JPH06298638A - Ribosome coated with sterol or sterol glucoside - Google Patents
Ribosome coated with sterol or sterol glucosideInfo
- Publication number
- JPH06298638A JPH06298638A JP10001293A JP10001293A JPH06298638A JP H06298638 A JPH06298638 A JP H06298638A JP 10001293 A JP10001293 A JP 10001293A JP 10001293 A JP10001293 A JP 10001293A JP H06298638 A JPH06298638 A JP H06298638A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- liposomes
- liposome
- sterol
- blood
- liver
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
- A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、脂質膜であるリポソー
ムを薬物のカプセルとして静脈投薬に使用するリポソー
ムの被覆組成物に関する。本発明はリポソームの被覆剤
としてステロール、ステロールグルコシドを用いること
により、血中滞留性や肝臓の実質細胞への取り込みがよ
く、また安定性も向上したリポソームを提供することに
関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a liposome coating composition in which a liposome, which is a lipid membrane, is used as a drug capsule for intravenous administration. The present invention relates to the provision of liposomes having good stability in blood and good uptake into parenchymal cells of the liver and improved stability by using sterol and sterol glucoside as a liposome coating agent.
【０００２】[0002]
【従来の技術】リポソームとは、内部に水相を含むリン
脂質二重層の微小ベシクルで、脂質を相転移温度以上
で、十分な量の水で水和することにより形成される。リ
ポソームは、その脂質二重層の数に基づいて分類した場
合、多重膜リポソーム（以下ＭＬＶという）と一枚膜リ
ポソームに分けられ、後者は、さらに大きさに基づい
て、小さな一枚膜リポソーム（以下ＳＵＶという）、大
きな一枚膜リポソーム（以下ＬＵＶという）および巨大
リポソーム（以下ＧＵＶという）に分けられる。BACKGROUND OF THE INVENTION Liposomes are microvesicles of a phospholipid bilayer containing an aqueous phase therein and are formed by hydrating a lipid with a sufficient amount of water at a phase transition temperature or higher. When classified based on the number of their lipid bilayers, liposomes are divided into multilamellar liposomes (hereinafter referred to as MLVs) and unilamellar vesicles, and the latter are further classified based on their size. SUVs, large unilamellar vesicles (hereinafter LUVs) and giant liposomes (hereinafter GUVs).
【０００３】ＳＵＶは直径数１０ｎｍ以下、ＬＵＶは１
００〜１０００ｎｍ、ＧＵＶは１０００ｎｍ以上のリポ
ソームを指す。ＭＬＶのサイズは不均一で、その分布は
数百から数千ｎｍにまで及ぶ。SUV has a diameter of 10 nm or less, and LUV has 1
0 to 1000 nm, GUV indicates a liposome of 1000 nm or more. The size of MLVs is non-uniform and their distribution ranges from hundreds to thousands of nm.
【０００４】このように、種々のタイプのリポソームが
知られているが、水溶性薬物はその内水相へ、油溶性の
ものは二重膜部分へ取り込むことができる。リポソーム
に内包された薬物は、遊離の薬物とまったく異なった体
内分布を示すので、薬物による副作用の軽減、徐放化な
どの効果があり、さらにつぎのような利点がある。As described above, various types of liposomes are known, but a water-soluble drug can be incorporated into the inner aqueous phase thereof, and an oil-soluble drug can be incorporated into the bilayer membrane portion. Since the drug encapsulated in the liposome exhibits a completely different distribution in the body than the free drug, it has the effects of reducing side effects due to the drug, sustained release, and the like, and further has the following advantages.
【０００５】リポソームを構成するリン脂質は、生体
膜の主要構成成分であるため毒性が低い。投与の目
的、方法により粒子サイズをコントロールすることがで
きる。 粒子表面に官能基を導入することにより抗原、抗体、
糖鎖などを導入することができ、標的部位へのターゲテ
ィングが可能である。Phospholipids constituting liposomes are low in toxicity because they are the main constituents of biological membranes. The particle size can be controlled depending on the purpose and method of administration. By introducing a functional group on the particle surface, an antigen, an antibody,
A sugar chain or the like can be introduced, and targeting to a target site is possible.
【０００６】肝臓へのターゲティングに際して最も広く
用いられているリガンドとして、ガラクトースおよびマ
ンノース残基がある。実質細胞はガラクトースに、マク
ロファージはマンノースに、それぞれ特異性を有するレ
セプターが存在することが知られており、それらの糖残
基で表面修飾したリポソームのそれぞれの細胞種に対す
るターゲティングがなされている。The most widely used ligands for liver targeting are galactose and mannose residues. It is known that galactose is present in parenchymal cells and mannose is present in macrophages, and the liposomes surface-modified with these sugar residues are targeted to the respective cell types.
【０００７】しかしながら、静脈投与されたリポソーム
は、肝臓、脾臓などの細網内皮系組織（以下ＲＥＳとい
う）に極めて取り込まれやすい性質を有している。ＲＥ
Ｓを標的部位とするときや、そこからの徐放性を期待す
る場合には有効である。しかし、標的部位がＲＥＳ以外
の場合には、リポソームにＲＥＳ回避能が必要となって
くる。However, intravenously administered liposomes have the property of being very easily taken up by reticuloendothelial tissues (hereinafter referred to as RES) such as liver and spleen. RE
It is effective when S is used as the target site or when sustained release from the site is expected. However, when the target site is other than RES, the liposome needs to have RES avoidance ability.
【０００８】従来のリポソームでは粒径を小さくすれ
ば、ある程度血中滞留時間を延長できるが、内包できる
薬物量が極めて少なくなり、一方、粒径を大きくすれば
内包薬物量は増えるが、ＲＥＳへ取り込まれ、血中での
徐放化やＲＥＳ以外の組織へのターゲティングは、非常
に困難であった。With conventional liposomes, if the particle size is reduced, the residence time in blood can be extended to some extent, but the amount of drug that can be encapsulated is extremely small. On the other hand, if the particle size is increased, the amount of drug encapsulated increases, but the RES It was very difficult to take in the drug and sustainedly release it in blood and target it to tissues other than RES.
【０００９】本発明は、上記従来技術に鑑み、ＲＥＳ回
避能、血中滞留時間を延長させ、安定性を向上させたリ
ポソームを提供することを課題とする。[0009] In view of the above-mentioned prior art, it is an object of the present invention to provide a liposome having improved RES avoidance ability, retention time in blood, and improved stability.
【００１０】上記課題を解決するために、本発明ではス
テロール配糖体であるステロールグルコシド（以下ＳＧ
という）及び／又はＳＧのグルコシド結合を加水分解し
て得られるアグリコンであるステロール（以下Ｓとい
う）でジパルミトイルホスファチジルコリンリポソーム
を被覆した。ＳあるいはＳＧの被覆によるリポソーム、
すなわち、ＳリポソームあるいはＳＧリポソームの安定
性及び体内における回避能を、リポソームに蛍光試薬で
あるカルセインを内包して、カルセインを指標にして調
べ、ジバルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）
のみで調製したリポソーム（以下ＤＰＰＣリポソームと
いう）と比較して有用性を認め本発明を完成した。In order to solve the above problems, in the present invention, a sterol glycoside, sterol glucoside (hereinafter referred to as SG) is used.
And / or sterol (hereinafter referred to as S), which is an aglycone obtained by hydrolyzing the glucosidic bond of SG, was coated on the dipalmitoylphosphatidylcholine liposome. Liposomes coated with S or SG,
That is, the stability of the S liposome or the SG liposome and the avoidance ability in the body were examined by encapsulating the fluorescent reagent calcein in the liposome and using calcein as an index, and divalmitoylphosphatidylcholine (DPPC)
The present invention was completed in recognition of its usefulness as compared with liposomes prepared by using only (hereinafter referred to as DPPC liposomes).
【００１１】本発明で用いるステロール及び／又はＳＧ
のグルコシドとしては、例えば植物精製工程で生じるソ
ーダ油宰から得られるステロールグルコシド（ＳＧ）
で、その組成はシトステリル−Ｄ−グルコシド、カンペ
ステリル−Ｄ−グルコシド、スチグマステリル−Ｄ−グ
ルコシド、ブラシカステリル−Ｄ−グルコシドからなる
混合物、又は、このステロールグルコシド（ＳＧ）を加
水分解して得たステロール混合物（Ｓ）が使用でき、ま
た、それらの混合物を構成する単独成分を使用しても有
効である。Sterol and / or SG used in the present invention
As the glucoside of, for example, sterol glucoside (SG) obtained from soda oil produced in the plant refining process
The composition is sitosteryl-D-glucoside, campesteryl-D-glucoside, stigmastereryl-D-glucoside, a mixture of brassicasteryl-D-glucoside, or a sterol obtained by hydrolyzing this sterol glucoside (SG). The mixture (S) can be used, and it is also effective to use the single components constituting the mixture.
【００１２】[0012]
【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。 実施例１ 本発明で用いるステロールグルコシド（ＳＧ）及びステ
ロール（Ｓ）の製造方法。植物油精製工程で生じるソー
ダ油宰の乾燥粉末１００ｇにピリジン１，０００ｍｌを
加え加熱溶解する。この溶液に活性炭を加え攪判後に濾
過し、濾液を得る。濾液１，０００ｍｌに対しアセトン
１，５００ｍｌを添加し冷却すると結晶が析出する。得
られた粗ステロールグルコシドを再びピリジンに加熱溶
解し、上記と同様に活性炭を加えて脱色処理を行った
後、アセトンを加えて結晶を析出させる。得られた結晶
を減圧乾燥し、精製ＳＧ３０ｇを得た。このステロール
グルコシドの組成はβ−シトステリルβ−Ｄ−グルコシ
ド（４９．９％）、カンペステリルβ−Ｄ−グルコシド
（２９．１％）、スチグマステリルβ−Ｄ−グルコシド
（１３．４％）、ブラシカステリルβ−Ｄ−グルコシド
（７．２％）の混合物であった。本発明で用いたステロ
ール（Ｓ）は、ＳＧを酸で加水分解したもので、成分と
してＳＧのステリルグルコシドと同一のステロール成分
比を含んだものである。EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples. Example 1 A method for producing sterol glucoside (SG) and sterol (S) used in the present invention. 1,000 ml of pyridine is added to 100 g of dried powder of soda oil produced in the vegetable oil refining step and dissolved by heating. Activated carbon is added to this solution, and the mixture is stirred and filtered to obtain a filtrate. When 1,500 ml of acetone is added to 1,000 ml of the filtrate and the mixture is cooled, crystals are precipitated. The obtained crude sterol glucoside is again dissolved in pyridine by heating, activated carbon is added in the same manner as above for decolorization treatment, and then acetone is added to precipitate crystals. The crystals obtained were dried under reduced pressure to obtain 30 g of purified SG. The composition of this sterol glucoside is β-sitosteryl β-D-glucoside (49.9%), campesteryl β-D-glucoside (29.1%), stigmasteryl β-D-glucoside (13.4%), brassicasteryl. It was a mixture of β-D-glucosides (7.2%). The sterol (S) used in the present invention is obtained by hydrolyzing SG with an acid, and contains the same sterol component ratio as the steryl glucoside of SG as a component.
【００１３】実施例２ リポソームの調製法 Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン［（日本
油脂（株）製）以下ＤＰＰＣという］の１０ｍＭのクロ
ロホルム溶液とＳ及びＳＧの１０ｍＭのメタノール：ク
ロロホルム＝２：１混液を調製する。この溶液をナス型
コルベンにＤＰＰＣ、ＳあるいはＳＧのモル比が７：
１：Ｘ（Ｘ＝０〜０．８，Ｘ＝Ｓ，ＳＧ）を量り取り、
室温でエバポレーターによって有機溶媒を減圧除去す
る。さらに、クロロホルムを完全に除くために減圧デシ
ケータ中で１６時間乾燥する。これに７０ｍＭのカルセ
インのＮａＣｌ含有リン酸緩衝溶液［（ｐＨ７．４）以
下ＰＢＳという］を加え、５０℃で１時間水和した後、
水浴型超音波器中で３０分間超音波を照射したのちに、
遠心分離して多重膜リポソーム（ＭＬＶ，１７．１ｍｇ
リン脂質／ｍｌＰＢＳ）を調製した。さらに、このリポ
ソーム懸濁液５００μｌをセファデックス（Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ）Ｇ−５０カラム（１．９ｃｍ×３２ｃｍ，フラ
クションサイズ４．５ｍｌ）で展開溶媒にＰＢＳを用い
てカルセイン内包リポソーム（１．９ｍｇ×リン脂質／
ｍｌＰＢＳ）と遊離カルセインとを分離した。リポソー
ムの粒子径は、約０．１μｍであった。上記において、
ＰＢＳは次の組成の物である。 塩化ナトリウム ８．０００ｇ 塩化カリウム ０．１９４ｇ リン酸二ナトリウム ２．２９０ｇ リン酸一カリウム ０．１９６ｇ 精製水 １０００．０００ｍｌExample 2 Preparation Method of Liposomes A 10 mM chloroform solution of L-α-dipalmitoylphosphatidylcholine (hereinafter referred to as “DPPC” manufactured by NOF CORPORATION) and 10 mM methanol: chloroform = 2: 1 mixture of S and SG. To prepare. This solution was added to eggplant-type Kolben at a molar ratio of DPPC, S or SG of 7:
1: Weigh X (X = 0 to 0.8, X = S, SG),
The organic solvent is removed under reduced pressure by an evaporator at room temperature. Further, it is dried in a vacuum desiccator for 16 hours to completely remove chloroform. A 70 mM NaCl-containing phosphate buffer solution [(pH 7.4) hereinafter referred to as PBS] of 70 mM was added thereto, and after hydration at 50 ° C. for 1 hour,
After irradiating ultrasonic waves for 30 minutes in a water bath type ultrasonic device,
Centrifugal separation and multilamellar liposomes (MLV, 17.1 mg
Phospholipid / ml PBS) was prepared. Further, 500 μl of this liposome suspension was added to Sephadex (Sephadex).
dex) G-50 column (1.9 cm × 32 cm, fraction size 4.5 ml) using PBS as a developing solvent, calcein-encapsulating liposome (1.9 mg × phospholipid /
(mlPBS) and free calcein were separated. The particle size of the liposome was about 0.1 μm. In the above,
PBS has the following composition. Sodium chloride 8.000 g Potassium chloride 0.194 g Disodium phosphate 2.290 g Monopotassium phosphate 0.196 g Purified water 1000.000 ml
【００１４】実施例３ Ｓリポソーム及びＳＧリポソームの血漿中での安定性 リポソームは体液中、特に血中で血液成分によってオプ
ソニ化され、内容物を漏出しやすいということが知られ
ている。そこで、各々のリポソームの体内での安定性に
及ぼすラット血漿の影響について試験した。図１ａ）
は、ＰＢＳ中に５０％ラット血漿を添加して、図１ｂ）
はＰＢＳのみに、それぞれリポソームを加え、３７．５
℃で１時間インキュベートしたときのカルセインの放出
プロファイルを示す。これより、ＤＰＰＣリポソーム、
ＳＧリポソームは、Ｓリポソームより漏出率が高く、１
時間後の漏出率は、ＤＰＰＣ＝ＳＧ＞Ｓの順に小さくな
った。また、ＰＢＳ中でのＤＰＰＣリポソーム、Ｓリポ
ソーム、及びＳＧリポソームの漏出率は、すべて２０％
以下であった。また図１ａ）において５６℃、３０分で
血漿を熱処理したときの１時間での漏出率は、無処理に
比べて、Ｓリポソームでは３２．８％から１９．５％
へ、ＳＧリポソームは６０．８％から４４．５％へと低
くなった。Example 3 Stability of S Liposomes and SG Liposomes in Plasma It is known that liposomes are opsonized by blood components in body fluids, particularly blood, and the contents thereof are likely to leak out. Therefore, the effect of rat plasma on the stability of each liposome in the body was examined. Figure 1a)
Added 50% rat plasma in PBS, Figure 1b).
Added liposomes only to PBS, and added 37.5
FIG. 3 shows the release profile of calcein when incubated at 0 ° C. for 1 hour. From this, DPPC liposomes,
SG liposomes have a higher leakage rate than S liposomes, and 1
The leakage rate after time decreased in the order of DPPC = SG> S. The leakage rate of DPPC liposomes, S liposomes, and SG liposomes in PBS is 20%.
It was below. Further, in FIG. 1a), the leakage rate in 1 hour when plasma was heat-treated at 56 ° C. for 30 minutes was 32.8% to 19.5% in the S liposome, as compared with the untreated plasma.
, SG liposomes fell from 60.8% to 44.5%.
【００１５】実施例４ Ｓリポソーム及びＳＧリポソームの血中滞留性と臓器分
布 静脈投与後の薬物の血中からの消失は、おもに各臓器で
の代謝と排泄に依存する。しかしながら、粒子性のリポ
ソーム自体及び添加薬物の体内動態は、主に、肝臓や脾
臓に存在するマクロファージ（細網内皮系組織：ＲＥ
Ｓ）による補足と血中での崩壊による。特に肝臓への分
布は、粒子径、表面の親水性や表面電位による。そこ
で、各々のリポソームをマウスに尾静脈投与したときの
血中滞留性の違いを測定し、図２に示した。投与５分後
の血中におけるリポソーム中のカルセインの蛍光強度を
１００％とすると、ＤＰＰＣリポソームの蛍光強度は６
時間後において０．８３（５．７％）、ＳＧリポソーム
は０．７（２．６％）、Ｓリポソームは４．１（７．７
％）が血中に滞留した。これは、Ｓリポソームは、ＤＰ
ＰＣリポソーム及びＳＧリポソームに比べ、リポソーム
膜の流動性が低く、血漿成分によってオプソニ化がされ
にくい。したがって、Ｓリポソームの血中滞留性が長い
のは、リポソーム膜が比較的固く、血漿中で安定なため
にマクロファージによる補足から回避され、また血中で
の崩壊も少ないためである。一方、ＤＰＰＣリポソーム
及びＳＧリポソームは、リポソーム膜の流動性がＳリポ
ソームより高く、血漿成分によって１時間で５０〜６０
％の内包物を放出した。したがって、ＤＰＰＣリポソー
ム及びＳＧリポソームの血中滞留性が短いのは、主に血
中でのリポソームの崩壊による。ＲＥＳの異物取り込み
能は、効率よく迅速で、たとえば１μｍ以下の粒子は静
脈投与して、約１分後には投与量の９０％以上は、肝臓
と脾臓に集まる。そこで、ＤＰＰＣリポソーム、Ｓリポ
ソーム及びＳＧリポソームの静脈投与６時間後の肝臓と
脾臓の分布を調べた。その結果は、図３に示したように
投与６時間後にリポソームは、投与量の約９０％以上が
肝臓に分布し、脾臓には投与量の１０％以下であった。Example 4 Retention of S Liposomes and SG Liposomes in Blood and Distribution of Organs The disappearance of a drug from blood after intravenous administration mainly depends on metabolism and excretion in each organ. However, the pharmacokinetics of the particulate liposome itself and the added drug is mainly due to macrophages (reticuloendothelial system tissue: RE) existing in the liver and spleen.
By supplementation with S) and disintegration in blood. In particular, distribution to the liver depends on the particle size, surface hydrophilicity, and surface potential. Therefore, the difference in blood retention when each liposome was administered to the tail vein of mice was measured and shown in FIG. When the fluorescence intensity of calcein in the liposome in blood 5 minutes after administration is 100%, the fluorescence intensity of DPPC liposome is 6
0.83 (5.7%) after time, 0.7 (2.6%) for SG liposomes, 4.1 (7.7) for S liposomes.
%) Remained in the blood. This is S liposome, DP
Compared with PC liposomes and SG liposomes, the fluidity of the liposome membrane is low and it is less likely to be opsonized by plasma components. Therefore, the reason why the S liposome has a long retention time in blood is that it is avoided from being captured by macrophages because the liposome membrane is relatively hard and stable in plasma, and it is also less disintegrated in blood. On the other hand, DPPC liposomes and SG liposomes have a higher liposome membrane fluidity than S liposomes, and depending on the plasma component, 50-60 times per hour.
% Inclusions were released. Therefore, the short blood retention of DPPC liposomes and SG liposomes is mainly due to the disintegration of liposomes in blood. The foreign substance uptake ability of RES is efficient and rapid, for example, particles of 1 μm or less are intravenously administered, and after about 1 minute, 90% or more of the dose is collected in the liver and spleen. Therefore, the distribution of liver and spleen 6 hours after intravenous administration of DPPC liposome, S liposome and SG liposome was examined. As a result, as shown in FIG. 3, about 6 hours after administration, about 90% or more of the dose of the liposome was distributed to the liver and 10% or less of the dose to the spleen.
【００１６】実施例５ Ｓリポソーム及びＳＧリポソームの肝細胞分布 ネンブタール（０．０６ｍｌ／３０ｍｇ）及びヘパリン
（２００ＩＵ）を腹腔内投与したマウスに、カルセイン
内包リポソームを尾静脈より投与し、２時間後に開腹
し、カニュレーションをして、第一潅流液は５分、ＰＢ
Ｓは５分、コラゲナーゼ溶液（７５ＩＵ）は１５分の順
に潅流する。次に、肝臓を切り離し、シャーレ中の氷令
したＨＡＮＫ′ｓ緩衝液（３ｍｌ）に移し、細胞を分散
させる。その後、ガーゼで濾過し、濾液をスピッツ管に
集め、５０×ｇ，７０×ｇ及び１４０×ｇでそれぞれ１
分間遠心分離し、実質細胞と非実質細胞を分離し、蛍光
強度を測定して、各リポソームの肝細胞分布を測定し
た。なお、１４０×ｇによって得た非実質細胞数分画の
各分画中の細胞数をＢｕｒｋｅｒ−Ｔｕｒｋ Ｃｈａｍ
ＢＥＲを用いて数えた結果、実質細胞数は２．４９×１
０７個、非実質細胞数は２．７６×１０７個となり、実
質細胞数と非実質細胞数は等しかった。また、実質細胞
数の生存率はトリパンブルーテストにより確認し、７０
％以上であった。Example 5 Hepatocyte Distribution of S Liposomes and SG Liposomes Nembutal (0.06 ml / 30 mg) and heparin (200 IU) were intraperitoneally administered to mice by intraperitoneal administration of calcein-encapsulated liposomes from the tail vein, and after 2 hours, abdominal laparotomy was performed. And cannulate, 5 minutes for the first perfusate, PB
S for 5 minutes and collagenase solution (75 IU) for 15 minutes. Next, the liver is separated and transferred to ice-cold HANK's buffer (3 ml) in a petri dish to disperse the cells. Then, filter with gauze, collect the filtrate in a Spitz tube, and use 1 at 50 × g, 70 × g, and 140 × g, respectively.
Centrifugation was performed to separate parenchymal cells and non-parenchymal cells, the fluorescence intensity was measured, and the hepatocyte distribution of each liposome was measured. In addition, the number of cells in each fraction of the non-parenchymal cell number fraction obtained by 140 × g was calculated by the Burker-Turk Chem.
As a result of counting using BER, the number of parenchymal cells is 2.49 × 1.
The number of non-parenchymal cells was 0 7, and the number of non-parenchymal cells was 2.76 × 10 7 , and the numbers of parenchymal cells and non-parenchymal cells were equal. In addition, the survival rate of the parenchymal cell number was confirmed by the trypan blue test, and
% Or more.
【００１７】肝臓では、栄養物質の処理、貯蔵、中毒性
物質（薬物）の解毒、分解、排泄などといった生体にと
って不可欠な機能が営まれており、実質細胞、網細胆
管、網細血管が放射状に集まった特有の構造をしてい
る。肝臓を構成する細胞には、実質細胞と非実質細胞で
ある内皮細胞、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞及び脂肪貯蔵細胞な
どがあり、それぞれ異なった構造と機能をもっている。
実質細胞は、肝臓の大部分（約７０％）を占め、代謝、
排泄など肝臓の主な機能を担っている。一方、非実質細
胞胞であるＫｕｐｆｆｅｒ細胞は、類洞の内側に定着し
た細網内皮系の細胞で、血液中に存在する微粒子性老廃
物の除去に中心的な役割を果たしている。In the liver, essential functions for the body such as processing and storage of nutritional substances, detoxification, decomposition and excretion of toxic substances (drugs) are carried out, and parenchymal cells, reticulo-biliary ducts and reticulocytes are radiated. It has a unique structure gathered in. Liver-constituting cells include parenchymal cells and non-parenchymal cells such as endothelial cells, Kupffer cells, and fat-storing cells, which have different structures and functions.
Parenchymal cells occupy most of the liver (about 70%), and metabolism,
It is responsible for the main functions of the liver such as excretion. On the other hand, Kupffer cells, which are non-parenchymal cells, are cells of the reticuloendothelial system established inside the sinusoids and play a central role in removing particulate wastes existing in blood.
【００１８】図３に示したようにリポソームはＲＥＳの
中でも特に肝臓に取り込まれることから、肝臓内での実
質及び非実質細胞への取り込みの違いを測定し、その結
果を図４に示した。ＤＰＰＣリポソームの実質及び非実
質細胞への取り込み量は、極めて少なかった。これは、
血中において血漿成分によりＤＰＰＣリポソームは、非
常に崩壊されやすいために、肝細胞への取り込み量が低
くなったためである。一方、ＳＧリポソームは、血漿中
でＤＰＰＣリポソームと同様に不安定であったが、実質
細胞に多く取り込まれた。しかし、血漿中で安定である
Ｓリポソームの実質細胞への取り込み量は、ＳＧリポソ
ームの約１／３であった。また、非実質細胞への取り込
み量は、Ｓ及びＳＧリポソームともほぼ同様であった。
これらの結果より、膜の流動性が高いＤＰＰＣリポソー
ムは血中において崩壊し、また、ＳＧリポソームは、実
質細胞に取り込まれ易く、血中での滞留率も低くなっ
た。よって、ＳＧリポソームは、ＲＥＳ回避能を有する
ことが証明された。また、膜の流動性の低いＳリポソー
ムは、血漿中で安定であり、実質及び非実質細胞にも取
り込まれにくいために、血中での滞留率が高くなったこ
とが証明された。このことから、薬物坦体としてのリポ
ソームは、薬物の徐放化にはＳリポソームが、肝臓への
ターゲティングにはＳＧリポソームが有効であることが
認められた。As shown in FIG. 3, liposomes are taken up by the liver among RES. Therefore, the difference in the uptake into parenchymal and non-parenchymal cells in the liver was measured, and the results are shown in FIG. The uptake of DPPC liposomes into parenchymal and non-parenchymal cells was extremely low. this is,
This is because the DPPC liposome is very easily disintegrated in the blood due to the plasma component, and thus the uptake amount into hepatocytes is low. On the other hand, SG liposomes were unstable in plasma as in DPPC liposomes, but a large amount of SG liposomes were taken up by parenchymal cells. However, the amount of S liposomes stable in plasma taken up by parenchymal cells was about 1/3 that of SG liposomes. The amount of uptake into non-parenchymal cells was almost the same as that of the S and SG liposomes.
From these results, DPPC liposomes having high membrane fluidity were disintegrated in blood, and SG liposomes were easily taken up by parenchymal cells and the retention rate in blood was low. Therefore, the SG liposome was proved to have the RES avoidance ability. Further, it was proved that the S liposome having low membrane fluidity is stable in plasma and is hardly taken up by parenchymal and non-parenchymal cells, and thus the retention rate in blood is high. From this, it was confirmed that the liposome as the drug carrier is effective in the S liposome for the sustained release of the drug and the SG liposome for the targeting to the liver.
【００１９】[0019]
【発明の効果】以上述べたように、ＤＰＰＣのみで調製
したリポソーム（ＤＰＰＣリポソーム）と比較して、ス
テロール（Ｓ）あるいはステロールグルコシド（ＳＧ）
でＤＰＰＣリポソームを被覆したものは安定性に優れ、
ＳリポソームとＳＧリポソームの血中滞留性は、Ｓリポ
ソームが最も良く、また、肝臓の実質細胞への取り込み
はＳＧリポソームが良いことが顕著に認められた。薬物
坦体としてのリポソームは、薬物の徐放化にはＳリポソ
ームが、肝臓へのターゲティングにはＳＧリポソームが
有効であることが認められ、本発明の有用性が証明され
た。INDUSTRIAL APPLICABILITY As described above, as compared with the liposome prepared only with DPPC (DPPC liposome), sterol (S) or sterol glucoside (SG) is used.
The one coated with DPPC liposome is excellent in stability,
It was remarkably observed that the S liposome and SG liposome had the best blood retention properties in the S liposome, and that the SG liposome had better uptake into the parenchymal cells of the liver. As for the liposome as a drug carrier, it was confirmed that S liposome was effective for sustained release of the drug and SG liposome was effective for targeting to the liver, demonstrating the usefulness of the present invention.
【図１】図１ａ）はＰＢＳ中に５０％ラット血漿を添加
して、図１ｂ）はＰＢＳのみに、それぞれリポソームを
加え、３７．５℃で１時間インキュベートしたときのカ
ルセインの放出プロファイルを示す。FIG. 1a) shows the release profile of calcein when 50% rat plasma was added to PBS and FIG. 1b) was added liposomes only to PBS and incubated at 37.5 ° C. for 1 hour. .
【図２】ＰＢＳ中の血漿添加量を０，２５，５０，９０
％と変化した場合の各々のリポソームからのカルセイン
の漏出変化を示す。FIG. 2 shows that the amount of plasma added to PBS is 0, 25, 50, 90
The change in the leakage of calcein from each liposome when the percentage changes with% is shown.
【図３】ＤＰＰＣリポソーム、Ｓリポソーム及びＳＧリ
ポソームをマウスに尾静脈投与したときの血中滞留性の
違い（蛍光強度）を示す。FIG. 3 shows the difference in blood retention (fluorescence intensity) when DPPC liposome, S liposome, and SG liposome were administered to mice via tail vein.
【図４】ＤＰＰＣリポソーム、Ｓリポソーム及びＳＧリ
ポソームのマウスに尾静脈投与６時間後の肝臓と脾臓の
分布を示す。FIG. 4 shows the distribution of liver and spleen of DPPC liposome, S liposome and SG liposome in mice 6 hours after tail vein administration.
【図５】リポソームをマウスに静脈投与したときの、２
時間後の肝臓内での実質及び非実質細胞の蛍光強度（各
リポソームの取り込みの違い）を示す。FIG. 5: 2 when liposomes were intravenously administered to mice
The fluorescence intensity of parenchymal and non-parenchymal cells (difference in uptake of each liposome) in the liver after time is shown.
─────────────────────────────────────────────────────
─────────────────────────────────────────────────── ───
【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成６年６月８日[Submission date] June 8, 1994
【手続補正１】[Procedure Amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】全文[Correction target item name] Full text
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction content]
【書類名】 明細書[Document name] Statement
【発明の名称】 ステロール又はステロールグルコシ
ドで被覆したリポソームTitle: Liposome coated with sterol or sterol glucoside
【特許請求の範囲】[Claims]
【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、脂質膜であるリポソー
ムを薬物のカプセルとして静脈投薬に使用するリポソー
ムの被覆組成物に関する。本発明はリポソームの被覆剤
としてステロール、ステロールグルコシドを用いること
により、血中滞留性や肝臓の実質細胞への取り込みがよ
く、また安定性も向上したリポソームを提供することに
関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a liposome coating composition in which a liposome, which is a lipid membrane, is used as a drug capsule for intravenous administration. The present invention relates to the provision of liposomes having good stability in blood and good uptake into parenchymal cells of the liver and improved stability by using sterol and sterol glucoside as a liposome coating agent.
【０００２】[0002]
【従来の技術】リポソームとは、内部に水相を含むリン
脂質二重層の微小ベシクルで、脂質を相転移温度以上
で、十分な量の水で水和することにより形成される。リ
ポソームは、その脂質二重層の数に基づいて分類した場
合、多重膜リポソーム（以下ＭＬＶという）と一枚膜リ
ポソームに分けられ、後者は、さらに大きさに基づい
て、小さな一枚膜リポソーム（以下ＳＵＶという）、大
きな一枚膜リポソーム（以下ＬＵＶという）および巨大
リポソーム（以下ＧＵＶという）に分けられる。BACKGROUND OF THE INVENTION Liposomes are microvesicles of a phospholipid bilayer containing an aqueous phase therein and are formed by hydrating a lipid with a sufficient amount of water at a phase transition temperature or higher. When classified based on the number of their lipid bilayers, liposomes are divided into multilamellar liposomes (hereinafter referred to as MLVs) and unilamellar vesicles, and the latter are further classified based on their size. SUVs, large unilamellar vesicles (hereinafter LUVs) and giant liposomes (hereinafter GUVs).
【０００３】ＳＵＶは直径数１０ｎｍ以下、ＬＵＶは１
００〜１０００ｎｍ、ＧＵＶは１０００ｎｍ以上のリポ
ソームを指す。ＭＬＶのサイズは不均一で、その分布は
数百から数千ｎｍにまで及ぶ。SUV has a diameter of 10 nm or less, and LUV has 1
0 to 1000 nm, GUV indicates a liposome of 1000 nm or more. The size of MLVs is non-uniform and their distribution ranges from hundreds to thousands of nm.
【０００４】このように、種々のタイプのリポソームが
知られているが、水溶性薬物はその内水相へ、油溶性の
ものは二重膜部分へ取り込むことができる。リポソーム
に内包された薬物は、遊離の薬物とまったく異なった体
内分布を示すので、薬物による副作用の軽減、徐放化な
どの効果があり、さらにつぎのような利点がある。As described above, various types of liposomes are known, but a water-soluble drug can be incorporated into the inner aqueous phase thereof, and an oil-soluble drug can be incorporated into the bilayer membrane portion. Since the drug encapsulated in the liposome exhibits a completely different distribution in the body than the free drug, it has the effects of reducing side effects due to the drug, sustained release, and the like, and further has the following advantages.
【０００５】リポソームを構成するリン脂質は、生体
膜の主要構成成分であるため毒性が低い。投与の目
的、方法により粒子サイズをコントロールすることがで
きる。 粒子表面に官能基を導入することにより抗原、抗体、
糖鎖などを導入することができ、標的部位へのターゲテ
ィングが可能である。Phospholipids constituting liposomes are low in toxicity because they are the main constituents of biological membranes. The particle size can be controlled depending on the purpose and method of administration. By introducing a functional group on the particle surface, an antigen, an antibody,
A sugar chain or the like can be introduced, and targeting to a target site is possible.
【０００６】肝臓へのターゲティングに際して最も広く
用いられているリガンドとして、ガラクトースおよびマ
ンノース残基がある。実質細胞はガラクトースに、マク
ロファージはマンノースに、それぞれ特異性を有するレ
セプターが存在することが知られており、それらの糖残
基で表面修飾したリポソームのそれぞれの細胞種に対す
るターゲティングがなされている。The most widely used ligands for liver targeting are galactose and mannose residues. It is known that galactose is present in parenchymal cells and mannose is present in macrophages, and the liposomes surface-modified with these sugar residues are targeted to the respective cell types.
【０００７】しかしながら、静脈投与されたリポソーム
は、肝臓、脾臓などの細網内皮系組織（以下ＲＥＳとい
う）に極めて取り込まれやすい性質を有している。ＲＥ
Ｓを標的部位とするときや、そこからの徐放性を期待す
る場合には有効である。しかし、標的部位がＲＥＳ以外
の場合には、リポソームにＲＥＳ回避能が必要となって
くる。However, intravenously administered liposomes have the property of being very easily taken up by reticuloendothelial tissues (hereinafter referred to as RES) such as liver and spleen. RE
It is effective when S is used as the target site or when sustained release from the site is expected. However, when the target site is other than RES, the liposome needs to have RES avoidance ability.
【０００８】従来のリポソームでは粒径を小さくすれ
ば、ある程度血中滞留時間を延長できるが、内包できる
薬物量が極めて少なくなり、一方、粒径を大きくすれば
内包薬物量は増えるが、ＲＥＳへ取り込まれ、血中での
徐放化やＲＥＳ以外の組織へのターゲティングは、非常
に困難であった。With conventional liposomes, if the particle size is reduced, the residence time in blood can be extended to some extent, but the amount of drug that can be encapsulated is extremely small. On the other hand, if the particle size is increased, the amount of drug encapsulated increases, but the RES It was very difficult to take in the drug and sustainedly release it in blood and target it to tissues other than RES.
【発明が解決しようとする課題】[Problems to be Solved by the Invention]
【０００９】本発明は、上記従来技術に鑑み、ＲＥＳ回
避能、血中滞留時間を延長させ、安定性を向上させたリ
ポソームを提供することを課題とする。[0009] In view of the above-mentioned prior art, it is an object of the present invention to provide a liposome having improved RES avoidance ability, retention time in blood, and improved stability.
【課題を解決するための手段】[Means for Solving the Problems]
【００１０】上記課題を解決するために、本発明ではス
テロール配糖体であるステロールグルコシド（以下ＳＧ
という）及び／又はＳＧのグルコシド結合を加水分解し
て得られるアグリコンであるステロール（以下Ｓとい
う）でジパルミトイルホスファチジルコリンリポソーム
を被覆した。ＳあるいはＳＧの被覆によるリポソーム、
すなわち、ＳリポソームあるいはＳＧリポソームの安定
性及び体内における回避能を、リポソームに蛍光試薬で
あるカルセインを内包して、カルセインを指標にして調
べ、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）
のみで調製したリポソーム（以下ＤＰＰＣリポソームと
いう）と比較して有用性を認め本発明を完成した。In order to solve the above problems, in the present invention, a sterol glycoside, sterol glucoside (hereinafter referred to as SG) is used.
And / or sterol (hereinafter referred to as S), which is an aglycone obtained by hydrolyzing the glucosidic bond of SG, was coated on the dipalmitoylphosphatidylcholine liposome. Liposomes coated with S or SG,
That is, the stability of S liposomes or SG liposomes and the avoidance ability in the body were examined by encapsulating a calcein, which is a fluorescent reagent, in the liposomes and using calcein as an index, and dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) was used.
The present invention was completed in recognition of its usefulness as compared with liposomes prepared by using only (hereinafter referred to as DPPC liposomes).
【００１１】本発明で用いるステロール及び／又はＳＧ
のグルコシドとしては、例えば植物精製工程で生じるソ
ーダ油宰から得られるステロールグルコシド（ＳＧ）
で、その組成はシトステリル−Ｄ−グルコシド、カンペ
ステリル−Ｄ−グルコシド、スチグマステリル−Ｄ−グ
ルコシド、ブラシカステリル−Ｄ−グルコシドからなる
混合物、又は、このステロールグルコシド（ＳＧ）を加
水分解して得たステロール混合物（Ｓ）が使用でき、ま
た、それらの混合物を構成する単独成分を使用しても有
効である。Sterol and / or SG used in the present invention
The glucosides, e.g. sterol glucosides obtained from soda oil Osamu occurring in plants purification step (SG)
The composition is sitosteryl-D-glucoside, campesteryl-D-glucoside, stigmastereryl-D-glucoside, a mixture of brassicasteryl-D-glucoside, or a sterol obtained by hydrolyzing this sterol glucoside (SG). The mixture (S) can be used, and it is also effective to use the single components constituting the mixture.
【００１２】[0012]
【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。 実施例１ 本発明で用いるステロールグルコシド（ＳＧ）及びステ
ロール（Ｓ）の製造方法。植物油精製工程で生じるソー
ダ油滓の乾燥粉末１００ｇにピリジン１，０００ｍｌを
加え加熱溶解する。この溶液に活性炭を加え攪判後に濾
過し、濾液を得る。濾液１，０００ｍｌに対しアセトン
１，５００ｍｌを添加し冷却すると結晶が析出する。得
られた粗ステロールグルコシドを再びピリジンに加熱溶
解し、上記と同様に活性炭を加えて脱色処理を行った
後、アセトンを加えて結晶を析出させる。得られた結晶
を減圧乾燥し、精製ＳＧ３０ｇを得た。このステロール
グルコシドの組成はβ−シトステリルβ−Ｄ−グルコシ
ド（４９．９％）、カンペステリルβ−Ｄ−グルコシド
（２９．１％）、スチグマステリルβ−Ｄ−グルコシド
（１３．４％）、ブラシカステリルβ−Ｄ−グルコシド
（７．２％）の混合物であった。本発明で用いたステロ
ール（Ｓ）は、ＳＧを酸で加水分解したもので、成分と
してＳＧのステリルグルコシドと同一のステロール成分
比を含んだものである。EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples. Example 1 A method for producing sterol glucoside (SG) and sterol (S) used in the present invention. To 100 g of dry powder of soda slag produced in the vegetable oil refining process, 1,000 ml of pyridine is added and dissolved by heating. Activated carbon is added to this solution, and the mixture is stirred and filtered to obtain a filtrate. When 1,500 ml of acetone is added to 1,000 ml of the filtrate and the mixture is cooled, crystals are precipitated. The obtained crude sterol glucoside is again dissolved in pyridine by heating, activated carbon is added in the same manner as above for decolorization treatment, and then acetone is added to precipitate crystals. The crystals obtained were dried under reduced pressure to obtain 30 g of purified SG. The composition of this sterol glucoside is β-sitosteryl β-D-glucoside (49.9%), campesteryl β-D-glucoside (29.1%), stigmasteryl β-D-glucoside (13.4%), brassicasteryl. It was a mixture of β-D-glucosides (7.2%). The sterol (S) used in the present invention is obtained by hydrolyzing SG with an acid, and contains the same sterol component ratio as the steryl glucoside of SG as a component.
【００１３】実施例２ リポソームの調製法 Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン［（日本
油脂（株）製）以下ＤＰＰＣという］の１０ｍＭのクロ
ロホルム溶液とＳ及びＳＧの１０ｍＭのメタノール：ク
ロロホルム＝２：１混液を調製する。この溶液をナス型
コルベンにＤＰＰＣ、ＳあるいはＳＧのモル比が７：
１：Ｘ（Ｘ＝０〜０．８，Ｘ＝Ｓ，ＳＧ）を量り取り、
室温でエバポレーターによって有機溶媒を減圧除去す
る。さらに、クロロホルムを完全に除くために減圧デシ
ケータ中で１６時間乾燥する。これに７０ｍＭのカルセ
インのＮａＣｌ含有リン酸緩衝溶液［（ｐＨ７．４）以
下ＰＢＳという］を加え、５０℃で１時間水和した後、
水浴型超音波器中で３０分間超音波を照射したのちに、
遠心分離して多重膜リポソーム（ＭＬＶ，１７．１ｍｇ
リン脂質／ｍｌＰＢＳ）を調製した。さらに、このリポ
ソーム懸濁液５００μｌをセファデックス（Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ）Ｇ−５０カラム（１．９ｃｍ×３２ｃｍ，フラ
クションサイズ４．５ｍｌ）で展開溶媒にＰＢＳを用い
てカルセイン内包リポソーム（１．９ｍｇ×リン脂質／
ｍｌＰＢＳ）と遊離カルセインとを分離した。リポソー
ムの粒子径は、約０．１μｍであった。上記において、
ＰＢＳは次の組成の物である。 塩化ナトリウム ８．０００ｇ 塩化カリウム ０．１９４ｇ リン酸二ナトリウム ２．２９０ｇ リン酸一カリウム ０．１９６ｇ 精製水 １０００．０００ｍｌExample 2 Preparation Method of Liposomes A 10 mM chloroform solution of L-α-dipalmitoylphosphatidylcholine (hereinafter referred to as “DPPC” manufactured by NOF CORPORATION) and 10 mM methanol: chloroform = 2: 1 mixture of S and SG. To prepare. This solution was added to eggplant-type Kolben at a molar ratio of DPPC, S or SG of 7:
1: Weigh X (X = 0 to 0.8, X = S, SG),
The organic solvent is removed under reduced pressure by an evaporator at room temperature. Further, it is dried in a vacuum desiccator for 16 hours to completely remove chloroform. A 70 mM NaCl-containing phosphate buffer solution [(pH 7.4) hereinafter referred to as PBS] of 70 mM was added thereto, and after hydration at 50 ° C. for 1 hour,
After irradiating ultrasonic waves for 30 minutes in a water bath type ultrasonic device,
Centrifugal separation and multilamellar liposome (MLV, 17.1 mg
Phospholipid / ml PBS) was prepared. Further, 500 μl of this liposome suspension was added to Sephadex (Sephadex).
dex) G-50 column (1.9 cm × 32 cm, fraction size 4.5 ml) using PBS as a developing solvent, calcein-encapsulating liposome (1.9 mg × phospholipid /
(mlPBS) and free calcein were separated. The particle size of the liposome was about 0.1 μm. In the above,
PBS has the following composition. Sodium chloride 8.000 g Potassium chloride 0.194 g Disodium phosphate 2.290 g Monopotassium phosphate 0.196 g Purified water 1000.000 ml
【００１４】実施例３ Ｓリポソーム及びＳＧリポソームの血漿中での安定性 リポソームは体液中、特に血中で血液成分によってオプ
ソニ化され、内容物を漏出しやすいということが知られ
ている。そこで、各々のリポソームの体内での安定性に
及ぼすラット血漿の影響について試験した。図１ａ）
は、ＰＢＳ中に５０％ラット血漿を添加して、図１ｂ）
はＰＢＳのみに、それぞれリポソームを加え、３７．５
℃で１時間インキュベートしたときのカルセインの放出
プロファイルを示す。これより、ＤＰＰＣリポソーム、
ＳＧリポソームは、Ｓリポソームより漏出率が高く、１
時間後の漏出率は、ＤＰＰＣ＝ＳＧ＞Ｓの順に小さくな
った。また、ＰＢＳ中でのＤＰＰＣリポソーム、Ｓリポ
ソーム、及びＳＧリポソームの漏出率は、すべて２０％
以下であった。また図１ａ）において５６℃、３０分で
血漿を熱処理したときの１時間での漏出率は、無処理に
比べて、Ｓリポソームでは３２．８％から１９．５％
へ、ＳＧリポソームは６０．８％から４４．５％へと低
くなった。Example 3 Stability of S Liposomes and SG Liposomes in Plasma It is known that liposomes are opsonized by blood components in body fluids, particularly blood, and the contents thereof are likely to leak out. Therefore, the effect of rat plasma on the stability of each liposome in the body was examined. Figure 1a)
Added 50% rat plasma in PBS, Figure 1b).
Added liposomes only to PBS, and added 37.5
FIG. 3 shows the release profile of calcein when incubated at 0 ° C. for 1 hour. From this, DPPC liposomes,
SG liposomes have a higher leakage rate than S liposomes, and 1
The leakage rate after time decreased in the order of DPPC = SG> S. The leakage rate of DPPC liposomes, S liposomes, and SG liposomes in PBS is 20%.
It was below. Further, in FIG. 1a), the leakage rate in 1 hour when plasma was heat-treated at 56 ° C. for 30 minutes was 32.8% to 19.5% in the S liposome, as compared with the untreated plasma.
, SG liposomes fell from 60.8% to 44.5%.
【００１５】実施例４ Ｓリポソーム及びＳＧリポソームの血中滞留性と臓器分
布 静脈投与後の薬物の血中からの消失は、おもに各臓器で
の代謝と排泄に依存する。しかしながら、粒子性のリポ
ソーム自体及び添加薬物の体内動態は、主に、肝臓や脾
臓に存在するマクロファージ（細網内皮系組織：ＲＥ
Ｓ）による補足と血中での崩壊による。特に肝臓への分
布は、粒子径、表面の親水性や表面電位による。そこ
で、各々のリポソームをマウスに尾静脈投与したときの
血中滞留性の違いを測定し、図２に示した。投与５分後
の血中におけるリポソーム中のカルセインの蛍光強度を
１００％とすると、ＤＰＰＣリポソームの蛍光強度は６
時間後において０．８３（５．７％）、ＳＧリポソーム
は０．７（２．６％）、Ｓリポソームは４．１（７．７
％）が血中に滞留した。これは、Ｓリポソームは、ＤＰ
ＰＣリポソーム及びＳＧリポソームに比べ、リポソーム
膜の流動性が低く、血漿成分によってオプソニン化がさ
れにくい。したがって、Ｓリポソームの血中滞留性が長
いのは、リポソーム膜が比較的固く、血漿中で安定なた
めにマクロファージによる補足から回避され、また血中
での崩壊も少ないためである。一方、ＤＰＰＣリポソー
ム及びＳＧリポソームは、リポソーム膜の流動性がＳリ
ポソームより高く、血漿成分によって１時間で５０〜６
０％の内包物を放出した。したがって、ＤＰＰＣリポソ
ーム及びＳＧリポソームの血中滞留性が短いのは、主に
血中でのリポソームの崩壊による。ＲＥＳの異物取り込
み能は、効率よく迅速で、たとえば１μｍ以下の粒子は
静脈投与して、約１分後には投与量の９０％以上は、肝
臓と脾臓に集まる。そこで、ＤＰＰＣリポソーム、Ｓリ
ポソーム及びＳＧリポソームの静脈投与６時間後の肝臓
と脾臓の分布を調べた。その結果は、図３に示したよう
に投与６時間後にリポソームは、投与量の約９０％以上
が肝臓に分布し、脾臓には投与量の１０％以下であっ
た。Example 4 Retention of S Liposomes and SG Liposomes in Blood and Distribution of Organs The disappearance of a drug from blood after intravenous administration mainly depends on metabolism and excretion in each organ. However, the pharmacokinetics of the particulate liposome itself and the added drug is mainly due to macrophages (reticuloendothelial system tissue: RE) existing in the liver and spleen.
By supplementation with S) and disintegration in blood. In particular, distribution to the liver depends on the particle size, surface hydrophilicity, and surface potential. Therefore, the difference in blood retention when each liposome was administered to the tail vein of mice was measured and shown in FIG. When the fluorescence intensity of calcein in the liposome in blood 5 minutes after administration is 100%, the fluorescence intensity of DPPC liposome is 6
0.83 (5.7%) after time, 0.7 (2.6%) for SG liposomes, 4.1 (7.7) for S liposomes.
%) Remained in the blood. This is S liposome, DP
Compared to the PC liposome and SG liposomes, low fluidity of the liposome membrane, hardly been Opusoni down by plasma components. Therefore, the reason why the S liposome has a long retention time in blood is that it is avoided from being captured by macrophages because the liposome membrane is relatively hard and stable in plasma, and it is also less disintegrated in blood. On the other hand, DPPC liposomes and SG liposomes have higher fluidity of the liposome membrane than S liposomes, and depending on the plasma component, 50 to 6 in 1 hour.
0% of inclusion was released. Therefore, the short blood retention of DPPC liposomes and SG liposomes is mainly due to the disintegration of liposomes in blood. The foreign substance uptake ability of RES is efficient and rapid, for example, particles of 1 μm or less are intravenously administered, and after about 1 minute, 90% or more of the dose is collected in the liver and spleen. Therefore, the distribution of liver and spleen 6 hours after intravenous administration of DPPC liposome, S liposome and SG liposome was examined. As a result, as shown in FIG. 3, about 6 hours after administration, about 90% or more of the dose of the liposome was distributed to the liver and 10% or less of the dose to the spleen.
【００１６】実施例５ Ｓリポソーム及びＳＧリポソームの肝細胞分布 ネンブタール（０．０６ｍｌ／３０ｍｇ）及びヘパリン
（２００ＩＵ）を腹腔内投与したマウスに、カルセイン
内包リポソームを尾静脈より投与し、２時間後に開腹
し、カニュレーションをして、第一灌流液は５分、ＰＢ
Ｓは５分、コラゲナーゼ溶液（７５ＩＵ）は１５分の順
に灌流する。次に、肝臓を切り離し、シャーレ中の氷冷
したＨＡＮＫ′ｓ緩衝液（３ｍｌ）に移し、細胞を分散
させる。その後、ガーゼで濾過し、濾液をスピッツ管に
集め、５０×ｇ，７０×ｇ及び１４０×ｇでそれぞれ１
分間遠心分離し、実質細胞と非実質細胞を分離し、蛍光
強度を測定して、各リポソームの肝細胞分布を測定し
た。なお、１４０×ｇによって得た非実質細胞数分画の
各分画中の細胞数をＢｕｒｋｅｒ−Ｔｕｒｋ Ｃｈａｍ
ＢＥＲを用いて数えた結果、実質細胞数は２．４９×１
０７個、非実質細胞数は２．７６×１０７個となり、実
質細胞数と非実質細胞数は等しかった。また、実質細胞
数の生存率はトリパンブルーテストにより確認し、７０
％以上であった。Example 5 Hepatocyte Distribution of S Liposomes and SG Liposomes Nembutal (0.06 ml / 30 mg) and heparin (200 IU) were intraperitoneally administered to mice by intraperitoneal administration of calcein-encapsulated liposomes from the tail vein, and after 2 hours, abdominal laparotomy was performed. Then, cannulate, 5 minutes for the first perfusate, PB
S for 5 minutes and collagenase solution (75 IU) for 15 minutes. Next, the liver is separated and transferred to ice-cold HANK's buffer (3 ml) in a petri dish to disperse the cells. Then, filter with gauze, collect the filtrate in a Spitz tube, and use 1 at 50 × g, 70 × g, and 140 × g, respectively.
Centrifugation was performed to separate parenchymal cells and non-parenchymal cells, the fluorescence intensity was measured, and the hepatocyte distribution of each liposome was measured. In addition, the number of cells in each fraction of the non-parenchymal cell number fraction obtained by 140 × g was calculated by the Burker-Turk Chem.
As a result of counting using BER, the number of parenchymal cells is 2.49 × 1.
The number of non-parenchymal cells was 0 7, and the number of non-parenchymal cells was 2.76 × 10 7 , and the numbers of parenchymal cells and non-parenchymal cells were equal. In addition, the survival rate of the parenchymal cell number was confirmed by the trypan blue test, and
% Or more.
【００１７】肝臓では、栄養物質の処理、貯蔵、中毒性
物質（薬物）の解毒、分解、排泄などといった生体にと
って不可欠な機能が営まれており、実質細胞、毛細胆
管、毛細血管が放射状に集まった特有の構造をしてい
る。肝臓を構成する細胞には、実質細胞と非実質細胞で
ある内皮細胞、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞及び脂肪貯蔵細胞な
どがあり、それぞれ異なった構造と機能をもっている。
実質細胞は、肝臓の大部分（約７０％）を占め、代謝、
排泄など肝臓の主な機能を担っている。一方、非実質細
胞胞であるＫｕｐｆｆｅｒ細胞は、類洞の内側に定着し
た細網内皮系の細胞で、血液中に存在する微粒子性老廃
物の除去に中心的な役割を果たしている。[0017] In the liver, treatment of nutrients, storage, detoxification of toxic substances (drugs), decomposition, are Itonama the essential feature for the biological, such as excretion, parenchymal cells, hair Hosotankan, capillary blood vessels radial It has a unique structure gathered in. Liver-constituting cells include parenchymal cells and non-parenchymal cells such as endothelial cells, Kupffer cells, and fat-storing cells, which have different structures and functions.
Parenchymal cells occupy most of the liver (about 70%), and metabolism,
It is responsible for the main functions of the liver such as excretion. On the other hand, Kupffer cells, which are non-parenchymal cells, are cells of the reticuloendothelial system established inside the sinusoids and play a central role in removing particulate wastes existing in blood.
【００１８】図４に示したようにリポソームはＲＥＳの
中でも特に肝臓に取り込まれることから、肝臓内での実
質及び非実質細胞への取り込みの違いを測定し、その結
果を図５に示した。ＤＰＰＣリポソームの実質及び非実
質細胞への取り込み量は、極めて少なかった。これは、
血中において血漿成分によりＤＰＰＣリポソームは、非
常に崩壊されやすいために、肝細胞への取り込み量が低
くなったためである。一方、ＳＧリポソームは、血漿中
でＤＰＰＣリポソームと同様に不安定であったが、実質
細胞に多く取り込まれた。しかし、血漿中で安定である
Ｓリポソームの実質細胞への取り込み量は、ＳＧリポソ
ームの約１／３であった。また、非実質細胞への取り込
み量は、Ｓ及びＳＧリポソームともほぼ同様であった。
これらの結果より、膜の流動性が高いＤＰＰＣリポソー
ムは血中において崩壊し、また、ＳＧリポソームは、実
質細胞に取り込まれ易く、血中での滞留率も低くなっ
た。よって、ＳＧリポソームは、ＲＥＳ回避能を有する
ことが証明された。また、膜の流動性の低いＳリポソー
ムは、血漿中で安定であり、実質及び非実質細胞にも取
り込まれにくいために、血中での滞留率が高くなったこ
とが証明された。このことから、薬物担体としてのリポ
ソームは、薬物の徐放化にはＳリポソームが、肝臓への
ターゲティングにはＳＧリポソームが有効であることが
認められた。As shown in FIG . 4 , liposomes are taken up by the liver among RES . Therefore, the difference in the uptake into parenchymal cells and non-parenchymal cells in the liver was measured, and the results are shown in FIG . The uptake of DPPC liposomes into parenchymal and non-parenchymal cells was extremely low. this is,
This is because the DPPC liposome is very easily disintegrated in the blood due to the plasma component, and thus the uptake amount into hepatocytes is low. On the other hand, SG liposomes were unstable in plasma as in DPPC liposomes, but a large amount of SG liposomes were taken up by parenchymal cells. However, the amount of S liposomes stable in plasma taken up by parenchymal cells was about 1/3 that of SG liposomes. The amount of uptake into non-parenchymal cells was almost the same as that of the S and SG liposomes.
From these results, DPPC liposomes having high membrane fluidity were disintegrated in blood, and SG liposomes were easily taken up by parenchymal cells and the retention rate in blood was low. Therefore, the SG liposome was proved to have the RES avoidance ability. Further, it was proved that the S liposome having low membrane fluidity is stable in plasma and is hardly taken up by parenchymal and non-parenchymal cells, and thus the retention rate in blood is high. Therefore, as the liposomal drug responsible body for sustained release of the drug S liposomes for targeting to the liver was found to be SG liposomes is valid.
【００１９】[0019]
【発明の効果】以上述べたように、ＤＰＰＣのみで調製
したリポソーム（ＤＰＰＣリポソーム）と比較して、ス
テロール（Ｓ）あるいはステロールグルコシド（ＳＧ）
でＤＰＰＣリポソームを被覆したものは安定性に優れ、
ＳリポソームとＳＧリポソームの血中滞留性は、Ｓリポ
ソームが最も良く、また、肝臓の実質細胞への取り込み
はＳＧリポソームが良いことが顕著に認められた。薬物
担体としてのリポソームは、薬物の徐放化にはＳリポソ
ームが、肝臓へのターゲティングにはＳＧリポソームが
有効であることが認められ、本発明の有用性が証明され
た。INDUSTRIAL APPLICABILITY As described above, as compared with the liposome prepared only with DPPC (DPPC liposome), sterol (S) or sterol glucoside (SG) is used.
The one coated with DPPC liposome is excellent in stability,
It was remarkably observed that the S liposome and SG liposome had the best blood retention properties in the S liposome, and that the SG liposome had better uptake into the parenchymal cells of the liver. Drug
Liposomes as responsible bodies, S liposomes to sustained release of the drug, it is recognized for targeting to the liver is effective SG liposomes, the usefulness of the present invention was proved.
【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]
【図１】図１ａ）はＰＢＳ中に５０％ラット血漿を添加
して、図１ｂ）はＰＢＳのみに、それぞれリポソームを
加え、３７．５℃で１時間インキュベートしたときのカ
ルセインの放出プロファイルを示す。FIG. 1a) shows the release profile of calcein when 50% rat plasma was added to PBS and FIG. 1b) was added liposomes only to PBS and incubated at 37.5 ° C. for 1 hour. .
【図２】ＰＢＳ中の血漿添加量を０，２５，５０，９０
％と変化した場合の各々のリポソームからのカルセイン
の漏出変化を示す。FIG. 2 shows that the amount of plasma added to PBS is 0, 25, 50, 90
The change in the leakage of calcein from each liposome when the percentage changes with% is shown.
【図３】ＤＰＰＣリポソーム、Ｓリポソーム及びＳＧリ
ポソームをマウスに尾静脈投与したときの血中滞留性の
違い（蛍光強度）を示す。FIG. 3 shows the difference in blood retention (fluorescence intensity) when DPPC liposome, S liposome, and SG liposome were administered to mice via tail vein.
【図４】ＤＰＰＣリポソーム、Ｓリポソーム及びＳＧリ
ポソームのマウスに尾静脈投与６時間後の肝臓と脾臓の
分布を示す。FIG. 4 shows the distribution of liver and spleen of DPPC liposome, S liposome and SG liposome in mice 6 hours after tail vein administration.
【図５】リポソームをマウスに静脈投与したときの、２
時間後の肝臓内での実質及び非実質細胞の蛍光強度（各
リポソームの取り込みの違い）を示す。FIG. 5: 2 when liposomes were intravenously administered to mice
The fluorescence intensity of parenchymal and non-parenchymal cells (difference in uptake of each liposome) in the liver after time is shown.
【手続補正２】[Procedure Amendment 2]
【補正対象書類名】図面[Document name to be corrected] Drawing
【補正対象項目名】全図[Correction target item name] All drawings
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction content]
【図１】 [Figure 1]
【図２】 [Fig. 2]
【図３】 [Figure 3]
【図４】 [Figure 4]
【図５】 [Figure 5]
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 47/28 Ｄ 7433−4Ｃ Ｃ 7433−4Ｃ Ｂ０１Ｊ 13/02 (72)発明者 永井 恒司 東京都文京区本駒込１−23−10−103 (72)発明者 三竹 茂夫 東京都千代田区東神田１−11−１ 株式会 社龍角散研究開発部内 (72)発明者 多田 宗和 東京都千代田区東神田１−11−１ 株式会 社龍角散研究開発部内Continuation of the front page (51) Int.Cl. 5 Identification code Office reference number FI Technical indication location A61K 47/28 D 7433-4C C 7433-4C B01J 13/02 (72) Inventor Tsuneji Nagai Bunkyo-ku, Tokyo 1-23 Komagome 1-23-10-103 (72) Shigeo Mitake 1-1-11-1, Higashi-Kanda, Chiyoda-ku, Tokyo Ryukakusan R & D Department (72) Inventor Munekazu Tada Higashi-Kanda, Chiyoda-ku, Tokyo 1-11-1 Stock Company Ryukakusan R & D Department
Claims (3)
シドで被覆したことを特徴とするリポソーム。1. A liposome coated with sterol and / or sterol glucoside.
ペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロー
ルから選ばれた１種以上であることを特徴とする請求項
１記載のリポソーム。2. The liposome according to claim 1, wherein the sterol is one or more selected from sitosterol, campesterol, stigmasterol, and brassicasterol.
ル−Ｄ−グルコシド、カンペステリル−Ｄ−グルコシ
ド、スチグマステリル−Ｄ−グルコシド、ブラシカステ
リル−Ｄ−グルコシドから選ばれた１種以上であること
を特徴とする請求項１記載のリポソーム。3. The sterol glucoside is one or more selected from sitosteryl-D-glucoside, campesteryl-D-glucoside, stigmasteryl-D-glucoside and brassicasteryl-D-glucoside. 1. The liposome according to 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10001293A JP3338114B2 (en) | 1993-03-22 | 1993-03-22 | Liposomes coated with sterol or sterol glucoside |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10001293A JP3338114B2 (en) | 1993-03-22 | 1993-03-22 | Liposomes coated with sterol or sterol glucoside |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06298638A true JPH06298638A (en) | 1994-10-25 |
| JP3338114B2 JP3338114B2 (en) | 2002-10-28 |
Family
ID=14262650
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10001293A Expired - Fee Related JP3338114B2 (en) | 1993-03-22 | 1993-03-22 | Liposomes coated with sterol or sterol glucoside |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3338114B2 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006080452A1 (en) * | 2005-01-28 | 2006-08-03 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Method for producing fine particle surface-modified with water-soluble substance |
| US7186459B2 (en) | 2001-07-10 | 2007-03-06 | Canon Kabushiki Kaisha | Liposome coated with polyhydroxyalkanoate and production method thereof |
| JP2011529043A (en) * | 2008-07-24 | 2011-12-01 | アモーレパシフィック コーポレイション | Multilayer lamellar granule and skin external preparation composition containing the same |
-
1993
- 1993-03-22 JP JP10001293A patent/JP3338114B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7186459B2 (en) | 2001-07-10 | 2007-03-06 | Canon Kabushiki Kaisha | Liposome coated with polyhydroxyalkanoate and production method thereof |
| WO2006080452A1 (en) * | 2005-01-28 | 2006-08-03 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Method for producing fine particle surface-modified with water-soluble substance |
| US9937127B2 (en) | 2005-01-28 | 2018-04-10 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Method of producing fine particles surface-modified with water-soluble substance |
| JP2011529043A (en) * | 2008-07-24 | 2011-12-01 | アモーレパシフィック コーポレイション | Multilayer lamellar granule and skin external preparation composition containing the same |
| US8771743B2 (en) | 2008-07-24 | 2014-07-08 | Amorepacific Corporation | Multi-layered lamellar granule and skin external application composition containing same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3338114B2 (en) | 2002-10-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU654120B2 (en) | Solid tumor treatment method and composition | |
| Takada et al. | Increased lung uptake of liposomes coated with polysaccharides | |
| EP0036676B1 (en) | Method of making uniformly sized liposomes and liposomes so made | |
| Barratt et al. | Preparation and characterisation of liposomes containing mannosylated phospholipids capable of targetting drugs to macrophages | |
| WO1993019738A1 (en) | Method of treatment of infected tissues | |
| IE50369B1 (en) | Lipid vesicles bearing carbohydrate surfaces as lymphatic directed vehicles for therapeutic and diagnostic substances,their use and method of preparing them | |
| CA2158055A1 (en) | Novel phospholipid-saccharide conjugates | |
| JP2015071631A (en) | Compositions and methods for treating lymphoma | |
| JPH0526767B2 (en) | ||
| US20080020029A1 (en) | Drug Delivery System Using an Immune Response System | |
| JPS62294432A (en) | Ribosome using phosphatide as base and medicine composition | |
| US20030113369A1 (en) | Liposomes with enhanced circulation time and method of treatment | |
| Kobayashi et al. | Enhancement of anti‐tumor activity of 1‐β‐D‐arabinofuranosylcytosine by encapsulation in liposomes | |
| KR100243933B1 (en) | Liposomes with excess negative charge | |
| EP0366770A1 (en) | Liposomes coupled to hormones. | |
| JPH06298638A (en) | Ribosome coated with sterol or sterol glucoside | |
| Arica et al. | Characterization, in vitro and in vivo studies on primaquine diphosphate liposomes | |
| Scherphof et al. | Stability of liposomes in presence of blood constituents: consequences for uptake of liposomal lipid and entrapped compounds by rat liver cells | |
| US20010051183A1 (en) | Liposomes with enhanced circulation time and method of treatment | |
| NZ190925A (en) | 3beta-hydroxy-5-ene(or 3beta-hydroxy-5alpha))-spiroketal steroid-3-mono-and-3-disaccharides in antiinflammatory compositions | |
| JP3943845B2 (en) | Liposome vector | |
| US20020164367A1 (en) | Botanical drug for increasing immunity and decreasing side effects of chemotherapy | |
| JP2705175B2 (en) | Low toxicity drug-lipid system | |
| AU646520B2 (en) | Phospholipid analogue vesicle with a succinimidyl moiety | |
| CN116270532A (en) | Vesicular drug delivery system targeting hepatic stellate cells, preparation method and application thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Year of fee payment: 7 Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090809 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Year of fee payment: 7 Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090809 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100809 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Year of fee payment: 9 Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110809 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110809 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Year of fee payment: 10 Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120809 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |