性質が発光性の場合には
フォトンカウンター等の測定機器を用いる常法、例えば
「酵素免疫測定法、蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北
川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、252〜263
頁、共立出版(株)、1987年9月10日発行」等に記載さ
れた方法に準じて測定を行えばよい。更に、その性質が
紫外部に吸収を有する性質の場合には分光光度計等の測
定機器を用いる常法によって測定を行えばよく、標識物
質がスピンの性質を有する物質の場合には電子スピン共
鳴装置を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質
核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫
・石川榮治編集、264〜271頁、共立出版(株)、1987年
9月10日発行」等に記載された方法に準じて夫々測定を
行えばよい。In the differential assay method of the present invention using the first antibody (or / and the second antibody) to which the labeling substance is bound,
Glycoprotein to be measured and first separated by HPLC
The labeling substance (measurement target) contained in the glycoprotein (including the second antibody binding) of the measurement target in which the complex with the antibody (or / and the second antibody) is not bound to the first antibody When the glycoprotein itself is measurable by any method, the amount of the glycoprotein itself can be measured (detected) by any method possessed by the labeling substance (or the glycoprotein itself to be measured). It is carried out according to a predetermined method depending on the nature. For example, if the property is enzymatic activity, E
Conventional methods of IA, for example, “Enzyme-linked immunosorbent assay, protein / nucleic acid / enzyme separate volume No. 31, edited by Tsunehiro Kitagawa, Toshio Minamihara, Akio Tsuji, Eiji Ishikawa, pages 51-63, Kyoritsu Publishing Co., Ltd., September 10, 1987. According to the standard method of RIA when the labeled substance is a radioactive substance, the immersion type is used according to the type and intensity of the radiation emitted by the radioactive substance. A measurement device such as a GM counter, a liquid scintillation counter, a well-type scintillation counter, or an HPLC counter may be appropriately selected and used for measurement (eg, medical chemistry experiment course, Volume 8, supervised by Yuichi Yamamura, 1st edition). , Nakayama Bookstore, 1971 etc.). When the property is fluorescent, FIA using a measuring device such as a fluorometer
Common method, for example, "Illustrated fluorescent antibody, Akira Kawao, 1st edition,
The measurement may be performed according to the method described in "Soft Science Co., Ltd., 1983" and the like. When the property is luminescent, a conventional method using a measuring device such as a photon counter, for example, "enzyme immunoassay method" , Protein Nucleic Acid Enzymes Separate Volume No.31, edited by Tsunehiro Kitagawa, Toshio Minamihara, Akio Tsuji, Eiji Ishikawa, 252-263
Page, Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., published on September 10, 1987 ”and the like. Further, when the property has absorption in the ultraviolet, the measurement may be carried out by a conventional method using a measuring device such as a spectrophotometer, and when the labeled substance is a substance having a spin property, electron spin resonance A conventional method using an apparatus, for example, “enzyme immunoassay, protein / nucleic acid / enzyme separate volume No. 31, edited by Tsunehiro Kitagawa, Toshio Minamihara, Akio Tsuji, Eiji Ishikawa, pages 262-171, Kyoritsu Publishing Co., Ltd., September 1987. The measurement may be performed according to the method described in "Issued on the 10th".
【0036】本発明の分別測定法に於いて、測定対象の
糖蛋白質と第1抗体(又は/及び第2抗体)との複合体
と第1抗体が結合していない測定対象の糖蛋白質との分
別、測定を行う際に用いられるHPLCとしては、装置
自身は通常分析の分野に於いて用いられているもので定
流速が得られるものであれば特に問題なく用いることが
できる。In the differential measurement method of the present invention, the complex of the glycoprotein to be measured and the first antibody (or / and the second antibody) and the glycoprotein to be measured to which the first antibody is not bound As the HPLC used for the fractionation and measurement, the apparatus itself can be used without any particular problem as long as it is one that is usually used in the field of analysis and a constant flow rate can be obtained.
【0037】HPLCにより測定対象の糖蛋白質と第1
抗体(又は/及び第2抗体)との複合体と第1抗体が結
合していない測定対象の糖蛋白質との分別、測定を行う
際に用いられる溶媒(溶離液)としては、形成された複
合体等が再び測定対象の糖蛋白質とレクチン(又は第1
抗体)とに分解されるようなことがなく、且つ糖蛋白質
自身が有しているか、或は第1抗体(又は/及び第2抗
体)が保持している標識物質が有している、何らかの方
法により検出し得る性質を失わしめるようなものでなけ
れば特に限定されることなく挙げられるが、通常は例え
ばEIA,RIA,FIA,アフィニティクロマトグラ
フィー等の自体公知の方法に於いて緩衝液として用いら
れているようなものが好ましく用いられる。具体例とし
ては、例えばリン酸塩,酢酸塩,クエン酸塩,グッド(G
ood)の緩衝剤,トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタ
ン等の緩衝剤、例えば塩化ナトリウム,塩化カリウム,
硫酸アンモニウム等の塩類、例えばメタノール,エタノ
ール,イソプロピルアルコール,アセトニトリル,テト
ラヒドロフラン等の極性有機溶媒類及び界面活性剤等
を、複合体等の性質に応じて適宜選択し、添加、混合し
て調製された、pH2〜10の緩衝液が好ましく用いられ
る。Glycoprotein to be measured by HPLC and the first
As the solvent (eluent) used for the separation and measurement of the complex with the antibody (or / and the second antibody) and the glycoprotein to be measured to which the first antibody is not bound, the complex formed is used. The body etc. again measure the glycoprotein and lectin (or the first
Antibody) and is not possessed by the glycoprotein itself, or is possessed by the labeling substance retained by the first antibody (or / and the second antibody), There is no particular limitation as long as it does not lose the property detectable by the method, but it is usually used as a buffer in a method known per se such as EIA, RIA, FIA, affinity chromatography and the like. Those described above are preferably used. Specific examples include, for example, phosphate, acetate, citrate, Good (G
ood) buffers, buffers such as tris (hydroxymethyl) aminomethane, such as sodium chloride, potassium chloride,
Salts such as ammonium sulfate, for example, polar organic solvents such as methanol, ethanol, isopropyl alcohol, acetonitrile, tetrahydrofuran and surfactants, etc. are appropriately selected according to the properties of the complex, etc., added, prepared by mixing. A buffer having a pH of 2 to 10 is preferably used.
【0038】また、本発明の分別測定法に於て、測定対
象の糖蛋白質と第1抗体(又は/及び第2抗体)との複
合体と第1抗体が結合していない測定対象の糖蛋白質と
の測定をHPLCによる分別後に行う場合の測定方式と
しては、例えば「最新液体クロマトグラフィ、原昭二・
辻章夫編、第1版、92〜104頁、南山堂、1978年2月1
日発行」等に記載されているような、HPLCのカラム
からの流出液をそのまま検出部に導き、流出液中の複合
体等に含まれる糖蛋白質自身或は第1抗体(又は/及び
第2抗体)が保持している標識物質量を直接測定する方
式が、測定が迅速に行えるのでより好ましい。この場合
に、複合体等に含まれる糖蛋白質自身或は第1抗体(又
は/及び第2抗体)が保持している標識物質が有してい
る、何らかの方法により検出し得る性質が、例えば酵素
活性であれば、HPLCのカラムと検出部との間に、酵
素活性測定用の試薬を添加し流出液と反応させる、所謂
ポストカラム法の反応部を設ける必要があることは言う
までもない。その性質が酵素活性である場合に該反応部
に於いて用いられる酵素活性測定用の試薬は、常法、例
えば「酵素免疫測定法、蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.3
1、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、51〜6
3頁、共立出版(株)、1987年9月10日発行」等に記載
された方法に準じて調製したものを用いてもよいし、市
販されている臨床検査用キットの試薬を適宜選択して利
用してもよい。また、その性質が酵素活性以外の場合に
於いても、検出感度を増加させる目的で所定の試薬を添
加、反応させるために、HPLCのカラムと検出部との
間に適当な反応部を設けることは任意である。In the differential assay method of the present invention, the complex of the glycoprotein to be assayed and the first antibody (or / and the second antibody) and the glycoprotein to be assayed in which the first antibody is not bound As a measurement method in the case of performing measurement with and after separation by HPLC, for example, “Latest Liquid Chromatography, Shoji Hara
Atsuo Tsuji, 1st edition, pages 92-104, Nanzandou, February 1978 1
The effluent from the column of HPLC as described in "Issuance by the Sun" etc. is directly introduced to the detection unit, and the glycoprotein itself or the first antibody (or / and the second antibody) contained in the complex etc. in the effluent is The method of directly measuring the amount of the labeling substance held by the antibody) is more preferable because the measurement can be performed quickly. In this case, the glycoprotein itself contained in the complex or the like or the labeling substance held by the first antibody (or / and the second antibody) has a property that can be detected by any method, for example, an enzyme. Needless to say, if it is active, it is necessary to provide a reaction part of a so-called post-column method between the HPLC column and the detection part, in which a reagent for measuring enzyme activity is added to react with the effluent. When the property is enzymatic activity, the reagent for measuring the enzymatic activity used in the reaction part is a conventional method, for example, “enzyme immunoassay, protein nucleic acid enzyme separate volume No. 3”.
1, edited by Tsunehiro Kitagawa, Toshio Minamihara, Akio Tsuji, Eiji Ishikawa, 51-6
3 page, Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., published September 10, 1987 "may be used, or the reagents of commercially available clinical test kits may be appropriately selected. You may use it. Even when the property is other than enzyme activity, an appropriate reaction part should be provided between the HPLC column and the detection part in order to add and react a predetermined reagent for the purpose of increasing the detection sensitivity. Is optional.
【0039】本発明の分別測定法でHPLCを使用する
場合に用いられる溶離液として成分の異なるものを複数
用いる場合には、その操作法としては濃度勾配法(リニ
アグラジエント法)により行ってもステップワイズグラ
ジエント法により行っても何れにても良いが、ステップ
ワイズグラジエント法には、操作が簡便であること、実
際の分析時間を短くすることができること、目的のピー
クがシャープになること等の利点があるので、より望ま
しい。When a plurality of eluents having different components are used when HPLC is used in the fractional measurement method of the present invention, the concentration gradient method (linear gradient method) may be used as the operating method. Although it may be carried out by the wise gradient method or any method, the stepwise gradient method has advantages such as easy operation, shortening the actual analysis time, and sharpening the target peak. Is more desirable.
【0040】また、本発明の分別測定法は、自体公知の
EIA、RIA、FIA等の免疫学的測定法に応用する
ことも当然のことながら可能である。以下に実施例を挙
げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれ
らにより何ら限定されるものではない。The fractional measurement method of the present invention can be naturally applied to immunological measurement methods such as EIA, RIA and FIA known per se. Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
【0041】[0041]
実施例1.レンズマメレクチン(LCA)−Aを用いた
AFP糖鎖による分別測定 (レクチン溶液)LCA−A(ホーネン(株)製)を、
50mM 3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)緩
衝液(pH7.5)に1mg/mlとなるように溶解したものをレ
クチン溶液とした。 (第1抗体溶液)全てのAFPと結合する性質を有する
が、LCA−Aと結合したAFPとの結合は妨げられる
ことを確認した抗AFPモノクローナル抗体(和光純薬
工業(株)製)を常法により処理してFab’とし、これ
に、二価性架橋剤であるN-(8-マレイミドカプリロキシ)
スルフォスクシンイミド((株)同仁化学製)を用いる
常法によりポリアスパラギン酸(平均分子量2880
0、シグマ社製)を結合させて、ポリアスパラギン酸結
合抗AFP−Fab’(Fab'-pAsp)を得、これを50mM MO
PS緩衝液(pH7.5)中に13.5μMとなるように添加した
ものを第1抗体溶液とした 。 (第2抗体溶液)第1抗体溶液を調製するのに用いた抗
体と抗原認識部位が異なり、全てのAFPと結合する性
質を有し、且つLCA−Aと結合したAFPにも結合し
得る性質を有することを確認した抗AFPモノクローナ
ル抗体(和光純薬工業(株)製)を常法により処理して
Fab’とし、これに、二価性架橋剤であるN-(8-マレイ
ミドカプリロキシ)スルフォスクシンイミド((株)同仁
化学製)を用いる常法により西洋ワサビペルオキシダー
ゼ(POD、東洋紡績(株)社製)を結合させて、PO
D標識抗AFP−Fab’をを得、これを50mM MOPS緩衝
液(pH7.5)中に100nMとなるように添加したものを第
2抗体溶液とした。 (試料溶液)LCA−A結合型AFP(肝細胞癌型AF
P)又はLCA−A非結合型AFP(正常型AFP)
を、50mM MOPS緩衝液(pH7.5、0.2W/V%牛血清アルブミ
ンを含有。)に100ng/mlとなるように添加し、肝細胞癌
型AFP溶液及び正常型AFP溶液を夫々調製した。両
AFP溶液を表1のような比率で混合して試料溶液を調
製した。Example 1. Fractional measurement by AFP sugar chain using lentil lectin (LCA) -A (lectin solution) LCA-A (Hornen Co., Ltd.)
A lectin solution was prepared by dissolving 1 mM / ml in 50 mM 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) buffer (pH 7.5). (First antibody solution) An anti-AFP monoclonal antibody (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), which has the property of binding to all AFPs, but was confirmed to prevent binding to AFPs bound to LCA-A, is always used. Fab 'by treatment with a divalent cross-linking agent N- (8-maleimidocapryloxy)
Polyaspartic acid (average molecular weight 2880) was prepared by a conventional method using sulfosuccinimide (manufactured by Dojindo Co., Ltd.).
0, manufactured by Sigma) was bound to obtain polyaspartic acid-conjugated anti-AFP-Fab '(Fab'-pAsp), which was 50 mM MO.
The first antibody solution was prepared by adding 13.5 μM to PS buffer (pH 7.5). (Second antibody solution) The antibody used for preparing the first antibody solution has a different antigen recognition site from the antigen recognition site, has a property of binding to all AFPs, and also has a property of binding to AFPs bound to LCA-A. An anti-AFP monoclonal antibody (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) confirmed to have Fab was treated with a conventional method to give Fab ′, to which a divalent cross-linking agent N- (8-maleimidocapryloxy) was added. Horseradish peroxidase (POD, manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was bound by a conventional method using sulfosuccinimide (manufactured by Dojindo Co., Ltd.) to obtain PO.
D-labeled anti-AFP-Fab ′ was obtained, and this was added to 50 mM MOPS buffer (pH 7.5) at 100 nM to give a second antibody solution. (Sample solution) LCA-A binding type AFP (hepatocellular carcinoma type AF
P) or LCA-A non-binding AFP (normal AFP)
Was added to 50 mM MOPS buffer (pH 7.5, containing 0.2 W / V% bovine serum albumin) at 100 ng / ml to prepare a hepatocellular carcinoma type AFP solution and a normal type AFP solution, respectively. Both AFP solutions were mixed at the ratios shown in Table 1 to prepare a sample solution.
【表1】 *表中の数字は各々の溶液の混合比率(%)を表わす。 (HPLC条件)HPLC構成図を図3に示す。 ・カラム:WAKOPAK MCI CQA-31S (4.6mmIDx10mm)。 ・溶離液A:50mM MOPS緩衝液(pH7.5、50mM 塩化ナト
リウム含有)。 ・溶離液B:50mM MOPS緩衝液(pH7.5、1M 塩化ナト
リウム含有)。 ・基質液:50mM MOPS緩衝液[pH7.5、100mM 3-(p-ヒド
ロキシフェニル)プロピオン酸及び20mM 過酸化水素を含
有]。 ・グラジェント:0〜5分 溶離液B 0% 5〜8分 溶離液B 20% 8〜12分 溶離液B 80% ・流速:溶離液A+B 1ml/分 基質溶液 0.1ml/分 ・発色コイル温度: 55℃ ・蛍光検出:励起波長 320nm/蛍光波長 404nm。 (測定方法)レクチン溶液 200μlと第2抗体溶液 10
μlの混合溶液に所定の試料溶液 10μlを加え10℃で1
5分間反応させた。この反応混液に第1抗体溶液 10μl
を加えて更に2分間反応させた後、反応混液100μlを
HPLCで分析した。 (結果)HPLCによる分離パターンを図1に示す。
尚、図1に於いて、ピーク1は第1抗体が結合していな
いAFPのピークを、また、ピーク2は第1抗体が結合
したAFPのピークを夫々示す。また、各種試料溶液に
ついての各ピーク面積値及び2つのピーク面積値の合計
を、各種試料溶液に於ける肝細胞癌型AFP溶液及び正
常型AFP溶液との混合比に基づいて図2に示す。尚、
図2に於いて、□はピーク1の面積値を、+はピーク2
の面積値を、また、◇はピーク1とピーク2の面積値の
合計を夫々示す。図2の結果から明らかな如く、ピーク
1の面積値は試料溶液中の肝細胞癌型AFP溶液量の増
加に比例して増加し、ピーク2の面積値は試料溶液中の
正常型AFP溶液量の減少に比例して減少するが、ピー
ク1とピーク2の面積値の合計は各種試料溶液について
ほぼ一定の値を示すこと、言い換えれば、これら2つの
ピーク面積値を利用することにより、試料溶液中に含ま
れる肝細胞癌型AFP量と総AFP濃度を同時に測定す
ることが可能であることが判る。実施例2.シアリダー
ゼ処理によるAFPのフコース付加率測定値の変化 (シアリダーゼ溶液)シアリダーゼ(東洋紡績(株)
製)を50mM MOPS緩衝液(pH7.5)に200Unit/mlとなるよう
に溶解したものをシアリダーゼ溶液とした。 (レクチン溶液)レンズ豆レクチン(LCA)−A(ホ
ーネン(株)製)を50mM MOPS緩衝液(pH7.5)に1mg/ml
となるように溶解したものをレクチン溶液とした。 (抗体溶液1)LCA−Aと競合する抗AFPモノクロ
ーナル抗体(和光純薬工業(株)製)を常法により処理
してFab’とし、これに、二価性架橋剤[N-(8-マレイ
ミドカプリロキシ)スルホスクシンイミド、(株)同仁
化学製]を用いる常法によりポリアスパラギン酸(平均
分子量28800、シグマ社製)を結合させてポリアス
パラギン酸結合抗AFP−Fab’(Fab'-pAsp)とした。
これを、50mM MOPS緩衝液(pH7.5)中に13.5μMとなるよ
うに添加したものを抗体溶液1とした。 (抗体溶液2)抗体溶液1で用いた抗体と競合しない抗
AFPモノクローナル抗体(和光純薬工業(株)製)を
常法により処理してFab’とし、これに、二価性架橋剤
[N-(8-マレイミドカプリロキシ)スルホスクシンイミ
ド、(株)同仁化学製]を用いる常法により西洋ワサビ
ペルオキシダ−ゼ(POD、シグマ社製)を標識してP
OD標識抗AFP−Fab’とした。これを、50mM MOPS
緩衝液(pH7.5)中に100nMとなるように添加したものを
抗体溶液2とした。 (試料溶液)AFP-レクチン分画キットL(和光純薬
工業(株)製)を使用したレクチンゲル電気泳動法(操
作はキットに添付された現品説明書の標準操作法によ
る。)により予めフコース付加率を測定した肝細胞ガン
患者血清3検体を、50mM MOPS緩衝液(pH7.5、0.2W/V%
牛血清アルブミンを含む。)でAFP値が100ng/mlとな
るように希釈したものを、夫々試料溶液1、2及び3と
した。 (HPLC条件)HPLC概略図を図3に示す。 ・カラム:Wakopak MCI CQA-31S (4.6mmIDx10mm、和光
純薬工業(株)製)。 ・溶離液A:50mM MOPS緩衝液(pH7.5、50mMの塩化ナト
リウム含有。)。 溶離液B:50mM MOPS緩衝液(pH7.5、1Mの塩化ナトリ
ウム含有。)。 基質液:50mM MOPS緩衝液(pH7.5、100mMの3-(p-ヒドロ
キシフェニル)プロピオン酸及び20mMの過酸化水素を含
有。)。 ・グラジェント条件:0〜5分 溶離液B 0% 5〜8分 溶離液B 20% 8〜12分 溶離液B 80% ・流速:溶離液A+B 1ml/分。 基質溶液 0.1ml/分。 ・発色コイル温度: 55℃。 ・蛍光検出:励起波長 320nm/蛍光波長 404nm。 (測定方法)シアリダーゼ溶液 10μl、レクチン溶液
100μl、抗体溶液2 5μl及び所定の試料溶液 10μ
lを混合し、10℃で3分間反応させた。この反応混液に
抗体溶液1 10μlを加えて更に37℃で4分間反応させ
た。反応終了後、反応混液100μlを上記条件でHPL
Cにより分析し、夫々の試料溶液についてピーク1(第
1抗体が結合していないAFPのピーク)の面積及びピ
ーク2(第1抗体が結合したAFPのピーク)の面積を
求め、以下の式に当てはめてピーク1比(%)を求め
た。 ピーク1比(%)=(ピーク1の面積)/(ピーク1及び2の
面積の和)×100 また、試料溶液の代わりに、フコース付加率0%のAF
P又はフコース付加率100%のAFP[フコース付加率
は何れもAFP-レクチン分画キットL(和光純薬工業
(株)製)により求めた。]を100ng/ml含む50mM MOPS
緩衝液(pH7.5、0.2% 牛血清アルブミンを含む。)を用
いた以外は上記と同じ溶液類を用いて同様の反応を行っ
て得られた反応液についても、上記と同様の操作により
HPLCにより分析し、夫々の試料溶液についてピーク
1の面積及びピーク2の面積を求め、上記の式に当ては
めてピーク1比(%)を求めた。得られたデータからピ
ーク1比とフコース付加率との関係を表す検量線を作成
し、この検量線に試料溶液1、2及び3について得られ
たピーク1比を当てはめ、夫々の試料溶液中のAFPの
フコース付加率を求めた。更にまた、シアリダーゼ溶液
10μlの代りに、50mM MOPS緩衝液(pH7.5) 10μlを用
いた以外は上記と同じ溶液類を用いて同様の反応を行っ
たものについても、上記と同様の操作により分析し、夫
々の試料溶液中のAFPのフコース付加率を求めた。 (結果)試料溶液1〜3のフコース付加率について、レ
クチンゲル電気泳動法により得られた値と上記本発明の
方法により得られた値を表2に併せて示す。[Table 1] * The numbers in the table represent the mixing ratio (%) of each solution. (HPLC conditions) An HPLC configuration diagram is shown in FIG. -Column: WAKOPAK MCI CQA-31S (4.6mmIDx10mm). Eluent A: 50 mM MOPS buffer (pH 7.5, containing 50 mM sodium chloride). Eluent B: 50 mM MOPS buffer (pH 7.5, containing 1M sodium chloride). Substrate solution: 50 mM MOPS buffer [pH 7.5, containing 100 mM 3- (p-hydroxyphenyl) propionic acid and 20 mM hydrogen peroxide].・ Gradient: 0 to 5 minutes Eluent B 0% 5 to 8 minutes Eluent B 20% 8 to 12 minutes Eluent B 80% ・ Flow rate: Eluent A + B 1 ml / min Substrate solution 0.1 ml / min ・ Color coil temperature : 55 ° C ・ Fluorescence detection: excitation wavelength 320 nm / fluorescence wavelength 404 nm. (Measurement method) 200 μl of lectin solution and second antibody solution 10
Add 10 μl of the specified sample solution to the mixed solution of μl, and add 1 at 10 ℃.
Allowed to react for 5 minutes. 10 μl of the first antibody solution was added to this reaction mixture.
Was added and reacted for another 2 minutes, then 100 μl of the reaction mixture was analyzed by HPLC. (Result) The separation pattern by HPLC is shown in FIG.
In addition, in FIG. 1, peak 1 shows the peak of AFP to which the first antibody is not bound, and peak 2 shows the peak of AFP to which the first antibody is bound. In addition, each peak area value and the sum of the two peak area values for each sample solution are shown in FIG. 2 based on the mixing ratio of the hepatocellular carcinoma type AFP solution and the normal type AFP solution in each sample solution. still,
In Fig. 2, □ is the area value of peak 1, and + is the peak 2.
Indicates the area value of, and ⋄ indicates the sum of the area values of peak 1 and peak 2. As is clear from the results of FIG. 2, the area value of peak 1 increases in proportion to the increase in the amount of hepatocellular carcinoma type AFP solution in the sample solution, and the area value of peak 2 shows the amount of normal type AFP solution in the sample solution. However, the sum of the area values of peak 1 and peak 2 shows a substantially constant value for each sample solution, in other words, by using these two peak area values, the sample solution It is understood that it is possible to simultaneously measure the amount of hepatocellular carcinoma type AFP contained therein and the total AFP concentration. Example 2. Change in measured value of fucose addition rate of AFP by sialidase treatment (sialidase solution) sialidase (Toyobo Co., Ltd.)
The product was dissolved in 50 mM MOPS buffer (pH 7.5) at 200 Unit / ml to give a sialidase solution. (Lectin solution) Lentil lectin (LCA) -A (Hornen Co., Ltd.) was added to 50 mM MOPS buffer (pH 7.5) at 1 mg / ml.
What was melt | dissolved so that it was set as lectin solution. (Antibody solution 1) An anti-AFP monoclonal antibody (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) that competes with LCA-A was treated by a conventional method to give Fab ', to which a divalent crosslinking agent [N- (8- Maleimidocapryloxy) sulfosuccinimide, manufactured by Dojindo Co., Ltd.] to bind polyaspartic acid (average molecular weight 28800, manufactured by Sigma) by a conventional method, and polyaspartic acid-bonded anti-AFP-Fab '(Fab'-pAsp). And
This was added to 50 mM MOPS buffer (pH 7.5) so as to have a concentration of 13.5 μM, which was designated as antibody solution 1. (Antibody solution 2) An anti-AFP monoclonal antibody (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) that does not compete with the antibody used in antibody solution 1 was treated by a conventional method to give Fab ', and a divalent crosslinking agent [N -(8-maleimidocapryloxy) sulfosuccinimide, manufactured by Dojindo Chemical Co., Ltd.] was used to label horseradish peroxidase (POD, manufactured by Sigma) by a conventional method.
It was designated as OD-labeled anti-AFP-Fab '. This is 50mM MOPS
Antibody solution 2 was prepared by adding 100 nM to a buffer solution (pH 7.5). (Sample solution) Add fucose in advance by lectin gel electrophoresis using the AFP-lectin fractionation kit L (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (the operation is according to the standard operation method in the instruction manual attached to the kit). The sera of 3 patients with hepatocellular carcinoma whose rates were measured were treated with 50 mM MOPS buffer (pH 7.5, 0.2 W / V%
Contains bovine serum albumin. The sample solutions 1, 2 and 3 were diluted so that the AFP value was 100 ng / ml. (HPLC conditions) A schematic HPLC diagram is shown in FIG. -Column: Wakopak MCI CQA-31S (4.6mmIDx10mm, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Eluent A: 50 mM MOPS buffer (pH 7.5, containing 50 mM sodium chloride). Eluent B: 50 mM MOPS buffer (pH 7.5, containing 1 M sodium chloride). Substrate solution: 50 mM MOPS buffer (pH 7.5, containing 100 mM 3- (p-hydroxyphenyl) propionic acid and 20 mM hydrogen peroxide). Gradient conditions: 0 to 5 minutes Eluent B 0% 5 to 8 minutes Eluent B 20% 8 to 12 minutes Eluent B 80% Flow rate: Eluent A + B 1 ml / min. Substrate solution 0.1 ml / min.・ Color coil temperature: 55 ℃. -Fluorescence detection: excitation wavelength 320 nm / fluorescence wavelength 404 nm. (Measurement method) Sialidase solution 10 μl, lectin solution
100 μl, antibody solution 25 μl and predetermined sample solution 10 μl
1 was mixed and reacted at 10 ° C. for 3 minutes. To this reaction mixture, 10 μl of antibody solution 1 was added and further reacted at 37 ° C. for 4 minutes. After the reaction was completed, 100 μl of the reaction mixture was added to HPL under the above conditions.
The area of peak 1 (peak of AFP to which the first antibody is not bound) and peak 2 (peak of AFP to which the first antibody is bound) are obtained for each sample solution by C, and the following formula is used. The peak 1 ratio (%) was determined by fitting. Peak 1 ratio (%) = (area of peak 1) / (sum of areas of peaks 1 and 2) × 100 In place of the sample solution, AF with a fucose addition rate of 0%
P or AFP with a fucose addition rate of 100% [Fucose addition rate was determined by AFP-lectin fractionation kit L (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). ] 50 mM MOPS including 100 ng / ml
The reaction solution obtained by performing the same reaction using the same solutions as above, except that the buffer solution (pH 7.5, containing 0.2% bovine serum albumin) was used, was analyzed by the same procedure as above. The area of peak 1 and the area of peak 2 were determined for each sample solution, and the peak 1 ratio (%) was determined by applying the above equation. A calibration curve representing the relationship between the peak 1 ratio and the fucose addition rate was created from the obtained data, and the peak 1 ratios obtained for sample solutions 1, 2 and 3 were applied to this calibration curve to determine the concentration in each sample solution. The fucose addition rate of AFP was calculated. Furthermore, sialidase solution
The same reaction was carried out using the same solutions as above except that 10 μl of 50 mM MOPS buffer (pH 7.5) was used instead of 10 μl. The fucose addition rate of AFP in the solution was determined. (Results) With respect to the fucose addition rates of the sample solutions 1 to 3, Table 2 shows the values obtained by the lectin gel electrophoresis method and the values obtained by the method of the present invention.
【表2】 表2の結果から明らかな如く、AFP糖鎖の非還元末端
側の糖残基をシアリダーゼ処理によって除去することに
より、フコース付加AFP量を迅速且つ精度良く測定し
得るようになることが判る。[Table 2] As is clear from the results in Table 2, it is understood that the amount of fucose-added AFP can be measured quickly and accurately by removing the sugar residue on the non-reducing end side of the AFP sugar chain by treating with sialidase.
【0042】[0042]
【発明の効果】以上述べたことから明らかな如く、本発
明は、疾病における糖蛋白質糖鎖の構造変化の程度を高
精度に、しかも迅速且つ簡便に測定することができる方
法を提供するものであり、本発明を利用することによ
り、糖蛋白質糖鎖の構造変化の程度を利用した癌等の診
断に新しい情報を提供することが可能となる、という効
果を奏するものであり、斯業に貢献するところ大なる発
明である。EFFECTS OF THE INVENTION As is clear from the above, the present invention provides a method capable of measuring the degree of structural change of a glycoprotein sugar chain in a disease with high precision, quickly and simply. Therefore, by utilizing the present invention, it is possible to provide new information in the diagnosis of cancer and the like using the degree of structural change of the glycoprotein sugar chain, it has an effect of contributing to the industry This is a great invention.
【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]
【図1】実施例1で得られた、高速液体クロマトグラフ
ィー(HPLC)による分離パターンを示すものであ
る。FIG. 1 shows a separation pattern by high performance liquid chromatography (HPLC) obtained in Example 1.
【図2】実施例1で得られた、各種試料溶液についての
各ピーク面積値及び2つのピーク面積値の合計を、各種
試料溶液に於ける肝細胞癌型α-フェトプロティン(A
FP)溶液及び正常型AFP溶液との混合比に基づいて
示した図である。FIG. 2 shows the peak area values and the total of two peak area values of various sample solutions obtained in Example 1 and shows the hepatocellular carcinoma type α-fetoprotein (A) in various sample solutions.
It is the figure shown based on the mixing ratio of a (FP) solution and a normal type AFP solution.
【図3】実施例1で使用したHPLC装置の概略図を示
したものである。FIG. 3 shows a schematic view of the HPLC apparatus used in Example 1.
図2に於いて、□はピーク1の面積値を、+はピーク2
の面積値を、また、◇はピーク1とピーク2の面積値の
合計を夫々示す。In Fig. 2, □ is the area value of peak 1, and + is the peak 2.
Indicates the area value of, and ⋄ indicates the sum of the area values of peak 1 and peak 2.
Claims (4)
同一な糖蛋白質を測定対象とする分別測定法であって、
測定対象の糖蛋白質の少なくとも1つの特定の糖鎖構造
を認識するレクチンと、測定対象の糖蛋白質全てに結合
する性質を有するが該レクチンが結合した測定対象の糖
蛋白質への結合が妨げられる性質を有する抗体(以下、
第1抗体と略記する。)とを組み合わせて用い、第1抗
体が結合した糖蛋白質と、第1抗体が結合していない糖
蛋白質とを、これらの性質の差を利用して分別測定する
ことを特徴とする分別測定法。1. A differential measurement method for measuring glycoproteins having different sugar chain structures but substantially the same protein structures, the method comprising:
A lectin that recognizes at least one specific sugar chain structure of a glycoprotein to be measured, and a property of binding to all of the glycoproteins to be measured, but a property of hindering the binding to the glycoprotein to be measured bound by the lectin An antibody having
Abbreviated as the first antibody. ) Is used in combination, the glycoprotein bound to the first antibody and the glycoprotein not bound to the first antibody are fractionally measured by utilizing the difference in these properties, and the differential measurement method is characterized. .
体との複合体の性質を変化させ得る物質又は標識物質が
結合されている、請求項1に記載の分別測定法。2. The differential measuring method according to claim 1, wherein a substance or a labeling substance capable of changing the properties of the complex of the glycoprotein to be measured and the first antibody is bound to the first antibody.
を含む測定対象の糖蛋白質全てに結合し得る性質を有
し、且つ標識物質が結合した抗体(以下、第2抗体と略
記する。)を更に組み合わせて用いる、請求項1又は2
に記載の分別測定法。3. An antibody having the property of being capable of binding to all glycoproteins to be measured, including the glycoprotein to be measured to which the lectin is bound, and having a labeling substance bound thereto (hereinafter abbreviated as second antibody). The method according to claim 1 or 2, wherein
Separated measurement method described in.
処理されたものであるか、又は測定対象の糖蛋白質とレ
クチンと第1抗体、更に要すれば第2抗体とを反応させ
る際にグリコシダーゼを共存させる、請求項1〜3の何
れかに記載の分別測定法。4. The glycoprotein to be measured is glycosidase-treated in advance, or coexistence of glycosidase when reacting the glycoprotein to be measured with a lectin and a first antibody, and optionally a second antibody. The method of fractionation measurement according to claim 1, wherein
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Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002101389A1 (en) * | 2001-06-12 | 2002-12-19 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Method of assaying hyaluronic acid |
US7842175B2 (en) * | 2001-04-04 | 2010-11-30 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Electrophoresis |
WO2013128914A1 (en) | 2012-02-28 | 2013-09-06 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | Cell differentiation assay method, cell isolation method, method for producing induced pluripotent stem cells, and method for producing differentiated cells |
WO2013161614A1 (en) * | 2012-04-27 | 2013-10-31 | コニカミノルタ株式会社 | Antigen detection method which uses lectin and comprises enzyme treatment step |
WO2014025013A1 (en) * | 2012-08-10 | 2014-02-13 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | Glycoform detection method and glycoform detection device |
JP2019500609A (en) * | 2015-12-23 | 2019-01-10 | ランドックス ラボラトリーズ リミテッド | Determination of glycosylation signature |
US10222385B2 (en) | 2013-12-27 | 2019-03-05 | Konica Minolta, Inc. | Methods for discriminating between prostate cancer and a benign prostate-disease |
US10371704B2 (en) | 2013-12-27 | 2019-08-06 | Konica Minolta, Inc. | Method for discriminating between prostate cancer and a benign prostate disease |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP4083624A4 (en) | 2019-12-27 | 2023-06-21 | FUJIFILM Corporation | Method for assisting diagnosis of metastatic castration-resistant prostate cancer |
JP7509361B2 (en) | 2020-07-22 | 2024-07-02 | 富士フイルム株式会社 | Methods for aiding in the diagnosis of inflammatory bowel disease - Patents.com |
-
1994
- 1994-11-15 JP JP6305445A patent/JP3070418B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7842175B2 (en) * | 2001-04-04 | 2010-11-30 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Electrophoresis |
WO2002101389A1 (en) * | 2001-06-12 | 2002-12-19 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Method of assaying hyaluronic acid |
WO2013128914A1 (en) | 2012-02-28 | 2013-09-06 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | Cell differentiation assay method, cell isolation method, method for producing induced pluripotent stem cells, and method for producing differentiated cells |
WO2013161614A1 (en) * | 2012-04-27 | 2013-10-31 | コニカミノルタ株式会社 | Antigen detection method which uses lectin and comprises enzyme treatment step |
JP5413544B1 (en) * | 2012-04-27 | 2014-02-12 | コニカミノルタ株式会社 | Antigen detection method using lectin including enzyme treatment step |
US10527615B2 (en) | 2012-04-27 | 2020-01-07 | Konica Monolta, Inc. | Antigen detection method which uses lectin and comprises enzyme treatment step |
JPWO2014025013A1 (en) * | 2012-08-10 | 2016-07-25 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | Sugar chain isoform detection method and sugar chain isoform detection apparatus |
US10352927B2 (en) | 2012-08-10 | 2019-07-16 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Glycoform detection method and glycoform detection device |
WO2014025013A1 (en) * | 2012-08-10 | 2014-02-13 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | Glycoform detection method and glycoform detection device |
US10222385B2 (en) | 2013-12-27 | 2019-03-05 | Konica Minolta, Inc. | Methods for discriminating between prostate cancer and a benign prostate-disease |
US10371704B2 (en) | 2013-12-27 | 2019-08-06 | Konica Minolta, Inc. | Method for discriminating between prostate cancer and a benign prostate disease |
JP2019500609A (en) * | 2015-12-23 | 2019-01-10 | ランドックス ラボラトリーズ リミテッド | Determination of glycosylation signature |
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Also Published As
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