JPH06504775A - Novel γ-pyrones, γ-pyridones and γ-thiopyrones, their use as drugs and their production method - Google Patents
Novel γ-pyrones, γ-pyridones and γ-thiopyrones, their use as drugs and their production methodInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】 新規なγ−ピロン類、γ−ピリドン類及びγ−チオピロン類、それらの薬剤とし ての用途及びそれらの製造方法 本発明は、新規なγ−ピロン類、γ−ピリドン類及びγ−チオピロン類及びそれ らのウィルス性疾患の治療用薬剤としての用途に関する。[Detailed description of the invention] New γ-pyrones, γ-pyridones and γ-thiopyrones, and their drugs uses and their manufacturing methods The present invention provides novel γ-pyrones, γ-pyridones and γ-thiopyrones and The present invention relates to its use as a therapeutic agent for viral diseases such as these.
Ｂ型及びＣ型肝炎又はエイズのようなウィルス性疾患は、指数関数的に蔓延して きている。従って、抗ウィルス剤の開発は、経済的に極めて重要となってきてお り、薬剤の研究がこれに集中している。現在の抗ウィルス剤は、抗ウイルス活性 スペクトルが不十分であり、はとんどの場合、毒性が高いことが確認されている 。致命的な欠点として、適応性が不十分であること及び耐性ウィルス株の急速な 誘発が言及されている。Viral diseases such as hepatitis B and C or AIDS are spreading exponentially. coming. Therefore, the development of antiviral agents has become economically extremely important. Therefore, drug research is concentrating on this topic. Current antiviral agents have antiviral activity have been found to be poorly spectrum and highly toxic in most cases. . The fatal disadvantage is insufficient adaptation and the rapid development of resistant virus strains. Induction is mentioned.
抗ウイルス予防剤として、アマンタジン及びリマンタジンがインフルエンザウィ ルスに有効であり、メチサゾンが痘癒ウィルスに有効である。アマンタジン及び リマンタジンは毒性が低い。更に抗ウィルス剤として、イドキシウリジン、トリ フルオロチミジン、エチルデオキシウリジン及びヨードデオキシシチジンが知ら れており、これらは、特にある種の局所ヘルペス感染症について、局所用でのみ 適用することができる。しかしなが呟これらの物質の一部は毒性が強い。As antiviral preventive agents, amantadine and rimantadine are effective against influenza viruses. methysazone is effective against smallpox virus. amantadine and Rimantadine has low toxicity. Furthermore, as antiviral agents, idoxyuridine, Fluorothymidine, ethyldeoxyuridine and iododeoxycytidine are known These can only be used topically, especially for certain localized herpes infections. Can be applied. However, some of these substances are highly toxic.
アデニンアラビノシト及びシトシンアラビノシトは、著しい免疫抑制作用と多く の副作用を示す。例えば、これらは染色体変化を生じる。Adenine arabinocytes and cytosine arabinocytes have significant immunosuppressive effects and many Shows the side effects of For example, these result in chromosomal changes.
ブロモビニルデオキシウリジンは、単純ヘルペスウィルスｌ型及び他のある種ウ ィルスに良好な活性を有するが、単純ヘスイスウィルス２型には無効である。Bromovinyldeoxyuridine is effective against herpes simplex virus type I and some other It has good activity against viruses, but is ineffective against Hesuis simplex virus type 2.
同様に、アシクロビルは、ある種ヘルペスウィルスに良好な活性を示すが、サイ トメガロウィルスには無効である。ジヒドロキシブロボシメチルグアニンは、エ プスタイン−パールウィルス及びサイトメガロウィルスに活性を有するが、毒性 が著しい。Similarly, acyclovir has good activity against some herpesviruses, but Ineffective against tomegalovirus. Dihydroxybrobosimethylguanine is Active against Stein-Pearl virus and cytomegalovirus, but toxic is remarkable.
ホスホノホルメート、スラミン及びシトプシンは、特にＨＩＶに対して活性を示 すが、毒性か高い。Phosphonoformates, suramin and cytopsin are particularly active against HIV. However, it is highly toxic.
上記の物質の多くは、ウィルスチミジンキナーゼ、ウィルスポリメラーゼ又はウ ィルス逆転写酵素に対して活性である。これらの物質の多くに関しては、感染ウ ィルスが治療中でさえも耐性をもつようになったことが観察されてきた。Many of the substances listed above are associated with viral thymidine kinase, viral polymerase or active against viral reverse transcriptase. For many of these substances, infectious It has been observed that viruses become resistant even during treatment.
ごく最近では、硫酸デキストラン及び多硫酸ベントサンのようなポリアニオンが 、レトロウィルス、特にＨＩＶの逆転写酵素に特異的に影響することがわかっで きたことから、有効な物質であることが明らかにされた。即ち、ドイツ公開明細 書第３６０１１３６号には、哺乳動物におけるレトロウィルス感染症の予防及び 治療用として無機アニオン基含有有機ポリマーの用途が記載されている。More recently, polyanions such as dextran sulfate and bentosan polysulfate have been , has been found to specifically affect the reverse transcriptase of retroviruses, especially HIV. It was revealed that it is an effective substance. i.e. German published details No. 3601136 describes the prevention and prevention of retrovirus infections in mammals. The use of organic polymers containing inorganic anionic groups for therapeutic purposes has been described.
欧州公開明細書第０．２９３．８２６号には、硫酸化多糖類のエイズに対する治 療及び予防活性が記載されている。European Publication No. 0.293.826 describes the use of sulfated polysaccharides as a treatment for AIDS. Therapeutic and prophylactic activities have been described.
本発明の技術的課題は、毒性が低く、比活性が高く、適応性が良好であり、耐性 ウィルス株を誘発しつる傾向が最も低い抗ウィルス剤を提供することである。The technical problems of the present invention are to achieve low toxicity, high specific activity, good adaptability, and resistant It is an object of the present invention to provide an antiviral agent that has the lowest tendency to induce virus strains.
この課題は、式（Ｉ）の化合物を用いることにより解決される。This problem is solved by using compounds of formula (I).
式中、Ｒｔ及びＲｔはＨ１分分枝れた又は分枝されないＣ１〜Ｃ１＠ｓ好ましく はＣ１〜Ｃｓアルキル基、Ｃ１〜Ｃ２１アルケニル基、Ｃ＋〜Ｃ！・アルキニル 基又はその組み合わせであり、Ｒ８は分枝された又は分枝されないＣ１〜Ｃｐｓ アルキル基であり、Ｒ９はＣ３〜Ｃ１−シクロアルキル基、分枝された又は直鎮 のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であり、Ｒｔ ＳＲｔ及びＲ１の メチレン基の水素原子を０−アルキル（ＣＩ−Ｃｓ）基、０−アシル基、０−ア リール基、０−アラルキル基及びアルキル（Ｃ，〜Ｃ１）基に置き換えてもよく 、Ｒ４のメチレン基の水素原子は更にハロゲノ基、二重結合オキソ基及びヒドロ キシ基に置き換えてもよく、Ｚは相互に独立してＯｌＳ又はＮＨであり、但し、 Ｒｔ”ＨのときＲ１！’Ｈであり、Ｒｔ＝ＨのときＲｔ＋Ｈであり、また下記化 合物は除外され、Ｎｏ、 Ｒｔ Ｒｔ Ｒｓ Ｘ Ｙ Ｉ ＨＨＭｅ ）Ｉｔ ＨＩ ２ ＨＨ）Ｉ ＨＩ Ｈヨ ３ ＨＨＭｅ Ｈｚ Ｈ，０Ａｃ ４ Ｍｅ ＨＭｅ Ｈｔ ＝０ ５ Ｍｅ ＨＭｅ Ｈｔ Ｈ，ＯＨ ６Ｍｅ ＨＭｅ ＨＩ １（，０Ａｃ ７ Ｍｅ Ｍｅ Ｍｅ ）Ｉｔ Ｈ，Ｏ＾Ｃ８ＨＨＣＨｔＯＡｃ ＨＩＨｔ ９ ＨＨＭｅ Ｈ１＝０ １０ Ｍｅ ＨＨＨｚ Ｈｔ ｌｌ Ｍｅ ＨＭｅ ＨＩ Ｈ２ １２ＨＨＨ：ＯＨＩ １３ ＨＨＭｅ ＝ＯＨＩ １４ Ｍｅ ＨＨ＝ＯＨＩ １５ Ｍｅ ＨＭｅ ：ＯＨｔ 同様に下記化合物も除外される。In the formula, Rt and Rt are preferably H1-branched or unbranched C1-C1@s is a C1-Cs alkyl group, a C1-C21 alkenyl group, C+-C!・Alkynyl group or a combination thereof, R8 is branched or unbranched C1-Cps is an alkyl group, R9 is a C3-C1-cycloalkyl group, branched or straight is an alkyl group, alkenyl group or alkynyl group, and Rt SRt and R1 are The hydrogen atom of the methylene group is replaced by a 0-alkyl (CI-Cs) group, 0-acyl group, or 0-acyl group. May be replaced with lyl group, 0-aralkyl group and alkyl (C, ~C1) group , the hydrogen atom of the methylene group of R4 is further a halogeno group, a double bond oxo group, and a hydro may be replaced by an xy group, Z is mutually independently OlS or NH, provided that When Rt”H, R1!’H, when Rt=H, Rt+H, and the following Compounds are excluded, No, Rt Rt Rs X Y I HHMe )It HI 2 HH) I HI H yo 3 HHMe Hz H,0Ac 4 Me HMe Ht = 0 5 Me HMe Ht H,OH 6Me HMe HI 1(,0Ac 7 Me Me Me ）It H,O^C8HHCHtOAc HIHt 9 HHMe H1=0 10 Me HHHz Ht ll Me HMe HI H2 12HHH:OHI 13 HHMe = OHI 14 Me HH=OHI 15 Me HMe ：OHt Similarly, the following compounds are also excluded.
１４ Ｍｅ ＨＨ：ＯＨｇ Ｉ２ Ｍｅ ＨＭｅ ＝ＯＨｔ これらの化合物は、哺乳動物におけるウィルス性疾患、好ましくはレトロウィル ス性疾患の治療用薬剤に調製で用いることができる。14 Me HH:OHg I2 Me HMe =OHt These compounds are suitable for the treatment of viral diseases in mammals, preferably retroviruses. It can be used in the preparation of drugs for the treatment of sexually transmitted diseases.
γ−ピロン誘導体は、デヒドロ酢酸から出発してメチル３．５−ジオキソヘキサ ノエートを経て得ることができる。対応して置換されたアセト酢酸誘導体からデ ヒドロ酢酸が生成される。デヒドロ酢酸をマグネシウムメタル−トと反応させる と、対応して置換されたメチル３．５−ジオキソヘキサノエートが得られ、これ を更に、例えば、ＣＨ酸性位置でアルキル化することにより誘導することができ る。γ-pyrone derivatives are produced by starting from dehydroacetic acid with methyl 3,5-dioxohexane. Can be obtained through Noate. Decomposition from correspondingly substituted acetoacetic acid derivatives Hydroacetic acid is produced. Reacting dehydroacetic acid with magnesium metalate and the correspondingly substituted methyl 3,5-dioxohexanoate, which can be further derived, for example, by alkylation at the CH acidic position. Ru.
これを再環化工程に続ける。ＤＢＵを環化試薬として用いることが好ましい。こ の方法において、側鎖を修飾すると対応する種類の構造を生じる（Ｐ、 Ｗａｎ ｇｅｍａｎｎ、Ｐｈ、Ｄ、 Ｔｈｅｓｉｓ １ｌｅｒｌｉｎ 、 １９８９、” ５ｙｎＬｈｅｓｅ ｖｏｎ ７−Ｐｙｒｏｎｅｎ ａｕｓ Ｐｏｄｏｌｅｐ奄■ ｈｉｅｒａｃｉｏｉｄｅｓ”）。This is followed by a recyclization step. Preferably, DBU is used as the cyclization reagent. child In the method, modification of the side chain results in the corresponding type of structure (P, Gemann, Ph, D, Thesis 1lerlin, 1989,” 5ynLhese von 7-Pyronen aus Podolep奄■ hieracioides”).
アルコキシ官能基の存在しないγ−ピロン構造は、カルボン酸又はその誘導体の 轄合により得られる（＾、Ｎ、 Ｓａｇｒｅｄｏｓ等、Ｌｉｅｂｉｇｓ Ａｎｎ 、Ｃｈｅｍ、 ７０６．９０−９４ 、Ｖ。A γ-pyrone structure without an alkoxy functional group is a carboxylic acid or its derivative. (^, N, Sagredos et al., Liebigs Ann , Chem, 706.90-94, V.
１．６９ヱ、 ｐＨ，１１１−１１５） ｏ Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａ ｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、巨旦、 １７９６−１７X９（１９７ ８）には、本発明により特許が請求された構造に対して出発物質であるピロノン をアルキル化する方法が記載されている。1.69ヱ, pH, 111-115) o Canadian Journal l of Chemistry, Kyotan, 1796-17X9 (197 8) contains the starting material pyronone for the structure claimed by the present invention. A method for alkylating is described.
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｆｔ、 （１９７６）２１６７及び例えばＪ、Ｏ ｒｇ、Ｃｈｅｍ、 ４３．４９６６（１９７８）には、チオピラン−４−チオ誘 導体の製造が記載されている。Ｌｉｅｂｉｇｓ Ａｎｎ、 Ｃｈｅｗ、 （１９ ８２）ｐｐ、 １４６６−１４７７において、Ｇ、 Ｖｏｓｓ及びＨ，Ｇｅｒｌ ａｃｈは、ガラス封管中で加熱して対応するピロンをアンモニアとメタノール中 で反応させることによる窒素類似ピロンの合成を記載している。Tetrahedron Left, (1976) 2167 and e.g. J.O. rg, Chem, 43.4966 (1978) describes thiopyran-4-thio derivatives. The manufacture of conductors is described. Liebigs Ann, Chew, (19 82) pp. 1466-1477, G. Voss and H. Gerl. ach is prepared by heating the corresponding pyrone in ammonia and methanol in a glass sealed tube. describes the synthesis of nitrogen-like pyrones by reacting with
式（１）の化合物の製造は、オーストラリア植物区系ボドレピス（＾ｕｓｔｒａ ｌｉａｎＰｏｄｏｌｅｐｉｓ）種、特にボドレピスロンギペダタＡ（Ｐｏｄｏｌ ｅｐｉｓ ＩｏｎｇｉｐｅｄａｔａＡ）及びポドレピスルガタ（Ｐｏｄｏｌｅｐ ｉｓ ｒｕｇａｔａ）の根茎並びにポドレピスヒエラシオイデス（ＰｏｄｏＩｅ ｐＩｓ ｈｉｅｒａｃｉｏｉｄｅｓ）から化合物（ＩＩ）を単離することにより 行うこともできる。これらの物質は、有機溶媒中で抽出し、引き続きクロマトグ ラフィーを用いて精製及び抽出処理することにより回収される。Ｆ、Ｂｏｈｌｍ ａｎｎ等、Ｐｔ＋ｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。The compound of formula (1) can be produced using Australian Bodrepis (^ustra). lian Podolepis) species, especially Bodolepis longipedata A (Podolepis epis Iongipedata A) and Podolep rugata (Podolep is By isolating compound (II) from pIs hieracioides) You can also do this. These substances are extracted in organic solvents and subsequently chromatographed. It is recovered by purification and extraction using roughy. F.Bohlm ann et al., Pt+ytochemistry.
Ｖｏｌ、２６、ｆｌｐ、 １８７−１９０（１９８７）及びＪ、 Ｊａｋｕｐｏ ｖｉｃ等、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 Ｖｏｌ、２８Aｐｐ。Vol, 26, flp, 187-190 (1987) and J, Jakupo vic et al., Phytochemistry, Vol. 28 App.
３４９７−３５０１（１９８９）に記載されている手順に準じる。3497-3501 (1989).
この方法で得られた物質を、試験系において抗ウィルス活性について試験する。The substances obtained in this way are tested for antiviral activity in a test system.
試験系として、旧ソー感染血液細胞中のウィルス複製の判定を用いた。この系は 、ウィルス複製及び感染の可能性を妨害する抗ウイルス物質を検出することがで きる。このような物質は、ウィルス粒子が細胞内部に侵入しないように防御し、 即ち、以前に感染した細胞内で増殖したウィルスはもはや新しい標的細胞を見出 すことができない。この方法で、ウィルス性疾患に対する効果的な予防が可能で あり、細胞内部へのウィルスの侵入を防御する治療が始められる。結果として、 感染が中断され、治療の目的が迅速且つ簡単に達成される。更に抗ウィルス剤の 細胞内の作用部位を、例えば、感染ピリオンの、いわゆる脱外皮物又は放出物と して考えることもできる。As a test system, the determination of virus replication in blood cells infected with old Thor was used. This system is , capable of detecting antiviral substances that interfere with viral replication and the possibility of infection. Wear. These substances protect virus particles from entering cells, That is, a virus that has multiplied in previously infected cells can no longer find new target cells. I can't do it. This method provides effective prevention against viral diseases. Yes, treatment can be initiated to prevent the virus from entering cells. as a result, The infection is interrupted and the goals of treatment are achieved quickly and easily. Furthermore, antiviral drugs The site of action within the cell is, for example, a You can also think about it.
抗ウイルス試験系は、モデルウィルス（ＨＩＶ）に対して、作用の分子位置又は 機構は未知であるが、抗ウィルス活性を有する物質の全てを示すように設計され ている。抗ウイルス物質に対して可能性のある標的部位についての感受性、特異 性及び広いスペクトルに、試験系の強い点が見られる。即ち、試験系は、プロテ アーゼインヒビター及びＲＴ阻害物質又は宿主細胞によるウィルス受容遮断薬を 示すものである。同様に、広い活性スペクトルを有するポリアニオンのようなウ ィルスの種類を越えて作用する活性物質は、確実に検出される。形質転換されな いヒト末梢血液細胞を用いることにより、感受性が高くなる。Antiviral test systems test the model virus (HIV) by determining the molecular location of the action or Although the mechanism is unknown, all substances are designed to exhibit antiviral activity. ing. Sensitivity and specificity of potential target sites for antivirals The strengths of the test system can be seen in its characteristics and broad spectrum. That is, the test system ase inhibitors and RT inhibitors or drugs that block virus reception by host cells. It shows. Similarly, polyanions such as polyanions with a broad spectrum of activity Active substances that act across virus types are reliably detected. not transformed Sensitivity is increased by using fresh human peripheral blood cells.
この系は、いわゆる主要構造、即ち、基本構造パターンを有する新規な種類の抗 ウイルス活性物質の検出に特に適し、これらの化学誘導体は、薬理的、この場合 には、抗ウイルス特性に影響を及ぼすものである。即ち、主要構造は、これらの 誘導体の合成を目的とする基本構造である。This system represents a novel class of resistors with so-called primary structures, i.e. basic structural patterns. Particularly suitable for the detection of viral active substances, these chemical derivatives are pharmacological, in this case have an effect on antiviral properties. That is, the main structures are these This is the basic structure for the purpose of synthesizing derivatives.
本試験において、本発明によるγ−ピロン類は抗ウィルス活性が顕著であった。In this test, the γ-pyrones according to the present invention had remarkable antiviral activity.
１／２最大細胞毒性濃度の１／１０より少ないｌＯμモルの濃度において、ヒト リンパ球をＨＩＶに露出した４日後にＨＩＶ複製の低下が見られた。即ち、驚く べきことに、共通の基本構造の特徴がγ−ピロン構造である新規な種類の抗ウイ ルス物質が発見された。At a concentration of 10 μM less than 1/10 of the 1/2 maximum cytotoxic concentration, human A decrease in HIV replication was seen 4 days after exposing lymphocytes to HIV. i.e. surprised Ideally, a new class of antiviral drugs whose common basic structural feature is the γ-pyrone structure has been developed. Rusu substance was discovered.
実施態様： 抽出により、オーストラリア区系ポドレピスヘラシオイデスから表１の７−ピロ ン類を回収し、引き続き、クロマトグラフィーにより精製した。Implementation: By extraction, the 7-pyro in Table 1 was extracted from the Australian Podrepis heracioides. The compounds were collected and subsequently purified by chromatography.
Ｎｏ、 ＲＩ Ｒ１ＲＩ Ｘ Ｙ 活性Ｉ ＨＨＭｅ ｎｌ Ｈｌ ＋ ２ ＨＨＨＨｌ ｔ＋＊ ＋ ３ ＨＨＭｅ Ｈｌ Ｈ，ＯＡＣ＋＋ ４ Ｍｅ ＨＭｅ Ｈｌ ：Ｏ＋＋ ５ Ｍｅ ＨＭｅ Ｈｌ Ｈ，Ｏｌｌ ＋６ Ｍｅ ＨＭｅ Ｈｌ Ｈ，ＯＡＣ ＋７ Ｍｅ Ｍｅ Ｍｅ Ｈｌ ＩＩ、０＾Ｃ＋８ Ｈｌ（ＣＨ，ＯＡＣＨｌ Ｈｌ ９ ＨＨＭｅ Ｈｌ ＝Ｏ＋ １０ Ｍｅ ＨＨＨｚ Ｈｚ − １１Ｍｅ ＨＭｅ Ｈｌ Ｈｚ ＋ １２ ＨＨＨ：ＯＨｇ Ｉ２ ＨＨＭｅ ＝Ｑ ）Ｉｔ ＋ １４ Ｍｅ ＨＨ：ＯＨｚ ＋ １５ Ｍｅ ＨＭｅ ；ＯＨｔ ４ 表１は、回収された物質と次のように測定されたそれらの抗ウィルス活性を示す ものである： 細胞培養におけるＨＩＶ増殖の物質誘発阻害は、ウィルス構造タンパク質（ｐ２ ４）及びウィルス核酸（）！ＩＶ ＲＮＡ）の量的定量によりめられる。ウィル ス増殖にはヒトリンパ球の培養が用いられる。No, RI R1RI X Y Active I HHMe nl Hl + 2 HHHHHl t＋＊ ＋ 3 HHMe Hl H, OAC++ 4 Me HMe Hl: O++ 5 Me HMe Hl H, Oll +6 Me HMe Hl H, OAC +7 Me Me Me Hl II, 0^C+8 Hl (CH, OACHl Hl 9 HHMe Hl = O+ 10 Me HHHz Hz - 11Me HMe Hl Hz + 12 HHH:OHg I2 HHMe = Q) It + 14 Me HH:OHz + 15 Me HMe ;OHt 4 Table 1 shows the recovered substances and their antiviral activity determined as follows. is: Substance-induced inhibition of HIV proliferation in cell culture is associated with viral structural proteins (p2 4) and viral nucleic acids ()! IV RNA). Will Culture of human lymphocytes is used for proliferation.
１〇−溶液の調製に続いて、前の細胞毒性試験で近似値として決定された非毒性 濃度まで培養培地中の連続希釈度１：１０で試験されるべき物質を調整する。10 - Following the preparation of the solution, the non-toxicity determined as an approximation in the previous cytotoxicity test Prepare the substance to be tested in serial dilutions 1:10 in culture medium up to concentration.
ドナー血液からヒトリンパ球を単離し、密度勾配遠心分離により血液容器の軟膜 からリンパ球を回収する。Isolate human lymphocytes from donor blood and remove the buffy coat of blood containers by density gradient centrifugation. Collect lymphocytes from.
Ｌ３ガイドラインを満たす安全な実験室において、細胞にヒト免疫不全ウィルス （Ｈｍを感染する。引き続き、感染細胞を試験されるべき物質の存在下３７℃で ４日間５駕ＣＯｔを含む水蒸気飽和雰囲気下でインキュベートする。human immunodeficiency virus in cells in a safe laboratory that meets L3 guidelines. The infected cells are then incubated at 37°C in the presence of the substance to be tested. Incubate for 4 days in a water vapor saturated atmosphere containing 5 tons of COt.
リンパ球の感染後にウィルス産生細胞によって培養上清に分泌されるＨＩＶ−特 異的コアタンパク質ｐ２４の濃度を“サンドイッチエリザ試験でめ、光度測定的 に評価する。検定曲線及び試験されるべき物質の存在下で増殖された）ＩＩＶ− 感染リンパ球の培養により表される得られた吸収値からタンパク質ｐ２４濃度が 計算される。ｐ２４生産の物質誘発阻害は、未処理の対照培養との比較による％ として計算される。HIV-specific secreted by virus-producing cells into the culture supernatant after infection of lymphocytes. Concentrations of the heterologous core protein p24 were determined by the “sandwich ELISA test” and photometrically. Evaluate. IIV- grown in the presence of the calibration curve and the substance to be tested The protein p24 concentration was determined from the absorption values obtained by culturing infected lymphocytes. Calculated. Substance-induced inhibition of p24 production is expressed as % compared to untreated control cultures. It is calculated as
感染リンパ球中に形成されたＨＩＶ ＲＮＡは、核酸ハイブリッド形成により検 出され、光度測定的に評価する。検定曲線及び試験されるべき物質の存在下で増 殖された旧ソー感染リンパ球の培養により表される得られた吸収値からＨＩＶＲ ＮＡ濃度が計算される。ＨｒＶ ＲＮＡ生産の物質誘発阻害は、未処理の対照培 養との比較による％として計算される。HIV RNA formed in infected lymphocytes can be detected by nucleic acid hybridization. and evaluated photometrically. calibration curve and increase in the presence of the substance to be tested. HIV NA concentration is calculated. Substance-induced inhibition of HrV RNA production was observed in untreated control medium. Calculated as a % compared to nutrition.
感染細胞の生存度は、トリバンブルー法によりめられる。試験されるべき物質の 存在下で４日間培養された感染細胞をトリバンブルーの溶液で処理する。顕微鏡 分析において計数により青色に着色した死細胞の割合をめる。生存度は、全細胞 と死細胞の差によって得られ、同様に％で示される。The viability of infected cells is determined by the Trivan blue method. of the substance to be tested Infected cells that have been cultured for 4 days in the presence of trivan blue are treated with a solution of trivan blue. microscope In the analysis, the percentage of dead cells colored blue is determined by counting. Viability is whole cell and dead cells, and is likewise expressed in %.
図１は、表１の化合物４についてのタンパク質２４阻害、ＨＩＶ ＲＮＡ阻害及 び生存度の用量／活性関係を示すものである。Figure 1 shows protein 24 inhibition, HIV RNA inhibition and Figure 2 shows the dose/activity relationship for survival and viability.
表２は、種々の単離ＨＩＶ物質に対する表１の化合物３．４．６及び７の効果を 、ＨＩＶに対して完全に確定されている活性物質としてアジドチミジン（ＡＺＴ ）とテトラヒドロイミダゾールベンゾジアゼピン（ＴＩＢＯ）と比較して示すも のである。Table 2 shows the effects of compounds 3.4.6 and 7 of Table 1 on various isolated HIV substances. , azidothymidine (AZT) as a fully defined active substance against HIV. ) and tetrahydroimidazole benzodiazepine (TIBO). It is.
化合物 濃度 ＨＩＶ−１標準 ＨＩＶ−Ｉ ＡＺＴ耐性 ＨＩＶ−２（３日、 ｎｇ ｐ２４／ｍｌ） （３日、ｎｇ ｐ２４／ｍｌ） （４日、ｐｇ ＩＩＮ ＾／■１）対照 ０ ５５．７ ４８．９ ３３３１００ ｎｇ／ｍｌ Ｏ２１ ，００ ＡＺＴ １０ 〃１５．９ ４３．２ １４１１〃３７．８ ４７．１ ２９８ ０、ｌ〃５８．８ ４７．９ ２８３ １００ ｎＭ Ｏ４２，９５８３ ＴＩＢＯ１０〃７．２ ４６．８ ４６５ｎ、ｄ、； 測定せず 転写酵素インヒビターに対して著しい耐性を示し、これらのインヒビターの２種 、即ち、逆転写酵素のヌクレオシド類似体インヒビターとしてアジドチミジン（ ＡＺＴ）及び非ヌク レオシト類似インヒビターとしてテトラヒドロイミダゾー ルベンゾジアゼピン （ＴＩＢＯ）を本試験の比較物質として共に含めた。更に 、単離ＨＩＶ２物質に対するこれらの化合物の活性を試験した。対応して、ＡＺ Ｔ及びＴＩＢＯを比較物質として共に含め、ＴＩＢＯは、既知のことであるが、 測定データからもわかるように単離ＨＩＶＩ物質に対して選択的活性を有する。Compound concentration HIV-1 standard HIV-I AZT resistance HIV-2 (3 days, ng p24/ml) (3 days, ng p24/ml) (4 days, pg IIN ^/■1) Control 0 55.7 48.9 333100 ng/ml O21 ,00 AZT 10 15.9 43.2 1411 37.8 47.1 298 0, l〃58.8〃47.9 283 100 nM O42,9583 TIBO10 7.2 46.8 465n, d; Not measured It shows significant resistance to transcriptase inhibitors, and two of these inhibitors , i.e., azidothymidine ( AZT) and tetrahydroimidazole as a non-nuc rheocyto-like inhibitor. Rubenzodiazepine (TIBO) was also included as a comparison substance in this study. Furthermore , tested the activity of these compounds against isolated HIV2 material. Correspondingly, AZ T and TIBO were included together as comparators, with TIBO being known to As can be seen from the measurement data, it has selective activity against isolated HIVI substances.
表２は、表１の化合物３．４．６及び７がＨＩＶ２に感染した細胞及びＡＺＴ〜 耐性単難物質に感染した細胞の両ウィルス複製を阻害することを明らかに示して いる。Table 2 shows that compounds 3.4.6 and 7 of Table 1 were used in cells infected with HIV2 and AZT~ It was clearly shown that the virus inhibits replication of both viruses in cells infected with resistant substances. There is.
工 国際調査報告 フロントページの続き （５１）Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号 庁内整理番号ＣＯ７Ｄ ３３５１０２ ７ ２５２−４Ｃ（７２）発明者 ミュラー−クールト ルッツドイツ連邦共和国 デー１０００ ベルリン２２ ヴーブリッッヴエーク １２アー゛Ｉ （７２）発明者 イメルマン アンドレアスドイツ連邦共和国 デー４０００ デュッセルドルフ １２ ヴエンシュトラーセ １５８engineering international search report Continuation of front page (51) Int, C1, 5 identification symbol Internal reference number CO7D 335102 7 252-4C (72) Inventor Muller-Kurt Lutz Federal Republic of Germany Day 1000 Berlin 22 Vivlivequake 12 AR゛I (72) Inventor Immelmann Andreas Federal Republic of Germany Day 4000 Düsseldorf 12 Wuenstrasse 158
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