JPH06508429A - Calcium analysis method - Google Patents

Calcium analysis method

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JPH06508429A
JPH06508429A JP4504195A JP50419592A JPH06508429A JP H06508429 A JPH06508429 A JP H06508429A JP 4504195 A JP4504195 A JP 4504195A JP 50419592 A JP50419592 A JP 50419592A JP H06508429 A JPH06508429 A JP H06508429A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 カルシウム分析法 本発明は、カルシウムの分析方法に関し、特に、体液、例えば、漿液中の遊離の カルシウム濃度を決定する方法に関する。[Detailed description of the invention] Calcium analysis method The present invention relates to a method for analyzing calcium, and in particular to a method for analyzing free calcium in body fluids, such as serum. METHODS FOR DETERMINING CALCIUM CONCENTRATION.

カルシウムは、多くの体機能に必須の元素である。遊離のカルシウムレベルは、 人体中のカルシウムの生理活性を表し、例えば、漿液中の遊離のカルシウム濃度 が正常なレベルの５０％以下に低下した場合、心臓の活性が非常に損なわれる。Calcium is an essential element for many body functions. Free calcium levels are It represents the physiological activity of calcium in the human body, for example, the concentration of free calcium in serum. If the amount decreases to less than 50% of normal levels, cardiac activity is severely impaired.

遊離のカルシウム濃度の決定は、多くの重症状態、例えば、心臓切開手術および 肝臓移植、新生児低カルシウム症、上皮小体亢進症およびセブシス、腎臓、心臓 または肺疾患に付随する病気において重要である。Determination of free calcium concentration is important in many serious conditions, e.g. open heart surgery and liver transplantation, neonatal hypocalcemia, hyperparathyroidism and sepsis, kidney, heart or is important in diseases associated with lung disease.

しかし、遊離のカルシウムの決定は、困難であることが証明され、実験的に要求 されている。今日まで、カルシウムの測定は、ポテンショメトリおよび分光学的 方法により行われている。ポテンショメトリ法は、特に開発されたカルシウム感 応性膜電極を使用する。このような方法は、Ｂｕｃｋｅｌｅｙ　ｅｔ　ａｌによ り、Ａｎｎ　Ｃ１１ｎ。However, determination of free calcium has proven difficult and experimentally demanding. has been done. To date, calcium measurements have been performed using potentiometric and spectroscopic methods. method. Potentiometric method is specially developed for calcium sensing using reactive membrane electrodes. Such a method is described by Buckeley et al. Ann C11n.

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１９８８．２５．４４７−４６５に総説が記載され、他方、 最近開発されたカルシウムイオン感応性液体膜ミクロ電極は、Ｆｅ１ｌｅにより 、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　１９８９．９１゜１２３９−１２４２に記載 されている。膜電極は、傷つきやすく、容易に破損する。さらに、カルシウム決 定のポテンショメトリ法は、例えば、ＥＰ−Ａ−１５３７８３に開示されている ように、カルシウム濃度の増大につれて、ロガリズム応答（ｌｏｇａｒｉｔｈＩ Ｉｌｉｃ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を与える。これとは別に、例えば、キレート化剤 としてカルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）を用いる遊離のカルシウムを測定する蛍光 法および生物発光法が提案されている（Ａｎａｌｙｓｔ、　Ｆｅｂ、　１９８８ ．１１３．２５１−２５３；　Ａｎａｌｙｔｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ 、　２０９D１ ９８８、３０３−３０８）。あるいは、Ｃｏｂｂｏｌｄ　ｅｔ　ａＬ、　Ｂｉｏ ｃｈｅｎ＋　Ｊ、　１９ｇ７．２４８．３１３−３２８に記載されているように 、蛍光キレート化剤および米蛋白質（ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）を用いる方法 も記載されている。このような方法は、行うのが難しく、比較的大きく、かつ、 複雑な装置の使用が必要である。A review is published in Biochem, 1988.25.447-465, and on the other hand, A recently developed calcium ion-sensitive liquid membrane microelectrode was developed by Fe1le. , Plant Physiol, 1989.91° 1239-1242 has been done. Membrane electrodes are fragile and easily damaged. In addition, calcium Certain potentiometry methods are disclosed, for example, in EP-A-153783. As calcium concentration increases, the logarithmic response (logarith I Ilic response). Apart from this, e.g. chelating agents Fluorescence to measure free calcium using calcein as and bioluminescence methods have been proposed (Analyst, Feb, 1988 ．． 113.251-253; Analytica Chimica Acta , 209D1 988, 303-308). Or Cobbold et aL, Bio As described in chen+J, 19g7.248.313-328 , method using fluorescent chelating agent and photoprotein is also listed. Such methods are difficult to perform, relatively large, and Requires the use of complex equipment.

最小限の装置で、過剰の予備精製処理に試料を付すことなく臨床試料を用いて、 迅速に行うことのできる遊離カルシウムの新しい分析法が必要とされていること は明白である。using clinical samples with minimal equipment and without subjecting the samples to excessive pre-purification treatments. There is a need for a new method for the rapid analysis of free calcium. is obvious.

本発明に従えば、ｑｕｉｎ　２およびその誘導体から選択されるカルシウムキレ ート剤を包含する電極の存在において、試料に電位差を印加し、電流を測定する ことにより、存在するカルシウムの量を決定することを含むカルシウム含量につ いて試料を分析する方法が提供される。According to the present invention, calcium killer selected from quin 2 and derivatives thereof In the presence of an electrode containing a coating agent, a potential difference is applied to the sample and the current is measured. Calcium content, including determining the amount of calcium present by A method for analyzing a sample is provided.

カルシウムキレート剤ｑｕｉｎ　２は、従来、遊離のカルシウムの蛍光測定にお いて使用されてきた。前述したＣｏｂｂｏｌｄ　ｅｔ　ａｌ、の文献参照。ｑｕ ｉｎ　２およびその他の蛍光キレート化剤（ｆｕｒａ−２および１ｎｄｏ−１） についての分光学的データは、本発明におけるように、ボルタメトリンク（ｖｏ ｌｔａｍｍｅｔｒｉｃ）な方法におけるｑｕｉｎ　２の使用を全（示唆していな い。さらに、驚くべきことに、キン２およびその誘導体は、本発明に従い使用す ることができるものの、ｆｕｒａ−２および１ｎｄｏ−１のようなその他の蛍光 キレート化剤については確かではないことが判明した。Calcium chelating agent quin 2 has conventionally been used for fluorescence measurement of free calcium. It has been used for many years. See the above-mentioned article by Cobbold et al. qu in2 and other fluorescent chelators (fura-2 and 1ndo-1) The spectroscopic data for the voltammetric link (vo The use of quin2 in a tammetric manner is completely stomach. Moreover, surprisingly, Kin 2 and its derivatives can be used according to the invention. Although other fluorophores such as fura-2 and 1ndo-1 can It turned out to be uncertain about chelating agents.

ｑｕｉｎ２は、次式： ［式中、ＲおよびＲｏは、メチルである。コで表されるテトラアニオンを有する キレート剤である。本発明において使用されるその誘導体としては、式中、Ｒお よび／またはＲｏがメチル以外のもの、例えば、エチル、プロピルもしくはｉ− プロピルであり、その他の置換基がベンゼン環上および／またはキノリン環上に 存在する化合物が挙げられる。quin2 is the following formula: [In the formula, R and Ro are methyl. It has a tetraanion represented by It is a chelating agent. The derivatives thereof used in the present invention include R and and/or Ro is other than methyl, such as ethyl, propyl or i- propyl with other substituents on the benzene ring and/or on the quinoline ring Compounds that exist are mentioned.

本発明は、所定の電位で特性電流を生じ、その電流が、カルシウムイオンの存在 により増大、あるいは、低下し、存在するカルシウムの量に定量的に関連づけら れるカルシウムキレート剤の酸化を含む電気化学反応の発生によるものである。The present invention generates a characteristic current at a predetermined potential, and the current is caused by the presence of calcium ions. It increases or decreases depending on the amount of calcium present and is not quantitatively related to the amount of calcium present. This is due to the occurrence of an electrochemical reaction involving the oxidation of the calcium chelating agent.

したがって、特定の試料を用いて観測される電流をカルシウムの既知量を含む標 準試料について観測される電流と比較することにより、特定の試料中に存在する カルシウムの量を決定することが可能である。Therefore, the current observed using a particular sample can be compared to a standard containing a known amount of calcium. present in a particular sample by comparing it with the current observed for a quasi-sample. It is possible to determine the amount of calcium.

分析用の実際のｐＨは重要でないが、本分析法は、それが実施される生理学的ｐ Ｈで特有な値を有する。さらに、本分析法は、分光学を基礎とした測定を歪める 血液成分の除去を必要とすることなく、血液全体、プラズマ、漿液を用いて行う こともできる。Although the actual pH for the analysis is not critical, the present analytical method is compatible with the physiological pH at which it is performed. H has a unique value. Furthermore, this analytical method distorts spectroscopy-based measurements. Performed using whole blood, plasma, and serum without requiring removal of blood components You can also do that.

キレート剤を包含する電極は、作業電極である。この電極は、好ましくは、グラ ファイトとキレート剤とを含むカーボンペースト電極である。グラファイト対キ レート剤の量比は、変化させることができるが、２：１〜１０：１の範囲が適当 であり、４：１〜６：１の範囲が好ましい。The electrode containing the chelating agent is the working electrode. This electrode is preferably a graphite This is a carbon paste electrode containing a phytophyte and a chelating agent. Graphite vs Ki The ratio of the rate agent can be changed, but a range of 2:1 to 10:1 is suitable. and the range of 4:1 to 6:1 is preferable.

このような電極を用いると、−２００〜＋６００ｍＶの範囲の直流電流環状ボル タモダラム（ｖｏｌｔａｍｍｏｇｒａＩｌｌ）と走査速度１０　ｒｎＶ／ｓｅｃ が、＋５ＱｍＶで酸化ピークを与え、　６５ｍＶで還元ピークを与えることが判 明した。＋５０１１１ｖのピークは、カルシウムの分析に特に好適であり、その 電圧で、試料中に存在するその他の血液成分による妨害がなく、酸素還元に付さ れるような物質、例えば、アスコルビン酸、グルタチオン、または尿酸もない。With such an electrode, a direct current annular voltage in the range -200 to +600 mV can be applied. Tamodarum (voltammograIll) and scanning speed 10 rnV/sec It can be seen that it gives an oxidation peak at +5QmV and a reduction peak at 65mV. I made it clear. The +50111v peak is particularly suitable for calcium analysis; voltage, allowing oxygen reduction to occur without interference from other blood components present in the sample. There are also no substances such as ascorbic acid, glutathione, or uric acid.

さらに、カルシウムの濃度の増大で得られる応答は、直線的であり、カルシウム 感応性電極ポテンショメトリで得られるロガリズム応答と比較して長所を有する 。Furthermore, the response obtained with increasing concentrations of calcium is linear, with calcium has advantages compared to the logarithmic response obtained with sensitive electrode potentiometry .

本分析法は、１または２のコンパートメントガラス電気化学セル中、例えば、図 １に示した２つのコンパートメントセル中で行うことができる。図１のセルは、 約１ｍｌの作業体積を有し、銅線３に取り付けられた作業電極２としてｑｕｉｎ 　２を包含する径４ｍｍのカーボンペースト状のディスクと、白金線５に取り付 けられたカランター電極としての１ＣＩ１１２の白金ガーゼ電極４とを有する単 純なコンパートメント１を有する。このコンパートメントは、ガス抜き用の導入 口６を具備する。The analytical method is performed in a one or two compartment glass electrochemical cell, e.g. It can be carried out in a two compartment cell as shown in 1. The cell in Figure 1 is quin as a working electrode 2 having a working volume of about 1 ml and attached to a copper wire 3 A carbon paste disk with a diameter of 4 mm that includes 2 and attached to the platinum wire 5. A cell with a platinum gauze electrode 4 of 1CI112 as a pierced calantar electrode. It has a pure compartment 1. This compartment is an introduction for degassing A mouth 6 is provided.

セルの参照コンパートメント７は、ラジオメータに４０１飽和カロメル参照電極 （ＳＣＥ）　８を有し、この参照コンパートメントは、ルギンキャピラリー（Ｌ ｕｇｇｉｎ　ｃａｐｉｌｌｉａｒｙ）　９を介して、作業コンパートメントに接 続されている。しかし、電極は、ディスク形態が好ましいものの、環状断面を有 したり、種々の物理的形状に形成することができ、また、好ましくは、１つ以上 の電流を導電するための手段に取り付けるのがよい。電極および前記手段は、好 ましくは、例えば、プラスチック材料等の材料のストリップである支持体に取り 付けるのがよい。Reference compartment 7 of the cell has a 401 saturated calomel reference electrode on the radiometer. (SCE) 8, and this reference compartment has a Luggin capillary (L uggin capillary) 9 to the work compartment. It is continued. However, the electrodes have an annular cross section, although a disk form is preferred. or formed into various physical shapes, and preferably one or more It is preferable to attach it to a means for conducting a current of . The electrode and said means are preferably Preferably, it is mounted on a support that is, for example, a strip of material, such as a plastic material. It is good to attach it.

カルシウム決定のために使用される回路は、好ましくは、第１の作業電極と第２ のカウンター電極とを含む。電位は、作業電極と参照電極との間に印加される。The circuit used for calcium determination preferably includes a first working electrode and a second working electrode. and a counter electrode. A potential is applied between the working electrode and the reference electrode.

電流は、レコーダに接続されているカウンター電極により取り出される。参照電 極は、好ましくは、標準カロメル参照電極であり、さらに好ましくは、Ａｇ／Ａ ｇＣ１電極である。所望とあれば、カウンター電極と参照電極とを組み合わせる ことも可能である。電流記録手段は、検量し、試料中のカルシウム濃度を直接読 み取ることができるという長所を有する。Current is extracted by a counter electrode connected to the recorder. reference voltage The poles are preferably standard calomel reference electrodes, more preferably Ag/A gC1 electrode. Combine counter and reference electrodes if desired It is also possible. The current recording means can be calibrated and directly read the calcium concentration in the sample. It has the advantage of being easy to understand.

本発明の分析処理操作は、好ましくは、電位印加手段、電流記録手段、前述した とおりのカルシウムキレート剤を包含する作業電極、参照電極およびカウンター 電極を含むキットを用いて、適用される。前記電流記録手段は、好ましくは、検 量し、試料中のカルシウム濃度を直接読み取るのがよい。キットの好ましい一つ の形態は、電位印加手段、電流記録手段、参照電極およびカウンター電極を含み 、これらの構成成分は、例えば、ディスク形態のカーボンペースト作業電極に接 続するのに適合していて、被検試料中に浸漬したり、試料をディスクの表面に滴 下することができる。１度決定を行ったら、使用したカーボンペースト電極は捨 て、さらなる決定を行うためには、新しいものを取り付ける。キットの構成成分 は、好ましくは、作業電極と接続するためのレンービング手段を有する容器内に 入れられる。The analysis processing operation of the present invention preferably includes a potential applying means, a current recording means, the above-mentioned Working electrodes, reference electrodes and counters containing calcium chelators as follows: It is applied using a kit containing electrodes. The current recording means preferably It is best to directly read the calcium concentration in the sample. One of the preferred kits The form includes a potential applying means, a current recording means, a reference electrode and a counter electrode. , these components are connected to a carbon paste working electrode in the form of a disc, for example. It is suitable for immersion into the specimen under test or by dropping the specimen onto the surface of the disc. can be lowered. Once the decision has been made, the used carbon paste electrode can be discarded. and install a new one to make further decisions. Kit components is preferably in a container with relieving means for connection with the working electrode. Can be put in.

前述したように、本発明は、広範な種々の起源を有する試料中のカルシウムの分 析に適用することができる。しかし、前述したように、カルシウムレベルの変化 は、病気の状態を示し、したがって、本発明の分析方法は、人体から得られるか 、あるいは、ある程度処理した後、その体液の試料に適用することを通して診断 のコンテキストに使用することができる。As previously mentioned, the present invention provides a method for determining the fraction of calcium in samples having a wide variety of origins. It can be applied to analysis. However, as mentioned above, changes in calcium levels is indicative of a disease state and, therefore, the analysis method of the present invention , or through application to a sample of that body fluid after some degree of processing. can be used in the context of

診断を行うためには、体液試料中に存在することを決定されるカルシウムの量を 正常な患者からの同様な試料中に存在するカルシウムの量と比較することが必要 であることは理解されるであろう。このような値は、文献を参考にするか、ある いは、このような正常な試料について実施される測定により決定される。カルシ ウム分析に通常使用される体液は、血液であり、通常、プラズマの形態で、また は、特に、漿液の形態で使用される。例えば、漿液については、カルシウムの正 常な濃度は、４．６〜５　、　２　ｍｅｑ、　／ｌｉｔ（ｍＭ）の範囲であり、 この範囲以下の濃度は、欠乏を示唆する。To make a diagnosis, the amount of calcium determined to be present in a body fluid sample is It is necessary to compare the amount of calcium present in similar samples from normal patients. It will be understood that Such values can be found by referring to the literature or by or determined by measurements performed on such normal samples. Karushi The body fluid commonly used for plasma analysis is blood, usually in the form of plasma and is used in particular in the form of a serum. For example, for serum, calcium Typical concentrations range from 4.6 to 5.2 meq/lit (mM); Concentrations below this range indicate deficiency.

本方法によって決定された体液試料中のカルシウムの値を正常な患者の同様な体 液中のカルシウムの理論値と一度比較し、偏位を検量すると、その結果は、病気 の状態を示唆することができ、この病気の状態は治療することができる。Calcium values in body fluid samples determined by this method can be compared to similar body fluid samples in normal patients. Once compared with the theoretical value of calcium in the fluid and calibrated for deviation, the result is The condition can be suggested and this disease condition can be treated.

実施例に基づき、以下、本発明をさらに詳細に説明する。The present invention will be explained in more detail below based on Examples.

実施例 図１に示し上述した２つのコンパートメントセルに一般に構造的に類似した１つ のコンパートメントガラス電気化学セルを用いて、環状ポルタモグラムを得た。Example One generally structurally similar to the two compartment cells shown in Figure 1 and described above. Annular portamograms were obtained using a compartment glass electrochemical cell.

このガラスセルは、作業体積１０ｍ１を有した。径６ＩＩｌａｌの改良カーボン ペースト電極を作業電極として用い、白金ガーゼカウンター電極に接続した。参 照電極は、飽和カロメル電極であった。改良カーボンペースト電極は、グラファ イト粉末をｑｕｉｎ　２と混合することにより調製し、スラリーは、エタノール 中で調製した。グラファイト、キレート化剤の３つの異なる比について試験した 。すなわち、２゜１、５：１および　１０：１について試験した。エタノールは 蒸発させ、鉱油数滴を乾燥したペースト上に穏やかに添加した。This glass cell had a working volume of 10 ml. Improved carbon with diameter 6IIlal A paste electrode was used as a working electrode and connected to a platinum gauze counter electrode. three The reference electrode was a saturated calomel electrode. Improved carbon paste electrodes The slurry was prepared by mixing the powder with quin 2, and the slurry was mixed with ethanol. Prepared inside. Three different ratios of graphite to chelating agent were tested. . That is, 2°1, 5:1 and 10:1 were tested. Ethanol is Evaporate and add a few drops of mineral oil gently onto the dry paste.

浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 手続補正書（方式） １、事件の表示 ＰＣＴ／ＧＢ９２１０Ｑ２７９ 甲成４年特許願第５０４１９５号 ２、発明の名称 カルシウム分析法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所 名　称　ブリティッシュ・テクノロジー・クループ・リミテッド４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号国際調査報告　ρＣＴ／ＧＢ　９ ２１００２７９Ｉ□　１１＋　ＰＣＴ／ＧＢ　９２１００２７９Engraving (no changes to the content) Engraving (no changes to the content) Procedural amendment (formality) 1.Display of the incident PCT/GB9210Q279 Kosei 4th year patent application No. 504195 2. Name of the invention Calcium analysis method 3. Person who makes corrections Relationship to the incident: Patent applicant address Name: British Technology Group Limited 4, Agent Address: 2-2-1 Otemachi, Chiyoda-ku, Tokyo International Investigation Report ρCT/GB 9 2100279I□ 11+ PCT/GB 92100279

Claims (9)

【特許請求の範囲】[Claims] １．Ｑｕｉｎ２およびその誘導体から選択されるカルシウムキレート剤を包含す る電極の存在中、試料に電位差を印加し、電流を測定することにより、存在する カルシウムの量を決定することを含むカルシウム含量について試料を分析する方 法。1. Calcium chelators selected from Quin2 and derivatives thereof. By applying a potential difference to the sample and measuring the current while the electrode is present, Anyone who analyzes samples for calcium content, including determining the amount of calcium Law. ２．前記電極が、グラファイトとキレート剤とを含むカーボンペースト電極であ る請求項１に記載の方法。2. The electrode is a carbon paste electrode containing graphite and a chelating agent. 2. The method according to claim 1. ３．グラファイト対キレート剤の比が、重量で、２：１〜１０：１の範囲である 請求項２に記載の方法。3. The graphite to chelating agent ratio ranges from 2:1 to 10:1 by weight. The method according to claim 2. ４．グラファイト対キレート剤の比が、４：１〜６：１の範囲である請求項３に 記載の方法。4. Claim 3, wherein the graphite to chelating agent ratio ranges from 4:1 to 6:1. Method described. ５．試料が体液試料である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。5. 5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the sample is a body fluid sample. ６．カルシウム含量について試料を分析する際に作業電極として使用するのに適 当な電極であって、グラファイトと、ｑｕｉｎ２およびその誘導体から選択され るキレート剤とを含むカーボンペースト電極である電極。6. Suitable for use as a working electrode when analyzing samples for calcium content. a suitable electrode selected from graphite, quin2 and its derivatives; An electrode that is a carbon paste electrode containing a chelating agent. ７．グラファイト対キレート剤の比が、４：１〜６：１の範囲である請求項６に 記載の電極。7. Claim 6, wherein the graphite to chelating agent ratio ranges from 4:1 to 6:1. Electrode as described. ８．前記作業電極が、ディスクの形態であり、これを試料に浸漬したり、あるい は、これに試料を滴下する請求項６または７に記載の電極。8. The working electrode is in the form of a disk, which is immersed in the sample or 8. The electrode according to claim 6, wherein a sample is dropped onto the electrode. ９．電位印加手段、電流記録手段、請求項６，７または７に記載の作業電極、参 照電極およびカウンター電極を含むカルシウムについて試料を分析する際に使用 するのに好適なキット。9. A potential applying means, a current recording means, a working electrode according to claim 6, 7 or 7, Used when analyzing samples for calcium, including reference and counter electrodes A suitable kit for
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