JPH0687797B2

JPH0687797B2 - Method for measuring α-amylase

Info

Publication number: JPH0687797B2
Application number: JP63333410A
Authority: JP
Inventors: 善資小川; 順西村; 才仁金島; 元信市野
Original assignee: Sanko Junyaku Co Ltd
Current assignee: Sanko Junyaku Co Ltd
Priority date: 1988-12-29
Filing date: 1988-12-29
Publication date: 1994-11-09
Anticipated expiration: 2009-11-09
Also published as: JPH02177900A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、α−アミラーゼの測定法の改良に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to improvement of a method for measuring α-amylase.

（従来の技術）急性すい炎、耳下線炎等の診断のために血清や尿中のα
−アミラーゼ活性を測定することが重要である。α−ア
ミラーゼ活性測定用基質として、従来はでんぷんが用い
られてきたが、精度の点で問題があった。近年、でんぷ
んに代わってマルトペンタオース（G5）に代表されるオ
リゴ糖がアミラーゼの基質として採用されつつある。即
ち、マルトペンタオースを基質に用いて共役酵素にα−
グルコシダーゼを組み合わせて測定することができる。(Prior art) α in serum or urine for diagnosis of acute pancreatitis, parotitis, etc.
-It is important to measure amylase activity. Starch has been conventionally used as a substrate for measuring α-amylase activity, but there was a problem in terms of accuracy. In recent years, oligosaccharides represented by maltopentaose (G5) have been adopted as a substrate for amylase instead of starch. That is, using maltopentaose as a substrate, α-
Glucosidase can be combined and measured.

（上式において、ATP:アデノシントリホスフェート、AD
P:アデノシンジホスフェート、NAD:ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド、NADH:ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド還元型、Ｇ−６−PDH:グルコース−６−リ
ン酸脱水素酵素）ここで生成したグルコースをヘキソキナーゼ（HK）／グ
ルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ−６−PDH）によ
りNADをNADHに変化させて酵素活性を測定する。この場
合、グルコースを経由させて反応させるから、血清及び
尿中のグルコースの影響を受けるということが難点であ
った。 (In the above formula, ATP: adenosine triphosphate, AD
P: adenosine diphosphate, NAD: nicotinamide adenine dinucleotide, NADH: nicotinamide adenine dinucleotide reduced form, G-6-PDH: glucose-6-phosphate dehydrogenase) Glucose produced here is converted into hexokinase (HK) / Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G-6-PDH) is used to change NAD into NADH and the enzyme activity is measured. In this case, since the reaction is performed via glucose, it is difficult to be affected by glucose in serum and urine.

最近、内因性のグルコースの影響を回避するためにｐ−
ニトロフェノールを修飾した各種のオリゴ糖が用いられ
るようになった。これによれば、α−グルコシダーゼを
組み合わせて、α−アミラーゼによって生じたｐ−ニト
ロフェノールを最終的に測定することができるので、内
因性のグルコースの影響がなくてすむものである。そし
て、ｐ−ニトロフェノールを修飾したオリゴ糖を基質と
して用いる方法は、グルコースの影響を受けずに測定で
きるので、かなり測定しやすく、また精度もよくなった
が、ビリルビンやヘモグロビンの影響を受ける点でまだ
問題が残されていた。Recently, in order to avoid the effects of endogenous glucose, p-
Various oligosaccharides modified with nitrophenol have come to be used. According to this, since p-nitrophenol produced by α-amylase can be finally measured by combining α-glucosidase, the influence of endogenous glucose can be eliminated. The method using a p-nitrophenol-modified oligosaccharide as a substrate can be measured without being affected by glucose, so that it is considerably easy to measure and the accuracy is improved, but it is affected by bilirubin and hemoglobin. So there was still a problem.

そこで、さらにこれらの問題を改善するため特開昭63-1
29997号に開示されているフラクトースを修飾したオリ
ゴ糖を用いる方法が開発された。このフラクトースのオ
リゴ糖を用いる方法は、α−アミラーゼの作用によって
生じた生成物にα−グルコシダーゼを働かせ、このとき
遊離したフラクトースにマンニトールデヒドロゲナーゼ
（MDH）を作用させて、NADHをNADに変化させてα−アミ
ラーゼ活性を測定できるものである。この方法は、内因
性のグルコースやマルトースの影響も受けず、しかもビ
リルビンやヘモグロビンにも影響されることがなく非常
に優れた方法である。しかし、この方法においては、共
役酵素として加えたα−グルコシダーゼはα−アミラー
ゼ及びグルコアミラーゼによって生じたサッカロースに
は十分作用せず、フラクトースの遊離が不完全であっ
た。Therefore, in order to further solve these problems, JP-A-63-1
A method using a fructose-modified oligosaccharide disclosed in 29997 was developed. This method using oligosaccharides of fructose makes α-glucosidase act on a product generated by the action of α-amylase, and at this time, acts mannitol dehydrogenase (MDH) on the released fructose to change NADH into NAD. The α-amylase activity can be measured. This method is a very excellent method without being affected by endogenous glucose or maltose, and by being unaffected by bilirubin or hemoglobin. However, in this method, α-glucosidase added as a coupling enzyme did not sufficiently act on saccharose produced by α-amylase and glucoamylase, and fructose was not completely released.

（発明が解決しようとする課題）本発明者は、上記した従来技術の問題点に鑑み、サッカ
ロースに作用しやすい酵素に着目することによって本発
明に到達したものである。換言すれば、本発明者は、シ
ュクロースホスホリラーゼ（SP）を用いて容易にフラク
トースが捕捉されることを見出し本発明を完成したもの
である。(Problems to be Solved by the Invention) The present inventors have arrived at the present invention by focusing on an enzyme that easily acts on saccharose in view of the problems of the above-mentioned conventional techniques. In other words, the present inventors have found that fructose can be easily captured using sucrose phosphorylase (SP), and have completed the present invention.

本発明は、サッカロースに着目することにより、測定待
ち時間が短縮でき、かつ少ない酵素量で済みしかも高濃
度のものまで測定できるようにしたα−アミラーゼの測
定法を提供することを目的とするものである。An object of the present invention is to provide a method for measuring α-amylase by focusing on saccharose, whereby the measurement waiting time can be shortened, a small amount of enzyme can be used, and a high concentration can be measured. Is.

（課題を解決するための手段）上記目的を達成するために、本発明においては、フラク
トースを修飾したオリゴ糖を基質に用いるα−アミラー
ゼの測定において、グルコアミラーゼ又はグルコアミラ
ーゼにα−グルコシダーゼを組み合わせることにより生
成するサッカロースをシュクロースホスホリラーゼを用
いて測定するものである。即ち、リン酸の存在のもと
に、サッカロースをシュクロースホスホリラーゼにより
グルコース−１−リン酸（Ｇ−１−Ｐ）とフラクトース
を生成させるものである。(Means for Solving the Problem) In order to achieve the above object, in the present invention, in the measurement of α-amylase using a fructose-modified oligosaccharide as a substrate, glucoamylase or glucoamylase is combined with α-glucosidase. The sucrose thus produced is measured using sucrose phosphorylase. That is, in the presence of phosphoric acid, sucrose is made to produce glucose-1-phosphate (G-1-P) and fructose by sucrose phosphorylase.

さらに、シュクロースホスホリラーゼにより生成したグ
ルコース−１−リン酸又はフラクトースを測定するのが
好ましい。即ち、グルコース−１−リン酸又はフラクト
ースを測定することにより検体中のα−アミラーゼ活性
を求めることができる。Furthermore, it is preferable to measure glucose-1-phosphate or fructose produced by sucrose phosphorylase. That is, the α-amylase activity in the sample can be determined by measuring glucose-1-phosphate or fructose.

α−アミラーゼ測定用の基質に用いるフラクトースを修
飾したオリゴ糖は、特開昭63-129997号公報に開示され
た各種基質を用いることができる。例えば、イソプロピ
リデン・マルトヘプタオシル・フルクシド（IPG7F）や
イソプロピリデン・マルトペンタオシル・フルクシド
（IPG5F）等が好適である。これらを使用する場合、フ
ラクトース修飾のオリゴ糖の非還元末端が無修飾及び修
飾ということは、本発明においては問題となるものでは
ない。As the oligosaccharide modified with fructose used as a substrate for measuring α-amylase, various substrates disclosed in JP-A-63-129997 can be used. For example, isopropylidene maltoheptaosyl frucside (IPG7F) and isopropylidene maltopentaosyl frucside (IPG5F) are preferable. When these are used, it is not a problem in the present invention that the non-reducing end of the fructose-modified oligosaccharide is unmodified or modified.

（作用）本発明の具体的を測定法として、例えば、以下のように
３つの方法を考えることができる。(Operation) As specific measurement methods of the present invention, for example, the following three methods can be considered.

（１法）（上式において、G:グルコース、F:フラクトース、P:リ
ン酸、GF:サッカロース、MDH:マンニトールデヒドロゲ
ナーゼ、Ｇ−１−P:グルコース−１−リン酸）（２法）上記の反応によって生成したＧ−１−Ｐより以下の如く
測定する。(1 method) (In the above formula, G: glucose, F: fructose, P: phosphate, GF: saccharose, MDH: mannitol dehydrogenase, G-1-P: glucose-1-phosphate) (Method 2) Produced by the above reaction It is measured from G-1-P as follows.

（上式において、α−PGM:α−ホスホグルコムターゼ、
Ｇ−1,6−P:グルコース−1,6−リン酸、Ｇ−６−PDH:グ
ルコース−６−リン酸脱水素酵素）（３法）上記した２法の反応により生じた６−ホスホグルコン酸
を利用して感度を上げるために次のように測定する。 (In the above formula, α-PGM: α-phosphoglucomutase,
G-1,6-P: Glucose-1,6-phosphate, G-6-PDH: Glucose-6-phosphate dehydrogenase) (Method 3) 6-phosphoglucon produced by the reaction of the above two methods The following measurement is performed in order to increase the sensitivity using acid.

（上式において、６−PGDH:6−ホスホグルコン酸脱水素
酵素）上記の各反応において、グルコアミラーゼの作用を補強
するためにα−グルコシダーゼを加えることができる。 (In the above formula, 6-PGDH: 6-phosphogluconate dehydrogenase) In each of the above reactions, α-glucosidase can be added to reinforce the action of glucoamylase.

（実施例）以下に本発明の実施例を挙げてさらに具体的に説明す
る。(Examples) Hereinafter, examples of the present invention will be described in more detail.

実施例１試薬組成第１試薬リン酸緩衝液 ……50mM,pH7.0 Ca²⁺ ……2mM NaCl ……20mM グルコアミラーゼ ……60U/ml シュクロースホスホリラーゼ ……3U/ml マンニトールデヒドロゲナーゼ ……10U/ml NADH ……0.2mM 第２試薬 IPG7F ……5mM 第１試薬2mlに検体40μｌ加え、37℃で５分間加温し、
第２試薬0.5mlを加える。340nmで１分間あたりの吸光度
変化を測定した。Example 1 Reagent composition No. 1 reagent Phosphate buffer ...... 50 mM, pH 7.0 Ca ²⁺ …… 2 mM NaCl …… 20 mM glucoamylase …… 60 U / ml sucrose phosphorylase …… 3 U / ml mannitol dehydrogenase …… 10 U / ml NADH ...... 0.2mM 2nd reagent IPG7F ...... 5mM 40ml of the sample was added to 2ml of the 1st reagent and heated at 37 ℃ for 5 minutes.
Add 0.5 ml of the second reagent. The change in absorbance per minute at 340 nm was measured.

結果タイムコース α−アミラーゼ活性500U/l相当の検体についてタイムコ
ースをとったところ、第１図に示すごとく、反応が直線
的に進んだ。Results Time course When a time course was taken for a sample corresponding to 500 U / l of α-amylase activity, the reaction proceeded linearly as shown in Fig. 1.

直線性高濃度のα−アミラーゼ活性を含む検体を５段階希釈し
測定を行った結果、第２図に示すごとく、約1000U/l以
下で原点を通る直線性が確認できた。Linearity As a result of measuring by diluting a sample containing a high concentration of α-amylase activity in five steps, linearity passing through the origin was confirmed at about 1000 U / l or less.

実施例２実施例１の第１試薬にα−グルコシダーゼを40U/ml添加
し、その他は全く同様にして実験を行った結果、実施例
１と同様の成績が得られた。Example 2 As a result of conducting an experiment in the same manner as in Example 1 except that 40 U / ml of α-glucosidase was added to the first reagent, the same results as in Example 1 were obtained.

実施例３試薬組成第１試薬リン酸緩衝液 ……50mM,pH7.0 Ca²⁺ ……2mM NaCl ……20mM グルコアミラーゼ ……100U/ml シュクロースホスホリラーゼ ……5U/ml α−ホスホグルコムターゼ ……1U/ml グルコース−６−リン酸脱水素酵素 ……3U/ml ６−ホスホグルコン酸脱水素酵素 ……0.5U/ml グルコース−1,6−リン酸 ……0.02mM NAD ……4mM 第２試薬 IPG7F ……5mM 第１試薬2mlに検体20μｌ加え、37℃で５分間加温し、
第２試薬0.5mlを加える。340nmで１分間あたりの吸光度
変化を測定した。Example 3 Reagent composition 1st reagent Phosphate buffer ...... 50 mM, pH 7.0 Ca ²⁺ ...... 2 mM NaCl ...... 20 mM glucoamylase ...... 100 U / ml sucrose phosphorylase ...... 5 U / ml α-phosphoglucomutase …… … 1U / ml glucose-6-phosphate dehydrogenase …… 3U / ml 6-phosphogluconate dehydrogenase …… 0.5U / ml glucose-1,6-phosphate …… 0.02mM NAD …… 4mM second Reagent IPG7F …… Add 5 μM of the first reagent (2 ml) to the sample (20 μl) and heat at 37 ℃ for 5 minutes.
Add 0.5 ml of the second reagent. The change in absorbance per minute at 340 nm was measured.

結果タイムコース α−アミラーゼ活性500U/l相当の検体についてタイムコ
ースをとったところ、第３図に示すごとく、反応が直線
的に進んだ。Results Time course When a time course was taken for a sample corresponding to 500 U / l of α-amylase activity, the reaction proceeded linearly as shown in FIG.

実施例４実施例３の第１試薬にα−グルコシダーゼを40U/ml添加
し、その他は全く同様にして実験を行った結果、実施例
３と同様の成績が得られた。Example 4 40 U / ml of α-glucosidase was added to the first reagent of Example 3, and the experiment was conducted in exactly the same manner as above, and as a result, the same results as in Example 3 were obtained.

実施例５試薬組成第１試薬リン酸緩衝液 ……50mM,pH7.0 Ca²⁺ ……2mM NaCl ……20mM グルコアミラーゼ ……100U/ml シュクロースホスホリラーゼ ……5U/ml α−ホスホグルコムターゼ ……1U/ml グルコース−６−リン酸脱水素酵素 ……3U/ml グルコース−1,6−リン酸 ……0.02mM NAD ……4mM 第２試薬 IPG7F ……5mM 第１試薬2mlに検体40μｌ加え、37℃で５分間加温し、
第２試薬0.5mlを加える。340nmで１分間あたりの吸光度
変化を測定した。Example 5 Reagent composition No. 1 reagent Phosphate buffer ...... 50 mM, pH 7.0 Ca ²⁺ ...... 2 mM NaCl ...... 20 mM glucoamylase ...... 100 U / ml sucrose phosphorylase ...... 5 U / ml α-phosphoglucomutase …… … 1U / ml Glucose-6-phosphate dehydrogenase …… 3U / ml Glucose-1,6-phosphate …… 0.02mM NAD …… 4mM 2nd reagent IPG7F …… 5mM Add 40µl sample to 2ml of the 1st reagent, Heat at 37 ℃ for 5 minutes,
Add 0.5 ml of the second reagent. The change in absorbance per minute at 340 nm was measured.

結果タイムコース α−アミラーゼ活性500U/l相当の検体についてタイムコ
ースをとったところ反応が直線的に進んだ。Results Time course When a time course was taken for a sample equivalent to 500 U / l of α-amylase activity, the reaction proceeded linearly.

実施例６実施例５の第１試薬にα−グルコシダーゼを40U/ml添加
し、その他は全く同様にして実験を行った結果、実施例
５と同様の成績が得られた。Example 6 As a result of conducting an experiment in the same manner as in Example 5 except that 40 U / ml of α-glucosidase was added to the first reagent, the same results as in Example 5 were obtained.

（発明の効果）以上述べたごとく、本発明のα−アミラーゼの測定法に
よれば、測定待ち時間が短縮でき、かつ少ない酵素量で
済みしかも高濃度のものまで測定できるという大きな効
果を奏するものである。(Effects of the Invention) As described above, according to the method for measuring α-amylase of the present invention, there is a great effect that the measurement waiting time can be shortened, a small amount of enzyme can be used, and a high concentration can be measured. Is.

[Brief description of drawings]

第１図は実施例１のタイムコースを示すグラフ、第２図
は実施例１の直線性を示すグラフ及び第３図は実施例３
のタイムコースを示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing the time course of Example 1, FIG. 2 is a graph showing the linearity of Example 1, and FIG. 3 is Example 3
It is a graph which shows a time course of.

Claims

[Claims]

1. In the measurement of α-amylase using a fructose-modified oligosaccharide as a substrate, sucrose produced by combining glucoamylase or glucoamylase with α-glucosidase is measured using sucrose phosphorylase. Α-
Amylase assay.

2. The method for measuring α-amylase according to claim 1, wherein glucose-1-phosphate or fructose produced by sucrose phosphorylase is measured.