JPH06508514A

JPH06508514A - Mouse immunoglobulin heavy chain locus enhancer cross-hybridizes with rat 3'-enhancer elements.

Info

Publication number: JPH06508514A
Application number: JP4510825A
Authority: JP
Inventors: ペテーション，スヴェン
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1991-06-07
Filing date: 1992-06-03
Publication date: 1994-09-29
Also published as: WO1992021762A1; EP0587676A1; SE9101740L; SE9101740D0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】ラットの３°−エンハンサ−要素と交差ハイブリッド形成するマウスの免疫グロブリン重鎮遺伝子座エンハンサ一本発明はリンパ様特異的転写増進特性を有する新規ＤＮＡ配列と新規ＤＮＡ４ｋｂ／Ｘｂａｌ断片に関する。さらに本発明は上記の新規エンハンサ−を含む真核生物免疫グロブリン発現ベクターに関する。[Detailed description of the invention] Mouse immunoglobulins that cross-hybridize with rat 3°-enhancer elements The Brin heavy gene locus enhancer of the present invention has lymphoid-specific transcriptional enhancement properties. Concerning a new DNA sequence and a new DNA 4kb/Xbal fragment. Furthermore, the present invention The present invention relates to a eukaryotic immunoglobulin expression vector containing the novel enhancer described above.

免疫グロブリン遺伝子の発現はリンパ様特異的プロモーターと協奏的に作用するリンパ様特異的エンハンサ−要素によって制御されている。カッパ（χ）遺伝子座の場合、中程度に弱いエンハンサ−がＪ、−Ｃ，イントロン中で最初に同定され［１，２コ、次いで、より強力なエンハンサ−が０１エクソンの３′に発見された［３］。Immunoglobulin gene expression acts in concert with lymphoid-specific promoters Controlled by lymphoid-specific enhancer elements. Kappa (χ) gene In the case of the locus, a moderately weak enhancer was first identified in the J, -C, intron. [1 or 2, then a more powerful enhancer was discovered at 3' of the 01 exon. [3]

再編成されたχ遺伝子の高レベル発現を確かなものにするうえで重要な役割を果たすのは３−エンハンサ−であることが明らかになっている［４．　５］。イントロンエンハンサ−はＶ、−Ｊ、連結の調節に関与しているようである。plays an important role in ensuring high-level expression of the rearranged χ gene. It has been revealed that it is a 3-enhancer [4. 5]. in The tron enhancer appears to be involved in the regulation of V, -J, linkage.

Ｈ鎖遺転子座の場合、ＩｇＨイントロン−エンハンサ−はχイントロンーエンハンサーよりかなり強力だと思われるが、やはりリンパ様特異的イントロン−エンハンサ−とリンパ様特異的Ｖｏ遺伝子プロモーターが存在する。再編成されたマウスのＩｇＨ遺伝子であって、そのＩｇＨイントロン−エンハンサ−が除去されているものは、それでもなお完全な転写活性を保持できることが立証されている［６〜９コ。多くのＩｇＨ転移遺伝子が内因性のＩｇＨ遺伝子と同等に高いレベルで発現されないことも知られている（［１０］とそこに挙げられている文献）。さらにｃ−ｍｙｃがん原遺転子（プロトオンコジーン）は、ＩｇＨ遺伝子座への転位時に、必ずしもＩｇＨイントロ−エンハンサ−に連結した形になることなく、活性化され得る［１１］。Ｉ　ｇＨ３’−エンハンサ−が最初に同定されたのはラットにおいてであった［１２コ。しかしマウスのχ遺伝子座における状況とは異なり、ＩｇＨ遺伝子の転写においてＩｇＨ３’−エンハンサ−が実際に役割を果たすかどうか、あるいはヒトβ−グロビン遺伝子座について記述されているような「位置決定」効果に関与し得るかどうかについてはまだ確かめられていない［２５］。In the case of the heavy chain trochanteric locus, the IgH intron-enhancer is Although it seems to be considerably more powerful than the lymphoid-specific intron-enzyme Hancer and lymphoid-specific Vo gene promoters are present. Reorganized Ma A mouse IgH gene whose IgH intron-enhancer has been removed. It has been demonstrated that those that are present can still retain full transcriptional activity. [6-9 pieces. Many IgH transgenes have levels as high as endogenous IgH genes. It is also known that it is not expressed in the human body ([10] and references cited therein). . Furthermore, the c-myc oncogene (proto-oncogene) is transferred to the IgH locus. When translocated, it does not necessarily become linked to the IgH intro-enhancer. and can be activated [11]. IgH3'-enhancer was first identified was found in rats [12 animals. However, the situation at the mouse χ locus In contrast, the IgH3'-enhancer actually plays a role in IgH gene transcription. whether or not the human β-globin locus has been described. It has not yet been confirmed whether or not it may be involved in such “positioning” effects. No [25].

ここにマウスのＩｇＨ３−エンハンサ−が単離された。このエンハンサ−は反対の配向で２つの種に存在するが、それは配列と体制の両方に関してラットと相同である。さらに我々は、それを含有することが形質細胞腫宿主中に安定にトランスフェクションされた再編成μ遺伝子の発現を刺激することを示す。Here, the mouse IgH3-enhancer was isolated. This enhancer is against present in two species in the orientation of It is. Furthermore, we demonstrated that it is stably translocated into plasmacytoma hosts that contain Figure 3 shows stimulation of expression of the transfected rearranged μ gene.

本発明の一側面によれば、図３に記載の配列の少なくとも一部（単数または複数）を有する上述の新規エンハンサ−を含む組換えＤＮＡ分子が提供される。According to one aspect of the invention, at least some of the arrays shown in FIG. ) A recombinant DNA molecule is provided that includes the novel enhancer described above.

この分子は他の要素をさらに含んでもよく、一般的には、プロモーターと興味あるタンパク質（単数または複数）をコードする遺伝子（単数または複数）をさらに含むであろう。This molecule may further include other elements, typically a promoter and The gene(s) encoding the protein(s) that will be included in

宿主細胞中で、インビボで、インビトロで、とりわけある種のリンパ様細胞系と形質転換動物中で遺伝子の発現を増進させるために、上記の新規エンハンサ−を用いることができる。またモノクローナル抗体の生産にこの新規エンハンサ−を使用することもできる。in host cells, in vivo, in vitro, especially with certain lymphoid cell lines. In order to enhance gene expression in transgenic animals, the novel enhancer described above was used. Can be used. Additionally, this new enhancer can be used to produce monoclonal antibodies. You can also use

この新規エンハンサ−はＢ細胞特異的であるので、遺伝子の組織特異的な発現を目標にするためにこれを使用することができる。この特性は、ある種の治療的応用、タンパク質の生産を目標にするため、並びにハイブリドーマ技術において、上記エンハンサ−が特定の用途を潜在的に保持していることを意味する。This novel enhancer is B-cell specific, allowing tissue-specific expression of the gene. You can use this to target. This property may be useful for certain therapeutic responses. for use in protein production, as well as in hybridoma technology. This means that the enhancer has potential specific uses.

新規エンハンサ−の配列は組換えＤＮＡ技術によって天然に存在する遺伝子系から誘導することができ、また、天然に存在する遺伝子系に関する配列データからポリヌクレオチドを合成する既知の技術を用いて製造されるという意味で、天然に存在する遺伝子系に相当することもできる。このエンハンサ−の機能を変化させないような配列の改変を行ってもよい。New enhancer sequences can be derived from naturally occurring gene systems using recombinant DNA technology. can also be derived from sequence data on naturally occurring gene systems. Natural in the sense that it is produced using known techniques for synthesizing polynucleotides It can also correspond to a gene system present in Change the function of this enhancer The sequence may be modified so that it does not occur.

また本発明は、遺伝子が宿主細胞によって発現され得るように宿主細胞の遺伝物質中に遺伝子を組み込むためのベクターであって、該遺伝子、プロモーターおよび上記の新規エンハンサ−からなるベクターをも提供する。Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス肝ＤＮＡの部分的５ａｕ３ＡＩ消化物をベクターλ２００１中にクローニングすることによってファージライブラリーを作成した。さらなる研究のために、ラットの３−エンハンサ七１２］要素と交差ハイブリッド形成する４ｋｂ／Ｘｂａｌ断片をプラスミドｐｌｃ２０Ｈに挿入した（図４Ａ）。剪断したＢＡＬＢ／ｃマウス肝ＤＮＡをコスミドｐＷＥ１５のＢａｍＨ１部位にクローニングすることによって、コスミドライブラリーのフィルターを作成した。コスミドＣｏ５３７−１−１のＤＮＡはラットのＣ１とラットのＩｇＨ３’エンハンサ−を含む［１３］。シークエナーゼ（ＳｅｑｕｅｎａｓｅＲ：　Ｕ　Ｓ　Ｂ、オハイオ州クリーブランド）を用いる鎖終結法によってＤＮＡの配列決定を行った。The present invention also provides a host cell with a host cell genetic code such that the gene can be expressed by the host cell. A vector for integrating a gene into a protein, which contains the gene, promoter and Also provided are vectors comprising the novel enhancer described above. B A L B / c A partial 5au3AI digest of mouse liver DNA was cloned into vector λ2001. A phage library was created by sequencing. For further research 4 kb that cross-hybridizes with the rat 3-enhancer 712] element. /Xbal fragment was inserted into plasmid plc20H (Fig. 4A). Sheared BA Cloning LB/c mouse liver DNA into the BamH1 site of cosmid pWE15 By doing this, we created a filter for the cosmid library. Cosmid C o537-1-1 DNA contains rat C1 and rat IgH3' enhancer. Including [13]. Sequenase (SequenaseR: USB, Ojai The DNA was sequenced by the chain termination method using the method (Cleveland, Ohio).

細胞系ＭＰＣＩＩ　３Ｕ４（ビー・ワシリク、ＬＧＭＥ、ストラスブルグから入手）、ＮＳＯ［１４］、ＨｅＬａ（我々の研究室のコレクションのなかから得た）、ＨＯＰＣ−１［１５コ、Ａ２０およびＭ１２細胞［１６コを、５０μＭ　２ −ＭＥの入ったＤＭＥＭ／１０％ＦＣ３中で培養した。Cell line MPCII 3U4 (from B Wasilik, LGME, Strasbourg) hand), NSO [14], and HeLa (obtained from our laboratory collection). ), HOPC-1 [15 cells, A20 and M12 cells [16 cells, 50 μM 2 - Cultured in DMEM/10% FC3 containing ME.

２０μｇの試験プラスミドと５μｇの内部参照を用いるリン酸カルシウム同時沈殿［１７］によって、ＭＰＣＩＩ　ＢＵ４形質細胞腫またはＨｅＬａ細胞の一時的トランスフエクションを行った。ＨＯＰＣ−１、Ａ２０およびＭ１２については、過去に記述されているように［１８］、ＤＥＡＥ−デキストランを用いてトランスフェクションを媒介し、次いで１０％ＤＭＳＯによるショックを与えた。Calcium phosphate co-precipitation using 20 μg test plasmid and 5 μg internal reference. [17], the temporary expression of MPCII BU4 plasmacytoma or HeLa cells. A specific transfection was performed. About HOPC-1, A20 and M12 was tested using DEAE-dextran as previously described [18]. Transfection was mediated followed by shock with 10% DMSO.

転写開始の１２８ヌクレオチド上流から、ポリリンカーのＰｓｔ１部位とＸｂａ１部位の間にクローニングされたコード配列の下流にあるＰｓｔＩまでのヒトβ −グロビン遺伝子を含有するｐＵｃ１２誘導体から試験プラスミドを構築した。From 128 nucleotides upstream of the transcription start, the Pst1 site of the polylinker and the Xba human β up to PstI downstream of the coding sequence cloned between 1 sites. - A test plasmid was constructed from a pUc12 derivative containing the globin gene.

該遺伝子の上流にある５ａｃＩ部位とＸｂａＩ部位の間に検定すべきエンハンサ −断片を導入した。ヒトα２−グロビン遺伝子を含有するプラスミドπ５ＶＨＰ α２を内部参照とした［１９］。トランスフェクションの３０〜３６時間後に細胞から全細胞質ＲＮＡを調製し、過去に記述されたりボヌクレアーゼ保護検定法［３］によって検定した。Enhancer to be assayed between the 5acI site and the XbaI site upstream of the gene - Introduced fragments. Plasmid π5VHP containing the human α2-globin gene α2 was used as an internal reference [19]. 30-36 hours after transfection Total cytoplasmic RNA was prepared from the cells using previously described or bonuclease protection assays. Tested according to [3].

ｐＳＶ２ｎｅｏに基づ（ベクター内に長いもしくは短いトランスフェクションされたχ遺伝子を保持しているＮＳＯのトランスフェクシント（ＬχまたはＳｘ：構築物１および４）は既に記述されている［５］。これらの細胞を、再編成されたマウスのμ遺伝子を含有するｐｓｖ２ｇｐｔに基づくプラスミド（ｐＳＶ−Ｖ μｍ：［２０］）または該プラスミドの唯一のＸｈｏ１部位にクローニングされたマウスのＩｇＨ３−エンハンサ−の５ｔｕｌ断片を含むｐＳＶ−Ｖμｍの誘導体で超トランスフエクンヨンした。Based on pSV2neo (long or short transfection Transfectants of NSO carrying the χ gene (Lχ or Sx: Constructs 1 and 4) have been previously described [5]. These cells are reorganized A psv2gpt-based plasmid (pSV-V μm: [20]) or cloned into the unique Xho1 site of the plasmid. Induction of pSV-Vμm containing the 5tul fragment of mouse IgH3-enhancer I felt super transformed in my body.

図１において、（Ａ）は５−反復とラット・エンハンサ−の３−反復の逆との並列を表す。ヌクレオチド位置は図３と同様に番号が付与されており、同一の位置には星印を付して示しである。（Ｂ）はラットＩ　ｇＨ３°−エンハンサ−中の逆反復を表す。少なくとも１２塩基からなる逆開−の配列を線で結んである。エンハンサ−の核は、配列が既に決定されている５ｔｕｌ−ＥｃｏＲＶ断片（線で示している）内に存在する［５コ。（Ｃ）はマウスＩ　ｇＨ３’−エンハンサ− 中の逆反復を示す。In Figure 1, (A) is a comparison of the 5-repeat and the inverse of the 3-repeat of the rat enhancer. Represents a column. Nucleotide positions are numbered as in Figure 3, and the same positions are indicated with an asterisk. (B) in rat IgH3°-enhancer Represents reverse repetition. Reverse sequences consisting of at least 12 bases are connected by lines. workman The core of the enhancer is a 5tul-EcoRV fragment (line) whose sequence has already been determined. (shown) exists within [5. (C) Mouse I gH3'-enhancer Indicates inverted repetition inside.

（Ｄ）はマウスのＩ　ｇＨ３’−エンハンサ−に隣接する反復を含むプローブとハイブリッド形成させたＢａｍＨＩ消化ゲノムマウスＤＮＡのサザンプロットを表す（ＥｃｏＲＩ−ＡｐａＬＩ断片は図４にプローブＡとして記載されている：マウス■ｇＨ３’−エンハンサー配列中のヌクレオチド５５〜７４８）。ＤＮＡはマウス肝またはＭＯＰＣ３１５もしくはＪ５５８Ｌ形賀細胞腫から得た。２ＸＳＳＣＸＳＳＣ中ソ５ルターを洗浄した。(D) Probe containing repeats flanking the mouse IgH3'-enhancer. Southern blot of hybridized BamHI-digested genomic mouse DNA (The EcoRI-ApaLI fragment is designated as probe A in Figure 4: Mouse ■gH3'-nucleotides 55-748 in the enhancer sequence). DNA were obtained from mouse liver or MOPC315 or J558L morphocytoma. 2X The sorter was washed in SSCXSSC.

図２はマウスＩｇＨ遺伝子座の地図とコスミドおよびファージクローン中に存在する領域の地図を表す。Figure 2 shows a map of the mouse IgH locus and its presence in cosmid and phage clones. represents a map of the area.

図３は本発明のマウス（Ａ）とラット（Ｂ）のＩ　ｇＨ３°−エンハンサ−の配列を表す。Figure 3 shows the arrangement of IgH3°-enhancer in mice (A) and rats (B) of the present invention. Represents a column.

図４はマウスとラットのＩ　ｇＨ３’−エンハンサ−が反対の配向にあることを示している。（Ａ）はマウスＣ，／Ｉ　ｇＨ３’−エンハンサ−領域の制限地図であり、ＢＡＬＢ／ｃマウス肝ＤＮＡのＥｃｏＲＩ（Ｒ）消化物をプローブするために用いるプローブの起源を示すために用いられる。プローブＡ、Ｂ、ＣおよびＦはファージλＭ２のＥｃｏＲＩ−ＡｐａＬＩ、５ｔｕｌ−ＸｂａＩ、Ｘｂ、ａｌ−ＰｓｔＩおよびＳａｃ　Ｉ亜断片であるのに対して、プローブＤおよびＥは、マウスとラットのエンハンサ−が高度に相同な領域を覆うラットＩｇＨ３’ −エンハンサ−のＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌｌ（ヌクレオチド５６５〜７４０）およびＡｃｃｌ−ＥｃｏＲＩ（ヌクレオチド４３１−５６５）亜断片として得た。（Ｂ）はラットＣ，／ＩｇＨ３’−エンハンサ−領域の地図である。コスミド３７− １−ｌＤＮＡを様々な制限エンドヌクレアーゼで消化し、表示のごとくハイブリッド形成させた。制限部位を次の通りに略号化する。Ｃ，Ｃ１ａＩ　；Ｎ、Ｎｒｕｌ　；Ｒ，ＥｃｏＲＩ　；Ｓ、５ａｃＩ：Ｘ、Ｘｈｏｌ。Figure 4 shows that mouse and rat IgH3'-enhancers are in opposite orientations. It shows. (A) Restriction map of the mouse C,/I gH3'-enhancer region. and probe the EcoRI(R) digest of BALB/c mouse liver DNA. Used to indicate the origin of the probe used for the purpose. Probes A, B, C and and F are phage λM2 EcoRI-ApaLI, 5tul-XbaI, Xb, al-PstI and SacI subfragments, whereas probes D and E is a rat IgH3' protein that covers a region where the mouse and rat enhancers are highly homologous. -enhancer- EcoRI-Bgll (nucleotides 565-740) and Obtained as an Accl-EcoRI (nucleotides 431-565) subfragment. (B ) is a map of the rat C,/IgH3'-enhancer region. Cosmid 37- 1-l DNA was digested with various restriction endonucleases and hybridized as indicated. was formed. Restriction sites are abbreviated as follows. C, C1aI; N, Nr ul　;R, EcoRI　;S, 5acI:X, Xhol.

図５はマウスＩ　ｇＨ３’−エンハンサ−がリンパ様特異的転写活性を発揮することを明らかにしている。表示の通りにエンハンサ−なしか、もしくはＳＶ４０、ラットＩｇＨ−イントロン、マウスＩｇＨ−イントロン、マウスＩ　ｇＨ３’ −エンハンサ−に連結したヒトβ−グロビン遺伝子を含有する試験プラスミドで、内部参照としてのＣ２−グロビンプラスミドと共に細胞をトランスフェクションした。ｐＢＲ３２２のＨｐａｌＩ消化物をマーカー（Ｍ）とした。Figure 5 shows that the mouse IgH3'-enhancer exerts lymphoid-specific transcriptional activity. It is made clear that. No enhancer or SV40 as shown , rat IgH-intron, mouse IgH-intron, mouse IgH3' A test plasmid containing the human β-globin gene linked to an enhancer. , transfect cells with the C2-globin plasmid as an internal reference. I turned on. A HpalI digest of pBR322 was used as a marker (M).

安定にトランスフェクションされたＩｇＨＳｘ遺伝子現に対する３−エンハンサ −の効果を図６に示す。ｐ　Ｓ　Ｖ−Ｖ、　１　（Ｖ、トＩｌ記ｔル）、ｐ　Ｓ　Ｖ−Ｖ、　１　［３Ｅ］（Ｖ、［３Ｂ］と標記する）またはプラスミドなしく −）で既に類トランスフェクションされている短いχ遺伝子（Ｓ２）か長いχ遺伝子（Ｌ、）のいずれかを保持するＮＳＯトランスフェクタントのプールからＲＮＡを抽出した。次に、このＲＮＡのノーザンプロットをＣ，プローブまたはＶｔ−０ｘ−１プローブのいずれかとハイブリッド形成させた。トランスフェクションされたＳｘ遺伝子とＬ□遺伝子はＶ□−Ｑよ一１可変セグメントを含有する［５］。3-Enhancer for stably transfected IgHSx gene expression - The effect of - is shown in FIG. p S V-V, 1 (V, tl), p S V-V, 1 [3E] (marked as V, [3B]) or without plasmid -) or long χ gene (S2) or long χ gene that has already been transfected R from a pool of NSO transfectants carrying either gene (L,) NA was extracted. Next, perform a Northern blot of this RNA with C, probe or V Hybridized with either t-0x-1 probe. transfection The transformed Sx and L□ genes contain one variable segment from V□-Q. [5].

Ｉ　ｇＨ３’−エンハンサ−には逆反復が隣接している。ラット３−エンハンサ −の５ｔｕｌ−ＥｃｏＲＶ断片の配列は過去に決定されている［１２］。本発明の配列（図３を参照のこと）は隣接する逆反復の存在を実際に確認する（図１）。これらの反復は３５７ｂｐ長にわたって１６個の不一致を示す（〉９５％同一）。The IgH3'-enhancer is flanked by inverted repeats. Rat 3 - Enhancer The sequence of the 5tul-EcoRV fragment of - has been previously determined [12]. present invention sequence (see Figure 3) actually confirms the presence of adjacent inverted repeats (Figure 1) . These repeats exhibit 16 mismatches over a length of 357 bp (>95% identical ).

したがって、ラット３′−エンハンサ−の核（ラット配列中のヌクレオチド４３２〜７４８：図４を参照のこと）に由来するＡｃｃｌ−Ｂｇｌｌ亜断片をプローブとして利用して、バクテリオファージλ中のマウス肝ライブラリーをスクリーニングした。２つの重複するクローン群（７Ｍ２と２Ｍ３）を単離した。７Ｍ２の制限地図を図２に記載する。ファージλＭ３は７Ｍ２の３′に伸長している。Therefore, the nucleus of the rat 3'-enhancer (nucleotide 43 in the rat sequence) 2-748: see Figure 4). used as a library to screen a mouse liver library in bacteriophage λ. I did a ning. Two overlapping clone groups (7M2 and 2M3) were isolated. 7M2 The restriction map is shown in Figure 2. Phage λM3 extends 3' to 7M2.

エンハンサ−相同性を含有する７Ｍ２のＸｂａＩ断片をプラスミドｐｌｃ２ＱＨ中にサブクローニングした。エキソヌクレアーゼＩＩＩを用いて欠失処理群を作成し、Ｍ２Ｓ中にサブクローニングした。マウスＩｇＨ３−エンハンサ−の配列を図３に記載の通りに決定し、ラットの配列と並列させている。ラットの［ＧＴ］７［（ＧまたはＣ）Ａｌｓ］反復はマウスには観測されないが、これら２つの種のエンハンサ−は良好な相同性を示す。さらに、ラットＩ　ｇＨ３°−エンハンサ−に隣接する逆反復が９６％の同一性を示すのに対し、等価なマウス反復の内部の２５０ヌクレオチドは８９％の同一性を示すに過ぎない（図ＩＣ）。８ヌクレオチド要素ＡＴＴＴＧＣＡＴはラットとマウスで保存されている。The XbaI fragment of 7M2 containing enhancer-homology was added to plasmid plc2QH. subcloned into. Create a deletion treatment group using exonuclease III. and subcloned into M2S. Sequence of mouse IgH3-enhancer was determined as described in Figure 3 and aligned with the rat sequence. Rat [GT ]7[(G or C)Als] repeats are not observed in mice, but these two Species enhancers show good homology. Furthermore, rat IgH3°-enha The inverted repeats adjacent to the sensor show 96% identity, whereas the equivalent mouse repeats show 96% identity. The internal 250 nucleotides show only 89% identity (Figure IC). 8 Nu The cleotide element ATTTGCAT is conserved in rat and mouse.

隣接する反復の１つをまたぐ断片を用いて、反復が反復される配列のより大きなファミリーの一部であるかどうかを調べるために、マウスゲノムをプローブした。その結果（図ＩＤ）は、プローブＡが（それが由来するところの）２ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片には強固に、１２ｋｂ断片（これは相同な隣接反復を含む）と４．８ｋｂの第３のバンドにはより弱くハイブリッド形成することを示している。しかしさらなるバンドが存在しないことは、マウス３“−エンハンサ−に隣接する反復が高度に保存された反復のより大きいファミリーの一部分でないことを示唆している。A fragment that spans one of the adjacent repeats is used to construct larger sections of the sequence in which the repeats are repeated. probed the mouse genome to see if it's part of the family . The result (Figure ID) is that probe A is 2 kb E (from which it originates) The coRI fragment has a robust 12 kb fragment (which contains homologous flanking repeats) and 4. A third band of 8 kb shows weaker hybridization. death However, the absence of additional bands indicates that the mouse 3″-adjacent to the enhancer suggesting that the repeat is not part of a larger family of highly conserved repeats are doing.

７Ｍ２と２Ｍ３はいずれも免疫グロブリンα、Ｈ鎖ｃＤＮＡプローブにハイブリッド形成しない。マウスのエンハンサ−ｅａｓがＩｇＨ遺伝子座と実際に連結したかどうかを決定するために、ファージλＭ２とＩｇＨ遺伝子座ＤＮＡの間の重複を確立する必要があった。我々はマウスのコスミド・ライブラリーを、ｃｍ領域を含有するクローンについてスクリーニングした。そのプローブはα膜エクソンのコード領域をまたぐポリメラーゼ連鎖反応によって生成した１１００ｎｔ断片であった。単離したコスミド（ＣｏｓＭｌｏＢ）の制限地図を図２に記載する。Both 7M2 and 2M3 hybridize to immunoglobulin α, H chain cDNA probe. do not form. The mouse enhancer-eas is actually linked to the IgH locus. The overlap between phage λM2 and IgH locus DNA was It was necessary to establish a duplicate. We have developed a mouse cosmid library into the cm domain. Clones containing the region were screened. The probe is an alpha membrane exo A 1100 nt fragment generated by polymerase chain reaction that spans the coding region of It was a piece. The restriction map of the isolated cosmid (CosMloB) is depicted in Figure 2. .

Ｃｏ５Ｍ１０Ｂの亜断片の７Ｍ２の亜断片との交差ハイブリッド形成並びに制限マツピングによって、重複を確立することができた。ファージＣｈ２８．Ｍ、　Ｉ　ａα（［２２］に記述されている）がＣｏ５Ｍ１０ＢとλＭ２ｓの両方と重複することもわかった。制限地図によって、マウスＩ　ｇＨ３’−エンハンサ− がＣα１エクソンの１６ｋｂ下流に位置することが明らかになった。Cross-hybridization of the Co5M10B subfragment with the 7M2 subfragment and restriction. By mapping, we were able to establish overlap. Phage Ch28. M. Iaα (described in [22]) overlaps with both Co5M10B and λM2s. I also found out that it can be duplicated. By restriction map, mouse IgH3'-enhancer was found to be located 16 kb downstream of the Cα1 exon.

ファージλＭ２に対するマウスＩｇＨ３’−エンハンサ−のサブクローンのハイブリッド形成は、マウスとラットの３゛−エンハンサ−がゲノム内でＩｇＨＣ領域に関して反対の配向で存在していたことを示している。これがクローニング人工産物でないことを確認するために、ゲノムマウスＤＮＡのサザンプロット分析を行った。ラットおよびマウス内のエンハンサ−の核領域は保存されたＥｃｏＲ１部位を含有する。ゲノムマウスプロットでは、プローブＦとプローブＣが１２ｋｂＥｃｏＲＩ断片にハイブリッド形成し、他方、プローブＢとプローブＥが２ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片にハイブリッド形成する（図４Ａ）′。これらのプローブはすべてファージλＭ２中の同じサイズの断片を明らかにし、さらにプローブＦはコスミドＭＩＯＢ中のＣ１の直ぐ３°の領域にハイブリッド形成する（記載なし）。したがってプローブＥはマウス３′−エンハンサ−中のＥｃｏＲＩ部位の０１−遠位側を明らかにする。しかしプローブＥはラット３°−エンハンサ−のＡｃｃｌ−ＥｃｏＲＩサブクローンであり、ラット３゛−エンハンサ−内のＥｃｏＲ１部位のＣα−近位側に位置する領域（ヌクレオチド４３２〜５６５）に由来する［１２］。このことは、ラットＣ，コスミド３７−１−１内にプローブＥとラットＩ　ｇＨ３−エンハンサ−のＣ，−遠位側を示す図４Ｂで確認されている。したがってラットとマウスの膜プローブは共通する１９ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を明らかにし、他方、プローブＤは反対の配向にあるエンハンサ−にハイブリッド形成する。Hypothesis of mouse IgH3'-enhancer subclones against phage λM2 Brid formation is caused by the mouse and rat 3'-enhancers forming IgHC regions within the genome. This shows that they existed in opposite orientations with respect to the area. This is the cloning person Southern blot analysis of genomic mouse DNA to confirm that it is not an artifact. I did it. The nuclear region of the enhancer in rats and mice is a conserved EcoR Contains 1 site. In the genome mouse plot, probe F and probe C are 12 kbEcoRI fragment, while probe B and probe E are 2 kb hybridizes to the EcoRI fragment (Fig. 4A)'. these probes all revealed fragments of the same size in phage λM2, and also probe F hybridizes to the immediate 3° region of C1 in cosmid MIOB (not described). death). Therefore, probe E probes the EcoRI site in the mouse 3'-enhancer. 01 - Reveal the distal side. However, probe E is the rat 3°-enhancer. Accl-EcoRI subclone, Ec in rat 3'-enhancer derived from the region (nucleotides 432 to 565) located on the Cα-proximal side of the oR1 site. Coming [12]. This indicates that probe E in rat C, cosmid 37-1-1 and confirmed in Figure 4B showing the C,-distal side of the rat IgH3-enhancer. Ru. Therefore, rat and mouse membrane probes have a common 19kb EcoRI cleavage. probe D hybridizes to the enhancer in the opposite orientation. form a head.

推定上のマウス３°−エンハンサ−が実際にエンハンサ−活性を発揮することを確認するために、エンハンサ−を含まないヒトβ−グロビン遺伝子に４　ｋ　ｂ／Ｘｂａｌ断片を連結し、内部参照としてのα寥−グロビン遺伝子と共にＭＰＣＩＩマウス形質細胞腫細胞中に導入した。図５に示すように、Ｉ　ｇＨ３’−エンハンサーは（ＳＶ４０およびＩｇＨイントロン−エンハンサ−と同様に）トランスフェクションされた骨髄腫細胞におけるβ−グロビンの発現を実際に強化する。さらにＩｇＨイントロン−エンハンサ−と同様に、また、ＳＶ４０エンハンサ−とは対照的に、Ｉ　ｇＨ３’−エンハンサ−はＨｅＬａ細胞中では不活性であった。したがってマウスＩ　ｇＨ３’−エンハンサ−はリンパ様特異的であると思われる。We confirmed that the putative mouse 3°-enhancer actually exerts enhancer activity. To confirm, we added 4k b to the human β-globin gene that does not contain an enhancer. /Xbal fragment and MPC with the α-globin gene as an internal reference. II mouse plasmacytoma cells. As shown in Figure 5, IgH3'-E Enhancers (like SV40 and IgH intron-enhancers) actually enhances β-globin expression in transfected myeloma cells. Ru. Furthermore, similar to the IgH intron-enhancer, also the SV40 enhancer In contrast to the IgH3'-enhancer, the IgH3'-enhancer is inactive in HeLa cells. there were. Therefore, the mouse IgH3'-enhancer is lymphoid-specific. I think that the.

ＩｇＨ３−エンハンサ−を探す理由のひとつは、形質細胞腫またはマウス生殖系中に導入されたＩｇＨ遺伝子が通常はよく発現される一方で、この発現のレベルがしばしば内因性のＩｇＨのレベルには及ばないという事実であった。この不足の原因を、トランスフェクションされた遺伝子に対して３′−エンハンサ−が存在しないということに帰することできるであろうか。これを調べるために、ＩｇＨイントロン−エンハンサ−を含む再編成されたμ遺伝子を含有するプラスミドｐＳＶ−Ｖ、１と、やはり転写単位の下流にクローニングされたＩｇＨ３°−エンハンサ−を含む誘導体ｐＳＶ−Ｖ、１［３°Ｅ］でマウス形質細胞腫細胞をトランスフェクションした。形質細胞腫宿主として、マウスχ鎖をコード化する２つのプラスミドのうちの１つで既にトランスフェクションされているＮＳＯ細胞を用いた。One reason to look for IgH3-enhancers is to find plasmacytoma or mouse germ line While the IgH gene introduced into the cell is usually well expressed, the level of this expression was a fact that often fell short of endogenous IgH levels. This lack The reason for this is the presence of a 3'-enhancer in the transfected gene. Can it be attributed to the fact that it does not exist? To investigate this, Ig Plasmid containing rearranged μ gene with H intron-enhancer pSV-V,1 and IgH3°-E, also cloned downstream of the transcription unit. Mouse plasmacytoma cells were stimulated with the enhancer-containing derivative pSV-V, 1[3°E]. transfected. 2 encoding the mouse χ chain as a plasmacytoma host NSO cells already transfected with one of the two plasmids was used.

ＮＳＯ［Ｓよコ細胞は、χ−イントロンを含むがχ３′−エンハンサーを含まないトランスフェクションされたχ遺伝子を保持し、他方、ＮＳＯ［Ｌｚ］細胞中にトランスフェクションされた遺伝子はχ−イントロンとχ３−エンハンサーの両方を含む［５コ。トランスフェクションされた細胞のプールのノーザンプロット分析（図６）は、プラスミドｐＳＶ−Ｖ、１上にＩ　ｇＨ３−エンハンサ−が含まれているということが、トランスフェクションされた細胞におけるμ遺伝子の発現のレベルに対して約６倍の効果を持つことをらかしている。NSO[S yoko cells contain a χ-intron but no χ3′-enhancer. on the other hand, in NSO[Lz] cells. The transfected gene contains a χ-intron and a χ3-enhancer. Including both [5 pieces. Northern blotting of a pool of transfected cells. Analysis (Fig. 6) shows that the IgH3-enhancer is present on plasmid pSV-V.1. The inclusion of the μ gene in transfected cells It has been revealed that the effect on the expression level of

したがってラットと同様にマウスもまた、ＣＨ領領域下流に位置するリンパ様特異的エンハンサ−を含有している。両種におけるエンハンサ−には逆反復が隣接している。興味深いことに、それらの反復の上流コピーの配列内にあるラットとマウスの間のいくつかの相違が下流コピー内にも認められる。したがってマウス上流反復内のヌクレオチド５７４〜５７８（Ｃ，ＡＴＧＡ）はラットには存在しない。同様に、この配列の逆（ＴＣＡＴＧ）はマウス反復の下流コピー内に保持されているが、それでもなおラットには存在しない。したがって隣接する反復は、上流反復内で起こった変化が下流コピー内にも固定されるように、２つの間の情報伝達と同時に進化してきたものと思われる。Therefore, like rats, mice also have lymphoid features located downstream of the CH region. Contains a heterogeneous enhancer. Enhancers in both species are flanked by inverted repeats. are doing. Interestingly, within the sequences of the upstream copies of those repeats Some differences between mice are also observed in the downstream copies. Therefore the mouse Nucleotides 574-578 (C, ATGA) within the upstream repeat are absent in rat. do not have. Similarly, the reverse of this sequence (TCATG) is retained within the downstream copy of the mouse repeat. However, it still does not exist in rats. Therefore adjacent iterations are , between the two so that changes that occur within the upstream repeat are also fixed within the downstream copy. It seems to have evolved at the same time as information transmission.

本明細書で使用する用語「ベクター」は最も広義には、あるの細胞から他の細胞にＤＮＡを転移させることができるあらゆる組換えＤＮＡ物質を意味する。As used herein, the term "vector" in its broadest sense refers to vectors that transport vectors from one cell to another. means any recombinant DNA material capable of transferring DNA to.

ベクターは直線状の単一のＤＮＡ断片であってもよいし、環状型であってもよく、本発明の基本的な機能的要素に加えて、特定の応用での必要に応じて他の配列を含んでもよい。例えばベクターは、選択可能なマーカー遺伝子（単数または複数）などの追加の特性および／または翻訳やクローン化した産物の生産の他の側面を援助する特性を含有することができる。Vectors may be linear single DNA fragments or circular. , in addition to the basic functional elements of the invention, other arrangements as required for a particular application. May include. For example, the vector may contain selectable marker genes (single or multiple). additional characteristics such as number) and/or other aspects of translation or production of the cloned product. It can contain properties that help the surface.

本明細書で用いられる用語「遺伝子」はＤＮＡ配列、好ましくはポリペプチドをコード化する構造遺伝子を意味する。ポリペプチドは医薬品などの商業的に有用なポリペプチドであり得、また宿生細胞にとって全く異種であうでもよい。あるいは、宿生細胞中で不足、欠失または突然変異しているポリペプチドを遺伝子がコード化してもよい。As used herein, the term "gene" refers to a DNA sequence, preferably a polypeptide. Refers to a structural gene that encodes. Polypeptides are commercially useful as medicines The host cell may be a polypeptide that is completely foreign to the host cell. be Or, if the gene contains a polypeptide that is missing, deleted, or mutated in the host cell, May be coded.

宿主細胞は本発明のベクターを取り込むことができる宿生細胞であればいずれでもよい。ベクターＤＮＡはトランスフェクション、感染、マイクロインジェクション、細胞融合またはプロトプラスト融合によって宿主細胞に移すことができる。The host cell may be any host cell that can take up the vector of the present invention. Good too. Vector DNA can be used for transfection, infection, and microinjection. can be transferred to host cells by cell fusion, cell fusion, or protoplast fusion. .

宿主細胞は生きているヒトまたは動物の細胞であってもよい。具体的には、宿主細胞はマウスなどの形質転換動物の細胞であり得る。宿主細胞が骨髄細胞などのヒトの幹細胞であってもよい。The host cell may be a living human or animal cell. Specifically, the host The cell may be a cell of a transformed animal such as a mouse. host cells such as bone marrow cells It may also be human stem cells.

プロモーターは宿主細胞中で機能することができるプロモーターであればいずれでもよく、例えば哺乳類またはウィルスプロモーターであり得る。The promoter can be any promoter that can function in the host cell. For example, it can be a mammalian or viral promoter.

本発明のベクターによって形質転換された細胞系または形質転換動物などの宿主細胞も本発明の範囲に包含される。A host such as a cell line or transformed animal transformed by the vector of the invention Cells are also within the scope of the invention.

さらに本発明はポリペプチドを生産する方法であって、本発明のベクターで形質転換された宿主細胞を培養することからなる方法をも提供する。Furthermore, the present invention provides a method for producing a polypeptide, the method comprising: transfecting the polypeptide with the vector of the present invention. Also provided is a method comprising culturing the transformed host cell.

所望のポリペプチドを生産するためにインビトロで上記の方法を適用することができる。さらに、その動物にとって治療的価値のないポリペプチドを生産するためにインビボで上記の方法を適用することができる。The above method can be applied in vitro to produce the desired polypeptide. can. In addition, because they produce polypeptides that have no therapeutic value for the animal, The above method can be applied in vivo to

本発明のさらなる側面として、欠陥のある遺伝子を置換または補足することによるヒトまたは動物の身体の治療法として本ベクターを使用することができる。As a further aspect of the invention, by replacing or supplementing the defective gene, This vector can be used as a treatment for the human or animal body.

ヒトまたは動物の身体の多くの疾患はある種の遺伝子産物の不足によってもたらされる。本発明のベクターの特徴は、インビボでの遺伝子療法による欠損症の治療に本発明のベクターを十分に適合させる。Many diseases of the human or animal body are caused by deficiencies of certain gene products. be done. A feature of the vector of the present invention is that it can be used to treat deficiencies by in vivo gene therapy. The vectors of the invention are well suited for medical treatment.

したがって、ヒトまたは動物の身体から幹細胞を採取し、体内に残っている幹細胞を殺傷し、上記ヒトまたは動物の身体中で不足または欠失している遺伝子を含有する本発明のベクターで取り出した幹細胞を形質転換し、形質転換した幹細胞を上記ヒトまたは動物の身体に戻すことからなる遺伝子療法が提供される。ヒトまたは動物中で欠乏している遺伝子を補足または置換するためにこの方法を使用することができる。Therefore, stem cells are harvested from the human or animal body and the remaining stem cells in the body are cells containing genes that are missing or deleted in the human or animal body. The stem cells obtained by transforming the stem cells extracted with the vector of the present invention containing Gene therapy is provided which consists of introducing the above-mentioned human or animal body back into the human or animal body. human or use this method to supplement or replace missing genes in animals can do.

骨髄は幹細胞の好適な供給源であり、それがリンパ球と赤血球系細胞の両方の前駆体を含有するという点で有利である。あるいは身体から他の組織を採取してトランスフェクションするか、さもなくば本発明のベクターを提供し、身体中に移植して戻すこともできよう。Bone marrow is a good source of stem cells, which are precursors to both lymphocytes and erythroid cells. It is advantageous in that it contains precursors. Alternatively, other tissue can be harvested from the body. transfection or otherwise provide a vector of the invention and transfer it into the body. You could probably replant it and bring it back.

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Claims

[Claims]

1. IgH3'-enhancer DNA 4kb/XbaI fragment, B A partial Sau3AI digest of ALB/c mouse liver DNA was placed in vector 22001. and the rat 3'-enhancer Fragments that cross-hybridize with.

2. A DNA fragment that is an IgH3'-enhancer and has the following sequence. [There is an array]

3. A DNA fragment that is an IgH3'-enhancer and has the following sequence. [There is an array]

4. Eukaryotic immunoglobulin expression vector containing an IgH3'-enhancer .