JPH06511140A

JPH06511140A - グラム陽性細菌中での外層膜タンパク質の生産及び保護的エピトープの回復

Info

Publication number: JPH06511140A
Application number: JP3511658A
Authority: JP
Inventors: サーヴァス　マティ; ブッチャー　サラー; ナーミネン―カリオコスキ　マージャッタ; ルネバーグ―ナイマン　ケイト; マティライネン　スザンナ; ワールストロム　エヴァ; イダンパーン―ヘイッキラ　イロナ; プオヒニエミ　リトヴァレーナ
Original assignee: ザ　フィニッシュ　ナショナル　パブリック　ヘルス　インスティチュート
Priority date: 1990-07-06
Filing date: 1991-07-05
Publication date: 1994-12-15
Also published as: CA2086761A1; ZA915234B; FI903414A0; EP0538318A1; AU6069296A; FI903414A; AU8187391A; WO1992001001A1; AU668075B2; IL98727A0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】グラム陽性細菌中での外層膜タンパク質の生産及び保護的エピトープの回復発明の背景グラム陰性細菌の表面層は外層膜（０Ｍ）から成っている。ＯＭの大部分はいわゆる外層膜タンパク質（ＯＭＰ’　ｓ）から成る。ＯＭＰ’　ｓは固有の構造と性質を有するタンパク質である。その本来の状態では、グラム陰性細菌のＯＭＰ ’Ｓはリボ多糖（ＬＰＳ）及び他の膜成分に緊密に結合している。○ＭＰ’　ｓの立体構造は、ＬＰＳ及び環境中の他の特定の因子との会合に依存するように思われる。これらの他の因子とは何か、そしてそれが立体構造にどのように影響するかについてはよくわかっていない。

Ｘ線回折分析の結果、ネイティブタンパク質のエピトープは約１５〜２５個のアミノ酸残基を含み、２又は３の不連続な表面ループから成ることが示された。

例えば、Ｌａｖｅｒら、ｎ土ユ　６１　：　５３３−５５６　（１９９０）参照、外層膜タンパク質中に含まれる保護エピトープは細菌の細胞表面上に露出しており、そのためそれらは同じ菌株の細菌による感染から動物を保護することができる抗体を誘起することができる。エネルギー計算によると、エピトープのより少ない５〜６アミノ酸残基が抗体との結合エネルギーの大部分に寄与し、他の周りの残基は単に相補性を助けるに過ぎないことが示唆されている。結合エネルギーの大部分に寄与すると考えられる残基は直線配列上に配列されているのではなく、エピトープ表面にわたって分散している。

○ＭＰ″　Ｓにおいては、エピトープ領域は、膜の外側に突出するいわゆるβ領域を結合するループである。これらのループは親水性で、○ＭＰ全体は水に可溶ではないが部分的には水溶性かもしれない。

変性したタンパク質中においては、ネイティブ（保護）エピトープの立体構造が通常失われており、このような変性タンパク質に対して形成された抗体は、このようなタンパク質が誘導された生物に対して保護的ではない、しかしながら。

タンパク質（及びエピトープ）の正しい立体構造を回復することは可能である。

熱、酸、アルカリ、尿素、又は塩酸グアニジンによって変性されたタンパク質を用いて再生の過程を説明するための実験的研究が多くなされた。プロリン残基のシス−トランス異性化又はジスルフィド結合の形成が含まれない限り、小さなタンパク質（例えば０．１ｓ）は迅速に再生する（Ｋｉｍ　Ｐ、とＢａｌｄｗｉｎ、　Ｒ，Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、現車±ｅｍ、　５９：６３１−６６０（１９９０）　、大きなタンパク質の再生は通常より複雑ではるかに非予測的である。尿素、塩酸グアニジン又はＳＤＳによって変性されたタンパク質はプロリン残基のシス −トランス立体配置を容易に喪失する。もとの立体配置は化学的な方法によっては容易には回復されないが、ペプチジル−プロリルシス−トランス異性化酵素によって触媒される場合もある（Ｆｉｓｈｅｒ、　Ｇ、とＢａｎｇ、　Ｈ、ＢＡ　８２８：３９−４２　（１９８５））、元のジスルフィド結合の回復もまたしばしば非常に問題である（Ｅｗｂａｎｋ、　Ｊ、とＣｒｅｉｇｈｔｏｎ、　Ｔ、　Ｎａｔｕｒｅ　３５０：５１８−５２０　（１９９１））、これはネイティブなタンパク質が水溶性の場合であっても当てはまり得る（タンパク質再生の問題にライては一般的にＲ４ｃｈａｒｄ、　Ｆ、　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　２６４：３４−４１　（Ｊａｎｕａｒｙ、　１９９１）参照）。

精製された外層膜タンパク質は、医学の分野において、病原性グラム陰性細菌により引き起こされる疾病を防ぐワクチンとして、又は免疫学的方法によりこのような疾病を診断するための試薬として用いることが可能である０例えば、ネイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　赳胆皿旦回」）菌（髄膜炎菌）は、ヒトの危険な感染症である化膿性髄膜炎を引き起こす（Ｐｅｌｔｏｌａ、　Ｈ，Ｒｅｖ、　Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｄｉｓ、　ｊ、　５ニア１−９１（１９８３））　、髄膜炎菌に対するワクチンは長い間必要とされている。１９７０年代の初め、莢膜多糖ワクチンが２つの髄膜炎菌血清群ＡとＣに対して有効であることが示された（世界保健機構研究グループ、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓｅｒｉｅｓ　Ｎｏ、　５８８．　Ｗｏｒｌｄ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、　Ｇｅｎｅｖａ、　１９７６）　、Ｌかしなが■ 、第３の主要な血清群である８群（以下、ＭｅｎＢという）の莢膜は、い（っかのヒト組織中の糖タンパク質の糖部分と構造的に類似していることがわかった（Ｆｉｎｎｅ、　Ｊ、　Ｌｅｉｎｏｍｅｎ、　Ｍ、とＭａｋｌｅｌａ、　Ｐ、Ｈ，Ｌａｎｃｅｔ　ｉｉ：３５５−３５７　（１９８３））　、■■■ 果もたらされる強い免疫学的交差反応性によって、ＭｅｎＢに対する莢膜多糖ワクチンを製造しようとする試みがなぜ失敗してきたのかが説明されるかもしれない。

ＭｅｎＢワクチンの他の候補が探されている。　Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　匹旦皿旦回Ｂ菌の外層膜は、この細菌が直接外界と接触する表面構造なので、このような候補の１っである。異なる○Ｍ膜成分対するモノクローナル抗体によりもたらされる保護が幼児ラットモデルを用いて行われている（Ｓａｕｋｋｏｎｅｎ、　Ｋ、　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、ハ遺回但凹ｓｉｓ　４：２０３−２１２（１９８８））、　０Ｍタンパク質に対する抗体は保護能力を有することがわかった０部分精製されたＯＭ膜成分ら成る○Ｍ複合ワクチンが調製され、いくつかの分野で試験されている（Ｆｒａｓｃｈ、　Ｃ，Ｅ、　Ｖａｃｃｉｎｅ　５：３−４　（１９８７）；　Ｆｒｏｈｏｌｍ。

Ｌ、Ｏ，、Ｂｅｒｄａｌ、　Ｂ、Ｐ、、　Ｂｏｖｒｅ、　Ｋ、、　Ｇａｕｓｔａｄ、　Ｐ、、　Ｈａｌｓｔｅｎｓｅｎ、＾、Ｉ、、　Ｈａｒｂ盾■A　Ａ。

、　Ｈａｒｔｈｕｇ、　Ｓ、、　Ｈｏ１ｔｅｎ、　Ｅ、Ｈｏ１ｂｙ、　Ｅ、Ａ、、　Ｌｙｓｔａｄ、　Ａ、、　０ｍ１ａｎｄ、　Ｔ、　Ｒｏ唐■獅曹魔奄■ ｔ、　Ｅ、、　Ｖｉｋｏ、　Ｇ、、　Ｆｒａｓｃｈ、　Ｃ，Ｅ、とＺｏｌｌｉｎｇｅｒ、　Ｗ、Ｄ、　Ａｎｔｏｎｉｅ　ｖａｎ　Ｌｅｅｕｗ■獅■盾■■ ＜５２：２３９−２４１　（１９８６））　。

Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ肌…皿旦旦」及び他の病原菌であるＮｅ１ｓｓｅｒｉａ釣工：垂狙鰭、抛旦Ｅ吐旦胚１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ、　Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｓｐ、及びＢｒｕｃｅｌｌａ　ｓｐ、のような菌からの○ＭＰ’ＳのようなＯＭＰ’ｓの需要はあるが、従来の生化学的方法によってグラム陰性細菌からＯＭＰ’　ｓを調製し精製することは困難である。特に問題は、ＯＭＰ’Ｓが毒性のあるリボ多糖と強く結合していることである（Ｈｉｔｃｈｃｏｃｋ、　Ｐ、Ｊ、とＭＯｒｒｉｓｏｎ、　Ｄ、Ｃ，、ｉｎ　Ｅ、Ｔ、　Ｒ４ｅｔｓｃｈｅ１編Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ、　ｖｏｌ、１．　Ｃｈ■高奄唐狽■ ｏｆ　Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、　Ｉｎｃ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８４）、■IなＬＰＳを除去する問題は、過激な方法を用いても満足できるようには解決されていない。

外層膜タンパク質の生産及び精製の両方とも、もし○ＭＰ’　ｓがグラム陽性細菌中で遺伝子工学的な方法を用いて生産されるならば、それらはリボ多糖を含まないのでより単純で有効な方法となり得る。

遺伝子工学的方法を用いてタンパク質を生産する際、組換えタンパク質を大量に生産することがしばしば目的となる。大量の組換えタンパク質が細菌中で生産されると、タンパク質は不溶性の凝集を形成することがある。これらの不溶性凝集は封入体と呼ばれる。封入体中では、タンパク質は、本来の立体配置とエピトープを持たない非天然状態にある。生物活性が回復する前に（例えば酵素若しくはレセプター活性又は保護エピトープ）１組換えタンパク質はそのネイティブな立体構造に戻らなければならない、すなわち、正しく再生されなければならないカオトロピック剤及び洗浄剤を用いていくつかのタンパク質を可溶化し、ネイティブの立体構造に戻すことができる（カオトロピック剤は、変性親油性タンパク質が水溶液中にある場合の特徴であるランダムコイルが親水性領域中に発生することを防止する）、残念ながら、細菌中に封入体として生産されるタンパク質は、多くのカオトロピック剤及び洗浄剤に対して非常に耐性であり（一般的に初ｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｅｎｚ　ｍｌｏ　、　１９９０参照）、もし溶けたとしても、高濃度の尿素、塩酸グアニジン又はＳＤＳに溶けるだけである。

ある場合には、酵素タンパク質の活性はカオトロピック剤を除去した後に回復し得る６例えば、不活性なプロウロキナーゼ封入体を６Ｍ塩酸グアニジン及び２− メルカプトエタノールで可溶化し、次いで２Ｍ尿素を含む緩衝液中で１５℃で２４時間タンパク質を再生させることにより活性なプロウロキナーゼが形成される（Ｏｒｓｉｎｉ、　Ｇ、ら、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１９５：６９１−６９７　（１９９１））、いくつかの組換えタンパク質はザルコシルに可溶であり（Ｐｕｏｈｉｎｉｅｍｉ、　Ｒ，、Ｍ、　Ｋａｒｖｏｎｅｎ、　Ｊ、　Ｖｕｏｐｉｏ−Ｖａｒｋｉｌａ、　Ａ、　Ｍｕｏｔｉａｌａ、１．Ｍ、　Ｈｅ１ａｎｄｅｒとＭ、　５ａｒｖａｓ、Ｉｎｆ、ｆｍ、５８：１６９１−P６９６（１９９０）；　Ｆｒａｎｋｅｌ、　Ｓ、ら、力１ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅ４．８８：１１９２−１１９６　（１９９１））　A洗浄剤を除去すると生物活性が回復することがある。アルカリもまた、封入体タンパク質の本来の立体構造を誘起し得る。アルカリ−尿素中に溶解されたプロキモトリプシンは、正しい本来の立体構造に再生され、次いで酸性ｐＨにおいて機能し得る　（Ｍａｒｓｔｏｎ　Ｆ、ら、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｌｅｔｔｅｒｓ　７７２４３−２５０　（１９８４））　。

変性した抗原上のエピトープの回復については、酵素として機能するタンパク質の酵素活性の回復についてよりも知られていない、わずかに得られている知識は変性されたネイティブタンパク質の研究からもたらされた。ある研究では、大腸菌の外層膜タンパク質であるＯｍｐＡとＯｍｐＦが５ＤＳ−ゲル電気泳動により初めて精製された（Ｄｏｒｎｍａｉｒ、　Ｋ、ら、シ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６５：　１８９０７−１８９１１　（１９９０）、他の研究では、これらの同じ○ＭＰ’　ｓがオクチルＰＯＥ抽出により抽出された（ＥｉｓｅｌｅとＲｏｓｅｎｂｕｓｃｈ、　１９９０）　、リボ多糖（ＬＰＳ）はいずれの場合も活性の回復に必要ではなかった。これは、大腸菌のスフェロプラストにおいて、ＯｍｐＦのトリマー化がＬＰＳの存在下においてのみ起きることを示した研究（Ｓｅｎ。

ＫとＮ１ｋａｉｄｏ、　Ｈ，、！、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７３：９２６− ９２８（１９９１））と一致していない。

大腸菌○ｍｐＡと○ｍｐＦの再生に関する知識は、ネイティブタンパク質の再生の全体的な知識に付加されるには有用であるが、ＬＰＳ、他の膜及び／又は環境成分と緊密に結合したことがない、遺伝子工学的に生産されたＯＭＰ゛　Ｓの再生に何が必要であるかを教示しないし予言もしない。

上述のように、グラム陰性細菌の外層膜タンパク質はリボ多糖（ＬＰＳ）及びおそらく他の膜成分と緊密に結合している。それらの立体構造は膜環境におけるこれらの成分との会合に依存している。従って、もしＬＰＳ及びおそらく他の膜成分が、単離された○ＭＰ’ｓの調製物中に存在しないとすれば、これらの安定化成分は、これらの機能をまねる他の成分によって置き換わっている必要があり、それによってＯＭＰが本来のβ−バレル立体構造において安定であることが確保されなければならない（β構造は、ＬＰＳと複合したＯＭＰの良く秩序だった部分である）。

このように、ＯＭＰの再生は、遺伝子工学的に生産されたＯＭＰを単に可溶化しカオトロピック剤を透析で除去するだけでは達成できない、免疫原的機能を回復するためには、すなわち、通常β立体構造として存在する膜結合領域を再安定化してエピトープループを露出するためには、洗剤又は他の薬剤を、天然のものを真似る環境によって置換する必要がある。ＯＭＰの本来の立体構造を１００％回復することは必要ではないかも知れないが、この置換によって（ａ）エピトープループの適正な再生及び（ｂ）免疫系との接触、すなわち、エピトープループが、動物又はヒトに注射され、次いで希釈された際に、主として水溶性の環境中に突出することがもたらされなければならない。

本発明の目的は、純粋なりローン化された外層膜タンパク質の製造方法を提供すること及び動物内において、　（ａ）殺菌力を有しくｂ）動物を元の感染源による感染から保護することができる抗体の産生を誘起することができる生物学的又は免疫学に活性なエピトープを回復するように前記外層膜タンパク質を再生する方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、これらの純粋なりローン化され、再生されたＯＭＰ゛　Ｓをグラム陰性細菌によって引き起こされる感染症の同定のための診断剤として用いることである。

本発明のさらなる目的は、これらの純粋なりローン化され、再生されたＯＭＰ゛　Ｓをワクチンとして用い、クローン化ＯＭＰ’　ｓをコードする遺伝子が誘導された細菌の菌株による感染に対して動物及びヒトを保護することである。

定義本願明細書及び請求の範囲において、以下の語は以下に記載する意味で用いている。

本発明において「調節及び発現配列」とは、遺伝子のポリペプチドをコードするＤＮＡの前にあるＤＮＡ配列を言う、このＤＮＡ配列は前記ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の転写及び翻訳に必要である。このような配列は典型的にはプロモーター及びリポソーム結合部位を含み、さらには調節タンパク質のための結合部位を含むこともある。「調節及び発現配列」はそれらのいずれの生物学的に活性な断片であってもよい、「調節及び発現配列」はまた、ポリペプチドのＮ− 末端断片が分泌のための機能的なシグナル配列でない場合には、該ポリペプチドのＮ−末端断片をコードするＤＮＡ配列をも包含することがある。

「外層膜タンパク質」及び「成熟外層膜タンパク質」は１分泌のためのシグナルペプチド又は機能的なシグナルペプチドが存在しない外層膜タンパク質を意味する。

「ベクター」は、宿主内で宿主の染色体とは独立して複製することができる自律的な要素であって、他のＤＮＡ配列をその中に組み入れることができるものを意味する。このようなベクターは細菌性プラスミド及びファージを包含するがこれらに限定されるものではない。

「機能的に連結した」とは、プロモーターを包含する調節及び発現配列が、構造遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現の開始を制御することを意味する。プロモーターとポリペプチドの開始部位との間にあり、ポリペプチドの発現を促進する、プロモーターと同じ遺伝子から誘導されたＤＮＡ配列又は他のＤＮＡ配列が存在し得る。このＤＮＡ配列はポリペプチドに融合して残るペプチドをコードしていてもよいが、該ペプチドは分泌のための機能的シグナルであってはならない。

ＯＭＰの生産に関し「組換え的に生産された」とは、細菌の１つの種のＯＭＰ゛　Ｓ又は該タンパク質をコードするＤＮＡが他の種の細菌細胞内で発現されることを意味する１組換え的に生産されたＯＭＰは遺伝子発現及び遺伝子工学的手法を用いて生産されたものであろう８組換え的に生産されたＯＭＰ’ｓはクローン化されたＯＭＰ’　ｓであり、細菌の天然の外層膜から抽出された○ＭＰ’ｓとは区別される。

発明の要約本発明は病原性グラム陰性細菌からクローン化された外層膜（ＯＭ）タンパク質を生産する方法を提供する０本発明はまた、このようにクローン化された外層膜タンパク質を再生し、殺菌性かつ前記病原性グラム陰性細菌による感染に対して保護を与えることができる抗体の産生を暉乳動物及び他の動物において誘起することができる免疫学的に活性なエピトープを、前記クローン化された０Ｍタンパク質が再獲得する方法を提供する。この方法では、ヒト及び動物において病原性を有することが知られているグラム陰性細菌の外層膜タンパク質をコードするＤＮＡがグラム陽性細菌宿主中で発現される。このようにして生産された組換えすなわちクローン化０Ｍタンパク質は次いで再生され、動物及びヒトにおける抗体産生を誘起する二とができる生物学的又は免疫学的に活性なエピトープが再獲得される。該抗体は殺菌性で該クローン化○ＭＰ’ｓをコードする遺伝子が誘導された病原性グラム陰性細菌による感染から動物及びヒトを保護するものである、本発明では、宿主中でよく発現される遺伝子の調節及び発現配列に、動物及びヒトに対して病原性であることが知られているグラム陰性細菌の外層膜をコードするＤＮＡ配列が機能的に連結されたものを含む組換えＤＮＡ分子を含む、バチルス又は他の適当なグラム陽性細菌宿主が用いられる。調節及び発現シグナルは典型的には有効なプロモーター及びリポソーム結合部位である。

好ましい態様では、外層膜タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、調節及び発現配列と同様、機能的なシグナル配列を有さない、シグナル配列が存在すると、グラム陽性宿主中で発現される組換え外層膜タンパク質の量が減少する。

本発明では、組換えＤＮＡ分子は、宿主菌株中で数個のコピーに複製することができるベクターで宿主を形質転換することによってバチルス又は他の適当なグラム陽性宿主に導入され得る。あるいは、組換えＤＮＡ分子はバチルス又は他の宿主菌株の染色体中に組み込まれ得る。この方法を用いると、通常の実験室培地を用いた場合、１リツトルの培養物中に１００ｍｇ以上の生産物を得ることができる。生産物は細胞内で凝集していることもあるし封入体の形態で見出されることもある。

本発明の教示によると、０Ｍタンパク質の再生条件は、０Ｍタンパク質がその天然の環境、すなわち、外層膜中におけるのと同じ又は部分的に同じ立体配座をとらせることを許容する条件である。このような条件は、０Ｍ中に存在する両親媒性の化合物、例えばＬＰＳを用いることによって達成され得るが、ＬＰＳは毒性を有するのでＬＰＳを使用することは好ましくない、ＬＰＳの無毒性誘導体を用いることができる。他の無毒性脂質若しくはその誘導体若しくは類似体を単独で、又は洗剤、ｐＨ及び／又は温度変化、例えば糖やアミノ酸のような化学物質の添加並びに保護的エピトープの再生にとって好ましい他の環境と組合せて用いることができる。　（ａ）エピトープループの適正な再生及び（ｂ）それが免疫系に接触可能であること、すなわち、エピトープループが、注射及びその後の希釈後、動物又はヒトの主として水溶性の血清中に突出することが確保される限り、これらのいずれの方法及び薬剤並びにそれらの組合せのいずれをも用いることができる。

本発明の方法は、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　赳ユ部旦回」のクローン化され再生されたクラス１外層膜タンパク質、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎ値劇１説卦のクラス３０Ｍタンパク質及び大腸菌の０Ｍタンパク質○ｍｐＡの、それぞれ枯革菌中での生産によって例示される。しかしながら、当業者に明らかなように、組換え０Ｍタンパク質を再生することが可能であるという教示の結果、この方法は、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅ旦皿旦胆鳥の他の０Ｍタンパク質、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｖ三：立狙井、勤μ回垂■四１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ、　Ｙｅｒｓｉｎｎ朋、及びＢｒｕｃｅｌ　ｌａ　朋、の０Ｍタンパク質を包含する（これに限定されない）他の外層膜タンパク質の生産に用いることもできる。

本発明の１つの目的は安全で有効なワクチンの生産方法を用いることである。

もう１つの目的はグラム陰性細菌によって引き起こされる感染の同定のための診断抗原を提供することである。

図面の簡単な説明及びヌクレオチド配列図１　ｐＫＴＨ２８８及び２８９の構築図２　ｐＫＴＨ２９０の構築［！１３　枯草菌菌株の全細胞のタンパク質パターン、レーンミニ低分子標準、レーンｂ、ｃ、ｄ及びｆ：対照菌株、レーンｅ：ｌＨ６６２７図４　湿重量０．５ｍｇの細菌から誘導された封入体（−２，ＯＯＯｘｇペレット）のタンパク質パターン、レーンａ、低分子標準、レーンｂ、ｃ、ｄ及びｆ、対照菌株、レーンｅ　：　ｌＨ６６２７図５　試験した１２の形質転換体コロニーのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クマシーブルー染色）　（実施例３参照）、レーン１：分子量標準、レーン２　：　ｐＫＴＨ２１７（Ｐｕｏｈｉｎｉｅｍｉ、　Ｒ，。

Ｍ、　Ｋａｒｖｏｎｅｎ、　Ｊ、　Ｖｕｏｐｉｏ−Ｖａｒｋｉｌａ、　Ａ、　Ｍｕｏｔｉａｌａ、　１．Ｍ、　Ｈｅ１ａｎｄｅｒ　ａｎｄ　l、　５ａｒｖａｓ、　Ｉｎｆ、　１ｍｍ、　５８：１６９１−１６９６（１９９０））から生産された、ザルコモ用可溶化Ｂａｃ−〇ｍｐＡ、レーン３：挿入物を全く含まない分泌ベクターを含む菌株であるｌＨ６４１８からレーン２のＯｍｐＡと同様にして調製されたＭ　ｏ　ｃ　ｋ調製物、レーン４〜１５：別個の形質転換体コロニーのサンプル、左の数字は分子量マーカーの位置と大きさくｋＤａ）を示す、右側の記号はＯｍｐＡの位置を示す。

図６　５００ｍ１のｌＨ６６４９（湿重量５〜７ｇの細胞）の粒子遠心の異なる段階における５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色、レーン１：分子量標準、５μｌ　（５００μｌの試料緩衝液に懸濁された）がアプライされた。レーン５　：　２．ＯＯＯｘｇの遠心後の上清、２０ｍ１の２μｌがアプライされた。

レーン６：２、０００ｘｇの遠心後のペレット（湿重量１．８８ｇ）、ペレットを１０ｍ１の５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐ　Ｈ８）に再懸濁し、０．３μ ｌをアプライした。レーン１３：　２．　ＯＯＯｘｇ遠心によるペレットの洗浄後（湿重量０．３８ｇ）、最終ベレットを４ｍｌの上記緩衝液中に再懸濁し、３ μｌの１〜１０倍希釈物をアプライした。

レーン１４　：　５．ＯＯＯｘｇ遠心後のペレット（湿重量０．４５ｇ）、ペレットは５ｍｌの上記緩衝液に再懸濁し、３μｌの１〜１０倍希釈物をアプライした。レーン１１　：　５，０００ｘｇ遠心後の上清、２０ｍ１の上清の２μｌをアプライした。左の数字は分子量マーカーの位置と大きさくｋＤａ）を示す、右側の記号はＯｍｐＡの位置を示す。

配列番号１及び２　（Ｓｅｑ、　１０１及びＳｅｑ、　ＴＤ２）　ＰＣＲ反応においてクラス１タンパク質をコードするＤＮＡを増幅するために用いたオリゴヌクレオチド、配列番号１のオリゴヌクレオチドはＨｉｎｄ　Ｉ＋１部位を与える４つのヌクレオチド（ＡＡＣＣ）と、成熟タンパク質の最初の１０アミノ酸をコードする、Ｂａｒｌｏｗ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｍｏ１．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　３：１３１−１３９（１９８９）の１２５〜１５５ヌクレオチドとから成る。

配列番号２のオリゴヌクレオチドは４つのヌクレオチド（ＡＡＣＣ）と以下の逆配列とから成る。…ｎｄＨＩ部位（停止コドンの一部を含む）、停止コドン及びＢａｒｌｏｗ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｍｏ１．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　３：１３１−１３９（１９８９）の１２４６〜１２１７ヌクレオチド、配列は請求の範囲の前に明細書中に含まれている。

配列番号３　（Ｓｅｑ、　１０３）　ｐＫＴＨ２５０挿入物Ｐｉ、７．１６のＤＮＡ配列、図示の配列のヌクレオチド１はＢａｒｌｏｗ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｍｏ１．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　３：１３１−１３９（１９８９）の配列のヌクレオチド１２５に対応している。

発明の詳細な説明０Ｍタンパク質の生産当業者に理解されるように、バチルスについての以下の段落に記載された方法は、必要ならば適当に修飾して、過度の実験を行うことなく他のグラム陽性細菌にも適用可能である。

バチルス又は他のグラム陽性宿主を形質転換することによる０Ｍタンパク質の生産本発明においては広範囲の適当な発現ベクターを用いることができ、これらは遺伝子組換えの分野の当業者にとって知られている。好ましいベクターは、１９９０年２月２日に出願された、「バチルス菌株におけるタンパク質及びペプチドの生産のための新規な組換えＤＮＡ分子」と題するＰＣＴ　ＷＯ９０ＦＩ４１（ＷＯ９００９４４８として１９９０年８月２３日に公開）に開示されている転移（ｔｒａｎｓｆｅｒ）ベクターは、バチルス菌株又は他のグラム陽性細菌中で数コピーにまで複製することができるいずれのプラスミド又はファージであってよい、このようなベクターは複数利用可能であり、最も代表的なものはスタフィロコッカス、バチルス若しくはストレプトコッカスから単離されたプラスミド又はその誘導体である。

調節及び発現配列はほとんどの場合まず使用する転移ベクターに連結され、次いで例えばＤＮＡリンカ−により修飾して発現すべき遺伝子がベクターの調節及び発現配列の下流に結合されるようにする。

本発明において、ＯＭタンパク質遺伝子をクローニングするため（二多くの方法を用いることができる。これらの方法は遺伝子組換えの分野の当業者（二知られている。

宿主を形質転換する前に、０Ｍタンパク質（又はその機能的エピトープ部分）をコードするＤＮＡ配列が適当なベクターに結合される。

ＤＮＡ配列は、特定の天然遺伝子中に見出される、特定のＯＭタンノくり質をコードするＤＮＡ配列と同一である必要はない、○Ｍタンノくり質の天然遺伝子の配列から誘導されたものでもよいが、得られるタンノくり質の性質を変える力１もしれないように修飾されたものでもよい、適当な配列はまた合成的又は半合成的番線も作る二とができる。

選択された宿主は従来方法により形質転換及び培養することができる。適当な形質転換系及び培養条件の選択は選択された宿主に依存する。

バチルス宿主又は他のグラム陽性細菌の細胞内で生産された○Ｍタンノくり質の精製本発明の方法により生産された０Ｍタンパク質はしばしば細胞内封入体を形成する。封入体くすなわち過剰生産されたタンパク質の細胞内凝集物）を生産することの主たる利点は精製が容易フあることである（Ｍａｒｓｏｎと）Ｉａｒｔｌｅｙ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　。

Ｌ血ｕ肌蝕ｕ１８２＋２６４−２７６（１９９０））　、細菌細胞は超音波処理、フレンチ圧力セル中の通過、リソシーム処理又は他の適当な手段により破壊される。二の懸濁液力）ら封入体は低速遠心によりペレット化することができ、通常穏やかな洗剤（二よりさらに洗浄される０通常（もつとも、タンパク質によるが）、封入体（よ尿素や塩酸グアニジンのようなカオトロピック剤又はＳＤＳのような強力な洗剤（二のみ可溶である。可溶形態において、タンパク質は従来の精製方法によりさら（二組製することができる。

バチルスにおいて生産された０Ｍタンパク質がもし封入体中に存在しな（１ならば、上記方法を修飾した方法を適用することができる。精製はまた、可溶化及び種々の洗剤による抽出並びにクロマトグラフィー並びに洗剤の存在下及び非存在下における電気泳動を包含し得る。

本発明の方法により生産された組換えポリペプチドの組成物を調製できるいくつかの異なる方法が当業者に知られている。精製された０Ｍタンパク質又はその断片はそれ単独で薬理的に許容できる投与形態に調製することもできるし、他のいずれのものとも混合することもできる。ネイティブエピトープの回復は、後から除去することができる、尿素、塩酸グアニジン及びＳＤＳのような可溶化及び／又は変性剤の添加を包含し得る。また、リン脂質及び／又はザルコシル又はその誘導体若しくは類似体のような化合物の添加を包含し得る。製剤はリポソーム又は他の形態であり得る。水酸化アルミニウムのような免疫アジュバント及びチオメサールのような薬理的に許容できる保存料を組成物に添加することもできる、これらの方法は１例えば、ｋＪ」１四Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、　１６ｔｈ　Ｅｄ、、　Ｍａｃ、　Ｅｄｓ、　（１９８０）に記載されている。

さらに念を入れることがなくても、当業者は上記記載及び以下の実施例を用いて、本発明を完全に利用することができるものと信じる。実施例に記載された内容は例示のためのものであり、従って、添附の請求の範囲をいかなる意味においても限定するものと解釈してはならない。

実施例実施例１ｌＨ６６２７中での舅、赳胆厘旦回」のＰＬ、７．１６　（クラス１）０Ｍタンパク質のクローニングクラス１タンパク質をコードするＤＮＡのクローニング成熟タンパク質をコードするＤＮＡ断片は以下のようにして得られた０、髄膜炎菌クラス１、ＰＬ、７．１６タンパク質の発行されたヌクレオチド配列（Ｂａｒｌｏｗｅｔ　ａｔ、、　Ｍｏ１．Ｍｉｃｒｏｂｊｏｌ、　３二１３１−１３９（１９８９）を用い、２つのオリゴヌクレオチド（プライマー１及びプライマー２；プライマー１は配列番号１に、プライマー２は配列番号２に示されている）を合成し、髄膜炎菌染色体ＤＮＡを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により成熟クラス１タンパク質をコードするＤＮＡを増幅するために用いた。１１膜炎菌ＤＮＡは、寒天に代えて１．５％アガロースを含むプロテアーゼ−ペプトンプレート上で生育したｌＨ５３４１（Ｐｌ、７．１６）菌株から単離した。クエン酸緩衝液中に両イオン性洗剤を含むもので処理して例えば莢膜を除去した後、ＤＮＡを単離した。ＰＣＲ反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ（商標）を用い、製造者（バーキンエルマーシータス）によって記載された方法を用いて行った。増殖されたＤＮＡ断片は、アガロースゲル電気泳動で分離すると２つのサイズを有していた。大きい方の断片は約１１００ｂｐでこれはクラス１のサイズであると予想され、小さい方のもう１つの断片は約９００ｂｐであった。増幅されたＤＮＡ混合物をフェノール抽出により精製し、エタノール沈殿を行い、ＴＥ　（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ１ｐＨ８，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、制限酵素胆ｎｄ　ＩＩＩで消化した。ユニ及び下記実施例で用いたＤＮＡ技術及び微生物学の従来方法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、、　Ｅ、Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　ａｎｄ　Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ（＋９８９）　Ｍｏ１ｅｃｕａｌｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ第２版、Ｃｏ１ｄ　ｓｐｒｉｎｇ　ｈａｒｂｏ■ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎ、Ｙ、　に記載されている。

プラスミドベクターｐｕｃｔｓを制限酵素Ｈ４ｎｄ　ＩＩＩで消化した。線状化ベクターＤＮＡを、肚ｎｄｌｌｌで消化した増幅ＤＮＡと連結した。ライゲーション混合物を用いてコンビ−テントな大腸菌に１２ＴＧ１細胞を形質転換した。

形質転換後、該大腸菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、４０　μｇ／ｍ　ｌのＸｇａｌ及び０．５ｍＭ　［’ＴＧを含むルリアプレート上で培養した。− 夜で生育したコロニーの約１０％が青色をしており、従ってベクターによりもたらされる背景を有していた。増幅されたＰｌ、、７．１６ＤＮＡの場合、９０個の白色コロニーについて仮想的挿入物のサイズ調べた。これらのうち、１１個が予想されるサイズの挿入物を含んでいた。プラスミドｐＫＴＨ２５０を含む、これらのうちの一つの菌株ＥＨ１５６３をさらに特徴づけた。制限酵素Ｈｉｎｄ　Ｉ比Ｅｃｏ　Ｒ１又は伽！で消化した後の断片は予想されたサイズを有することが示された。挿入物は、Ｍ２Ｓにサブクローニングした後、サンガージデオキシシーケンシング法により配列を決定した。ｐＫＴＨ２５０挿入物の配列は配列番号３に示されている。予想されるように、それは発行されたＰＬ、７．１６配列（Ｂａｒｌｏｗ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｍｉ二σｚｉｏ１．３：１３１− １３９（１９８９）と比較して違いはほとんどなかった。

枯草菌中でのクラス１０Ｍタンパク質の細胞内生産のためのｐＫＴＨ２９０の構築プラスミドｐＫＴＨ２９０の構築は図３に模式的に示されている。プラスミドｐＫＴＨ２５０（クローン化されたクラス１タンパク質ＰＬ、７．１６をコードするＤＮＡを含むｐＵｃ１８）をＨｉｎｄ　ＩＩＩで消化してクローン化されたクラスｌ遺伝子を放出した。プラスミドｐＫＴＨ２８９もまたＨｉｎｄ　ＩＩＩで消化し過剰のアダプターコピーを放出し、ベクターを線状化した（図１参照）、２つの…ｎｄｌｌＩ消化物を連結し、ライゲーション混合物を用いてｌＨ６１４０を形質転換した。

少なくともｐＫＴＨ２８９を受容した細胞をカナマイシン耐性に基づき選択した、カナマイシンを含むルリアプレート上で生育したコロニー中に存在するプラスミドのサイズを細胞溶解及び常法によりアガロースゲル中に試料を走らせることによりチェックした。予想されるサイズのプラスミドを含むコロニーについて、ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及び５ＤＳ −ＰＡＧＥとそれに続く免疫プロッティング（ウェスタンプロッティング）によりクラス１タンパク質の発現を分析した。クラス１タンパク質を発現する、プラスミドｐＫＴＨ２９０を含む１つの菌株ｌＨ６６２７をさらに分析した。ｐＫＴＨ２９０をサンガージデオキシ法によりシーケンシングしてクローニング部位を調べ、アダプターの１つのコピーのみが存在することを確認した。

枯草菌中で細胞内生産されたクラス１タンパク質の発現のスクリーニングバチルス形質転換体中でのクラスＩＰ１．７．１６の発現は５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて以下のようにして行った。ルリア寒天プレート上で生育した細菌の−さじをレムリのサンプル緩衝液中に懸濁し、１００℃に加熱した後、サンプルを５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。クラスｌタンパク質はクマシーブルー染色（図３）及びミリポアフィルタ−上にタンパク質をプロッティングした後、５ＤＳ−ＰＡＧＥを免疫染色する（ウェスタンブロッティング）ことにより可視化した。ウサギをＭｅｎＢ：　１５：Ｐｌ、７．１６細菌の抽出物で免疫化することにより調製した抗血清ＫＨＩＩＩＯを免疫染色に用いた。結果は、市販の髄膜炎菌血清型判別キット（ＲＩＶＮ、Ｂｏｘ４５７，３７２０　ＡＬ　Ｂ１１ｔｈｏｖｅｎ、オランダ）から得たＰｌ、７．１６特異的モノクローナル抗血清により確認した。

Ｐｌ、７．１６タンパク質を発現している１つの形質転換体（ｌＨ６６２７株）をさらなる研究のために選択した。

数種類の他のクラスｌタンパク賀サブタイプ（Ｐｌ、１５、Ｐｌ、２、ＰＩ。

１、Ｐｌ、９）並びに髄膜炎菌クラス３タンパク質血清型９及び１５をコードするＤＮＡについて同様な構築を行った。

実施例２ｌＨ６６２７中での舅、並虹皿ユ回旦のＰＬ、７．１６　（クラス１）０Ｍタンパク質であるＢａｃＰｌ、７．１６タンパク質の生産ＢａｃＰ１．７．１６タンパク質を含む封入体（Ｉ　Ｂ）の調製１リツトルあたり１０〜３０μｇのカナマシンを含む液体又は固体ルリア培地上で細菌を生育した。１リツトルのルリア液体培地を培養した場合、約ｌｏｇ　（湿重量）の細菌細胞が得られた。

細菌を以下のようにしてリゾチームで破壊した。カナマイシンを含むルリア寒天プレート上で生育した細菌１グラムを、５ｍｌの緩衝液中２０シヨ糖（２５ｍＭＴｒｉｓＨＣ１、ｐＨ８，０，１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１ｍｇリゾチーム／ｍｌを含む）中に懸濁した。３７℃で３０分間インキュベートした後、プロトプラストを遠心（１０，０００ｘ　ｇ）により回収し、それを５ｍｌの５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣＩ、ｐＨ８，０中に懸濁することにより溶解した。ＤＮａｓｅ　（１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、５分後、封入体を１０．　ＯＯＯｘｇ、１０分の遠心分離により回収した。

これを５ｍｌの５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣＩ、ｐＨ８，０中２％ＮＰ−４０に懸濁（洗浄）し、１０．ＯＯＯｘｇ、１０分の遠心により回収した。生産物のサンプルを５ＤＳ−ＰＡＧＥ（レム１月により電気泳動した０図４は、クマシーブルーで染色したこの５ＤＳ−ＰＡＧＥのタンパク質パターンを示す、封入体として単離されたＢａｃＰｌ、７．１６タンパク質をＢａｃＰｌ、７．１６−ＩＢと呼ぶ。

１０ｇの細菌（約５００ｍｇタンパク質）から誘導された封入体分画は、３００ｍｇ　（ローリ−法（Ｌｏｗｒｙ、　Ｏ，Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、１９３：２６５−２７５（１９５１）により測定）のタンパク質を含んでいた。この分画中のＢａｃＰｌ、７．１６の量は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（図６）の肉眼観察によると大ざっばに見積もって少なくとも１２０ｍｇである。これはｌＨ６６２７からの封入体中に存在するタンパク質の１／３以上がＢａｃＰｌ、７．１６タンパク質であることを意味する。ＢａｃＰｌ、７．１６タンパク質は、ｌＨ６６２７の全細胞性タンパク質の少なくとも２５％を占めると計算される。また、培養物１リツトル中の１００ｍｇを超えるＢａｃＰｌ、７．１６タンパク質が存在したものと計算される。

ＢａｃＰｌ、７．１６タンパク質のサイズは、５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、Ｎ。

煕肚町ｎ図旦の真正なタンパク質のサイズとほぼ同じである。

実施例３枯草菌中における大腸菌の外層膜タンパク質○ｍｐＡの細胞内生産発現ベクターｐＫＴＨ３１２５の構築プラスミドｐ　ＫＴ　Ｈ２１７（Ｐｕｏｈｉｎｉｅｍｉ、　Ｒ，、Ｍ、　Ｋａｒｖｏｎｅｎ、　Ｊ、　Ｖｕｏｐｉｏ−ＶａｒｋｉＩａ、　Ａ、　Ｍｕｏｔｉａｌａ、１．Ｍ、　Ｈｅ１ａｎｄｅｒとＭ、　５ａｒｖａｓ、Ｉｎｆ、ＩｏＩｌｌ、　５８：ｌ６９１−１６９６i１９９０））は、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ末端から始まり、大腸菌のＯｍｐＡタンパク質の８〜３２５番アミノ酸残基をコードする２、５ｋｂのＨｉｎｄ　ＩＩＩ−Ｂａｍ　Ｈ１１月を含む、該断片は、胆ｎｄ　ＩＩＩ末端において唯一のＣｌａ　ｌ−Ｈｌｎｄ　ＩＩＩ断片と隣接する。プラスミドｐＫＴＨ３１２５を構築するために、このＣ１ａ　Ｉ−…ｎｄｌｌ［断片を図１に示すプラスミドｐＫＴＨ２８８のＣ１ａ　ｌ−…ｎｄｌＩＩ断片で置換した。後者の断片はα−アミラーゼのプロモーター及び先端が切断された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）非機能的シグナル配列を含む。

ｐＫＴＨ３１２５において、それらは○ｍｐＡタンパク質をコードするＤＮＡ断片と融合された。プラスミドｐＫＴＨ２１７及び２８８をエンドヌクレアーゼ辺ａＩ及び胆ｎｄ　ＩＩＩで消化し、フェノール抽出し、エタノール沈殿し、水に再懸濁した３次いで１．２μｇの消化したｐＫＴＨ２１７を２．５μｇの消化したｐＫＴＨ２８８と混合し、ポリヌクレオチドキナーゼで処理し、次いでライゲートした。全てのＤＮＡ操作はＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　（Ｍａｎｉａｔｉｓ、丁、、　Ｅ、Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈとＪ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ秩@Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｙ、　Ｎ、Ｙ、　１’９８２）に記載されたように行った。枯草菌ｌＨ６１４０株のコンビ−テントな細胞を次いでライゲーション混合物で＠ａｎｉａｔｉｓらによって記載された通りに形質転換し、１０ｇｇのカナマイシンを含むルリアプレート上にプレーとした。得られた１０４個の形質転換体コロニー中の２４個についてＯｍｐＡの発現を以下のようにして試験した。コロニーの約半分を１０ｇｍのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液と混合し、１００℃に５分間加熱し、試料を５ＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した（Ｉａｅｍｍｌｉ、　［１，に、　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　２２７：６８０−６８５（１９７０））、成熟ＯｍｐＡタンパク質のサイズの大きなバンド（図４．レーン４．６〜９．１３，１４）の存在から判断されるように、数個のコロニーが○ｍｐＡタンパク質を含んでいた。これらのバンドはまた免疫プロッティングにおいてＯｍｐＡと反応した、これらのうちの１つをｌＨ６６４９と命名し、この菌株中のプラスミドをｐＫＴＨ３１２５と命名した。

ｌＨ６６４９中で生産されたＯｍｐＡの分析及び精製１リツトル当たりｌ　ＯｍｇのＮａＣｌ、１ｍｌ当たり１０ｇｇのカナマイシン及び１ｍｌ当たり３０μ工のポテトエキストラクトを含む２倍濃縮し一ブロス（Ｋａｌｌｉｏ、　Ｐ、、　Ｍ、Ｓｉａｌｏｎｅｎ、１．　Ｐａ１ｖａとＭ、　５ａｒｖａｓ、　ｊ、Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１３２F６７７− ６７８　（１９８６））中でｌＨ６６４９を３７℃で一夜振盪（２５０ｒｐｍ）液体培養した。５００ｍ１の培養物からの細胞を遠心により集め（湿重量５．７ｇ）、リゾチームでプロトプラスト化し、ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅ（約５μｇ／ｍｌ）の存在下で浸透圧ショックにより破砕した（Ｓｃｈｏａｉｔ＋ｎａｎ、　Ｃ，、Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ　ＡＳＭ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｄ、Ｃ，（１９８１））　、細胞の破壊は位相差顕微鏡によりモニターした９粒子状物質を次いで１６，０００ｘｇ、１０分の遠心分離によりペレット化した。５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（図５、レーン４）で分析したところ、上清中ではＯｍｐＡは主たるバンドではなかった。ベレット（湿重量１．９ｇ）を５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８，０中に再懸濁し、　２，０００ｘｇで５分間遠心した。５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０，５０ｍＭＴｒｊｓＨＣＩ、ｐＨ８を含む１０ｍ１の洗浄緩衝液中にベレット（０，９ｇ湿重量）を再懸濁した。懸濁液を５ＤＳ− ＰＡＧＥに付したところ、これは主たるバンドとしてＯｍｐＡを含んでいた（図５、レーン６）、次いで懸濁液を５゜０００ｘｇ、１０分間遠心した。ベレットをＰＢＳで洗浄し、次いで再びペレット化した（５．ＯＯＯｘｇ、１０分間）、得うレタヘレット（湿重量０．３８ｇ）を４ｍｌの５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８中に再懸濁した（図５、レーン１３）、上記２．ＯＯＯｘｇの遠心後の上溝（図５、レーン５）もまたＯｍｐＡを主たるバンドとして含んでいた９このため、これをさらに５．ＯＯＯｘｇで１０分間遠心した。得られた上清はもとのＯｍｐＡの痕跡量のみを含んでいた（図５、レーン１１）、得られたベレットをＰＢＳで洗浄したもの（湿重量０．４５ｇ）を５ｍｌの５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８に再懸濁したもの（図５、レーン１４）もまたＯｍｐＡを含んでいたが、量はより少なかった（同量のサンプルをアプライした図５のレーン１３．１４を比較のこと）、結論として、驚くべきことに、ＯｍｐＡを枯草菌ｌＨ６６４９中で発現させると、ＯｍｐＡは２０００〜５０００ｘｇの遠心で集めることができる凝集体又は封入体を形成する。

洗浄後の２０００ｘｇペレット中のＯｍｐＡ量及び５０００ｘｇでペレット化し洗浄した後の２ＱＯＯｘｇ上清中のＯｍｐＡ量を、５ＤＳ−ＰＡＧＥ中のＯｍｐＡバンドの強度（図５、レーン１３及び１４）と分子量標準のバンド強度を比較することにより可視的に見積もった（製造者であるファルマシア社によると、５ μｌの標準をアプライすると、６７ｋＤａと３０ｋＤ＆のバンドは０．８３μｇのタンパク質を含み、４３ｋＤａのバンドは１．４７μｇのタンパク質を含む）９両方のレーンに３μｍの１０倍希釈サンプルをアプライした。レーンエコ中のバンドは１．５μｇのＯｍｐＡを含み、これは２０００Ｘｇペレット中に総量２０ｍｇのＯｍｐＡが含まれることを意味する。レーン１４中のバンドは０．８μ ｇのＯｍｐＡを含むと見積もられ、これは５０００ｘｇペレット中に総量１３ｍｇのＯｍｐＡが含まれることを意味する。従って、精製されたＯｍｐＡの総収量は培養物１リツトル当たり約６０ｍｇであった。

枯草菌中で生産された０Ｍタンパク質の再生及びｌＨ６６２７中で生産されたＢ λｃＰ１．７．１６タンパク質がらの保護エピトープの回復。

再生されたＢａｃＰｌ、７．１６タンパク賀中に保護的エピトープが存在するか否かを、マウスを免疫しその抗血清を酵素免疫分析（Ｅ　Ｉ　Ａ）によって、また殺菌及び保護分析によって調べた。ＯｍｐＡの場合には、ネイティブエピトープの再生はバタテリオファージ阻害分析（実施例８）によって分析した。

マウスの免疫化保護的エピトープの回復は、１群１０匹のマウスを、種々処理した２０ｇｇのＢａｃＰｌ、７．１６タンパク質で免疫化することにより試験した。免疫は２回の注射によって行った。抗原をＰＢＳで希釈したちのＯ，１ｍｌを皮下又は腹腔的注射した。最初の免疫化は表１〜４に示すアジュバントを含んでいた。２回目の注射から１０日後、マウスから採血し、プールした血清を分析した。

免疫血清の分析酵素免疫分析（Ｅ　Ｉ　Ａ）抗髄膜炎薗抗体は、Ｐｌ、７．１６髄膜炎菌ＯＭ製剤又はＢａｃＰｌ、７．１６タンパク質を抗原としたＥ　ｒ　Ａ　（Ｊａｌｏｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、、　Ｊ、旧ｆｅｃｔ、　１９：１２７−１３４（１９８９）により行った６コーテイングの至適量はいずれの場合とも５μｇタンパク質／ｍｌであった。

殺菌検定（Ｇｏｌｄｓｃｈｎｅｉｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１２９：１３０７−１３２３　（１９６９））Ｎ、　ｍ　ｅ@ｎ　ｉユｘ上上ｉｄユニグループＢ：１５：Ｐｌ、７．１６のＨ４４／７６菌株（Ｅ、　Ｈｏ　ｌ　ｔｅｎ社、ノルウェーから入手）を殺菌検定に用いた。髄膜炎菌の他のサブタイプ（Ｊ、Ｔ、　Ｐｏｏ１ｍａｎ社、オランダから入手したＭｅｎＢ：２ｂ：Ｐｉ、２：Ｌ２及びＭｅｎＢ＋１５：Ｐｉ、１５＋Ｌｌ、８菌株を用いて殺菌反応の特異性を調べた。新鮮なモルモット血清を補体源として用いた。５０％の死亡をもたらす最大の血清希釈率を最終力価とした。血清の殺菌活性は保護に相関することが知られている。従って、この検定において陽性であった全ての血清を、保護検定におし＼ても試験した。

Ｍ　ｅ　ｎ　Ｂ感染に対する保護の検定生後５日の異系交配したウィスターラットの子供（Ｓａｕｋｋｏｎｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂ、　Ｐａｔｈ。

Ｋ、　４：２０３−２１２　（１９８ｇ））の実験的感染において、血清が幼ラットを画一性及び髄膜炎から保護する能力を試験した。Ｐｌ、７．１６髄膜炎○ Ｍａ剖で免疫することによって得られたマウス血清（ＨＨ２０９）を陽性対照として用いた。

幼ラットを１群６匹に分け、数種の希釈率（１：１０．１　：　１００．１：１０００）で希釈した免疫血清１００μｍを腹腔的注射した。１時間後、１０８細菌／ｍｌの細菌懸濁液１００μｌを腹腔内投与した。細菌接種６時間後に適当なサンプルを取り、細菌を培養して生ぎた細菌を数えることにより画一性及び髄膜炎の発達を検査した。

保護的抗体は細菌数を減少させ、これは４８時間以内の死亡からの保護と完全に相関している（Ｓａｕｋｋｏｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｉｃｒｏｂ、　ｈ止部、　３：２６１−１６７　（１９８７））　。

塞施億Ａ洗剤及び塩酸グアニジンで処理したＢａｃＰｌ、７．１６タンパク質によるマウスの免疫化（表１参照）ＢａｃＰｌ、７．１６−ＩＢタンパク質の可溶化ＢａｃＰ１．７．１６−ＩＢタンパク質はＳＤＳ、塩酸グアニジン及び尿素には完全に溶けるが、ザルコシル又はセチルアンモニウムプロミド中には部分的にしか溶けない、このタンパク質は可溶化剤を除去すると沈殿する。可溶化剤が塩酸グアニジンである場合には、沈殿したタンパク質はＢａｃＰｌ、７．１６−ＧＵと表示する。詳細には、ＢａｃＰｌ、７．１６−ＧｕはＢａｃＰｌ、７．１６−ＩＢから以下の方法により調製される。５ｍｇのＢａｃＰｌ、７．１６−ＩＢタンパク質を１ｍｌの６Ｍ塩酸グアニジン中に溶かした。遠心後（５０００ｘｇ、５分）、透明な上溝を水で６倍に希釈し、水に対して透析した。沈殿を遠心で回収した。Ｂａｃｋ、１７．１６ −Ｇｕは、ザルコシル及びセチルアンモニウムプロミド（ＣＴＢ）にかなり溶ける点でＢａｃＰｌ、７．１６−ＩＢとは異なるマウスをＢａｃＰｌ、７．１６− ＩＢ若しくは−Ｇｕ又はこれらを上記洗剤に溶解しく５ｍＭのＥＤＴＡを含む、１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８，０中２％洗剤１ｍｌ当たり１ｍｇのタンパク質を含む）、ＰＢＳで５倍希釈したもので免疫した。

免疫血清は上述のように分析した。試験結果を表１に示す、血清は全てＢ、ａｃＰｌ、７．１６タンパク質に対する抗体を含んでいたが、これらのうちの１つ、ザルコシルー可溶化ＢａｃＰ　１．　７．　１６−Ｇｕタンパク質のみがＭｅｎＢ：Ｐｌ、７．１６タンパク賀に対する抗体を有し、わずかに殺菌性及び保護的であった。

実施例５ＢａｃＰｌ、７．１６−ＬＰＳ複合体によるマウスの免疫化ａ）１ｍｇのＢａｃＰｌ、７．１６−Ｇｕを１ｍｌの３Ｍ塩酸グアニジン中に溶かした。２５０ｇｇのＬＰＳを加え、試料を水で３倍希釈し、連続的に０．６Ｍ、０．３Ｍ及びＱ、１５Ｍ塩酸グアニジン、さらに０．１５Ｍ　ＮａＣ１に対して透析した。免疫化の前に試料をＰＢＳで５倍希釈した。

ｂ）５ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８，０中１％ＳＤ３１ｍｌに、１ｍｇのＢａｃＰｌ、７．１６−Ｇｕ　（ａ）と同様）を溶かした、２５０μｇのＬＰＳを加えた。試料を１０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８，０に対して十分に透析した。免疫化の前に試料をＰＢＳで５倍に希釈した。

ｃ）１ｍｇのＢａｃＰｌ、７．１６−Ｇｕ　（ａ）と同様）をＯ，１ｍｌの１％ＳＤＳ　（ｂ）と同様）に溶かした。２５０μｇのＬＰＳ及び０．９ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８中１５０ｍＭ　ＮａＣ１，１％ＮＰ−４０，０，５Ｄｏｃ、０．１％５ＤＳ）を添加した。免疫化の前に試料をＰＢＳで５倍希釈した。

免疫血清は、上記方法により分析した。試験結果を表２に示す、全ての血清はＢａｃＰｌ、７．１６タンパク質に対する抗体をかなりの量含んでし）た、それらはまたＭｅｎＢ：Ｐｌ、６．１６膜に対する抗体も有しており、殺菌性で保護的であった。このことは、この再生方法により保護的エピトープが得られたことを示している。

実施例６ＢａｃＰｌ、７．１６−レシチン複合体によるマウスの免疫化ａ）１ｍｇのＢａｃＰｌ、７．１６−Ｇｕを１ｍｌの１００ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８中２％ＳＤＳに溶かし、１００℃で５分間加熱した。透明な上清を１００ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣ：１．１）８９９２％オクチルグルコシド又は同緩衝液中２％オクチルオリゴオキシエチレン（ｏ　ｃ　ｔ　ｙ　１−ＰＯＥ）で５倍希釈し、室温で一夜インキユベートした。

ｂ）ガラス管上でのレシチン−洗剤フィルムの調製、１０ｍｇのオクチルグルコシド又は０（ｔｙｌ−ＰＯＥを２．５ｍｌのクロロホルム：メタノール（２：１）中に溶かし、クロロホルムに溶けた２０ｍｇのダイズレシチンを加えた。クロロホルムを窒素ガス下で蒸発させ、溶液（ａ）をフィルム上に添加した。よ（混合した後、懸濁液をＰＢＳに対して２日間透析した。この間ＰＢＳは４回取替えた。免疫化の前に試料をＰＢＳで５倍希釈した。

免疫血清は上記方法により分析した。試験結果を表３に示す、全ての血清はＢａｃＰｌ、７．１６タンパク質及びＭｅｎＢ：Ｐｉ、７．１６−膜に対する抗体を含んでおり、殺菌性で保護的であった。このことは、二の再生方法により保護的エピトープが得られたことを示している。

実施例７ＢａｃＰＬ、７．１６タンパク質−レシチンーザルコシル複合体によるマウスの免疫化１ｍｇのＢａｃＰｌ、７．１６−ＩＢ又はＢａｃＰｌ、７．１６−Ｇｕを１ｍｌの２％ザルコシルに懸濁し、Ｏ，１ｍｌのダイズレシチン（２５ｍｇ／ｍｌの２％ザルコシル）を加えた。免疫化の前に試料を０．９％ＮａＣ１で５倍希釈した。いずれの場合もマウスに０．２ｍｌの抗原製削を投与した。

免疫血清は上記方法により分析した。試験結果を表４に示す、２種類の血清のうちの１つ、すなわち、ＢａｃＰｌ、７．１６−４Ｂタンパク質を用いて調製した血清はＢａｃＰｌ、７．１６タンパク質及びＭｅｎＢ：Ｐｉ、７．１６−膜に対する抗体を含んでおり、殺菌性で保護的であった。このことは、この再生方法により保護的エピトープが得られたことを示している。

実施例８リボ多糖を添加することによるＯｍｐＡの再生Ｄｅｔｔａら、シ、　Ｂａｃｔ、　１３１：８２１−８２９　（１９７７）は、大腸菌の精製ＯｍｐＡ中のバタテリオファージに３レセプターループがＬＰＳ　（リポ多糖）及びマグネシウムの助けにより再生できることを示した。このループは、その中心がアミノ酸番号７０のアミノ酸残基からなり、外層膜の外側に位置するものと考えられる。その再生をファージ結合阻害検定により測定した。この検定では、例えば、インジケーター大腸菌上で測定されるプラーク数の減少が再生ＢａｃＯｍｐＡ中でのネイティブエピトープの存在を示す。

ＢａｃＯｍｐＡ２２６０ｍｐＡ２２Ｂ　−ｓｓ　（バチルス・アミロリフエフアシエン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍ　１ｏｌｉ　ｕｉｆａｃｉｅｎ　）の完全なシグナル配列を有するＯｍｐＡの８〜２２８アミノ酸が縦に２つつながったもの）（１８６４４３株中で生産）が大腸菌の精製○ｍｐＡと同様に再生できることが示された。ＢａｃＯｍｐＡ２２ｓ　ＯｎりＡ２２８−５Ｓを陽性対照として用いることによって、ＬＰＳによるＯｍｐＡ（ＢａｃＯｍｐＡ−ｓｓΔ）の立体配座を調べた０表５に示すように、ＢａｃＯｍ＋）Ａ−８５Δは、インジケーター大腸菌へのに３フアージの結合を阻害することができた。しかしながら、必要な量はＢａｃＯｍｐＡ２２ｓ○ｍｐＡ２２８　５ＳよｌＪモ多カッｔ：、　ｔすわち、１５μＨのＢａｃＯｍｐＡ２２ｓ○ｍｐＡ２２Ｂ　−５ｇ　（＋ＬＰＳ）がファージ結合を８３％阻害したのに対し、７５μｇのＢａｃＯｍ＋）Ａ−ｓｓΔ（＋ＬＰＳ）が７０％のファージ結合を阻害するのに必要であった。

従って、ＢａｃＯｍｐＡ−ｓｓΔ＋ＬＰＳによる結合はより非効率であった。ＢａｃｏｍｐＡ−ｓｓΔのファージ結合能力はある程度ＬＰＳｉ二よｊＪ回復され得ると言える。

寄託親株ｌＨ６１４０の枯草菌中のプラスミドｐＫＴＨ２９０（組換え菌株（よｌ８６６２７と命名）は１９９０年７月５日に、ドイツ国Ｄ−３３００ブラウンシュヴアイヒ、マチエルオーダー　ヴエグ１所在のトイチェ　ザムルング　ヴオンミクロオーガニズメン（ＤＳＭ）に、ブダペスト条約に基づき寄託されてし＼る。

その受託番号はＤＳＭ６０８９である。ｐＫＴＨ２９０を含む枯草菌サンプル（よ、本願力咄願され、若しくは本願に基づく優先権を主張する出願が出願され、又はこのような出願に基づいて特許が認められている知的所有権官庁及びブダペスト条約の規定に基づき分譲を受ける権利を有するものに対して分譲される。

勿　へまとめ本発明は、クローン化され、再生された外層膜（０Ｍ）タンパク質を病原性グラム陰性細菌から生産する方法を提供することがわかるであろう０本発明の方法により生産される、再生０Ｍタンパク質は、殺菌性で病原性グラム陰性細菌による感染によるに対して保護を与えることができる抗体の産生を誘起することができる免疫学的に活性なエピトープを有する。これらのクローン他再生○Ｍタンパク質はグラム陰性細菌によって引き起こされる感染症の同定のための診断剤として有用である。これらはまた、ワクチン又はワクチン成分としても有用である。

上記したちの以外の、本発明の種々の修飾が上述の記載から当業者にとって明らかになるであろう、このような修飾は、添附の請求の範囲内に入るものであることを意図している。

（２）配列番号ｌの情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ＝４０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）頗の数ニ一本頗（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル二Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ（Ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント（Ｖり起源：（Ａ）生物名：　Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　匹皿麗旦」Ｊ（Ｂ）株名：　ＩＨ５３４１（Ｘｌ）配列：配列番号１人ＡＣＣＡＡＧＣＴＴ　ＧＡＴＧＴＣＡにＣＣＴＧＴＡＣＧＧＣＧＡ　ＡＡＴＣＡＡＡＧＣＣ４０（２）配列番号２の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：４１塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本領（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボセティカル＝ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０（Ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：　Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　姐阻］旦回ム（Ｂ）株名：　ＩＨ５３４１（ｘｉ）配列：配列番号２ＡＡＣＣＭＧＣＴＴ　ＡＧＡＡＴＴＴＧＴＧ　ＧＣＧＣ；λ％ＣＣＧ　ＡＣＧＧ入ＧＣ；ＣＣ；Ｇ　Ｃ４１（２）配列番号３の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ・１１２２塩基対（Ｂ）型、核酸（Ｃ）＃Ｉの数ニ一本領（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボセティヵル：Ｎ。

（１ｖ）アンチセンス：Ｎ。

（Ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：　Ｎｅｊｓｓｅｒｉａ　肛ユ組り工匡聾（Ｂ）株名・ＩＨ５３４１（ｘｌ）配列：配列番号３ＧＡＴＧＴＣＡＧＣＣＴＧＴｋＣＧＧＣＧｋ　入ＡＴＣ入入ＡＧＣＣＧＧＣＧＴＧＧＡＡＧ　ＧＣＡＧＧ入ＡＣ”ｒＡ　ＣＣＡＧＣＴＧＣ入■@６０ｐｋＴＨ３９のＥｃｏ　Ｒ１消化　アニールしたオリゴヌクレオチドＨｉ間■　消化 ↓ ライゲーン璽ン ↓ カナマイシン選択 ↓ 図１ｐｋＴＨ２５０のＨｉｎｄ　ＩＩ［消化　ｐｋＴＨ２８９のＨｉｎｄ　ＩＩＩ消化ｔ−ｆｉｎｄ　ＩＴＩクラスｒ　ＨｉｎｄｌｌＴ　ＥｃｏＲＩ　ＨｉｎｄＨＩ　ＥｃｏＲｒ　ＨｉｎｄｌＨＥｃｏＲＩ↓ カナマイシン選択 ↓ ウェスタンプロット ↓ プロモーターからの配列番図２国際調査報告、、、、、、、、、。＋、、、、、、、ｃ、、、、、、、、　ＰＣＴ／Ｆｌ　９１１００２１２国際調査報告７１１１曲１かｌｅｍ　ｌ−マー−１吟叩１ｈり削−一一＋１＋ｍ　Ｉｓ　ｌｈｔ　６ｍ−１−φ中−−噛噛隋−ｔｈｅ　Ｍｅ＋−ＢＭｌ　ａｈ　ｌｅ”ｍｗｇ　帽％＋　Ｓ＋Ｍｎｈ　ｐｊｌｅＭ＋　Ｏ＋ｌｕｖ　１０１−１ｅ　ｗ　９１− ＱＢ−３０ｔｋ１ｍｍ＋＠＆Ｐｍ１ｍ６ｎｎｅＩＩ＋５Ｍ５ｔｙｌｌｔｌｌｆ＋ＭＩｈＭ＃＃＃Ｍ１１ｍｌｙ＋ｍｔｈＩｌ＃ｍｍｆ＠ＬｍＩｗ１６１ｅ翌高≠高高撃＝狽mａフロントページの続き（５１）　ｒｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／１０２　９２８４−４Ｃ３９／１０８　９２８４−４ＣＣＯ７Ｋ　１５１０４　８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　１５／３１／／（Ｃ１２Ｎ　１５／３１Ｃ１２Ｒ１：９１）（Ｃ１２Ｎ　１５／３１Ｃ１２Ｒ１：３６）（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、ＧＡ（ＢＰ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ、　ＤＫ。

ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、ＭＣ，ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＳＤ、　ＳＥ、　ＳＵ、　ＵＳ（７２）発明者　ナーミネンーカリオコスキ　マーシャッタフィンランド国　ヘルシンキ　ニスエフ−００９５０ヴオラーデンティエ　５（７２）発明者　ルネバーグーナイマン　ケイトフィンランド国　ヘルシンキ　ニスエフ−〇〇２５０　ウルヘイルカツ　３６Ｉ（７２）発明者　マティライネン　スザンナフィンランド国　ヘルシンキ　ニスエフ−〇〇２６０　ルネバーギンカツ　６９　ジー　５１（７２）発明者　ワールストロム　エヴアフィンランド国　ヘルシンキ　ニスエフ−００２６０ポウジ、ヘスペリアンカッ　９エイ（７２）発明者　イダンパーンーへイッキラ　イロナフィンランド国　ヘルシンキ　ニスエフ−００１５０メリミエヘンカツ　３５　エイ　ジ（７２）発明者　プオヒニエミ　リトヴアレーナフィンランド国　ヴアンター　ニスエフ−０１６００ヴアータクジャ　２シー５５

Claims

【特許請求の範囲】

１．病原性グラム陰性細菌からクローン化された外層膜タンパク質を生産し、該生産されたクローン化外層膜タンパク質を再生して、殺菌性でかつもとの感染源による感染に対する保護を与えることができる抗体の産生を哺乳動物及び他の動物中において誘起することができる免疫学的に活性なエピトープを回復する方法であって、（ａ）ヒト及び動物において病原性であることが知られているグラム陰性細菌の外層膜タンパク質をコードするＤＮＡをグラム陽性細菌宿主中で発現させ、（ｂ）工程（ａ）からの前記外層膜タンパク質を再生して、殺菌性でかつヒト及び動物において病原性であることが知られている上記グラム陰性細菌による感染から前記動物及びヒトを保護することができる抗体の動物及びヒトにおける産生を誘起することができる生物学的又は免疫学的に活性なエピトープを回復することを含む方法。
２．前記細菌宿主はバチルス属に属するあらゆる細菌である請求項１記載の方法。
３．前記宿主は枯草菌である請求項１記載の方法。
４．前記外層膜タンパク質をコードする前記ＤＮＡは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｓｐ．及びＢｒｕｃｅｌｌａ　ｓｐ．の外層膜タンパク質をコードするＤＮＡ配列から選ばれる請求項１記載の方法。
５．前記外層膜タンパク質をコードする前記ＤＮＡ配列は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのクラス１外層膜タンパク質をコードする請求項１記載の方法。
６．前記工程（ａ）からの前記外層膜タンパク質は、ＳＤＳ、塩酸グアニジン、セチルアンモニウムプロミド、リン脂質、レシチン、ザルコシル及び尿素からなる群より選ばれる薬剤又はその組合せにより再生される請求項１記載の方法。
７．請求項１ないし６のいずれかの方法により調製された病原性グラム陰性細菌の外層膜タンパク質。
８．請求項１ないし６のいずれかの方法により調製された、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのクラス１外層膜タンパク質である病原性グラム陰性細菌の外層膜タンパク質。
９．請求項１ないし６のいずれかの方法により調製された、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのクラス１外層膜タンパク質である病原性グラム陰性細菌の外層膜タンパク質であって、該クラス１外層膜タンパク質は血清群Ｂに属するＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｓの菌株からのものである外層膜タンパク質。
１０．請求項１ないし６のいずれかの方法により生産されたクローン化され再生された外層膜タンパク質を含む組成物。
１１．請求項１ないし６のいずれかの方法により生産されたクローン化され再生された外層膜タンパク質を含む組成物であって、薬理的に投与可能な形態にある組成物。
１２．請求項１ないし６のいずれかの方法により生産されたクローン化され再生された外層膜タンパク質を含むワクチン。
１３．前記ワクチンは免疫アジュバント及び薬理的に許容できる保存料をさらに含む請求項１２記載のワクチン。
１４．免疫学的方法で癌原性グラム陰性細菌に対する抗体を検出するための抗原性診断薬としての請求項７ないし１０のいずれか１項に記載の外層膜タンパク質の用途。
１５．ワクチン又はその成分としての請求項７ないし１０のいずれか１項に記載の外層膜タンパク質の用途。
１６．病原性グラム陰性細菌からクローン化された外層膜タンパク質を生産し、該生産されたクローン化外層膜タンパク質を再生して、殺菌性でかつもとの感染源による感染に対する保護を与えることができる抗体の産生を哺乳動物及び他の動物中において誘起することができる免疫学的に活性なエピトープを回復する方法であって、（ａ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのクラス１外層膜タンパク質からの外層膜タンパク質をコードするＤＮＡをグラム陽性細菌宿主中で発現させ、（ｂ）工程（ａ）からの前記外層膜タンパク質を再生して、殺菌性でＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓによる感染から前記動物及びヒトを保護することができる抗体の動物及びヒトにおける産生を誘起することができる生物学的又は免疫学的に活性なエピトープを回復することを含む方法。
１７．前記細菌宿主はバチルス属に属するあらゆる細菌である請求項１６記載の方法。
１８．前記宿主は枯草菌である請求項１６記載の方法。
１９．前記工程（ａ）からの前記外層膜タンパク質は、ＳＤＳ、塩酸グアニジンセチルアンモニウムプロミド、リン脂質、レシチン、ザルコシル及び尿素からなる群より選ばれる薬剤又はその組合せにより再生される請求項１６記載の方法。
２０．請求項１６ないし１９のいずれかに記載の方法により調製されたＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのクラス１外層膜タンパク質。
２１．請求項１６ないし１９のいずれかに記載の方法により調製された、血清群Ｂに属するＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの菌株からのクラス１外層膜タンパク質。
２２．請求項１６ないし１９のいずれかの方法により生産されたＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのクローン化され再生された外層膜タンパク質を含む組成物。
２３．請求項１６ないし１９のいずれかの方法により生産されたクローン化され再生されたＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外層膜タンパク質を含む組成物であって、薬理的に投与可能な形態にある組成物。
２４．請求項１６ないし１９のいずれかの方法により生産されたクローン化され再生されたＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外層膜タンパク質を含むワクチン。
２５．前記ワクチンは免疫アジュバント及び薬理的に許容できる保存料をさらに含む請求項２４記載のワクチン。