JPH06508523A

JPH06508523A - Iron chelate medium additive

Info

Publication number: JPH06508523A
Application number: JP5501299A
Authority: JP
Inventors: シュール　イェッセン，ペテル　ベルント
Original assignee: ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ
Priority date: 1991-06-21
Filing date: 1992-06-18
Publication date: 1994-09-29
Also published as: WO1993000423A1; CA2111984A1; EP0593539A1; AU2196892A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】鉄キレート培地添加剤発明の分野本発明は、哺乳動物細胞の増殖のための培地、主に血清を含まない、又は蛋白質を含まない培地のための鉄則、並びに咳鉄則を含有する培地に関する。[Detailed description of the invention] Iron chelate medium additive field of invention The present invention provides media for the growth of mammalian cells, primarily serum-free or protein-free. Regarding the golden rule for a culture medium that does not contain , as well as the culture medium that contains a cough golden rule.

発明の背景極く最近まで、哺乳動物細胞を増殖するための通常の培地は、細胞の増殖および天然の繁殖のための必要な集団における成長因子の重要な起源として血清を含有していた。しかし、培地中での血清又は特異的な添加された蛋白質の存在は、次の不利益を被っている：すなわち、哺乳動物の培養からの所望の蛋白質製品の精製はより困難でありそして伝染性試剤によって汚染の危険性が増加する。従って、哺乳動物細胞の培養分野において培地を開発することが重要な目的でありこの培地中細胞培養に必要な血清中の成分は同１．；月的にかなう非蛋白質の物質で置き代えられる。従って、血・清を有しないか、又は蛋白質を有しない培地は、生物学的材料（例えば、モノクローナル抗体、天然又は組換え体医薬等）の製造において哺乳動物細胞の培養に著るしく重要になってきている。大抵の血清を有しない培地は、インシュリン、トランスフェリン、セレン、成長因子および成る種の蛋白質および脂肪源を加えた商業的に入手可能な基礎培地である〔ハミルトン等、　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　１３　：５３７−５４７．１９７７　；ハム等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｔｓｏｌ、　５８：　４４−９３．１９７９　；　？シアタ等、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ。Background of the invention Until very recently, the usual media for growing mammalian cells were Contains serum as an important source of growth factors in populations necessary for natural reproduction Was. However, the presence of serum or specific added proteins in the medium suffer the disadvantages of manufacture is more difficult and increases the risk of contamination by infectious agents. Therefore In the field of mammalian cell culture, developing media is an important objective. The components of serum necessary for cell culture in medium are the same as 1. ;A non-protein substance that meets the needs of the moon. Can be replaced. Therefore, a medium without serum/serum or without protein, Production of biological materials (e.g. monoclonal antibodies, natural or recombinant drugs, etc.) has become of significant importance in the culture of mammalian cells. Has most serum No medium consists of insulin, transferrin, selenium, growth factors and A commercially available basal medium supplemented with seed protein and fat sources [Hamilt Ham et al., M. et al., In Vitro 13:537-547.1977; methods Enzytsol, 58: 44-93.1979;? S Atta et al., Ce1l Biol.

Ｉｎｔ、　Ｒｅｐ、　４　；　４３−５０．１９８０　；　Ｂａｒｎｅｓ、　ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５　：　５３４−５４０　、　１９８７　；フォレンチニ等、　Ａｍ、　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　Ｌａｂ、　８　：３５−３７゜１９９０　；プジャーレ、　Ｊ、　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　１５　：　１４７−１５４．１９９０　；ヘプレノトＣｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５：　３−１４．　１９９１）発明の要約今や血清を有しない培地中鉄起源としてトランスフェリンをシトレートおよび鉄塩の非蛋白質シトレートにより置換できることが見出された。Int, Rep, 4; 43-50.1980; Barnes, B ioTechnology 5: 534-540, 1987; Foret Nchini et al., Am, Biotech, Lab, 8:35-37°199 0; Pujare, J., Biotech, 15: 147-154.1 990; Heprenoto Cytotechnology 5: 3-14. 19 91) Summary of the invention Citrate and iron transferrin as iron source now in serum-free medium It has been found that the salt can be replaced by non-protein citrate.

従って、本発明は可溶性鉄塩およびアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属シトレートの鉄キレートを含んでなる培地添加剤に関する。血清を存しない培地に対する鉄キレートは従来、例えば鉄−ＥＤＴＡ／クエン酸キレートおよびオーリン三カルボン酸を含有する培地添加剤を記載するヨーロッパ特許２７４４４５に提案されている０本発明の鉄キレート添加剤は、次の点でヨーロッパ特許２７４．４４５で提案されたものよりも利点を有している：すなわち本発明の鉄キレート添加剤は、安価な成分から構成され、そして該添加剤は汚染の源となるようなより少ない成分を含有する。Therefore, the present invention provides soluble iron salts and alkali metal or alkaline earth metal salts. The present invention relates to a medium additive comprising an iron chelate. For serum-free medium Traditionally, iron chelates used for this purpose are e.g. Filed in European Patent 274445 describing a media additive containing tricarboxylic acids. The proposed iron chelating additive of the present invention is disclosed in European Patent No. 274. 445: the iron chelates of the present invention Additives are made up of inexpensive ingredients, and they are often used as a source of contamination. Contains fewer ingredients.

別の面において、本発明は哺乳動物細胞の増殖のための培地に関し、該培地は可溶性鉄およびアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属シトレートの鉄キレートを含んでなる。In another aspect, the invention relates to a medium for the growth of mammalian cells, the medium comprising: Iron chelates of soluble iron and alkali metal or alkaline earth metal citrates Contains.

発明の詳細な開示鉄の沈殿並びに培養される細胞に対する鉄の潜在力のある毒性効果を避けるため、シトレートキレータ−は培地に添加する前に平衡を発生させるために鉄塩と混合されるべきである。この平面は、例えば濃厚原液中で、形成され、そしてプロセスは撹伴、オートクレーブ処理等により加速される。鉄添加側の調製において、必要な平衡は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属シトレートが鉄塩に対してモル過剰で存在する場合、特に鉄塩に対するシトレートの割合が１：１超で５０＝１未満である場合、最も好都合に達せられる。Detailed disclosure of the invention To avoid iron precipitation as well as the potential toxic effects of iron on the cells being cultured. , the citrate chelator is mixed with iron salts to generate equilibrium before adding to the medium. should be combined. This plane is formed, for example in a concentrated stock solution, and the Processing is accelerated by stirring, autoclave treatment, etc. In the preparation of the iron addition side , the required equilibrium is that the alkali metal or alkaline earth metal citrate is relative to the iron salt. When present in molar excess, especially when the ratio of citrate to iron salt is more than 1:1, = less than 1, this is most conveniently achieved.

本発明の添加剤中に含まれるための適当な鉄塩は、ＦｅＣ１ｚ、　ＦｅＣＩ＝。Suitable iron salts for inclusion in the additives of the present invention are FeClz, FeCI=.

Ｆｅ５（ＰＯ４）ｚ　、　Ｆｅ（ＮＯ３）ｉおよびＦｅＩｚから成る群から選ばれることができる。本発明の添加剤中に含まれるための適当なアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属シトレートの例は、Ｎａ−シトレート、Ｋ−シトレート又はＭｇ−シトレートである。特に、好ましいＢ様において、添加剤中に含まれる鉄塩はＦｅＣ１，又はＦｅＣ１５であり、そしてシトレートはＮａ−シトレートである。この場合、ＦｅＣＩｚ　／ＦｅＣ１ｚに対するＮａ−シトレートの好ましい割合は、２：１〜５００　：　１である。Selected from the group consisting of Fe5(PO4)z, Fe(NO3)i and FeIz can be Suitable alkali metals may be used for inclusion in the additives of the invention. Examples of alkaline earth metal citrates include Na-citrate, K-citrate or is Mg-citrate. Particularly, in preferable type B, the additive contains The iron salt is FeC1 or FeC15, and the citrate is Na-citrate. It is. In this case, the preference of Na-citrate over FeCIz/FeClz A suitable ratio is 2:1 to 500:1.

添加剤が含まれることが意図されている培地は、好ましくは哺乳動物細胞を増殖するための培地であり、本発明の添加剤は哺乳動物細胞が驚くべきことに利用可能であった安価な鉄起源を構成する。The medium intended to contain additives preferably grows mammalian cells. The additives of the present invention are surprisingly available to mammalian cells. It was an inexpensive source of iron.

従って、培地は例えば低血清培地又は、好ましくは血清を有しないか又は蛍白質を有しない培地であり、この培地において非蛋白質鉄剤を提供することが重要である。従来、真水のシトレートテトラハイメナサーモフィ−Ｔｅｔｒａｈ　ｍｅｎｄ　ｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｌａ）は唯一の鉄源として前キレート化鉄シトレートを利用することができることが記載されているけれども（注、Ｐ、　Ｂ、スーザーヤノセン　アンドＬ、ラスムセン、ハＬ匹虱り旦Ｌ　且ム　１９８２．４５７ −４６０頁；Ｌ、ラスムセン等、丈−並旦一ハ旦工理ム１５５−１５８頁；哺乳動物細胞は又血清を有しない培地中、鉄源としてシトレート／塩化鉄キレートを利用することは示唆されていない。生物学的に言えば、栄養成分の豊富な環境下でかつ相当の浸透圧の下で存在する哺乳動物細胞が栄養荊−プール環境中に生存する特別な原始的真水生物、と同様の方法で栄養剤を同化し得ることは全く驚くべきことである。Thus, the medium may be, for example, a low serum medium or preferably serum-free or fluorescent. It is important to provide a non-protein iron supplement in this medium. be. Conventionally, fresh water citrate tetrahymena thermophyte nd thermohila) uses prechelated iron citrate as the sole iron source. Although it is stated that it is possible to use (Note, P, B, Sousa - Janosen And L, Rasmussen, HaL 1982.457 - p. 460; L. Rasmussen et al.; Animal cells also receive citrate/iron chloride chelate as an iron source in serum-free medium. It is not suggested that it be used. Biologically speaking, in an environment rich in nutrients Mammalian cells exist in a nutrient pool environment that is large and under considerable osmotic pressure. It is quite surprising that special primitive freshwater organisms could assimilate nutrients in a similar way to It is the right thing to do.

本発明を次の実施例によって更に説明するが、いかなる場合も本発明の範囲を制限するものではない。The invention is further illustrated by the following examples, which in no way limit the scope of the invention. It is not limited.

例１．−則ぴＪＬＢ町唯−の鉄ｆｉ　（ＳＦＮＭＴ）としてトランスフェリンを有するＢＨＫ細胞（マシアーク等（１９８０、同表）により記載の如し）に対し血清を有しない普通培地を含むコーテッド　Ｔ−フラスコ中で培養される着生のＢＨＫＥＩＩ胞をトランスフェリン（ＳＦＮＭ−）を欠いているが、Ｎａ　−シトレートおよび塩化鉄のキレート化原液を加えた血清な有しない栄養培地を含有する一連のコーテッドニーフラスコに付随して接種した。実験１〜３は、異なる持続時間を有しそして実験のシトレート濃度はそれぞれ２　ｍＭ、２　ｍＭおよび５１（最終濃度）であった、平行の対象培養株をＳＦＮ肘中で培養した。Example 1. - Noripi JLB Town BHK cells (matrix) have transferrin as the only iron fi(SFNMT). (as described by Siark et al. (1980, same table)) in normal medium without serum. Transplant epiphytic BHKE II cells cultured in coated T-flasks containing soil. Lacks sferrin (SFNM-) but contains Na-citrate and iron chloride Coated series containing nutrient media without serum plus chelated stock solution of It was inoculated in a knee flask. Experiments 1-3 had different durations and Citrate concentrations in the experiment were 2 mM, 2 mM and 51 (final concentration), respectively. A parallel control culture was grown in the SFN elbow.

各細胞培養物を、使用した培地の代わりに同し種類の新しい血清を有しない培地を用い又は同じ種類の新しい血清を有しない培地を有する新しいＴ−フラスコにサブ培養して独立に処理した。実験の終りに、各培地におけるは培加の総数を計算した：＊シトレートおよび塩化鉄はＳＦＮＭＴに添加されながった。Each cell culture was grown in fresh serum-free medium of the same type in place of the medium used. or into a new T-flask with fresh serum-free medium of the same type. Subcultures were processed independently. At the end of the experiment, count the total number of cultures in each medium. Calculated: *Citrate and iron chloride were not added to SFNMT.

例２．ｆｆ２ＩＩＩＭのシトレートおよび１００μＭのＦｅＣｌ５　（最終濃度）をもたらすキレート化シトレート鉄原液を加えたＢＨＫ細胞（例１参照）のためのＳＦＮＭ含有のスピンネルフラスコにＢＨＫ細胞を接種した６ｗｉ胞をコーテッドマイクロキャリアに付着せしめた数時間の後、細胞は拡散し、増殖しそして実験が終了したとき２週間以上本質的に融合性でかつ健全であった。Example 2. ff 2IIIM citrate and 100 μM FeCl5 (final concentration) SFN for BHK cells (see Example 1) with chelated iron citrate stock solution 6wi cells inoculated with BHK cells were placed in a spinnel flask containing M-coated microorganisms. After several hours of attachment to the crocarriers, the cells spread, proliferate, and the experiment is terminated. The patient remained essentially confluent and healthy for more than two weeks when completed.

例３．二赳坦皿唯−の鉄源（ＳＦＮ？ｌＴ）としてトランスフェリンを有するＣＨＯ細胞（バーム等（１９７９，同上）によって記載の如く）に対し血清を有しない普通培地を含有するコーテッドニーフラスコ中で培養した付着ＣＨＯ細胞を、トランスフェリン（ＳＦＮＭ−）を欠いているがＮａ−シトレートと塩化鉄のキレート化原液を加えた血清を有しない普通培地を有する一連のコーテッドニーフラスコ内に随伴して接種した。実験ｌおよび２は異なる接待期間を有しそして実験のシトレートの濃度は２ＩＩＩＭ（最終濃度）であった。平行の対象培養株をＳＦＮＭＴ中で培養した。Example 3. Two-sided plate CHO cells (Barr) with transferrin as the only iron source (SFN?IT) (1979, supra)) using normal medium without serum. Adherent CHO cells cultured in coated knee flasks containing Chelated stock solution of Na-citrate and iron chloride lacking phosphorus (SFNM-) in a series of coated knee flasks with normal medium without serum supplemented with It was also inoculated. Experiments I and 2 had different reception periods and The concentration of the sample was 2IIIM (final concentration). Parallel target cultures in SFNMT It was cultured in

各細胞培養物を、用いた培地の代わりに同じ種類の新しい血清を有しない培地を用い又は同じ種類の新しい血清を有しない培地を有する新しいＴ−フラスコにサブ培養して独立に処理した。Replace each cell culture with fresh serum-free medium of the same type in place of the medium used. or into a new T-flask with fresh serum-free medium of the same type. cultured and treated independently.

実験の終りに、各培地における培加の総数を計算した：＊シトレートおよび塩化鉄はＳＦＮＭＴに添加しなかった。At the end of the experiment, the total number of cultures in each medium was calculated: *Citrate and Chloride No iron was added to the SFNMT.

例４．−ΩＷｌｌ巳ＣＨＯ細胞を、それぞれ２１のシトレートおよび１００および３００μｍの（最終濃度）のＦｅＣｌ２をもたらすキレート化シトレート−塩化鉄原液を加えたＣＨＯ細胞（例３参照）に対しＳＦＮＭ−を含有する２個のスピン皐ルフラスコに接種した。細胞をコーテッドマイクロキャリアに付着せしめた数時間後、細胞は拡散し、増殖しそして実験が終了したとき２週間以上本質的に融合性でかつ健全であった。Example 4. -ΩWll Snake CHO cells were incubated with 21 citrate and 100 and 300 μm (maximum), respectively. C with addition of chelated citrate-iron chloride stock solution resulting in FeCl2 (final concentration) HO cells (see Example 3) in two spinner flasks containing SFNM- Inoculated. Several hours after cells were attached to the coated microcarriers, the cells Spread, proliferate and remain essentially confluent and healthy for more than 2 weeks when the experiment is finished. Met.

例５．を妃Ｉｌ唯一の鉄！　（ＳＦＮＭＴ　）としてトランスフェリンを有するＲＰＭＩへ一スの血清を有しない普通培地（シャクター１９８９．　ＴＩＢＴＥＣＨ，７、２４８−２５３）を含有するＴ−フラスコ中での懸濁培養において培養したＳＰ　２１０骨髄腫細胞を、トランスフェリン（ＳＦＮＭ−１を欠いているがＮａ−シトレートおよび塩化鉄のキレート化原液を加えた血清を有しない普通培地を含有する一連のＴ−フラスコ内に付随して接種した。Example 5. Princess Il The only iron! One step to RPMI with transferrin as (SFNMT) Normal medium without serum (Schacter 1989. TIBTECH, 7, 24 SP2 cultured in suspension culture in T-flasks containing 8-253) 10 Myeloma cells were incubated with transferrin (lacking SFNM-1 but with Na-cytophosphate). containing serum-free normal medium supplemented with a chelating stock solution of iron chloride and iron chloride. The cells were inoculated concomitantly into a series of T-flasks.

各細胞培養物を、用いた培地の代替に関し同し種類の新たな血清を有しない培地を用い、又は同し種類の新たな血清を有しない培地を含有する新しいＴ−フラスコ内にサブ培養することにより独立に処理した。実験の終りに、各培地の培加の総数を計算した。Each cell culture was grown in fresh serum-free medium of the same type for replacement of the medium used. or a new T-flas containing fresh serum-free medium of the same type. The cells were treated independently by sub-cultivation within a co-culture. At the end of the experiment, the culture of each medium The total number was calculated.

ギシトレートおよび塩化鉄はＳＦＭＮＴに加えながった。Gycitrate and iron chloride were not added to the SFMNTs.

例６．ハイプリドーマ唯一の鉄！　（ＳＦＮＭＴ　）としてトランスフェリンを有するハイブリドーマ細胞（シャクター１９８９．　ＴＩＢＴＥＣＨ，７、２４８−２５３）Ｃ対すルＲＰ？ＩＩベースの血清を有しない普通培地を含有するＴ−フラスコ中の懸濁培養中で培養したＳＰ２１０ベースのハイブリドーマ細胞を、トランスフェリン（ＳＦＮＭ−）を欠いているがＮａ−シトレートおよび塩化鉄のキレート化原液を加えた血清を有しない普通培地を含有する一連のＴ−フラスコに付随的に接種した。Example 6. hyperidoma The only iron! Hybridoma with transferrin as (SFNMT) cells (Schacter 1989. TIBTECH, 7, 248-253) RP? Suspension medium in T-flasks containing normal medium without II-based serum SP210-based hybridoma cells cultured in culture were treated with transferrin ( SFNM-) but with a chelated stock solution of Na-citrate and iron chloride. Concomitantly inoculate a series of T-flasks containing normal medium without added serum. Ta.

各細胞培養物を、用いた培地の代替に関し同じ種類の新たな血清を有しない培地を用い、２は同じ種類の新たな血清を有しない培地を含有する新しいＴ−フラスコ内にサブ培養することにより独立に処理した。実験の終りに、各培地の培加の総数を計算した。Each cell culture was grown in fresh serum-free medium of the same type with respect to the replacement of the medium used. 2 is a new T-flas containing fresh serum-free medium of the same type. The cells were treated independently by sub-cultivation within a co-culture. At the end of the experiment, the culture of each medium The total number was calculated.

＊シトレートおよび塩化鉄はＳＦＮ？ＩＴに加えなかった。*Are citrate and iron chloride SFN? I didn't add it to IT.

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成５年１２月ｚｏ日Submission of translation of written amendment (Article 184-8 of the Patent Act) December 1993

Claims

[Claims]

1. Iron salts of soluble iron salts and alkali metal or alkaline earth metal citrates A culture medium additive comprising a rate.

2. Alkali metal or alkaline earth metal citrate in molar excess relative to iron salt An additive according to claim 1, wherein the additive is present in:

3. Iron salt, FeCl2, FeCl3, FeSO4, Fe3(SO4)2, Fe Claim 1 or 2 selected from the group consisting of (NO3)3 and Fel2. Additives listed.

4. Alkali metal or alkaline earth metal citrate is Na-citrate, Claim No. 1 selected from the group consisting of K-citrate and Mg-citrate. The additive according to any one of items 1 to 3.

5. The molar ratio of alkali metal or alkaline earth metal citrate to iron salt is The additive according to any one of claims 1 to 4, which is more than 1:1 and less than 500:1. Additive.

6. Claims 1 to 5, wherein the medium contained is for the growth of mammalian cells. The additive described in any of the above.

7. In a medium containing no serum or no protein. The additive according to any one of claims 1 to 6.

8. iron salt, FeCl2 or FeCl3, and citrate is Na-cytochloride. The additive according to any one of claims 1 to 7, which is a rate.

9. The molar ratio of Na-citrate to FeCl2/FeCl3 is from 2:1 to 9. The additive of claim 8, wherein the ratio is 200:1.

10. A medium for the growth of mammalian cells containing soluble iron salts and alkali metals. or an iron chelate of an alkaline earth metal citrate.

11. The molar excess of alkali metal or alkaline earth metal citrate to iron salt is 11. The medium according to claim 10, wherein the medium is present in excess.

12. Iron salts include FeCl2, FeCl3, FeSO4, Fe3(SO4)2, F Claim 10 selected from the group consisting of e(NO3)3 and Fel2 or The medium according to item 11.

13. Alkali metal or alkaline earth metal citrate is Na-citrate , K-citrate and Mg-citrate. The medium according to any one of items 10 to 12.

14. Molar ratio of alkali metal or alkaline earth metal citrate to iron salt is more than 1:1 and less than 500:1, according to any one of claims 10 to 13. medium.

15. Claim No. 1, which is a serum-free or protein-free medium. The medium according to any one of items 10 to 14.

16. The iron salt is FeCl2 or FeCl3 and the citrate is Na-Si. The culture medium according to any one of claims 10 to 15, which is a tray.

17. The molar ratio of Na-citrate to FeCl2/FeCl3 is not 2:1. 200:1.