JPH06500699A

JPH06500699A - 新規なエンドペプチダーゼ

Info

Publication number: JPH06500699A
Application number: JP4510877A
Authority: JP
Inventors: ザスロフ，マイケル，エイ．; レズニック，ニコル，エム．
Original assignee: ザチルドレンズホスピタルオブフィラデルフィア
Priority date: 1991-04-12
Filing date: 1992-04-10
Publication date: 1994-01-27
Also published as: CA2083702A1; IL101573A0; EP0533913A4; NZ242341A; AU650150B2; US5518912A; AU1900492A; EP0533913A1; WO1992018516A1

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】この発明は、タンパク質分解酵素、更に詳しくは実験用の蛙（Ｘｅｎｏｐｕｓ　１ａｅｖｉｓｌの皮膚から抽出されたタンパク質分解性のエンドペプチダーゼに関する。

発明の背景ホルモンおよび神経ペプチドの初期合成、すなわち大型ポリペプチド前駆体としての合成は、酵母菌から哺乳類に到る生体内で認識される広範な現象である。生物活性分子のプロペプチド構造からの翻訳後遊離には、真核細胞を経由して保存されると想定される酵素を処理する主体者が必要である。

成熟ペプチドおよびホルモン生成の初期段階、即ち内部タンパク質分解による開裂段階においては、配列特異性が要件であると推定される。既に、若干の再生アミノ酸配列形態に対して特異的な内部タンパク質分解酵素が、プロペプチドおよびプロホルモンポリペプチド内で特定され、これらが分離され、かつその基質認識部位が研究され、以下の文献に記載されている。

（Ｃｈｅｃｌｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　ｒ鼠脳シナプス膜からの新規なニューロテンシン分解ペプチダーゼの精製および特性Ｊ　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　（：ｈｅｍ。

２６１、１１２７４−１１２８１　（１９８６１；　Ｃｌａｍａｇｉｒａｎｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　ｒ塩基性アミノ酸対に存するプロオシドシン／ニューロフィシンを開裂するウシ神経分泌顆粒からの内部タンパク質分解酵素の部分精製と機能的性質Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２６．６０１８−６０２３　（１９８７１；　Ｇｌｕｃｈａｎｋｏｆ、　ｅｔ　ａＬ、、ｒ内部タンパク質分解酵素により塩基性アミノ酸対に存するペプチドプロホルモンを選択処理する際のペプチド基質構造の役割Ｊ　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　２３４．１４９−１５２　ｆ１９８８ｉ）　、その−例は通常Ｌｙｓ−ＡｒｇもしくはＡｒｇ−Ａｒｇである塩基対残基に特異的なエンドペプチダーゼ、および単一プロリンであることを特徴とする開裂部位である。−塩基残基認識部位もまた、ペプチド結合をアミノ基もしくは単一アルギニン、あるいはリジンのカルボキシル端末サイドのいずれかに加水分解する特殊なタンパク質分解酵素を誘引することが発見されている。

生理学的プロペプチド及びプロホルモンは、複数個の開裂部位と、未だ加水分解されない認識部位より成る多数のアミノ酸配列を含む場合が多い、推定される配列特異性のエンドペプチダーゼは、若干のペプチド結合を選択的に加水分解させ、その他の共通部位をそのままに残す可能性がある。さらに組織特異性処理過程により、内部タンパク質分解酵素で、成る１つの特定組織内にペプチド結合を形成させ、他の組織には形成させないことも可能と見られる。［Ｌｏｈ、　ｅｔ　ａｌ、、　ｒ神経ペプチド処理およびその他の神経機能におけるタンパク質分解現象Ｊ　Ａｎｎｕ。

Ｒｅｖ、　Ｎｅｕｒｏ、　７．１８９−２２２　（１９８４１］付加的なパラメータを適用すれば、明らかにエンドペプチダーゼの基質認識が可能であり、また高次の構造がクリティカルな役割を果たすことが多くの研究者によって一致して認められている。

タンパク質分解処理を研究するよう企図された数多くの実験システムにおいて、 −次配列のみでは、所与の酵素により加水分解されるペプチド結合の選択性を説明することはできない。

このため内部タンパク質分解酵素の基質の特異性を実証付ける数多くの報告では、二次構造により演じられる明白な役割を認めている。［Ｂｅ１ｎｆｅｌｄ、ｅｔ　ａｌ、、　ｒ単一アルギニン残基よりソマトスタチン−２８を生成するラットの小腸粘膜分泌粒から得られる内部タンパク質分解酵素の特性Ｊ　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ　２６４゜４４６０−４４６５（１９８９１、Ｇｌｕｓｃｈａｎｋｏｆ、ｅｔ　ａｌ、、５ｕｐｒａ（１９８８１１より最近には、ペプチド処理を支配する構造特性は、ｃＤＮＡｓ　（相補的ＤＮＡ）の部位指向突然変異誘発により修飾された短縮合成類似体もしくは前駆体ポリペプチドとして定量されることで、試験が行われてきている＊　［Ｂｒａｋｃｈ、ｅｔ　ａｌ、、　ｒ内部タンパク質分解酵素による処理はペプチド・プロホルモンの開裂部位における構造特性を認識する。Ｊ　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ　２６４，１５９１２−１５９１６（１９８９１゜Ｄｏｃｈｅｒｔｙ、ｅｔ　ａｌ、、　ｒプロインシュリンの部位指向突然変異誘発により規定されるプロインシュリン・エンドペプチダーゼ基質の特異性Ｊ　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６４．１８３３５−１８３３９　ｆ１９８９１、　Ｇｏｍｅｚ、ｅｔ　ａｔ、、ｒ部位特定突然変異誘発はプロホルモン処理にクリティカルであるアミノ酸残基を識別するＪＥＭＢＯＪ。

８、２９１１−２９１５　（１９ｇ９１．およびＴｈｏｒｎｅ、　ｅｔ　ａｌ、　ｒインシュリン細胞プロホルモン処理酵素の開裂部位特異性についての生体内特性Ｊ　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ、　２６５．８４３６−８４４３（１９９（１１１この種の研究は通常、基質の感受性に影響を与える開裂部位もしくはその近傍で特定残基を識別する場合にのみ成功し、またその基質の全構造に対するアミノ酸による寄与は評価されない。

二塩基残基により特徴づけられる開裂部位におけるＢ−旋回の確度の高さが、この特殊な構造的主題に新たな関心を向けるのに役立ったことを、ある統計分析が明らかにしたｅ　［Ｒｈｏｌａ＋ｍ、ｅｔ　ａｌ、ｒペプチド・ホルモンの前駆体はタンパク質分解処理部位において特性を形成する共通の二次構造を共有する」。

ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　２０７．ｌ−６ｆ１９８６１］この観察は合成基質内の開裂部位においてそのような配座の採用に関し、残基の導入もしくは欠失が影響するものと想定されることにより、直接的な挑戦を受けている。［Ｂｒａｋｃｈ、ｅｔ　ａｌ、、５ｕｐｒａ　１９８９　；　Ｇｏｍｅｚ　ｅｔ　ａｌ、、５ｕｐｒａ１９８９　］より最近では、既知のプロホルモンに塩基開裂部位において知られる“オメガループ（長い非構造ループ）の発生を予言するよう企図されたコンピューター・アルゴリズムは加水分解された結合が同様にこの配座という主題とまさに関連づけられることを示したｍ　［Ｂｅｋ、ｅｔ　ａｌ、、ｒプロホルモン部位はオメガループと関連するＪ　８ｉｏｃｈｅｍ、　２９，１７８−１８３（１９９［１１］　Ｌかしながら、ポリペプチドの残存領域による構造的寄与は事実上無視され、巨大ポリペプチドを操作する際に生じる困難に起因し、試験されないままになることがある。

配列独立処理の一つの標本モデルは、分泌タンパク質のシグナル・ペプチドの部位、およびミトコンドリアタンパク質の標的を特定するリーダー配列に含まれるペプチダーゼの行動である。［ｖａｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ、ｅｔ　ａｌ、＋　ｒシグナル配列開裂部位の近傍でのアミノ酸のパターンＪ　Ｅｕｒｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３３．１７−２１ｆ１９８３１゜Ｂｕｆｆａｕｄ、ｅｔ　ａｌ、Ａシグナル・ペプチダーゼは分泌タンパク質の開裂部位において構造特性を認識するＪ　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ■、２６３．１０２２４−１０２２８　（１９８ｇ＋　、およびＦｏｌｚ、ｅｔ　ａｌ、、　ｒ真核シグナル・ペプチダーゼの基質特異性Ｊ　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６３，２０７０−２０７８＋１９８８＋　］　Ｌかしながら、分泌タンパク質のシグナル・ペプチドに特有な疎水性コア・ドメインおよび陽電荷アミン端末領域内のいずれにおいても開裂部位よりはるか上流にあるアミノ酸は、同じようにプロセシングに深く影響することが発見された。プレプロバラチロイド・ホルモン、シグナル、ペプチドのαヘリックス・ポテンシャルにねじれを起こし、あるいは親木性残基を保存された疎水性ドメインに入れるアミノ酸置き換えは、真核シグナル・ペプチドにより触媒反応する開裂反応に対し粗悪な基質を作り出す［Ｃａｕｌｆｉｅｌｄ、ｅｔ　ａｌ、、ｒ真核シグナル・ペプチダーゼのための合成基質Ｊ　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６４．１５８１３−１５８１７　［１９８９１同様に、ミトコンドリア標的シグナルよりなる酵母菌シトクローム・オキシダーゼ　サブユニット■のアミン端末からの４個の残基の欠失は、野生型部位２４アミノ酸下流における部位を予防するのに役立った＊　［Ｈｕｒｔ、ｅｔ　ａｌ、、　ｒ移入性ミトコンドリアタンパク質の予備配列においてアミノ端末の欠失はカルボキシ端末において予備配列の標的機能およびタンパク質分解開裂を阻害するＪ　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６２．１４２０−１４２４（１９８７１１゜抗生物質として最初に分離されたマゲイニンは、一群の少（とも１ダースの塩基性イオノフオア・ペプチドよりなり、背椎動物の神経ペプチドおよびホルモンの研究に関する一つのモデルシステムを表わす。［Ｚａｓｌｏｖ、ｅｔ　ａｌ、、　ｒ合成マゲイニン・ペプチドおよびいくつかの同族体の殺菌活性Ｊ　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５，９１０−９１３（１９８１１）、およびＢｅｖｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、ｒ蛙の皮膚から得たペプチドＪ　Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｅｈｅｓ、５９．３９５−４１４（１９９０１１マゲイニン・ペプチドは大量の生物活性ペプチドおよび神経伝達物質を貯蔵する分泌細胞として特化された顆粒腺で生み出される。顆粒腺は両生類の皮膚および胃に存在し、緊張とか危害に対応して全分接様式でその内容物を放出する。これらの構造は肉眼で見λるサイズの捕食者に対し防御し、あるいは創傷に伴う細菌を制御するのに生理的役割を果たすものと見られている。著しくは無尾類の顆粒腺に貯蔵された無尾類の生合成に含まれている大抵のホルモンおよび数多くの処理酵素が補乳動物の中枢神経系の中に見出され、かつ末梢神経系へと拡散する。

［Ｂｅｖｉｎ、ｅｔ　ａｌ、、５ｕｐｒａ　（１９９０）　］マゲイニンベブチドは、ポリタンパク質から合成され、これからいくつかの場合、抗生物質およびホルモン活性ペプチドが遊離される［５ｕｒｅｓ、ｅｔ　ａｌ、、ｒキセノプシン：　Ｘｅｎｏｐｕｓの前躯体のカルボキシ端末でその皮膚から得られるニューロテンシン状のオクタペプチドＪ　Ｒｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　ＵＳＡ、８１．３８０−３８４　ｆ１９８４１　：　Ｒｉｅｈｔｅｒ、ｅｔ　ａｌ、、ｒＸｅｎｏｐｕｓ　１ａｅｖｉｓの皮膚から得られるクローン・プレプロセルレイン　ｃＤＮＡｓの配列」Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６１．３６７６−３６８０（１９８６１、およびＰｏｕｌｔｅｒ、ｅｔ　ａｌ、。

「レヴイチド：　Ｘｅｎｏｐｕｓ　１ａｅｖｉｓの皮膚より得られる神経ホルモン状ペプチドＪ　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６３．３２７９−３２８３（１９８８１］生物活性ペプチド交叉する一次配列は想定されるホルモン処理部位を表わし、またこれらは唾乳動物の神経ペプチド前躯体の処理シグナルに特有の二塩基および一塩基開裂部位を含む。顆粒膣内に含まれるペプチドは、当初のタンパク質分解事象の分泌に先立って起こることを活性種が暗示しながら、処理に従い分泌小胞内に貯蔵される。［Ｇｉｂｓｏｎ、ｅｔ　ａｌ、、他ｒＰＧＬａおよびＸｅｎｏｐｕｓ　１ａｅｖｉｓのセルレインおよびキセノプシン萌躯体より生じる新規なペプチド断片Ｊ　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６１．５３４１−５３４９（１９１１６１］ペプチドが顆粒腺より分泌された後、ペプチドは更にタンパク質分解され半ペプチド断片となるｅ　［Ｇｉｂｓｏｎ、ｅｔ　ａｌ、。

ｒＸｅｎｏｐｕｓ　１ａｅｖｉｓのプロホルモンより誘導されたペプチドの生合成および分解Ｊ　（１９８６）　：　Ｇｉｏｖａｎｎｉｎｉ、ｅｔ　ａｌ、、５ｕｐｒａ（１９８７１］半ペプチド製品は広範なマス分光分析により完全に特徴付けられている。処理されたペプチドはもはや抗生活性を保有しないため、処理反応は不活性段階を表示する。しかし同時に半分子が分泌物に累積しており、そのいくつかは、多くのホルモンに共通の一次変異である連続カルボキシル端末のアミド化することが示されてきている。［Ｇｉｂｓｏｎ、ｅｔ　ａｌ、、５ｕｐｒａｆ１９８６＋　７かくして内部タンパク質分解はマゲイニンベブチドの抗生活性を不活性化するが、それは同じく新しいホルモンを遊離するのに役立つ。

Ｘｅｎｏｐｕｓ　１ａｅｖｉｓの分泌物は、ペプチド前躯体のプロセシングおよび生合成のメカニズム、および分泌後利用されてきた。

［Ｇｉｏｖａｎｎｉｎｉ、ｅｔ　ａｌ、、５ｕｐｒａ　（１９８７１１Ｘｅｎｏｐｕｓ　１ａｅｖｉｓより得られるより大きな一次製品のタンパク質分解が分泌後に生じることが報告されており、これは多分Ｘａａ−Ｌｙｓ結合という非常に特殊な細胞質酵素によりもたらされており、ここでＸａａはＡｌａ、Ｌｙｓ、ＬｅｕもしくはＧｌｙである。この代替案としでは、小胞に入るが分泌の市ｊに不活性となる酵素によりタンパク質分解が行われていることが想定された。Ｇｌｙ −Ｌｙｓ配列を含むキセノプシンが報告された状態では分離されないことが認められ、ペプチドの二次構造あるいは近傍のアミノ酸がタンパク質開裂部位への接近を決定するのに重要な役割を果たすことが提案された。

多種多様のタンパク質が組替え技術等の合成手段により製造できるし、また現に製造されている。宿主細胞によるこれらの組替えタンパク質の発生は、望ましい成熟した機能的タンパク質を産出するために更に処理を必要とするタンパク質にしばしば帰着することとなる。組替えにより作り出されたタンパク質の天然処理を模倣する試みとして、発現因子タンパク質がタンパク質分解酵素に被爆されてきた。一般に、タンパク質分解酵素は部位特定であり、関連あるペプチドが酵素により認識されるいくつかの部位を含む数の開裂を生じさせることができる。

合成タンパク質生産の分野においては、従来の部位特定酵素に対し多発性認識部位をもつタイプのようなタンパク質を処理するのに利用できる、より精巧な基質特異性をもつ酵素が必要となる。

発明の概要この発明は、少なくとも部分的に精製された形態の。

Ｘｅｎｏｐｕｓ　１ａｅｖｉｓ　の皮膚から抽出された生体細胞に内因性のエンドペプチダーゼより成る新規な組成物を提供する。この組成物は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定された分子量が約１１万ダルトンで；その酵素活性が、ＰＭＳＦ。

ＴＰ（：に、　Ｅ−６４，ロイペプチン、バシトラシン、ホスホルアミトン、ペプスタチンに等に対してほぼ非感受性であり；その酵素活性は、ＥＤＴＡおよび１−１０フエナントロリンによって少なくとも部分的に阻害され：さらに、少なくとも２０ないし４０個のアミノ酸のアルファらせん構造より成るペプチド基質を開裂する能力を備え、前記らせん構造は、１個の疎水結合面と１個の親水結合面とを備え、前記開裂は、親木結合面上のリジンまたはアルギニン残基に対するアミノ末端において発生し、前記リジンまたはアルギニン残基は、前記らせんの疎水結合面に沿って配列された少なくとも４個のアミノ酸の配列内に位置することを特徴とする。さらにこの発明のエンドペプチダーゼにコード付与する遊離のＤＮＡ配列が提供される。

さらに前記エンドペプチダーゼにコード付与するＤＮＡ配列を含む新規な組換え形発現ベクターを提供し、このベクターは、ホスト細胞内のエンドペプチダーゼを発現することができる。

また発明のエンドペプチダーゼにコード付与するＤＮＡによって形質転換された新規なホスト細胞、またはそのホスト細胞によるエンドペプチダーゼの発現に十分なホスト細胞の部分を提供する。

エンドペプチダーゼを生成する方法、その方法によって生成されるエンドペプチダーゼを提供する。その方法は、適切な調節制御配列に連結されて機能する前記エンドペプチダーゼに対してコードするＤＮＡ配列によって形質転換された組換えホスト細胞を培養することによって生成する方法であり、その配列は、前記被転換細胞内のコード化配列の発現を可能ならしめると共に、かく発現されたエンドペプチダーゼを再生させるものである。

また、ペプチド基質を化水分解させる新規な方法を提供し、その方法は、１個の疎水結合面と、親水結合面と、前記疎水結合面に沿って配列された少なくとも４個の不極性アミノ酸の配列内に位置する親水結合面上のリジンまたはアルギニン残基を有し、少なくとも２０個のアミノ酸のアルファらせん構造より成るペプチド基質を調製するステップと；ペプチド基質の加水分解の生起に十分な条件下で、前記ペプチド基質を、この発明のエンドペプチダーゼに接触させるステップとから成る。

さらに、複数個の小形ペプチドまたはアミノ酸から、より大形のペプチドの合成を可能ならしめる条件下で、小形のペプチドまたはアミノ酸を、この発明のエンドペプチダーゼに接触させることにより、より大形のペプチドを合成する新規な方法を提供する。

驚異的なことは、この発明のエンドペプチダーゼは、−次アミノ酸構造のみでなくて、むしろ二次構造に基づいてペプチドを加水分解するものであり、それ故ペプチド処理の分野における有用な手段を提供する。

図面の簡単な説明第１図　酸性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による酵素活性の検定レーン６−８は、後記「実験方法」で説明するクーマシー青呈色による合成全長マゲイニン２ペプチド、および半長へブチドの浸透図である。酵素単位量の減少を利用した開裂反応の結果をレーン１−５に示す。酵素活性の１単位（レーン３）の定義はｒ実験方法」に記載の通りである。

第２図　精製過程における酵素物質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気電気分動分析活性の約２０単位をレーン２−５に負荷した。これは、１５μｇの硫酸アンモニウム分画（レーン２）、１．５μｇの等電点集束分画（レーン３）、１．０ μｇのセファクリルＳ−３００分画（レーン４）、０．５μｇのヒドロキシルアパタイト分画（レーン５）、および０．２μｇ（１００）のグリセロール勾配分画（レーン６）に対応する。レーン１内のマーカータンパク質（ビオラード）に対する分子量（ｘｔｏ−”）を表示する。試料を「実験方法」に記載の電気泳動法で分析し、硝酸ナトリウムで呈色させた。レーン６内に約６Ｏ−６５ｋＤａで泳動した２つの淡色帯は、銀呈色方法（オツクス。

１９８３）によって共通に検出されたアーティファクト（人工産物）である。

第３図　数種のペプチド基質に対して活性な単一酵素（Ａ）分画２５−３３の銀星色ＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析が、酵素活性の１５−３０％グリセロール勾配分画生成から再生された。矢印は沈降の反対方向を示す。

マゲイニン２のアミド（Ｂ）、ＰＧＬａ　（Ｃ）、ＸＰＦ（Ｄ）の内部加水分解開裂が、酸性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に続くクーマシー青呈色操作によって検出された。最下部のグリセロール勾配分画に付した番号は、酸性ゲル電気泳動法によってモニターされた個々の検定に対して使用された酵素の根源を示す。矢印は、各全長非開裂ペプチド基質の泳動位置を示し、各ゲル内の帯の消失は、半長ペプチド生成物の変換を示す、ＰＧＬａとＸＰＦの場合は、開裂によって、実効静電荷がなくてもアミノ末端半長ペプチドが遊離され、それによりゲル内への泳動が除外されることが解る。

第４図　一単位の酵素活性量を使用した開裂反応の逆相ＨＰＬＣクロマトグラフ法分析結果を示す。マゲイニン２−アミド（Ａ）、ＰＧＬａ　（Ｂ）とＸＰＦ　（Ｃ）に対する開裂を分析する標準１００ｕＩ２反応を実行したのち、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフ法）分析を行った。各反応のビークａは、「実験方法」に記述したアミノ酸分析により、アミノ末端半長ペプチドを表わし、ビークｂは、カルボキシル末端半長ペプチドを、ビークＣは、非開裂の全長ペプチド基質を示す。逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃ分析は、「実験方法」中の記載によった。

第５図　アミノ末端欠除同族体耐性内部加水分解過程マゲイニン２−アミドアミノおよびカルボキシ欠除同族体の開裂試験用の標準酵素検定を実行し、開裂を酸性ゲル電気泳動法により分析した。欠失同族体（Ｄｅｓ）レーン１−４　（１欠失から１−４欠失同族体まで）は、半長ペプチド生成物の不在を示すと共に、レーン５−７（各々２２−２３欠失、２〇−２３欠失および１８−２３欠失を示す）は、半長ペプチド生成物が遊離されたことを示す、酸性ゲル電気泳動法は「実験方法」中に記載の方法による。

第６図　マゲイニン２のアミノ末端半長内の単一アミノ酸欠除による、エンドペプチダーゼ活性に耐性な各ペプチドの生成酸アクリルアミドゲル内の各レーンの下の単文字アミノ酸記号は、この反応中のエンドペプチダーゼによる開裂の試験に供された合成マゲイニン２の同族体から欠除された残基を示す。

攻撃を受け易い同族体は、右側に記号で示したように、Ｃ末端とＮ末端が現れることによって判定される。

第７図　らせん円輪として図式化した天然ペプチド各天然ペプチド基質のらせん円輪（マゲイニン２とＣＰＦの１−１２番残基、ＰＧＬａとＸＰＦの１−１３番残基）は、２それらのアミノ酸配列が可変であるにも拘らず、構造の簡便な表現として便利である。各らせんの非極性面を有する疎水性アミノ酸は円形に、各開裂部位（親水結合面に位置する）を包括する残基は陰影を付して示しである。

第８図　認識の決定因子としての基質疎水性（Ａ）はグルタミン置換同族体を使用した反応の酸性アクリルアミドゲル分析図で、各レーン下の単文字アミノ酸記号は、その同族体内のグルタミン置換！換された野生形残基を示す、開裂は、右側に併記した水平位置のアミノ末端半長ペプチドの出現によってアクリルアミドゲル内に検出される。

（Ｂ）は、マゲイニンらせん円輪上に図示されたグルタミン置換の結果を示す。

０から１０％の開裂活性（天然マゲイニン２の活性に対する相対（１）を示す種々の置換を、箱形の陰影残基として示す。２５〜５０％開裂を生ずる置換は円形で、７５〜１００％活性を生ずる置換は箱形で示す、各置換同族体は、クーマシー青で呈色した酸性ゲルから眼視で識別され、若干の独立試験によっても要約される。

ＩＩＧ図　ＰＧＬａ欠除同族体シこ対するエンドペプチダーゼの活性による構造形態の決定（９Ａ）は、Ｌｙｓ’欠除とＧ１ｙ＋１欠除のＰＧＬａの同族体の開裂を示す酸性アクリルアミドゲル分析図で、レーンｌ。

３と５は、酵素なしての結果で、非開裂の全長ペプチドの制御レーンの役割を有し、レーン２．４と６は、酵素を伴った反応で、開裂はアミノ末端半長ペプチドの発生によって判定される。

（９Ｂ）は、（９Ａ）内の開裂を検定した天然ＰＧＬａ　（１−１３）と、１個だけの残基欠除を有する３種の同族体のらせん円輪突起とを示す。各々の潜在アルファらせんの非極性面を構成する疎水性アミノ酸は円形で、開裂可能結合を箱形で示したアミノ酸には陰影を付して表示し、Ｇ　ｌ　ｙｌ　ｌ欠除同族体の開裂を起させると考えられるリジンは四角で囲って示した。

第１０図　エンドペプチダーゼ活性の阻害剤としてのペプチドの分析マゲイニンの１−４欠除同族体と、天然マゲイニン２−アミドのエンドペプチダーゼ開裂を阻害するメリチンとの両者の能力を試験するための酵素検定の酸性アクリルアミドゲル試験結果を示す。レーン１から４は、阻害剤が両者ともに、エンドペプチダーゼの代理の役目を果さないことを例証するための制御要素を示す。レーン２と５も、制御要素として役立ち、阻害剤がない場合の天然マゲイニン２−アミドの１００％開裂を示す、レーン３と６は、天然基質を添加する前に、１０回折なたみ過剰の阻害剤により酵素を培養した結果を示す。阻害剤の検定は「実験方法」中に記載した通りである。

第１１図　エンドペプチダーゼに対して試験されたペプチドと同族体との総括矢印は、「実験方法Ｊに記載の逆相Ｉ（ＰＬＣ分析とアミノ酸分析によって判定された開裂部位を示し、下線を付した残基は、酸性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で検出された開裂部位を下す。ペプチド末端から欠除されたアミノ酸は、短線で表示しく１１Ｂ図）、内部で欠除された残基は、全長配列内の記号間スペースで表示する（ＩＩＣ，ＩＩＥ図）。置換されたアミノ酸は、下線付き文字で示す（＋、ＬＤ、ＩＩＦ図）、右手の欄は、天然マゲイニン２−アミドに対するエンドペプチダーゼ活性と比較した、各ペプチド同族体の相対的開裂度の概要で、４個の十記号は開裂の野生形レベルを示し、−記号は開裂しないことを示す。

相対的開裂度の判定は、クーマシー青で呈色した酸性アクリルアミドゲルによって行った。

発明の詳細な説明この発明によれば、少なくとも部分的にＭＨされた形態の、実験用蛙（Ｘｅｎｏｐｕｓ　１．ａｅｖｉｓ）の皮膚から抽出された生体細胞に内因性のエンドペプチダーゼより成る新規な組成物が提供される。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定された分子量は約１１万ダルトンである。またＰ１４ＳＦ、　ＴＰＣＫ、　Ｅ−６４゜ロイペプチン、バシトラシン、ホスホルアミトン、ペプスタチンに対して不感受性であり、その酵素活性は、ＥＤＴＡおよび１−１０フエナントロリンによって少なくとも部分的に阻害され；さらに、少なくとも２０ないし４０個のアミノ酸のアルファらせん構造より成るペプチド基質を開裂する能力を備え、前記らせん［ｉｔｉは、１個の疎水結合面と１個の親木結合面とを備え、前記開裂は、親木結合面上のリジンまたはアルギニン残基に対するアミノ末端において発生し、前記リジンまたはアルギニン残基は、前記らせんの疎水結合面に沿って配列された少なくとも４個のアミノ酸の配列内に位置するものである。

「アルファらせん構造Ｊとは、蛋白質の右同りらせんのペプチド鎖によりらせんが形成される蛋白質分子配列の呼称である。エンドペプチダーゼ活性の特徴は基質疎水性である。さらに具体的には、＠５ｉ親媒性のアルファらせん形態は、この新規なエンドペプチダーゼによって最適な基質として認識されるためには疎水性でなければならない。特定の理論はさておき、酵素と基質物質の間の疎水性相互作用は、タンパク質の加水分解の前の初期結合反応と想定される。

この発明のエンドペプチダーゼは、実験用蛙の皮膚内にかなり多量に存在し、従来のクロマトグラフィー法でも、少なくとも部分的に精製された形で分離できる。さらにこの発明のエンドペプチダーゼは、ペプチド基質が、（１）少なくとも２０個のアミノ酸と、（２）１個の疎水結合面と、（３）前記疎水結合面に沿って配列された少なくとも４個のアミノ酸の配列内に位置する親木結合面上のリジンまたはアルギニン残基、より成る両親媒性アルファらせん分域を有し、かっこの基質が小断片に加水分解されている場合に、他の生体細胞から、天然発生エンドペプチダーゼとして得ることができる。

必要ならば、このエンドペプチダーゼのアミノ酸およびＤＮＡ配列は、在来の方法で容易に判定することが可能である。即ち、アミノ酸配列をめるには、酵素の部分的アミノ酸配列をコード付与するＤＮＡ分子を合成するが、または、かかる分子に対して相補性ＤＮＡ線維を表示する分子を合成する。そこでこの合成りＮＡは、生体のゲノムＤＮＡから、またはその生体から分離されたｍ　ＲＮ　ＡのｃＤＮＡコピーがら採取されたＤＮＡ配列内のＤＮＡ配列等質性を探るのに使用することができる。一般に１５分子以上のＤＮＡ分子は、成る等質ＤＮＡを一義的に特定するために要求される。個々のアミノ酸は６個までの一義的３ヌクレオチドＤＮＡ配列またはコドンに対してコード付与されるので、アミノ酸配列にコード付与できる種々のＤＮＡ分子の数はきわめて多数となる。それ故考えられる全ての合成りＮＡプローブを逐一試験することは非現実的であり、幾つかのＤＮＡ分子の総量をプローブとして使用する方が有利である。これを「縮重」プローブと称し、既知の方法で生成できる。プローブ混合体内の唯一のＤＮＡ分子のみが厳密な配列等質性を有するとはいえ、複数個の高度の等質性さえ得られれば十分であるから、複数個の合成りＮＡ分子によって遺伝子を−ｍ的に特定することができる。

遺伝子配列を特定する一方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の利用であり、米国特許４，６８３，１５９　と４，６８３，２０２　の各号に記載されている。このＰＣＨによれば、ＤＮＡ配列の２末端が既知であれば、１択してＤＮＡ配列を生成することができる。その各末端に対応するプライマー、即ちオリゴヌクレオチド・プローブが得られる０次いで、ＤＮＡ配列の中央部分が合成によって生成される。

遺伝子を得るためのＰＣＲを適用した一方法においては、生体からＲＮＡが分離精製される。次いでデオキシチミディレート末端オリゴヌクレオチドが、それをプライマーとしてＲＮＡをｃＤＮＡ内に逆転写するために使用される０次ぎに前記縮重プローブとしての１合成りＮＡ分子またはそれらの混合体が生成され、これは既に判明したアミノ末端アミノ酸配列をコードすることができる。このＤＮＡ混合体とデオキシチミディレート末端オリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲ反応を生起させる。ＰＣＲ反応の生起に使用されるこの合成りＮＡ混合体は、所望のｍＲＮＡ配列に対して特異的であるので、所望のｃＤＮＡのみを有効に増幅することができる。その結果生成物は、多数の既知のクローニングベクターに結合させることができるように増幅されたｃＤＮＡである。

最後にこの生成ｃＤＮＡを、適宜のベクター内にクローンさせて分析され、ヌクレオチド塩基配列が判定される。これらのＰＣＲ生成物からの直接アミノ酸翻訳により、それらが酵素に対する完全なコード化配列であることが判明した。

試験用蛙等から直接に採取する他に、この酵素を既知の種々の方法によっても有効に調製することが可能である。要するに細胞の転換、ベクターの構成、メツセンジャーＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡライブラリーの調製等の方法の多くは、広〈実施されており、またそれらの条件および手法は諸種の文献によって周知であるが、なお参考のため以下に説明する。

組換えタンパク質を生成するための最も通用の原核生物系は、Ｅ、ｃｏｌｉ（大腸菌）であるが、枯草菌、シェードモナス等の桿菌、またはその他の微生物菌株を使用することもできるので、その生物体と両立できる種から採取されたレプリカ末端と制御配列を含むプラスミド・ベクターが使用される。通用の制御配列は、転写阻害用のプロモータを有し、所要によりオペレータ、リボゾヘム結合部位配列を含む。

組換λ形外部蛋白質を生成するには、種々の真核生物体も使用され、それらは、直接に蛋白質を生成できる発現系によって転換され、さらに蛋白質分泌のための信号配列が提供される。

真核生物体を使用する他の利点として、高等生物の蛋白質にコード付与するゲノム配列内に発生するイントロンを処理できる。さらに成る種のアミノ酸残基のグリコジル化、酸化、誘導体合成および構造制御等の処理機構を可能とする。

酵母菌、昆虫細胞、哨乳類細胞、鳥類細胞、および高等植物細胞等、種々の真植生物体が使用される。これらの生体内での使用において両立性で機能できる適切なプロモータ、並びに終結配列およびエンハンサ−１例えばバクロウィルス・ポリヘトリン・プロモータ等が使用できる。前記の通り、プロモータは、構成性でも誘導性でもよく、例えば唖乳類系において、ＭＴＩＩプロモータを重金属の添加によって誘導することができる。

所望の生体に適合する発現系の構成のための諸要素は周知の通りである。蛋白質を組換え生成するには、それにコード付与するＤＮＡが発現系内に適切に連結された上で、生体細胞内に転移され、外部遺伝子の発現が可能な条件下で培養、保存される。かくして生成されたエンドペプチダーゼは、既知の方法により、細胞の分解または培養媒体から再生される。

プラスミド構造への結合は、適切な生体を連結混合体により一次転換することによって確認できる。適切な転換体は、アンピシリン、テトラサイクリン、その他の抗生耐性物質、またはプラスミド構造の形態によって選ばれたマーカーを使用することによって選択される。

この発明のエンドペプチダーゼは１例えば組換え法によって生成されて必要な蛋白質を生成する特定の加水分解を必要とするペプチドを処理する場合に有効である。当業者であればペプチドが種々の方法、例えば加水分解へ導く条件下でエンドペプチダーゼに直接接触させることにより、処理できることは理解できる。さらにこの発明の酵素に対するＤＮＡは、これをキメラ遺伝子を発現すると同時にペプチドが自動的に処理されるような処理を必要とする蛋白質のＤＮＡに結合させることができる。

さらに発明によれば、発明のエンドペプチダーゼの縮合触媒有効量に接触させた小形ペプチドまたはアミノ酸から大型ペプチド合成へ誘導する条件下において、ＷＩ数個の小形ペプチドまたはそれらを有するアミノ酸から大型ペプチドを合成する方法が提供される。当業者であれば、使用すべき酵素の縮合触媒有効量を判定することは容易である。この酵素の縮合触媒有効量とは、アミノ酸の少なくとも数個の小さなペプチドを縮合（大型ペプチドの合成）させるのに十分な量のことである。

かくしてこの発明のエンドペプチダーゼは、複数個の小形ペプチドから大型ペプチドを合成する際の縮合触媒として有用であると確信される。縮合触媒として成る種の蛋白質分解酵素を使用することは下記各々に記載されている。米国特許第５．００２８７１号、およびＶ、にａｓｃｈｅ、ｒタンパク質酵素およびペプチドの合成Ｊ　Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ。

ｐｐ、　１２５−１４５　ｅｄ、　Ｒ，Ｊ、　Ｂａｙｎｕ＋ｗ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｓ、　Ｂｏｎｄ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓｆ１９８９１　。

実験方法材料と購入先　−（材料：購入先、所在地）試験用蛙：ナスコ（ウィスコンシン州フォート　アトキンソン）、ｆｆｌ酸アンモニウム：ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ。グリセロール、酢酸アンモニウム、Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０：シグマ（モンタナ州セントルイス）、アクリルアミド：ベーリンガー・マンハイム（インディアナ州インディアナポリス）。フェナントロリン、ロイペプチン、ペプスタチン、ＰＭＳＦ、　ＴＰＣＫ、　Ｅ−６４，ホスホルアミトン、メリチン：シグマまたはベーリンガー・マンハイム。

ペプチドの合成　−マゲイニン１．２、ＰＧＬａ、　ＸＰＦ、　ＣＰＦ　各ペプチドおよびペプチド誘導体は、前記Ｚａｓｌｏｆｆ、　ｅｔ　ａｌ、の方法により、固相法によって合成した。

酵素の検定　−マゲイニン・アミド基質で、各クロマトグラフを培養することによって酵素活性をモニターした。反応緩衝液は燐酸ナトリウムおよび塩かナトリウムである。０．５容積の氷酢酸で反応を凍結した後、各反応の１５ｕ１の分割１を酸性ゲル電気泳動法で分析した。活性の１単位は、前記条件下で２５μｇのマゲイニン２アミド基質の半長ペプチド精製物に変換させるのに必要な酵素の量と定義する。

基質特異性分析も前記と同じ方法で、但しマゲイニン２アミドの代わりに検討すべき各基質同族体の５０μｇを使用して同一濃度の培養体中で実施した。

阻害剤の検討も同一方式であるが、まず試験される各阻害剤で、基質無しの特定濃度で酵素を室温１時間培養し、次いで基質を反応に加えた上、さらに１時間培養した。

酸性ゲル電気泳動法　−酸性ゲル（ｐＨ４）を調製し、初期の方法（Ｇａｂｒｉｅｌ、　１９７ｔｌ　を若干修正して適用した。ゲル溶液組成：最終濃度１５％（ｖ／ｖ）アクリルアミド（アクリルアミド対ビスアクリルアミド３７．５：１）、８８ｒｎＭ　ＫＯＨ１３％（ｖ　／　ｖ　）氷酢酸、０．７５％（Ｖ／Ｖ）テトラエチレン・メチレン・ジアミン（Ｔｅｍｅｄ）、０．３７５％過硫酸アンモニウム（３０ｍｇ／ｒｎｌ）。試料を混入する前に、０．５体積の氷酢酸と０．５体積の０．１％プロリン付加染料を添加した。　１４ＩＮＩ　ＰＲＯＴＥＡＮ　ゲル装置（カリフォルニア州Ｂｉｏｒａｄ。

Ｒｉｃｈｍｏｎｄ社製）を使用して、０．０３５ＭベータアラニンとｐＨ４の木酢ｉｌｌ　（２，４５ｍ　ｌ／　ｌ　）を含む緩衝液中で２００ボルトでゲル電気泳動を実施し、ゲルをクーマシーブリリアント青、メントール、水の混合液で着色し、蒸留水で税色した。

ナトリウムドデシル硫酸塩ポリアクリルアミド電気泳動法（略してｒｓＤｓ　ＰＡＧＥＪ　）−文献Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｌａｅｍ＋ｍｌｉ、　Ｕに［バクテリオファージ１゛４の頭部形成中における構造蛋白質の開裂」の方法で実施した。高分子量標準は、Ｂｉｏｒａｄから購入した。

高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）とアミノ酸の分析　−これらの分析に伴う酵素反応は、１％三フッ化酢酸（ＴＦＡ）内で終了し、最終濃度０．１％ＴＦＡとなった。１００μｍ反応が装置に投入され、逆相カラム上でアクアボアを使用して実行した。３０−７０％線形勾配法を４５分間以上実行し、ペプチドを含む分画を親液性化し、ＨＰＬＣグレード水中に再懸濁し、再懸濁試料の蛋白質を自動化水分解法によってアミノ酸分析装置に投入し、アプライド・バイオシステムのデータ分析装置を使用して特異アミノ酸に対する数値計算を実施した。

蛋白質濃度　−ブラッドフォード法またはピアースＢＣＡ検定により、牛血清アルブミンを標準として算定した。

精製　−被麻酔試験用蛙の背腹両面皮膚から５０ｍｇを切取して秤量し、ポリトロン・酢酸アンモニウム・グリセロール混液（バッファーＡ）で均質化、４℃４０分間１０ｒｐｍで遠心分離後、上澄み液を収集、硫酸アンモニウムで３０％まで飽和させる。沈澱遠心分離後、３０％まで飽和させ、再沈澱する。

ベレットを前記バッファーＡ中に再懸濁し、十分に透析した。

この被透析試料を自由流等電点電気沫動集中法によってリサイクルし、１５００Ｖで約６０分間予備集中させた後、７−１０℃で１２０分間集中させ、２．５ｍ１分画を収集して酵素活性を検定した。

（以下はすべて４０℃で実行）活性分画を収集してセントリコン３０管によって濃縮し、均衡化された酢酸アンモニウム、ノニデット混液（バッファーＢ）内のセファクリルカラムにロードし、洗浄、還流し、ｉ、５ｍ１分画を採取して２８０ｎｍでの紫外線吸収により蛋白質を検出した。

酵素活性による分析と変性ゲル電気泳動後に、活性分画のサブセラ１−を再び収集し、バイオゲルＨＰＴハイトロキシルアパタイト・カラム上に収集試料を加えて、同一のバッファーで洗浄した。酵素の滴離は、０．１ｍＩ２／分の流率で線形勾配法によって行い、酵素活性を解析したのち、活性分画を収集し、超濾過法で濃縮した。

１２ｍＩ２のグリセロール勾配液を調製し、前記のカラムから得られた濃縮酵素試料を、既に形成された勾配の上部に供給し、３９．ＯＯＯｒｐｍで３６時間遠心分離し、０，２５ｍｆｆ分画を、勾配管の底部から収集して、ゲル電気泳動法により酵素活性と純度とを解析した。

実施例１−酵素の精製実験用蛙の皮膚から開始して、この発明のエンドペプチダーゼを、数回のクロマトグラフ・ステップを経て等質化精製し、酸性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、酵素活性を検定し、第１図の結果を得た。実効ｎ電荷の差により、加水分解によって生成された２種の開裂生成物から、全長マゲイニン２−アミドベブチド基質が分別された。酵素活性の数単位量を反応に加えるに伴って、半長ペプチドの生成が増加し、全長基質が減少することが、ゲルのパターンによって表示された（レーン１−５）。前記両者の開裂生成物は、合成半長ペプチドの進行に伴って泳動し、これをゲル上の標準とした（レーン６−８）。

精製の結果を要約すれば、エンドペプチダーゼは、硫酸アンモニウム分画化ステップにより、約１００回折たたみ精製されたことを示す（表１）。この可成り低い折たたみ精製は、蛙皮膚内にきわめて豊富な酵素が存在することの証拠である。第２図は、銀呈色ドデシル硫酸ナトリウム・アクリルアミドゲル法による各精製ステップで、最後に均一な試料となることを示す。

表１１ｔｆ製表精製　体積　タン＾゛り貿　全　単位数　全　特異　取量　折返し度ステップ　Ｃａ１）含有量　タンハ゛り質　／ｍｌ’　１１位数　活性　（％）（ｔａｇ／セｌ）　（岨）硫酸アンモニウム　３．６　１５．００　５４．００　２０，０００　７２，０００　１，３３３　１００．０　−一−等電位集束　１５．５　０．１５　２．３０　２２５０　３４，８７５　１５，１８３　４８．０　１！、４セフアクリルＳ−３００１０，６０，０７０，７４３０００３１，８００４３，０００４４，０３２，３ヒドロキシルアパタイト　４．２　０．０３　０．１２６　４０００　１６．８００１３４，４００　２３．０　１００．８ａ　は、本文に記載の「実験手順」に記載した酵素活性の１単位を示す。

ｂ：ヒドロキシアパタイトステップからグリセロール勾配ステップへの特異的活性の減少は、等質の酵素試料のみを定量した結果である。純粋の酵素は、グリセロール勾配分別に続いて再生された活性物質の一部分のみを表わす。

実施例２−エンドペプチダーゼの特性このエンドペプチダーゼの分子量は約１１万ダルトンである。還元性および非還元性の条件下で電気泳動させると、タンパク質帯は、精製の各段階における酵素活性に対応して、同一位置に泳動するので、活性は単一のサブ単位から成るものと結論できる。レートゾーン遠心分離法によるグリセロール勾配中への酵素活性の沈降は、約１１０ｋＤの分子量とよく対応すると共に、単量体が内部タンパク質分解に応答することの証左である。

数種のプロテアーゼ阻害剤を使用する阻害試験法によれば、エンドペプチダーゼは、酵素の金属プロテアーゼの複数個より成るよとを示唆する。ロイペプチン、フェニルメタンスルホニル・フルオライドおよびトシル−Ｌ−フェニルアラニン・クロロメチル・ケトン（ＴＰＣＫ）、オチール・プロテアーゼ阻害剤Ｅ−６４（Ｎ−［Ｎ−（Ｌ−３−トランス−カルボキシオキシラン−２−カルボニル）− Ｌ−ロイシル］−アグマチン）、およびアスバチル・プロテアーゼ阻害剤ベブチタチンは、酵素活性に対して作用を及ぼさないが、金属プロテアーゼの特徴的阻害剤としての、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と１゜１０−フェナントロリンは、十分に酵素活性を阻害した。ドシトラシン、ホスホルアミトン等の阻害剤も、内部加水分解を生起させないことが判明した。これらの結果を表２に示す。

酵素精製の最終段階は、単一の酵素が若干の関連ペプチド基質を開裂させることを暗示する。１５−３０％グリセロール勾配から再生された各分画をＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析した結果を第３Ａ図に示す、マゲイニン２−アミドの２７−３０分画に対する酵素活性ピークが、酸性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によってめられ（第３Ｂ図）、これは約１１０キロダルトンで泳動する高度に濃縮されたタンパク質帯に対応する。他の２種の天然抗微生物性ペプチドＰＧＬａとＸＰＦ　（ゼノプシン前躯体分＠）に対する最大加水分解活性は、１１０ｋＤａタンパク質との相関性を裏付ける（第３０と３Ｄ図）。

各ペプチドの厳密な開裂部位を見きわめることにより、その酵素を、ペプチド鎖内部のペプチド連鎖を加水分解できるタンパク質分解酵素の１つとして分類付けできることになった。逆相ＨＰＬＣ分析に次いで、純粋酵素と基質とを培養して得られたペプチド主要ピークをアミノ酸分析することにより、試験管的にめられた開裂部位が、生体内で特定される基質の開裂部位と一致することが確認された。なおジョバンニー二他（１９８７）も参照のこと。第４Ａ図と表３に示す通り、マゲイニン２−アミドの１０および１１番残基位置のＬｙｓ−１ｙｓペプチド結合は、この酵素によって加水分解される。基質としてＰＧＬａとＸＰＦを使用した開裂反応のＨＰＬＣクロマトグラフ図形もまた、単一のタンパク質分解過程が、それぞれのペプチドに向けられることを明示する（第４Ｂと４Ｃ図）。逆相ピークの各々についてアミノ酸分析した結果、エンドペプチダーゼが、予想通り、ＰＧＬａとＸＰＦのＧｌｙ”−Ｌｙｓ”ペプチド結合、およびＣＰＦ内に存する類似のＬｅｕ’°−Ｌｙｓ１対をも開裂させることが判明した。第１１Ａ図は、天然ペプチド基質について検出された開裂部位の概要を示す。

表２　阻害の態様阻害剤　濃度　阻害率％ロイペプチン　１ｍＭ　Ｏペプスタチン　１００　ｍＭ　ＯＰＭＳＦ　１０　ｍＭ　０ＴＰＣＫ　１ｍＭ　０Ｅ−６４３００ｕＭ　Ｏバシトラシン　１　ｍｇ／ｍｌ　Ｏホスホルアミトン　１　μＭＯ１００ｕＭ。

ＥＤＴＡ　０．５　ｍＭ　２５５ｍＭ　２５５０ｍＭ　５０１．１０− フェナントロリン　０．２ｍＭ　７０２　ｍＭ　１００２０ｍＭ　１００表中の％阻害度は、マゲイニン２−アミドを基質としで使用した酵素検定の後、酸性ゲル電気泳動法のクーマシーブルー呈色によって測定した値。

表３（１）　アミノ末端半長ペプチドアミノ酸　観測値　期待値Ｇｌｙ　１．１６　１．１２　（２１１１ｅ　１．１０　１．１０　（１１Ｌｙｓ　Ｑ。７８　０．８９　（２１Ｐｈｅ　１．５０　１．３５　（１１Ｌｅｕ　１．０２　１．０３　［１１Ｈｉｓ　２．０４　１．９０　ｆｉｌＳｅｒ　１．４２　１．２７　ｆｉｌＡｌａ　Ｏ，９５０，９（！　ｆｉｌ（２）カルボキシル末端半長ペプチドアミノ酸　観測値　期待値Ｇｌｙ　１．１０　１．１２　（２１１１ｅ　Ｏ，８２１，１０ｆｉｌＬｙｓ　Ｏ，９１Ｇ、８９　（２１Ｐｈｅ　３．１１　２．７０　（２１Ｓｅｒ　１．１７　１．２７　１ｌｌＡｌａ　０．８０　０．９０　（１１Ｖａｌ　Ｏ，８８１，３７（ｌｌＧｌｕ　２．０４　Ｇ、７０　ｆｉｌ賛ｅｔ　、　１．４５　（１１１，７１Ａｓｎ　１．５５　１．９１　［１１表３に示す通りエンドペプチダーゼは、単−Ｘａａ−Ｌｙｓ末端において、天然基質を開裂する。

実施例３−エンドペプチダーゼは、特定の基質の二次構造を認識する。

マゲイニン、ＰＧＬａ、ＸＰＦ、ＣＰＦは、すべて抗菌性を示すが、極端な配列相同性は有しない。エンドペプチダーゼによる開裂が示す限りにおいては、２個の残基のみが、これら４種の天然基質を通じて保有されている。それらは、加水分解された結合の、アミノ末端のグリシン、およびカルボキシル末端のりジン残基である。

前記各データに基づいて、基質の可能な決定要素がめられる。エンドペプチダーゼは、残基位置にあるペプチド結合の性質とは無関係に、基質の末端からの残基の特定数に位置するペプチド結合を開裂させるという計数的な機構を利用することができる。さらに、エンドペプチダーゼの活性が、−次配列のみによって決定されると仮定することができる。エンドペプチダーゼに関する多くの報告は、「基質の特異性は、特定のアミノ酸または残基の配列の存在に由来する。」としている。例えば推定的な二塩基性認識部位は、神経ペプチドおよびホルモン前駆体ポリペプチドが多くの処理過程に従う際にきわめて通例的であり、またエンドペプチダーゼがＬｙｓ−ＡｒｇまたはＡｒｇ−Ａｒｇ対を認識するという種々の例証が存在する。さらに基質二次構造が、タンパク質内部分解酵素による認識と加水分解とに影響を与える可能性もある。

計数機構に関する第１の仮定を検証するには、アミノまたはカルボキシル末端が欠除されたマゲイニン２の同族体を使用した（ペプチド配列に関する第１１Ｂ図）、エンドペプチダーゼが、−末端からのアミノ酸の幾つかの順番を厳密に算えていたならば、各同族体は加水分解されるべきであるが、なお開裂部位も移動せざるを得ない。第５図のとおり、欠除−１同族体のわずかな開裂は検出される（レーン１）が、なおより長いアミノ末端欠除同族体は影響されなかった（レーン２−４）。欠失同族体Ｄｅｓ−１−３は、エンドペプチダーゼが末端からアミノ酸を算えられないことを示すものではないことの最も有力な証左である。マゲイニン２のアミノ末端から最初の３個の残基を欠失させると、Ｇｌｙ′１−ＬｙＳ１４の対を、１０−１１位置、即ちエンドペプチダーゼが開裂させた位置へ移動させることができる。Ｇｌｙ−Ｌｙｓは、天然ＰＧＬａ、ＸＰＦ、ＣＰＦ内で認識される天然の開裂配列ではあるが、このマゲイニン同族体は酵素によって加水分解されなかった。

これに対し、優に６個の残基が欠失された場合でさえも、カルボキシル末端欠失は、野性形に比敵する程度まで、すべて加水分解された。レーン５，６．７内に現出した共通ペプチド断片は、天然マゲイニン２アミノ末端半長ペプチド（１− １０）を伴って泳動する。そこで、（１）エンドペプチダーゼは、ペプチド末端から測っても、その開裂特異性を達成できず、（２）認識を可能ならしめる決定要素は、マゲイニンペプチドのアミノ末端内に存在することが結論された。

エンドペプチダーゼにより認識と開裂に対していかなる特定残基が特に寄与するかを検討するために、マゲイニン２を欠除した同族体の完全な一連を検定し、これによって加水分解に対する感受性は、如何なる特定のアミノ酸にも依存しないことが判明した。マゲイニン２配列の１ないし１２の位置から、いずれの１個のアミノ酸を欠除しても、その結果内部タンパク質分解の準位が同等に低下する（第６図）、他方、１４から２３までの位置から１つの残基を除去して生じた同族体は、野性形準位において加水分解される。グリシン１３の欠除は中間的な効果を与えるものと見られ、恐らく開裂に係るエンドペプチダーゼによって認識される基質領域の境界において占める位置によって説明できるようである。第１１ｃ図は、活性の欠除は、グリシン、リジンおよびフェニルアラニンの残基がいずれも欠除した場合と考えられる。唯一の統一的特性は、アミノ酸の欠除による基質不活性を生じ得るアミノ酸が、いずれもそのペプチドのアミノ末端半長内に存在することである。−次配列こそが基質特異性の唯一の決定因子であるという仮定に加えて、このデータは、マゲイニンの認識決定因子がペプチドの最初の１２個の残基内に存在することをも支持する。さらに、この結果に対して最も強力な事実は、これらのデータが、この区域内の基質二次構造が、この発明のエンドペプチダーゼによる加水分解に対する感受性を左右するということである。

実施例４−エンドペプチダーゼによって認識される構造形態の推定天然マゲイニンベブチド基質の一次配列相同性に拘らず、これらの基質は構造的特徴を有することが判明している。ラマン散乱、ＭＭＲ，サーキュラ−二色分光法により、リン脂質内においてペプチドが、両親媒性のアルファらせん構造な誉することが判明した。

アルファらせん構造は、これらの配列のらせん形部分を検討して得られる（第７図）。

両親媒性らせんの非極性面を構成する疎水性残基が連続的に整列していることにより、再生形態が表示され、親水性部位上のエンドペプチダーゼ開裂部位の位置により、天然基質の他の特徴も表示される。最後に加水分解された結合のカルボキシル側にあるリジン残基ば、類似の方向の各らせんから突出している。

マゲイニン２欠除同族体の結果（第６図）は、この構造解析の範囲内で解釈される限り、説明が可能である。１個の残基のみの欠除は、アルファらせん構造の両親媒性の全体から除去することではないが、最初の１２個の内のいずれのアミノ酸が欠失しても、非極性面に沿った疎水性残基の整列、および開裂部位に対する向きが乱される。前記各データに基づき、基質特異性を支配する二次構造の重要性が確認された。

実施例５−タンパク質内部分解に必要な精密構造形態の判定基質特異性における両親媒性の役割を直接に見きわめるため、一連のマゲイニン２のグルタミン酸置換同族体を試験した。グルタミン酸によるアミノ酸１−１２の置換を表示する１２例の合成誘導体を、そのタンパク質分解過程を検定した（第１１Ｄ図）。疎水性面に沿った位置にあると考えられる疎水性残基の置換は、同族不活性を支配することが予想されたが、想定されるアルファらせんの親木結合面を維持するのに寄与するような置換は、基質感受性を大きく左右しないと予想された。第８Ａ、８Ｂ図に示す結果は、疎水性が基質酵素相互作用の重要な決定因子であることを示す。さらに具体的には、基質の開裂部位（Ａｌａ９とＰｈｅ　１２．レーン９と１２）を包囲する２個の疎水性残基およびアミノ末端のグリシン（レーンｌ）がグルタミン酸塩で置換されると、ペプチドは不適切な基質に変化する。これに対してレーン６．７．１０は、野性形レベルで開裂される同族体を示す。開裂効率の低下も、Ｉ　Ｌｅ”とＰｈｅ’位置（レーン２と５）をグルタミン酸で置換した同族体において現れる。らせん円形として（第８Ｂ図）現れた特定残基は、すべてらせんの非極性面上にある。これに反し、Ｌｙｓ’とＬｙｓｌｌとを除けば（下記参照）、らせんの極性面上のアミノ酸の置換では、基質に対する顕著な加水分解性は見られない。

エンドペプチダーゼが、開裂部位を取巻く一次配列のみを検出するならば、アミノ酸１，２．５位置の加水分解結合をさかのぼった置換が行われてはならない。

さらに、マゲイニン２欠除の同族体とは異なり、酵素が開裂部位に対して一定のペプチド長さのみを必要とする場合は、グルタミン酸塩置換が基質開裂を妨げてはならない、特定の基質構造に対する明らかな要件が浮上してくる。この実施例中に見られる基質の感受性の定量的な相違は、認識形態を有するような残基を明瞭ならしめるに役立つ。開裂部位を総括する２個の疎水性残基は最も決定的とは見られるが、他の３個の非極性アミノ酸（ａｔｙ’。

Ｉ　ｌｅ”　、Ｐｈｅ’　）も荷電残基と置換することにより加水分解を生起されるので、これらもまた重要なアミノ酸である。−見ランダムなアミノ酸であるが、これらを統一すると、アルファらせん構造を有する以上、マゲイニンペプチドのアミノ末端領域内に強力な疎水結合面を形成させることができる。

Ｌｙｓ’　、Ｇ　ｌ　ｙ”またはＬ　ｙＳｌ　１の欠失を有する合成Ｐ　Ｇ　Ｌ　ａ誘導体（第ＬＩＥ図の配列図）を、エンドペプチダーゼに対して試験し、基質二次構造のモデルを想定した。第９Ａ図に示すとおり、Ｌｙｓ’欠除同族体は未変性ＰＧＬａ（レーン２）と同程度の効率で開裂されるが　Ｇ１ｙＩ＋欠除ＰＧＬａ誘導体は、未変性ペプチドと比較するタンパク質分解の明らかな減少を示す（レーン４）。ＬｙＳ１２欠除同族体は、酵素の存在の如何に拘らず、開裂されていないペプチドと同等の強度を示すとおり、加水分解に対して完全に耐性である（レーン５と６を比較）。

各誘導体のらせん円形の突出群（第９Ｂ図）を精査することにより、Ｌｙｓ’欠除誘導体が理想的な基質であり、他方Ｇｌｙ”欠除誘導体は活性が劣るという理由が解明される。欠失があるとしても、Ｌｙｓ’欠除同族体内の相隣る疎水性残基（円形で表わされた部分）は、それらの位置が開裂部位かららせんを経由して直接にその位置を保っている（未変性ＰＧＬａと比敵する）ので、それらの残基の連続性は不変に保たれている。単一の欠除が、疎水性アミノ酸の配列内のＬｙｓ’　（四角形で示す）再定置を起こさせるようなＧｌｙ”欠除の場合は、前記とは相違する。マゲイニン２のＰｈｅ’をグルタミン酸塩で置換する効果と蔑似して（第６図参照）、エンドペプチダーゼは、このＰＧＬａ誘導体に対する活性が低下する。Ｌｙｓ”欠除ＰＧＬａ同族体は、開裂可能な結合のカルボキシル側の荷電リジンの欠除を構成する。後記に補足する結果によれば、この同族体は、その位置にある荷電残基が開裂される必要があったので、タンパク質分解に対して耐性であると結論された。

実施例６−開裂部位における一次配列による配列特異性の判定天然ペプチド基質の開裂結合のカルボキル側にリジン残基が保存されていることは、加水分解部位にある一次配列が、基質特異性を決定する重要な因子であることを示す。どんな塩基性残基であっても、この基準を満足できるか否かを判定するために、マゲイニンｌの類似体ＫＩＩＲ１つまりレジンのすべてをアルギニンで置換したペプチドを検定し、第１ＩＧ図のペプチド配列を得た。このペプチドは、いずれの塩基性アミノ酸でも加水分解用の酵素によって寛容性であるという予測を確証する基質として有効であった。エンドペプチダーゼが、むしろ特異性が少なくて、残基の位置にある塩基性または酸性の１個の荷電残基のみを必要とするという可能性は、すでにマゲイニンＬｙＳ１１のグルタミン酸置換によって確認された（第８図参照）、この誘導体の開裂耐性により、塩基性アミノ酸がエンドペプチダーゼによる加水分解には必要であると結論された。

レジンまたはアルギニンが、タンパク質分解に必要であるという決定的な証拠は、加水分解部位の荷電残基が欠除されたペプチド同族体の幾つかを検定することによって確定された。

Ｌｙｓｌｌが欠除したＰＧＬａの欠除同族体は、開裂可能な結合点にＧｌｙ−１１ｅ対を有することになり、加水分解に対して感受性がなく（第９Ｂ図、レーン６参照）、第１に、この位置にリジンが必要であることを指示している０位置１１にあるリジンがアラニンで置換されたマゲイニン同族体ＫＩＩＡ、および１− 　ｙｓｌ＋の位置にプロリンを有するマゲイニン同族体Ｋ１１Ｐに対して、それらの開裂性および耐性を決定した（第１１Ｆ図）。これにより、基質特異性決定の他の因子は、開裂可能な結合のカルボキシル側の塩基性残基の存在であると結論された。

実施例７−アルファらせん構造を補助するいずれの残基も、開裂可能結合のアミノ末端側に存在すること開裂部位の性質をさらに特性化することにより、加水分解された結合のアミノ末端側を有する残基位置の限定が判定された。試験用蛙によって天然合成された基質内のこの位置にある残基を検討すると、リジン、グリシンおよびロイシンを受容することが判明した。マゲイニン１の誘導体ＧＩＯＡは、この部位にあるアラニンが、ＱｌｙＩ＋欠除のＰ　Ｇ　Ｉ−ａ同族体Ｉ＋の開裂に対応して、開裂に適合することが判明した。同様に、前記位置のグリシンをグルタミン酸で置換したマゲイニン同族体（Ｇ　１０　Ｅ）は、加水分解に対する感受性が認められた。エンドペプチダーゼによる開裂に適合することが試験された唯一のアミノ酸はプロリンであった。基質内へのプロリンの導入を排除する効果は、プロリンがアルファらせんを破壊する性質に起因すると考えられる。

Ｌｙｓ″とＬｙＳｌｏとをＤアミノ酸で直接したマゲイニン２の同族体ｄＫ１１とｄＫｌｏとを、酵素に対して検討した。予想に反し、エンドペプチダーゼが、これらの同族体を開裂させた（そのデータの概要を第１１Ｈ図に示す）。ｄＫ１１同族体は、天然基質と同等効率で開裂されたが、これは、この位置の塩基性残基に対する酵素要件に拘らず、ｌｌｌ１ｉの鏡像異性がペプチド感受性に対して決定的ではないことを示唆している。他方ｄＤｌｏ同族体は、開裂可能結合のアミノ末端側にＤレジンを有するもので、その開裂度が約５０％の減少を示した。

加水分解されたペプチド結合位置の立体化学的特異性に対して、新規なエンドペプチダーゼが応答性を示さないことは、酵素活性としては異富な特性である。タンパク質の内部開裂部位にあるアミノ酸の立体化学的要件に対して若干の類似の検討の結果、Ｄアミノ酸を含む基質は完全に不活性であると報告されている（文献：　Ｃ：ｈｅｃｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６；および（：ｌａｍａｇｉｒａｎｄｅｔ　ａｌ、、１９８９１゜実施例８−基質構造形態は、エンドペプチダーゼにより、自律性領域と認識される４個の残基アミノ酸末端延長部を有するマゲイニン２の合成同族体ＲＥＶＲ（ｔ −４）（第１ＬＨ参照）をも、精製エンドペプチダーゼに対して試験した。天然マゲイニン２と比較して、前記同族体は、約５０％の効率で開裂され、またＨＰＬＣとアミノ酸分析により、加水分解が同一のＬｙＳｌｏ−ＬｙＳ１１結合において発生することが確認された。アミノ末端には４個の特殊な残基が存在しても、開裂部位は確実に認識されるので、エンドペプチダーゼが算定機構を有しない、という初期の結論は、重ねて確認された。さらに、この類似体の加水分解により、酵素によって認識される二次構造領域が、自律性機構であると見なしてよいことが示される。また、この基質が酵素との相互作用において必須の構造を有すること、および近辺に導入された付加構造がタンパク質分解をきびしく阻害することも判明した。

実施例９−特定の構造形態を有する不活性基質でも、エンドペプチダーゼと結合する能力があること基質特異性の広範な分析によれば、若干の合成同族体は、タンパク質分解用の基質としての機能を示さなかった。マゲイニン２の１−４アミノ末端欠除同族体が、２つの可能性を判別するように設定された阻害決定に使用された。第１０図に図示のとおり、１０回折たたみ分子過剰のエンドペプチダーゼによる同族体の予備培養体は、マゲイニン２の開裂を阻害するのに有効であった（レーン２と３を比較）。さらに１−４欠除の同族体は、ＰＧＬａ、ＸＰＦ、ＣＰＦに対するタンパク質分解を阻害すること、ならびに単一のエンドペプチダーゼ活性でも多重ペプチド基質を開裂させることが判明した。この現象は、たとえアミノ酸末端から４個の残基が欠除された結果、開裂のためのエンドペプチダーゼによって必要とされる構造形態の改変が生じたとしても、初期の結合反応は、有力な構造因子とは重要な関連性がないことを示唆するものである。

マゲイニンとは無関係ではあるが、ミツバチの毒液から採取されたアルファらせん形細胞溶解ペプチドであるグリシンは、マゲイニンと酷似した脂溶性を示す（文献：　Ｔｏｓｔｅｓｏｎ　ａｎｄＴｏｓｔｅｓｏｎ、　１９８１１゜これらの機能的類似性は、それらの構造的特徴に由来すると考えられるので、エンドペプチダーゼが、基質としてグリシンを処理する能力を検討した。その−次配列の検討（表２）により、そのらせんの親水結合面上の特定の位置に必須の塩基性残基を含まないゆえに、グリシンは開裂されないものと予見された（第１Ｏ図、レーン４）。さらにグリシンを、天然基質マゲイニン２に対する酵素活性についても試験した。グリシンの１０回折たたみ分子過剰と共に、エンドペプチダーゼを予備培養（第１０図、レーン６）したものは、開裂の阻害に寄与したが、それは約２５％程度に過ぎなかった。これはエンドペプチダーゼに対する結合親和性が（欠除形マゲイニン１−４と比較して）低いためであり、恐らくは第１４残基位置のプロリンの存在によるものと推定される。この結果力）ら、エンドペプチダーゼによる開裂のみならず、有効な結合のためにも、中断されないアルファらせんを維持することが必要であるという仮定に到達する。

配列リスト（１）一般情報ｆｉｔ　出願人　マイケル　エイ　ザスロフ、ニコールレズニック（０１発明の名称：新規なエンドペプチダーゼ（ｉｉｉｌ配列数：５６（ｉｖｌ連絡先（Ａ）名　称　：ウッドコック　ウオツシエバーンカーツ、マツキーヴイッツ　アントノリス（Ｂ）ストリート名　：ワン　リバティ　ブレイス　４６階（Ｃ）市　名　：フィラデルフィア（ＤＪ州　名　：ペンシルヴアニア（Ｅ）国　名　：アメリカ合衆国Ｍ　コンピューター読取フオーム（Ａ）記録媒体　＝３．５インチディスク。

１．４４Ｍｂストーレッジ（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ　ＰＳ／２（Ｃ）作動システム　：　ＰＣ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア　：ワードパーフェクト５．０（ｖｉｌ現出現出−データ）出願番号　・（Ｂ）登録日　・（Ｃ）　分　類　・（ｖｉｉｌ先行出願データ（Ａ）出願番号（Ｂｌ登録日（ｖｉｉｉ１代理人情報（Ａ）名　称　：バトリシア　エイ　シュレック（Ｂ）登録番号　：３３，７７７（Ｃ１’照／ドケット：ＣＨ−００６番号ｆｉｘ）通信情報（Ａ）ｉ［話　：　（２１５）５６８−３１００（Ｂ）テレファックス：　（２１５）５６８−３４３９（２）配列識別番号１に関する情報（１）配列特性（Ａ）　長　さ　：　２３（Ｂ）タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：未知（ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号ＩＧｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ５１Ｏ（２）配列識別番号２に関する情報（ｉｆ配列特性（Ａｌ　長　さ　＝２１（Ｂ）タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：未知（ｘｌ）配列の記述　：配列識別番号２Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ａｌ、ａｌ　５　１０（２）配列識別番号３に関する情報（１）配列特性（Ａ３　長　さ　：　２５（Ｂ）タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　二未知（ｘｌ）配列の記述　：配列識別番号３Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ａｌａｌ５１０Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ（２）配列識別番号４に関する情報（１）配列特性（Ａ）　長　さ　：　２７（Ｂｌ　タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　二未知（ｘｌ）配列の記述　：配列識別番号４Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｈａ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ５１ＯＬｙｓ　ｌｉｅ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｇ１ｎ（２）配列識別番号５に関する情報ｆｉｌ配列特性（Ａ）　長　さ　＝　２２（Ｂｌタイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：未知（ｘ１１１００記述　：配列識別番号５１１ｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｑ　Ｐｈｅ　ＧＬｙ　Ｌｙｓ　Ａｌａｌ　５　１０（２）配列識別番号６に関する情報（ｉｌ配列特性（Ａ）　長　さ　：２１（Ｂｌタイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：未知ｆｘｉ）配列の記述　：配列識別番号６Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｐｈｅ５１Ｏ（２）配列識別番号７に関する情報（Ｕ配列特性（Ａ）　長　さ　：　２０（Ｂ）タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　二未知（ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号７Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｖａｌｌ　５　１０（２）配列識別番号８に関する情報（ｉ）配列特性（Ａ）　長　さ　：　１９（Ｂ）タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　二未知（ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号８Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｖａｔ　Ｇｌｙｌ　５　１０（２）配列識別番号９に関する情報ｆｉｔ配列特性（Ａ）　長　さ　：２１（Ｂ）タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：未知（ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号９（２）配列識別番号１０に関する情報ｆｉｔ配列特性（Ａ）　長　さ　：　１９（Ｂｌタイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：未知（ｘｌ）配列の記述　：配列識別番号１０（２）配列識別番号１１に関する情報ｆｉｔ配列特性（Ａ）　長　さ　：　１７（Ｂ）タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：未知（ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号１１Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓｌ　５　１０（２）配列識別番号１２に関する情報（ｉｔ配列特性（Ａ）　長　さ　：　２２（ＢＪタイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　二未知ｆｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号１２（２）配列識別番号１３に関する情報ｆｉｔ配列特性（Ａｌ　長　さ　：　２２（Ｂ）タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：未知（ｘｌ）配列の記述　：配列識別番号１３ＰｈｅＶａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ、Ａｓｎ　５ｅｒ（２）配列識別番号１４に関する情報ｆｉｌ配列特性（Ａ）　長　さ　：　２２（Ｂ）タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　二未知（ｘ１１１００記述　：配列識別番号１４（２）配列識別番号１５に関する情報ｆｉｔ配列特性（Ａｌ　長　さ　＝　２２（Ｂｌタイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：未知（ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号１５（２）配列識別番号１６に関する情報（ｉｔ配列特性（Ａｌ　長　さ　：　２３（ＢＪタイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：未知ｆｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号１６Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓｌ　５　１０（２）配列識別番号１７に関する情報ｆｉｔ配列特性（Ａ）　長　さ　：　２３（ＢＪタイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　二未知（ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号１７（２）配列識別番号１８に関する情報ｆｉｔ配列特性（Ａ）　長　さ　：　２２（Ｂ）タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　二未知（ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号１８（２）配列識別番号１９に関する情報（ｉｌ配列特性（Ａ）　長　さ　：　２２（ＢＪタイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：未知ｆｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号１９Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｌａｌ　５　１０（２）配列識別番号２０に関する情報（ｉｔ配列特性（Ａ）　長　さ　：　２２（Ｂ）タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　二未知ｆｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号２０Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｔ＋ｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｌａｌ　５　１０Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　［ｌｅ　１４ｅｔ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ（２）配列識別番号２１に関する情報（ｉｆ配列特性（Ａ）　長　さ　：　２２（Ｂ）タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　二未知ｆｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号２１Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｌａｌ　５　１０（２）配列識別番号２２に関する情報（ｉｌ配列特性（Ａ）　長　さ　＝　２２（Ｂ）タイプ　二アミノ酸ＣＤ）トポロジー　二未知（ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号２２Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｌａ１５１゜（２）配列識別番号２３に関する情報（１）配列特性（Ａ）　長　さ　＝　２２（Ｂ）タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　二未知（ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号２３Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　ＡｌａＰｈｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ（２）配列識別番号２４に関する情報ｆｉｌ配列特性（Ａ）　長　さ　：　２２（Ｂ）タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　二未知ｆｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号２４Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｌａｌ　５　１０（２）配列識別番号２５に関する情報ｆｉｔ配列特性（Ａ）　長　さ　＝　２２（Ｂｌタイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　二未知（ｘｌ）配列の記述　：配列識別番号２５（２）配列識別番号２６に関する情報ｆｉｔ配列特性（Ａ）　長　さ　：　２２（Ｂｌタイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　二未知［ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号２６（２）配列識別番号２７に関する情報（１）配列特性（Ａ）　長　さ　：　２２（Ｂ）タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：未知（Ｘｌ）配列の記述　：配列識別番号２７Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　５ｅｒ（２）配列識別番号２８に関する情報ｆｉｌ配列特性（Ａ）　長　さ　：　２２（８３タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　二未知ｆｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号２８Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　１．ｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓｌ　５　１０（２）配列識別番号２９に関する情報ｆｉｔ配列特性（Ａ）　長　さ　＝　２２（Ｂ）タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　二未知（ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号２９Ｇｌｙ　ＩＩｓ　Ｇｌｙ　ＬｙＳＰｈｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓｌ５１０（２）配列識別番号３０に関する情報［ｉ１配列特性（Ａ）　長　さ　：　２２（Ｂ）タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：未知（ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号３０Ｇ１：ｒ　Ｉｉｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　１．ｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓｌ　５　１０（２）配列識別番号３１に関する情報ｆｉｌ配列特性（Ｄ）トポロジー　：未知（ｘｉ）配列の記述　：配列識別番号３１＾１ａ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ（２）配列識別番号３２に関する情報（ｉｌ配列特性（Ｄ）トポロジー　：未知［ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号３２Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ（２）配列識別番号３３に関する情報ｆｉｌ配列特性（Ａｌ　長　さ　：　２２（Ｂ）タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：未知（ｘｌ）配列の記述　：配列識別番号３３Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓｌ　５　１Ｇ（２）配列識別番号３４に関する情報（１１配列特性（Ａｌ　長　さ　：　２２（Ｂｌ　タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　二未知（ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号３４Ｇａｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓｌ５１０Ａｌａ　ＰｂｅＶａｔ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ（２）配列識別番号３５に関する情報ｆｉｔ配列特性（Ａ）　長　さ　：　２３（Ｂ）タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：未知［ｘｉ）配列の記述　：配列識別番号３５Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓｌ５１０（２）配列識別番号３６に関する情報（ｉｔ配列特性（Ａ）　長　さ　：　２３（Ｄ）トポロジー　：未知（ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号３６Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓｌ　５　１０Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｖａｔ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　ｌｉｅ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ（２）配列識別番号３７に関する情報（ｉｌ配列特性ＣＤ）トポロジー　：未知（ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号３７Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　ｌｉｅ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ（２）配列識別番号３８に関する情報ｍ配列特性（Ｄ）トポロジー　二未知ｆｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号３８（２）配列識別番号３９に関する情報ｆｉｌ配列特性（Ａｌ　長　さ　：　２３（Ｂ）タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：未知（ｘｌ）配列の記述　：配列識別番号３９Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓｌ　５　１０（２）配列識別番号４０に関する情報ｆｉｌ配列特性（Ａ）　長　さ　：　２３（Ｂ）タイプ　二アミノ酸ＣＤ）　トポロジー　：未知（ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号４０Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓｌ５１Ｏ（２）配列識別番号４１に関する情報（ｉｆ配列特性（Ａ）　長　さ　＝　２３（Ｂ）タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　二未知ｆｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号４１Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　１Ｊｅｔ　Ｌｙｓ　５ｅｒ（２）配列識別番号４２に関する情報（１）配列特性（Ｄ）トポロジー　二未知（ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号４２Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ（２）配列識別番号４３に関する情報（１）配列特性（Ｄ）トポロジー　：未知（ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号４３Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ（２）配列識別番号４４に関する情報ｆｉｔ配列特性（ｘｌ）配列の記述　：配列識別番号４４ＧｌｙＩｌｅＧｌｙＬｙｓＬｅｕＨｉｓＳｅｒＡｌａＧｌｕＬｙｓＰｈｅＧｕｙＬｙｓＡＪａ（２）配列識別番号４５に関する情報（１）配列特性（Ａ）　長　さ　：　２３（Ｂｌタイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：未知（ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号４５Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ（２）配列識別番号４６に関する情報（Ｕ配列特性（Ａ）　長　さ　：　２３（Ｂ）タイプ　二アミノ酸ＣＤ）トポロジー　二未知（ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号４６Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｕｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓｔ　ｓ　ｔ。

（２）配列識別番号４７に関する情報（１）配列特性（Ａ）　長　さ　：　２０（Ｂ）タイプ　二アミノ酸ＣＤ）トポロジー　二未知（ｘｌ）配列の記述　：配列識別番号４７Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇ］、ｙ　Ａｌａ　ｌｉｅ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｌｙｓｌ　５　１０（２）配列１別番号４８に関する情報ｆｉｌ配列特性（Ａ）　長　さ　＝　２０（Ｂ）タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　二未知（ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号４８Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｌｙｓｌ　５　１０（２）配列識別番号４９に関する情報ｆｉｔ配列特性（Ａ）　長　さ　二　２０（ＢＣタイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：未知（ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号４９Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｌｙｓｔ　ｓ　ｉ。

（２）配列識別番号５０に関する情報（１）配列特性（Ａ）　長　さ　：　２２（Ｄ）トポロジー　：未知（ｘｌ）配列の記述　：配列識別番号５０Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｒｇｌ　５　１０Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ（２）配列識別番号５１に関する情報（ｉｌ配列特性（Ｄ）トポロジー　：未知（ｘ１１１００記述　：配列識別番号５１Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓｌ　５　１０Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｇｕｙ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　１４ｅｔ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ（２）配列識別番号５２に関する情報（ｉｌ配列特性（Ｄ）トポロジー　二未知（ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号５２Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｕｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓｌ　５　１０（２）配列識別番号５３に関する情報（ｉｌ配列特性（Ａ）　長　さ　＝　２３（Ｂ）タイプ　二アミノ酸（Ｄ）　トポロジー　：未知（ｘｉｌ配列の記述　；配列識別番号５３Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｉｙ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓｌ　５　１０＾１ａ、　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　ｌｉｅ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ（２）配列識別番号５４に関する情報ｆｉｔ配列特性（Ａ）　長　さ　：　２３（Ｂ）タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　二未知［ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号５４Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓｌ５１０（２）配列識別番号５５に関する情報ｆｉｔ配列特性（Ａ）　長　さ　＝　２３（Ｂ）タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：未知（ｘｌ）配列の記述　：配列識別番号５５Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　１４ｅｔ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ（２）配列識別番号５６に関する情報ｆｉｌ配列特性（Ａ）　長　さ　＝　２３（町タイプ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：未知（ｘｉｌ配列の記述　：配列識別番号５６１０　５　１　０．５０．１ＦＩＧ、１ＦＩＧ、２ＦＩＧ、５ＦＩＧ、７ｃＦＩＧ、９ＡＧＩ　ＫＦＬ）−１ｓＡＫＫ　ＦＧＫＡＦＶＧＥＩＭＮＳ　＋ＧＩＧＫＦしｊ− ｉｓＡＫＫ　ＧＫＡＦＶＧεＩＭＮｓ　＋ＧＩＧＫＦＬＨＦＡＫＫＦＧＫＡＦＶ　ＥＩＭＮＳ　＋＋→ＧＩＧＫＦＬＩ−１ｓＡＫＫＦＧＫＡＦＶＧＥＩＭ　Ｓ　＋＋　＋ＧＩＧＫＦＬＩ−１５４■ＦＧ　ＫＡ　ＦＶＧＥＩＭＮ　＋　＋　＋ＦＩＧ、ｌｌｄウシ功２θ・、 εＩＧＫＦＬＪ−ＩＳＡＧＫＦＧＫＡＦＶＧＥＩＭＫＳＦＩＧ、ＩＩｅ　ＰＧＬａ−９ＦＩＧ、ＩｌｆなＡｋ１麹ＫＩＴ　ＲＧＩＧＲＦＬＲ５ＡＱ旦ＦＧＲＡＦＶＲＩＬＮＳ　＋＋ＫＩＴＥ　ＧＩＧＫＦＬＨ５ＡＧＥＦＧＫＡＦＶＧＥＩＭＫＳ　−ＫＩＩＡ　ＧＩＧＫＦＬ＋ＳＡＧΔＦＧＫＡＦＶＧＥＩＭＫＳ　−ＫＩＩＰ　ＧＩＧＫＦＬＨ５ＡＧＰＦＧＫＡＦＶＧＥＩＭＫＳ　−ＧＩＯＡ　ＧＩＧＫＦＬＨ５Ａ、７ＦＧＫＡＦＶＧε ＩＭＫＳ　＋÷＋引ＯＥ　ＧＩＧＫＦＬ＋ＳＡＱＦＧＫＡＦＶＧＥＩＭＫＳ　＋＋＋＋ｃ＋ｏｐ　ＧＩＧＫＦＬ＋ＳＡＰＫＦＧＫＡＦＶＧＥＩＭＫＳ　−メ）？／　ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬρＡＬＩＳＷＩＫＫＫＫＯＯ−

Claims

【特許請求の範囲】

（１）少なくとも部分的に精製された形態の、Ｘｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉｓの皮膚から抽出された生体細胞に内因性のエンドペブチダーゼより成る組成物であって、この組成物は、（ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定された分子量が約１１万ダルトンで；（ｂ）その酸素活性が、ＰＭＳＦ，ＴＰＣＫ，Ｅ−６４，ロイペプチン、バシトラシン、ホスホルアミドン、ペプスタチンに等に対してほぼ非感受性であり；（ｃ）その酵素活性は、ＥＤＴＡおよび１−１０フェナントロリンによって少なくとも部分的に阻害され；さらに、（ｄ）少なくとも２０ないし４０個のアミノ酸のアルファらせん構造より成るペブチド基質を開裂する能力を備え、前記らせん構造は、１個の疎水結合面と１個の親水結合面とを備え、前記開裂は、親水結合面上のリジンまたはアルギニン残基に対するアミノ末端において発生し、前記リジンまたはアルギニン残基は、前記らせんの疎水結合面に沿って配列された少なくとも４個のアミノ酸の配列内に位直することを特徴とする組成物。
（２）エンドペブチダーゼが、Ｘｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉｓの皮膚から分離されたところの請求の範囲第１項記載の組成物。
（３）エンドペブチダーゼが開裂させ得るペブチド基質が、マゲイニン、ＰＧＬａ、ＸＰＦまたはＣＰＦであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組成物。
（４）請求の範囲第１項記載のエンドペブチダーゼに暗号付与する遊離ＤＮＡ配列。
（５）請求の範囲第１項記載のエンドペブチダーゼに遺伝暗号付与するＤＮＡ配列より成り、ホスト細胞内のエンドペブチダーゼを発現することができる組換え形発現ベクター。
（６）請求の範囲第１項記載のエンドベブチダーぜに遺伝暗号付与するＤＮＡによって形質転換されたホスト細胞、またはそのホスト細胞によるエンドペブチダーゼの発現に十分なホスト細胞の部分。
（７）適切な調節制御配列に連結されて機能するエンドペブチダーゼに対してコードするＤＮＡ配列によって形質転換された組換えホスト細胞を培養することより成り、その配列は、前記被転換細胞内のコード化配列の発現を可能ならしめると共に、かく発現されたエンドペブチダーゼを再生させることを特徴とするエンドペブチダーゼを生成する方法。
（８）請求の範囲第７項記載の方法によって生成されたエンドペブチダーゼ。
（９）（ａ）１個の疎水結合面と、親水結合面と、前記疎水結合面に沿って配列された少なくとも４個の不極性アミノ酸の配列内に位置する親水結合面上のリジンまたはアルギニン残基を有し、少なくとも２０個のアミノ酸のアルファらせん構造より成るペブチド基質を調製するステップと；（ｂ）ペブチド基質の加水分解の生起に十分な条件下で、前記ペブチド基質を、この発明のエンドペブチダーゼに接触させるステップとから成るところのペブチド基質を開裂させる方法。
（１０）複数個の小形ペブチドまたはアミノ酸から、より大形のペブチドの合成を可能ならしめる条件下において、小形のペブチドまたはアミノ酸を、請求の範囲第１項記載のエンドペブチダーゼの縮合触媒有効量に接触させることにより、より大形のペブチドを合成する方法。