JPH06508510A - Improvements related to organic compounds - Google Patents
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- JPH06508510A JPH06508510A JP4509173A JP50917392A JPH06508510A JP H06508510 A JPH06508510 A JP H06508510A JP 4509173 A JP4509173 A JP 4509173A JP 50917392 A JP50917392 A JP 50917392A JP H06508510 A JPH06508510 A JP H06508510A
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- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
- A01H6/82—Solanaceae, e.g. pepper, tobacco, potato, tomato or eggplant
- A01H6/826—Solanum melongena [eggplant]
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】 有機化合物に関する改良 本発明は、他のナス科植物の特徴を有する二倍体のナス(ソラヌム・メロンギー ナ)および係る植物を産生ずる方法に関するものである。[Detailed description of the invention] Improvements related to organic compounds The present invention is directed to a diploid eggplant (Solanum melongii) that has characteristics of other Solanaceae plants. f) and a method for producing such a plant.
背景 ナスは、成る種の真菌による病気に対して天然の抵抗性を持たない。これらはヴ エルティンリウム凋萎およびフザリウム凋萎のような真菌病に非常にかかり易い 。このような病気に対する天然の抵抗性の供給源は、ヴエルティシリウムおよび フサリウムに対する天然の抵抗性を示すソラヌム・トルヴムのような他のナス科 植物において入手できる。ナスと他のナス科植物との間の種間雌雄交雑は、不稔 性子孫を与える。これはとりわけナスおよびニス・トルジム間の雌雄交雑につい て知られている。そのうえ、このような交雑は、胚培養を使用する場合でさえ効 率が悪く困難である[K、R,マン力モン等、ホルト・サイエンス、18(6) 巻894−895頁(1983)]。さらに、この交雑は、ニス・トルヴムが花 粉供給植物として用いられる場合にの、み実施することができる。background Eggplants have no natural resistance to certain fungal diseases. These are Very susceptible to fungal diseases such as Ertinrium wilt and Fusarium wilt . Sources of natural resistance to such diseases are Vuelticillium and Other Solanaceae such as Solanum torvum that exhibit natural resistance to Fusarium Available in plants. Interspecific dioecious hybrids between eggplants and other Solanaceae plants result in sterility. Give sexual offspring. This applies especially to female-male hybrids between eggplants and Niss tolzim. It is known as Moreover, such crosses are ineffective even when using embryo culture. The rate is poor and difficult [K, R, Manrikimon et al., Holt Science, 18(6) Vol. 894-895 (1983)]. In addition, this cross was produced by Nis torvum. This can only be done when used as a flour-feeding plant.
ナスおよびニス・トルヴムの間のプロトプラスト融合は、様々な理由で所望の結 果をもたらさなかった。このプロトプラスト融合は効率が悪く、得られる抵抗性 植物は常に異数体、即ち二倍体でなく、したがってその子孫は低稔性ないし不稔 性の範囲の稔性を示す。文献に報告されているナスおよびニス・トルヴムプロト ブラストの間の融合[例えばA、カリ等、セオレティカル・アンド・アプライド ・ノエ不テノクス76巻(1988)490−496頁]は、同じ種類の植物材 料(葉肉×葉肉)によって、且つドナーを照射せずに実施された。Protoplast fusion between Solanum and Nis torvum may not be the desired result for various reasons. brought no fruit. This protoplast fusion is inefficient and the resulting resistance Plants are always aneuploid, i.e. not diploid, and their offspring are therefore low or sterile. Shows a range of fertility. Solanum and Nis torvumprot reported in the literature Fusion between blasts [e.g. A, Cali, etc., Theoretical and Applied ・Noe Futenochus Vol. 76 (1988) pp. 490-496] is the same type of plant material. (mesophyll x mesophyll) and without donor irradiation.
詳細な説明 本発明によれば、ナス科の種に天然に見いだされナスにおいては天然に見いださ れない特徴を含む、稔性の二倍体のナスを生産する方法であって、】)ドナープ ロトプラストの染色体の分断をもたらすに充分な照射量で所望の特徴を有するナ ス科植物のプロトプラストドナーを照射し、ii)係る照射されたドナープロト プラストをアクセプターとしての役割を有するナスプロトプラストと融合させ( ここで該ドナープロトプラストおよびアクセプタープロトプラストは、異なった 型の外植体から誘導される)、そして、1ii)得られた融合プロトプラストを 再生して成熟植物とする、ことからなる方法が提供される。detailed description According to the present invention, it is found naturally in species of the Solanaceae family and is naturally found in eggplants. 1. A method for producing fertile diploid eggplant containing characteristics that A sample with the desired characteristics at a dose sufficient to cause fragmentation of rotoplast chromosomes. ii) irradiating a protoplast donor of a plant belonging to the family Succedeaceae; By fusing plasts with eggplant protoplasts, which have the role of acceptors ( wherein the donor protoplast and acceptor protoplast are different 1ii) the resulting fused protoplasts A method is provided comprising: regenerating into a mature plant.
真菌による病気に対して抵抗性を示すナス科植物プロトプラストドナーの染色体 の分断は、自体既知の方法、例えば照射によって達成することができる。この照 射はγ、UVまたはX線を用いて実施できる。照射をX線源によって実施する場 合、一般に20ないし100kradの線量を適用することによって染色体の分 断が得られる。好ましくは致死量を使用し、その場合少なくとも50kradを 適用せねばならない。照射目的のためには、プロトプラストは、簡便にはプロト プラスト洗浄媒質のような適当なプロトプラスト懸濁媒質中の懸濁液とする。Chromosomes from a Solanaceae protoplast donor showing resistance to fungal diseases The cleavage can be achieved in a manner known per se, for example by irradiation. This light The radiation can be carried out using gamma, UV or X-rays. Where irradiation is carried out by an X-ray source chromosomal fractionation, generally by applying a dose of 20 to 100 krad. You can get a clear answer. Preferably a lethal dose is used, in which case at least 50 krad must be applied. For irradiation purposes, protoplasts are conveniently Suspend the protoplasts in a suitable protoplast suspension medium, such as a plast washing medium.
本明細書中出発物質として使用されるドナーおよびアクセプタープロトプラスト は、適当な植物細胞から自体既知の方法で取得することができる。これにより、 ドナーおよびアクセプターのプロトプラストの調製に用いられる植物材料は、異 なった起源または型のものであるということが必須である。Donor and acceptor protoplasts used herein as starting materials can be obtained by methods known per se from suitable plant cells. This results in The plant materials used for the preparation of donor and acceptor protoplasts are It is essential that it be of the origin or type that it became.
プロトプラストの調製のための出発材料としての使用に好適な植物材料の型の例 は、茎材料、茎材料、板材料、子葉等である。好ましくは、アクセプタープロト プラストは子葉から誘導される。ドナープロトプラストは好ましくは茎材料から 誘導される。植物材料は、適当なホルモン不含基本栄養培地、例えば、ンユクロ ースのような炭水化物を添加した、塩類、ビタミン類を含有するホルモン不含ム ラシゲおよびスクーグ(MS)の基本培地中、種子の発芽条件下における滅菌し た種子の発芽によって簡便に得られる。このような条件は自体既知である。発芽 温度は、簡便には228Cないし28℃の範囲である。苗木を正常に発育させる ため、充分な光を供給しなければならず、平均的な夏の日の昼光に相当する光( 約16時間)が適当である。一般に、約9ないし17日の子葉がプロトプラスト 出発材料としての使用に好適である。子葉由来のプロトプラストは、例えば、細 かいさいの目に切った子葉を、ヘミセルラーゼ、セルロースおよび/またはペク チナーゼのような細胞壁を破壊するための適当な酵素を含む酵素溶液により、自 体既知の方法で処理することによって得られる。例えば2ないし5ヶ月齢の植物 材料をカルス誘導培地に入れ、適当な細胞懸濁媒質中で、得られたカルス材料か ら細胞懸濁液を調製することにより、茎、葉または板材料由来の細胞懸濁液が自 体既知の方法で同様に得られる。次いで指数生長相の開始期における細胞懸濁液 を適当な酵素溶液で処理することにより、プロトプラストを得ることができる。Examples of types of plant material suitable for use as starting material for the preparation of protoplasts are stem material, stem material, board material, cotyledon, etc. Preferably, the acceptor proto Plasts are derived from cotyledons. Donor protoplasts are preferably from stem material be guided. The plant material is grown in a suitable hormone-free basic nutrient medium, e.g. Hormone-free milk containing salts and vitamins with added carbohydrates such as Sterilized under seed germination conditions in Lasige and Skoog (MS) basal medium. It can be easily obtained by germinating seeds. Such conditions are known per se. germination The temperature conveniently ranges from 228C to 28C. Allow seedlings to develop properly Therefore, sufficient light must be provided, equivalent to daylight on an average summer day ( Approximately 16 hours) is appropriate. Generally, cotyledons that are about 9 to 17 days old are protoplasts. Suitable for use as starting material. Cotyledon-derived protoplasts are e.g. Diced cotyledons are treated with hemicellulase, cellulose and/or pectin. The enzyme solution containing appropriate enzymes to destroy the cell wall, such as tinase, can be used to obtained by processing the body in a known manner. For example, 2 to 5 month old plants The material is placed in callus induction medium and the resulting callus material is suspended in a suitable cell suspension medium. Cell suspensions derived from stem, leaf or plate materials can be made automatically by preparing cell suspensions from can be similarly obtained by known methods. Then the cell suspension at the beginning of the exponential growth phase Protoplasts can be obtained by treating with an appropriate enzyme solution.
カルス誘導培地、細胞懸濁媒質およびプロトプラスト懸濁液の調製に好適な酵素 溶液は、自体既知である。Enzymes suitable for the preparation of callus induction media, cell suspension media and protoplast suspensions Solutions are known per se.
選択の目的のためには、親プロトプラストは、例えば蛍光染料、例えばフルオレ セインイソチオンアナート(F T TC)フルオレセインジアセタート(FD A)により染色し、または、融合相手の一方のためには葉緑素の自己蛍光を使用 することができる。このような染色は自体既知の方法で実施することができる。For selection purposes, parent protoplasts may be dyed with fluorescent dyes, e.g. Cein isothionate (FTTC) Fluorescein diacetate (FD A) or use chlorophyll autofluorescence for one of the fusion partners can do. Such staining can be carried out by methods known per se.
本発明方法におけるプロトプラスト融合は、自体既知の方法、例えばいわゆる化 学的融合または電気融合によって、当分野において既知の条件下に実施すること ができる。Protoplast fusion in the method of the present invention can be carried out using methods known per se, such as so-called fusion. carried out by chemical fusion or electrofusion under conditions known in the art. Can be done.
異なった起源のプロトプラストを混合し、好ましくは105ないし10’/ml のプロトプラスト最終濃度に濃縮する。融合相手は、好ましくは1.1の比率で 混合する。Mix protoplasts of different origins, preferably 105 to 10'/ml Concentrate to a final concentration of protoplasts. The fusion partners are preferably in a ratio of 1.1 Mix.
化学的プロトプラスト融合は、適当なプロトプラスト凝集溶液中でプロトプラス トを凝集させ、この後高いpHの溶液中で膜融合させることによって簡便に実施 できる。プロトプラスト凝集溶液は、本質的には、凝集を惹起するポリエチレン グリコール(PEG)、オスモティクム、例えば細胞の破裂を回避するためのマ ンニトールまたはグルコースのような炭水化物、ならびにカルシウム塩からなる 。PEGは好ましくは1500ないし6000の分子量を育する。一般に、所望 の凝集は、PEGの最終濃度10ないし16%(重量)を有する溶液において得 られる。こうして得られた凝集プロトプラスト細胞の懸濁液をCaCl2−高p H溶液で徐々に希釈して膜を融合させる。Chemical protoplast fusion involves merging protoplasts in a suitable protoplast aggregation solution. Conveniently carried out by aggregating the membranes and then membrane fusion in a high pH solution. can. The protoplast flocculation solution essentially consists of polyethylene that induces flocculation. glycol (PEG), osmoticum, e.g. consisting of carbohydrates such as nitol or glucose, as well as calcium salts . PEG preferably develops a molecular weight of 1500 to 6000. In general, the desired aggregation was obtained in solutions with a final concentration of PEG of 10 to 16% (by weight). It will be done. The suspension of aggregated protoplast cells thus obtained was mixed with CaCl2-high p Fuse the membrane by gradual dilution with H solution.
電気融合は、オスモティクム、好ましくはマンニトールのような炭水化物、およ びカルシウム塩の存在下で簡便に実施される。pHは好ましくは7.2±0゜1 の範囲である。Electrofusion is carried out with osmoticum, preferably carbohydrates such as mannitol, and It is conveniently carried out in the presence of calcium salts. pH is preferably 7.2±0°1 is within the range of
電気融合の目的のために、プロトプラストの鎖を形成させ、その鎖を直流(DC )にさらす。プロトプラスト鎖の形成は、例えばそのプロトプラストを、IMH z前後の周波数および50ないし150V/am、より好ましくは50ないし1 00V/cmの範囲の電場強度を有する交流(AC)電場にさらすことにより誘 導することができる。係る条件の下で約5ないし8個のプロトプラストを有する プロトプラスト鎖が数分間以内に得られる。このプロトプラスト鎖を、パルスの 持続が例えば10ないし50μsである、例えば04ないし1,7、より好まし くは1.3ないし1.7kV/cmの範囲のDCパルスにさらす。一般に、2な いし6パルスで良好なプロトプラスト融合の頻度がもたらされる。このようにし て融合させたプロトプラストを、電場に若干の時間、例えば工ないし2秒間保持 し、この後電場を止めるとプロトプラストがそのうちにそれらの球形を回復する 。For the purpose of electrofusion, chains of protoplasts are formed and the chains are exposed to direct current (DC ). Formation of protoplast chains can be achieved by, for example, converting the protoplasts into IMH frequency around z and 50 to 150 V/am, more preferably 50 to 1 induced by exposure to an alternating current (AC) electric field with an electric field strength in the range of 00 V/cm. can be guided. have about 5 to 8 protoplasts under such conditions. Protoplast chains are obtained within a few minutes. This protoplast chain is pulsed More preferably, the duration is e.g. 10 to 50 μs, e.g. 04 to 1,7, or to a DC pulse in the range of 1.3 to 1.7 kV/cm. In general, 2 Six pulses result in a good frequency of protoplast fusion. Do it like this The fused protoplasts are held in an electric field for some time, e.g. 1 to 2 seconds. But after this, when the electric field is stopped, the protoplasts eventually regain their spherical shape. .
融合生成物は、非融合親プロトプラストの存在下で、または培養からの目視選択 の後に再生することができる。目視選択は、例えばパトナイク等、プラント・サ イエンス・レターズ24巻(1982)105頁に開示される方法にしたがい、 細胞を顕微操作することによって、または、例えばグリメリウス等、プラント・ サイエンス45巻(1986)133頁に開示される、細胞のソーティングによ る植物プロトプラスト異核接合体の選択および強化のための方法にしたがい、セ ルソーターの使用によって、実施することができる。Fusion products are determined by visual selection in the presence of unfused parental protoplasts or from culture. It can be played after. Visual selection can be done by plant support, e.g. Patnaik. According to the method disclosed in Jens Letters, Vol. 24 (1982), p. 105, By micromanipulating cells or by Based on the cell sorting method disclosed in Science Vol. 45 (1986) p. 133, According to the method for selection and enrichment of plant protoplast heterozygotes, This can be done by using a Rousoter.
融合生成物の成熟植物への再生は、常法によって、例えば以下のように実施する ことができる。Regeneration of the fusion product into a mature plant is carried out by conventional methods, for example as follows. be able to.
融合生成物を、微量(ミクロ)元素および大量(マクロ)元素、ビタミン、アミ ノ酸および炭水化物、例えばグルコースおよびマンニトールを含む糖類を含有す る、プロトプラストの生長のための均衡のとれた栄養を含む適当な培養基中で培 養する。糖類は、炭素供給源およびオスモティクムとしての役割を有する。適当 な培養基は当分野において知られており、例えばB5培地およびKM8p培地で ある。このような培養基は、細胞分裂および苗条の発生を調節することのできる 植物ホルモン類(オーキシンおよびサイトキニン)を含んでいる。好適なオーキ ノン類の例は、ナフチル酢酸(NAA) 、2.4−ジクロロフェノキシ酢酸( 2,4−D)およびインドール酢酸−(IAA)である。好適なサイトキニン類 の例は、ベンジルアミノプリン(BAP)およびゼアチン(Z)を包含する。一 般にNAAおよび2.4−DをBAPと組み合わせて細胞分裂を開始させるため に使用する。この場合、オーキノン/サイトキニンの比率は高い、例えば1より 大きくな(ではならない。The fusion product is combined with trace (micro) and macroscopic (macro) elements, vitamins, and amino acids. containing amino acids and carbohydrates, such as sugars, including glucose and mannitol. culture in a suitable culture medium containing balanced nutrients for protoplast growth. nourish Sugars have a role as a carbon source and osmoticum. suitable Culture media are known in the art, such as B5 medium and KM8p medium. be. Such culture media can regulate cell division and shoot development. Contains plant hormones (auxin and cytokinin). suitable oak Examples of nons include naphthylacetic acid (NAA), 2,4-dichlorophenoxyacetic acid ( 2,4-D) and indoleacetic acid-(IAA). Preferred cytokinins Examples include benzylaminopurine (BAP) and zeatin (Z). one Generally, NAA and 2.4-D are combined with BAP to initiate cell division. used for. In this case, the oquinone/cytokinin ratio is high, e.g. It shouldn't be big.
プロトプラストの培養および再生のためには、新鮮な培養基を規則的に2ないし 4日毎に添加する。For culture and regeneration of protoplasts, add fresh culture medium regularly to Add every 4 days.
最初の細胞分裂が起こったら(即ちこれは一般にプロトプラスト融合の約5ない し10日後に起こる)、カルス形成を誘導するため2.4−Dを含まない、そし てマンニトール濃度の低い(培養基の浸透圧を低下させるため)さらなる培養基 を添加する。このようなカルス誘導培地を規則的に、例えば2ないし4日毎に添 加して、カルスを形成させる。Once the first cell division has occurred (i.e. this is generally about 5 minutes after protoplast fusion) (occurs after 10 days), does not contain 2.4-D to induce callus formation, and Additional culture medium with a lower concentration of mannitol (to reduce the osmolarity of the culture medium) Add. Such callus induction medium is added regularly, for example every 2 to 4 days. In addition, callus is formed.
一般に2ないし4週間後であるが微小カルスが形成されたなら、マンニトール濃 度をさらに低下させる。微小カルスの形成から各々約1ないし2週間後にあたる 、プロトプラスト融合の約4ないし6週間後、この微小カルスをオーキシンを欠 くまたはオーキシンの実質上無い固体培地に移し、カルスを生長させる。オー・ キノンを使用する場合、これは好ましくはNAAである。この培地は好ましくは サイトキニンとしてB A Pを含む。カルス再生培地中に存在するオーキノン /サイトキニンの重量比は、1未満、より好ましくは1:5未満である。カルス は低い光強度、例えば3Wm”の下で生長させるのが好都合である。カルスが所 望の大きさ、約3−5mmに達した時(これは一般にカルス生長培地中で6ない し8週間生長させた後である)、このカルスを苗条誘導培地に移す。カルスが苗 条誘導培地中にある間、光強度を段階的に、例えば2週間毎に約3Wm−”ずつ 最大18Wm−2まで増強させる。カルスは定期的に、例えば2ないし3週間毎 に新鮮な苗条誘導培地に移す。Generally after 2 to 4 weeks, once a minute callus has formed, concentrate the mannitol concentration. further reduce the degree of Approximately 1 to 2 weeks after the formation of micro callus , approximately 4 to 6 weeks after protoplast fusion, this microcallus was cultured in the absence of auxin. The callus is then transferred to a solid medium substantially free of auxin or auxin to grow callus. Oh If a quinone is used, this is preferably NAA. This medium is preferably Contains BAP as a cytokinin. Ouchinone present in callus regeneration medium /cytokinin weight ratio is less than 1, more preferably less than 1:5. callus It is convenient to grow under low light intensity, e.g. 3 Wm. When the desired size is reached, approximately 3-5 mm (this is generally not 6 mm in the callus growth medium) After 8 weeks of growth), the callus is transferred to shoot induction medium. callus is seedling While in the row induction medium, the light intensity may be increased stepwise, e.g. by approximately 3 Wm-" every two weeks. Increase up to 18 Wm-2. Calluses are removed periodically, e.g. every 2 to 3 weeks. Transfer to fresh shoot induction medium.
苗条の発達は、オーキシン:サイトキニンの重量比が1未満、好ましくは1・5 未満であるオーキシンおよびサイトキニンを含む苗条再生培地中で達成させる。Shoot development is achieved when the auxin:cytokinin weight ratio is less than 1, preferably 1.5. This is accomplished in a shoot regeneration medium containing less than 10% auxin and cytokinin.
一般に、苗条の再生のためには、オーキシンIAAをサイトキニンZおよび/ま たはBAPと組み合わせて使用するのが好ましい。Generally, for shoot regeneration, auxin IAA is combined with cytokinin Z and/or or in combination with BAP.
苗条および原始苗条を切り取り、次いで、サイトキニンを欠きオーキシンを欠く または実質上火<MSのような基本発根培地上に根付かせる。Shoots and primordial shoots are excised and then depleted of cytokinin and auxin. or root on a basic rooting medium such as substantially fire<MS.
再生工程の間は、ガラス化を減少させるため、ガラス瓶を使用するのが好ましい 。During the regeneration process, it is preferable to use glass bottles to reduce vitrification. .
本発明方法にしたがって得られた苗木は、自体既知の方法で、それらのゲノム中 に他のナス科植物由来の遺伝子を有する成熟した稔性二倍体のナスに再生するこ とができる。係る成熟植物は、インビトロおよび/または所望の特徴を有するナ スを使用する掛は合わせ技術を含む自体既知の品種改良技術を用いる品種改良計 画に使用することができる。このようにして得られた、ナスには天然に存在しな いが他のナス科植物には天然に存在する特徴、例えば真菌による病気に対する低 罹患性を有するナスは、新規であり、本発明の一部を構成する。Seedlings obtained according to the method of the present invention can be prepared by a method known per se. can be regenerated into mature, fertile diploid eggplants with genes derived from other Solanaceae plants. I can do it. Such mature plants can be grown in vitro and/or with the desired characteristics. Breeding methods using known breeding techniques, including cross-pollinating techniques that use It can be used for drawings. The product obtained in this way does not exist naturally in eggplant. However, other Solanaceae plants have naturally occurring characteristics such as low resistance to fungal diseases. The diseased eggplant is new and forms part of the present invention.
本発明に係る好ましい稔性二倍体ナスは、ヴエルティノリウム凋萎および/また はフザリウム凋萎に対する低罹患性を有する。Preferred fertile diploid eggplants according to the present invention have Vueltinorium wilt and/or has low susceptibility to Fusarium wilt.
以下の実施例は本発明を例示するものである:以下の略語を実施例および表中に 使用する。The following examples illustrate the invention: The following abbreviations are used in the examples and tables: use.
B5 : ○、L、ギャンボーグ、R,A ミラーおよびに、オンマ、エクスペ リメンタル・セル・リサーチ、50巻151−158頁(1968)により開示 される基本培地を意味する。B5: ○, L, Gamborg, R, A Mirror and Ni, Onma, Expedition Disclosed by Remental Cell Research, Vol. 50, pp. 151-158 (1968) refers to the basic medium used in
6−BA : 6−ベンジルアミツブリン。6-BA: 6-benzylamitubulin.
CPW : N、S、 バンクスおよびP、K エバンズ、プラント・サイエン ス・レター、No、70.409−416頁(1976)に開示される基本培地 を意味する。CPW: N.S. Banks and P.K. Evans, Plant Scien. Basal medium disclosed in S. Letter, No. 70, pp. 409-416 (1976). means.
2、 4−D ・ (2,4−ノクロロフエノキシ)酢酸。2, 4-D.(2,4-nochlorophenoxy)acetic acid.
IAA : インドール−3−酢酸。IAA: Indole-3-acetic acid.
KM8p : K、N、カオおよびM、R,ミチャイリュク、ブランク、126 巻105−110頁(1975)に開示される基本培地を意味する。KM8p: K, N, Kao and M, R, Michailuk, blank, 126 vol. 105-110 (1975).
MES : 2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸。MES: 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid.
モーレル 、G、モーレルおよびR,M、ウェットモア、アメリカン・ジャーナ ル・オブ・ボタニー、38巻141−143頁(1951)に開示される基本培 地を意味する。Morel, G. Morel and R.M. Wetmore, American Journala The basic culture disclosed in Book of Botany, Vol. 38, pp. 141-143 (1951). means earth.
MS ・ T、ムラシゲおよびF、スクーグ、フィジオロジア・プランタールム 15巻473−497頁(1962)に開示される基本培地を意味する。MS, T, Murashige and F, Skoog, Physiologia Plantarum. 15, pp. 473-497 (1962).
NAA : 1−ナフタレン酢酸。NAA: 1-naphthaleneacetic acid.
ST : J、E、シェパードおよびR,E、トラテン、プラント・フィジオロ ノー、60巻313−316頁(1977)に開示される基本培地を意味する。ST: J, E, Shepherd and R, E, Traten, Plant Physiolo. No. 60, pp. 313-316 (1977).
W5 ■ 不グルテユー等、プラント・モレキュラー・バイオロジー、No 8 .363−373頁(1987)に開示される基本培地を意味する。W5 ■ Nongluteyou etc., Plant Molecular Biology, No. 8 .. 363-373 (1987).
実施例1 融合親の選択 1.1 アクセプター ソラヌム・メロンギーナのナスから、以下の一般に入手し得る遺伝子型/変種を 使用した ポニカ(スライス・アンド・グルート)およびリーガル(ノースラッ プ・キング)。滅菌した種子を1%シュクロースを加えた固体MS培地[培養基 (17)。第2表を参照されたい]上で、25℃で光強度4Wm−2および光周 期16/8時間で発芽させる。この子葉は、約2週間後に使用できる。Example 1 Selection of fusion parent 1.1 Acceptor The following commonly available genotypes/variants were selected from Solanum melongina eggplant. I used Ponica (Slice and Groot) and Regal (North Slack). King). Sterilized seeds were placed in a solid MS medium (culture medium) containing 1% sucrose. (17). See Table 2] at 25°C with a light intensity of 4 Wm-2 and a photoperiod. Germinate at 16/8 hours. The cotyledons are ready for use after about two weeks.
12 ドナー インビボでヴエルティシリウム・ダーリエおよびフザリウム・オキシスポルムに 対する抵抗性が試験された、所蔵品由来のソラヌム・トルヴムの種子を使用する 。滅菌した種子を、1%シュクロースを添加したMS培地[培養基(17)]上 で発芽させる。3ヶ月齢の植物の茎からカルスを誘導する。この茎を1cmの断 片に切り、培養基(1)[第1表]上装置62ケ月後、2gのカルスを10m1 の培養基(2)[第1表]に使用して細胞懸濁液を誘導する。この細胞懸濁液を 、回転振盪機(100rpm)上28℃の暗所で生長させる。1週間に1回、1 0m1の押し固めた細胞を新たな培地75m1に移す。さらに30m1の新たな 培地を3日後に添加する。プロトプラストの分離のためには4−5日齢の細胞懸 濁液を使用する。12 Donor Vuelticillium dahliae and Fusarium oxysporum in vivo. Use Solanum torvum seeds from our collection that have been tested for resistance to . Sterilized seeds were grown on MS medium [culture medium (17)] supplemented with 1% sucrose. Germinate with. Callus is induced from the stems of 3 month old plants. Cut this stem into 1cm pieces. Cut into pieces and place on culture medium (1) [Table 1] After 62 months on the device, 2g of callus was placed in 10m1 Culture medium (2) [Table 1] is used to induce a cell suspension. This cell suspension , grown in the dark at 28°C on a rotary shaker (100 rpm). Once a week, 1 Transfer 0 ml of compacted cells to 75 ml of fresh medium. Furthermore, a new 30m1 Add medium after 3 days. For isolation of protoplasts, 4-5 day old cell suspensions should be used. Use a suspension.
実施例2 プロトプラストの分離 2.1 アクセプタープロトプラスト 2適齢植物の子葉をプロトプラストの分離に使用する。酵素溶液10m1につき 約1gの子葉を用いる[培養基(3)。第1表。]。この子葉を酵素溶液中、細 かくさいの目に切り、24℃の暗所で16時間インキュベートする。必要ならば 、次いでこの溶液を回転振盪機(30rpm)上で30分間インキュベートす、 る。次にこのプロトプラスト懸濁液を70μmのフィルターで濾過し、酵素溶液 10m1につき5mlを使用する培養基(4)[第3表]で洗浄する。純粋なプ ロトプラストの画分を、600rpmで15分間の遠心後、浮選によって集める ことができる。次いでこの両分をW5培地中で洗浄し、その後プロトプラストの 密度をW5で調節する。Example 2 Isolation of protoplasts 2.1 Acceptor protoplast 2. Cotyledons of appropriate-age plants are used for protoplast isolation. per 10ml of enzyme solution Approximately 1 g of cotyledons are used [culture medium (3). Table 1. ]. The cotyledons were placed in an enzyme solution. Cut into cubes and incubate for 16 hours in the dark at 24°C. If necessary , then incubate this solution for 30 minutes on a rotary shaker (30 rpm), Ru. Next, this protoplast suspension was filtered through a 70 μm filter, and the enzyme solution was Wash with culture medium (4) [Table 3] using 5 ml per 10 ml. pure pu The rotoplast fraction is collected by flotation after centrifugation at 600 rpm for 15 minutes. be able to. Both parts were then washed in W5 medium, and then the protoplasts were Adjust the density with W5.
2.2 ドナープロトプラスト 指数成長相の開始時における細胞懸濁液を使用する。この相は、移動の4−5日 後に出現する。分離のために、酵素溶液10m1につき押し固めた細胞4mlを 使用する[培養基(5)。第1表。]。ゆっくりと振盪(40rpm)Lながら 25℃の暗所で16時間インキュベートした後、プロトプラストを集める。懸濁 液を連続して3回濾過する(200μm、100μm170μm)。プロトプラ スト懸濁液を同容量の洗浄溶液(培養基(6)。第1表。コで洗浄する。次いで ベレットを培養基(7)[第1表コに再墾濁する。純粋なプロトプラストの画分 を、600rpmで15分間遠心した後に浮選によって集めることができる。2.2 Donor protoplast Use cell suspensions at the beginning of the exponential growth phase. This phase lasts 4-5 days of migration. will appear later. For isolation, add 4 ml of compacted cells per 10 ml of enzyme solution. Use [Culture medium (5). Table 1. ]. While shaking slowly (40 rpm) Protoplasts are collected after 16 hours of incubation in the dark at 25°C. suspension The liquid is filtered three times in succession (200 μm, 100 μm, 170 μm). protopra Wash the stock suspension with the same volume of washing solution (culture medium (6), Table 1). Re-suspend the pellet in culture medium (7) [Table 1]. Pure protoplast fraction can be collected by flotation after centrifugation at 600 rpm for 15 minutes.
以下の工程は、アクセプタープロトプラストについて記載された工程と基本的に 同一である。The following process is essentially the same as that described for acceptor protoplasts. are the same.
実施例3 ドナーの融合前処理 蛍光染色 フルオレセインイソチオノアナート(FITC)溶液8μm (5mgFITC /mlアセトン)を、インキュベーション前に10m1の酵素溶液に添加する。Example 3 Donor fusion pretreatment fluorescent staining Fluorescein isothionoanate (FITC) solution 8 μm (5 mg FITC /ml acetone) is added to 10 ml of enzyme solution before incubation.
フルオレセインジアセター) (FDA)1ml (0,5Mマンニトール溶液 5ml中50μmの保存溶液[1mg/mlアセトンコ)を、インキュベーショ ン前に細胞懸濁液10m1に加える。プロトプラスト分離後の染色のため、プロ トプラスト懸濁液2mlにつき13mlのFDA溶液を加え、1時間インキュベ ートする。W5培地による洗浄を行なう。Fluorescein diaceter) (FDA) 1ml (0.5M mannitol solution A stock solution of 50 μm in 5 ml [1 mg/ml acetone] was added to the incubator. Add to 10 ml of cell suspension before incubation. For staining after protoplast isolation, Add 13 ml of FDA solution per 2 ml of toplast suspension and incubate for 1 hour. start. Wash with W5 medium.
実施例4 核の分断 融合に先立ち、ドナー染色体の分断のため、X線照射を使用する。W5培地中の プロトプラスト2ml (1xlO’プロトプラスト/m1)を50ないし10 0kradで照射する。Example 4 Nuclear division Prior to fusion, X-ray radiation is used to disrupt the donor chromosomes. in W5 medium 2ml of protoplasts (1xlO' protoplasts/ml) 50 to 10 Irradiate at 0 krad.
実施例5 プロトプラスト融合 51 化学的融合 二つの融合相手のプロトプラストを7xlO5プロトプラスト/mlの密度てW 5培地に懸濁し、同容量を混合する。このプロトプラスト懸濁液を4x150μ l/ペトリ皿の小滴として分配し、5分間放置して落ち着かせる。各小滴に、P EGの最終濃度が10ないし16%となるように50−100μmのPEG溶液 培地(8)〔第3表コを加えるっ5−10分間のインキュベーションの後、PE G溶液を20分間の間にゆっくりと3−4m1のCaC]□−高pH溶液培地最 後に2mlの培養基(11)[第2表コを加えて1.5xlO5プロトプラスト /mlの最終濃度とする。Example 5 Protoplast fusion 51 Chemical fusion The protoplasts of the two fusion partners were brought to a density of 7xlO5 protoplasts/ml. 5 medium and mix the same volume. Add this protoplast suspension to 4x150μ Dispense as a droplet in a Petri dish and leave for 5 minutes to settle. In each droplet, P 50-100 μm PEG solution such that the final concentration of EG is 10-16%. Add medium (8) [Table 3] After incubation for 5-10 minutes, PE G solution was slowly added to 3-4 ml of CaC]□-high pH solution medium for 20 minutes. After that, add 2 ml of culture medium (11) [Table 2] and add 1.5xlO5 protoplasts. /ml final concentration.
5.2 電気融合 矩形波パルス発生機(コンブテックス(商標))をステンレススチール製融合室 と共に使用する。融合の前にプロトプラストを、マンニトールおよびカルシウム を含有する洗浄溶液[培養基(10)。第3表。]で3回洗浄する。最後にプロ トプラストをこの培地で5xlO5プロトプラスト/mlの濃度に希釈する。5.2 Electric fusion Stainless steel fusion chamber with square wave pulse generator (Combutex(TM)) Use with. Protoplasts were treated with mannitol and calcium before fusion. A washing solution containing [culture medium (10)]. Table 3. ] Wash 3 times. Finally a pro Toplasts are diluted with this medium to a concentration of 5xlO5 protoplasts/ml.
二つの融合相手のプロトプラストを1:1に混合し、氷上に保持する。各々の融 合について0.8mlのプロトプラストを使用する。プロトプラストの誘電泳動 または鎖形成を達成するために、IMHz、8O−130V/cm AC電場を 適用し、融合のために4−6パルス(10−50μsec x 1. 3−1. 7kV/cm)を使用する。融合後、1.6mlの培養基(11)[第2表] を融合したプロトプラストに加え、1.6x105プロトプラスト/mlの最終 濃度を得る。The two fusion partner protoplasts are mixed 1:1 and kept on ice. each melt Use 0.8 ml of protoplasts per batch. Dielectrophoresis of protoplasts or IMHz, 8O-130V/cm AC electric field to achieve chain formation. Apply 4-6 pulses (10-50 μsec x 1.3-1. 7kV/cm). After fusion, 1.6 ml of culture medium (11) [Table 2] was added to the fused protoplasts for a final concentration of 1.6 x 105 protoplasts/ml. Get the concentration.
実施例6 プロトプラスト培養および再生5cmのTC−ペトリ皿中で1.5x lO5プロトプラスト/ml培養基(11)[第2表コのプロトプラストを培養 する。3日後に新しい培地1mlを加える。さらに6日後、各培養を2枚の皿に 分け、培養基(11)1mlで希釈する。Example 6 Protoplast culture and regeneration 1.5x in 5 cm TC-Petri dishes 105 protoplasts/ml culture medium (11) [Culture the protoplasts in Table 2 do. Add 1 ml of fresh medium after 3 days. After another 6 days, divide each culture into two dishes. Separate and dilute with 1 ml of culture medium (11).
今後、低濃度のマンニトールを含み2.4−Dを含まない培養基(12)1ml を、生長に応じて1週間に2回またはこれより低頻度で添加する。プロトプラス トは、必要ならば新たな皿に分配する。3遇間後に微小カルスが観察できる。こ の時点において、マンニトール濃度を培養基(13)の添加によりさらに低下さ せる。さらに1週間後、幾らかの液体培養基と共に微小カルスを固体培養基(1 4)に移し、低光強度(3Wm−りの下で生長させる。6週間後にカルスは3− 5mmとなるであろう。次にこれらを苗条誘導培養基(15)に移す。ここで光 強度を、3Wm−2で2週間、9Wm−2で2週間、そして最後に18Wm”、 というふうに段階的に増強する。2ないし3週間毎にカルスを新しい培地に移す 。苗条および原始苗条を切り取って苗条発育培養基(16)上に置き、続いてホ ルモン類を欠(培養基(17)上に置いて根の形成を誘導する。ガラス化を減少 させるため、再生工種の間はガラス瓶を使用する。From now on, 1 ml of culture medium (12) containing low concentration of mannitol and not containing 2.4-D Add twice a week or less frequently depending on growth. protoplus Divide the ingredients into new plates if necessary. Minute callus can be observed after 3 minutes. child At the time point, the mannitol concentration was further reduced by the addition of culture medium (13). let After another week, micro calli were grown in solid culture medium (1 4) and grow under low light intensity (3Wm). After 6 weeks, the callus will grow at 3Wm. It will be 5mm. These are then transferred to the shoot induction culture medium (15). light here The intensity was increased to 3 Wm-2 for 2 weeks, 9 Wm-2 for 2 weeks, and finally 18 Wm''. In this way, it will be strengthened in stages. Transfer callus to new medium every 2 to 3 weeks . Shoots and primordial shoots are cut out and placed on a shoot growth medium (16), followed by hoisting. Induce root formation by placing on culture medium (17) lacking rumons. Reduce vitrification. To prevent this, glass bottles are used during the recycling process.
病原体を接種することにより、再生された植物の抵抗性を試験する。この試験は 、植物を土壌に移してから約2週間後に実施する。真菌ヴヱルティシリウム・ダ ーリエおよびフザリウム・オキシスポルムによる病気に対するこの二倍体のナス の罹患性の低下が観察される。この植物は稔性であり且つ二倍体である。Test the regenerated plants for resistance by inoculating them with the pathogen. This test , about two weeks after transferring the plants to soil. Fungus Vulticillium da This diploid eggplant against diseases caused by Fusarium oxysporum and Fusarium oxysporum A decrease in susceptibility is observed. This plant is fertile and diploid.
第1表 一マクロ MS MS Its CPW CPf CPW−ミクロ MS MS 115M5 CPW CPW CPWN^^ (mg/l) 1.0 − ■^^ (mg/1) 6−BA(mg/l) 0.1 0.1 0.2 −寒天メルク 0.8% − 7セロ号゛イム(R100ノス′力) −〇 8% −セルリノ゛ン(hルビオ ケム) −〇 1% −マセラーセ゛(カルビオケム) −0,025%pH5 ,75,75,55,55,85,8第2表 一マクa KM8p KM8p KM8p 85 B5 113 MSマンニト ール(g/l) 70 60 10 36.4 − −ンユクロース(g/l) 10 10 10 5 20 10 10容量オスモル濃度 550 450 200 500 15ONAA(mg/l) LO1,01,00,05−− IAA (II1g/l) −0,20,1−6−BA(a+g/l) 0.5 0.5 0.5 0.5 − −ZEA (mg/l) −2,01,0−ア ガロース −−0,7% −− ンーブラーク 第3表 PEG1500 40% グリノン 5QmM − グルコース 0.3M O,21M −CaC1□(mM) 15 50 50 1pH5,810,5− 第4表 基本培地・ 塩(mg/ml) !IIs B5 K1118pCPW W5KNO3190 0,02500,01900,0101,0NH4NO* 1650.0 Kl12P0. 170.0 170.0 27.2CaC122Hzo 44 0.0 150.0 600.0 1480.0 18.300Mg5047H 20370,0250,0300,0246,(] −KCI 300.0 3 70.0 NaH2PO42H20150,0 (NH4)2SO4134,0 NaC19,000,0 ミクロ CoC1□6B20 0.025 0.025CUSO45[1200,025 0,0250,025−1(、Bo、 6.2 3.0 KI O,830,750,16− MnS0.4H2022,310,O Na2MoOJ(200,250,25246,0ZnSO47H208,62 ,0 FeS(L7H2027,827,8 Na2EDTA 37.3 37.3 グルコース 9000 p8 5.8 第5表 基本培地: 有機物添加 MS ST KM8p モーレルアスコルビン酸 20 ビオチン 001 力ゼイン加水分解物 1000.0 250.0コリンct 1,0 クエン酸 40.0 ココナツ水 ml/1 20.0 ノステイン 0.2 d−へントテン酸カルシウム 10 1.0葉酸 0.5 0.4 フマル酸 40.0 グリノン 2.0 2.0 イノシトール 100.00 100.0 100゜0 100.OL−グルタ ミン 5・6 リンゴ酸 40.0 ピルビン酸Na 20.0 ニコチンアミド 5.0 5.0 1.0 1.Op−アミノ安息香酸 0.0 2 塩酸ピリドキノン 5.0 0.5 1.0 1.0リボ7うと7 0.2 塩酸チアミン 1.0 0.5 1.0 1.0ビタミン812 0.02 セロビオース 250.0 フルクトース 250.0 マノノース 2500 ラムノース 2500 リボース 2500 1ルピトール キノロース −2500 1−−N、 PCT/εP 92ノ01035フロントページの続き (51) Int、 C1,5識別記号庁内mT1番号//Cl2N 5/14 (72)発明者 ヤールースーネソン、カーリン・インゲイエルド スウェーデン、ニス−2225フルント、ユーリヴエーゲン22番 ITable 1 1 Macro MS MS Its CPW CPf CPW-Micro MS MS 115M5 CPW CPW CPWN^^ (mg/l) 1.0 - ■^^ (mg/1) 6-BA (mg/l) 0.1 0.1 0.2 - Agar Merck 0.8% - 7 Cero No. Im (R100 Nos' Power) -〇 8% -Cerulino (H Rubio Chem) -〇1% -Macerase (Calbiochem) -0,025% pH5 , 75, 75, 55, 55, 85, 8 Table 2 One Maca KM8p KM8p KM8p 85 B5 113 MS Manito (g/l) 70 60 10 36.4 - -Nucrose (g/l) 10 10 10 5 20 10 10 Osmolarity 550 450 200 500 15ONAA (mg/l) LO1,01,00,05-- IAA (II1g/l) -0,20,1-6-BA (a+g/l) 0.5 0.5 0.5 0.5 - -ZEA (mg/l) -2,01,0-a Gallose --0.7% -- nubrak Table 3 PEG1500 40% Grinone 5QmM - Glucose 0.3M O, 21M -CaC1□ (mM) 15 50 50 1pH5,810,5- Table 4 Basic medium・ Salt (mg/ml)! IIs B5 K1118pCPW W5KNO3190 0,02500,01900,0101,0NH4NO*1650.0 Kl12P0. 170.0 170.0 27.2CaC122Hzo 44 0.0 150.0 600.0 1480.0 18.300Mg5047H 20370,0250,0300,0246,(]-KCI 300.0 3 70.0 NaH2PO42H20150,0 (NH4)2SO4134,0 NaC19,000,0 micro CoC1□6B20 0.025 0.025 CUSO45 [1200,025 0,0250,025-1(,Bo, 6.2 3.0 KI O,830,750,16- MnS0.4H2022,310,O Na2MoOJ(200,250,25246,0ZnSO47H208,62 ,0 FeS (L7H2027,827,8 Na2EDTA 37.3 37.3 Glucose 9000 p8 5.8 Table 5 Basic medium: Organic matter addition MS ST KM8p Morel ascorbic acid 20 Biotin 001 Zein hydrolyzate 1000.0 250.0 Choline ct 1,0 Citric acid 40.0 Coconut water ml/1 20.0 Nostain 0.2 Calcium d-hentothenate 10 1.0 Folic acid 0.5 0.4 Fumaric acid 40.0 Grinnon 2.0 2.0 Inositol 100.00 100.0 100°0 100. OL-Gluta Min 5/6 Malic acid 40.0 Sodium pyruvate 20.0 Nicotinamide 5.0 5.0 1.0 1. Op-aminobenzoic acid 0.0 2 Pyridoquinone hydrochloride 5.0 0.5 1.0 1.0 Ribo 7 Uto 7 0.2 Thiamine hydrochloride 1.0 0.5 1.0 1.0 Vitamin 812 0.02 Cellobiose 250.0 Fructose 250.0 Manonose 2500 Ramnose 2500 Ribose 2500 1 lupitor Quinolose -2500 1--N, PCT/εP 92no01035 Front page continuation (51) Int, C1,5 identification code Office mT1 number //Cl2N 5/14 (72) Inventor: Jarrus Souneson, Karlin Ingeierd Sweden, Nis-2225 Furund, Jurivwegen 22 I
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