JPH06321978A - New carcinostatic antibiotic substance mj654-nf4 substance and its production - Google Patents
New carcinostatic antibiotic substance mj654-nf4 substance and its productionInfo
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- JPH06321978A JPH06321978A JP5139231A JP13923193A JPH06321978A JP H06321978 A JPH06321978 A JP H06321978A JP 5139231 A JP5139231 A JP 5139231A JP 13923193 A JP13923193 A JP 13923193A JP H06321978 A JPH06321978 A JP H06321978A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は抗腫瘍活性を有する新規
な制癌性抗生物質、ＭＪ６５４−ＮＦ４物質及びその製
造法に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a novel antitumor antibiotic having antitumor activity, MJ654-NF4 substance, and a method for producing the same.
【０００２】[0002]
【従来の技術】微生物の生産する物質はこれまで多く報
告されており、癌及び感染症の治療に広く用いられてい
る。このうちストレプトミセス属に属する微生物の生産
する抗腫瘍性抗生物質としてはアクチノマイシンＤ、マ
イトマイシンＣ、ブレオマイシン、アドリアマイシン等
が知られている。2. Description of the Related Art Many substances produced by microorganisms have been reported so far and are widely used for the treatment of cancer and infectious diseases. Of these, actinomycin D, mitomycin C, bleomycin, adriamycin, etc. are known as antitumor antibiotics produced by microorganisms belonging to the genus Streptomyces.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】本発明は抗腫瘍活性を
有する有用な新規抗生物質を得ることを目的とする。DISCLOSURE OF THE INVENTION The object of the present invention is to obtain a useful novel antibiotic having antitumor activity.
【０００４】[0004]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、微生物の
生産物中に有用な新規な生理活性物質を見いだす目的
で、天然の土壌より数多くの微生物を単離し、その生産
物について種々の研究を行った。The present inventors have isolated a large number of microorganisms from natural soil in order to find useful novel bioactive substances in the products of microorganisms, I did a research.
【０００５】その研究の結果、本発明者らは、土壌より
分離したストレプトミセス属に属する微生物であるＭＪ
６５４−ＮＦ４株の培養液中に抗腫瘍活性を有する抗生
物質、ＭＪ６５４−ＮＦ４物質が生産され蓄積されてい
ることを認め、その物質を単離して物理化学的性状と生
物学的活性を調べ、この物質が抗腫瘍活性を有する新規
化合物であることを見いだして本発明を完成した。As a result of the research, the present inventors have found that MJ, which is a microorganism belonging to the genus Streptomyces isolated from soil.
It was confirmed that an antibiotic substance having an antitumor activity, MJ654-NF4 substance, was produced and accumulated in the culture solution of 654-NF4 strain, and the substance was isolated to examine its physicochemical properties and biological activity, The present invention was completed by finding that this substance is a novel compound having antitumor activity.
【０００６】本発明を概説すれば、本発明は抗腫瘍活性
を有する新規な制癌性抗生物質、ＭＪ６５４−ＮＦ４物
質及びその製造法を提供するものである。The present invention will be summarized. The present invention provides a novel antitumor antibiotic having antitumor activity, MJ654-NF4 substance, and a method for producing the same.
【０００７】詳しく言えば、第１の本発明によると、下
記の物理化学的性状を有する新規な制癌性抗生物質、Ｍ
Ｊ６５４−ＮＦ４物質及びその塩が提供される。More specifically, according to the first aspect of the present invention, M is a novel carcinostatic antibiotic having the following physicochemical properties.
Provided are J654-NF4 substances and salts thereof.
【０００８】〔１〕ＭＪ６５４−ＮＦ４物質の物理化学
的性質 （１）物質の色および性状：黄褐色飴状である。 （２）分子式：Ｃ21Ｈ33Ｏ7 Ｐ 高分解ＦＡＢ−ＭＳ〔Neg.〕により決定した。 Ｃ21Ｈ33Ｏ7 Ｐ〔Ｍ−Ｈ〕- として 実測値 ４２７．１８９８ 計算値 ４２７．１８８６ なお、基準物質はＰＥＧ４００を用いた。 （３）分子量：４２８ ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ ４２７〔Ｍ−Ｈ〕- ４５１〔Ｍ＋Ｎａ〕+ が観測された。[1] Physicochemical properties of MJ654-NF4 substance (1) Color and properties of substance: Yellowish brown candy-like. (2) Molecular formula: was determined by C 21 H 33 O 7 P high decomposition FAB-MS [Neg.]. C 21 H 33 O 7 P [M-H] - Found 427.1898 Calculated 427.1886 noted as reference material using PEG 400. (3) Molecular weight: 428 FAB-MS: m / z 427 [M-H] - 451 [M + Na] + were observed.
【０００９】（４）紫外線吸収スペクトル： (4) Ultraviolet absorption spectrum:
【００１０】５）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）：
添付図面の図１に示す通りである。 （６） 1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル (４００MHz)：添付
図面の図２に示す通りである。重メタノール中、内部基
準にテトラメチルシランを使用して測定した。 （７）13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル (１００MHz)：添付
図面の図３に示す通りである。重メタノール中、内部基
準にテトラメチルシランを使用して測定した。 （８）溶解性：メタノール、クロロホルム、ジメチルス
ルホキシドに可溶。ヘキサン及び水に難溶である。5) Infrared absorption spectrum (KBr method):
As shown in FIG. 1 of the accompanying drawings. (6) 1 H-nuclear magnetic resonance spectrum (400 MHz): As shown in FIG. 2 of the accompanying drawings. It was measured using tetramethylsilane as an internal standard in deuterated methanol. (7) 13 C-nuclear magnetic resonance spectrum (100 MHz): As shown in FIG. 3 of the accompanying drawings. It was measured using tetramethylsilane as an internal standard in deuterated methanol. (8) Solubility: Soluble in methanol, chloroform and dimethylsulfoxide. It is sparingly soluble in hexane and water.
【００１１】（９）薄層クロマトグラフィー： Ｒｆ値は０．２９である。 吸着剤：シリカゲル（メルク社製、Ａｒｔ ５５５４） 展開溶媒：ｎ−ブタノール：酢酸：水（４：１：１） (10) 呈色反応：アニスアルデヒド−硫酸、リンモリブ
デン酸、塩化第二鉄の反応に対して陽性、ニンヒドリン
反応に対して陰性である。(9) Thin layer chromatography: Rf value is 0.29. Adsorbent: silica gel (Merck, Art 5554) Developing solvent: n-butanol: acetic acid: water (4: 1: 1) (10) Color reaction: anisaldehyde-sulfuric acid, phosphomolybdic acid, ferric chloride Positive for reaction, negative for ninhydrin reaction.
【００１２】〔２〕ＭＪ６５４−ＮＦ４物質の生物学的
活性 第１の本発明によるＭＪ６５４−ＮＦ４物質は、種々の
癌細胞の増殖に対し阻害活性を示した。更に、in vivo
においてマウス白血病Ｌ−１２１０癌細胞を腹腔内に移
植したマウスの実験系において延命効果を示した。ま
た、in vivo においてマウス黒色腫Ｂ１６癌細胞を静脈
内に移植したマウスの実験肺転移系においてＢ１６癌細
胞の肺転移に対し抑制効果を示した。[2] Biological activity of MJ654-NF4 substance The MJ654-NF4 substance according to the first aspect of the present invention showed inhibitory activity against proliferation of various cancer cells. Furthermore, in vivo
In the experiment system of mice in which mouse leukemia L-1210 cancer cells were intraperitoneally transplanted, the survival effect was shown. In addition, it showed an inhibitory effect on the lung metastasis of B16 cancer cells in an experimental lung metastasis system of a mouse in which mouse melanoma B16 cancer cells were intravenously transplanted in vivo.
【００１３】以上要約すると、本発明によるＭＪ６５４
−ＮＦ４物質はある種の癌細胞に対して抗癌活性を有し
て有用な抗癌剤としての用途がある。In summary, the MJ654 according to the present invention
-The NF4 substance has an anticancer activity against a certain type of cancer cells and has a use as a useful anticancer agent.
【００１４】第１の本発明によるＭＪ６５４−ＮＦ４物
質の生理活性を後記の試験例で評価した。The physiological activity of the MJ654-NF4 substance according to the first aspect of the present invention was evaluated in the test examples described below.
【００１５】試験例１ 各種の癌細胞に対する増殖阻害活性 各種の動物癌細胞を培養し、これら培養癌細胞に対する
本発明の制癌性抗生物質の増殖阻害活性 (IC50) 値を測
定し、その結果を表１に示す。 Test Example 1 Growth inhibitory activity against various cancer cells Various animal cancer cells were cultured, and the growth inhibitory activity (IC 50 ) value of the antitumor antibiotic of the present invention against these cultured cancer cells was measured. The results are shown in Table 1.
【００１６】[0016]
【表１】 [Table 1]
【００１７】試験例２ マウスの白血病Ｌ−１２１０癌細胞に対する制癌効果 ＣＤＦ1 マウスにＬ−１２１０癌細胞（１×１０5 個／
マウス）を腹腔内に移植し、供試化合物としてＭＪ６５
４−ＮＦ４物質は移植後１〜９日目まで腹腔内に注射し
た。生理食塩水を投与した対照群のマウスの生存日を１
００とした場合の次式で算出される延命率（％）で評価
した。 延命率（％）＝Ｔ／Ｃ×１００ ただし、Ｔは供試化合物を投与した時の生存日を表し、
Ｃは供試化合物無投与の時の生存日を表す。結果を表２
に示す。 Test Example 2 Antitumor effect on leukemia L-1210 cancer cells of mice L-1210 cancer cells (1 × 10 5 cells / CDF 1 mouse)
Mouse) was intraperitoneally transplanted, and MJ65 was used as a test compound.
The 4-NF4 substance was injected intraperitoneally from day 1 to day 9 after transplantation. The survival date of the control group of mice to which saline was administered was set to 1
The life extension rate (%) calculated by the following formula when the value is 00 was evaluated. Life prolongation rate (%) = T / C × 100 where T represents the survival day when the test compound was administered,
C represents the survival date when the test compound was not administered. The results are shown in Table 2.
Shown in.
【００１８】[0018]
【表２】 [Table 2]
【００１９】試験例３ マウスのメラノーマＢ１６細胞の高転移株癌細胞に対す
る肺転移阻害効果 ＢＤＦ1 マウスにメラノーマＢ１６細胞（５×１０5 個
／マウス）を静脈内に移植し、供試化合物としてＭＪ６
５４−ＮＦ４物質は移植後１〜９日目まで腹腔内に注射
した。移植後２０日目に肺を摘出し、メタノール固定を
行い顕微鏡下にて細胞集団を数えた。この抑制効果は次
式で算出される阻害率（％）で評価した。 Test Example 3 Pulmonary metastasis inhibitory effect of mouse melanoma B16 cells on highly metastatic cancer cells BDF 1 mice were intravenously transplanted with melanoma B16 cells (5 × 10 5 cells / mouse), and MJ6 was used as a test compound.
The 54-NF4 substance was injected intraperitoneally from 1 to 9 days after transplantation. On the 20th day after the transplantation, the lungs were removed, fixed with methanol, and the cell population was counted under a microscope. This inhibitory effect was evaluated by the inhibition rate (%) calculated by the following formula.
【００２０】阻害率（％）＝１００−（Ｔ／Ｃ×１０
０） ただし、Ｔは供試化合物を投与した時の肺転移したメラ
ノーマＢ１６細胞数を表し、Ｃは供試化合物無投与の時
の肺転移したメラノーマＢ１６細胞数を表す。その結果
を表３に示す。Inhibition rate (%) = 100− (T / C × 10
0) where T represents the number of melanoma B16 cells that metastasized to the lung when the test compound was administered, and C represents the number of melanoma B16 cells that metastasized to the lung when the test compound was not administered. The results are shown in Table 3.
【００２１】[0021]
【表３】 [Table 3]
【００２２】更に、第２の発明によると、ストレプトミ
セス属に属する抗生物質ＭＪ６５４−ＮＦ４物質生産菌
を培養し、その培養物からＭＪ６５４−ＮＦ４物質を採
取することを特徴とする、抗腫瘍活性を有する新規制癌
性抗生物質、ＭＪ６５４−ＮＦ４物質の製造法が提供さ
れる。Furthermore, according to the second aspect of the present invention, an anti-tumor activity is characterized in that an antibiotic MJ654-NF4 substance-producing bacterium belonging to the genus Streptomyces is cultured and the MJ654-NF4 substance is collected from the culture. A method for producing a new regulated cancer antibiotic, MJ654-NF4 substance, is provided.
【００２３】本発明の方法に用いるＭＪ６５４−ＮＦ４
物質生産菌はストレプトミセス属の菌株でＭＪ６５４−
ＮＦ４物質生産能を有するものであれば良く特に限定さ
れない。使用できるＭＪ６５４−ＮＦ４物質生産菌の一
例には、茨城県つくば学園都市で採取された土壌より分
離された放線菌でＭＪ６５４−ＮＦ４物質の菌株番号が
付された菌株がある。MJ654-NF4 used in the method of the present invention
The substance-producing bacterium is a strain of the genus Streptomyces and is MJ654-
There is no particular limitation as long as it has an ability to produce NF4 substances. An example of an MJ654-NF4 substance-producing bacterium that can be used is an actinomycete isolated from soil collected in Tsukuba Gakuen City, Ibaraki Prefecture, which is designated by the strain number of the MJ654-NF4 substance.
【００２４】以下、ＭＪ６５４−ＮＦ４株の菌学的性状
について述べる。 １．形態 ＭＪ６５４−ＮＦ４株は、分枝した基生菌糸より気菌糸
を伸長し、その先端は２〜５回転のらせんを形成する。
輪生枝及び胞子のうは認められない。成熟した胞子鎖に
は３０個以上の円筒形の胞子の連鎖を認め、胞子の大き
さは約0.7 〜0.8 ×1.1 〜1.3 ミクロンであった。な
お、胞子の表面は平滑である。The mycological properties of the MJ654-NF4 strain will be described below. 1. Morphology The MJ654-NF4 strain extends aerial hyphae from branched basal hyphae, and the tip thereof forms a helix of 2 to 5 turns.
There are no limbus or sporangia. In the matured spore chain, a chain of 30 or more cylindrical spores was recognized, and the size of the spore was about 0.7 to 0.8 x 1.1 to 1.3 microns. The surface of the spores is smooth.
【００２５】２．各種培地における生育状態 色の記載について〔 〕内に示す標準は、コンティナー
・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモ
ニー・マニュアル(Container Corporation ofAmerica
の color harmony manual)を用いた。2. Regarding the description of the growth state color in various media, the standard shown in [] is the Container Harmony Manual (Container Corporation of America).
Color harmony manual).
【００２６】（１）シュクロース・硝酸塩寒天培地（２
７℃培養） 無色の発育上に明るい茶灰〔3dc, Natural〕の気菌糸を
うっすらと着生し、溶解性色素は認められない。 （２）グルコース・アスパラギン寒天培地（２７℃培
養） うす黄〔1ga, Lt Lemon Yellow〕〜うす黄茶〔3gc, Lt
Tan 〕の発育上に、明るい灰〔3fe, Silver Gray〕の気
菌糸を部分的に着生し、溶解性色素は認められない。 （３）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培
地５、２７℃培養） うす黄〔3gc, Lt Tan 〜3le, Cinnamon 〕の発育上に、
明るい茶灰〔3dc, Natural〕〜明るい灰〔3fe, Silver
Gray〕の気菌糸を着生する。培養後２１日目頃より、気
菌糸の湿潤化が観察される。溶解性色素は認められな
い。 （４）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４、２
７℃培養） うす黄〔2gc, Bamboo 〕の発育上に、白〜明るい灰〔3f
e, Silver Gray〕の気菌糸を部分的に着生するが、培養
後１０日目頃より湿潤化し、黒色を呈する。溶解性色素
は認められない。(1) Sucrose / nitrate agar medium (2
(7 ° C culture) On the growth of colorless, light aerial mycelium of brown ash [3dc, Natural] grows faintly, and soluble pigment is not observed. (2) Glucose-asparagine agar medium (27 ° C culture) light yellow [1ga, Lt Lemon Yellow] to light yellow tea [3gc, Lt
On the growth of Tan], aerial hyphae of bright ash [3fe, Silver Gray] are partially settled and no soluble pigment is observed. (3) Glycerin / asparagine agar medium (ISP-medium 5, 27 ° C. culture) To develop light yellow [3gc, Lt Tan to 3le, Cinnamon],
Bright brown ash (3dc, Natural) ~ Bright ash (3fe, Silver)
Gray] aerial mycelium. From around 21 days after culturing, wetting of aerial hyphae is observed. No soluble dye is found. (4) Starch / inorganic salt agar medium (ISP-medium 4, 2
7 ℃ culture) White to bright ash [3f] on the growth of light yellow [2gc, Bamboo]
e, Silver Gray] aerial hyphae partially settled, but became moist from about 10 days after culturing and turned black. No soluble dye is found.
【００２７】（５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ−培地
７、２７℃培養） うす茶〔4gc, Nude Tan 〜4ie, Cork Tan 〕の発育上
に、明るい茶灰〔3dc,Natural〕〜明るい灰〔3fe, Silv
er Gray〕の気菌糸を着生する。培養後２１日目頃より
湿潤化し、黒色を呈する。溶解性色素はわずかに茶色味
を帯びる。 （６）栄養寒天培地（２７℃培養） 発育はうす黄〔2gc, Bamboo 〕、気菌糸は着生せず、溶
解性色素も認められない。 （７）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２、２７
℃培養） うす黄茶〔3ie, Camel〜3le, Cinnamon 〕の発育上に、
明るい灰〔3fe,SilverGray〕の気菌糸を着生するが、培
養後１４日目頃より湿潤化し、黒色を呈する。溶解性色
素は認められない。 （８）オートミール寒天培地（ＩＳＰ−培地３、２７℃
培養） うす黄〔2ca, Lt Ivory 〜2gc, Bamboo 〕の発育上に、
明るい灰〔3fe, Silver Gray 〕の気菌糸を着生する
が、培養後１０日目頃より湿潤化し、黒色を呈する。溶
解性色素は認められない。 （９）グリセリン・硝酸塩寒天培地（２７℃培養） 無色〜うす黄の発育上に白の気菌糸をわずかに着生し、
溶解性色素は認められい。 （10）スターチ寒天培地（２７℃培養） 発育はうす黄色〔1ca, Pale Yellow〜1ea, Canary Yell
ow〕、気菌糸は着生せず、溶解性色素は認められない。(5) Tyrosine agar medium (ISP-medium 7, cultured at 27 ° C.) Light brown ash [3dc, Natural] to bright ash [3fe, for developing light tea [4gc, Nude Tan-4ie, Cork Tan] Silv
er Gray] aerial mycelium. It becomes moist from around 21 days after culturing and appears black. Soluble dyes are slightly brownish. (6) Nutrient agar medium (27 ° C. culture) Growth is pale yellow [2gc, Bamboo], aerial hyphae do not grow, and soluble pigments are not observed. (7) Yeast-malt agar medium (ISP-medium 2, 27
℃ culture) For the development of light yellow tea [3ie, Camel ~ 3le, Cinnamon],
Although aerial hyphae of bright ash [3fe, Silver Gray] settle, they become moist from around 14 days after culturing and appear black. No soluble dye is found. (8) Oatmeal agar medium (ISP-medium 3, 27 ° C)
(Culture) For the development of light yellow [2ca, Lt Ivory ~ 2gc, Bamboo],
Although aerial hyphae of light ash [3fe, Silver Gray] are settled, they become moist from about 10 days after culturing and appear black. No soluble dye is found. (9) Glycerin / nitrate agar medium (27 ° C. culture) White to aerial hyphae slightly grow on the development of colorless to light yellow,
No soluble dye is found. (10) Starch agar medium (27 ° C culture) Growth pale yellow [1ca, Pale Yellow ~ 1ea, Canary Yell
ow], aerial hyphae do not grow, and no soluble pigment is observed.
【００２８】（11）リンゴ酸石灰寒天培地（２７℃培
養） 無色の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生し、溶解
性色素は認められない。 （12）セルロース（濾紙片添加合成液。２７℃培養） ３６日間の培養では生育しなかった。 （13）ゼラチン穿刺培養 １５％単純ゼラチン培地（２０℃培養）では、発育はう
す黄、気菌糸は着生せず、溶解性色素は認められない。
グルコース・ペプトン・ゼラチン培地（２７℃培養）の
場合、発育はうす黄〜うすだいだい、気菌糸は着生せ
ず、溶解性色素も認められない。 （14）脱脂牛乳（３７℃培養） 発育はうす黄、気菌糸は着生せず、溶解性色素も認めら
れない。(11) Lime malate agar medium (27 ° C. culture) White aerial mycelium grows faintly on colorless growth, and no soluble pigment is observed. (12) Cellulose (synthetic solution with filter paper pieces added, 27 ° C. culture) It did not grow in 36 days of culture. (13) Gelatin puncture culture In a 15% simple gelatin medium (cultured at 20 ° C), growth does not grow yellow, aerial hyphae do not grow, and soluble pigments are not observed.
In the glucose-peptone-gelatin medium (cultured at 27 ° C.), the growth was pale yellow to dull, aerial hyphae did not grow, and soluble pigments were not observed. (14) Defatted milk (37 ° C culture) Growth is pale yellow, aerial hyphae do not grow, and soluble pigments are not observed.
【００２９】３．生理的性質 （１）生育温度範囲 グルコース・アスパラギン寒天培地（グルコース 1.0
％、Ｌ−アスパラギン0.05 ％、リン酸水素二カリウム
0.05％、ひも寒天 3.0 ％、ｐＨ6.8 〜7.0）を用
い、１０℃、２０℃、２４℃、２７℃、３０℃、３７
℃、５０℃の各温度で試験した結果、１０℃、５０℃を
除き、そのいずれの温度でも成育する。生育至適温度は
２７℃〜３０℃付近と思われる。3. Physiological properties (1) Growth temperature range Glucose / asparagine agar medium (glucose 1.0
%, L-asparagine 0.05%, dipotassium hydrogen phosphate
0.05%, string agar 3.0%, pH 6.8-7.0), 10 ° C, 20 ° C, 24 ° C, 27 ° C, 30 ° C, 37
As a result of testing at each temperature of 0 ° C and 50 ° C, it grows at any temperature except 10 ° C and 50 ° C. The optimum temperature for growth seems to be around 27 ° C to 30 ° C.
【００３０】（２）ゼラチンの液化（１５％単純ゼラチ
ン培地、２０℃培養；グルコース・ペプトン・ゼラチン
培地、２７℃培養） １５％単純ゼラチン培地の場合、培養後１０日目頃より
液化を認めるが、その作用は極めて弱く、２５日目後も
液化の進行はほとんど認められない。グルコース・ペプ
トン・ゼラチン培地では培養後２１日目頃より液化が始
まり、極めてゆっくりと進行し、その作用は弱い。(2) Liquefaction of gelatin (15% simple gelatin medium, 20 ° C. culture; glucose / peptone / gelatin medium, 27 ° C. culture) In the case of 15% simple gelatin medium, liquefaction is observed around 10 days after culturing. , Its action was extremely weak, and almost no progress of liquefaction was observed even after 25 days. In glucose-peptone-gelatin medium, liquefaction started about 21 days after culturing, progressed extremely slowly, and its action was weak.
【００３１】（３）スターチの加水分解（スターチ・無
機塩寒天培地、ＩＳＰ−培地４及びスターチ寒天培地、
いずれも２７℃培養） いずれの培地においても培養後３日目頃より水解性は認
められ、その作用は強い。 （４）脱脂牛乳の凝固・ペプトン化（脱脂牛乳、３７℃
培養） 培養後、１２日目頃より凝固状を呈し、２〜３日で完了
後、ペプトン化が始まるが、その作用は弱い。 （５）メラニン様色素の生成（トリプトン・イースト・
ブロス、ＩＳＰ−培地１；ペプトン・イースト・鉄寒天
培地、ＩＳＰ−培地６；チロシン寒天培地、ＩＳＰ−培
地７；いずれも２７℃培養） いずれの培地でも陰性である。(3) Hydrolysis of starch (starch / inorganic salt agar medium, ISP-medium 4 and starch agar medium,
Both cultures were 27 ° C.) In any medium, water-decomposability was observed around the 3rd day after the culture, and the action was strong. (4) Coagulation and peptone conversion of skim milk (Skim milk, 37 ° C)
Cultivation) After culturing, a coagulated state is exhibited from around the 12th day, and after completion in 2-3 days, peptonization begins, but its action is weak. (5) Formation of melanin-like pigment (tryptone, yeast,
Broth, ISP-medium 1; peptone yeast iron agar medium, ISP-medium 6; tyrosine agar medium, ISP-medium 7; both cultures at 27 ° C) Both media are negative.
【００３２】（６）炭素源の利用性（プリドハム・ゴド
リーブ寒天培地、ＩＳＰ−培地９、２７℃培養） Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−フラクトース
を利用して発育し、イノシトール、ラムノース、ラフィ
ノース、Ｄ−マンニトール、ラクトースは利用しない。
シュクロースはおそらく利用しないと思われ、Ｄ−キシ
ロースの利用は判然としない。(6) Utilization of carbon source (Pridham-Godlieve agar medium, ISP-medium 9, 27 ° C. culture) Grow with D-glucose, L-arabinose and D-fructose to develop inositol, rhamnose and raffinose. , D-mannitol and lactose are not used.
Sucrose is probably not used, and the use of D-xylose is unclear.
【００３３】（７）リンゴ酸石灰の溶解（リンゴ酸石灰
寒天培地２７℃培養） 陰性である。 （８）硝酸塩の還元反応（0.1 ％硝酸カリウム含有ペプ
トン水、ＩＳＰ−培地８、２７℃培養） おそらく陽性である。 （９）セルロースの分解（濾紙片添加合成液、２７℃培
養） ３６日間培養の観察で分解は認められない。(7) Dissolution of lime malate (lime malate agar medium culture at 27 ° C.) Negative. (8) Reduction reaction of nitrate (peptone water containing 0.1% potassium nitrate, ISP-medium 8, 27 ° C. culture) Probably positive. (9) Decomposition of cellulose (synthesis solution with filter paper pieces added, 27 ° C. culture) No decomposition was observed by observing the culture for 36 days.
【００３４】以上の性状を要約すると、ＭＪ６５４−Ｎ
Ｆ４株は、その形態上、気菌糸がらせんを形成し、輪生
枝及び胞子のうは認められない。成熟した胞子鎖には３
０個以上の円筒形の胞子を連鎖し、その表面は平滑であ
る。種々の培地で、発育はうす黄〜うす黄茶、気菌糸は
明るい灰を呈し、湿潤化が観察される。溶解性色素は認
められない。生育至適温度は２７℃〜３０℃付近であ
る。メラニン様色素の生成は陰性、スターチの水解性は
強いほう、蛋白の分解力は弱い。なお、細胞壁に含まれ
る２，６−ジアミノピメリン酸はＬＬ−型であった。To summarize the above properties, MJ654-N
Due to the morphology of the F4 strain, the aerial hyphae form a helix and no limbus or sporangia are observed. 3 for mature spore chains
It connects 0 or more cylindrical spores and its surface is smooth. In various media, growth is light yellow to light yellow tea, aerial hyphae show bright ash, and moistening is observed. No soluble dye is found. The optimum growth temperature is around 27 ° C to 30 ° C. The formation of melanin-like pigments is negative, the starch is more hydrolyzable, and the protein degrading power is weaker. The 2,6-diaminopimelic acid contained in the cell wall was LL-type.
【００３５】これらの性状より、ＭＪ６５４−ＮＦ４株
は、ストレプトミセス(Streptomyces)属に属すると考え
られる。近縁の既知菌種を検索するとストレプトミセス
・シラツス(Streptomyces cirratus, The Journal of A
ntibiotics A，16巻、59頁、1963年) 、ストレプトミセ
ス・フミズス(Streptomyces humidus, InternationalJo
urnal of Systematic Bacteriology, 18巻、 334頁、19
68年) 、ストレプトミセス・エンズス(Streptomyces en
dus, International Journal of SystematicBacteriolo
gy, 18巻、 316頁、1968年) 及びストレプトミセス・ハ
イグロスコピカス(Streptomyces hygroscospicus, Inte
rnational Journal of SystematicBacteriology, 22
巻、 307頁、1972年) があげられた。現在、上記４種の
当研究所保存菌株とＭＪ６５４−ＮＦ４株とを実地に比
較検討中である。そこで現時点では、ＭＪ６５４−ＮＦ
４株をストレプトミセス・エスピー(Streptomyces sp.)
ＭＪ６５４−ＮＦ４とする。なお、ＭＪ６５４−ＮＦ４
株をつくば市所在の工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託申請し、平成５年４月１２日、ＦＥＲＭＰ−１３
６００として受託された。From these properties, it is considered that the MJ654-NF4 strain belongs to the genus Streptomyces. Searching for closely related known strains, Streptomyces cirratus, The Journal of A
ntibiotics A, 16, p. 59, 1963), Streptomyces humidus, InternationalJo
urnal of Systematic Bacteriology, 18: 334, 19
68), Streptomyces en
dus, International Journal of Systematic Bacteriolo
gy, 18: 316, 1968) and Streptomyces hygroscospicus, Inte.
rnational Journal of Systematic Bacteriology, 22
Vol., P. 307, 1972). At present, the above-mentioned 4 strains of the present laboratory, which are conserved strains of the present laboratory, and the MJ654-NF4 strain are being compared and examined. Therefore, at the moment, MJ654-NF
Streptomyces sp.
MJ654-NF4. In addition, MJ654-NF4
The deposit was submitted to the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, Tsukuba City Institute of Industrial Technology, April 12, 1993, FERMP-13
It was entrusted as 600.
【００３６】次に、第２の本発明の方法による新規制癌
性抗生物質、ＭＪ６５４−ＮＦ４物質の製造法について
説明する。Next, a method for producing a new regulated cancer antibiotic, MJ654-NF4 substance, according to the second method of the present invention will be described.
【００３７】本発明による抗生物質、ＭＪ６５４−ＮＦ
４物質はストレプトミセス属に属するＭＪ６５４−ＮＦ
４物質生産菌を適当な培地で培養することにより、好ま
しくは好気的条件下に培養することにより、培地中に目
的物質を産生、蓄積させ次いで培養物から目的物質を採
取することにより製造することができる。Antibiotics according to the invention, MJ654-NF
4 substances belong to the genus Streptomyces MJ654-NF
It is produced by culturing a 4-substance-producing bacterium in an appropriate medium, preferably by culturing under aerobic conditions, to produce and accumulate the target substance in the medium, and then collecting the target substance from the culture. be able to.
【００３８】培地はＭＪ６５４−ＮＦ４物質生産菌が利
用しうる任意の栄養源を含有するものでありうる。例え
ば、炭素源としてグルコース、マルトース、スターチ、
ダイズ油、グリセロールなどが使用でき、窒素源として
は、大豆粉、酵母エキス、小麦胚芽油、フィッシュミー
ル、グルテンミール、トーストソーヤ、プロリッチなど
が使用できる。又必要に応じて食塩、炭酸カルシウム、
リン酸塩、重金属塩などの無機塩類を添加することがで
きる。その他、必要に応じて適当な消泡剤、例えばシリ
コーン系消泡剤を添加することもできる。The medium may contain any nutrient source that can be utilized by the MJ654-NF4 substance-producing bacterium. For example, glucose, maltose, starch as carbon source,
Soybean oil, glycerol and the like can be used, and as the nitrogen source, soybean powder, yeast extract, wheat germ oil, fish meal, gluten meal, toast soya, prorich and the like can be used. If necessary, salt, calcium carbonate,
Inorganic salts such as phosphates and heavy metal salts can be added. In addition, if necessary, an appropriate defoaming agent, for example, a silicone-based defoaming agent can be added.
【００３９】培養方法としては、一般に行われている生
理活性物質の生産のための醗酵的方法であればよく、Ｍ
Ｊ６５４−ＮＦ４物質の製造には好気的液体深部培養法
が適している。培養温度はＭＪ６５４−ＮＦ４物質生産
菌が発育しＭＪ６５４−ＮＦ４物質を生産する範囲で使
用でき通常２７〜３２℃である。培養は以上述べた条件
を使用しＭＪ６５４−ＮＦ４物質生産菌の性質に応じて
適宜選択して行うことができる。このようにしてＭＪ６
５４−ＮＦ４物質の蓄積された培養物が得られる。培養
物中ではＭＪ６５４−ＮＦ４物質は菌体中および培養液
中に存在するが、特に培養濾液中により多く存在する。The culture method may be any fermentation method commonly used for the production of physiologically active substances.
The aerobic liquid submerged culture method is suitable for producing the J654-NF4 substance. The culturing temperature can be used within a range where the MJ654-NF4 substance-producing bacterium grows to produce the MJ654-NF4 substance, and is usually 27 to 32 ° C. Culturing can be performed using the above-mentioned conditions by appropriately selecting it according to the properties of the MJ654-NF4 substance-producing bacterium. In this way MJ6
An accumulated culture of 54-NF4 material is obtained. In the culture, the MJ654-NF4 substance is present in the bacterial cells and the culture medium, but more in particular in the culture filtrate.
【００４０】ＭＪ６５４−ＮＦ４物質の採取に当って
は、培養濾液より酢酸エチル、ｎ−ブタノール等の有機
溶媒でＭＪ６５４−ＮＦ４物質を抽出することができ
る。この抽出液を減圧下濃縮し、遠心液液分配クロマト
グラフィー、適当な吸着剤を用いたクロマトグラフィー
および高速液体クロマトグラフィーなどを適宜組み合わ
せることによってＭＪ６５４−ＮＦ４物質を単離、精製
して純粋に採取することができる。In collecting the MJ654-NF4 substance, the MJ654-NF4 substance can be extracted from the culture filtrate with an organic solvent such as ethyl acetate or n-butanol. The extract is concentrated under reduced pressure, and centrifugal liquid-liquid partition chromatography, chromatography using a suitable adsorbent, high performance liquid chromatography, etc. are combined as appropriate to isolate and purify the MJ654-NF4 substance, and to collect it purely. can do.
【００４１】[0041]
【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。EXAMPLES The present invention will now be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
【００４２】実施例１ （１）種母の調製 種母の調製に使用した培地は下記の成分を１ｌの水に溶
解した組成をもつものである。 可溶性スターチ ４％ エビオス ４％ ポリペプトン ０．５％ Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．３％ ＫＨ2 ＰＯ4 ０．１％ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２％ ＮａＣｌ ０．２％ ＣａＣＯ3 ０．１％シリコーン Example 1 (1) Preparation of Seed Mother The medium used for the preparation of the seed mother has a composition in which the following components are dissolved in 1 l of water. Soluble starch 4% Ebios 4% polypeptone 0.5% K 2 HPO 4 0.3% KH 2 PO 4 0.1% MgSO 4 · 7H 2 O 0.2% NaCl 0.2% CaCO 3 0.1% silicone
【００４３】上記培地１１０ｍｌを５００ｍｌのワッフ
ル付三角フラスコに分注し、ＭＪ６５４−ＮＦ４株（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１３６００）をスラントより１白金耳摂取
し、上記培地に接種して３０℃で３日間培養した。110 ml of the above medium was dispensed into a 500 ml Erlenmeyer flask with a waffle, and the MJ654-NF4 strain (F
1 platinum loop of ERM P-13600) was ingested from a slant, inoculated into the above medium, and cultured at 30 ° C. for 3 days.
【００４４】（２）培養 ＭＪ６５４−ＮＦ４物質の醗酵的製造に使用した培地
は、下記の成分を１ｌの水に溶解した組成をもつもので
ある。 エスサンミート ２．５％ Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．０５％ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０５％ 大豆油 ２％ マルトース １％酵母エキス ０．２％ (2) Culture The medium used for the fermentative production of MJ654-NF4 substance has a composition in which the following components are dissolved in 1 l of water. S. San meat 2.5% K 2 HPO 4 0.05% MgSO 4 · 7H 2 O 0.05% soybean oil 2% maltose 1% yeast extract 0.2%
【００４５】上記培地を１１０ｍｌずつ５００ｍｌの三
角フラスコへ分注したものへ、上記種母２．２ｍｌを添
加し、ロータリーシェーカーを用いて２７℃、１８０ｒ
ｐｍにて３日間振盪培養した。The above medium was dispensed into a 500 ml Erlenmeyer flask by 110 ml, to which 2.2 ml of the above seed was added, and the mixture was stirred at 27 ° C. for 180 r using a rotary shaker.
The cells were shake-cultured at pm for 3 days.
【００４６】（３）ＭＪ６５４−ＮＦ４物質の採取 上記（２）の条件で３日間培養の後、得られた培養液約
１０ｌをとり、遠心分離により菌体を除去し、培養濾液
を酢酸エチルで２回抽出し抽出液を減圧下濃縮し0.8 ｇ
の粗物質を得た。この粗物質を遠心液液分配クロマトグ
ラフィー（三鬼エンヂニアリング社製、分配液、クロロ
ホルム：メタノール：水＝２：２：１）移動相として上
層、回転数４００ｒｐｍ、流量１ｍｌ／分の条件で溶出
分画し活性分画を集め、減圧下濃縮した。(3) Collection of MJ654-NF4 substance After culturing for 3 days under the above condition (2), about 10 l of the obtained culture broth was taken, the cells were removed by centrifugation, and the culture filtrate was washed with ethyl acetate. Extract twice and concentrate the extract under reduced pressure to 0.8 g
Of crude material was obtained. This crude material was subjected to centrifugal liquid-liquid partition chromatography (manufactured by Sanki Engineering Co., Ltd., distributed liquid, chloroform: methanol: water = 2: 2: 1) as an upper layer as mobile phase, rotation speed 400 rpm, elution fraction under conditions of flow rate 1 ml / min The active fractions were collected and concentrated under reduced pressure.
【００４７】このようにして得られた粗精製物質１２７
ｍｇをメタノールに溶解し、その一定量をカプセルパッ
ク５Ｃ18（資生堂社製）のカラム（２０ｍｍφ×２５０
ｍｍ）を用いた高速液体クロマトグラフィーにかけ、展
開溶媒としてメタノール−水（６０：４０）にて溶出し
ＭＪ６５４−ＮＦ４物質含有フラクションを得た。これ
らを減圧下濃縮後、少量のメタノールに溶解しセファデ
ックスＬＨ−２０を担体としたゲル濾過クロマトグラフ
ィーに付し、ＭＪ６５４−ＮＦ４物質を含むフラクショ
ンを集め、減圧下濃縮乾燥するとＭＪ６５４−ＮＦ４物
質が黄褐色飴状物質18.9ｍｇとして得られた。Crude substance 127 thus obtained
mg is dissolved in methanol, and a certain amount is dissolved in a capsule pack 5C 18 column (manufactured by Shiseido Co., Ltd.) (20 mmφ × 250).
mm) and eluted with methanol-water (60:40) as a developing solvent to obtain a fraction containing MJ654-NF4 substance. These were concentrated under reduced pressure, dissolved in a small amount of methanol, and subjected to gel filtration chromatography using Sephadex LH-20 as a carrier. Fractions containing the MJ654-NF4 substance were collected and concentrated and dried under reduced pressure to give the MJ654-NF4 substance. Obtained as a yellowish brown candy-like substance (18.9 mg).
【００４８】[0048]
【発明の効果】以上、詳細に説明した通り、本発明によ
り抗腫瘍活性を有する新規抗生物質としてＭＪ６５４−
ＮＦ４物質が得られ、またその製造方法が提供された。INDUSTRIAL APPLICABILITY As described above in detail, the novel antibiotic MJ654- having antitumor activity according to the present invention.
An NF4 material was obtained and a method for its preparation was provided.
【図１】本発明のＭＪ６５４−ＮＦ４物質のKBr ディス
ク法による赤外部吸収スペクトル図である。FIG. 1 is an infrared absorption spectrum diagram of the MJ654-NF4 substance of the present invention measured by the KBr disk method.
【図２】ＭＪ６５４−ＮＦ４物質の重メタノール中にお
ける４００MHz での 1Ｈ−ＮＭＲスペクトル図である。FIG. 2 is a 1 H-NMR spectrum diagram of MJ654-NF4 substance in deuterated methanol at 400 MHz.
【図３】ＭＪ６５４−ＮＦ４物質の重メタノール中にお
ける１００MHz での13Ｃ−ＮＭＲスペクトル図である。FIG. 3 is a 13 C-NMR spectrum diagram of MJ654-NF4 substance in deuterated methanol at 100 MHz.
─────────────────────────────────────────────────────
─────────────────────────────────────────────────── ───
【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成６年８月３日[Submission date] August 3, 1994
【手続補正１】[Procedure Amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】００１８[Correction target item name] 0018
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction content]
【００１８】[0018]
【表２】 [Table 2]
【手続補正２】[Procedure Amendment 2]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】００１９[Correction target item name] 0019
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction content]
【００１９】マウスのメラノーマＢ１６細胞の高転移株
癌細胞に対する肺転移阻害効果 ＢＤＦ1 マウスにメラノーマＢ１６細胞（５×１０5 個
／マウス）を静脈内に移植し、供試化合物としてＭＪ６
５４−ＮＦ４物質は移植後１〜９日目又は１〜１９日目
まで腹腔内に注射した。移植後２０日目に肺を摘出し、
メタノール固定を行い顕微鏡下にて細胞集団を数えた。
この抑制効果は次式で算出される阻害率（％）で評価し
た。Lung metastasis inhibitory effect of mouse melanoma B16 cells on highly metastatic cancer cells BDF 1 mice were intravenously transplanted with melanoma B16 cells (5 × 10 5 cells / mouse), and MJ6 was used as a test compound.
The 54-NF4 substance was injected intraperitoneally from 1 to 9 days or 1 to 19 days after transplantation. 20 days after transplantation, the lungs were removed and
After fixing with methanol, the cell population was counted under a microscope.
This inhibitory effect was evaluated by the inhibition rate (%) calculated by the following formula.
【手続補正３】[Procedure 3]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】００２１[Correction target item name] 0021
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction content]
【００２１】[0021]
【表３】 [Table 3]
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 染野 哲也 埼玉県大宮市大字東新井710番地の50 (72)発明者 長縄 博 東京都大田区田園調布本町３番17号 (72)発明者 濱田 雅 東京都新宿区内藤町１番地26 秀和レジデ ンス405号 (72)発明者 前田 謙二 東京都目黒区五本木２丁目46番11号 (72)発明者 竹内 富雄 東京都品川区東五反田５丁目１番11号 ニ ューフジマンション701 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (72) Inventor Tetsuya Someno 50, 710, Higashiarai, Omiya City, Saitama Prefecture (72) Inventor Hiroshi Naganawa 3-17 Denenchofuhoncho, Ota-ku, Tokyo (72) Inventor Masa Hamada 26, No.405 Naiwa-cho, Shinjuku-ku, Tokyo 405 (72) Inventor Kenji Maeda 2-46-11, Gobongi, Meguro-ku, Tokyo (72) Tomio Takeuchi 5-1-11, East Gotanda, Shinagawa-ku, Tokyo No. New Fuji Mansion 701
Claims (3)
性抗生物質、ＭＪ６５４−ＮＦ４物質およびその塩。 （１）物質の性状：黄褐色飴状である。 （２）分子式：Ｃ21Ｈ33Ｏ7 Ｐ （３）分子量：４２８（ＦＡＢ−ＭＳ法により測定） （４）紫外線吸収スペクトル： （５）赤外線吸収スペクトル：添付図面の図１に示す通
りである。 （６） 1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル (４００MHz)：添付
図面の図２に示す通りである。重メタノール中、内部基
準にテトラメチルシランを使用して測定した。 （７）13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル (１００MHz)：添付
図面の図３に示す通りである。重メタノール中、内部基
準にテトラメチルシランを使用して測定した。 （８）溶解性：メタノール、クロロホルム、ジメチルス
ルホキシドに可溶であるがヘキサン及び水に難溶であ
る。1. A novel anti-cancer antibiotic, MJ654-NF4 substance and its salt having the following physicochemical properties. (1) Property of substance: It is a yellowish brown candy. (2) Molecular formula: C 21 H 33 O 7 P (3) Molecular weight: 428 (measured by FAB-MS method) (4) Ultraviolet absorption spectrum: (5) Infrared absorption spectrum: As shown in FIG. 1 of the accompanying drawings. (6) 1 H-nuclear magnetic resonance spectrum (400 MHz): As shown in FIG. 2 of the accompanying drawings. It was measured using tetramethylsilane as an internal standard in deuterated methanol. (7) 13 C-nuclear magnetic resonance spectrum (100 MHz): As shown in FIG. 3 of the accompanying drawings. It was measured using tetramethylsilane as an internal standard in deuterated methanol. (8) Solubility: Soluble in methanol, chloroform and dimethylsulfoxide, but sparingly soluble in hexane and water.
−ＮＦ４物質生産菌を培養し、その培養物から請求項１
に記載の制癌性抗生物質、ＭＪ６５４−ＮＦ４物質を採
取することを特徴とする新規制癌性抗生物質、ＭＪ６５
４−ＮＦ４物質の製造法。2. MJ654 belonging to the genus Streptomyces
-The NF4 substance-producing bacterium is cultivated, and from the culture,
MJ65, a new regulated cancer antibiotic characterized by collecting MJ654-NF4 substance as a carcinostatic antibiotic described in 1.
Method for producing 4-NF4 substance.
プトミセス・エスピー(Streptomyces sp.)ＭＪ６５４−
ＮＦ４株である請求項１記載の方法。3. The MJ654-NF4 substance producing bacterium is Streptomyces sp. MJ654-
The method according to claim 1, which is NF4 strain.
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|---|---|---|---|
| JP13923193A JP3674955B2 (en) | 1993-05-19 | 1993-05-19 | Newly regulated cancer antibiotic MJ654-NF4 substance and its production method |
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|---|---|---|---|
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Publications (2)
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| JPH06321978A true JPH06321978A (en) | 1994-11-22 |
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