JPH0636735B2 - New rhabdovirus that has been separated from wasabi (Rhabdovirus) - Google Patents

New rhabdovirus that has been separated from wasabi (Rhabdovirus)

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JPH0636735B2
JPH0636735B2 JP1720190A JP1720190A JPH0636735B2 JP H0636735 B2 JPH0636735 B2 JP H0636735B2 JP 1720190 A JP1720190 A JP 1720190A JP 1720190 A JP1720190 A JP 1720190A JP H0636735 B2 JPH0636735 B2 JP H0636735B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、退化現象の現れたワサビから分離されたラブドウイルス(Pant rhabdovirus)に属する新規ウイルス及びその変異株に関する。 Description of the Invention The present invention [relates] relates to a novel virus and the mutant strain belonging to the degeneration phenomenon appeared rhabdovirus that has been separated from wasabi (Pant rhabdovirus).

本発明のウイルスは、退化現象の原因となるこれらのウイルスにワサビが感染しているか否かを検定するための抗体作製用の抗原として利用することができる。 Viruses of the invention can be used as antibody-antigen for producing for wasabi these viruses that cause degeneration phenomena assaying whether or not infected. さらに、これらのワサビウイルス病を予防乃至治療するための検体として利用することもできる。 Furthermore, it is also possible to use as a sample for the prevention or treatment of these wasabi viral diseases.

〔従来の技術〕 [Prior art]

ワサビ(Wasabia japonica)の多くの品種は実生で増殖されているが、「真妻」等の優良品種は株分けで増殖されている。 Although many varieties of wasabi (Wasabia japonica) have been grown in seedlings, better varieties such as "true wife" is grown in Kabuwake. しかし株分けを繰り返すことによって根茎の肥大が悪くなり、子株もほとんど採れなくなるという、いわゆる退化現象が現われるので、優良株分け品種は絶滅の危機に瀕している。 However, enlargement of the rhizome by repeating the Kabuwake becomes worse, Kokabu that also hardly caught, because the so-called degeneration phenomenon appears, excellent Kabuwake varieties are on the verge of extinction. この退化現象の主な原因となっているのがウイルス感染によるウイルス病と考えられている。 It has become the main cause of this degeneration phenomenon is believed to viral diseases caused by viral infection. 〔鈴木春夫ら、静岡農試研法21 ,55〜66(1976)〕。 [Haruo et al Suzuki, Shizuoka Agricultural試研Law 21, 55-66 (1976)].
ワサビから分離されているウイルスはTMV-W(タバコモザイクウイルスワサビ系)CMV(キュウリモザイクウイルス)及びTuMV(カブモザイクウイルス)の3種が報告されている〔上掲誌、小室康雄ら、植物防疫20 ,486〜48 Virus is separated from wasabi TMV-W (Tobacco Mosaic Virus horseradish system) CMV (cucumber mosaic virus) and TuMV 3 species (turnip mosaic virus) it has been reported [above掲誌, Yasuo Komuro et al, Plant Protection 20 , 486-48
8(1966)、栃原比呂志ら、関東東山病虫研報11 ,46(196 8 (1966), Hiroshi Tochihara et al., Kanto Higashiyama disease insect Research Report 11, 46 (196
4)〕。 Four)〕. 現在のところ、植物に感染しているウイルスを殺滅し、ウイルス病を治療する農薬はまだ見出されていない。 Currently, to kill the virus that has infected the plant, agricultural chemicals for the treatment of viral diseases has yet to be found. ウイルスに感染した植物からウイルスを除去するいわゆるウイルスフリー化のためのほとんど唯一の方法として組織培養技術を利用した茎頂生長点培養法がラン、 Most only shoot apex meristem culture method using tissue culture techniques as methods run for so-called virus-free to remove the virus from plants infected with the virus,
ユリ、カーネーション等の花卉、ブドウ、リンゴ、ミカン等の果樹、イチゴ、ヤマノイモ等の野菜、センキョウ、ジオウ等の薬用植物において実用化されている。 Lily, carnation and the like of the flowers, grapes, apples, fruit of mandarin orange, etc., strawberries, vegetables such as yam, tactical situation, has been put to practical use in medicinal plants such rehmannia. ワサビにおいても茎頂生長点培養法が適用され、メリクロン法や苗条原基法により実用化が進められている。 Shoot apex meristem culture method is applied in wasabi, practical application has been developed by Merikuron method or seedling JoHara Motoho.

しかし茎頂生長点培養法により作出した苗が全てウイルスフリーになるわけではなく、茎頂生長点培養法により作出した苗のウイルス検定は必須である。 But not necessarily seedlings that were created all become virus-free by the shoot apical meristem culture method, the virus test of seedlings that were generated by the shoot apex meristem culture method is required. ウイルス検定法には、生物検定法、電子顕微鏡法及び抗血清試験法があり、対照とする植物とウイルスの種類により、これらの方法を組合せて検定することが必要である。 The virus assays, bioassays, and electronic microscopy and antisera testing method, the type of plants and virus as a control, it is necessary to test a combination of these methods. ワサビにおいては前述のごとく3種類のウイルスすなわちTMV-W As described above in wasabi three virus That TMV-W
CMV及びTuMVにのみ感染していることが知られていたため、茎頂培養法により作出した培養苗がウイルスフリーか否かの検定は当然これら3種類のウイルスのみを対照として行なわれてきた。 Since it was known that only are infected with CMV and TuMV, cultured seedlings were produced virus free whether tests have been carried out naturally only these three viruses as a control by shoot culture. しかし、検定の結果、ウイルスフリーと判断されても実際にはウイルスに感染されていることが見出されている。 However, the results of the test, in fact, be determined that the virus-free has been found to have been infected with the virus.

〔発明が解決しようとする課題〕 [Problems that the Invention is to Solve]

本発明は、ワサビのウイルス検定を確実なものとし、完全にウイルスフリーなワサビを得ることを目的としてワサビに感染する新規なウイルスを検索し、これを獲得しようとするものである。 The present invention, wasabi viral assay was made reliable, fully searching novel virus that infects horseradish for the purpose of obtaining viral free wasabi, it is intended to acquire it. そして得られたウイルスは、ワサビウイルス検定を行うための抗体作製用の抗原として、またこれらのウイルス病の予防ないし治療のための検体として利用しようとするものである。 And the resulting virus, as antibody-antigen for producing for performing wasabi virus assay, also seeks to use as a sample for the prevention or treatment of these viral diseases.

〔課題を解決するための手段〕 [Means for Solving the Problems]

本発明者らは、ワサビの新規ウイルスを取得することを目的として静岡県湯ケ島町のワサビ田から得られたワサビ(品種:真妻)について新規ウイルスの検索を行った。 The present inventors have, wasabi obtained from the wasabi fields of Shizuoka Prefecture Yugashima the town for the purpose of obtaining the wasabi of the new virus was carried out a search of a new virus for the (breed true wife). その結果、棒状ウイルス、ひも状ウイルス及び桿菌状〜弾丸状ウイルスの3種のウイルスが検出された。 As a result, the rod-shaped virus, three viral string-shaped viruses and bacilli shape-bullet virus was detected. このうち棒状ウイルスは、300nm×18nmの大きさでTMV-Wの抗血清とよく反応したので、公知のtabaco mosaic viru Among the rod-shaped virus, since the well reacts with antiserum TMV-W in size of 300 nm × 18 nm, known tabaco mosaic Viru
sのワサビ系と同定した。 It was identified as wasabi system of s. そして、ひも状ウイルス及び桿菌状〜弾丸状ウイルスについては後述するような検定の結果、丈献未載の新規のウイルスであることが確認され、本発明をなすに至った。 The results of the assay, as will be described later corded viruses and bacilli shape-bullet-shaped virus, it was confirmed that a novel virus length 献未 mounting, the present invention has been accomplished.

本発明は、上記2種のウイルスのうち桿菌状〜弾丸状ウイルスであるラブドウイルス(Pant rhabdoviru The present invention, Rhabdoviridae a bacillus shape-bullet-shaped viruses of the two viruses (Pant rhabdoviru
s)に属する新規ウイルスに関する。 It relates to a novel virus belonging to the s).

また、本発明のラブドウイルスは35〜37℃で5〜15日程度さらす高温処理、亜硝酸、ヒドロキシアミンで処理する化学処理及びIn vitro mutagen-esis-reverse geneti Further, rhabdovirus of the present invention is a high temperature process of exposing approximately 5 to 15 days at 35 to 37 ° C., nitrous acid, a chemical treatment is treated with hydroxylamine and In vitro mutagen-esis-reverse geneti
cs法等による遺伝子操作等で変異させることができるがこのような変異株も本発明は包含する。 May be mutated by genetic manipulation such as by the cs method also present invention such variants include.

本発明のウイルスについて採取法及び形態等を示すと次のとおりである。 The virus of the present invention when showing a sampling method and forms and the like are as follows.

a) ウイルスの採取及び検出 静岡県湯ケ島町のワサビ田から得られたワサビ(品種: a) wasabi obtained from the wasabi fields of sampling and detection, Shizuoka Prefecture Yugashima the town of virus (variety:
「真妻」)を10mm×1mm程度に細切し、さらにそれを切りきざんだ。 Minced a "true wife") to about 10mm × 1mm, but further chopped off it. スライドグラス上に0.1mo/リン酸緩衝液を一滴たらし、その中に上記切りきざんだわさびを入れ、汁液をしみ出させた。 Pour drop of 0.1Mo / phosphate buffer on a slide glass, put wasabi chopped the cut therein and exude juice.

次いで、コロジオン支持膜を張り、カーボン補強した銅製グリッドの膜面をこのワサビ汁液に接触させ、速やかに余分の液を濾紙で吸いとり膜面を上にして風乾させた。 Then, span the collodion support film, by contacting the film surface of the copper grid and carbon reinforced this wasabi juice was in the upper air-dried film surface is sucked quickly the excess liquid in the filter paper. スライドグラス上に0.1mo/リン酸緩衝液に1%グルタルアルデヒドを溶かした固定液を数滴たらし、その液面に風乾させたグリッドの試料面を下にして3〜5分間浮かべ、固定させた。 On a slide glass to 0.1Mo / phosphate buffer fixative few drops dissolved with 1% glutaraldehyde, floated for 3 to 5 minutes to below the sample surface of the grid was air-dried on the liquid surface, is fixed It was. 固定させた試料の乗ったグリッドを脱イオン蒸留水で3回洗浄した後、染色液(2%リンタングステン酸水溶液、ドライウェル0.5% After the grid riding was fixed samples were washed 3 times with deionized distilled water, stain (2% phosphotungstic acid solution, dry well 0.5%
添加pH7.0)で30秒間染色し、濾紙で余分の染色液を吸いとり、膜面を上にして風乾させて検出のための試料とした。 It added pH 7.0) with stained for 30 seconds, and sucks the excess stain with filter paper to obtain a sample for detection in the above air-dried film surface.

b) ウイルスの形態の観察 この様にして作成した試料を透過型電子顕微鏡で検鏡し、ウイルスの形態を観察した。 b) in the observation this way the form of the virus to microscopic inspection in a transmission electron microscope sample prepared was observed form of the virus.

その結果、棒状ウイルス、ひも状ウイルス及び桿菌状〜 As a result, the rod-shaped virus, string-shaped viruses and bacilli shape ~
弾丸状ウイルスの3種のウイルスが検出された。 Three viruses bullet-shaped virus was detected. 棒状ウイルスは300nm×18nmの大きさで、TMV-Wの抗血清とよく反応したことから既知のTMV-Wと同定した。 Rod-like virus in the size of 300 nm × 18 nm, was identified as a known TMV-W since responded well with antiserum TMV-W. ワサビに感染していることが報告されているひも状ウイルスとしてはTuMVがあるが、TuMVの大きさが750nm×11nmであるのに対し検出されたひも状ウイルスの大きさは650〜700nm The string-like viruses that are infected with wasabi has been reported is TuMV, but the size of the string-shaped viruses magnitude of TuMV has been detected whereas it is 750 nm × 11 nm is 650~700nm
×13nmと大きく異なり、また、TuMVに感染した植物に特異的に見出される風車状封入体は見出されなかった。 Significantly different from × 13 nm, also windmill-like inclusion bodies specifically found in plants infected with TuMV was found. さらに、TuMVの抗血清と全く反応しなかった。 In addition, it did not react with anti-serum of TuMV. 以上のことからひも状ウイルスはTuMVとは異なるカルラウイルス(C Carla virus (C different from the more string-like virus from it TuMV
arlavirus)に属するウイルスであると判断した。 It was determined to be a virus belonging to the arlavirus). 一方、 on the other hand,
本発明の桿菌状〜弾丸状のウイルスは約230〜250nm×85 Bacillus shaped ~ bullet-like viruses of the invention from about 230 to 250 nm × 85
〜90nmで内部に約4.5nmのら旋構造のヌクレオキャプシドと外部に被膜を有することから、このウイルスはラブドウイルス(Pant rhabdovirus)に属するウイルスであると判断した。 Since it has a coating on nucleocapsid and external about 4.5nm Nora旋 structure inside ~90Nm, it is determined that this virus is a virus belonging to the rhabdovirus (Pant rhabdovirus).

c) 超薄切片法によるウイルスの細胞内所見 グルタルアルデヒドとオスミウム酸による二重固定法により固定したワサビ試料をエポキシ樹脂に包理・固化後、超薄切片を作成した。 c) After embedding and solidified wasabi sample fixed to the epoxy resin by a double fixation by intracellular findings glutaraldehyde and osmium acid of the virus by the ultrathin sectioning method to create a super-thin slice. この超薄切片を銅製グリッドにのせ酢酸ウランとクエン酸鉛による二重染色法で染色した。 It was stained with double staining by the ultrathin sectioning placed into copper grid uranyl acetate and lead citrate. この様に作成した試料を透過型電子顕微鏡で検鏡し、ウイルスの細胞内存在様式及びウイルス感染細胞の変化について観察した。 The samples prepared in this manner was microscopically with a transmission electron microscope, and observed for changes in the intracellular presence manner and virus-infected cells of a virus.

本発明のラブドウイルス(Pant rhabdovirus)に属する桿菌状〜弾丸状ウイルスは、核、核膜間隙及び細胞質に見出された。 Bacillus shaped ~ bullet virus belonging to the rhabdovirus of the present invention (Pant rhabdovirus) was found in the nucleus, nuclear membrane pore, and cytoplasm. 核内にはウイルス粒子と共に被膜をかぶっていないヌクレオキャプシドが認められた。 Is nucleocapsid not wearing a coat with virus particles was observed in the nucleus. 以上の所見から、このウイルスは核内増殖型のウイルスであることがわかった。 From the above findings, the virus was found to be nuclear-replicating virus.

d) 寄主範囲 本発明のラブドウイルス(Pant rhabdovirus)が他の植物に感染するかどうかについてアブラナ科植物を中心に6科29種の植物について接種試験を行った。 d) host plant range rhabdovirus of the present invention (Pant rhabdovirus) has performed the inoculation test about whether cruciferous plant center in 6 families 29 species of plants about what to infect other plants.

すなわち、ラブドウイルス(Pant rhabdovirus) In other words, rhabdovirus (Pant rhabdovirus)
カルラウイルス(Carlavirus)及びTMV-Wに混合感染している親ワサビ「真妻」(品種名)を接種源としてアブラナ科植物を中心に6科29種の植物に汁液接種した。 Was sap inoculated with cruciferous plants in 6 families 29 species of plant in the center as an inoculum source Carla virus (Carlavirus) and parent wasabi "true wife" that mixed infection in TMV-W (breed name). その結果を第1表および第2表に示す。 The results are shown in Tables 1 and 2. いずれの植物に対してもラブドウイルス(P−ant rhabdovirus)もカルラウイルス(Carlavirus)も感染を認められなかった。 Rhabdovirus to any of the plant (P-ant rhabdovirus) also Carla virus (Carlavirus) was not observed the infection. ラブドウイルス(P−ant rhabdovirus)がアブラナ科植物に感染することはヨーロッパで、ブロッコリーネクロティックイエロウス ウイルスとブラジルで、ラファナスSP.からの2種が報告されているだけであり、本発明のラブドウイルス(Pant rhabdovi That rhabdovirus (P-ant rhabdovirus) to infect cruciferous plants in Europe, with broccoli necrotic yellow mouse virus and Brazil, has only been reported two from Rafanasu SP., Loved of the present invention virus (Pant rhabdovi
rus)は、第1表に示した通り、ブロッコリーにもラファナス(ダイコン)にも感染せず、このことから本ウイルスは新種のウイルスであることが明らかとなった。 rus), as shown in Table 1, not infect Rafanasu (radish) to broccoli, the virus from this was found to be a new virus.

e) 新種ウイルスの現地発生調査 ワサビ栽培現地のウイルス発生調査を行なった。 e) was carried out on-site generation survey wasabi cultivation local virus outbreak investigation of new viruses. すなわち、ワサビ5品種31検体についてDN法で検定を行なったところ、ラブドウイルス(Pant rh-abdoviru In other words, it was subjected to a test in the DN method for wasabi 5 varieties 31 specimen, rhabdovirus (Pant rh-abdoviru
s)は「真妻」のみから検出され、退化現象による収量低下が問題となっているこのワサビ品種にとって、このウイルスは重要な影響を与えるウイルスであることが明らかとなった。 s) is detected only from the "true wife", for this wasabi varieties that yield reduction due to degeneration phenomenon has become a problem, the virus it became clear that the virus a significant impact.

〔発明の効果〕 〔Effect of the invention〕

本発明は、退化現象の現れたワサビから分離されたラブドウイルス(Pant rhabdovirus)に属する新種のウイルスを提供するものである。 The present invention is to provide a new type of virus belonging to Rhabdoviridae viruses isolated from emerged wasabi degenerative phenomena (Pant rhabdovirus). 本発明の新種ウイルスは、栽培中のワサビがこのウイルスに感染しているか否かの検定あるいは、組織培養により作出した培養体がウイルスフリーになっているか否かの検定のための抗体作製用抗原として利用することができる。 New virus of the present invention, antibody production for antigens for whether wasabi in cultivation is infected with this virus assay or whether cultures were produced by tissue culture is in virus-free assays it can be used as. また、このウイルスに感染したワサビの治療乃至感染予防のための研究の検体として利用することもできる。 It is also possible to use as a sample for research for the treatment or prevention of infection horseradish infected with this virus.

その結果、ワサビの退化現象を予防し、ワサビの品質を向上することができる。 As a result, prevent degeneration phenomenon wasabi, thereby improving the quality of wasabi.

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

第1図は、本発明の微生物ラブドウイルス(Pant Figure 1 is a microbial rhabdovirus of the present invention (Pant
rhabdovirus)の形態を示す電子顕微鏡写真である。 Is an electron micrograph showing the morphology of rhabdovirus).
(倍率220,000倍) (Magnification 220,000 times)

フロントページの続き (72)発明者 山下 修一 東京都江東区越中島1―3―16―104 (72)発明者 土崎 常男 茨城県稲敷郡茎崎町城山43―14 Of the front page Continued (72) inventor Shuichi Yamashita Koto-ku, Tokyo Etchujima 1-3-16-104 (72) inventor Tsuchizaki Tsuneo Inashiki-gun, Ibaraki Kukizaki-cho, Shiroyama 43-14

Claims (1)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】ワサビから分離され、ダイレクトネガティヴ法(DN法)で約230〜250×85〜90nmの桿菌状〜弾丸状形態を示し、内部にら旋構造のヌクレオキャプシドと外部に被膜とを有するラブドウイルス(Rhabdovirus)に属するウイルスまたはその変異株 1. A isolated from horseradish, it shows a bacillus shape-bullet-shaped configuration of about 230~250 × 85~90nm direct Negative method (DN) method, and a coating nucleocapsid and outside of the inner Nira旋 structure virus or a mutant strain belonging to the rhabdovirus (rhabdovirus) with
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