JPH0672B2 - Fermentation method for producing L-phenylalanine or L-tyrosine - Google Patents
Fermentation method for producing L-phenylalanine or L-tyrosineInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は、3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプチュロ
ン酸−7−リン酸シンターゼ(以下「DS」と記す)が
組込まれている組換えDNAを有するコリネ型細菌及び
それを用いるL−フェニルアラニンまたはL−チロシン
の製造法に関する。TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION The present invention has recombinant DNA in which 3-deoxy-D-arabino-hepturonate-7-phosphate synthase (hereinafter referred to as “DS”) is incorporated. The present invention relates to a coryneform bacterium and a method for producing L-phenylalanine or L-tyrosine using the same.
従来の技術 DSは、ホスホエノールピルピン酸とエリスロース4−
リン酸よりの3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプチュロ
ン酸−7−リン酸(以下「DAHP」と記す)の合成を
触媒する酵素であり、DAHPは、コリスミ酸を経由し
てフェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンに変
換される。コリネ型細菌では、DS活性は、最終生産物
であるフエニルアラニンとチロシンによる相乗的な阻害
を受けることが知られており、芳香族アミノ酸生産菌を
育種する場合、この阻害の解除した強力なDS活性を保
持する株を選択することが重要である。Prior art DS is phosphoenolpyruvate and erythrose 4-
An enzyme that catalyzes the synthesis of 3-deoxy-D-arabino-heptulonic acid-7-phosphate (hereinafter referred to as "DAHP") from phosphoric acid, and DAHP is phenylalanine, tyrosine, or tryptophan via chorismate. Is converted to. In coryneform bacteria, DS activity is known to be synergistically inhibited by phenylalanine and tyrosine, which are the final products, and when breeding aromatic amino acid-producing bacteria, DS activity is released. It is important to select strains that retain DS activity.
一方、組換えDNA法によりこれら芳香族アミノ酸生産
菌を育種することは、いくつか知られているが(例えば
特開昭57−208994、特開昭57−71397、
特開昭58−89194、特開昭58−134994
等)、コリネ型細菌のDSをコードする遺伝子(以下
「DS遺伝子」と記す)が組込まれたものではない。On the other hand, breeding of these aromatic amino acid-producing bacteria by the recombinant DNA method is known, but some of them have been known (for example, JP-A-57-208994 and JP-A-57-71397).
JP-A-58-89194, JP-A-58-134994
Etc.), a gene encoding DS of coryneform bacterium (hereinafter referred to as “DS gene”) is not incorporated.
発明が解決しようとする問題点 この発明は、L−フェニルアラニンまたはL−チロシン
の生産性がより高い微生物を得ること、及びそれによつ
てL−フェニルアラニンまたはL−チロシンのより効率
のよい製造法を見い出すことにある。DISCLOSURE OF THE INVENTION Problems to be Solved by the Invention The present invention finds a microorganism having higher productivity of L-phenylalanine or L-tyrosine, and thereby finds a more efficient method for producing L-phenylalanine or L-tyrosine. Especially.
問題点を解決するための手段 本発明者は、叙上の問題点を解決するため研究の結果、
コリネ型細菌細胞内で発現しDSをコードする遺伝子が
コリネ型細菌細胞内で増殖しうるプラスミドベクターに
接続されている組換えDNAを有するコリネ型細菌を分
離することに成功し、得られたコリネ型細菌がL−フェ
ニルアラニンまたはL−チロシンの高い生産性を有する
ことを見い出した。Means for Solving Problems As a result of research to solve the above-mentioned problems,
The coryneform bacterium having a recombinant DNA in which a gene encoding DS that is expressed in a coryneform bacterial cell and ligated to a plasmid vector capable of growing in the coryneform bacterial cell was successfully isolated, and the obtained coryneform It has been found that type bacteria have high productivity of L-phenylalanine or L-tyrosine.
即ち本願発明は、コリネ型細菌に属するDNA供与菌よ
り得られ、第1図あるいは第2図中挿入遺伝子部分の制
限酵素地図で表現される3−デオキシ−D−アラビノ−
ヘプチュロン酸−7−リン酸シンターゼ遺伝子を含むD
NA断片が、コリネ型細菌の菌体内で自律複製できるベ
クタープラスミドに接続されて、コリネ型細菌に属する
DNA受容菌に導入されて得られるL−フェニルアラニ
ンまたはL−チロシン生産能を有する微生物を培養し、
培養液中に蓄積されたL−フェニルアラニンまたはL−
チロシンを採取することを特徴とするL−フェニルアラ
ニンまたはL−チロシンの製造法である。That is, the present invention is obtained from a DNA-donating bacterium belonging to a coryneform bacterium, and is represented by a restriction enzyme map of the inserted gene portion in FIG. 1 or FIG. 2 and represented by 3-deoxy-D-arabino-
D containing the hepturonic acid-7-phosphate synthase gene
The NA fragment is ligated to a vector plasmid capable of autonomously replicating in the coryneform bacterium, and introduced into a DNA recipient bacterium belonging to the coryneform bacterium to cultivate a microorganism capable of producing L-phenylalanine or L-tyrosine. ,
L-phenylalanine or L- accumulated in the culture medium
A method for producing L-phenylalanine or L-tyrosine, which comprises collecting tyrosine.
さらに本願発明は、コリネ型細菌に属するDNA供与菌
及び/またはDNA受容菌がm−フルオロフェニルアラ
ニン耐性であることを特徴とする前記のL−フェニルア
ラニンまたはL−チロシンの製造法である。Further, the present invention is the above-mentioned method for producing L-phenylalanine or L-tyrosine, wherein the DNA-donating bacterium and / or the DNA-accepting bacterium belonging to the coryneform bacterium is resistant to m-fluorophenylalanine.
本発明にいうコリネ型細菌(Coryneform bacteria)
は、バージース・マニュアル・オブ・デターミネイティ
ブ・バクテリオロジー(Bargeys Manual of Determinat
ive Bacteriology)第8版599頁(1974)に定義
されている一群の微生物であり、好気性、グラム陽性、
非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌である。このよう
なコリネ型細菌のうち特に以下に述べるようなコリネ型
グルタミン酸生産性細菌が本発明においては、最も好ま
しいものである。Coryneform bacteria referred to in the present invention
Is the Bargeys Manual of Determinat.
ive Bacteriology) 8th edition p. 599 (1974), a group of microorganisms, aerobic, gram positive,
It is a non-acidic, non-spore forming bacillus. Among such coryneform bacteria, coryneform glutamic acid-producing bacteria as described below are most preferable in the present invention.
コリネ型グルタミン酸生産性細菌の野生株の例としては
次のようなものがあげられる。Examples of wild strains of coryneform glutamic acid-producing bacteria include the following.
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC
14020 ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ATCC
14066 ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ATCC
14068 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC
13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC
13825 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC
13826 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC
19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム ATCC
13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ATCC
15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC
15991 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 1
3032,13060 コリネバクテリウム・リリウム ATCC
15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC
17965 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC
15354 本発明のコリネ型グルタミン酸生産性細菌には上記のよ
うなグルタミン酸生産性を有する野性株のほかにグルタ
ミン酸生産性を有するまたはグルタミン酸生産性を失っ
た変異株も含まれる。Brevibacterium divalicatum ATCC
14020 Brevibacterium saccharolyticum ATCC
14066 Brevibacterium Inmario Film ATCC
14068 Brevibacterium lactofermentum ATCC
13869 Brevibacterium roseum ATCC
13825 Brevibacterium flavum ATCC
13826 Brevibacterium thiogenitalis ATCC
19240 Corynebacterium acetoside film ATCC
13870 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC
15806 Corynebacterium carnae ATCC
15991 Corynebacterium glutamicum ATCC 1
3032, 13060 Corynebacterium Lilium ATCC
15990 Corynebacterium meracecola ATCC
17965 Microbacterium Ammonia Philum ATCC
15354 The coryneform glutamic acid-producing bacterium of the present invention includes mutant strains having glutamic acid productivity or having lost glutamic acid productivity in addition to the above-mentioned wild strain having glutamic acid productivity.
DS遺伝子を単離する方法は、コリネ型細菌のDS遺伝
子を有している株より、まず染色体遺伝子を抽出し(例
えばバイオケミカル・エ・バイオフィジカ・アクタ(Bi
ochem.Biophys.Acta)72巻、619頁、1963年の
方法が使用できる。)、これを適当な制限酵素で切断す
る。ついで、コリネ型細菌細胞内で増殖し得るプラスミ
ドベクターに接続し、得られた組換えDNAを用いてコ
リネ型細菌のDS欠損変異株を形質転換せしめ、DS生
成活性を保有するにいたつた菌株を単離し、これよりD
S遺伝子を分離できる。The method of isolating the DS gene is as follows. First, a chromosomal gene is extracted from a strain having the DS gene of coryneform bacterium (for example, Biochemical et Biophysica Actor (Bi
ochem.Biophys.Acta) 72, 619, 1963 can be used. ), And cut it with an appropriate restriction enzyme. Then, it was ligated to a plasmid vector capable of growing in coryneform bacterium cells, and the recombinant DNA obtained was used to transform a DS-deficient mutant strain of coryneform bacterium to obtain a strain which possesses DS-forming activity. Isolated and from this D
The S gene can be isolated.
また、同様の組換えDNAを用いてコリネ型細菌の野生
株の形質転換せしめ、DS活性に阻害効果を有する芳香
族アミノ酸のアンタゴニストなどに耐性を保持するにい
たつ菌株を単離し、これよりDS遺伝子を分離すること
も可能である。In addition, a similar recombinant DNA was used to transform a wild strain of coryneform bacterium, and a strain that retained the resistance to an aromatic amino acid antagonist having an inhibitory effect on DS activity was isolated. It is also possible to isolate the gene.
芳香族アミノ酸のアンタゴニストの例としては、o−フ
ルオロフェニルアラニン、m−フルオロフェニルアラニ
ン、p−フルオロフェニルアラニン、p−アミノフェニ
ルアラニン、β−3−チエニルアラニン、3−アミノチ
ロシン、チロシンヒドロキサメート、5−メチルトリプ
トファン等がある。Examples of aromatic amino acid antagonists include o-fluorophenylalanine, m-fluorophenylalanine, p-fluorophenylalanine, p-aminophenylalanine, β-3-thienylalanine, 3-aminotyrosine, tyrosine hydroxamate, 5-methyl. There are tryptophan and the like.
DNA供与菌としては、前記の芳香族アミノ酸アンタゴ
ニスト耐性などの変異を付与することにより、L−フェ
ニルアラニンまたはL−チロシンまたはその前駆体の生
合成活性が高まったような変異株を用いれば更によい。As the DNA-donating bacterium, it is more preferable to use a mutant strain in which biosynthesis activity of L-phenylalanine or L-tyrosine or its precursor is enhanced by imparting a mutation such as resistance to the aromatic amino acid antagonist.
ここにいうL−フェニルアラニンまたはL−チロシンの
前駆体とはDAHP3−デヒドロキナ酸、3−デヒドロ
シキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−3−リン酸、5−エノ
ールピルビルシキミ酸−3−リン酸、コリズミン酸、プ
レフェン酸、フェニルピルピン酸などをいう。The precursor of L-phenylalanine or L-tyrosine referred to herein is DAHP3-dehydroquinic acid, 3-dehydroshikimic acid, shikimic acid, shikimic acid-3-phosphate, 5-enolpyruvylshikimic acid-3-phosphate, Refers to colismic acid, prephenic acid, phenylpyrupic acid, etc.
このような変異株の例としては先に述べた米国特許3,
660,235、米国特許3,759,970、特開昭
56−64793等に記載されている。Examples of such mutant strains include the above-mentioned US Pat.
660,235, U.S. Pat. No. 3,759,970, JP-A-56-64793 and the like.
DS遺伝子として、野性型のものを用いることができる
し、更に変異株の遺伝子を用いることもできる。変異株
遺伝子として、フェニルアラニンとチロシンによる相乗
阻害の程度が軽減されたDSをコードするように変異さ
れたものが特に好ましい。As the DS gene, a wild type gene can be used, and a mutant gene can also be used. It is particularly preferable that the mutant gene is mutated so as to encode DS having a reduced degree of synergistic inhibition by phenylalanine and tyrosine.
変異型の遺伝子を得るには、DNA供与菌を変異処理し
てもよいし、DS遺伝子をベクタープラスミドに挿入
後、得られた組換えDNAをDNA受容菌に導入し得ら
れた形質転換株を変異処理しても良い。更に、上記組換
えDNA自体を生体外で変異処理しても、変異型遺伝子
を得ることもできる。In order to obtain a mutant gene, a DNA-donating bacterium may be subjected to mutation treatment, or the DS gene may be inserted into a vector plasmid, and the resulting recombinant DNA may be introduced into a DNA-accepting bacterium to obtain a transformant strain. Mutation processing may be performed. Furthermore, a mutant gene can also be obtained by subjecting the above recombinant DNA itself to mutation treatment in vitro.
染色体遺伝子を切断するために、切断反応時間等を調節
して切断の程度を調節すれば、巾広い種類の制限酵素が
使用できる。In order to cleave chromosomal genes, a wide variety of restriction enzymes can be used if the degree of cleavage is controlled by controlling the cleavage reaction time and the like.
本発明にて使用されるプラスミドベクターは、コリネ型
細菌細胞内において増殖し得るものであればどのような
ものでも良い。具体的に例示すれば、以下のものがあげ
られる。The plasmid vector used in the present invention may be any as long as it can grow in coryneform bacterial cells. Specific examples are as follows.
(1) pAM 330 特開昭58−67699参照 (2) pAM 1519 特開昭58−77895参照 (3) pAJ 655 特開昭58−192900参照 (4) pAJ 611 同 上 (5) pAJ 1844 同 上 (6) pCG 1 特開昭57−134500参照 (7) pCG 2 特開昭58−35197参照 (8) pCG 4 特開昭57−183799参照 (9) pCG 11 同 上 プラスミドベクターDNAの開裂は、当該DNAを一箇
所で切断する制限酵素を用いて切断するか、複数部位を
切断する制限酵素を用いて部分的に切断することにより
行う。(1) pAM 330 See JP-A-58-67699 (2) pAM 1519 See JP-A-58-77895 (3) pAJ 655 See JP-A-58-192900 (4) pAJ 611 Same as above (5) pAJ 1844 Same as above (6) pCG 1 See JP-A-57-134500 (7) pCG 2 See JP-A-58-35197 (8) pCG 4 See JP-A-57-183799 (9) pCG 11 Ditto Cleavage of plasmid vector DNA It is carried out by cutting the DNA with a restriction enzyme that cuts at one site, or by partially cutting with a restriction enzyme that cuts at multiple sites.
ベクターDNAは、染色体遺伝子を切断した際に用いら
れた制限酵素により切断され、または染色体DNA切断
フラグメント及び切断されたベクターDNAのそれぞれ
の両端に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を接続しせめて、ついでプラスミドベクターと染色体D
NAフラグメントとのライゲーション反応に付される。The vector DNA is cleaved by the restriction enzyme used when the chromosomal gene is cleaved, or a chromosomal DNA cleavage fragment and an oligonucleotide having a complementary nucleotide sequence are connected to both ends of the cleaved vector DNA, Then plasmid vector and chromosome D
Subject to ligation reaction with NA fragment.
このようにして得られた、染色体DNAとベクタープ
ラスミドとの組換えDNAをコリネ型細菌に属する受容
菌へ導入するには、エシェリヒア・コリK−12につい
て報告されている様なジャーナル・オブ・モレキュラー
バイオロジー(J.Mol.,Biol.,)53巻,159頁,1
970年)受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDN
Aの透過性を増す方法、またはバチルス・ズブチリスに
ついて報告されている様に(ジーン(Gene),1
巻,153頁,1977年細胞がDNAを取り込み得る
様になる増殖段階(いわゆるコンビテントセル)に導入
する方法により可能である。あるいは、バチルス・ズブ
チリス、放射菌類および酵母について知られている様に
(モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス
(Molec.Gen.,Genet.)168巻,111頁,1979
年;ネイチャー(Natuer),274巻,398頁,19
78年;プロスィーティング・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンスUSA(Proc.Natl.Acad.Sei・US
A),75巻,1929頁,1978年、DNA受容菌
を、プラスミドDNAを容易に取り込むプロトプラスト
またはスフェロプラストにしてプラスミドをDNA受容
菌に導入することも可能である。In order to introduce the recombinant DNA of the chromosomal DNA and the vector plasmid thus obtained into a recipient bacterium belonging to a coryneform bacterium, the Journal of Molecular as reported for Escherichia coli K-12 is used. Biology (J. Mol., Biol.,) 53, 159, 1
970) Treat the recipient cells with calcium chloride and DN
A method of increasing the permeability of A, or as reported for Bacillus subtilis (Gene, 1
Vol. 153, 1977. It is possible by a method of introducing into a growth stage (so-called competent cell) where cells can take up DNA. Alternatively, as is known for Bacillus subtilis, radiofungi and yeast (Molec. Gen., Genet.) 168, 111, 1979.
Year; Nature, 274, 398, 19
1978; Pro-Sweeting of National Academy of Sciences USA (Proc.Natl.Acad.Sei.US)
A), Vol. 75, p. 1929, 1978, it is also possible to introduce a plasmid into a DNA recipient bacterium by converting the DNA recipient bacterium into a protoplast or spheroplast which easily incorporates plasmid DNA.
プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチリスにお
いて使用されている方法でも充分高い頻度を得ることが
できるし、特開昭57−183799に記載されたコリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属のプロト
プラストにポリエチレングリコールまたはポリビニルア
ルコールと二価金属イオンとの存在下にDNAをとり込
ませる方法も当然利用できる。ポリエチレングリコール
またはポリビニルアルコールの代りに、カルボキシメチ
ルセルロース、デキストラン、フィコール、ブルロニッ
クF68(セルバ社)などの添加によつてDNAのとり
込みを促進させる方法でも同等の結果が得られる。In the protoplast method, a sufficiently high frequency can be obtained even by the method used in the above Bacillus subtilis, and the protoplasts of the genus Corynebacterium or Brevibacterium described in JP-A-57-183799 can be treated with polyethylene glycol or A method of incorporating DNA in the presence of polyvinyl alcohol and a divalent metal ion can of course be used. Similar results can be obtained by a method of promoting the uptake of DNA by adding carboxymethyl cellulose, dextran, Ficoll, Bulonic F68 (Selva Co.) or the like instead of polyethylene glycol or polyvinyl alcohol.
L−フェニルアラニンまたはL−チロシン生産菌とし
て、野生株あるいはDS欠損株を宿主として形質転換し
た株を用いることができるが、以下に示すように宿主を
用いればよりL−フェニルアラニンまたはL−チロシン
の生産性が高い菌株が得られることがある。As the L-phenylalanine or L-tyrosine-producing bacterium, a wild strain or a strain transformed with a DS-deficient strain as a host can be used. However, as shown below, the production of L-phenylalanine or L-tyrosine can be further improved by using the host. A strain with high activity may be obtained.
チロシンの場合 コリネバクテリウム属のフェニルアラニンを要求し3−
アミノチロシン、p−アミノフェニルアラニン、p−フ
ルオロフェニルアラニン、チロシンヒドロキサメートに
耐性を有する変異株日本農芸化学会誌(Agric.Biol.Che
m.),37巻,2013頁,(1973),ブレビバク
テリウム属のm−フルオロフェニルアラニンに耐性を示
す変異株日本農芸化学会誌(Agric.Biol.Chem.),37
巻,2327頁,1973年等がある。In the case of tyrosine, phenylalanine of the genus Corynebacterium is required.
Mutant strains resistant to aminotyrosine, p-aminophenylalanine, p-fluorophenylalanine, and tyrosine hydroxamate Journal of the Japanese Society of Agricultural Chemistry (Agric.Biol.Che
m.), 37, 2013, (1973), mutant strains resistant to m-fluorophenylalanine of the genus Brevibacterium (Agric. Biol. Chem.), 37
Vol., Page 2327, 1973, etc.
フェニルアラニンの場合 プレビバクテリウム属のm−フルオロフェニルアラニン
耐性を有する変異株日本農芸化学会誌(Agric.Biol.Che
m.),37巻,2327頁,1973年)、ブレビバク
テリウム属のチロシン、メチオニンを要求し5−メチル
トリプトファン、p−フルオロフェニルアラニンに耐性
を有する変異株(特開昭49−116294)、ブレビ
バクテリウム属のチロシン、メチオニンを要求し、5−
メチルトリプトファン、p−フルオロフェニルアラニン
耐性、デコイニン感受性を有する変異株(特開昭56−
64793)コリネバクテリウム属のチロシンを要求
し、p−フルオロフェニルアラニン、p−アミノフェニ
ルアラニンに耐性を有する変異株(日本農芸化学会誌
(Agric.Biol.Chem.,38巻,157頁,1974年)
等がある。In the case of phenylalanine A mutant strain of the genus Previbacterium that has resistance to m-fluorophenylalanine (Agric.Biol.Che)
m.), 37, 2327, 1973), a mutant strain requiring tyrosine and methionine of the genus Brevibacterium and having resistance to 5-methyltryptophan and p-fluorophenylalanine (JP-A-49-116294), Brevi. Requires tyrosine and methionine of the bacterium,
Mutant strains resistant to methyltryptophan, p-fluorophenylalanine, and sensitive to decoinine (JP-A-56-
64793) Mutant strain that requires tyrosine of the genus Corynebacterium and has resistance to p-fluorophenylalanine and p-aminophenylalanine (Journal of the Japanese Society of Agricultural Chemistry (Agric.Biol.Chem., 38, 157, 1974)).
Etc.
DS遺伝子のほかに、以下の遺伝子が挿入されていれば
L−フェニルアラニンまたはL−チロシンの生産性がよ
り高くなることが多い。If the following genes are inserted in addition to the DS gene, the productivity of L-phenylalanine or L-tyrosine is often higher.
これらの遺伝子としては、3−デヒドロキナ酸シンター
ゼ酸遺伝子、3−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ遺伝
子、シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、シキミ酸キナー
ゼ遺伝子、5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸
シンターゼ遺伝子、コリズミ酸シンターゼ遺伝子等があ
げられる。These genes include 3-dehydroquinate synthase acid gene, 3-dehydroquinate dehydratase gene, shikimate dehydrogenase gene, shikimate kinase gene, 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase gene, chorismate synthase gene. Etc.
またフェニルアラニン又はチロシン生産菌を得ようとす
るときは、プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子、プレフ
ェン酸トランスアミナーゼ、プレチロシンデヒドロゲナ
ーゼ遺伝子、チロシンアミノトランスフェラーゼ遺伝子
等がDS遺伝子のほかに挿入されていることが望まし
い。When obtaining a phenylalanine- or tyrosine-producing bacterium, it is desirable that the prephenate dehydratase gene, prephenate transaminase, pretyrosine dehydrogenase gene, tyrosine aminotransferase gene, etc. be inserted in addition to the DS gene.
このようにして得られたL−フェニルアラニンまたはL
−チロシン生産能を有するコリネ型細菌を培養してL−
フェニルアラニンまたはL−チロシンを生産蓄積せしめ
る方法は、従来コリネ型細菌によるL−フェニルアラニ
ンまたはL−チロシンの製造のために使用されていた方
法と特に大きく違う点はない。即ち、培地としては、炭
素源、窒素源、無機イオン、更に必要に応じアミノ酸、
ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常のものであ
る。炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラク
トース等及びこれらを含有する澱粉加水分解液、ホエ
イ、糖蜜等が用いられる。窒素源としては、アンモニア
ガス、アンモニア水、アンモニウム塩その他が使用でき
る。L-Phenylalanine or L thus obtained
-L-by culturing a coryneform bacterium capable of producing tyrosine
The method of producing and accumulating phenylalanine or L-tyrosine is not particularly different from the method conventionally used for production of L-phenylalanine or L-tyrosine by coryneform bacteria. That is, as the medium, carbon source, nitrogen source, inorganic ions, further amino acids, if necessary,
It is a normal one containing organic micronutrients such as vitamins. As the carbon source, glucose, sucrose, lactose and the like and starch hydrolysates containing these, whey, molasses and the like are used. As the nitrogen source, ammonia gas, aqueous ammonia, ammonium salt and the like can be used.
培養は好気的条件下で培地のpH及び温度を適宜調節しつ
つ、実質的にL−フェニルアラニンまたはL−チロシン
の生産蓄積が停止するまで行なわれる。Culturing is carried out under aerobic conditions while appropriately adjusting the pH and temperature of the medium until the production and accumulation of L-phenylalanine or L-tyrosine is substantially stopped.
実施例 (1) DS遺伝子を含む染色体DNAの調製 染色体DNAの調製源としては、フェニルアラニンによ
るDSの阻害が解除したことによって、フェニルアラニ
ンアナログであるm−フルオロフェニルアラニンに対し
て抵抗性を有するに到ったフェニルアラニン生産菌ブレ
ビバクテリウム・ラクトフエルメンタムAJ1957(FE
RM−P6673)を用いた。Example (1) Preparation of chromosomal DNA containing DS gene As a source for preparing chromosomal DNA, phenylalanine has been released from inhibition of DS, and thus has a resistance to m-fluorophenylalanine which is a phenylalanine analog. Phenylalanine-producing bacterium Brevibacterium lactofermentum AJ1957 (FE
RM-P6673) was used.
この菌を1のCMG培地(ペプトン1g/dl、酵母エ
キス1g/dl、グルコース0.5g/dl、及びNaCl
0.5g/dlを含み、pH7.2に調整したもの)に植菌
し、30℃で約3時間振盪培着を行ない、対数増殖期の
菌体を集めた。This fungus was treated with 1 CMG medium (peptone 1 g / dl, yeast extract 1 g / dl, glucose 0.5 g / dl, and NaCl.
0.5 g / dl, adjusted to pH 7.2), and cultured at 30 ° C. for about 3 hours with shaking to collect the bacterial cells in the logarithmic growth phase.
この菌体をリゾチール・SDSで溶菌させたのち、通常
のフェノール処理法により、染色体DNAを抽出精製
し、最終的に3.5mgのDNAを得た。After lysing the cells with lysotil-SDS, chromosomal DNA was extracted and purified by a usual phenol treatment method to finally obtain 3.5 mg of DNA.
(2) ベクターDNAの調製 ベクターとしてpAJ1844(分子量5.4メガダルト
ン)を用い、そのDNAを次の様にして調製した。(2) Preparation of vector DNA Using pAJ1844 (molecular weight 5.4 megadalton) as a vector, the DNA was prepared as follows.
まずpAJ1844をプラスミドとして保有するプレビバ
クテリウム・ラクトフェルメンタムAJ12037(FERMBP-57
7)を100mlのCMG培地に接種し、30℃で対数増
殖期後期まで培養したのち、リゾチームSDS処理によ
り溶菌させ、30,000×g,30分の超遠心により
上清を得た。フェノール処理ののち、2容のエタノール
を加えてDNAを沈澱回収した。これを少量のTEN緩
衝液(20mMトリス塩酸基、20mM NaCl、1
mM EDTA(pH8.0))に溶解後、アガロースゲ
ル電気泳動にかけ分離後、切り出してpAJ1844プラスミ
ドDNA約15μgを得た。First, Prebibacterium lactofermentum AJ12037 (FERMBP-57, which carries pAJ1844 as a plasmid
7) was inoculated into 100 ml of CMG medium, cultured at 30 ° C. until the late logarithmic growth phase, lysed by lysozyme SDS treatment, and a supernatant was obtained by ultracentrifugation at 30,000 × g for 30 minutes. After phenol treatment, 2 volumes of ethanol was added to precipitate and collect DNA. Add a small amount of TEN buffer (20 mM Tris-HCl group, 20 mM NaCl, 1
After dissolving in mM EDTA (pH 8.0)), it was subjected to agarose gel electrophoresis for separation, and cut out to obtain about 15 μg of pAJ1844 plasmid DNA.
(3) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 (1)で得た染色体DNA10μgと(2)で得たプラスミド
DNA5μgとを制限エンドヌクアーゼPatIでそれ
ぞ37℃に1時間保持し、切断した。65℃に10分間
加熱した後、両反応液を混合し、ATP及びジチオスレ
イトール存在下、T4ファージ由来のDNAリガーゼに
よって10℃に24時間保持しDNA鎖を連結せしめ
た。ついで反応液を、65℃にて5分間加熱し、反応液
に2倍容のエタノールを加えて連結されたDNAの沈澱
を採取した。(3) Insertion of chromosomal DNA fragment into vector 10 μg of chromosomal DNA obtained in (1) and 5 μg of plasmid DNA obtained in (2) were each kept with restriction endonuclease PatI at 37 ° C. for 1 hour and cleaved. After heating for 10 minutes to 65 ° C., a mixture of both the reaction solution, ATP and dithiothreitol presence was ligated a 24 hour hold to DNA strand 10 ° C. by DNA ligase from T 4 phage. Then, the reaction solution was heated at 65 ° C. for 5 minutes, and 2 volumes of ethanol was added to the reaction solution to collect a precipitate of ligated DNA.
(4) DS遺伝子クローニング DNA受容菌としては、m−フルオロフェニルアラニン
感受性のプレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムAJ
12036(FERM P−7559,FERM BP−7
34)を用いた。(4) Cloning of DS gene As a DNA recipient bacterium, m-fluorophenylalanine-sensitive Prebibacterium lactofermentum AJ
12036 (FERM P-7559, FERM BP-7
34) was used.
形質転換の方法としては、プロトプラストトランスフォ
ーメーション法を用いた、まず、菌株を5mlのCMG液
体培地で対数増殖期の初期まで培養し、ペニシリンGを
0.6ユニット/ml添加後、さらに1.5時間振盪培養
し、遠心分離により菌体を集め、菌体を0.5Mシュー
クロース、20mMマレイン酸、20mM塩化マグネシ
ウム、3.5%ペナッセイブロス(Difco)からな
るSMMP培地(pH6.5)0.5mlで洗浄した。次い
で10mg/mlのリゾチームを含むSMMP培地に懸濁し
30℃で20時間プロトプラスト化を図った。6000
×g,10分間遠心分離後、プロトプラストをSMMP
で洗浄し0.5mlのSMMPに再度懸濁した。この様に
して得られたプロトプラストと(3)で調製したDNA1
0μgを5mM EDTA存在下で混合し、ポリエチン
レングリコールを最終濃度が30%になる様に添加した
後、DNAをプロトプラストに取り込ませるために室温
に2分間放置した。このプロトプラストをSMMP培地
1mlで洗浄後、SMMP培地1mlに再懸濁し、形質発現
のため、30℃で2時間培養した。この培養液をpH7.
0のプロトプラスト再生培地上に塗布した。プロトプラ
スト再生培地は蒸留水1あたりトリス(ヒドロキシメ
チル)アミノメタン12g、KCl0.5g、グコース
10g、MgCl2・6H2O8.1g、CaCl2・
2H2O2.2g、ペプトン4g、粉末酵母エキス4
g、カザミノ酸(Difco社)1g、K2HPO
40.2g、コハク酸ナトリウム135g、寒天8g及
びクロラムフェニコール3μg/mlを含む。As the transformation method, the protoplast transformation method was used. First, the strain was cultured in 5 ml of CMG liquid medium until the beginning of the logarithmic growth phase, and penicillin G was added at 0.6 unit / ml, and then 1.5 After culturing with shaking for a period of time, cells were collected by centrifugation, and the cells were 0.5 ml of SMMP medium (pH 6.5) consisting of 0.5 M sucrose, 20 mM maleic acid, 20 mM magnesium chloride and 3.5% Penassay broth (Difco). Washed with. Then, the cells were suspended in SMMP medium containing 10 mg / ml of lysozyme and protoplastized at 30 ° C. for 20 hours. 6000
After centrifuging at × g for 10 minutes, SMMP the protoplasts
It was washed with and washed again with 0.5 ml of SMMP. The protoplast thus obtained and DNA1 prepared in (3)
After mixing 0 μg in the presence of 5 mM EDTA and adding polyethylene glycol to a final concentration of 30%, the mixture was left at room temperature for 2 minutes to incorporate DNA into protoplasts. The protoplasts were washed with 1 ml of SMMP medium, resuspended in 1 ml of SMMP medium, and cultured at 30 ° C. for 2 hours for expression of traits. This culture solution was adjusted to pH 7.
Plated on 0 protoplast regeneration medium. Protoplast regeneration medium is 12 g of tris (hydroxymethyl) aminomethane, 0.5 g of KCl, 10 g of gucose, 8.1 g of MgCl 2 .6H 2 O, 8.1 g of CaCl 2 per distilled water.
2H 2 O 2.2 g, peptone 4 g, powdered yeast extract 4
g, casamino acid (Difco) 1 g, K 2 HPO
4 0.2 g, sodium succinate 135 g, agar 8 g and chloramphenicol 3 μg / ml.
30℃で2週間培養後、約25000個のクロラムフェ
ニコール耐性コロニーが出現してきたのでこれをm−フ
ルオロフェニルアラニン500μg/mlを含む最少培地
(2%グルコース、1%硫酸アンモニウム、0.3%尿
素、0.1%りん酸二水素カリウム、0.04%硫酸マ
グネシウム7水塩、2ppm鉄イオン、2ppmマンガンイオ
ン、200μg/サイアミン塩酸塩、50μg/ビ
オチン、クロラムフェニコール10μg/ml、pH7.0、
寒天1.8%)にレプリカし、クロラムフェニコール耐
性でかつm−フルオロフェニルアラニン耐性の菌株5株
を得た。After culturing at 30 ° C. for 2 weeks, about 25,000 chloramphenicol-resistant colonies appeared, and these were used as a minimal medium (2% glucose, 1% ammonium sulfate, 0.3% urea) containing 500 μg / ml of m-fluorophenylalanine. , 0.1% potassium dihydrogen phosphate, 0.04% magnesium sulfate heptahydrate, 2 ppm iron ion, 2 ppm manganese ion, 200 μg / cyamine hydrochloride, 50 μg / biotin, chloramphenicol 10 μg / ml, pH 7.0 ,
Agar (1.8%) was replicated to obtain 5 strains of chloramphenicol resistant and m-fluorophenylalanine resistant strains.
(5) 形質転換株のプラスミド解析 これらの株より(2)で述べた方法により、溶菌液を調製
し、アガロースゲル電気泳動法により、プラスミドDN
Aを検出したところ、全ての株でベクターのpAJ184
4よりも明らかに大きなプラスミドが検出された。(5) Plasmid analysis of transformed strains From these strains, lysates were prepared by the method described in (2), and plasmid DN was analyzed by agarose gel electrophoresis.
When A was detected, vector pAJ184 was detected in all strains.
A plasmid clearly larger than 4 was detected.
5株のブラスミドをそれぞれ組換えに用いた制限酵素Ps
tIで切断するとその内の4株には共通な6.7kbのD
NA挿入断片が認められた。Restriction enzyme Ps using 5 strains of plasmid for recombination
When digested with tI, a 6.7 kb D, which is common to the 4 strains
NA insert was observed.
また、他の1株には、3.7kb、3.0kb、1.7kb、
1.6kb、1.4kb、1.3kb、0.8kb、0.7kb、
0.4kbの9個のDNA挿入断片が認められた。ベクタ
ーpAJ1844のPatI切断点に、前者の6.7kbのPat
I断片を有する組換えプラスミドをpAR−2と名付け、
後者の9個のPatIDNA断片を有する組換えプラスミ
ドをpAR−1と名付け、pAR−1を保持する株をAJ12181
(FERM-P7948)、pAR−2を保持する株をAJ12182
(FERM P−7947,FERM BP−917)
と名付けた。尚pAR−2は第1図に示す制限酵素地図を
有する。In addition, for the other 1 strain, 3.7 kb, 3.0 kb, 1.7 kb,
1.6kb, 1.4kb, 1.3kb, 0.8kb, 0.7kb,
Nine DNA inserts of 0.4 kb were observed. The 6.7 kb Pat of the former was inserted at the PatI breakpoint of the vector pAJ1844.
The recombinant plasmid containing the I fragment was named pAR-2,
The latter recombinant plasmid having 9 PatI DNA fragments was designated as pAR-1, and a strain carrying pAR-1 was designated as AJ12181.
(FERM-P7948), a strain harboring pAR-2 is AJ12182
(FERM P-7947, FERM BP-917)
I named it. Note that pAR-2 has the restriction enzyme map shown in FIG.
(6) 再トランスホーメーション (5)で検出されたDNA断片を含む組換えプラスミド上
にm−フルオロフェニルアラニン抵抗性を付与する遺伝
子が存在することを確認するためこのプラスミドDNA
pAR−1とpAR−2を用い、ブレビバクレチウム・ラク
トフェルメンタムAJ12036を再度、形質転換し
た。(6) In order to confirm that the gene conferring m-fluorophenylalanine resistance is present on the recombinant plasmid containing the DNA fragment detected by retransformation (5), this plasmid DNA
Brevivacletium lactofermentum AJ12036 was transformed again using pAR-1 and pAR-2.
生じたクロラムフェニコール耐性コロニーのうちそれぞ
れ50個を釣り上げm−フルオロフェニルアラニンに対
する感受性をテストしたところ、これらのいずれも耐性
が付与されており、上記のプラスミド上に、m−フルオ
ロフェニルアラニン抵抗性を付与する遺伝子が存在する
ことが明らかとなつた。When 50 chloroamphenicol-resistant colonies were picked up and tested for their sensitivity to m-fluorophenylalanine, resistance was imparted to all of them, and m-fluorophenylalanine resistance was found on the above plasmid. It was revealed that the gene to be added exists.
(7) 形質転換株のDS活性 被検株をフェニルアラニン生産培地(グルコース130
g、(NH4)2SO410g,KHP2PO41g,MgSO4・
7HP2O1g,フマル酸12g、酢酸3ml、大豆蛋白
酸加水分解液「味液」50ml,FeSO4・7H2O10m
g,MnSO4・4H2O10mg、ビオチン50μg、サイ
アミン塩酸塩2000μg及びCaCO350gを水1に
含む。pH7.0)20mlで30℃にて15時間培養した
菌体より、超音波処理により、溶菌液を調製し、これを
32000×g,20分間遠心分離して上清を得た。こ
の上清を粗酵素液として用い、50mMトリス−塩酸緩
衝液(pH7.5)、0.5mMホスホエノールピルビン
酸、0.5mMエリスロース−4−リン酸から成る1.
0mlの反応液中で30℃、10分間反応させ、反応終了
後0.2mlのトリクロロ酢酸を加え酵素を失活させる。
変性蛋白を遠心除去後、得られた上清0.25mlに0.
25mlの0.025M過ヨウ素酸を加え、37℃で30
分間インキュベートする。これに0.5mlの2%亜砒酸
ナトリウムを加え酸化反応を停止後、2.0mlの0.3
%2−チオバルビツール酸を加え100℃で8分間加熱
する。反応液の579nmの吸光度を測定し、DAHP
の分子吸光係数4.5×104(ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.),241
巻,3365頁,1966年)を使用して酵素活性を求
めた。また、反応液中にフェニルアラニン,チロシンの
いずれか、或いはその両者を1mMづつ添加した時の活
性も測定し、無添加時を100%として表示した。第1
表に測定結果を示す。(7) DS activity of transformant strain The test strain was treated with phenylalanine production medium (glucose 130
g, (NH 4) 2 SO 4 10g, KHP 2 PO 4 1g, MgSO 4 ·
7HP 2 O1g, fumaric acid 12g, acetic 3 ml, soybean protein acid hydrolyzate "Taste liquid" 50ml, FeSO 4 · 7H 2 O10m
g, MnSO 4 .4H 2 O 10 mg, biotin 50 μg, thiamine hydrochloride 2000 μg and CaCO 3 50 g are included in water 1. A lysate was prepared from the cells cultured in 20 ml of pH 7.0) at 30 ° C. for 15 hours by ultrasonic treatment, and the lysate was centrifuged at 32,000 × g for 20 minutes to obtain a supernatant. This supernatant was used as a crude enzyme solution and was composed of 50 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.5), 0.5 mM phosphoenolpyruvate, and 0.5 mM erythrose-4-phosphate.
The reaction is carried out in 0 ml of the reaction solution at 30 ° C. for 10 minutes, and after completion of the reaction, 0.2 ml of trichloroacetic acid is added to inactivate the enzyme.
After removing the denatured protein by centrifugation, 0.25 ml of the resulting supernatant was added with 0.
Add 25 ml of 0.025M Periodic acid and add 30 at 37 ° C.
Incubate for minutes. After 0.5 ml of 2% sodium arsenite was added to stop the oxidation reaction, 2.0 ml of 0.3
% 2-Thiobarbituric acid is added and heated at 100 ° C. for 8 minutes. The absorbance of the reaction solution at 579 nm is measured and DAHP is measured.
Molecular extinction coefficient of 4.5 × 10 4 (Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 241
Vol. 3, p. 3365, 1966) was used to determine enzyme activity. Further, the activity when either 1 mM of phenylalanine or tyrosine or both of them were added to the reaction solution was also measured, and the activity when not added was expressed as 100%. First
The measurement results are shown in the table.
得られた組換プラスミドが導入されることにより、DS
活性は2.6〜14倍に増大し、各アミノ酸による活性
阻害パターンも、野性株型から変異株型に変化してお
り、pAR−1,pAR−2にコードされたm−フルオロフェ
ニルアラニン耐性遺伝子は、DS遺伝子であることは明
らかである。また、pAR−1とpAR−2の有するPst I
断片が全く異なることより、DS活性を有する蛋白質を
コードする遺伝子は2種類以上存在すると考えられる。 By introducing the obtained recombinant plasmid, DS
The activity was increased by 2.6 to 14 times, and the activity inhibition pattern by each amino acid was changed from the wild type to the mutant type, and the m-fluorophenylalanine resistance gene encoded by pAR-1 and pAR-2. Is clearly the DS gene. In addition, Pst I possessed by pAR-1 and pAR-2
Since the fragments are completely different, it is considered that there are two or more types of genes encoding proteins having DS activity.
(8) DS遺伝子のサブクローニング pAR−1を制限酵素PstIで切断し、65℃、10分間加
熱した後、ATP及びジチオスレイトール存在下でT4フ
ァージ由来のDNAリガーゼによつて4℃に一晩放置し
DNA鎖を連結せしめた。ついで反応を65℃にて10
分間加熱し、反応液に2倍容のエタノールを加えて連結
されたDNAの沈澱を採取した。これに少量のTEN緩
衝液を加え形質転換に用いた。(8) Subcloning of DS gene pAR-1 was cleaved with restriction enzyme PstI, heated at 65 ° C. for 10 minutes, and then left overnight at 4 ° C. in the presence of ATP and dithiothreitol using T4 phage-derived DNA ligase. The DNA strands were then ligated. Then the reaction is carried out at 65 ° C for 10
After heating for 1 minute, 2 volumes of ethanol was added to the reaction solution to collect the ligated DNA precipitate. A small amount of TEN buffer was added to this and used for transformation.
(4)で示した形質転換方法を用いてブレビバクテリウム
・ラクトフェルメンタムAJ12036を形質転換した。30
℃で2週間クロラムフェニコール3μg/mlを含む再生培
地で再生させた後、m−フルオロフェニルアラニン50
0μg/mlを含む最少培地にレプリカし、クロラムフェニ
コール耐性でかつm−フルオロフェニルアラニン耐性と
なつた株を多数得た。これらの株のいくつかが、pAR-1
より小型のプラスミド群を有していた。このうちの最も
小型化したプラスミドをpAR-112と名付け、pAR-112を有
する株をAJ12183(FERM-p7946)と名付けた。尚pAR
-112は、第2図に示す制限酵素地図を有する。Brevibacterium lactofermentum AJ12036 was transformed using the transformation method shown in (4). Thirty
After regeneration with a regeneration medium containing chloramphenicol 3 µg / ml for 2 weeks at ℃, m-fluorophenylalanine 50
By replicating in a minimal medium containing 0 μg / ml, a large number of strains resistant to chloramphenicol and resistant to m-fluorophenylalanine were obtained. Some of these strains have pAR-1
It had a smaller group of plasmids. The most miniaturized plasmid among these was named pAR-112, and the strain carrying pAR-112 was named AJ12183 (FERM-p7946). PAR
-112 has the restriction map shown in FIG.
(9) 各形質転換株のフェニルアラニン及びチロシンの
生産能 上記のpAR-1を用い、m−フルオロフェニルアラニン耐
性株ブレビバクテリウム・ラクトフェニルメンタムAJ12
184を(4)で述べた方法により形質転換し、クロラムフェ
ニコール耐性を指標として形質転換株を選択した。かく
して得られたAJ12185(FERM P−7945,BP
−916D及び上記のAJ12036,AJ12181,AJ12182,AJ1
2183を培養し、フェニルアランニン及びチロシンの生産
能を調べたところ、第2表に示す結果を得た。(9) Phenylalanine and tyrosine productivity of each transformant Using the above pAR-1, the m-fluorophenylalanine-resistant strain Brevibacterium lactophenylmentum AJ12
184 was transformed by the method described in (4), and a transformant was selected using chloramphenicol resistance as an index. The thus obtained AJ12185 (FERM P-7945, BP
-916D and the above AJ12036, AJ12181, AJ12182, AJ1
When 2183 was cultured and the phenylalanine and tyrosine production ability was examined, the results shown in Table 2 were obtained.
培養は(7)で述べたフェニルアラニン生産培地20mlを
500mlの肩付フラスコに入れたものに被検菌株を植え
つけ、30℃にて72時間、振盪下に行なった。培養
後、6Nの水酸化カリウム溶液2mlを添加し析出したL
−チロシンを溶解させ遠心上清中のL−フェニルアラニ
ン及びL−チロシンを液体クロマトグラフィーにより定
量した。The culturing was carried out by inoculating the test strain into 20 ml of the phenylalanine production medium described in (7) in a 500 ml shoulder flask and shaking at 30 ° C. for 72 hours. After culturing, 2 ml of 6N potassium hydroxide solution was added to precipitate L
-Tyrosine was dissolved and L-phenylalanine and L-tyrosine in the centrifugation supernatant were quantified by liquid chromatography.
尚、AJ12184を得るためには寄託されたAJ12185より宿主
細胞を損うことなく宿主細胞中の複合プラスミドを除去
することが可能である。即ち、プラスミドは宿主より自
然に失なわれることもあるし、「除去」操作によって除
くこともできる(バクテリオロジカルデビュー(Bact.R
ev.),36巻,361〜405頁,1972年)。他
の除去操作の例は以下の通りである。AJ12185をCMG
液体培地に接種し、37℃で一晩培養(高温処理)後、
培養液を適当に希釈し、クロラムフェニコールを含有し
又は含有しないCMG寒天培地に塗布し、30℃で1〜
3日間培養する。かくしてクロラムフェニコール感受性
株として分離される株がAJ12184である。 In order to obtain AJ12184, it is possible to remove the complex plasmid in the host cell from the deposited AJ12185 without damaging the host cell. That is, the plasmid may be naturally lost by the host, or it may be removed by a “removal” operation (bacteriologic debut (Bact.R).
ev.), 36, 361-405, 1972). Examples of other removal operations are as follows. AJ12185 to CMG
Inoculate the liquid medium and incubate at 37 ° C overnight (high temperature treatment),
The culture broth is appropriately diluted and applied to a CMG agar medium containing or not containing chloramphenicol, and 1 to 30 ° C.
Incubate for 3 days. The strain thus isolated as a chloramphenicol sensitive strain is AJ12184.
第1図はプラスミドpAR-2の制限酵素地図である。第2
図はプラスミドpAR-112の制御酵素地図である。各図
中、 はpAJ1844, は挿入遺伝子;E,P,S,BはそれぞれEcoRI,Pst
I,SalI,BamHIを示す。FIG. 1 is a restriction map of plasmid pAR-2. Second
The figure is a map of the regulatory enzyme of plasmid pAR-112. In each figure, Is pAJ1844, Is an inserted gene; E, P, S and B are EcoRI and Pst, respectively.
I, SalI, BamHI are shown.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:13) 審査官 平田 和男─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 5 Identification code Office reference number FI technical display location C12R 1:13) Examiner Kazuo Hirata
Claims (4)
られ制限酵素地図Iで表現される3−デオキシ−D−ア
ラビノ−ヘプチュロン酸−7−リン酸シンターゼ遺伝子
を含むDNA断片、又はコリネ型細菌に属するDNA供
与菌より得られ制限酵素地図IIで表現される3−デオ
キシ−D−アラビノ−ヘプチュロン酸−7−リン酸シン
ターゼ遺伝子を含むDNA断片が、コリネ型細菌の菌体
内で自律複製できるベクタープラスミドに接続されて、
コリネ型細菌に属するDNA受容菌に導入されて得られ
るL−フェニルアラニンまたはL−チロシン生産能を有
する微生物を培養し、培養液中に蓄積されたL−フェニ
ルアラニンまたはL−チロシンを採取することを特徴と
するL−フェニルアラニンまたはL−チロシンの製造
法。 1. A DNA fragment containing a 3-deoxy-D-arabino-heptulonic acid-7-phosphate synthase gene represented by restriction enzyme map I obtained from a DNA-donating bacterium belonging to a coryneform bacterium, or a coryneform bacterium. Which can be autonomously replicated in the coryneform bacterium, in which a DNA fragment containing the 3-deoxy-D-arabino-heptulonic acid-7-phosphate synthase gene represented by the restriction map II obtained from a DNA donor bacterium belonging to Connected to the plasmid,
A method for culturing a microorganism having an ability to produce L-phenylalanine or L-tyrosine obtained by being introduced into a DNA recipient bacterium belonging to a coryneform bacterium, and collecting L-phenylalanine or L-tyrosine accumulated in the culture solution. And a method for producing L-phenylalanine or L-tyrosine.
フルオロフェニルアラニン耐性であることを特徴とする
特許請求の範囲第1項記載のL−フェニルアラニンまた
はL−チロシンの製造法。2. A DNA-donating bacterium belonging to a coryneform bacterium is m-
The method for producing L-phenylalanine or L-tyrosine according to claim 1, which is resistant to fluorophenylalanine.
コードされる3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプチュロ
ン酸−7−リン酸シンターゼが、L−チロシンおよびL
−フェニルアラニンによる相乗的フイードバック阻害が
解除されたものであることを特徴とする特許請求の範囲
第1項記載のL−フェニルアラニンまたはL−チロシン
の製造法。3. The 3-deoxy-D-arabino-heptulonic acid-7-phosphate synthase encoded by the DNA fragment according to claim 1 is L-tyrosine and L-tyrosine.
-The method for producing L-phenylalanine or L-tyrosine according to claim 1, wherein synergistic feedback inhibition by phenylalanine is eliminated.
フルオロフェニルアラニン耐性であることを特徴とする
特許請求の範囲第1項ないし第3項記載のL−フェニル
アラニンまたはL−チロシンの製造法。4. A DNA recipient bacterium belonging to a coryneform bacterium is m-
4. A method for producing L-phenylalanine or L-tyrosine according to claims 1 to 3, which is resistant to fluorophenylalanine.
Priority Applications (4)
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---|---|---|---|
JP59245700A JPH0672B2 (en) | 1984-11-20 | 1984-11-20 | Fermentation method for producing L-phenylalanine or L-tyrosine |
EP85114713A EP0183175B1 (en) | 1984-11-20 | 1985-11-19 | Coryneform bacteria carrying recombinant dna and a process for producing aromatic amino acids using said bacteria |
DE8585114713T DE3576523D1 (en) | 1984-11-20 | 1985-11-19 | RECOMBINANT DNA-CONTAINING CORYNEFORM BACTERIA AND METHOD FOR PRODUCING AROMATIC AMINO ACIDS USING THESE BACTERIA. |
US07/316,961 US4968609A (en) | 1984-11-20 | 1989-02-28 | Coryneform bacteria carrying recombinant DNA and a process for producing aromatic amino acids using said bacteria |
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JP59245700A JPH0672B2 (en) | 1984-11-20 | 1984-11-20 | Fermentation method for producing L-phenylalanine or L-tyrosine |
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Publication Number | Publication Date |
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JPS61124375A JPS61124375A (en) | 1986-06-12 |
JPH0672B2 true JPH0672B2 (en) | 1994-01-05 |
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Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2009153382A (en) | 2006-03-30 | 2009-07-16 | Ajinomoto Co Inc | Method for producing carboxylic acid using methanol-assimilating bacterium |
-
1984
- 1984-11-20 JP JP59245700A patent/JPH0672B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
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JPS61124375A (en) | 1986-06-12 |
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