JPH0632614B2 - Immobilized microorganism and its use - Google Patents
Immobilized microorganism and its useInfo
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- JPH0632614B2 JPH0632614B2 JP27110086A JP27110086A JPH0632614B2 JP H0632614 B2 JPH0632614 B2 JP H0632614B2 JP 27110086 A JP27110086 A JP 27110086A JP 27110086 A JP27110086 A JP 27110086A JP H0632614 B2 JPH0632614 B2 JP H0632614B2
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Description
【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明は固定化微生物およびその利用に関する。さらに
詳しくは、増殖休止状態においてもβ−グルコシダーゼ
活性を示すリポマイセス(Lipomyces)属に属する酵母を
固定化した固定化微生物およびそれを利用してβ−グル
コシル化合物からの分解生成物の製造法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an immobilized microorganism and its use. More specifically, the present invention relates to an immobilized microorganism in which yeast belonging to the genus Lipomyces, which exhibits β-glucosidase activity even in a growth quiescent state, is immobilized, and a method for producing a decomposition product from a β-glucosyl compound using the same.
[従来技術] β−グルコシル化合物のβ−グルコシド結合を分解し、
分解生成物を製造することは、工業上しばしば行われて
いる。例えば、セルロースからグルコースを製造する場
合が挙げられる。[Prior Art] Decomposing a β-glucoside bond of a β-glucosyl compound,
The production of decomposition products is often carried out industrially. For example, the case of producing glucose from cellulose can be mentioned.
セルロースを分解してグルコースを製造するための一般
的方法は、強酸、高圧下で化学的に加水分解する方法で
あるが、この方法は装置の傷みがはげしく、また、グル
コースの分解が生じたり、反応液が褐変したりするなど
の欠点がある。The general method for decomposing cellulose to produce glucose is a method of chemically hydrolyzing under strong acid and high pressure, but this method is liable to cause damage to the device and also causes decomposition of glucose, There are drawbacks such as browning of the reaction solution.
従って、酵素を用いてより穏和な条件でセルロースを加
水分解する方法も多数報告されている。セルロースの分
解に関与する酵素は単一ではなく、エンド−β−1・4
グルカナーゼ、エキソ−β−1・4グルカナーゼおよび
β−グルコシダーゼ等の多様な酵素系からなるセルラー
ゼ複合酵素系であることはよく知られており、その作用
は、セルロースを分解し、これをセロオリゴ糖さらには
グルコースにまで糖化することである。このうちβ−グ
ルコシダーゼはグルカナーゼの作用により生じたセロオ
リゴ糖類をグルコースにまで分解する作用をもっている
と考えられている。従って、セルロースをグルコースに
高度に変換するためには、β−グルコシダーゼがセルラ
ーゼ複合物中の必須の成分である。また、セルロースを
セルラーゼ複合物で分解する際、グルカナーゼ活性に比
較してβ−グルコシダーゼ活性を弱いと、反応液中にセ
ロオリゴ糖が蓄積し、それがエンド−β−1・4グルカ
ナーゼ活性を阻害するため、酵素系全体のセルロース分
解力が弱まってしまう結果となり、その面からもβ−グ
ルコシダーゼ活性の高いことが必須である(Biotechnolo
gy and Bioengineering,Vol.XXIII 473,1981)。Therefore, many methods of hydrolyzing cellulose under milder conditions using an enzyme have been reported. The enzyme involved in the degradation of cellulose is not single, but endo-β-1.4
It is well known that it is a cellulase complex enzyme system consisting of various enzyme systems such as glucanase, exo-β-1.4 glucanase and β-glucosidase. Its action is to decompose cellulose and Is to saccharify to glucose. Among them, β-glucosidase is considered to have an action of degrading cellooligosaccharides produced by the action of glucanase into glucose. Therefore, β-glucosidase is an essential component in the cellulase complex for highly converting cellulose to glucose. In addition, when degrading cellulose with a cellulase complex, if β-glucosidase activity is weaker than glucanase activity, cellooligosaccharides accumulate in the reaction solution, which inhibits endo-β-1.4 glucanase activity. Therefore, the cellulose degrading power of the entire enzyme system is weakened, and also from this aspect, it is essential that the β-glucosidase activity is high (Biotechnolo
gy and Bioengineering, Vol.XXIII 473, 1981).
しかし、セルロースを含有する懸濁液にセルラーゼを添
加して主として回分法で行う従来の方法では、β−グル
コシダーゼを適時追加するなどしてその活性を増強する
ために種々工夫がなされているものの(特開昭57-15038
3号公報)、やはり多量の酵素の使用が避けられず、実
用化に供するには難かしい面があった。However, in the conventional method in which cellulase is added to a suspension containing cellulose and mainly performed by the batch method, various measures have been made in order to enhance its activity by, for example, adding β-glucosidase in a timely manner ( JP-A-57-15038
However, the use of a large amount of enzyme was unavoidable, and it was difficult to put it to practical use.
このため、加水分解速度を促進し、生成物を連続して分
離する研究も行われ、例えばセルロースから切断された
グルコースを限外過を利用して分離しながらセルロー
スを分解する方法も報告されている〔T.K.Chose and J.
A.Kostick,Biotechnol,Bioeng.,12,921(1970)〕。この
方法は、生成されるグルコースが反応系から除かれてゆ
き、蓄積されたグルコースによるβ−グルコシダーゼ活
性の阻害が起こらない点で優れている。しかし、この方
法は、限外過材の過面に、反応系中の含有不純物や
分解生成物が付着して過効率を低下させる欠点があ
り、実用性に乏しい。For this reason, studies have been conducted to accelerate the hydrolysis rate and continuously separate products, and for example, a method for degrading cellulose while separating glucose cleaved from cellulose using ultrafiltration has been reported. (TK Chose and J.
A. Kostick, Biotechnol, Bioeng., 12,921 (1970)]. This method is excellent in that the produced glucose is removed from the reaction system, and the accumulated glucose does not inhibit the β-glucosidase activity. However, this method has a drawback in that impurities contained in the reaction system and decomposition products adhere to the outer surface of the ultrafiltration material to reduce the over-efficiency, and thus it is not practical.
また、β−グルコシダーゼを固定化して流動層カラムに
充填し、これにセルラーゼ複合物によるセルロース糖化
液を通液し、グルコースを製造する方法も報告されてい
るが、β−グルコシダーゼを固定化する方法が煩雑であ
り、グルコースの生成効率や固定化酵素の安定性の面か
らみても必ずしも充分でない。Further, a method of immobilizing β-glucosidase and packing it in a fluidized bed column, and passing a cellulose saccharified solution by a cellulase complex into this to produce glucose has also been reported, but a method of immobilizing β-glucosidase. Is complicated, and it is not always sufficient in terms of glucose production efficiency and stability of the immobilized enzyme.
[発明が解決しようとする問題点] そこで、β−グルコシダーゼ活性をもち、かつ固定化が
酵素より容易な微生物を固定化して流動層カラムに充填
し、このカラムにセルロース糖化液を通液して絶えずグ
ルコシダーゼ活性を発現させることができれば、固定化
酵素を繰り返し調製、添加する必要がなく、効率よくグ
ルコースの生産が可能であると期待される。また、この
カラム法は、グルコースの蓄積による酵素活性の阻害も
起こらない点でも有利と考えられる。[Problems to be Solved by the Invention] Therefore, a microorganism having β-glucosidase activity and more easily immobilized than an enzyme is immobilized and packed in a fluidized bed column, and a saccharified cellulose solution is passed through this column. If the glucosidase activity can be constantly expressed, it is expected that the immobilized enzyme does not need to be repeatedly prepared and added, and glucose can be efficiently produced. Further, this column method is considered to be advantageous in that the enzyme activity is not inhibited by the accumulation of glucose.
β−グルコシダーゼ活性を持つ微生物としては酵母が広
く自然界に存在し、これらはセロビオースを単一炭素源
として好気的条件下で増殖する。しかしながら、β−グ
ルコシダーゼ生産能を有する酵母は、一般に嫌気的条件
下ではセロビオースを資化できず、また増殖休止状態で
もβ−グルコシダーゼ活性は極めて弱いことが知られて
いる。従って、これらの酵母を固定化菌体のようなバイ
オリアクターとして使用し、セロビオースからグルコー
スを得ようとすれば、栄養源を添加し酸素の存在下で、
絶えず酵母を増殖させて、酵素を生産させる必要があ
る。その結果、(1)工程が複雑となり、(2)雑菌汚染が生
じやすく、(3)増殖した酵母の菌体や不快臭が生成物に
混入し、(4)生成したグルコースが増殖した酵母に消費
されてしまう等の問題がある。このため、未だ固定化微
生物によるグルコースの工業的成功例は報告されていな
い。As a microorganism having β-glucosidase activity, yeast is widely present in nature, and they grow under aerobic conditions using cellobiose as a single carbon source. However, it is known that yeast having β-glucosidase-producing ability cannot generally assimilate cellobiose under anaerobic conditions, and that β-glucosidase activity is extremely weak even in a growth quiescent state. Therefore, when these yeasts are used as a bioreactor such as immobilized cells to obtain glucose from cellobiose, in the presence of oxygen by adding a nutrient source,
It is necessary to constantly grow yeast to produce enzymes. As a result, (1) the process is complicated, (2) contamination of bacteria is likely to occur, (3) bacterial cells and unpleasant odor of the grown yeast are mixed in the product, and (4) produced glucose is grown in the grown yeast. There are problems such as being consumed. For this reason, no industrial success example of glucose by immobilized microorganisms has been reported yet.
同様な問題は、天然着色剤の原料であるゲニピンを製造
する際にも知られていた。即ち、クチナシの実から得ら
れるイリドイド配糖体であるゲニポシドもしくはその含
有物をβ−グルコシダーゼで分解すればゲニピンが得ら
れるが、回分法で酵素処理を行うと非常に大量の酵素の
使用が必要になるばかりでなく、生成するゲニピンが酵
素自身の持つ第1級アミンと反応して、ゲニピンの収量
が減少するという問題があった。Similar problems were known in the production of genipin, a source of natural colorants. That is, if geniposide, which is an iridoid glycoside obtained from gardenia nuts, or its content is decomposed with β-glucosidase, genipin can be obtained, but when the enzyme treatment is performed by the batch method, it is necessary to use a very large amount of enzyme. In addition, the generated genipin reacts with the primary amine of the enzyme itself, resulting in a decrease in the yield of genipin.
従って、ゲニピンの製造においても、β−グルコシダー
ゼを生産する微生物をそのまま固定化して使用する方法
の開発が強く要求されている。しかしながら、従来知ら
れているβ−グルコシダーゼ生産微生物を使用すれば、
前記のとおり、絶えず菌体を増殖させながら、ゲニピン
を生産させなければならない。そのため、上記グルコー
ス生産の場合と同様の問題に加えて、生成物のゲニピン
が固定化担体から遊離して増殖した酵母のもつβ−グル
コシダーゼ等の酵素と反応し、生産効率を低下させると
いう問題があった。Therefore, also in the production of genipin, there is a strong demand for the development of a method in which a β-glucosidase-producing microorganism is directly immobilized and used. However, if a conventionally known β-glucosidase-producing microorganism is used,
As described above, genipin must be produced while constantly growing the cells. Therefore, in addition to the same problem as in the case of glucose production, the product genipin reacts with an enzyme such as β-glucosidase of yeast which is released from the immobilization carrier and proliferated, and there is a problem of decreasing production efficiency. there were.
本発明は、増殖休止状態でもβ−グルコシル化合物に対
するβ−グルコシダーゼ活性を示す微生物を見出すこと
により、上記問題を解決しようとするものである。The present invention is intended to solve the above problems by finding a microorganism that exhibits β-glucosidase activity against β-glucosyl compounds even in a growth quiescent state.
[問題点を解決するための具体的手段] 本発明者らは、ある種の酵母、特にリポマイセス属のあ
る種のものは、増殖状態(増殖系)においてだけでな
く、増殖休止状態(非増殖系)においても、β−グルコ
シダーゼ活性を示すという新事実を見出した。さらに、
これらの酵母を適当な担体に固定化して、β−グルコシ
ル化合物に作用させたところ、固定化後にも非増殖系で
のβ−グルコシダーゼ活性が長期間安定に維持される事
を見出した。[Specific Means for Solving Problems] The present inventors have found that certain yeasts, particularly certain yeasts of the genus Lipomyces, are not only in a growth state (growth system) but also in a growth quiescent state (non-growth state). System) has also found a new fact that it exhibits β-glucosidase activity. further,
When these yeasts were immobilized on a suitable carrier and allowed to act on a β-glucosyl compound, it was found that the β-glucosidase activity in the non-growing system was stably maintained for a long period of time even after immobilization.
従って、本発明は増殖休止状態においても、β−グルコ
シダーゼ活性を示すリポマイセス属に属する酵母を担体
に固定化してなる固定化微生物を提供する。さらに、本
発明はこの固定化微生物をβ−グルコシル化合物に連続
法もしくは回分法で繰り返し作用させて、目的の分解生
成物を効率的に生産する方法を提供する。Therefore, the present invention provides an immobilized microorganism in which yeast belonging to the genus Lipomyces which exhibits β-glucosidase activity is immobilized on a carrier even in a growth quiescent state. Furthermore, the present invention provides a method for efficiently producing a target decomposition product by causing this immobilized microorganism to act repeatedly on a β-glucosyl compound by a continuous method or a batch method.
固定化微生物 本発明に使用する酵母は、リポマイセス属に属し、非増
殖系でβ−グルコシダーゼ活性を示す任意の酵母から選
択される。その例としてリポマイセス スターキーHUT
7263、リポマイセス スターキーIFO 0678、リポマイセ
ス リポファーIFO 1288等があるが、これらに限定され
るものではなく、後記実施例1の方法に準じて、セロビ
オース資化性のリポマイセス属酵母から選択することが
できる。好ましくは、非増殖系でβ−グルコシダーゼ活
性が約5単位/g乾燥菌体以上、より好ましくは約20単
位/g乾燥菌体以上の酵母を選択する。Immobilized Microorganism The yeast used in the present invention is selected from any yeast belonging to the genus Lipomyces and exhibiting β-glucosidase activity in a non-growing system. As an example, Lipomyces Starkey HUT
7263, Lipomyces starkey IFO 0678, Lipomyces lipophore IFO 1288, and the like, but are not limited thereto, and can be selected from cellobiose-assimilating Lipomyces yeasts according to the method of Example 1 described below. . Preferably, a yeast having a β-glucosidase activity of about 5 units / g dry cells or more, more preferably about 20 units / g dry cells or more in a non-growing system is selected.
さらに、本発明に使用する酵母は、非増殖系での固定化
状態においてβ−グルコシダーゼ活性を示すものでなけ
ればならない。その確認は後記実施例2に準じておこな
うことができる。Furthermore, the yeast used in the present invention must exhibit β-glucosidase activity in the immobilized state in a non-growing system. The confirmation can be performed according to Example 2 described later.
本発明に於いて、酵母の固定化に用いる担体とは、酵母
をその内部もしくは表面に保持し、かつ保持された酵母
と、その基質であるβ−グルコシル化合物の接触を妨げ
ない任意の担体であってよい。例としてアルギン酸カル
シウム、ポリアクリルアミドゲル、寒天ゲル、セファロ
ースゲルのような、酵母を封入するが基質となるβ−グ
ルコシル化合物は通過させるマトリックスからなるゲル
状物質があげられる。担体に固定化する酵母の量に特に
制限はないが、固定化を妨げない範囲で多く使用するこ
とが好ましい。固定化微生物は、目的に応じてビーズ
状、顆粒状、板状、ブロック状等任意の形状にしてよい
が、カラムで使用するにはビーズ状が都合がよい。In the present invention, the carrier used for the immobilization of yeast is any carrier that holds the yeast inside or on the surface thereof and that does not prevent the held yeast from contacting the β-glucosyl compound that is the substrate thereof. You can Examples thereof include gel-like substances such as calcium alginate, polyacrylamide gel, agar gel, and sepharose gel, which consist of a matrix that encapsulates yeast but allows a β-glucosyl compound as a substrate to pass through. The amount of yeast immobilized on the carrier is not particularly limited, but it is preferable to use a large amount as long as the immobilization is not hindered. The immobilized microorganisms may have any shape such as beads, granules, plates and blocks depending on the purpose, but beads are convenient for use in a column.
固定化微生物によるβ−グルコシル化合物からの目的生
成物の生産 本発明の固定化微生物を使用すれば、酵母とβ−グルコ
シル化合物との接触を酵母の増殖休止条件下で行い、目
的とする分解生成物を生産することができる。このよう
に、反応系に栄養源を特に添加しなくてもよいから、雑
菌汚染が防止されるとともに、原材料の無駄を省くこと
もでき、目的生産物を後に精製する手間も軽減される。
さらに、増殖休止条件下で行えば、酵母の遊離菌体や不
快臭の目的産物への混入が起こらず、固定化担体から遊
離した増殖中の酵母による目的生産物、例えばグルコー
スの消費も起こらないという利点がある。Production of Target Product from β-Glucosyl Compound by Immobilized Microorganism When the immobilized microorganism of the present invention is used, contact between yeast and β-glucosyl compound is carried out under conditions of growth suspension of yeast, and the target decomposition product is produced. Can produce things. As described above, since it is not necessary to add a nutrient source to the reaction system, contamination of various bacteria can be prevented, waste of raw materials can be omitted, and labor for purifying the target product later can be reduced.
Furthermore, if the growth is carried out under resting conditions, free yeast cells and unpleasant odor do not contaminate the target product, and the target product by the growing yeast released from the immobilization carrier, for example, consumption of glucose does not occur. There is an advantage.
固定化微生物を使用して、β−グルコシル化合物から分
解生成物を取得する本発明の方法は、回分法で行って
も、カラムで連続的に行ってもよい。回分法で行うに
は、固定化微生物を適当濃度のβ−グルコシル化合物の
水性溶液に加えて、目的の分解生成物が得られるまで穏
やかに攪拌する。固定化微生物の使用量、β−グルコシ
ル化合物の濃度および反応時間等は、実験により適当な
条件を選択できる。反応温度は20〜45℃、好ましくは約
30〜40℃であり、好ましい反応pHは弱酸性、より好まし
くはpH3〜5である。セロビオースからグルコースを生
産する場合、例えば約100mMのセロビオース溶液に直
径約4mmのビーズ状固定化微生物約50粒を加え、pH約5
で35℃、30分間反応させ、良好な結果が得られる。The method of the present invention for obtaining a decomposition product from a β-glucosyl compound using an immobilized microorganism may be performed by a batch method or continuously by a column. To perform the batch method, the immobilized microorganisms are added to an aqueous solution of a β-glucosyl compound at an appropriate concentration and gently stirred until the desired decomposition product is obtained. The amount of the immobilized microorganism used, the concentration of the β-glucosyl compound, the reaction time, and the like can be selected as appropriate by experiments. The reaction temperature is 20 to 45 ° C, preferably about
The temperature is 30 to 40 ° C., and the preferable reaction pH is weakly acidic, more preferably pH 3 to 5. When glucose is produced from cellobiose, for example, about 50 mM bead-shaped immobilized microorganisms with a diameter of about 4 mm are added to a cellobiose solution of about 100 mM, and a pH of about 5 is added.
Good results are obtained by reacting at 35 ℃ for 30 minutes.
本発明の方法をカラムを使用して連続的に行うには、固
定化微生物を適当な直径および高さのカラムに充填し、
β−グルコシル化合物を含有する水性溶液を適当な流速
で流入させることにより行う。その際の温度、pHおよび
β−グルコシル化合物の濃度等の反応条件は上記と同様
であり、その他の各条件は実験で定めることができる。In order to carry out the method of the present invention continuously using a column, the immobilized microorganism is packed in a column having an appropriate diameter and height,
It is carried out by flowing an aqueous solution containing a β-glucosyl compound at an appropriate flow rate. The reaction conditions such as temperature, pH, and β-glucosyl compound concentration at that time are the same as above, and other conditions can be determined by experiments.
本発明の固定微生物はそのβ−グルコシダーゼ活性が長
期間安定であるから、回分法で使用するときも、回収し
て繰り返し使用が可能であり、酵素をそのまま使用する
場合に多量の酵素を必要とするのに比べてはるかに有利
である。カラム法で使用するときも長期間の連続使用が
可能である。さらに、固定化微生物のβ−グルコシダー
ゼ活性が低下したときは、固定化微生物を適当な増殖培
地中に20〜40℃で数時間ないし数日間静置または振盪培
養、好ましくは30〜35℃で約24時間振盪培養することに
よりその活性を回復させ、再使用することができる。Since the β-glucosidase activity of the immobilized microorganism of the present invention is stable for a long period of time, even when used in the batch method, it can be recovered and repeatedly used, and a large amount of enzyme is required when the enzyme is used as it is. It is much more advantageous than doing. When used in the column method, it can be used continuously for a long period of time. Furthermore, when the β-glucosidase activity of the immobilized microorganism is decreased, the immobilized microorganism is allowed to stand or shake culture in a suitable growth medium at 20 to 40 ° C for several hours to several days, preferably at 30 to 35 ° C. The activity can be recovered by shaking culture for 24 hours and reused.
本発明の方法は、水性溶液中の任意のβ−グルコシル化
合物に適用して、その分解生成物を生産することが可能
である。The method of the present invention can be applied to any β-glucosyl compound in aqueous solution to produce its degradation product.
例えば本発明の方法の一態様によれば、セロビオースを
固定化微生物に接触させて、分解生成物のグルコースを
生産することができる。その際、セロビオースとして、
あらかじめセルロースを可溶性セルラーゼ複合物で部分
的に糖化した糖化液を使用すれば、セルロースからのグ
ルコースの連続的製造も可能になる。さらに、固定化微
生物カラムからの流出液を、引き続いてアルコール発酵
酵母に接触させれば、セルロースからのエタノールの連
続発酵も可能である。For example, according to one aspect of the method of the present invention, cellobiose can be contacted with an immobilized microorganism to produce the decomposition product glucose. At that time, as cellobiose,
If a saccharified solution obtained by partially saccharifying cellulose with a soluble cellulase complex in advance is used, continuous production of glucose from cellulose is also possible. Furthermore, continuous fermentation of ethanol from cellulose is also possible if the effluent from the immobilized microbial column is subsequently contacted with alcohol-fermenting yeast.
本発明の方法の他の好ましい態様は、ゲニポシドからの
アグリコンであるゲニピンの製造である。この製造にお
いて、本発明の方法をカラムで行うと特に効率的であ
る。何故なら、固定化微生物カラムから流出される溶液
を冷却するだけで、ゲニポシドとの溶解度の差に基づい
て、目的とするゲニピンを結晶状で回収できるからであ
る。こうして得られたゲニピンはさらに第1級アミノ基
含有化合物と反応させて、青色色素を得ることができ
る。Another preferred embodiment of the method of the invention is the production of the aglycone genipin from geniposide. In this production, it is particularly efficient to carry out the method of the invention on a column. This is because the desired genipin can be recovered in crystalline form based on the difference in solubility with geniposide, simply by cooling the solution flowing out from the immobilized microorganism column. The genipin thus obtained can be further reacted with a primary amino group-containing compound to obtain a blue dye.
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明する。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples.
実施例1 非増殖系でβ−グルコシダーゼ活性を有する酵母の選択 第1表に示す11株のセロビオース資化性酵母(これらは
いずれも増殖系でβ−グルコシダーゼ活性を示す)を、
第2表で示すセロビオースを唯一の炭素源とする培地
で、30℃、36時間振盪培養した。得られた菌体(菌体量
は第1表に示す)を、pH5の100mM酢酸バッファーで
洗浄したのち4℃で一夜同じバッファーで保持した。Example 1 Selection of Yeast Having β-Glucosidase Activity in Non-Proliferation System Eleven cellobiose-assimilating yeasts shown in Table 1 (all of which show β-glucosidase activity in a growth system)
The cells were cultured with shaking at 30 ° C. for 36 hours in a medium containing cellobiose as a sole carbon source shown in Table 2. The obtained bacterial cells (the amount of bacterial cells are shown in Table 1) were washed with 100 mM acetate buffer of pH 5 and then kept in the same buffer overnight at 4 ° C.
次に、この増殖静止状態の菌体を用いて、3.4%セロビ
オースを含有するpH5の酢酸バッファー中37℃、30分間
でのセロビオース分解活性を測定した。分解活性は、残
存するセロビオース量および生成するグルコース量をHP
LCで定量することにより行った。 Next, the cellobiose-degrading activity at 37 ° C. for 30 minutes in an acetate buffer containing 3.4% cellobiose and having a pH of 5 was measured using the cells in the growth quiescent state. Degradation activity determines the amount of cellobiose remaining and the amount of glucose produced by HP.
It was performed by quantifying by LC.
その結果、第1表に示すように、リポマイセス(Lipomyc
es)属の酵母の数株(特に、リポマイセス スターキーH
UT 7263、IFO 0678およびリポマイセス リポファーIFO
1288)が、増殖静止状態でも高いセロビオース分解活性
を有することが見出された。As a result, as shown in Table 1, lipomyces (Lipomyc
es) several yeast strains (especially Lipomyces starkey H
UT 7263, IFO 0678 and Lipomyces Lipopher IFO
1288) was found to have a high cellobiose degrading activity even in the growth quiescent state.
尚、第1表中これらの酵母に付与されているHUTおよびI
FOは各々広島大学工学部および財団法人発酵研究所の保
存番号であり、当業者は入手可能である。さらに、リポ
マイセス スターキーHUT 7263は、SAM 0433と命名し、
微工研に寄託番号FERM P-9037を得て寄託されている。In Table 1, HUT and I assigned to these yeasts
FO is a preservation number of Faculty of Engineering, Hiroshima University and Fermentation Research Institute, respectively, and can be obtained by those skilled in the art. In addition, Lipomyces Starkey HUT 7263 is named SAM 0433,
Deposited with the deposit number FERM P-9037 at the Institute of Mechanical Engineering.
実施例2 (i)固定化菌体の調製およびセロビオースの分解 リポマイセス スターキーHUT 7263(FERM P-9037)一白
金耳を90mlのセロビオース培地(セロビオース1%、酵
母エキス0.5%、pH5.7)で30℃、48時間振盪培養し、菌
体を遠沈集菌、洗浄後、2%のアルギン酸ナトリウム溶
液に懸濁しこれを1%のCaCl2溶液に滴下すること
により固定化酵母を調製した。Example 2 (i) Preparation of Immobilized Cells and Degradation of Cellobiose Lipomyces Starkey HUT 7263 (FERM P-9037) One platinum loop was treated with 90 ml of cellobiose medium (cellobiose 1%, yeast extract 0.5%, pH 5.7). After culturing with shaking at 30 ° C. for 48 hours, the cells were centrifugally precipitated, washed, and then suspended in a 2% sodium alginate solution, and the suspension was added dropwise to a 1% CaCl 2 solution to prepare an immobilized yeast.
次に、このように調製した直径約4mmのビーズ状固定化
酵母50粒を100mM濃度のセロビオース溶液(酢酸バッ
ファー、pH5)に加え、35℃で30分間反応後、生成する
グルコース量をHPLCで測定することにより固定化酵母
(リポマイセス)のβ−グルコシダーゼ活性を算出し
た。その結果、本固定化酵母の活性は1.5単位/mlゲル
であった。Next, 50 beads of immobilized bead-shaped yeast having a diameter of about 4 mm prepared in this way were added to a 100 mM cellobiose solution (acetate buffer, pH 5), and after reacting at 35 ° C for 30 minutes, the amount of glucose produced was measured by HPLC. Then, the β-glucosidase activity of the immobilized yeast (Lipomyces) was calculated. As a result, the activity of the present immobilized yeast was 1.5 unit / ml gel.
次に、本固定化酵母の繰返し使用の可能性を調べるた
め、反応(30℃、30分間)後の上澄液を新しいセロビオ
ース溶液で置き換え、上記と同様な条件で反応を繰返し
ていくという実験を15回繰返した。その結果、第1図に
示すように、13回の繰返し使用ではβ−グルコシダーゼ
活性は全く低下せず、14回以降で若干低下するにすぎな
かった。尚、第1図では、最初の反応における活性を10
0として各回数時の活性を相対活性で示している。Next, in order to investigate the possibility of repeated use of the immobilized yeast, an experiment in which the supernatant after the reaction (30 ° C, 30 minutes) was replaced with a new cellobiose solution, and the reaction was repeated under the same conditions as above. Was repeated 15 times. As a result, as shown in FIG. 1, the β-glucosidase activity did not decrease at all after repeated use of 13 times, but only slightly decreased after 14 times. In Fig. 1, the activity in the first reaction is 10
As 0, the activity at each number of times is shown by relative activity.
(ii)再培養によるβ−グルコシダーゼ活性の回復 β−グルコシダーゼ活性が低下した固定化酵母は、前述
のセロビオース培地で30℃、48時間再培養することによ
り活性を回復することができた。その1例を第2図に示
す。第2図は15回繰返し使用により活性が低下した固定
化酵母(リポマイセス スターキーHUT 7263)の再培養
による活性の回復を示したものである。(ii) Recovery of β-glucosidase activity by reculturing The immobilized yeast having a decreased β-glucosidase activity was able to recover the activity by reculturing in the cellobiose medium at 30 ° C. for 48 hours. One example is shown in FIG. FIG. 2 shows the recovery of the activity of the immobilized yeast (Lipomyces starkey HUT 7263) whose activity was reduced by repeated use 15 times.
(iii)固定化菌体のカラムによる連続使用 続いて、本実施例において調製したリポマイセス スタ
ーキーHUT 7263の固定化菌体(以下固定化リポマイセス
と称す)の連続的使用の可能性について調べた。即ち、
固定化リポマイセス2mlをガラスカラムに充填して40℃
に保ち、100mM濃度のセロビオース溶液を0.7ml/hrで
送液し、流出する溶液中の残存するセロビオース量およ
び生成したグルコース量を経時的に測定した。その結果
第3図に示すように、20日間に亘りグルコース生成収率
は95%を保ち、固定化リポマイセスによる長期に安定し
た連続的グルコース生産が可能であることが示された。(iii) Continuous use of immobilized cells by column Next, the possibility of continuous use of the immobilized cells of Lipomyces Starkey HUT 7263 (hereinafter referred to as immobilized Lipomyces) prepared in this Example was investigated. That is,
2 ml of immobilized Lipomyces was packed in a glass column and 40 ℃
The cellobiose solution having a concentration of 100 mM was fed at 0.7 ml / hr, and the amount of residual cellobiose in the solution flowing out and the amount of glucose produced were measured with time. As a result, as shown in FIG. 3, the glucose production yield was kept at 95% for 20 days, and it was shown that stable and continuous glucose production was possible for a long period by immobilized Lipomyces.
尚、他のリポマイセス酵母、IFO 0678およびIFO 1288に
おいて活性量のちがいはあるが、上記と同様な結果であ
った。It should be noted that the results were similar to those described above, although there was a difference in the activity levels of the other lipomyces yeasts, IFO 0678 and IFO 1288.
実施例3 固定化リポマイセスによるセルロースの糖化 固定化リポマイセスによるセルロースの糖化効率につい
て、第4図のような装置を用いて調べた。Example 3 Saccharification of Cellulose by Immobilized Lipomyces The saccharification efficiency of cellulose by immobilized Lipomyces was examined using an apparatus as shown in FIG.
即ち、第4図において反応槽Aにとうもろこし由来のセ
ルロース(44g/)とアスペルギルス由来のセルラー
ゼ(新日本化学工業社製:230単位/)との溶液(pH
5)を入れ、50℃に保ち攪拌する。次にこの反応槽Aか
らの透明な反応液の1部を、35℃に保った固定化リポマ
イセス(1)の20%充填流動床型リアクター(反応槽B)
(pH5)にリサイクルしながら導入し、反応槽A内の混
合物(2)におけるセロビオースとグルコース濃度の経時
変化を測定した。一方、反応槽Bを通さないリサイクル
系における反応槽Aにおけるセロビオースとグルコース
濃度を測定し、固定化リポマイセスの効果を評価した。
その結果、第5図に示すように、反応槽Bを通してリサ
イクルした場合、グルコース(−○−)濃度が上昇しセ
ロビオース(−△−)が低濃度に保たれ、これに対し反
応槽Bを通さない場合はグルコース(−●−)生成量は
低く、セロビオース(−▲−)濃度が高いことが示され
た。これは、反応槽Bを通すことにより、反応液中のセ
ロビオースの糖化活性(β−グルコシダーゼ活性)が向
上し、その結果セロビオース濃度が低下し、それに伴い
セロビオースによるグルコース生成物阻害が低下して、
セルロースの糖化系全体の活性が向上したものと考えら
れる。That is, in FIG. 4, a solution (pH of cellulose (44 g /) derived from corn and cellulase derived from Aspergillus (manufactured by Shin Nippon Kagaku Kogyo Co., Ltd .: 230 units /) in reaction tank A (pH).
Add 5), hold at 50 ° C and stir. Next, a part of the transparent reaction solution from this reaction tank A was kept at 35 ° C. in a immobilized Lipomyces (1) 20% packed fluidized bed reactor (reaction tank B).
The mixture was introduced into (pH 5) while being recycled, and changes with time of cellobiose and glucose concentrations in the mixture (2) in the reaction tank A were measured. On the other hand, the cellobiose and glucose concentrations in the reaction tank A in the recycle system in which the reaction tank B was not passed were measured to evaluate the effect of immobilized lipomyces.
As a result, as shown in FIG. 5, when recycled through the reaction tank B, the glucose (− ○ −) concentration increased and cellobiose (−Δ−) was maintained at a low concentration. It was shown that the glucose (-●-) production amount was low and the cellobiose (-▲-) concentration was high when there was no glucose. This is because, by passing through the reaction tank B, the saccharification activity of cellobiose in the reaction solution (β-glucosidase activity) is improved, and as a result, the cellobiose concentration is decreased, and accordingly, the inhibition of glucose products by cellobiose is decreased,
It is considered that the activity of the entire saccharification system of cellulose was improved.
実施例4 固定化リポマイセスによるゲニポシドからゲニピンの製
造 (i)非増殖系での微生物のゲニポシド分解活性: リポマイセス スターキーHUT 7263一白金耳をセロビオ
ース培地(セロビオース1.0%、酵母エキス0.5%、pH5.
7)90mlに植菌し、30℃、48時間振盪培養し、培養液5m
lを遠沈し、無菌水で洗浄した菌体を130mMのゲニポシ
ド溶液5mlに加え、35℃、30分反応させゲニピン生成量
をHPLCで測定しβ−グルコシダーゼ活性を求めた。1分
間に1μモルのゲニピンを生成する活性を1unit(ユニ
ット)とした。Example 4 Production of Genipin from Geniposide by Immobilized Lipomyces (i) Microbial Geniposide Degrading Activity in Non-Proliferation System: Lipomyces Starkey HUT 7263 One platinum loop of cellobiose medium (cellobiose 1.0%, yeast extract 0.5%, pH 5.
7) Inoculate 90 ml and cultivate with shaking at 30 ℃ for 48 hours.
l was spun down and washed with sterile water, and the bacterial cells were added to 5 ml of a 130 mM geniposide solution, reacted at 35 ° C. for 30 minutes, and the amount of genipin produced was measured by HPLC to determine β-glucosidase activity. The activity of producing 1 μmol of genipin in 1 minute was defined as 1 unit.
その結果、48時間振盪培養後の菌数は6.24×107cells/m
lになり、この菌体のβ−グルコシダーゼ活性は2.45×1
0-7単位/cellを示した。As a result, the number of bacteria after shaking culture for 48 hours was 6.24 × 10 7 cells / m 2.
The β-glucosidase activity of this bacterium was 2.45 × 1
0-7 units / cell was shown.
(ii)非増殖系での固定化リポマイセス スターキーの繰
り返しゲニポシド分解活性; 上記(i)の方法で培養し培養液90mlから集菌したリポマ
イセス スターキーを2%アルギン酸ナトリウム溶液5
mlに懸濁し、1%CaCl2溶液20mlに滴下し、固定化
酵母を調製した。195mMのゲニポシド溶液5mlに固定
化酵母50個を加え、35℃で30分、24時間反応させ、ゲニ
ピン生成量をHPLCで測定した。30分後のゲニピン生成量
から活性を求め、24時間後のゲニピン生成量からゲニピ
ン生成収率を求めた。24時間後に反応液を除き、新しい
基質を加え、上記の操作を8回繰り返した。(ii) Repeated Geniposide Degrading Activity of Immobilized Lipomyces Starkey in Non-Proliferation System; 2% sodium alginate solution of Lipomyces Starkey collected from 90 ml of the culture cultivated by the method of (i) above
Immobilized yeast was prepared by suspending it in 20 ml of 1% CaCl 2 solution. Fifty immobilized yeasts were added to 5 ml of a 195 mM geniposide solution, reacted at 35 ° C. for 30 minutes for 24 hours, and the amount of genipin produced was measured by HPLC. The activity was determined from the amount of genipin produced after 30 minutes, and the yield of genipin production was determined from the amount of genipin produced 24 hours later. After 24 hours, the reaction solution was removed, a new substrate was added, and the above operation was repeated 8 times.
その結果、固定化酵母の活性は、1.11単位/mlゲル、1.
00×10-9単位/cellを示した。固定化酵母の8回繰り返
し使用による活性と24時間後のゲニピンの生成量の変化
を第6図に示した。活性は1回目の活性を100%とし
た。本固定化酵母は8回の繰り返し使用による活性の低
下は見られなかった。さらに、24時間後のゲニピン生成
収率は、90%と高い値を示した。As a result, the activity of immobilized yeast was 1.11 units / ml gel, 1.
00 × 10 -9 units / cell was shown. FIG. 6 shows the activity of the immobilized yeast repeatedly used 8 times and the change in the amount of genipin produced after 24 hours. Regarding the activity, the activity at the first time was 100%. This immobilized yeast did not show a decrease in activity after repeated use eight times. Furthermore, the yield of genipin production after 24 hours was as high as 90%.
(iii)固定化リポマイセス スターキーによるゲニポシ
ドの連続加水分解: 実施例(4)−(ii)で調製した固定化リポマイセス スタ
ーキー2mlをガラスカラムに充填し、40℃に保ち、195
mMのゲニポシド溶液を0.7ml/hrで送液した。流出する
ゲニポシドの加水分解液を経時的に採取した残存ゲニポ
シド濃度および生成ゲニピン濃度を測定した。(iii) Continuous hydrolysis of geniposide by immobilized Lipomyces starkey: 2 ml of immobilized Lipomyces starkey prepared in Example (4)-(ii) was packed in a glass column and kept at 40 ° C., 195
The mM geniposide solution was delivered at 0.7 ml / hr. The hydrolyzed liquid of geniposide that flowed out was collected over time, and the concentration of residual geniposide and the concentration of generated genipin were measured.
その結果、20日間ゲニピン生成収率は95%を保った。そ
の後、ゲニピン生成収率は徐々に減少し40日後には80%
に低下した。As a result, the yield of genipin production was kept at 95% for 20 days. After that, the yield of genipin production gradually decreased to 80% after 40 days.
Fell to.
(iv)固定化リポマイセス スターキーの再培養によるゲ
ニポシド分解活性の再活性化: 実施例(4)−(iii)で40日間連続運転した固定化リポマイ
セス スターキーをカラムリアクターから取り出し、実
施例(4)−(ii)の方法で固定化リポマイセス スターキ
ーのβ−グルコシダーゼ活性を測定した(第7図)。そ
の結果、固定化酵母の活性は、0.71単位/mlゲル、を示
した調製時の64%に減少していた。そこで、この固定化
酵母2mlをセロビオース培地(セロビオース1.0%、酵
母エキス0.5%、pH5.65)20mlに入れ、30℃で24時間振
盪培養し、培養液の固定化酵母のβ−グルコシダーゼ活
性を測定した結果、1.30単位/mlゲルの活性を示し調製
時の活性を上回る活性を示した。(iv) Reactivation of geniposide-degrading activity by reculturing immobilized Lipomyces starkey: In Example (4)-(iii), immobilized Lipomyces starkey that was continuously operated for 40 days was taken out from the column reactor, and )-(Ii) was used to measure the β-glucosidase activity of immobilized Lipomyces starkey (FIG. 7). As a result, the activity of the immobilized yeast was reduced to 64% at the time of preparation, which showed 0.71 unit / ml gel. Therefore, 2 ml of this immobilized yeast was placed in 20 ml of cellobiose medium (cellobiose 1.0%, yeast extract 0.5%, pH 5.65), and cultured by shaking at 30 ° C for 24 hours, and the β-glucosidase activity of the immobilized yeast in the culture solution was measured. As a result, the activity of the gel was 1.30 units / ml, which was higher than the activity at the time of preparation.
(v)ゲニポシド連続加水分解液からのゲニピンの結晶
化: 実施例(4)−(iv)の方法で得たゲニポシドの加水分解液5
0mlを5℃で24時間静置した。その結果、針状の結晶が
現われた。本結晶を別し、乾燥し1.2gの乾燥物を得
た。本乾燥物をメタノールに溶解しHPLCを用いて分析し
た結果(カラムYMC-ODS A-312、溶媒:43%メタノール
1ml/hr、検出:UV-240nm)、純度98%のゲニピンであ
ることを確認した。(v) Crystallization of Genipin from Continuous Hydrolysis Solution of Geniposide: Hydrolysis solution of geniposide obtained by the method of Example (4)-(iv) 5
0 ml was left at 5 ° C. for 24 hours. As a result, needle-like crystals appeared. This crystal was separated and dried to obtain 1.2 g of a dried product. The dried product was dissolved in methanol and analyzed by HPLC (column YMC-ODS A-312, solvent: 43% methanol 1 ml / hr, detection: UV-240 nm), and it was confirmed to be genipin with a purity of 98%. did.
ゲニポシドの加水分解液50ml中のゲニピン量は2.05gで
あり、そのうち1.2gが非常に容易に結晶として採取で
きたことになる。The amount of genipin in 50 ml of the hydrolyzed solution of geniposide was 2.05 g, and 1.2 g of it could be collected as crystals very easily.
また、結晶を除いた母液中の残存ゲニピンは、母液を減
圧濃縮し1.5倍に濃縮した後、5℃で24時間静置するこ
とにより、ゲニピン結晶が再び析出し0.3gのゲニピン
結晶を得ることができた。For the remaining genipin in the mother liquor after removing the crystals, concentrate the mother liquor under reduced pressure to 1.5 times and then leave it at 5 ° C. for 24 hours to precipitate genipin crystals again to obtain 0.3 g of genipin crystals. I was able to.
[発明の効果] 上述のように、本発明は、β−グルコシル化合物のβ−
グルコシド結合を切断して得られる反応生成物の効率的
製造をもたらすものであり、産業上の有用性は大なるも
のである。EFFECTS OF THE INVENTION As described above, the present invention provides a β-glucosyl compound β-
It provides efficient production of a reaction product obtained by cleaving the glucoside bond, and has great industrial utility.
第1図は、固定化リポマイセスの繰返し使用におけるβ
−グルコシダーゼ活性の変化を示すグラフである。 第2図は、固定化リポマイセスの再培養によるβ−グル
コシダーゼの再活性化を示すグラフである。 第3図は、固定化リポマイセスによるセロビオースの連
続糖化のパターンを示すグラフである。 第4図は、セルロースの糖化実験装置を示す模式図であ
る。 第5図はセルロース糖化実験におけるグルコースおよび
セロビオースの生成経過を示すグラフである。 第6図は、固定化リポマイセスの繰返し使用におけるゲ
ニポシド分解活性を示すグラフである。 第7図は固定化リポマイセスによるゲニポシドの連続加
水分解を示すグラフである。 1……固定化リポマイセス 2……反応槽A内の混合物 A……反応槽 B……固定化リポマイセスを充填した反応槽Fig. 1 shows β in repeated use of immobilized Lipomyces.
-Is a graph showing changes in glucosidase activity. FIG. 2 is a graph showing reactivation of β-glucosidase by reculturing immobilized Lipomyces. FIG. 3 is a graph showing a pattern of continuous saccharification of cellobiose by immobilized Lipomyces. FIG. 4 is a schematic diagram showing an apparatus for saccharification of cellulose. FIG. 5 is a graph showing the production process of glucose and cellobiose in a cellulose saccharification experiment. FIG. 6 is a graph showing the geniposide degrading activity in repeated use of immobilized Lipomyces. FIG. 7 is a graph showing continuous hydrolysis of geniposide by immobilized Lipomyces. 1 ... Immobilized Lipomyces 2 ... Mixture in reaction tank A A ... Reaction tank B ... Reaction tank filled with immobilized Lipomyces
Claims (12)
ゼ活性を示すリポマイセス(Lipomyces)属に属する酵母
を担体に固定化してなる固定化微生物。1. An immobilized microorganism in which yeast belonging to the genus Lipomyces, which exhibits β-glucosidase activity even in a growth quiescent state, is immobilized on a carrier.
es starkeyi)またはリポマイセス リポファー(Lipomyc
es Lipofer)である特許請求の範囲第1項記載の固定化
微生物。2. The yeast is Lipomyces starkey (Lipomyc
es starkeyi) or Lipomyces lipophers (Lipomyc
The immobilized microorganism according to claim 1, which is an es lipofer).
RM P-9037またはIFO 0678である特許請求の範囲第2項
記載の固定化微生物。3. The deposit number of Lipomyces Starkey is FE.
The immobilized microorganism according to claim 2, which is RMP-9037 or IFO 0678.
O 1288である特許請求の範囲第2項記載の固定化微生
物。4. The deposit number of Lipomyces Lipopher is IF
The immobilized microorganism according to claim 2, which is O 1288.
を特徴とする特許請求の範囲第1項ないし第4項記載の
固定化微生物。5. The immobilized microorganism according to any one of claims 1 to 4, which is immobilized with calcium alginate.
ゼ活性を示すリポマイセス(Lipomyces)属に属する酵母
を担体に固定化してなる固定化微生物に、β−グルコシ
ル化合物を接触せしめて、該化合物のβ−グルコシド結
合を切断し、得られた分解生成物を取得する方法。6. A β-glucosyl compound is contacted with an immobilized microorganism obtained by immobilizing a yeast belonging to the genus Lipomyces, which exhibits β-glucosidase activity even in a growth quiescent state, on a carrier, and β-glucosyl compound A method of cleaving the glucosidic bond and obtaining the resulting decomposition product.
接触を、前記酵母の増殖休止条件下で行う特許請求の範
囲第6項記載の方法。7. The method according to claim 6, wherein the contact between the immobilized microorganism and the β-glucosyl compound is carried out under the growth quiescent condition of the yeast.
はゲニポシドである特許請求の範囲第7項記載の方法。8. The method according to claim 7, wherein the β-glucosyl compound is cellooligosaccharide or geniposide.
ある特許請求の範囲第7項記載の方法。9. The method according to claim 7, wherein the decomposition product is glucose or genipin.
リポマイセス リポファーである特許請求の範囲第8項
記載の方法。10. The method according to claim 8, wherein the yeast is Lipomyces starkey or Lipomyces lipophore.
栄養物を実質的に含まない条件である、特許請求の範囲
第6項記載の方法。11. The method according to claim 6, wherein the growth suspension condition of yeast is a condition substantially free of nutrients as a nitrogen source.
し、β−グルコシル化合物との接触を連続的に行う、特
許請求の範囲第6項記載の方法。12. The method according to claim 6, wherein the immobilized microorganism is used by being packed in a column, and the contact with the β-glucosyl compound is continuously performed.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP27110086A JPH0632614B2 (en) | 1986-11-14 | 1986-11-14 | Immobilized microorganism and its use |
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JP27110086A JPH0632614B2 (en) | 1986-11-14 | 1986-11-14 | Immobilized microorganism and its use |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63123382A JPS63123382A (en) | 1988-05-27 |
JPH0632614B2 true JPH0632614B2 (en) | 1994-05-02 |
Family
ID=17495347
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JP27110086A Expired - Lifetime JPH0632614B2 (en) | 1986-11-14 | 1986-11-14 | Immobilized microorganism and its use |
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---|---|---|---|---|
KR20020029885A (en) * | 2002-03-19 | 2002-04-20 | 대한민국 (경북대학교총장) | Cross-linked calcium alginate bead containing cell-suspension from a brewery, method for preparation thereof and heavy metal recovery thereof |
JP5470612B2 (en) * | 2008-05-22 | 2014-04-16 | 国立大学法人弘前大学 | Sugar chain modification method and sugar chain modification apparatus |
-
1986
- 1986-11-14 JP JP27110086A patent/JPH0632614B2/en not_active Expired - Lifetime
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JPS63123382A (en) | 1988-05-27 |
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