JPH06289017A - Ｄｎａの塩基配列決定方法及びｄｎａの塩基配列決定用測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 走査型プローブ顕微鏡を利用したＤＮＡの塩
基配列決定方法及びＤＮＡの塩基配列決定用測定装置を
提供する。 【構成】 ＤＮＡの塩基配列決定用測定装置は、走査型
プローブ顕微鏡と、前記走査型プローブ顕微鏡の探針２
と被測定一本鎖ＤＮＡを収容するための溶液セル４と、
溶液セル４に設けられた溶液の進入口５及び排出口６
と、進入口５につながれている溶液タンク１４、１５、
１６から構成される。塩基またはＤＮＡ断片を含まない
溶液を導入したときのＤＮＡ像と、前記塩基またはＤＮ
Ａ断片を含む溶液を導入したときのＤＮＡ像とを比較す
ることにより、ＤＮＡの塩基配列を簡単に、迅速に、し
かも少量の試料を用いて読みとることができる。走査型
プローブ顕微鏡は、走査型トンネル顕微鏡または原子間
力顕微鏡であることが好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、分子生物学、医学、法
医学、農林水産業、製薬業における、ＤＮＡの塩基配列
決定方法及びＤＮＡの塩基配列決定用測定装置に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】化学反応と分離分析を組み合わせたＤＮ
Ａの塩基配列決定方法（細胞の分子生物学第２版（１９
８９）、中村桂子監修、教育社、１８５〜１８８ペー
ジ）に代わる新規な方法として、走査型トンネル電子顕
微鏡（以下、ＳＴＭという）（ネイチャー３３９（１９
８９）、４８４〜４８６ページ：Ｎａｔｕｒｅ３３９
（１９８９）、ｐｐ４８４−４８６）や原子間力顕微鏡
（以下、ＡＦＭという）（バイオフィジカル・ジャーナ
ル５８（１９９０年）、１２５１〜１２５８ページ：Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５８（１９９０）、ｐｐ１２５１−
１２５８）を用いたＤＮＡの塩基配列決定法が研究され
ている。

【０００３】ＳＴＭ及びＡＦＭとは走査型プローブ顕微
鏡の一種で、これは細い探針を物質表面に接近もしくは
接触させて、原子レベルの精度でこの物質表面を走査
し、探針と物質表面間に発生する様々な相互作用の結果
生じるトンネル電流や力や熱などの物理量を検出するこ
とによって、物質表面の形状を調べる装置である。

【０００４】ＳＴＭやＡＦＭを用いることにより、原理
的には一分子のＤＮＡから塩基配列を決めることが可能
となる。また、従来法に比べて安全かつ簡便に塩基配列
を決定できるので、将来的には、従来法に取って代わる
ものとして期待されている。

【０００５】ＳＴＭは、先端の尖った探針をピエゾ素子
を用いて試料に原子数個分の距離まで近づけ、特定領域
を走査しながら試料と探針との間に流れるトンネル電流
を測定することにより試料の表面形状を調べる測定装置
である。ＳＴＭを用いることにより、試料の形状を原子
レベルの分解能で調べることができる（フィジカル・レ
ビュー・レターズ５０（１９８３）、１２０〜１２３ペ
ージ：Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔｅｒｓ５０（１９８
３）、ｐｐ１２０−１２３）。

【０００６】また、ＡＦＭはトンネル電流の代わりに探
針と試料との間に働く原子間力を測定することにより、
試料表面の形状を調べることができる（フィジカル・レ
ビュー・レターズ５６（１９８６）、９３０〜９３３ペ
ージ：Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔｅｒｓ５６（１９８
６）、ｐｐ９３０−９３３）。

【０００７】以下にＳＴＭやＡＦＭを用いてＤＮＡの塩
基配列を決定する方法を示す。ＤＮＡは４種類の塩基、
アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シト
シン（Ｃ）を含む。それらの塩基はそれぞれ分子の形状
が違うので、あらかじめ一種類の塩基だけから成る一本
鎖ＤＮＡを観察し、各塩基の形状を調べておく。

【０００８】次に、塩基配列を調べたい一本鎖ＤＮＡを
基板に固定して、このＤＮＡの形状をＳＴＭ、もしくは
ＡＦＭを用いて調べる。既に４種類の塩基の形状は分か
っているので、一本鎖ＤＮＡの形状から各塩基の位置が
分かり、このＤＮＡの塩基配列が分かる。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】ＳＴＭを用いることに
より、試料表面の原子一個一個を識別して見ることが可
能である。しかし、これは導電性のある試料に限ったこ
とであり、導電性のない試料表面を原子分解能で見るこ
とは難しい。ＤＮＡは不導体なので走査型プローブ顕微
鏡の分解能は高くなく、ＤＮＡの内部構造を調べること
が難しい。そのため、ＤＮＡを構成する４種類の塩基の
位置を正確に再現性良く調べることはできていない。

【００１０】ＡＦＭは導電性のない試料でも観測可能で
あるが、測定分解能はＳＴＭほど高くなく、ＤＮＡ内の
塩基の位置を完全に調べることは難しい。また、基板へ
のＤＮＡの固定のされ方により塩基の見え方が変わるの
で、あらかじめ観察した、一種類の塩基だけを含むＤＮ
Ａの像から得られたデーターをそのまま用いることがで
きない。従って、ＳＴＭやＡＦＭを用いてＤＮＡを構成
する塩基の配列を決定することは難しい。

【００１１】本発明は、前記従来の課題を解決し、ＳＴ
ＭやＡＦＭを用いてＤＮＡの塩基配列を正確に再現性良
く決定する方法及び塩基配列を決定するための測定装置
を提供することを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】前記目的を達成するた
め、本発明のＤＮＡの塩基配列決定方法は、走査型プロ
ーブ顕微鏡を用いたＤＮＡの塩基配列決定方法であっ
て、少なくとも２種類の溶液中で一本鎖ＤＮＡを順次観
察することを特徴とする。

【００１３】前記構成においては、少なくとも２種類の
溶液が、一本鎖ＤＮＡ断片を含まない１種類の溶液と、
少なくとも１分子の一本鎖ＤＮＡ断片を含む少なくとも
１種類の溶液とからなることが好ましい。

【００１４】また、前記構成においては、少なくとも２
種類の溶液が、ＤＮＡを構成する塩基と塩基対をなす塩
基を含まない１種類の溶液と前記ＤＮＡを構成する塩基
と塩基対をなす塩基を含む少なくとも１種類の溶液とか
らなることが好ましい。

【００１５】また、前記構成においては、走査型プロ−
ブ顕微鏡が走査型トンネル顕微鏡であることが好まし
い。また、前記構成においては、走査型プローブ顕微鏡
が原子間力顕微鏡であることが好ましい。

【００１６】次に、本発明のＤＮＡの塩基配列決定用測
定装置は、走査型プローブ顕微鏡と、前記走査型プロー
ブ顕微鏡の探針と被測定一本鎖ＤＮＡとを収容するため
の溶液セルと、前記溶液セルに設けられた溶液の進入口
及び排出口と、前記進入口につながれている少なくとも
２つの溶液タンクからなるという構成を備えたものであ
る。

【００１７】前記構成においては、走査型プロ−ブ顕微
鏡が走査型トンネル顕微鏡であることが好ましい。ま
た、前記構成においては、走査型プローブ顕微鏡が原子
間力顕微鏡であることが好ましい。

【００１８】

【作用】前記本発明の構成によれば、少なくとも２種類
の溶液中で一本鎖ＤＮＡを順次観察することにより、塩
基の配列を正確に決定することができる。すなわち、一
本鎖ＤＮＡは、その基板上への固定のされ方によって形
状は違って見えるが、本発明の測定においては、異なる
溶液を試料一本鎖ＤＮＡにさらしたときの試料一本鎖Ｄ
ＮＡ像の変化のみをとらえているため、ＤＮＡ内の各塩
基の配列を確実に決定することができる。

【００１９】また、少なくとも２種類の溶液が、一本鎖
ＤＮＡ断片を含まない１種類の溶液と、少なくとも１分
子の一本鎖ＤＮＡ断片を含む少なくとも１種類の溶液と
からなるという本発明の好ましい構成によれば、試料の
一本鎖ＤＮＡで特定のタンパク質の情報がコードされて
いる部分を調べたい場合に都合がよい。

【００２０】適当な条件下では、一本鎖ＤＮＡは相補的
な塩基配列をもつ一本鎖ＤＮＡと結合する。例えば、試
料一本鎖ＤＮＡが塩基配列ＣＣＣＡＧＴを含む場合、こ
のＤＮＡを塩基配列ＧＧＧＴＣＡのみをもつ一本鎖ＤＮ
Ａ断片を含む溶液にさらすと、前記一本鎖ＤＮＡ断片は
試料一本鎖ＤＮＡの塩基配列ＣＣＣＡＧＴの部分にのみ
結合する。すなわち、調べたいタンパク質をコードして
いる一本鎖ＤＮＡを試料ＤＮＡにさらせば、前記一本鎖
ＤＮＡは試料ＤＮＡのタンパク質をコードしている部分
にのみ結合する。従って、タンパク質をコードしている
一本鎖ＤＮＡを含む溶液をさらす前後の試料ＤＮＡの形
状変化を走査型プローブ顕微鏡で調べることにより、目
的とする塩基配列が試料ＤＮＡのどこにあるのかが分か
る。

【００２１】また、少なくとも２種類の溶液が、ＤＮＡ
を構成する塩基と塩基対をなす塩基を含まない１種類の
溶液と、前記ＤＮＡを構成する塩基と塩基対をなす塩基
を含む少なくとも１種類の溶液とからなるという本発明
の好ましい構成によれば、ＤＮＡ内の各塩基の配列を正
確に決定することができる。すなわち、基板表面に固定
されたＤＮＡを溶液にさらしＤＮＡを観察する。この状
態では、ＤＮＡ内の各塩基を識別できるほど走査型プロ
ーブ顕微鏡の分解能は高くないが、ＤＮＡのおおよその
形態は識別できる。一本鎖ＤＮＡを構成する塩基は適当
な条件下では、それぞれ特定の塩基と水素結合する性質
を持っている。すなわち、ＡはＴと、ＧはＣと水素結合
する。

【００２２】そこで次に、走査型プローブ顕微鏡で引き
続きＤＮＡを測定しながら、溶液をＡを含む溶液に変え
る。このＡ分子の大きさは０．５ｎｍ以上なので、Ａが
ＤＮＡ中のＴと結合した際の、ＤＮＡの形状変化を走査
型プローブ顕微鏡で充分とらえることができる。従っ
て、変化した部分にＴの存在することが分かる。同様に
Ｇ、Ｃ、Ｔを含む溶液をそれぞれ一本鎖ＤＮＡにさらす
ことにより、ＤＮＡ中のＣ、Ｇ、Ａの配列が分かる。

【００２３】また、走査型プロ−ブ顕微鏡が走査型トン
ネル顕微鏡であると、溶液中で一本鎖ＤＮＡを観察する
のに都合がよい。また、走査型プローブ顕微鏡が原子間
力顕微鏡であると、溶液中で一本鎖ＤＮＡを観察するの
に都合がよい。

【００２４】次に，本発明のＤＮＡの塩基配列決定用測
定装置は、走査型プローブ顕微鏡と、前記走査型プロー
ブ顕微鏡の探針と被測定一本鎖ＤＮＡとを収容するため
の溶液セルと、前記溶液セルに設けられた溶液の進入口
及び排出口と、前記進入口につながれている少なくとも
２つの溶液タンクを備えることにより、一本鎖ＤＮＡの
特定の塩基が特定の塩基と結合する前後の像が観察でき
るので、ＤＮＡの塩基配列が決定できる。

【００２５】また、走査型プロ−ブ顕微鏡が走査型トン
ネル顕微鏡であると、溶液中で一本鎖ＤＮＡを観察する
のに都合がよい。また、走査型プローブ顕微鏡が原子間
力顕微鏡であると、溶液中で一本鎖ＤＮＡを観察するの
に都合がよい。

【００２６】

【実施例】以下、実施例を用いながら本発明を詳しく説
明する。図１は本発明の一実施例のＳＴＭを用いたＤＮ
Ａの塩基配列決定用測定装置の原理説明図である。

【００２７】被測定物質である一本鎖ＤＮＡを基板１に
固定する。基板１と、圧電体３に接続する探針２とを溶
液セル４に入れる。圧電体３はＺ軸方向制御用サーボ回
路５２およびＸ−Ｙ軸方向走査用回路５４によってコン
トロールされ、探針２を原子レベルの精度で走査する。
すなわち、圧電体３は電気信号（電圧）により伸縮し、
三次元方向つまり探針２を上下するＺ軸方向、探針２を
図の手前や奥方向に移動させるＹ軸方向、探針２を図の
左右方向に移動させるＸ軸方向に動くように構成されて
いる。基板１上の測定試料と探針２との間にトンネル電
流を流すための電圧発生器４９を作動する。圧電体３に
より、探針２を前記一本鎖ＤＮＡの表面に原子数個分の
距離まで近づけると、探針２と試料間にトンネル電流が
流れる。電流の大きさは電流検出器５０で検出する。ト
ンネル電流の変化量は電流検出器５０で電気信号に変え
られ電気信号増幅器５１で増幅される。前記トンネル電
流の大きさは探針２と試料の間の距離に指数関数的に比
例するので、この距離の微小な変化をトンネル電流の変
化量から知ることができる。

【００２８】そこで、トンネル電流の値が一定になるよ
うにＺ軸方向制御用サーボ回路５２を用いて探針２を走
査し、Ｘ、Ｙ、Ｚ軸方向のメモリー装置５５およびデー
ター解析装置５６を通して探針２の動きをディスプレイ
５７に表示することにより、試料の形状が分かる。

【００２９】溶液タンク１４、１５、１６内の溶液はそ
れぞれポンプ１１、１２、１３に汲み出され細管５を通
って溶液セル４に送られ、細管６を経て廃液タンク７に
排出される。ポンプ１１、１２、１３の運転とバルブ
８、９、１０の開閉は、バルブ・ポンプ制御装置５３に
より制御する。例えば、溶液タンク１４内の溶液を溶液
セル４に送る場合は、バルブ８を開け、ポンプ１１を運
転する。他のバルブ９、１０は全て閉じ、ポンプ１２、
１３は運転しない。このようにして溶液タンク１４内の
溶液のみを溶液セル４に入れる仕組みとなっている。

【００３０】図１においては、３つの溶液タンクとそれ
に付随するバルブ、ポンプしか描かれていないが、実際
はタンク数はいくらでも増やすことができる。図２は、
本発明の一実施例のＡＦＭを用いたＤＮＡの塩基配列決
定用測定装置の原理説明図である。図３は図２の試料の
測定部を拡大したものである。

【００３１】まず図２について説明する。図２において
は、図１で示されたいくつかの部分がそのまま利用され
ている。図１と共通する部分の説明は省略する。Ｘ−Ｙ
軸方向走査用回路１５４で走査する範囲やピッチを予め
設定しておき、探針１０２を試料表面に接近または接触
させて試料表面を走査する。

【００３２】光源１１２から出たレーザー光などの光１
０５はレンズ１１３で収束し、探針の梃部１０３に当た
る。この時に探針１０２と基板１０１との間に原子間力
が働くと、探針の梃部１０３がそれに応じてたわみ、こ
のため、レーザー光１０５の反射角が変化する。この反
射角の変化をセンサー１５０でキャッチし電気信号に変
え、この信号は電気信号増幅器１５１で増幅される。こ
の場合に、Ｚ軸方向制御用サーボ回路１５２は、センサ
ー１５０の電気信号の出力が常に一定になるような制御
信号を圧電体１１１に出力するようになっている。すな
わち強い原子間力が働いて探針１０２と基板１０１の距
離が近づくような力が生じた場合にはその力が生じてい
なかったときの力と同じになるよう試料がＺ軸方向で引
き離されるように作動する。このようにして試料上を所
定の範囲にわたって走査し、Ｘ、Ｙ、Ｚ軸方向のメモリ
ー装置１５５、データ解析装置１５６、ディスプレイ１
５７または記録装置（図示せず）により試料検査結果が
出力される。

【００３３】なお、この場合、センサー１５０はフォト
ダイオードである。次に図３について説明する。基板１
０１を基板１１０に固定する。前記基板１１０はオーリ
ング１０８、１０９によって溶液セル１０７の底部の穴
を封入するための基板である。圧電体１１１は基板１０
１および１１０を原子レベルの精度で走査する。前記圧
電体１１１は電気信号（電圧）により伸縮し、三次元方
向すなわち試料を上下するＺ軸方向、試料を図の手前方
向や奥方向に移動させるＹ軸方向、試料を図の左右方向
に移動させるＸ軸方向に動くように構成されている。溶
液セル１０７はレーザー光が透過できるようにガラスで
できている。探針の梃部１０３の上面には金属が蒸着さ
れていて、レーザー光などの光を反射できる。探針の梃
部１０３に接続する探針の基部１０４は溶液セル１０７
に固定されている。

【００３４】探針１０２、探針の梃部１０３、探針の基
部１０４は半導体微細加工技術によって、シリコン、酸
化シリコン、窒化シリコンのいずれかの材料から作製す
る。探針１０２の先端の曲率半径は、２０ｎｍ以下が好
ましい。

【００３５】また、一本鎖ＤＮＡに４種類の塩基を特異
的に結合させるためには、公知の生化学的手法（例え
ば、細胞の分子生物学、第２版（１９８９）、中村桂子
監修、教育社、１８８〜１９２ページを参照）を用い
る。

【００３６】まず、あらかじめ、一本鎖ＤＮＡにプライ
マー（被測定一本鎖ＤＮＡの特定領域に結合する相補的
な塩基配列をもつヌクレオチドで、一般に、一本鎖の端
に結合する）を結合させておく。このＤＮＡを酵素ポリ
メラーゼと４種類の塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）の溶解した
溶液に入れると、ポリメラーゼの働きにより、Ａ、Ｔ、
Ｃ、Ｇが一本鎖ＤＮＡ中のＴ、Ａ、Ｇ、Ｃにそれぞれ結
合して２本鎖ＤＮＡが形成される。

【００３７】また、被測定一本鎖ＤＮＡに、相補的な塩
基配列をもつ一本鎖ＤＮＡを結合させるには、前記相補
的な塩基配列をもつＤＮＡの溶解した溶液にさらし、６
０℃で約一時間反応させれば良い。

【００３８】また、被測定一本鎖ＤＮＡ内の塩基に相補
的な塩基が結合するためには、一本鎖ＤＮＡ内の塩基が
基板に対して外側を向いている必要がある。一本鎖ＤＮ
Ａは糖とリン酸残基が交互につながった長い鎖状分子
で、糖にはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔが結合し、リン酸部分はｐＨ
＝７付近で負の電荷を帯びている。従って、正の電荷を
帯びている基板に一本鎖ＤＮＡを固定することにより、
塩基を基板に対して外側に向けることができる。このた
めに、被測定一本鎖ＤＮＡを固定する基板としては、へ
き開した雲母、正の電荷の帯びた薄膜（例えば、雲母基
板上に積層されたラングミュアブロジェット（ＬＢ）
膜）等がある。また、へき開したグラファイトや金の蒸
着膜上の一本鎖ＤＮＡを測定する場合も、塩基が基板の
外側を向いているＤＮＡを探し、それを測定すること
で、塩基配列を決定することができる。

【００３９】この中でも、ワイゼンホルンら（ラングミ
ュア第７巻、８ページ（１９９１年）：Ａ．Ｌ．Ｗｅｉ
ｓｅｎｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ． Ｌｎｇｕｍｕｉｒ，７
（１），ｐ８（１９９１））が開発したＤＮＡ固定方法
は優れている。へき開した雲母基板上にｄｉｏｃｔａｄ
ｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉ
ｄｅ（ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロマイ
ド；以下ＤＯＤＡＢと記す）とＬ−α−ｄｉｐａｌｍｉ
ｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ
（Ｌ−α−ジパルミトイルフォスパチジルグリセロー
ル；以下ＤＰＰＧと記す）の混合単分子膜をラングミュ
アブロジェット法により積層する。雲母に積層されたＤ
ＯＤＡＢとＤＰＰＧは、それぞれ正と負の電荷を帯びて
いる。ＤＯＤＡＢのみの単分子膜にＤＮＡを固定する
と、一本鎖ＤＮＡがまっすぐに伸びずに凝集する場合が
あるが、混合膜の場合はその様なことが少ない。

【００４０】以下に、具体的な実施例を示す。 実施例１ ３０塩基対分だけ切断し取り出した大腸菌ＤＮＡの塩基
配列を本発明の塩基配列決定方法で読みとった。以下に
詳細を示す。

【００４１】まず、３０塩基対からなる大腸菌ＤＮＡを
２０μｇ／ｌ以下の濃度となるように塩濃度０．１×Ｓ
ＳＣの溶液に溶解する（１×ＳＳＣは１５０ｍＭの塩化
ナトリウムと１５ｍＭのクエン酸ナトリウムの混合溶
液）。そして、この溶液を沸騰した湯に１０分間つけた
後、氷水で急冷して、大腸菌ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡにし
た。この溶液に１０×ＳＳＣを加え、１０ｍｌ中に一本
鎖ＤＮＡが２００μｇ含む６×ＳＳＣの溶液を作った。
なお、今回用いたＤＮＡの塩基配列を、マクサム・ギル
バード法であらかじめ調べた。その結果、３′−ＧＡＡ
ＴＣＣＡＴＡＧＧＴＴＡＡＴＧＡＧＧＣＧＡＡＣＣＧＧ
ＧＧ−５′の塩基配列を持つことが分かった。

【００４２】次に、へき開したグラファイト基板、もし
くは約１０ｎｍの厚さの金が蒸着されている雲母基板を
前述の塩基配列をもつ一本鎖ＤＮＡを含む溶液に１時間
浸した後、６×ＳＳＣの溶液で洗浄し、図１に示した塩
基配列決定用測定装置に組み込んだ。

【００４３】次に、一本鎖ＤＮＡの断片（塩基配列は
５′−ＡＡＴＴＡ−３′）を０．２μｇ／ｌ含む２×Ｓ
ＳＣの溶液、及び、洗浄用として、２×ＳＳＣの溶液を
それぞれ溶液タンク１４、１５に入れた。また、溶液セ
ル４が６０℃になるようにヒーターの上に乗せて測定を
行った。

【００４４】試料の観察はトンネル電流一定モードで行
い、探針２と試料間の電位差は１００ｍＶ、トンネル電
流は０．６ｎＡとした。まず、溶液セル４に洗浄用の溶
液を１μｌ／ｍｉｎ．の流量で導入し、基板表面上の一
本鎖ＤＮＡの観察を行ったところ、長い棒状の像が見え
た。この像を観測しつつ、前述の５′−ＡＡＴＴＡ−
３′の塩基配列をもつＤＮＡ断片を含む溶液を１μｌ／
ｍｉｎ．の流量で導入した。約２０分後に、ＤＮＡの像
に変化が現れた。すなわち、長い棒状の像の中心部分が
太くなって見えた。詳しく調べてみたところ、３′末端
から１２番目の塩基から１６番目の塩基までの部分が太
くなって見えた。従って、被測定一本鎖ＤＮＡの３′末
端から１２番目から１６番目までの塩基配列がＴＴＡＡ
Ｔであることが分かった。この結果は、マクサム・ギル
バード法より求めた結果と一致した。

【００４５】実施例２ ＤＮＡの塩基配列決定用ＡＦＭ装置（図２、３参照）を
用いて、実施例１と同様に一本鎖ＤＮＡの塩基配列を調
べた。

【００４６】へき開したグラファイト、へき開した雲
母、厚さ約１０ｎｍの金が蒸着された雲母基板に、実施
例１と同様な方法で一本鎖ＤＮＡを基板１に固定した。
測定においてはＡＦＭの探針１０２にかかる力を数ナノ
ニュートン以下にして、測定中、探針１０２によって被
測定物質のＤＮＡが変形、もしくは基板１０１から剥離
しないようにした。また、溶液セル１０７にヒーター線
を巻き、セル内の溶液の温度が６０℃に保たれるように
した。

【００４７】この結果、実施例１と同様、一本鎖ＤＮＡ
の特定領域の塩基配列を決定できた。 実施例３ 実施例２と同様に、一本鎖ＤＮＡを測定した。但し、ワ
イゼンホルンら（ラングミュア第７巻、８ページ（１９
９１年）：Ａ．Ｌ．Ｗｅｉｓｅｎｈｏｒｎ ｅｔ ａ
ｌ． Ｌｎｇｕｍｕｉｒ，７（１），ｐ８（１９９
１））が開発した方法をそのまま用いて、ＤＮＡ固定用
基板を作製した。すなわち、へき開した雲母に、アラキ
ン酸のＬＢ膜を一層、その上に、ＤＯＤＡＰとＤＰＰＧ
の混合膜（１：１）を一層積層した。この基板に、実施
例１と同様の方法を用いて一本鎖ＤＮＡを固定した。

【００４８】この結果、実施例２と同様、一本鎖ＤＮＡ
の特定領域の塩基配列を決定できた。 実施例４ プライマーの結合した被測定一本鎖ＤＮＡを公知の方法
により作製した。

【００４９】まず、Ｍ１３系ファージに３′−ＧＡＡＴ
ＣＣＡＴＡＧＧＴＴＡＡＴＧＡＧＧＣＧＡＡＣＣＧＧＧ
Ｇ−５′の塩基配列を持つ一本鎖ＤＮＡを組み込み、こ
れにＭ１３ファージのプライマーである５′−ＧＴＡＡ
ＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３′を結合させ、被測定
一本鎖ＤＮＡを作った（詳しくは、例えば、高浪満、大
井龍夫編、ＤＮＡシークエンス解析マニュアル、丸善出
版、１９８３年）。

【００５０】この一本鎖ＤＮＡを２０μｇ／ｌ以下の濃
度となるように塩濃度０．１×ＳＳＣの溶液に溶解し
た。次に、実施例１と同様の方法でこの一本鎖ＤＮＡを
グラファイト基板、もしくは厚さ約１０ｎｍの金の蒸着
された雲母基板に固定し、塩基配列決定用ＳＴＭ装置
（図１参照）に組み込んだ。また、溶液セル４をヒータ
ーの上に乗せ、セル内の温度を３７℃に保つようにし
た。

【００５１】次に、ＤＮＡポリメラーゼであるクレノウ
酵素１μｇ／ｌ、塩化ナトリウム２０ｍｍｏｌ／ｌ、Ｅ
ＤＴＡ０．１ｍｍｏｌ／ｌの溶解したｐＨ＝７．５のト
リス−塩酸緩衝溶液７ｍｍｏｌ／ｌ溶液と、これに５μ
ｍｏｌ／ｌのＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃをそれぞれ加えた４種類の
溶液の計５種類の溶液を作り、それぞれを溶液タンクに
入れた。

【００５２】試料の観察はトンネル電流一定モードで行
い、探針２と試料間の電位差は１００ｍＶ、トンネル電
流は０．６ｎＡとした。溶液セル４に、まず、塩基の入
っていない溶液を１μｌ／ｍｉｎ．の流量で導入し、基
板表面上の一本鎖ＤＮＡの観察を行ったところ、長い棒
状の像が見えた。この像を観測しつつ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ
の各溶液を順番に溶液セル内に導入した。但し、一種類
の溶液の導入時間は１０分とし、各溶液を導入する前
に、塩基の入っていない溶液を５分間溶液セルに導入
し、セル内を洗浄した。

【００５３】この結果、長い棒状に見えた一本鎖ＤＮＡ
のＳＴＭ像は、端から少しづつ太くなっていった。すな
わち、Ｔの溶けた溶液をセル内に導入したときに、少し
でもＤＮＡが太くなって見えた場合、その太くなった部
分にはＴと相補的な塩基であるＡが存在していることが
分かった。また、太くなる領域の大きさを調べることよ
りＡが何個存在しているかも調べることができた。この
ようにして、一本鎖ＤＮＡの塩基配列が決定できた。

【００５４】実施例５ ＤＮＡの塩基配列決定用ＡＦＭ装置（図２、３参照）を
用いて、実施例４と同様に一本鎖ＤＮＡの塩基配列を調
べた。

【００５５】へき開したグラファイト、へき開した雲
母、厚さ約１０ｎｍの金が蒸着された雲母基板に、実施
例１と同様な方法で一本鎖ＤＮＡを基板に固定した。測
定においてはＡＦＭの探針１０２にかかる力を数ナノニ
ュートン以下にして、測定中、探針１０２によって被測
定物質のＤＮＡが変形、もしくは基板１０１から剥離し
ないようにした。また、溶液セル１０７にヒーター線を
巻き、セル内の溶液の温度が３７℃に保たれるようにし
た。

【００５６】この結果、実施例４と同様、一本鎖ＤＮＡ
の塩基配列を決定できた。 実施例６ 実施例５と同様に、一本鎖ＤＮＡを測定した。但し、ワ
イゼンホルンら（ラングミュア第７巻、８ページ（１９
９１年）：Ａ．Ｌ．Ｗｅｉｓｅｎｈｏｒｎ ｅｔ ａ
ｌ． Ｌｎｇｕｍｕｉｒ，７（１），ｐ８（１９９
１））が開発した方法をそのまま用いて、ＤＮＡ固定用
基板を作製した。すなわち、へき開した雲母に、アラキ
ン酸のＬＢ膜を一層、その上に、ＤＯＤＡＰとＤＰＰＧ
の混合膜（１：１）を一層積層した。この基板に、実施
例１と同様の方法を用いて一本鎖ＤＮＡを固定した。

【００５７】この結果、実施例５と同様、一本鎖ＤＮＡ
の特定領域の塩基配列を決定できた。

【００５８】

【発明の効果】以上説明した通り、本発明によれば、少
なくとも２種類の溶液中で一本鎖ＤＮＡを順次観察する
ことにより、塩基の配列を正確に決定することができ
る。すなわち、一本鎖ＤＮＡは、その基板上への固定の
され方によって形状は違って見えるが、本発明の測定に
おいては、異なる溶液を試料一本鎖ＤＮＡにさらしたと
きの試料一本鎖ＤＮＡ像の変化のみをとらえているた
め、ＤＮＡ内の各塩基の配列を確実に決定することがで
きる。

【００５９】また、少なくとも２種類の溶液が、一本鎖
ＤＮＡ断片を含まない１種類の溶液と、少なくとも１分
子の一本鎖ＤＮＡ断片を含む少なくとも１種類の溶液と
からなることにより、試料の一本鎖ＤＮＡで特定のタン
パク質の情報がコードされている部分を調べたい場合に
都合がよい。すなわち、タンパク質をコードしている一
本鎖ＤＮＡを含む溶液をさらす前後の試料ＤＮＡの形状
変化を走査型プローブ顕微鏡で調べることにより、目的
とする塩基配列が試料ＤＮＡのどこにあるのかが分か
る。

【００６０】また、少なくとも２種類の溶液が、ＤＮＡ
を構成する塩基と塩基対をなす塩基を含まない１種類の
溶液と、前記ＤＮＡを構成する塩基と塩基対をなす塩基
を含む少なくとも１種類の溶液とからなることにより、
ＤＮＡ内の各塩基の配列を正確に決定することができ
る。

【００６１】また、走査型プロ−ブ顕微鏡が走査型トン
ネル顕微鏡であると、溶液中で一本鎖ＤＮＡを観察する
のに都合がよい。また、走査型プローブ顕微鏡が原子間
力顕微鏡であると、溶液中で一本鎖ＤＮＡを観察するの
に都合がよい。

【００６２】次に、本発明のＤＮＡの塩基配列決定用測
定装置によれば、走査型プローブ顕微鏡と、前記走査型
プローブ顕微鏡の探針と被測定一本鎖ＤＮＡとを収容す
るための溶液セルと、前記溶液セルに設けられた溶液の
進入口及び排出口と、前記進入口につながれている少な
くとも２つの溶液タンクを備えることにより、一本鎖Ｄ
ＮＡの特定の塩基が特定の塩基と結合する前後の像が観
察できるので、ＤＮＡの塩基配列が決定できる。

【００６３】また、走査型プロ−ブ顕微鏡が走査型トン
ネル顕微鏡であると、溶液中で一本鎖ＤＮＡを観察する
のに都合がよい。また、走査型プローブ顕微鏡が原子間
力顕微鏡であると、溶液中で一本鎖ＤＮＡを観察するの
に都合がよい。

【００６４】ＤＮＡの塩基配列を迅速に決めることは、
分子生物学、医学、法医学、農林水産業、製薬業の分野
でたいへん重要である。特に、遺伝病の治療や、ＤＮＡ
操作による植物等の品種改良、有用物質の生物による生
産を行う場合、ＤＮＡの塩基配列を読みとることは基礎
技術として今後ますます重要になってくると考えられ
る。

【００６５】本発明によれば、今までの方法に比べて簡
便で少量のＤＮＡしか必要としないので、これらの分野
に多大な恩恵を与えるものである。さらに、現在、ヒト
のＤＮＡ配列をすべて決めてしまおうとする“ヒトゲノ
ム解析計画”が進められている。この場合、読みとるべ
きヒトＤＮＡの塩基対の数は２８億と非常に多く、迅速
にしかも正確に塩基配列を読みとる手段の開発が強く望
まれている。本発明は、このゲノム解析の有力な手段と
なろう。

【００６６】なお、本発明はＤＮＡの塩基配列を決定す
る方法とその測定装置に関するものであるが、ＲＮＡの
塩基配列も同様の原理で決定できることは言うまでもな
い。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例のＤＮＡの塩基配列決定用Ｓ
ＴＭ装置の原理説明図。

【図２】本発明の一実施例のＤＮＡの塩基配列決定用Ａ
ＦＭ装置の原理説明図。

【図３】図２の探針部分の拡大図。

【符号の説明】

１ 基板 ２ 探針 ３ 圧電体 ４ 溶液セル ５ 細管 ６ 細管 ７ 廃液タンク ８、９、１０ バルブ １１、１２、１３ ポンプ １４、１５、１６ 溶液タンク ４９ 電圧発生器 ５０ トンネル電流検出器 ５１ 電器信号増幅器 ５２ Ｚ軸方向サーボ回路 ５３ バルブ・ポンプ制御装置 ５４ Ｘ−Ｙ軸方向走査用回路 ５５ Ｘ、Ｙ、Ｚ軸方向のメモリー装置 ５６ データ解析装置 ５７ ディスプレイ １０１ 基板 １０２ 探針 １０３ 探針の梃部 １０４ 探針の基部 １０５ レーザー光線 １０７ 溶液セル １０８、１０９ オーリング １１０ 基板１０１を固定する基板 １１１ 圧電体 １１２ レーザー光源 １１３ レンズ １２０ 細管 １２１ 細管 １２２ 廃液タンク １２３、１２４、１２５ バルブ １２６、１２７、１２８ ポンプ １２９、１３０、１３１ 溶液タンク １５０ センサー １５１ 電器信号増幅器 １５２ Ｚ軸方向サーボ回路 １５３ バルブ・ポンプ制御装置 １５４ Ｘ−Ｙ軸方向走査用回路 １５５ Ｘ、Ｙ、Ｚ軸方向のメモリー装置 １５６ データ解析装置 １５７ ディスプレイ

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 走査型プローブ顕微鏡を用いたＤＮＡの
   塩基配列決定方法において、少なくとも２種類の溶液中
   で一本鎖ＤＮＡを順次観察することを特徴とするＤＮＡ
   の塩基配列決定方法。
2. 【請求項２】 少なくとも２種類の溶液が、一本鎖ＤＮ
   Ａ断片を含まない１種類の溶液と、少なくとも１分子の
   一本鎖ＤＮＡ断片を含む少なくとも１種類の溶液とから
   なる請求項１に記載のＤＮＡの塩基配列決定方法。
3. 【請求項３】 少なくとも２種類の溶液が、ＤＮＡを構
   成する塩基と塩基対をなす塩基を含まない１種類の溶液
   と、前記ＤＮＡを構成する塩基と塩基対をなす塩基を含
   む少なくとも１種類の溶液とからなる請求項１に記載の
   ＤＮＡの塩基配列決定方法。
4. 【請求項４】 走査型プロ−ブ顕微鏡が走査型トンネル
   顕微鏡である請求項１、２又は３に記載のＤＮＡの塩基
   配列決定方法。
5. 【請求項５】 走査型プローブ顕微鏡が原子間力顕微鏡
   である請求項１、２又は３に記載のＤＮＡの塩基配列決
   定方法。
6. 【請求項６】 走査型プローブ顕微鏡と、前記走査型プ
   ローブ顕微鏡の探針と被測定一本鎖ＤＮＡとを収容する
   ための溶液セルと、前記溶液セルに設けられた溶液の進
   入口及び排出口と、前記進入口につながれている少なく
   とも２つの溶液タンクからなるＤＮＡの塩基配列決定用
   測定装置。
7. 【請求項７】 走査型プローブ顕微鏡が走査型トンネル
   顕微鏡である請求項６に記載のＤＮＡの塩基配列決定用
   測定装置。
8. 【請求項８】 走査型プローブ顕微鏡が原子間力顕微鏡
   である請求項６に記載のＤＮＡの塩基配列決定用測定装
   置。