JPH06505719A - 環状ケタール誘導体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 環状ケタール誘導体 本発明は、低コレステロール性、低脂肪血症性ｉよび／または抗真菌性活性を有 する新規な化合物、それらの製造法、それらを含む医薬組成物、およびそれらの 医療における使用、詳細にはアテローム性動脈硬化症およびこれに関連する循環 器系疾患の治療および／または予防に関する。本発明はまた、低コレステロール 性、低脂肪血症性および／または抗真菌性作用を有する化合物の製造における中 間体として有用な新規な化合物にも関する。

血中コレステロールおよび血中脂質の濃度が高いことは、脈管壁疾患の発病に関 係した症状である。従って、効果的に血漿コレステロール濃度を低下させる方法 に関心が高まっている。コレステロール濃度は、例え（ｆステロールの食餌によ る摂取を低下させたり、その代謝および消失を高めたり、またはその生合成の率 を低下させることにより、低下することができる。生理学的なコレステロール濃 度を低下させる最も有効な方法として（よ、コレステロール合成はフィード／く ・ツク制御が為され、コレステロール濃度の低下が生合成の増加により補償され る様になっているので、−要因としてのコレステロール生合成の阻害を含むこと が考えられる。

コレステロールの生合成における１つの律速段階には３−ヒドロキシ−３−メチ ルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭ　Ｇ　Ｃｏ　Ａ　）からのメバロン酸形成があり、 ＨＭＧ　ＣｏＡレダクターゼ阻害物質のメビン酸族を用い、高コレステロール血 症の治療に臨床的成功を収めてきた。しかしながら、メバロン酸は、動物での補 酵素Ｑ、ヘムＡおよびドリコールなどを含む全てのイソプレニル誘導体に共通の 前駆体である。

専ら、ステロールを生じる最初の生合成段階、つまり２種類のファルネシルビロ リン酸塩を縮合してスクアレンを生成する段階は、第二の調節しつる部位である 。ファルネシルピロホスフェートからのスクアレンの合成には分離可能な中間体 であるプレスクアレンピロホスフェートが関与し、全合成順序は、膜結合酵素で あるスクアレンシンターゼ（ファルネシルジホスフエートニファルネシルジホス フェートファルネシルトランスフェラーゼ、ＥＣ２，５，１，２１）のにより触 媒される。それ故、この酵素スクアレンシンターゼを阻害する作用を有する薬剤 は、コレステロール生成を調節する有力な薬剤である。ステロイド以外の経路は ほとんど影響されないことから、このような薬剤の使用が望まれる。

エルゴステロールという真菌細胞膜の主要なステロール成分の生合成は、哺乳類 におけるコレステロールの生合成に類似しており、酵素スクアレンシンターゼに よって媒介される。それ故、真菌細胞の酵素スクアレンシンターゼを阻害する薬 剤は、真菌に対する化学療法のための有力な薬剤である。

我々は今般、酵素スクアレンシンターゼの阻害剤として作用する新規な化合物群 および／または酵素スクアレンシンターゼの阻害物として作用する化合物の製造 のための中間体を見出だした。

従って、本発明の第一の態様では、下記の一般式（１）で表される化合物および その塩が提供される。

Ｒ１は水素原子またはアセチル基を表し、Ｒ−１Ｒ３およびＲ４は各々独立に水 素原子またはメチル基を表し、 ｎは１から３までの整数であり、 存在するフッ素原子は、分子の残りの部分に対してベンゼン環のオルト、メタ、 またはバラ位に結合することができる。） 式（１）の化合物において、Ｒ、ＲおよびＲ４が水素原子であるかまたは生理学 的に許容可能なカチオンであるものが、一般的に好ましい。

本発明の化合物の特定の群は、Ｒ１がアセチル基であす、Ｒ％ＲおよびＲが各々 水素原子であり、ｎが１である、式（１）の化合物およびその塩である。

式（１）の特に好ましい化合物は下記の通りである＝［ＩＳ−［１α（４Ｒ″″ ５Ｓ）、３α、４β、５α。

６α（２Ｅ、４Ｒ，６Ｒ）、７β１１１−［４−アセトキシ−６−（４−フルオ ロフェニル）−５−メチル−３−メチレンヘキシル］−４，６，７−）ジヒドロ キシ−２，８−ジオキサビシクロ［３，２，１１オクタン−３，４，５−トリカ ルボン酸、６−　（４，６−シメチルー２−オクテノエート）、 ［ＩＳ−［１α（４Ｒ＊５Ｓ”）、３ａ、４１３，５ａ。

６α（２Ｅ、４Ｒ，６Ｒ）、７β］］１−［４−アセトキシ−６−（３−フルオ ロフェニル）−５−メチル−３−メチレンヘキシル］　−４，６，７−ドリヒド ロキシー２．８−ジオキサビシクロ［３，２，１］オクタン−３，４，５−）リ カルボン酸、６−　（４，６−シメチルー２−オクテノエート）、 Ｉｓ　−［１α　（４Ｒ５Ｓ　）、３ａ、４β、５ａ、６α（２Ｅ、４Ｒ，６Ｒ ）、７β］１１−［４−アセトキシ−６−（２−フルオロフェニル）−５−メチ ル−３−メチレンヘキシル］−４．６．７−ドリヒドロキシー２，８−ジオキサ ビシクロ［３，２，１〕オクタン−３，４，５−トリカルボン酸、６−　（４， ６−ジメチルおよびそれらの塩。

本発明の化合物は、無機および有機の塩基と塩を形成することができる。生理学 的に許容可能な塩には、無機塩基の塩、例えばアルカリ金属塩（例えば、三ナト リウム、ニカリウムおよび三カリウム塩などのナトリウムおよびカリウム塩）、 アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩）、アンモニウム塩（例えば、ジア ンモニウム塩）およびアミノ酸塩（例えば、トリーＬ−リジン塩などのリジンお よびアルギニン塩）が挙げられる。好適な有機塩基の塩は、アミン塩、例えばト リアルキルアミン（例えば、トリエチルアミン）、ジアルキルアミン（例えば、 ジシクロヘキシルアミン）、所望により置換されたベンジルアミン（例えば、ｐ −ブロモベンジルアミン）およびトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン塩が 挙げられる。

本発明の化合物は、酵素スクアレンシンターゼおよびコレステロール生合成を阻 害するので、医療上、特に動物（特にヒト）の血漿コレステロール濃度を低下さ せることが有益な様々な症状において有用であることが分がっている。そのよう な症状の例としては、高コレステロール血症および高リポタンパク血症に関連し た疾患、特にアテローム性動脈硬化症および循環器系疾患（心虚血性疾患、大脳 虚血性疾患および末梢動脈疾患等）が挙げられる。

スクアレンシンターゼを阻害する本発明の化合物は、ヒトなどの動物において真 菌感染症の治療に用いることもできる。例えば、それらはＣａｎｄｉｄａ　（例 えばＣａｎｄ　１ｄａａｌｂ１ｃａｎｓ、　Ｃａｎｄｌｄａ　ｇｌａｂｒａｔａ 、　Ｃａｎｄｌｄａ　ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｌｓおよびＣａｎｄｉｄａ　ｐｓｅ ｕｄｏｔｒｏｐ）　、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆ’ｏｒｍａｎｓ。

Ａｓｐｅｒｇｌ　ｌ　ｌｕｓ種（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｌａｖｕ ｓおよびＡｓｐｅｒｇ目１ｕｓ　ｒｕｓｉｇａｔｕｓ）、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄ ｅｓ　（例えば、Ｃｏｃｃｌｄｉｏｉｄｅｓ　ｌｅｍｌｔｉｓ）　、Ｐａｒａｃ ｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ　（例えば、Ｐａｒａｃｏｃｅｌｄｉｏｉｄｅｓ　ｂｒ ａｓｆｌｆｅｎｓｌｓ）、　Ｈｌｓｔｏｐｌａｓａａ　（例えば、Ｈｌｓｔｏｐ ｌａｓｍａ　ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）または旧ａｓｔｏｍｙｃｅｓ　（例えば、 Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ　ｄｅｒｎ＋ａｔｉｔｌｄｉｓ）などによってか引き起 こされる全身性感染症の治療に用いることができる。

それらはまた、０痒菌属、小胞子菌類または表皮菌属（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｐ ｈｙｔｏｎ　ｍｅｎｔｏｇｒａｐｈｙｔｅｓ、　Ｍｌｃｒｏｓｐｏｒｕｇｃａｎ ｔｓまたはＥｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ　ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ）の種によって 引き起こされる局所感染症の治療に用いることもできる。

これらは、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｌｓ　ｇｌａｂｒａｔａおよびｐｉｔｙｒｏｓｐｏ ｒｕ＊ｏｖａｌｅによって引き起こされる真菌症の治療に用いることもできる。

本発明の化合物の抗真菌活性についてのイン・ビトロでの評価は、最小発育阻止 濃度（ＭＩＣ）と言う、特定の微生物が成長できない培地における試験化合物の 濃度を測定することにより行うことができる。

抗真菌療法におけるこれらの可能性を考慮すると、スクアレンシンターゼを阻害 する本発明の化合物は、ヒトおよび動物における様々な真菌感染症の治療に推奨 できる。そのような感染には真菌性感染症、例えばカンジダ症および慢性粘膜カ ンシタ症（例えば、鵞口癒および腟カンジダ症）および菌の引き起こす皮膚感染 症、皮膚および粘膜皮膚のカンジダ症、自粛および輪廚感染などの真菌性疾患、 足白癖、爪周囲炎、でん風、紅色陰１、間擦疹、真菌おしめ皮疹、カンジダ外陰 炎、カンジダ亀頭炎および外耳炎などが挙げられる。それらはまた、全身性およ び局部的な真菌感染症を防ぐ予防薬として用いることもできる。予防薬としての 使用は、例えば、免疫不全患者の感染防止における、選択的な消化管の除染によ る養生法の一つとして適当な場合がある。抗生物質治療を行っている間の真菌の 過成長防止についても、いくつかの疾患症候群または医原性の症状において所望 される場合がある。

本発明の化合物がは乳動物および真菌の酵素スクアレンシンターゼを阻害する能 力は、イン・ビトロで［２−１４Ｃ］フアルネシルピロホスフエートを基質とし て、Ｓ、＾、　Ｂｆｌｌｅｒ　ら、Ｊ、　Ｍｅｄｉｃｌｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ　３１（１０）。

１８６９−１８７１　（１９８８）に報告したのと同じ分析条件下で明らかにす ることができ、［１４Ｃ］スクアレンを薄層クロマトグラフィプレート上で未反 応基質から分離して、液体シンチレーションカウント法によって測定するのであ る。本発明の化合物がコレステロール生合成を阻害する能力は、Ｙ、　Ｔｓｕｊ ｌｔａら、Ｂｌｏｃｈｅｍ、　Ｂｌｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　８７７゜５０− ８０　（１９８Ｂ）に記載し、改質して高性能液体クロマトグラフィ　（ｈ、ｐ 、１．ｃ、）によるコレステロールの測定を含めたのと同様の方法を用い、雄の ウィスター系ラットの肝臓切片における［１４Ｃ］−アセテートからの阻害を測 定することによって明らかにすることができる。

治療に用いる場合、スクアレンシンターゼを阻害する本発明の化合物は未加工の 化合物として投与することができるが医薬組成物として活性成分を含むことが好 ましい。従って、本発明ではさらに、本発明の化合物を１種類以上のその薬学上 許容可能な担体および所望により他の治療および／または予防成分と共に含んで 成る医薬組成物を提供する。この（１種類以上の）担体は、この配合物の他の成 分と混和性であり、その賦形剤に有害でないという意味で「許容可能」でなけれ ばならない。

本発明の組成物には、特に経口、口腔、非経口、移植、直腸、局部、目、または 泌尿生殖器用に配合した形態、または吸入若しくは吹送による投与に適した形態 の組成物が挙げられる。

経口投与用の錠剤およびカプセルは、結合剤、例えばシロップ、アラビアゴム、 ゼラチン、ソルビトール、トラガカントゴム、澱粉の粘質物またはポリビニルピ ロリドンなど；充填剤、例えば乳糖、ショ糖、微品質セルロース、とうもろこし 澱粉、リン酸カルシウムまたはソルビトール、潤滑剤、例えばステアリン酸マグ ネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコールまたはシリカ、崩壊 剤、例えばジャガイモ澱粉またはナトリウム澱粉グリコレート、または湿潤剤、 ラウリル硫酸ナトリウムのような通常の賦形剤を含むことができる。この錠剤は 、当該技術分野で周知の方法によりコーティングすることができる。経口用の液 体製剤は、例えば水性または油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップまた はエリキシルの形態をとることができ、または使用前に水または他の好適なビヒ クルで構成するような乾燥生成物として提供することもできる。このような液体 製剤は、沈澱防止剤、例えばソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコ ース／ショ糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメ チルセルロース、アルミニウムステアリン酸ゲルまたは水素添加した食用脂肪； 乳化剤、例えばレシチン、ソルビタンモノ−オレエートまたはアラビアゴム；非 水性ビヒクル（食用オイルを含むことがある）、例えばアーモンド油、精溜した ヤシ浦、油性エステル、プロピレングリコールまたはエチルアルコール；および 防腐剤、例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピルまたはソルビン酸 のような通常の添加剤を含むことができる。本組成物はまた、例えばカカオ脂ま たは他のグリセリドのような通常の座薬基剤を含む座薬として配合することもで きる。

口腔投与用には、本組成物は通常の方法で配合される錠剤またはロゼンジの形態 をとっても良い。

本発明による組成物は、注射または連続輸液による非経口投与用に配合すること ができる。注射用の処方は、アンプルでの単位投与形態で、または防腐剤を加え た複数投与用容器で提供することができる。本組成物は、油性または水性ビヒク ルの懸濁液、溶液またはエマルジョンとしての形態を取ることができ、沈澱防止 剤、安定剤および／または分散助剤などの配合剤を含んでも良い。

或いは、本活性成分は、使用前に適当なビヒクル、例えば無菌の発熱性物質不含 水で構成する粉末形態でも良い。

吸入による投与には、本発明による組成物を、例えばジクロロジフルオロメタン 、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素また は他の適当なガスなどの好適なプロペラントを用いた加圧容器、もしくは噴霧器 からエアゾールスプレーの形態で好都合に噴射される。加圧したエアゾールの場 合、投与単位は弁を取り付け、計測した分量を噴射するようにすることができる 。

或いは、吸入による投与には、本発明による組成物は、乾燥粉末組成物、例えば 本化合物と乳糖または澱粉などの好適な粉末基剤との粉末混合物の形態をとって も良い。

この粉末組成物は、例えばゼラチンのカプセルまたはカートリッジ、または吸入 装置または吹送装置を用いて粉末を投与することができるブリスターバックの単 位投与形態で提供することができる。

本組成物は、例えば通常の座薬基剤を含む座薬または例えば通常のペッサリー基 剤を含むペッサリーの形態をとっても良い。

本組成物は、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、シャンプー、粉末（スプレー 粉末を含む）、ペッサリー、タンポン、スプレー、浸漬、エアゾール、層剤（例 えば眼、耳または算用層剤）または注入剤（ｐｏｕｒ−ｏｎｓ）の形態で局部投 与用に処方しても良い。軟膏およびクリームの場合には、水性または油性の基剤 に好適な増粘剤および／またはゲル化剤を加えて処方しても良い。眼に投与する 軟膏は、殺菌した成分を用い無菌状態で製造することができる。注入剤は、例え ば、有機溶媒を所望により安定剤および可溶化剤などの配合剤と共に含む油状生 成物で獣医用に処方しても良い。腟に挿入するペッサリーおよびタンポンは、通 常の技術により処方することができ、適宜発泡性のビヒクルを含んでも良い。こ のような組成物は、コルチコステロイド、抗生物質または抗寄生虫薬のような他 の活性成分を適宜含むことができる。

鼻腔内投与用の液体製剤は、溶液または懸濁液の形態をとることができ、通常の 賦形剤、例えば張度調節剤の塩化ナトリウム、デキストロースまたはマンニトー ル；防腐剤の塩化ベンザルコニウム、チオメルサール、フェニルエチルアルコー ル、およびその他の配合剤、例えば沈澱防止剤、緩衝剤、安定剤および／または 分散助剤を含んでも良い。

経皮投与は、皮膚を通じた活性化合物の吸着を促進する好適な系を設計によって 影響を受ける場合があるが、典型的には裏張り用フィルム、膜および放出ライナ ーから成る粘着性の貼剤の中に封入した基剤配合物から成っている。

本発明による組成物は、デポ−製剤として処方しても良い。こういった長期作用 型配合薬は、移植（例えば皮下または筋肉内）、または筋肉注射により投与する ことができる。従７て、例えば本発明の化合物は、好適なポリマー性または疎水 性の材料（例えば、許容可能な油状物質のエマルジョンとして）またはイオン交 換樹脂と共に配合することができ、または貧溶性の誘導体、例えば貧溶性塩とし て配合しても良い。

組成物が投与単位から成るときには、各単位は本発明の化合物を経口投与する場 合、活性成分０．００１ｍｇ−１０００ｍｇを含むのが好ましく、０．０１ｍｇ 〜４００ｍｇを含むのが有利である。ヒト成人を治療する１日投与量は、活性成 分０．００１ｍｇ　〜５０００ｍｇが好ましく、０．０１ｍｇ〜２０００ｍｇが 最も好ましく、これは例えば投与経路および患者および治療を行う疾患の状態に 応じ１日１回から４回に分けて投与しても本化合物は、活性成分の５０　ｍ　ｇ 　／　ｋ　ｇ　／日まで使用して静脈内輸液により投与しても良い。治療期間は 、任意の日数ではなく応答速度により指示される。

本発明の化合物は、他の治療薬と併用しても良く、従って本発明は、もう一つの 態様では、本発明の化合物を別の治療上活性な薬剤、例えば３−ヒドロキシ−３ −メチルグルタリル補酵素Ａ　（ＨＭＧ　ＣｏＡ）レダクターゼの阻害剤または 血清コレステロールを減少させおよび／またはコレステロール生合成を阻害する 他の薬剤、例えば胆汁酸金属イオン封鎖剤または抗高リポタンパク血症または抗 高脂血症の薬剤、例えばプロブコール、ゲムフィブロジル、クロフィブレート、 デキストロチロキシンまたはそのナトリウム塩、コレステロールまたはその塩酸 塩の塩、コレスチラミン、ニコチン酸、ネオマイシン、ｐ−アミノサリチル酸、 アスピリン、ＤＥＡＥ−セファデックス、ポリ（ジアリルメチルアミン）誘導体 、イオネン、またはポリ（ジアリルジメチルアンモニウム）クロリドと一緒に含 んで成る組合せを提供する。

前記の組合せは、医薬組成物の形態で使用するのに好都合に提供することができ 、従って前記の組合せと薬学上許容可能なその担体とを含んで成る医薬組成物は 本発明のもう一つの態様である。このような組合せの個々の成分は、個別のまた は組合せた医薬組成物で順次または同時に投与しても良い。

本発明の化合物を、同じ症状に対し第二の治療薬と組み合わせて用いる場合、各 化合物の用量はその化合物を単独で用いる時と異なる場合がある。適切な用量に ついては当業者が容易に理解するであろう。

本発明のもう一つの態様によれば、本発明の化合物または前記に定義した本発明 の化合物を含んで成る薬学組成物であって、治療に用いられる、特に動物（特に ヒト）での血漿コレステロールの濃度の低下が有益な症状の治療、または動物（ 特にヒト）の真菌感染症の治療するための薬学組成物が提供される。

本発明の特定の態様では、本発明の化合物または前記に定義した本発明の化合物 を含んで成る薬学組成物であって、高コレステロール血症および／または高リポ タンパク血症に関連した疾患、特にアテローム性動脈硬化症および循環器系疾患 （例えば心虚血性疾患、大脳虚血性疾患および末梢動脈疾患）の治療に用いられ るものが提供される。

本発明のもう一つの態様によれば、高コレステロール血症および／または高リポ タンパク血症に関連した疾患、特にアテローム性動脈硬化症および循環器系疾患 （例えば、心虚血性疾患、大脳虚血性疾患および末梢動脈疾患）の治療薬の製造 における本発明の化合物の使用が提供される。

本発明のもう１つの態様によれば、ヒトまたはヒト以外の動物の患者における真 菌感染症の治療薬の製造における本発明の化合物の使用が提供される。

本発明の更にもう一つの態様によれば、高コレステロール血症および／または高 リポタンパク血症に関連した疾患、特にアテローム性動脈硬化症および循環器系 疾患（心虚血性疾患、大脳虚血性疾患および末梢動脈疾患）を治療しまたは真菌 疾患を治療するためのヒトおよびヒト以外の動物の体を治療する方法であって、 本発明の化合物の有効量を前記の体へ投与することを特徴とする方法が提供され る。

本明細書で治療という表示は、既に発現した症状または感染症の治療から予防に まで亙ることか当業者に理解されるであろう。

本発明の化合物は、下記に説明する方法により製造することができる。

したがって、本発明のもう一つの態様によれば、本発明の化合物の製造法であっ て、フッ化安息香酸またはその前駆体の存在下で本発明の化合物を１種類以上産 生ずることのできる微生物を培養した後、培養物から所望の化合物を分離し、所 望ならば前記の化合物を脱アセチル化しおよび／またはこの化合物をエステル化 して対応するメチルエステルとする段階から成る方法が提供される。

フッ化安息香酸またはその前駆体の存在下で本発明の化合物を産生できる微生物 は、小規模試験を用いて、標準的な方法を用いた微生物の発酵により得た試験試 料を分析することにより容易に同定することができる。

詳細には使用される微生物は、ＣＡ　Ｂ　ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＭｙｃｏ ｌｏｇｌｃａｌ　Ｉｎ５ｔｌｔｕＬｅ、Ｆｅｒｒｙ　Ｒｏｏｄ、　Ｋｅｙ、５ｕ ｒｒｙ　ｓ英国、のＰｅｒｓａｎｅｎｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ ｎに寄託された微生物の１菌株である。この菌株は１９８９年５月２５日に同研 究所で受理された後、受付番号ＩＭＩ　３３２９６２を受け、寄託口を１９８９ 年６月２７日（生存を確認した日付）とした。この寄託株を本明細書では研究所 の受付番号ＩＭ１３３２９６２として同定する。ＩＭＩ３３２９６２に関してこ れまでに同定した特性を、下記の例２に示す。

１Ｍ１３３２９６２の突然変異体は、自然発生的に生じることがあり、またはＨ ，１，＾旧ｅｒのＲａｄ１ａｔ１ｏｎ　ａｎｄＲａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅｓ　ｒ ｏｒ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　旧ＣｒＯ％　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｒｔｈｅ 　ｓｙ＋＋ｐｏｓｌｕｓ、Ｖｉｅｎｎａｓ　１９７３年、２４１頁、国際原子力 エネルギー機関、のｒＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｌｃｒｏ　−ｏｒｇａ ｎｉｓｓｓの技術」に概説された方法を含む様々な方法により産生ずることがで きる。このような方法には、イオン化放射線、化学的方法、例えばＮ−メチル− Ｎ’　−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）による処理、加熱、遺伝子 技術、例えば組換えおよび形質転換、および自然発生的な突然変異体のための選 択的技術などがある。

本発明の化合物の１つ以上の合成に関与するＩＭｌ　３３２９６２の遺伝材料お よびその突然変異体は、ＲａｍｂｏｓｅｋとＬｅａｃｈ　著　ｒＲｅｃｏｓｂｉ ｎａｎｔ　ＤＮＡ　ｉｎ　ｆ’ｌｌａｍｅｎｔｏｕｓ１’ｕｎｇｉ：　ｐｒｏｇ ｒｅｓｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ、　ＣＲＣクリティカル・レビューズ・ イン・バイオテクノロジー、１９８７年、第６巻、３５７〜３９３頁で概説する ような通常の遺伝子工学技術を用いて得ることができる。これらの技術は、Ａｃ ｒｅ■ｏｎｌｕｗ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍでの抗生物質の生合成遺伝子をクロ ーン化してβ−ラクタム抗生物質を生合成することに関して先に記載されたのと 同様の方法で用いることができる（Ｓａｎｓｏｓ、　Ｓ、Ｍ、　ら、１９８５． 　Ｎａｔｕｒｅ、　３１８．１９１−１９４頁）。こうして得た遺伝材料は、例 えば５ｋａｔｒｕｄ、　Ｐ、Ｌ。

ら、１９８９．　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７．４７７−４８５頁に記載さ れたような菌株の改良に用いて、イン・ビトロでの応用のための生合成酵素を産 生させ、またはＩＭＩ　３３２９６２以外の生体にこのような材料を導入するこ とによる新規な化合物の生成に用いることができる。

本発明のもう一つの態様では、フッ化安息香酸またはその前駆体、脱アセチル化 誘導体およびそのメチルエステルの存在下でＩＭＩ　３３２９６２またはその突 然変異体の発酵から得ることのできる架橋した環状ケタール誘導体が提供される 。

本発明の特定の態様では、フッ化安息香酸またはその先駆物質、脱アセチル化誘 導体およびそのメチルエステルの存在下でＩＭＩ　３３２９６２またはその突然 変異体の発酵から得ることのできるスクアレンシンターゼ阻害活性を有する化合 物が提供される。

本発明の発酵過程に準じて使用するフッ化安息香酸の前駆体として好適な化合物 は、通常の小規模発酵を用い、試験試料の分析用高性能液体クロマトグラフィー により様々な化合物を加える効果を調べることにより容易に同定することができ る。本発明の発酵過程により使用するフッ化安息香酸の前駆体として作用する好 適な化合物の例には、フッ化フェニルアラニン、フッ化ケイ皮酸およびフッ化ベ ンズアルデヒドが挙げられる。

本明細書のフッ化安息香酸およびその前駆体とは、モノ−、ジー、またはトリー フッ化安息香酸およびその前駆体を適宜意味する。

好適な生物の発酵による本発明の化合物の産生は、通常の手段、即ち炭素、窒素 および鉱物の同化性栄養源の存在下で生物を培養し、フッ化安息香酸またはその 前駆体を、微生物の培養中の任意の適当な時点で添加することによって行うこと ができる。

炭素、窒素および鉱物の同化性栄養源は、単独または複合栄養素のいずれによっ ても供給することができる。

炭素源としては、通常グルコース、マルトース、澱粉、グリセロール、糖蜜、デ キストリン、乳糖、蔗糖、フルクトース、ガラクトース、ミオ−イノシトール、 Ｄ−マンニトール、大豆浦、カルボン酸、アミノ酸、グリセリド、アルコール、 アルカンおよび植物油などがある。炭素源は、通常発酵培地の０．５〜１０重量 ％である。フルクトース、グルコースおよび蔗糖が、好ましい炭素源である。

窒素源には、通常大豆ミール、コーンステイープリカー、可溶性留分、酵母抽出 物、綿実ミール、ペプトン、粉砕ナツツミール、麦芽抽出物、糖蜜、カゼイン、 アミノ酸混合物、アンモニア（ガスまたは溶液）、アンモニウム塩または硝酸塩 が挙げられる。尿素および他のアミドを用いることもできる。窒素源は通常、発 酵培地の０．１〜１０重量％である。

培養培地に配合することができる栄養素の無機塩には、ナトリウムカリウム、ア ンモニウム、鉄、マグネシウム、亜鉛、ニッケル、コバルト、マンガン、ノ（カ リウム、クロム、カルシウム、銅、モリブデン、ホウ素、ホスフェート、スルフ ェート、塩化物およびカーボネートイオンを生成することのできる、通常使用す る塩が挙げられる。

微生物の培養は、通常２０から４０℃、好ましくは２０から３５℃、特に約２５ から２８℃の温度で行い、望ましくは例えば振盪または撹拌により通気および撹 拌を行う。培地には、初めに少量の菌糸および／または胞子を接種しても良い。

入手した生長力のある種菌を、発酵培地または１以上の播種ステージに移して、 更に成長させた後、主発酵用培地に移すことができる。フッ化安息香酸またはそ の前駆体は、主発酵の間、例えば主発酵開始後約３日日に、好都合に加えること ができ、または必要に応じ発酵培地に供給しても良い。必要とされるフッ化安息 香酸またはその前駆体の量は、培地および用いる微生物の性質により変化し、通 常各培養の要件に合致するように経験的に決定することができる。発酵は、通常 ｐｉ（３，５から９，５の範囲、好ましくは４．５から７．５で行われる。塩基 または酸を醗酵培地に加えてｐ）Ｉを所望の範囲内に保持することが必要な場合 がある。

加えることができる好適な塩基には、アルカリ金属水酸化物、例えば水性の水酸 化ナトリウムまたは水酸化カリウムがある。好適な酸には鉱酸、例えば塩酸、硫 酸またはリン酸がある。

発酵は全部で４から３０日間、好ましくは約７から１８日間行うことができる。

過度の発泡を制御するため、消泡剤を加えておくことができ、必要に応じて定期 的に加えることができる。炭素および／または窒素源を、必要に応じて醗酵培地 に供給することもできる。

本発明の化合物は、醗酵液に含まれており、これは濾過または遠心分離により好 都合に分離することができる。

次いで、この液を、所望により有機溶媒の存在下にて硫酸のような酸で処理して 、ｐＨが６を下回る（例えば約ｐＨ３）ようにすることができる。

本発明の化合物は、通常の単離および分離技術により発酵液から分離することが できる。単離技術の選択は広範囲に亙って変動し得ることが判るであろう。

本発明の化合物は、例えば吸着−溶離、沈殿、分別結晶、溶媒抽出および液−液 分配のような様々な分画法によって単離および精製することができ、これらの手 法は様々な方法で組合せることができる。

固形物担体への吸着の後の溶離は、本発明の化合物の単離および精製に好適であ ることが分かった。

本発明の化合物は、ケトン（例えばアセトン、メチルエチルケトンまたはメチル イソブチルケトン）、ハロゲン化炭化水素、アルコール、ジオール（例えばプロ パン−１，２−ジオールまたはブタン−１，３−ジオール）、またはエステル（ 例えば酢酸メチルまたは酢酸エチル）のような適当な有機溶媒により抽出するこ とができる。

通常、最適の回収率を達成するには、２回以上の抽出を行うことが望ましい。水 に非相溶性の溶媒抽出物は、それ自身を塩基性の水性溶液により抽出することが でき、これらの塩基性溶液を酸性化した後に所望の化合物を水に非相溶性の有機 相に再抽出しても良い。次に、この溶媒を有機抽出物から除去しく例えば蒸発に より）、所望の化合物を含む材料を生成させることができる。

クロマトグラフィ　（高性能液体クロマトグラフィーを含む）は、例えばシリカ ；非機能性巨細状吸着樹脂、例えば架橋スチレン−ジビニルベンゼンポリマー樹 脂、例えばアンバーライトＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−１６またはＸＡＤ −１１８０樹脂（Ｒｏｈｍ　ｌ　ｌ１ａａｓ）またはカスチルＳ　１１２　（Ｍ ｏｎｔｅｄｉｓｏｎ）　：置換スチレンージビニルヘンゼンポリマー、例えばシ アイオン５Ｐ２０７（旧ｔｓｕｂｌｓｈ１）のようなハロゲン化（例えば、臭素 化）スチレン−ジビニルベンゼンポリマー；陰イオン交換体（例えば、ＩＲＡ− ３５またはＩＲＡ−６８）；セファデックスＬ　Ｈ２０（Ｐｈａｒ＋ｇａｃｉａ 　ＵＫ　Ｌｔｄ）のような有機溶媒相溶性の架橋デキストラン：または炭化水素 に結合したシリカのような逆相支持体、例えばＣ１８に結合したシリカなどの好 適な支持体上で行うことができる。本発明の化合物を精製／分離するもう一つの クロマトグラフィーによる方法は、多層コイル抽出器のようなコイル抽出器を用 いた向流クロマトグラフィである。

本発明の化合物は、ＬＡ２のような液体陰イオン交換体を用いて単離および精製 することもできる。

ＩＲＡ−６８、特にＩＲＡ−３５を固形吸着剤として使用する場合、固形不純物 を濾過した後、抽出物をｐＨ約３またはｐｎ約８で直接載荷することができる。

本発明の化合物をクロマトグラフィーにより精製／分離するのに好適な溶媒／溶 離剤は、カラムの種類および支持体の性質によって変化するのは勿論である。向 流クロマトグラフィを用いる場合には、酢酸エチル、ヘキサン、メタノールおよ び水性酸（例えば、水性硫酸）を含んで成る溶媒系が特に好適である。ＩＲＡ− ３５のような陰イオン交換体を用いる場合には、樹脂は水性のアセトンで洗浄し 、水性アセトン中の硫酸により溶出するのが好都合なことがある。

抽出／単離手続きの際の本発明の化合物の存在は、ｈ、ｐ、１．ｃまたはＵＶ分 光光度法のような通常の技術により、または化合物の特性を利用して観察するこ とができる。

本発明の化合物を、例えばクロマトグラフィによる精製の後に有機溶媒の溶液の 形態で得る場合、溶媒を従来の手続き、例えば蒸発により除去して必要な化合物 を生成させることができる。所望ならば、この化合物を前記のクロマトグラフィ ー法によって更に精製することができる。

本発明の化合物の脱アセチル化は、酸または塩基によって触媒される加水分解に より行うことができる。好適な塩基には、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウ ムのような水酸化物、およびアルコキシド（例えば、メトキシト）が挙げられる 。塩基によって触媒される加水分解は、水中で、所望によりエーテル（例えば、 テトラヒドロフラン）またはアルコール（例えば、メタノール）のような有機溶 媒の存在下で、０″から１００℃の範囲の温度、好ましくは高温で起こすことが できる。アルコキシドを塩基として用いる場合、この反応はアルコール溶媒（例 えば、メタノール）中で、０＠から］００℃の範囲の温度で好都合に行うことが できる。好適な酸には、鉱酸（例えば、塩酸または硫酸）および有機酸（例えば 、ｐ−＋−ルエンスルホン酸）が挙げられる。酸触媒加水分解は、水中で、所望 によりエーテル（例えば、ジオキサンまたはテトラヒドロフラン）またはケトン （例えば、アセトン）のような有機共溶媒の存在下で、０℃から１００℃の範囲 の温度、好ましくは室温で行うことができる。

本発明の化合物の、対応するメチルエステルへのエステル化は、アミド（例えば 、ジメチルアセタミドまたは好ましくはジメチルポルムアミド）のような好適な 有機溶媒中で、重炭酸塩（例えば、重炭酸ナトリウム）のような塩基の存在下に て、ハロゲン化メチル（例えば、ヨウ化メチル）またはジメチル硫酸のようなメ チル化剤で処理することによって好都合に行うことができる。この反応は、０° から１０００℃、好ましくは２０″から３０℃の範囲の温度で好都合に行うこと ができる。或いは、エステル化は、メタノールのような適当な溶媒中でジアゾメ タンのエーテル性溶液で処理することにより行うことができる。エステル化は、 鉱酸（例えば、塩酸）のような好適な酸の存在下で、室温でメタノールで処理す ることによって行うこともできる。

本発明の１つのメチルエステルから本発明の別のメチルエステルへ転換は、適当 なエステル化／脱エステル化段階により行うことができる。この脱エステル化は 、標準的な条件で、例えば塩基加水分解により行うことができる。

脱エステル化およびエステル化の工程は、逐次または同時反応段階として組み合 わせることができることを理解すべきである。

本発明の化合物の塩は、本発明の化合物を適当な塩または塩基で処理することに よって好都合に形成することができる。したがって、例えば、塩は、式（１）の 化合物を、水酸化ナトリウムまたはカリウム、炭酸水素塩、炭酸塩または酢酸塩 （例えば、水酸化カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウムまたは酢酸 カリウム）、酢酸アンモニウム、酢酸カルシウムおよびＬ−リジンから選択され る塩または塩基で適宜処理することによって好都合に調製することができる。こ の塩は、適当な塩または塩基を（必要ならば、水性溶液として）式（１）の化合 物の溶液または懸濁液の好適な溶媒、例えば水、および／または共溶剤の例えば アルコール（例えば、メタノール）、ニトリル（例えば、アセトニトリル）また はケトン（例えばアセトン）を、例えば０℃から８０℃の温度、好都合には室温 で加えることにより調製することができる。

塩の形成は、水性の不溶性塩を希求性鉱酸（例えば、塩酸または硫酸）で処理し た後、逆相シリカへバッチ吸着させ、適当な有機溶媒で溶出することにより、本 発明の化合物をその水性の不溶性塩（例えば、カルシウム塩）から遊離させるこ とによって、適宜行うことができる。

本発明の単離化合物およびその塩は、この化合物の溶液（例えば、アセトン溶液 ）を無菌条件下で濾過し、濾液から化合物を再結晶させることにより更に精製す ることができる。

下記の実施例は本発明の例示を目的として提供するものであり、いかなる意味に おいても本発明の制限を意図するものではない。

実施例Ｉ ＩＭｌ　３３２９６２を下記の組成の寒天プレート上で成長させた。

麦芽抽出物（オキソイドＬ３９）　３０ｇ真菌ペプトン（オキソイドＬ４０）　 ５ｇ酵母抽出物（オキソイドＬ２１）　０．５ｇ寒天（オキソイドＮｏ３）　２ ０ｇ 蒸留水を加えて総量を１リツトルとする。

オートクレーブ中で処理する前の培地のｐＨは、５．３〜５．５の範囲であった 。接種したプレートを２８℃で１４日間インキュベーションした。真菌菌糸体で 覆われた寒天を、培地の生長の盛んな部分がら数個の６ｍｍ直径のプラグ状に切 り取り、２個のプラグを別々の無菌蒸留水１．６ｍｌを含むクリオチューブに移 した。

チューブに蓋をし、必要なときまで一２０’Ｃの温度で保存した。

１Ｍ１３３２９６２　０．５ｍｌを用いて、２５０ｍ１三角フラスコに入れた種 培地５０ｍ１に接種した。

種培地（Ａ） ペプトン（オキソイド　Ｌ３４）　１０ｇ麦芽抽出物（オキソイド　Ｌ３９）　 ２１ｇグリセロール　４０ｇ シュンロン　１１０　（Ｉｌｏｎｅｙｖｌｌｌ　＆　５ｔｅｌｎ　Ｌｉｄ、、ウ ォリントン、サリー）　１ｇ 蒸留水を加えて総量を１リツトルとする。

培地は、オートクレーブ中で処理する前に、水酸化ナトリウム水性液によりｐＨ ６，３〜６．５に調整した。

接種した種培地のフラスコを、直径５０ｍｍの軌道運動を行いながら２５Ｏｒｐ ｍで回転する振盪培養機のプラットホーム上で２５℃で３日間培養した。次にこ の培置物を容ｆｆ１５０ｍ１のシリンジへ移し、その１ｍｌを用いて発酵培地（ Ｂ）を含む５０ｍ１試験フラスコに接種した。

発酵培地（Ｂ）　フルクトース　５０ｇ／リットル大豆油　３０ｇ／リットル 綿実粉　２０ｇ／リットル （Ｓｉｇｍａ） フラスコの内容物を前記と同様に３日間培養し、この時点でフッ化安息香酸また は前駆体を加え（適宜、濾過殺菌した６、２５−１２．５ｍｇ／ｍｌの水溶液ま たは液体のまま直接）、最終濃度を２５０ｍｇ／リットルとした。フラスコを前 記と同様の方法で更に４または５日間培養した。次に、ブロスを総量で１ｍｌを 、同量の抽出混合物（５ｍｌ／リットルの濃硫酸を含むアセトニトリル）と混合 し、３０分間放置した。その後、この試験管を１０分間遠心分離し、この上澄液 を新しい試験管に傾瀉した。次いで、遠心分離を繰り返して行い、透明な上澄液 を得た。

生成物の形成は、上澄液材料をグラディエンド高性能液体クロマトグラフィー　 （Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ５　ｐ　Ｍ　Ｃ６カラム：１５ｃｍＸ４．６ｍｍ内径） により溶離剤として酸性にした水性アセトニトリルを用いて分析し、２１０ｎｍ で検出することによって測定した。新規な生成物を産生じた試料については、下 記のようにスケールアップした。

−ジメチルー２−オクテノエート） 加えた２０本の振盪フラスコの内容物を纏めたもの（約８００ｍ１）を、０．８ ８０アンモニア溶液でｐＨ１０，４に調整し、３０分間遠心分離（５０００ｇ） ！。

て菌体と上澄液とを分離した。この菌体を水（２５０ｍｌ）に懸濁し、懸濁液を ０．８８０アンモニア溶液によりｐＨ１０，４に調整した後、前記と同様１こ遠 心分離した。それぞれの遠心分離により得た上澄液をまとめ、ｐＨ８，２に調整 して１．５べ・ソド容量／時でアンバーライトＸＡＤ１６カラム（２２Ｘ　２． 　６　ｃ　ｍ内径）に装填した。カラムを水（５００ｍｌ）、エデト酸四ナトリ ウム（１重量／容量％、５００ｍ１）、水−（５００ｍｌ）で洗浄し、アセトン ／水（６：　４）で溶出した。必要とする成分を含む溶出物（溶出開始後の９０ ｍ１から１５０ｍ１）を、等容の水で希釈し、次１こ硫酸（２，４ｍ１）で酸性 にし、５ｐｈｅｒｌｓｏｒｂＳ　５０ＤＳ２のカラム（２５Ｘ２．１ｃｍ内径） に送ｉ夜しｔ二。

このカラムを、アセトニトリル１０．０９５Ｎ硫酸（１：３．１リツトル）で洗 浄し、アセトニトリル１０．１３Ｎ硫酸（４５：５５）により溶出した。

８７５ｍ１から１１７５ｍ１までの溶出分画を等容の水で希釈し、洗浄して水で 平衡にしたカラム上に戻した。

カラムを、酸が検出されなくなるまで水で洗浄した後、アセトニトリル／水（９ ：　１）で溶出した。溶出物を蒸発させて油状残渣（３ｍｌ）を得て、これにア セトニトリル（２，４５ｍ１）と硫酸（１１μｍ）を加えた。この溶液を２つに 分け、５ｐｈｅｒｌｓｏｒｂＳ　５０　Ｄ　Ｓ　２カラム（２５ｘ２．１ｃｍ内 径）上で、アセトニトリル１０．１３Ｎ硫酸（４５：　５５）２５ｍｌ／分でり ０７トグラフイ処理を行い２１０ｎｒｒ＋で検出した。双方の処理において３６ 〜４０分の間にカラムから溶出した成分を集め、−緒に合せた溶液を等容の水で 希釈し、洗浄して水で平衡にしだカラム上に戻した。このカラムを水（１゜５リ ツトル）で洗浄し、アセトニトリル／水（９：　１）で溶出した。溶出物を、真 空で蒸発させ、水性懸濁液を凍結乾燥し、表題化合物を白色粉末（１，２ｍｇ） として得た。ＦＡＢマススペクトル分析［Ｍ−Ｈ］　７０７、分子量約７０８、 分子式−ＣＨＦＯ、重水素化メタノール中での５００　Ｍ　Ｈｚプロトンｎｍｒ スペクトルでは下記のシグナルが見られる［はぼ下記に中心を有するδ値、括弧 内は多重線、カップリング定数（Ｈｚ）および積分値］　：　０．８３〜０．９ ０　（ｍ、９Ｈ）。

１、　０３　（ｄ、７．　３Ｈ）、２．　１０　（ｓ、３Ｈ）。

２、　２５　（ｍ、ＩＨ）、２．　３６　（ｍ、ＬＨ）。

２、　６７　（ｄｄ、１４．　６．　ＬＨ）、４．　０２　（ｄ、２゜ＩＨ）、 ４．　９６　（ｓ、ＩＨ）、５．　０２　（ｓ、ＩＨ）。

５、　０８　（ｄ、５．　ＩＨ）、５．　２７　（ｓ、ＩＨ）。

５．８１　（ｄｄ、１６．　１．　ＩＨ）、６．　３３　（ｄ、２゜ＩＨ）、６ ．８５　（ｄｄ、１６．８．　ＩＨ）。

６、　９９　（ｔ、８．　２Ｈ）、７．　２１　（ｄｄ、８．　５゜−メチル− ３−メチレンヘキシル］−４．６．７−ドリーシメチルー２−オクテノエート） 加えた４０本の振盪フラスコの内容物を合わせたもの（約１８００ｍｌ）を、０ ．８８０アンモニア溶液でｐＨ１０，４に調整し、３０分間遠心分離（５０００ ｇ）して菌体と上澄液とを分離した。この菌体を水（１す・ソよりｐＨ１０，４ に調整した後、前記と同様に遠心分離した。それぞれの遠心分離により得た上澄 液をまとめ、ｐ）１ｇ、２に調整して約１ベツド容量／時でアンバーライトＸＡ Ｄ１６カラム（２３Ｘ　３．　５　ｃ　ｍ内径）に装填した。カラムを水（５０ ０ｍｌ）、エデト酸四ナトリウム（１重量／容量％、５００ｍ１）、水（１リツ トル）で洗浄し、アセトン／水（６：　４）で溶出した。必要とする成分を含む 溶出物（溶出開始後の２５０ｍ１から約５００ｍ１まで）を、水で希釈しく１　 ：　１）　、硫酸で酸性にした後、５ｐｈｅｒｉｓｏｒｂＳ　５０　Ｄ　Ｓ　２ のカラム（２５Ｘ２．１ｃｍ内径）に送液した。このカラムを、アセトニトリル １０．０９５Ｎ硫酸（１：３．３００ｍ１）で洗浄した後、アセトニトリル１０ ．１３Ｎ硫酸（４５：５５）で溶出した。２２５ｍ１〜８００ｍ１までの溶出分 画を等容の水で希釈し、洗浄して水で平衡にしだカラム上に戻した。カラムを、 酸が検出されなくなるまで水で洗浄した後、アセトニトリル／水（９：　１）で 溶出した。溶出物を蒸発させて油状残渣（３ｍｌ）を得て、これにアセトニトリ ル（２，４５ｍ１）と硫酸（０，０１１ｍ１）を加えた。この溶液を、１０回に 分けて、５ｐｈｅｒｌｓｏｒｂＳ　５０　Ｄ　Ｓ　２カラム（２５Ｘ２．１ｃｍ 内径）上で、アセトニトリル１０．１３Ｎ硫酸（４５：　５５）２５ｍｌ／分て クロマトグラフィ処理を行い２１０ｎｍで検出した。それぞれの処理で、５３〜 ５７分の間に溶出する成分を集め、−緒に合わせた溶液を等容の水で希釈し、洗 浄して水で平衡にしたカラム上に戻した。このカラムを水（２リツトル）で洗浄 し、アセトニトリル／水（９：　１）で溶出した。溶出物を真空で蒸発させ、水 性懸濁液を凍結乾燥し、表題化合物を白色粉末（２９，４ｍｇ）として得た。Ｆ ＡＢマススペクトル分析［Ｍ−Ｈ］　７０７、分子量約７０８、分子式−ＣＨＦ Ｏ、重水素化メタノール中での５００　Ｍ　Ｈｚプロトンｎｍｒスペクトルでは 下記のシグナルが見られる［はぼ下記に中心を有するδ値、括弧内は多重線、カ ップリング定数（Ｈｚ）および積分値］　二０．８３〜０．９０　（ｍ、９Ｈ） 、１．０３　（ｄ、７゜３Ｈ）、２．１１　（ｓ、３Ｈ）、２．２５　（ｍ、Ｉ Ｈ）。

２．３４　（ｍ、ＬＨ）、２．７２　（ｄｄ、１３，６．ＬＨ）、４．０６　（ ｄ、２．ＩＨ）、４．９８　（ｓ、ＩＨ）、５．０３　（ｓ、ＩＨ）、５．１０ 　（ｄ、５．ＬＨ）。

５．２７　（ｓ、ＩＨ）、５．８０　（ｄｄ、１６，１゜ＩＨ）、６．３２　（ ｄ、２．ＩＨ）、６．８４　（ｄｄ。

１６．８．ＩＨ）、６．８８　（ｔｄ、９，２．ＬＨ）。

６．９４　（ｄｔ、１０，２．ＩＨ）、７．０３　（ｄ、８゜ＩＨ）、７．２８ 　（ｄｔ、６．８．ＩＨ）。

（ｃ）　［ＩＳ　−［１α　（４Ｒ５Ｓ＊）、３ａ、４β。

［４−アセトキシ−６−（２−フルオロフェニル）−５ヒドロキシ−２，８−ジ オキサビシクロ［３，２゜１］前記と同様にして調製し、０−フルオロベンズア ルデヒドを加えた９９本の振盪フラスコの内容物を合せたもの（約４．５リツト ル）を、濃硫酸でｐＨ２に調整し、３０分間遠心分離（５０００ｇ）　して上澄 液を分離した。

菌体を０．５ｍｌ／リットル硫酸を含むアセトニトリル／水（１：１）（３リツ トル）に懸濁した後、アセトニトリルを真空で蒸発させて水性溶液を得た。この 溶液を、約１ベツド容量／時でアンバーライトＸＡＤ１６カラム（２６ｘ３．５ ｃｍ内径）に装填した。カラムを水（５００ｍｌ）、エデト酸四ナトリウム（１ 重量／容量％、５００ｍ１）、水（５００ｍｌ）で洗浄した後、アセトン／水（ ６：　４）で溶出した。必要とする成分を含む溶出物（溶出開始後の約３００ｍ １から８００ｍ１まで）を、等容の水で希釈し、濃硫酸（２ｍ　ｌ）で酸性にし た後、５ｐｈｅｒｉｓｏｒｂＳ　５０　Ｄ　Ｓ　２のカラム（２５Ｘ　２．　。

１ｃｍ内径）に送液した。このカラムを、アセトニトリル１０．０９５Ｎ硫酸（ １：３．１．４リツトル）で洗浄した後、アセトニトリル１０．１３Ｎ硫酸（４ ５：５５）で溶出した。溶出開始後５５０ｍ１〜１３５０ｍｌまでの溶出分画を 集めて、等容の水で希釈した。この溶液を、洗浄して水で平衡にしたカラム上に 戻した。カラムを、水（１，５リツトル）で洗浄した後、アセトニトリル／水（ ９：　１）で溶出した。溶出物を蒸発させて濃縮した抽出物（５ｍｌ）を得て、 これにアセトニトリル（４，０５ｍ１）と濃硫酸（０，０１８ｍ１）を加えた。

この溶液を、７回に分けて、５ｐｈｅｒ１ｓｏｒｂ５０ＤＳ２カラム（２５Ｘ２ ゜１ｃｍ内径）上で、アセトニトリル１０．１３Ｎ硫酸（４５：　５５）２５ｍ ｌ／分でクロマトグラフィ処理を行い２１０ｎｍで検出した。

４２〜５０分の間に溶出する成分をそれぞれの処理で集め、−緒に合わせた溶液 を等容の水で希釈した。この溶液を、洗浄して水で平衡にしだカラム上に戻し、 カラムを水（１，７５リツトル）で洗浄し、アセトニトリル／水（９：　１）で 溶出した。溶出物を真空で蒸発させ、濃縮した抽出物（４，２５ｍ１）を得た。

この抽出物にメタノール（５，７５ｍ１）とリン酸（０，０２ｍ１）を加え、溶 液を５分間遠心分離（１２０００ｇ）した。上澄液を、１０回に分けて、５ｐｈ ｅｒｉｓｏｒｂＣ６５μＭ（２５ｘ２．１ｃｍ内径）のカラム上で、リン酸（７ ５μｌ／リツトル、ｐＨ３）を含むメタノール／水（５７，５：４２．５）を用 いて２２．５ｍｌ／分でクロマトグラフィ処理を行い、２１０ｎｍで検出した。

それぞれの処理で９０〜９５分の間に溶出する成分を集めた。−緒に合わせた溶 液を等容の水で希釈し、洗浄して水で平衡にしだカラムに戻した。カラムを水（ １，５すットル）で洗浄し、アセトニトリル／水（９：１）で溶出した。溶出物 を真空で蒸発させ、薬１ｍｌの濃縮溶液を得た。この溶液にメタノール（４ｍｌ ）とリン酸（０，０１ｍ１）を加え、この溶液を濾過した。濾液を５ｐｈｅｒｉ ｓｏｒｂＣ６５μＭ（２５Ｘ２．　１ｃｍ内径）のカラム上で、リン酸（７５μ ＋、ｐＨ３）を含むメタノール／水（５７，５：４２．５）を用いて２２．５ｍ ｌ／分でクロマトグラフィ処理を行い、２１０ｎｍで検出した。８０〜９１分の 間に溶出する成分を集めて、等容の水で希釈し、洗浄して水で平衡にしだカラム に送液して戻した。カラムを水（２リツトル）で洗浄し、アセトニトリル／水（ ９：　１）で溶出した。溶出物を真空で蒸発させてアセトニトリルを除去し、水 性懸濁液を凍結乾燥し、表題化合物を白色粉末（２ｍｇ）として得た。ＦＡＢマ ススペクトル分析［Ｍ−ＨＥ　７０７、分子量約７０８、分子式ＣＨＦＯ重水素 化メタノール中で３５４５１４ゝ の５００　Ｍ　Ｈｚプロトンｎｍｒスペクトルでは下記のシグナルが見られる［ はぼ下記に中心を有するδ値、括弧内は多重線、カップリング定数（Ｈｚ）およ び積分値］　＝０．８３−０．９０　（ｍ、９Ｈ）、１．０３　（ｄ、７゜３Ｈ ）、２．１０　（ｓ、３Ｈ）、２．７２　（ｄｄ、１３゜６、ＬＨ）、４．００ 　（ｓ、ＩＨ）、４．９６　（ｓ。

ＩＨ）、５．０２　（ｓ、ＩＨ）、５．０７　（ｄ、５゜ＩＨ）、５．２４　（ ｓ、ＩＨ）、５．８３　（ｄ、１６゜ＩＨ）、６．　３１　（ｓ、ＩＨ）、６． 　８４’（ｄｄ、１６゜８、ＩＨ）、７．　００　（ｍ、ＩＨ）、７．　０９　 （ｄｔ。

１、　７．　ＬＨ）、７．　１８　（ｍ、ＩＨ）、７．　２８（ｄｔ、１．　７ ．　ＩＨ）　。

前記の発酵手順を、０−フルオロ安息香酸、ｍ−フルオロベンズアルデヒド、ｐ −フルオロベンズアルデヒド、０−ｌｍ−およびｐ−フルオロケイ皮酸および０ −１ｍ　−オヨヒｐ−フルオロフェニルアラニンを供給して繰り返した。各実験 から得たブロスの分析（高性能液体クロマトグラフィ／マススペクトル分析によ る）を行ったところ、式（１）の適当なｏ−ｌｍ−またはｐ−フルオロ置換化合 物の存在が認められた。各実験から得た所望の生成物のタイターを、下表に示す 。

化合物　供給物質　タイター（Ｉｌ１ｇ／Ｌ）実施例１（ａ） ｐ−フルオロケイ皮酸　１６ ｐ−フルオロベンズアルデヒド　５ ｐ−フルオロフェニルアラニン　１３ 実施例１（ｂ） ｍ−フルオロケイ皮酸　６７ ｍ−フルオロベンズアルデヒド　１５ ｍ−フルオロフェニルアラニン　３０ 実施例　１（ｃ） ０−フルオロ安息香酸　３０ ０−フルオロケイ皮酸　］］ ２０−フルオロフェニルアラニン　２ オートミール寒天上で、２５℃で２〜３週間成長させたコロニーの色は、コロニ ーの表面および裏面共に薄灰色からねずみ色（レイナーの菌類のカラーチャート 、１９７０年：迎邦農業局刊）をしていた。

オートミール寒天上で２５℃で生育した菌株の形態観察は、光学顕微鏡下で行っ た。この菌には、性的な生殖段階かなかったか、粉胞子器を形成したため、コエ ロミケス類に分類した。この菌は、疎菌糸および無隔膜および１個の隔膜を有す る分生子をａする嘴状粉胞子器を産生じた。この分生子は、大きさが約５〜９Ｘ １．５〜３μＭ（通常は、７〜９Ｘ１．５０２．５μＭ）であった。

厚膜胞子および初期粉胞子器に類似した多数の多隔膜／多細胞性の球状構造も観 察することができた。特異な網状厚膜胞子（ｄｉｃｔｙｏｃｈｌａｌＩｌｙｄｏ ｓｐｏｒｅｓ）はなかった。

この分離株は、Ｐ　ｋｌｏ　ｍ　ａ属の１種として認められ、この認定はＣＡ　 Ｂ　ＩｎｔｅｒｎａＬｉｏｎａｌ　Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ ｅによって確認された。

イン・ビトロの結果 本発明の化合物が酵素スクアレンシンターゼを阻害する能力を、Ｓ、Ａ、Ｂｉｌ 　Ｉｅｒら、Ｊ、　Ｍｅｄｉｃｌｎａｌ　Ｃｈｅ＋＊１ｓｔｒｙ、　３１（１０ ）、　１８６９−１８７１　（１９８８）に記載の分析条件と同じ条件で基質と して［２Ｃ］ファルネシルピロホスフェートを用いて証明した。［１４Ｃ］スク アレンを、薄層クロマトグラフィープレート上で未反応の基質から分離し、液体 シンチレーションカウント法によって測定した。スフアレンシンターゼの阻害は 、［２Ｃ］ファルネシルピロホスフェートの存在下で、ラット肝臓ホモジネート を本試験化合物の濃度を様々に変えたものと共にインキュベーションすることに よって定量した。３０分間の分析で［１４ｃ　３スクアレンの産生を５０％阻害 する化合物の濃度を、ＩＣ５ｏ値とした。

この試験では、実施例１（ａ）　、１（ｂ）　、１（ｃ）の表題化合物のＩＣ５ ｏ値は、Ｉ００ｎＭ００ｍあった。

製剤例 下記の実施例おいて、「活性成分」という用語は、本発明の化合物、例えば前記 の実施例に記載の化合物を表す。

実施例］−錠剤 （ａ）　活性成分　５．０ｍｇ 乳糖　９５．０ｍｇ 微品質セルロース　９０．０ｍｇ 架橋ポリビニルピロリドン　８．０ｍｇステアリン酸マグネシウム　２．０ｍｇ 圧縮重量　２００．０ｍｇ 活性成分、微品質セルロース、乳糖および架橋ポリビニルピロリドンを５００ミ クロンの篩を用いて整粒し、適当なミキサーで混合する。ステアリン酸マグネシ ウムを２５０ミクロンの篩を用いて整粒し、活性混合物と混合する。この配合物 を、適当なパンチを使用して圧縮する。

（ｂ）　活性成分　５．０ｍｇ 乳糖　１６５．０ｍｇ 予備ゼラチン化澱粉　２０．０ｍｇ 架橋ポリビニルピロリドン　８．０ｍｇステアリン酸マグネシウム　２．０ｍｇ 圧縮重量　２００．０ｍｇ 活性成分、乳糖および予備ゼラチン化澱粉を混合し、水で造粒した。湿ったマス を乾燥させ、微粉砕した。ステアリン酸マグネシウムおよび架橋ポリビニルピロ リドンを２５０ミクロンの篩を用いて整粒し、造粒物に混合した。こうして得た 配合物を適当な錠剤パンチを用いて圧縮する。

実施例２−カプセル （ａ）　活性成分　５．０ｍｇ 予備ゼラチン化澱粉　１９３．０ｍｇ ステアリン酸マグネシウム　２．０ｍｇ充填重量　２００．０ｍｇ 活性成分および予備ゼラチン化澱粉を、５００ミクロンの篩を用いて整粒し、混 合して、ステアリン酸マグネシウム（２５０ミクロンの篩で整粒したもの）によ り潤滑化する。この配合物を適当な寸法の硬質ゼラチンカプセルに充填する。

（ｂ）　活性成分　５．０ｍｇ 乳糖　１７７．０ｍｇ ポリビニルピロリドン　８．０ｍｇ 架橋ポリビニルピロリドン　８．０ｍｇステアリン酸マグネシウム　２．０ｍｇ 充填重ｆｌ　２００．Ｏｍｇ 活性成分および乳糖を混合し、ポリビニルピロリドンの溶液で造粒する。湿った マスを乾燥し、微粉砕する。

ステアリン酸マグネシウムおよび架橋ポリビニルピロリドンを２５０ミクロンの 篩を用いて整粒し、造粒物に混合する。こうして得た配合物を、好適な寸法の硬 質ゼラチンカプセルに充填する。

実施例３−シロップ 活性成分　５ｍｇ ヒドロキシプロピル メチルセルロース　４５ｍｇ プロピル ヒドロキシベンゾエート　１．５ｍｇ ブチルヒドロキシベンゾエート０．７５ｍｇサッカリンナトリウム　５ｍｇ ソルビトール溶液　１．０ｍｇ 適当な緩衝剤　適量 適当なフレーバー剤　適量 精製水を加えて、総量を１０．Ｏｍｌとする。

ヒドロキシプロピルメチルセルロースをヒドロキシベンゾエートと共に熱精製水 の一部に分散し、この溶液を室温まで放冷する。サッカリンナトリウム、フレー バー剤およびソルビトール溶液を、このバルク溶液に加える。

活性成分を残りの水の一部に溶解し、バルク溶液に加える。適当な緩衝剤を加え て、ｐＨを安定性が最大になるような領域に調節することができる。この溶液を 所定の容積にして、濾過し、適当な容器に充填する。

実施例４−鼻腔内溶液 （ａ）　防腐剤を加えた溶液 ２６重重量型量 活性成分　０．１ デキストロース（無水）５．０ 塩化ベンザルコニウム　０．０２ 適当な緩衝剤　適量 精製水を加えて総量を１００とする。

活性成分およびデキストロースをバルク溶液の一部に溶解する。適当な緩衝剤を 加えて、ｐＨを安定性が最大になるような領域に調節することができる。この溶 液を所定の容積にして、濾過し、適当な容器に充填する。

或いは、溶液は無菌の単位投与形態にして、処方から防腐剤を省いたものとして 提供することもできる。

（ｂ）防腐剤不含の無菌溶液 ％重量／重量 活性成分　０．　１ デキストロース（無水）　５．０ 適当な緩衝剤　適量 精製水を加えて総量を１００とする。

国際調査報告 ＃ｗｌＩＰＣＴハＳＡ／２＋０１蛸−ｖ藺−−−＋２トＰ６１１２１１　ｏ＆？ ＋国際調査報告 ＥＰ　９２００５０９ Ｓ＾　５７１０３ フロントベージの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、 ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ、　ＵＳ （７２）発明者　ノープル、デビット イギリス国ミドルセックス、グリーンフォード、バークレー、アベニュー（番地 なし）　グラクツ、グループ、リサーチ、リミテッド内 （７２）発明者　ヘイル、リチャード　スチーブンイギリス国ミドルセックス、 グリーンフォード、バークレー、アベニュー（番地な−い　グラクツ、グループ 、リサーチ、リミテッド内 （７２）発明者　サイドボトム、フィリップ　ジェームズイギリス国ミドルセッ クス、グリーンフォード、バークレー、アベニュー（番地なし）　グラクツ、グ ループ、リサーチ、リミテッド内 （７２）発明者　ホール、リチャード　マルコムイギリス国ミドルセックス、グ リーンフォード、バークレー、アベニュー（番地なし）　グラクツ、グループ、 リサーチ、リミテッド内

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．下記の式（Ｉ）有する化合物およびその塩。 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）（式中、 Ｒ１は水素原子またはアセチル基を表し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は各々独立に、水素 原子またはメチル基を表し、 ｎは１から３の整数を示し、 存在するフッ素原子は、分子の残りの部分に対してベンゼン環のオルト、メタま たはパラ位に結合することができる。）
2. ２．Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４が水素原子である、請求の範囲第１項に記載の化合物。
3. ３．Ｒ１がアセチル基であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４が各々水素原子であり、ｎが１ である、請求の範囲第１項に記載の化合物およびその塩。
4. ４．［１Ｓ−［１α（４Ｒ＊５Ｓ＊），３α，４β，５α，６α（２Ｅ，４Ｒ＊ ，６Ｒ＊），７β］］１−［４−アセトキシ−６−（４−フルオロフェニル）− ５−メチル−３−メチレンヘキシル］−４，６，７−トリヒドロキシ−２，８− ジオキサビシクロ［３，２，１］オクタン−３，４，５−トリカルボン酸，６− （４，６−ジメチル−２−オクテノエート）およびその塩。
5. ５．［１Ｓ−［１α（４Ｒ＊５Ｓ＊），３α，４β，５α，６α（２Ｅ，４Ｒ＊ ，６Ｒ＊），７β］〕１−［４−アセトキシ−６−（３−フルオロフェニル）− ５−メチル−３−メチレンヘキシル］−４，６，７−トリヒドロキシ−２，８− ジオキサビシクロ［３，２，１］オクタン−３，４，−トリカルボン酸，６−（ ４，６−ジメチル−２−オクテノエート）およびその塩。
6. ６．［１Ｓ−［１α（４Ｒ＊５Ｓ＊），３α，４β，５α，６α（２Ｅ，４Ｒ＊ ，６Ｒ＊），７β］］１−［４−アセトキシ−６−（２−フルオロフェニル）− ５−メチル−３−メチレンヘキシル］−４，６，７−トリヒドロキシ−２，８− ジオキサビシクロ［３，２，１］オクタン−３，４，５−トリカルボン酸，６− （４，６−ジメチル−２−オクテノエート）およびその塩。
7. ７．実質的に純粋な形態での、請求の範囲第１項〜第６項のいずれか一項に記載 の化合物。
8. ８．治療に用いられる、請求の範囲第１項〜第７項のいずれか一項に記載の化合 物。
9. ９．ヒトを含む動物における血漿コレステロール濃度の低下が有益である症状の 治療に用いられる、請求の範囲第１項〜第８項のいずれか一項に記載の化合物。
10. １０．ヒトおよびヒト以外の動物の患者における真菌感染症の治療に用いられる 、請求の範囲第１項〜第７項のいずれか一項に記載の化合物。
11. １１．ヒトまたはヒト以外の動物体の高コレステロール血症および／または高リ ボタンパク血症に関連した疾患または真菌性の疾患に対する治療法であって、ス クアレンシンターゼを抑制する請求の範囲第１項から第７項のいずれか一項に記 載の化合物の有効量を前記の個体に投与することを含んでなる方法。
12. １２．請求の範囲第１項から第７項のいずれか一項に記載の化合物を１種類以上 の担体および／または賦形剤とともに含んで成る、医薬組成物。
13. １３．請求の範囲第１項から第７項のいずれか一項に記載の化合物の活性量を含 んで成る、ヒトを含む動物における血漿コレステロール濃度の低下が有益である 症状の治療に用いられ、医薬組成物。
14. １４．請求の範囲第１項から第７項のいずれか一項に記載の化合物の活性量を含 んで成る、ヒトまたはヒト以外の動物患者の真菌感染症の治療に用いられる、薬 学組成物。
15. １５．経口、口腔、局所、非経口、移植、直腸、目、または泌尿生殖器への投与 に好適な形態、または吸入または吹送による投与に好適な形態の、請求の範囲第 １２項から第１４項のいずれか一項に記載の医薬組成物。
16. １６．単位投与形態の、請求の範囲第１２項から第１５項のいずれか一項に記載 の医薬組成物。
17. １７．ヒトまたはヒト以外の動物患者の高コレステロール血症および／または高 リボタンパク血症を治療するための医薬品の製造のための、請求の範囲第一項か ら第７項のいずれか一項に記載の化合物の使用。
18. １８．ヒトまたはヒト以外の動物患者における真菌感染症を治療するための医薬 品の製造のための、請求の範囲第一項から第７項のいずれか一項に記載の化合物 の使用。
19. １９．ＩＭ１３３２９６２またはその突然変異体をフルオロ安息香酸およびその 前駆体の存在下で培養した後、培養物から一つ以上請求の範囲第一項〜第７項の いずれか一項に記載の化合物を単離し、所望ならば脱アセチル化および／または メチルエステルヘの転換により、所望の化合物を提供する工程を含んで成る、請 求の範囲第一項から第７項のいずれか一項に記載の化合物の製造法。
20. ２０．請求の範囲第１９項に記載の方法により得ることのできる、架橋環状ケタ ール誘導体。
21. ２１．請求の範囲第１９項に記載の方法を含む方法により生産される、スクアレ ンシンターゼ阻害物質。
22. ２２．請求の範囲第２−項に記載の化合物の脱アセチル化誘導体およびそのメチ ルエステル。
23. ２３．実質的に本明細書に記載された、請求の範囲第一項から第７項のいずれか 一項に記載の化合物。
24. ２４．実質的に本明細書に記載された、請求の範囲第１２項から第１６項のいず れか一項に記載の組成物。