JPH0640824B2 - Stable fructose-dehydrogenase composition - Google Patents
Stable fructose-dehydrogenase compositionInfo
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- JPH0640824B2 JPH0640824B2 JP62066682A JP6668287A JPH0640824B2 JP H0640824 B2 JPH0640824 B2 JP H0640824B2 JP 62066682 A JP62066682 A JP 62066682A JP 6668287 A JP6668287 A JP 6668287A JP H0640824 B2 JPH0640824 B2 JP H0640824B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、安定なクラフトースデヒドロゲナーゼ（以下
ＦＤＨ）組成物、特にＦＤＨの凍結乾燥物に関するもの
である。ここでいうＦＤＨは酵素番号（ＥＣ１．１．９
９．１１）であって、現在までのところ、細菌に存在す
るものが知られている。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a stable kraftose dehydrogenase (hereinafter referred to as FDH) composition, and more particularly to a freeze-dried product of FDH. The FDH here is the enzyme number (EC 1.1.9
9.11), which has so far been known to exist in bacteria.
ＦＤＨの反応は以下の通りである。The reaction of FDH is as follows.
ＦＤＨは基質特異性がすぐれており、Ｄ−フラクトース
以外の糖、糖アルコール等には作用しない〔飴山、足立
の報告（ジャーナル オブ バクテリオロジーVol.145,
No2 1981）参照〕。したがって、ＦＤＨを用いれば生体
中又は食品中あるいは、農産物中のフラクトース量を正
確に測定することができ、農業、食品業あるいは臨床検
査等の分野への利用が期待されている。 FDH has excellent substrate specificity and does not act on sugars other than D-fructose, sugar alcohols, etc. [Ameyama, Adachi's report (Journal of Bacteriology Vol. 145,
No2 1981)). Therefore, the use of FDH can accurately measure the amount of fructose in the living body, food, or agricultural products, and is expected to be used in fields such as agriculture, food industry, and clinical examination.
（従来の技術） ＦＤＨは、細菌の膜画分に存在するため、例えば非イオ
ン界面活性剤トリトンＸ−１００により可溶化され、精
製される。精製されたＦＤＨは、溶液状態では２５℃以
上の高温になると活性の低下が著しく、また低温でも、
長期間保存すると活性の低下がみられる。(Prior Art) Since FDH exists in the membrane fraction of bacteria, it is solubilized and purified by, for example, the nonionic surfactant Triton X-100. Purified FDH has a remarkable decrease in activity at a high temperature of 25 ° C or higher in a solution state, and also at a low temperature,
Decrease in activity is observed after long-term storage.
また、トリトンＸ−１００，ツイーン２０等の液状の非
イオン界面活性剤は、凍結乾燥に不適であり、それ故、
トリトンＸ−１００等の非存在下では、活性を保持でき
ないＦＤＨの凍結乾燥は今迄成功していなかった。Further, liquid nonionic surfactants such as Triton X-100 and Tween 20 are not suitable for freeze-drying, and therefore,
In the absence of Triton X-100 and the like, lyophilization of FDH, which is unable to retain activity, has heretofore been unsuccessful.
（発明が解決しようとする問題点） このように、ＦＤＨはハンドリングの良い状態での長期
保存が困難であり、産業上利用するためには、非常に不
適な酸素形態であった。そのためハンドリングの良い安
定な酵素形態を創出することが必要であり、この事は、
安定なＦＤＨの凍結乾燥物を創出することにより解決さ
れる。(Problems to be Solved by the Invention) As described above, FDH is difficult to be stored for a long period of time in a good handling state, and it is a very unsuitable oxygen form for industrial use. Therefore, it is necessary to create a stable enzyme form that is easy to handle.
The solution is to create a stable lyophilizate of FDH.
（問題点を解決するための手段） 本発明者は、ＦＤＨの凍結乾燥物について、種々鋭意研
究した結果本発明に到達した。すなわち、本発明はＦＤ
Ｈ、(i)糖、糖アルコールおよびアミノ酸もしくはその
塩からなる群から選ばれた１種又は２種以上の化合物お
よび(ii)非イオン界面活性剤を含有し、凍結乾燥された
ことを特徴とする安定なフラクトースデヒドロゲナーゼ
組成物である。(Means for Solving Problems) The present inventor arrived at the present invention as a result of various studies on freeze-dried products of FDH. That is, the present invention is FD
H, (i) sugar, sugar alcohol and one or more compounds selected from the group consisting of amino acids or salts thereof and (ii) a nonionic surfactant, and freeze-dried Which is a stable fructose dehydrogenase composition.
一般にトリトンＸ−１００，ツイーン２０等の液状の非
イオン界面活性剤は凍結乾燥に適さないとされている。
しかし、本発明者等は凍結乾燥に供する酵素液中の蛋白
質濃度、安定剤の種類、安定化剤の濃度を調整すること
により、液状非イオン界面活性剤の存在下でも安定なＦ
ＤＨの凍結乾燥物を創出することに成功し、本発明に到
達した。Generally, liquid nonionic surfactants such as Triton X-100 and Tween 20 are not suitable for freeze-drying.
However, the present inventors adjusted the protein concentration, the type of stabilizer, and the concentration of the stabilizer in the enzyme solution to be freeze-dried to stabilize the stable F even in the presence of the liquid nonionic surfactant.
The inventors have succeeded in creating a freeze-dried product of DH and have reached the present invention.
本発明のＦＤＨは、酵素番号(ＥＣ.1.1.99．11)であっ
て、細菌の膜画分にその活性が認められ、例えばトリト
ンＸ−１００によって可溶化し、精製される。このＦＤ
Ｈは、活性保持のため、例えばトリトンＸ−１００を常
時添加しておく必要があり、そのため、ＦＤＨの凍結乾
燥物は今迄創出されていなかった。しかし、本発明で
は、糖、糖アルコール、アミノ酸又はその塩を添加し、
かつ、トリトンＸ−１００等の非イオン界面活性剤の存
在下、安定なＦＤＨの凍結乾燥物を創出することに成功
し、本発明に到達した。The FDH of the present invention has an enzyme number (EC.1.1.99.11), and its activity is recognized in the membrane fraction of bacteria. For example, it is solubilized with Triton X-100 and purified. This FD
In order to retain the activity of H, for example, Triton X-100 needs to be added all the time, and thus a freeze-dried product of FDH has not been created so far. However, in the present invention, sugar, sugar alcohol, amino acid or a salt thereof is added,
In addition, they succeeded in creating a stable lyophilized product of FDH in the presence of a nonionic surfactant such as Triton X-100, and arrived at the present invention.
蛋白質の添加量は凍結乾燥前の酵素液中濃度０．１％以
上が好ましい。The amount of the protein added is preferably 0.1% or more in the enzyme solution before freeze-drying.
本発明に用いる糖としては、ブドウ糖、ガラクトース、
キシロース、フラクトース等の単糖類、乳糖、マルトー
スの二糖類があるが、特にショ糖、フラクトースが好ま
しい。糖アルコールとしては、マンニトール、ソルビト
ール、キシリトール等があるが、特にマンニトール、ソ
ルビトールが好ましい。糖の添加量は凍結乾燥前の酵素
液中、０．１〜２０％である。また糖アルコールの添加
量は０．１〜１０％である。糖、糖アルコールの添加量
が０．１未満では効果が期待されない。The sugar used in the present invention includes glucose, galactose,
There are monosaccharides such as xylose and fructose, lactose and maltose disaccharides, and sucrose and fructose are particularly preferable. Examples of the sugar alcohol include mannitol, sorbitol, xylitol and the like, and mannitol and sorbitol are particularly preferable. The added amount of sugar is 0.1 to 20% in the enzyme solution before freeze-drying. The addition amount of sugar alcohol is 0.1 to 10%. If the added amount of sugar or sugar alcohol is less than 0.1, no effect is expected.
本発明に用いるアミノ酸もしくはその塩としては、グリ
シン、アルギニン等の親水性のアミノ酸もしくはそのナ
トリウム、カリウム、アンモニウム等の塩または塩酸塩
などがある。アミノ酸としてはアルギニン−塩酸塩が好
ましい。アミノ酸またはその塩の添加量は、凍結乾燥前
の酵素液中濃度０．１％〜２０％であり、０．１％未満
では効果が期待されない。Examples of the amino acids or salts thereof used in the present invention include hydrophilic amino acids such as glycine and arginine, and salts or hydrochlorides thereof such as sodium, potassium and ammonium. Arginine-hydrochloride is preferred as the amino acid. The added amount of the amino acid or its salt is 0.1% to 20% in the enzyme solution before freeze-drying, and if less than 0.1%, no effect is expected.
本発明に用いる非イオン界面活性剤としては、ポリエチ
レングリコールエーテル型非イオン界面活性剤（例えば
トリトンＸ−１００）、ソルビタンエステル型エチレン
オキサイド非イオン界面活性剤（例えばツイーン２０）
などが挙げられる。As the nonionic surfactant used in the present invention, a polyethylene glycol ether type nonionic surfactant (for example, Triton X-100), a sorbitan ester type ethylene oxide nonionic surfactant (for example, Tween 20).
And so on.
本発明に用いる非イオン界面活性剤の濃度は、ＦＤＨの
活性の保持のため凍結乾燥前の酵素液中濃度０．０１％
〜２０％であることが望ましい。The concentration of the nonionic surfactant used in the present invention is 0.01% in the enzyme solution before freeze-drying for maintaining the activity of FDH.
It is desirable to be 20%.
本発明の安定化剤の配合法は、特に制限はない。例えば
ＦＤＨを含む緩衝液に安定化剤を配合する方法、安定化
剤を含む緩衝液にＦＤＨを配合する方法、あるいはＦＤ
Ｈと安定化剤を緩衝液に同時に配合する方法などがあ
る。The compounding method of the stabilizer of the present invention is not particularly limited. For example, a method of adding a stabilizer to a buffer solution containing FDH, a method of adding FDH to a buffer solution containing a stabilizer, or FD
There is a method in which H and a stabilizer are simultaneously added to a buffer solution.
緩衝液としては、マッキルバイン緩衝液、酢酸緩衝液、
その他生化学で用いられる緩衝液なら何れでも良いが、
ｐＨは４．０〜７．０、望ましくはｐＨ４．５〜６．０
である。Examples of the buffer solution include McIlvain buffer solution, acetate buffer solution,
Any other buffer solution used in biochemistry may be used,
pH is 4.0 to 7.0, preferably pH 4.5 to 6.0
Is.
また、凍結乾燥前の酵素液中に、安定化剤、ＦＤＨの他
に他の酵素を含んでもよく、またこの他の酵素は１種で
はなく多種混合してもよい。In addition, the enzyme solution before freeze-drying may contain other enzymes in addition to the stabilizer and FDH, and other enzymes may be mixed in various kinds instead of one kind.
凍結乾燥物の形状を維持するために、蛋白質、例えばＢ
ＳＡを添加してもよい。To maintain the shape of the lyophilizate, proteins such as B
SA may be added.
凍結乾燥法は特に制限はなく、常法に従う。本発明の組
成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した
溶液状態であってもよい。The freeze-drying method is not particularly limited and may be a conventional method. The composition of the present invention is not limited to a freeze-dried product, and may be a solution state in which the freeze-dried product is redissolved.
（発明の効果） 本発明ではＦＤＨに蛋白質、糖、糖アルコールおよびそ
の塩からなる群から選ばれた１種又は２種以上の化合物
を配合し、かつ非イオン界面活性剤の存在下凍結乾燥し
て、安定でしかもハンドリングのよいＦＤＨ凍結乾燥物
として長期保存することが可能になった。(Effects of the Invention) In the present invention, FDH is blended with one or more compounds selected from the group consisting of proteins, sugars, sugar alcohols and salts thereof, and freeze-dried in the presence of a nonionic surfactant. As a result, it has become possible to store the FDH freeze-dried product as a stable and easily handled product for a long period of time.
（実施例） 以下本発明を実施例を用いて説明する。(Example) Hereinafter, the present invention will be described using examples.
実施例中、ＦＤＨ活性測定は、以下の方法に従った。In the examples, FDH activity was measured according to the following method.
下記測定試薬混合液０．９ｍｌを２５℃で５分加温し、
試料（ＦＤＨ酵素力価１〜４単位／ｍｌ程度）を０．１
ｍｌ加え撹拌し、正確に５分後、Ｆｅ２（ＳＯ４）３・
デュパノール液を０．５ｍｌ加え、２０分静置後、３．
５ｍｌの蒸留水を加えた後、６６０mmにおける吸光度を
測定した。ＦＤＨの力価は、下記式に従って算出する。Heat 0.9 ml of the following measurement reagent mixture at 25 ° C. for 5 minutes,
Sample (FDH enzyme titer 1 to 4 units / ml) 0.1
Add exactly ml, stir, and after exactly 5 minutes, Fe 2 (SO 4 ) 3
Add 0.5 ml of Dupanol solution, leave it for 20 minutes, and then 3.
After adding 5 ml of distilled water, the absorbance at 660 mm was measured. The FDH titer is calculated according to the following formula.
測定試薬混合液 マッキルバイン緩衝液ｐＨ４．５ ０．７ｍｌ １Ｍフラクトース溶液 ０．１ ０．１Ｍフェリシアン化カリ溶液 ０．１ ０．９ｍｌ Ｆｅ２（ＳＯ4）３・デュパノール溶液 ＳＤＳ（ソディウムドデシルサルフェィト） ３ｇ Ｆｅ２（ＳＯ4 ）３・ＸＨ２Ｏ ５ｇ ８５％ リン酸 ９５ｍｌ を蒸留吸に溶解し１にする。Measurement reagent mixed solution McIlvain buffer pH 4.5 0.7 ml 1 M fructose solution 0.1 0.1 M potassium ferricyanide solution 0.1 0.9 ml Fe 2 (SO 4 ) 3 / dupanol solution SDS (sodium dodecyl sulphate) 3 g Fe 2 (SO 4 ) 3 · XH 2 O 5 g 85% Phosphoric acid 95 ml is dissolved in distilled water to make 1.
実施例１ 下記第１表に示される添加剤を溶解したマッキルバイン
緩衝液に０．１％トリトンＸ−１００を含むＦＤＨ溶液
を混合して凍結乾燥を行った。得られた凍結乾燥物を３
７℃、１週間および３週間保存した後、再溶解して、酵
素活性を測定した。凍結乾燥直後の残存活性（％）を乾
燥前の酵素液中の活性を１００％として第１表に示す。
また括弧内に凍結乾燥を実施せずに、酵素液のまま、３
７℃、３日間保存したものの残存活性（％）を示す。凍
結乾燥前の酵素活性に対する凍結乾燥後の酵素活性を残
存活性（％）として第１表に示す。 Example 1 A McDilvine buffer solution containing the additives shown in Table 1 below was mixed with an FDH solution containing 0.1% Triton X-100 and freeze-dried. The lyophilizate obtained is 3
After storing at 7 ° C. for 1 week and 3 weeks, it was redissolved and the enzyme activity was measured. The residual activity (%) immediately after freeze-drying is shown in Table 1 with the activity in the enzyme solution before drying being 100%.
Also, without performing freeze-drying in the parentheses, the enzyme solution remains as it is.
The residual activity (%) after storage at 7 ° C. for 3 days is shown. The enzyme activity after freeze-drying with respect to the enzyme activity before freeze-drying is shown in Table 1 as residual activity (%).
参考のため０．１％トリトンＸ−１００を含むＦＤＨ溶
液を本発明の添加剤を溶解した、マッキルバイン乾燥液
に代えて添加剤を加えないマッチルバイン緩衝液に混合
した場合を第１表に示す。For reference, Table 1 shows the case where the FDH solution containing 0.1% Triton X-100 was mixed with the Matchluvine buffer solution in which the additive of the present invention was dissolved, and the additive was not added in place of the McIlvine dry solution.
添加剤を加えない場合、３７℃、３週間後のＦＤＨの残
存活性は、４２．０％であるのに対し、本発明の添加剤
を加えた場合では、３７℃、３週間後でも、ＦＤＨの残
存活性は、良好である。When the additive is not added, the residual activity of FDH after 3 weeks at 37 ° C. is 42.0%, whereas in the case where the additive of the present invention is added, FDH remains at 3 ° C. even after 3 weeks. Has a good residual activity.
Claims (1)
糖アルコールおよびアミノ酸もしくはその塩からなる群
から選ばれた１種または２種以上の化合物および(ii)非
イオン界面活性剤を含有し、凍結乾燥されたことを特徴
とする安定なフラクトースデヒドロゲナーゼ組成物。1. Fructose dehydrogenase, (i) sugar,
Stable fructose dehydrogenase composition comprising one or more compounds selected from the group consisting of sugar alcohols and amino acids or salts thereof and (ii) a nonionic surfactant, and freeze-dried .
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62066682A JPH0640824B2 (en) | 1987-03-19 | 1987-03-19 | Stable fructose-dehydrogenase composition |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62066682A JPH0640824B2 (en) | 1987-03-19 | 1987-03-19 | Stable fructose-dehydrogenase composition |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63230085A JPS63230085A (en) | 1988-09-26 |
| JPH0640824B2 true JPH0640824B2 (en) | 1994-06-01 |
Family
ID=13322944
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62066682A Expired - Fee Related JPH0640824B2 (en) | 1987-03-19 | 1987-03-19 | Stable fructose-dehydrogenase composition |
Country Status (1)
| Country | Link |
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| JP (1) | JPH0640824B2 (en) |
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|---|---|---|---|---|
| US20090081300A1 (en) | 2005-11-16 | 2009-03-26 | Pro Natura Gesellschaft Fuer Gesunde Ernaehrung Mb | Agent for use in the case of fructose intolerance |
| KR101792832B1 (en) * | 2014-10-29 | 2017-11-20 | 충남대학교산학협력단 | Method for Fabrication of Polymer Film by Gas-Liquid Interfacial Plasma Polymerization and Polymer Film Manufactured by the Same |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6033472A (en) * | 1983-08-04 | 1985-02-20 | 三洋電機株式会社 | Cooling device |
-
1987
- 1987-03-19 JP JP62066682A patent/JPH0640824B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPS6033472A (en) * | 1983-08-04 | 1985-02-20 | 三洋電機株式会社 | Cooling device |
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| JPS63230085A (en) | 1988-09-26 |
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