JPH06242111A - Chemiluminescent analysis method using peroxidase as marker - Google Patents
Chemiluminescent analysis method using peroxidase as markerInfo
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- JPH06242111A JPH06242111A JP23639693A JP23639693A JPH06242111A JP H06242111 A JPH06242111 A JP H06242111A JP 23639693 A JP23639693 A JP 23639693A JP 23639693 A JP23639693 A JP 23639693A JP H06242111 A JPH06242111 A JP H06242111A
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、標識物としてパーオキ
シダーゼを用いる化学発光分析方法に関するもので、生
体の微量成分の分析、疾患の診断等に利用できる。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a chemiluminescence analysis method using peroxidase as a labeling substance, which can be used for analysis of trace constituents of a living body, diagnosis of diseases and the like.
【0002】[0002]
【従来の技術】分析対象物質を感度よく検出・測定する
方法としては、その物質に特異的に結合する抗体等の特
異結合試薬(予め、パーオキシダーゼ等の酵素で標識し
ておく場合が多い)を検体と反応させ、引き続いて標識
物であるパーオキシダーゼ等の酵素の触媒反応により生
じる信号を検出・測定する方法(いわゆる、酵素免疫測
定法等)が知られている。また、この酵素免疫測定法に
は、一抗体法、二抗体法、サンドイッチ法、ホモジーニ
アス法、ヘテロジーニアス法等、種々の改良法又は変法
が知られている。2. Description of the Related Art As a method for sensitively detecting and measuring a substance to be analyzed, a specific binding reagent such as an antibody that specifically binds to the substance (often labeled with an enzyme such as peroxidase in advance) There is known a method (so-called enzyme immunoassay method, etc.) of reacting a sample with a sample and subsequently detecting and measuring a signal generated by a catalytic reaction of an enzyme such as peroxidase which is a labeled substance. As the enzyme immunoassay, various improved methods or modified methods such as a one-antibody method, a two-antibody method, a sandwich method, a homogeneous method, and a heterogeneous method are known.
【0003】パーオキシダーゼ等の酵素の触媒反応で生
成するシグナルを効率よく測定する方法として、パーオ
キシダーゼにより触媒されるルミノール/過酸化水素の
化学発光を測定する方法があり、この場合しばしば、ル
ミノールの一電子酸化を助けるラジカル安定化剤が増感
剤として用いられる(Methods in Enzymology,Vol.133,
p.331-353,1986;特開平2−291299号公報)。As a method of efficiently measuring the signal generated by the catalytic reaction of an enzyme such as peroxidase, there is a method of measuring the chemiluminescence of luminol / hydrogen peroxide catalyzed by peroxidase. Radical stabilizers that aid one-electron oxidation are used as sensitizers (Methods in Enzymology, Vol.133,
p.331-353,1986; JP-A-2-291299).
【0004】一方、パーオキシダーゼの活性はポリオキ
シエチレンエーテル類の添加により増大することも知ら
れており(Clinica Chimica Acta, 109, 177-181, 198
1; J.Clin. Chem. Clin. Biochem., 19, 435-439, 198
1)、また酵素免疫測定法において緩衝液中にポリオキシ
エチレンエーテル類を含有させ、S/N比もしくは測定
感度を高める方法も提案されている(特表平2−503
029号公報)。また従来、担体や抗体(もしくは抗
原)固定化担体の非特異的反応をブロックする目的で、
担体や抗体(もしくは抗原)固定化担体をアルブミン、
乳蛋白質、卵白アルブミン等の蛋白質で処理することは
知られている(特開平1−217266号公報、特開平
1−224665号公報)。On the other hand, it is also known that the activity of peroxidase is increased by adding polyoxyethylene ethers (Clinica Chimica Acta, 109 , 177-181, 198).
1; J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 19 , 435-439, 198
1) In addition, in the enzyme immunoassay method, a method has also been proposed in which polyoxyethylene ethers are contained in a buffer solution to enhance the S / N ratio or the measurement sensitivity (Tokuhyohei 2-503).
No. 029 publication). Further, conventionally, for the purpose of blocking nonspecific reaction of a carrier or an antibody (or antigen) -immobilized carrier,
A carrier or an antibody (or antigen) -immobilized carrier is albumin,
It is known to treat with proteins such as milk protein and ovalbumin (Japanese Patent Laid-Open Nos. 1-217266 and 1-224665).
【0005】[0005]
【発明が解決しようとする課題】分析対象物質が生体の
超微量物質等である場合には、何よりも更に感度の高い
方法の開発が望まれている。本発明は、従来法よりも更
に感度の高い方法を開発すること目的とする。When the substance to be analyzed is an ultratrace substance in the living body, etc., it is desired to develop a method having higher sensitivity than anything else. The present invention aims to develop a method that is even more sensitive than conventional methods.
【0006】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、感度の高
い方法を開発するべく、ルミノールの一電子酸化を容易
にする増感剤の存在下にパーオキシダーゼを用い、ルミ
ノール/過酸化水素系で反応を行う化学発光分析を種々
検討したところ、反応液に第2級アルコールポリエトキ
シレートを存在させると、パーオキシダーゼの活性(シ
グナル)が増大し、試薬ブランク(ノイズ)が低下して
S/N比が向上すること、並びに反応液に第2級直鎖ア
ルコールポリエトキシレートとともに脱脂乳及び/又は
卵白アルブミンを共存させると、両者の効果が相乗的も
しくは相加的に働いて、S/N比が大幅に向上すること
を見出し、本発明を完成した。In order to develop a highly sensitive method, the present inventors have used peroxidase in the presence of a sensitizer that facilitates the one-electron oxidation of luminol to produce luminol / hydrogen peroxide. When various chemiluminescence analyzes for conducting the reaction in a system were examined, the presence of secondary alcohol polyethoxylates in the reaction solution increased the activity (signal) of peroxidase and decreased the reagent blank (noise), resulting in S / N ratio is improved, and when skimmed milk and / or ovalbumin coexist with the secondary linear alcohol polyethoxylate in the reaction solution, the effects of both act synergistically or additively, and S / The present invention has been completed by finding that the N ratio is significantly improved.
【0007】すなわち、本発明は下記の(1)及び
(2)に関する。 (1)増感剤の存在下に、パーオキシダーゼで標識した
分析対象物質と、ルミノール及び過酸化水素を反応さ
せ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析方法に
おいて、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液
に第2級アルコールポリエトキシレートを存在させる、
化学発光分析方法。 (2)増感剤の存在下に、パーオキシダーゼで標識した
分析対象物質と、ルミノール及び過酸化水素を反応さ
せ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析方法に
おいて、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液
に第2級アルコールポリエトキシレートとともに脱脂乳
及び/又は卵白アルブミンを存存させる、化学発光分析
方法。That is, the present invention relates to the following (1) and (2). (1) In a chemiluminescence analysis method in which a substance to be analyzed labeled with peroxidase is allowed to react with luminol and hydrogen peroxide in the presence of a sensitizer, and the generated luminescence amount is detected and measured, luminescence in a reaction solution When detecting and measuring the amount, a secondary alcohol polyethoxylate is present in the reaction solution,
Chemiluminescence analysis method. (2) In a chemiluminescence analysis method in which a substance to be analyzed labeled with peroxidase is reacted with luminol and hydrogen peroxide in the presence of a sensitizer, and the generated luminescence amount is detected and measured, luminescence in the reaction solution A chemiluminescence analysis method, wherein skimmed milk and / or ovalbumin is present together with a secondary alcohol polyethoxylate in the reaction solution when detecting / measuring the amount.
【0008】本発明に用いる第2級アルコールポリエト
キシレートは、化1The secondary alcohol polyethoxylate used in the present invention is
【化1】 (化1中、R1及びR2は、同じであっても異なってもよ
い飽和脂肪族アルキル基、nは1以上の整数である)で
表される分枝アルキルポリオキシエチレンエーテルであ
る。[Chemical 1] (In Chemical Formula 1, R 1 and R 2 are the same or different saturated aliphatic alkyl groups, and n is an integer of 1 or more), and is a branched alkyl polyoxyethylene ether.
【0009】このような第2級アルコールポリエトキシ
レートとしては、旭電化工業(株)製「アデカトール
SO シリーズ」があり、アデカトール SO−80、ア
デカトール SO−105、アデカトール SO−12
0、アデカトール SO−135、アデカトール SO−
145、アデカトール SO−160等が使用できる。As such a secondary alcohol polyethoxylate, "Adecatol" manufactured by Asahi Denka Kogyo Co., Ltd.
SO series ”, and ADECATOL SO-80, ADECATOL SO-105, ADECATOL SO-12
0, ADECATOL SO-135, ADECATOL SO-
145, ADECATOL SO-160, etc. can be used.
【0010】これら第2級アルコールポリエトキシレー
トは、反応に用いる緩衝液又は反応液に含有させる。そ
の使用量は、少なくとも化学発光のS/N比を向上させ
る量で、通常、0.01〜10重量%の範囲、好ましく
は0.02〜2重量%の範囲で用いる。使用量が0.0
1重量%未満であると化学発光のS/N比を向上させる
程度が低く、10重量%を超えると液の粘性が大きくな
り、試薬の均一な混合が困難となる。なお、以下本明細
書で単に%とあるのは、特に断わらない限り重量%を意
味する。These secondary alcohol polyethoxylates are contained in the buffer solution or reaction solution used in the reaction. The amount used is an amount that improves at least the S / N ratio of chemiluminescence, and is usually used in the range of 0.01 to 10% by weight, preferably 0.02 to 2% by weight. Usage is 0.0
If it is less than 1% by weight, the degree of improving the S / N ratio of chemiluminescence is low, and if it exceeds 10% by weight, the viscosity of the liquid becomes large and it becomes difficult to uniformly mix the reagents. In the following description, “%” simply means “% by weight” unless otherwise specified.
【0011】本発明における化学発光分析は、増感剤の
存在下に、標識物であるパーオキシダーゼとルミノール
及び過酸化水素を反応させ、生じた発光を検出・測定す
る分析法であれば特に限定するものではなく、一抗体免
疫分析法、二抗体免疫分析法、競合分析法、サンドイッ
チ法、ホモジーニアス法、ヘテロジーニアス法、ウェス
ターン分析法、DNAプローブ法等の各種分析法に利用
できるが、特に、次のような固相サンドイッチ法に好適
に用いられる。以下、固相サンドイッチ法の手順等を説
明する。The chemiluminescence analysis in the present invention is not particularly limited as long as it is an analytical method in which peroxidase, which is a labeling substance, is reacted with luminol and hydrogen peroxide in the presence of a sensitizer, and the generated luminescence is detected and measured. However, it can be used for various analysis methods such as a one-antibody immunoassay method, a two-antibody immunoassay method, a competitive analysis method, a sandwich method, a homogeneous method, a heterogeneous method, a Western analysis method, and a DNA probe method. In particular, it is preferably used in the following solid phase sandwich method. The procedure of the solid-phase sandwich method will be described below.
【0012】手順: (1) 分析対象物質の特定部位に結合できる第1の結合試
薬(例えば、第1抗体)を固相担体に固定して第1結合
試薬固定化担体とする。 (2) 非特異的結合を防止するため、予めタンパク質で処
理(ブロッキング処理)した第1結合試薬固定化担体
に、検体を直接又は水性溶媒とともに加え、インキュベ
ートし、第1結合試薬固定化担体/分析対象物質の複合
体を形成させる。 (3) 洗浄液で洗浄する。 (4) これに、分析対象物質の他の特定部位に結合でき、
かつパーオキシダーゼで標識された第2の結合試薬(例
えば、第2抗体)を水性溶媒とともに加え、第1結合試
薬固定化担体/分析対象物質/パーオキシダーゼ標識化
第2結合試薬の複合体を形成させる。 (5) 洗浄液で洗浄する。 (6) 水性溶媒中、ルミノール、過酸化水素及び増感剤、
並びに第2級アルコールポリエトキシレートを加える。 (7) 生じる発光量を測定する;Procedure: (1) A first binding reagent (for example, a first antibody) capable of binding to a specific site of a substance to be analyzed is immobilized on a solid phase carrier to obtain a first binding reagent-immobilized carrier. (2) In order to prevent non-specific binding, a sample is added directly or with an aqueous solvent to a first binding reagent-immobilized carrier that has been previously treated with protein (blocking treatment), and incubated, Form a complex of the analyte. (3) Wash with the washing solution. (4) In addition to this, it can bind to other specific sites of the substance
A second binding reagent labeled with peroxidase (eg, a second antibody) is added together with an aqueous solvent to form a complex of the first binding reagent-immobilized carrier / analyte / peroxidase-labeled second binding reagent. Let (5) Wash with the washing solution. (6) Luminol, hydrogen peroxide and a sensitizer in an aqueous solvent,
And the secondary alcohol polyethoxylates are added. (7) Measure the amount of emitted light;
【0013】固相担体に固定する第1の結合試薬は、分
析対象物質が抗原となりうるようなものの場合は抗体
(ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、又は抗体
断片等)が好適に用いられ、分析対象物質が核酸である
場合は、それに相補する(1本鎖の)核酸又は核酸断片
が好適に用いられる。As the first binding reagent to be immobilized on the solid-phase carrier, an antibody (polyclonal antibody, monoclonal antibody, antibody fragment or the like) is preferably used when the substance to be analyzed can be an antigen. When is a nucleic acid, a (single-stranded) nucleic acid or nucleic acid fragment complementary thereto is preferably used.
【0014】パーオキシダーゼで標識される第2の結合
試薬は、分析対象物質が抗原となりうるようなものか核
酸か等により、第1の結合試薬が結合する部位とは異な
る部位で分析対象物質に結合できる、抗体又は核酸が用
いられる。The second binding reagent labeled with peroxidase is attached to the substance to be analyzed at a site different from the site to which the first binding reagent binds, depending on whether the substance to be analyzed can be an antigen or nucleic acid. An antibody or nucleic acid that can bind is used.
【0015】第2の結合試薬をパーオキシダーゼで標識
するには、マレイミド・ヒンジ法、サクシンイミド法等
によりパーオキシダーゼを直接標識するか、第2の結合
試薬にビオチニル基等の化学基を有せしめたのち、これ
と反応するアビジン等の化学基を有するパーオキシダー
ゼを反応させ、間接的に標識すればよい。第2の結合試
薬を標識するパーオキシダーゼとしては、西洋ワサビ由
来の塩基性アイソザイムが好適である。塩基性アイソザ
イムにはB、C、D及びEの型が知られているが、これ
らの中ではC型が最も好ましい。To label the second binding reagent with peroxidase, the peroxidase is directly labeled by the maleimide / hinge method, the succinimide method or the like, or the second binding reagent has a chemical group such as a biotinyl group. After that, peroxidase having a chemical group such as avidin that reacts with this may be reacted to label indirectly. As the peroxidase for labeling the second binding reagent, a horseradish-derived basic isozyme is suitable. B, C, D and E types of basic isozymes are known, and of these, the C type is most preferable.
【0016】用いる固相担体としては、通常、マイクロ
タイタプレートが好適である。このようなマイクロタイ
タプレートとしては、ブラックモジュールプレート(Nu
nc社製)、マイクロフルオロプレート黒(ダイナテク社
製)、マイクロフルオロリモーバウェル黒(ダイナテク
社製)等がある。場合によっては、隣接ウェルからの迷
光を防止する白色系のマイクロタイタプレートを使用す
ることもできる。このようなマイクロタイタプレートと
しては白色顔料を含む、マイクロフルオロプレート白
(ダイナテク社製)、マイクロフルオロリモーバウェル
白(ダイナテク社製)、あるいは白色プレート(住友ベ
ークライト社製)等がある。As the solid phase carrier to be used, a microtiter plate is usually suitable. A black module plate (Nu
nc), Micro Fluoroplate Black (manufactured by Dynatech), Micro Fluorimovawell Black (manufactured by Dynatech) and the like. In some cases, white microtiter plates that prevent stray light from adjacent wells can be used. Examples of such a microtiter plate include a white pigment (Microfluoroplate white (manufactured by Dynatech), Microfluororemovawell white (manufactured by Dynatech), a white plate (manufactured by Sumitomo Bakelite), and the like.
【0017】発光反応に用いられるルミノールは、通常
入手できる試薬グレードのものには製造原料であるヒド
ラジン及び硫化物イオンが混入している場合が多いの
で、再結晶を繰り返し、精製したものを用いる。As the luminol used for the luminescence reaction, hydrazine and sulfide ions, which are the starting materials for production, are often mixed in the commonly available reagent grade products, so that the product is purified after repeated recrystallization.
【0018】本発明に用いられる増感剤は、ルミノール
の一電子酸化を助けて増感作用を有するもので、4−ヨ
ードフェノール、4−ブロモフェノール、4−クロロフ
ェノール、4−フェニルフェノール、2−クロロ−4−
フェニルフェノール、4−(2’−チエニル)フェノー
ル、6−ヒドロキシベンゾチアゾール、4−〔4’−
(2’−メチル)チアゾリル〕フェノール、4−〔2’
−(4’−メチル)チアゾリル〕フェノール、4−
(2’−ベンゾチアゾリル)フェノール、3−(10−
フェノチアジル)−n−プロピル−スルホン酸塩等があ
る。The sensitizer used in the present invention has a sensitizing effect by assisting the one-electron oxidation of luminol, and is composed of 4-iodophenol, 4-bromophenol, 4-chlorophenol, 4-phenylphenol and 2 -Chloro-4-
Phenylphenol, 4- (2'-thienyl) phenol, 6-hydroxybenzothiazole, 4- [4'-
(2'-methyl) thiazolyl] phenol, 4- [2 '
-(4'-methyl) thiazolyl] phenol, 4-
(2'-benzothiazolyl) phenol, 3- (10-
Phenothiazyl) -n-propyl-sulfonate and the like.
【0019】これらの増感剤の存在下にパーオキシダー
ゼの触媒作用でルミノール/過酸化水素の発光反応を行
うと、増感剤が増感ラジカルとなり、これがルミノール
と反応し発光する。When the luminescence reaction of luminol / hydrogen peroxide is carried out by the catalytic action of peroxidase in the presence of these sensitizers, the sensitizer becomes a sensitizing radical, which reacts with luminol to emit light.
【0020】反応液の溶媒は通常、水性溶媒を用いる。
水性溶媒には、水又はリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グ
ッド緩衝液等の緩衝液等がある。これら緩衝液のpHは
通常、5〜12、好ましくは7〜11とする。pHが5
未満であると、パーオキシダーゼの最適pHから外れて
発光量が弱くなり、pHが12を超えると、パーオキシ
ダーゼ活性に依存しない発光(ノイズ)が強くなる。The solvent of the reaction solution is usually an aqueous solvent.
Examples of the aqueous solvent include water or a buffer solution such as a phosphate buffer solution, a borate buffer solution, and a Good's buffer solution. The pH of these buffers is usually 5 to 12, preferably 7 to 11. pH is 5
If it is less than the above, the amount of luminescence deviates from the optimum pH of peroxidase, and the amount of luminescence becomes weak. If the pH exceeds 12, luminescence (noise) not depending on the peroxidase activity becomes strong.
【0021】本発明で用いられる脱脂乳は、脂肪分を除
いたミルクのことで、別名、脱脂粉乳、スキムミルク等
とも呼ばれる。これは市販品、例えば、「MILK DILUENT
/BLOCKING SOLUTION」(KPL社製、コード番号:50-82
-01)、「ブロックエース」(大日本製薬製、コード番
号:UK-B25)、「ブロックエース粉末」(大日本製薬
製、コード番号:UK-B80)等が容易に入手できる。The skim milk used in the present invention is a milk from which fat is removed, and is also called as skimmed milk powder or skim milk. This is a commercial product, for example, "MILK DILUENT
/ BLOCKING SOLUTION "(KPL, code number: 50-82
-01), "Block Ace" (Dainippon Pharmaceutical, code number: UK-B25), "Block Ace Powder" (Dainippon Pharmaceutical, code number: UK-B80), etc. are easily available.
【0022】また、本発明で用いられる卵白アルブミン
は、卵白から分離される分子量4万5千、等電点4.6
のタンパク質で、これについても市販品、例えば、「ア
ルブミン、卵白、5回結晶」(生化学工業社製、コード
番号:250440)、「オボアルブミン」(太陽化学社製、
コード番号:300-00711)、「アルブミン、卵製」(和
光純薬工業社製、コード番号:018-09882)、「Albumin
chicken egg」(シグマ社製、コード番号:A7641)等
が容易に入手できる。The ovalbumin used in the present invention has a molecular weight of 45,000 separated from egg white and an isoelectric point of 4.6.
, Which is also a commercially available product, such as "albumin, egg white, 5 times crystal" (Seikagaku Corporation, code number: 250440), "ovalbumin" (Taiyo Kagaku Corporation,
Code number: 300-00711), "Albumin, egg" (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., code number: 018-09882), "Albumin
Chicken egg ”(manufactured by Sigma, code number: A7641) and the like are easily available.
【0023】これら脱脂乳又は卵白アルブミンの使用濃
度は、それぞれ、少なくともS/N比が向上する濃度と
する。通常、その濃度はそれぞれ、反応液の最終濃度で
0.01〜0.5%、好ましくは0.02〜0.2%の
範囲である。濃度が0.01%未満ではS/N比を向上
させる効果が少なく、0.5%を超えると特異的発光反
応を抑えるため好ましくない。The concentrations of these skim milk or ovalbumin used are such that at least the S / N ratio is improved. Usually, the respective concentrations are in the range of 0.01 to 0.5%, preferably 0.02 to 0.2% in the final concentration of the reaction solution. If the concentration is less than 0.01%, the effect of improving the S / N ratio is small, and if it exceeds 0.5%, the specific luminescent reaction is suppressed, which is not preferable.
【0024】反応液には、操作性、安定性等の性能を上
げるために、他の添加物、例えば、マンニトール、ソル
ビトール等の糖アルコール等を添加してもよい。Other additives, for example, sugar alcohols such as mannitol and sorbitol, may be added to the reaction solution in order to improve performance such as operability and stability.
【0025】以下に実験例を示す。実験例1 4−[4'−(2'−メチル)チアゾリル]フ
ェノール存在下の化学発光反応における第2級アルコー
ルポリエトキシレートの添加効果 化学発光反応(無添加対照)は以下のようにして行っ
た。すなわち、ブラックモジュールプレート(Nunc
社製,475515)に、パーオキシダーゼ(POD)
標識化抗エンドセリン抗体(ヤマサ醤油社製、MCA
ET−02)の1/105希釈液〔希釈用緩衝液として
50mMホウ酸ナトリウム緩衝液(pH10.0)を使
用〕100μlを注入し、次いで2mM 4−[4'−
(2'−メチル)チアゾリル]フェノールのジメチルス
ルフォキシド溶液8μl、4mM過酸化水素含有の50
mMホウ酸ナトリウム緩衝液(pH10)50μl及び
20mMルミノール50μlを添加し、ルミノメータ
(コロナ電気社製、MLR-100型)で10分後の発光量を
測光し、シグナル(S)とした(測光条件:Response 6
4、Sense Auto)。また、POD標識化抗エンドセリン
抗体の1/105希釈液の代わりに、50mMホウ酸ナ
トリウム緩衝液(pH10.0)を用い同様に操作して
発光量を測光し、これをノイズ(N)とした。Experimental examples are shown below. Experimental Example 1 Effect of Addition of Secondary Alcohol Polyethoxylate in Chemiluminescent Reaction in the Presence of 4- [4 ′-(2′-methyl) thiazolyl] phenol The chemiluminescent reaction (no addition control) was performed as follows. It was That is, the black module plate (Nunc
475515), peroxidase (POD)
Labeled anti-endothelin antibody (Yamasa Shoyu Co., MCA
ET-02) 1/10 5 diluted solution [using 50 mM sodium borate buffer (pH 10.0) as a diluting buffer] 100 μl was injected, and then 2 mM 4- [4′-
(2'-Methyl) thiazolyl] phenol dimethylsulfoxide solution 8 μl, 4 mM hydrogen peroxide-containing 50
50 μl of mM sodium borate buffer (pH 10) and 50 μl of 20 mM luminol were added, and the amount of luminescence after 10 minutes was measured with a luminometer (Corner Electric Co., Ltd., MLR-100 type) to obtain a signal (S). : Response 6
4, Sense Auto). Further, instead of the 1/10 5 dilution of the POD-labeled anti-endothelin antibody, 50 mM sodium borate buffer (pH 10.0) was used in the same manner to measure the luminescence amount, which was designated as noise (N). did.
【0026】第2級アルコールポリエトキシレートの添
加試験は、使用するPOD標識化抗エンドセリン抗体希
釈用50mMホウ酸ナトリウム緩衝液(pH10.0)
中に、予めアデカトール SO-135(旭電化工業製)を
0.1重量%含有させたほかは、上記と同様に操作し
た。また、比較添加実験としてアデカトール SO-135
の代わりに、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレ
ート(和光純薬工業製、「ツィーン20」)を用い、同
様に行った。表1に測定結果を示す。The secondary alcohol polyethoxylate addition test was carried out by using a 50 mM sodium borate buffer (pH 10.0) for diluting the POD-labeled anti-endothelin antibody used.
Adecatol SO-135 (manufactured by Asahi Denka Kogyo Co., Ltd.) was contained in advance at 0.1% by weight, and the same operation as above was performed. In addition, as a comparative addition experiment, ADECATOL SO-135
Instead of polyoxyethylene sorbitan monolaurate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., "Tween 20") was used in the same manner. Table 1 shows the measurement results.
【0027】アデカトールSO-135の添加では、無
添加に比べ発光のノイズが約2/3、シグナルは約1.
5倍、S/N比は2倍強となった。一方、ツィーン20
の添加では、無添加に比べ発光ノイズの低減はみられ
ず、シグナルの若干の増加だけがみられた。When ADECATOL SO-135 was added, the emission noise was about 2/3 and the signal was about 1.
It was 5 times and the S / N ratio was slightly more than 2 times. Meanwhile, Tween 20
In addition, the addition did not show a reduction in luminescence noise as compared to the case without addition, but only a slight increase in the signal was seen.
【表1】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 添加物(*) ノイズ(N) シグナル(S) S/N比 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 無添加 1,581 1,968 1.24 アデカトール SO-135 1,105 3,043 2.75 ツィーン20(比較) 1,537 2,800 1.82 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ *:添加物の濃度は、無添加を除きそれぞれの成分の濃
度が0.1%である(以下、実験例2〜9も同じ)。[Table 1] ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ Additive (*) Noise (N) Signal (S) S / N ratio ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ No additives 1,581 1, 968 1.24 ADECATOL SO-135 1,105 3,043 2.75 Tween 20 (Comparison) 1,537 2,800 1.82 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ━━━━━━━━━━━━━━━━━ *: As for the concentration of the additives, the concentration of each component is 0.1% except for the non-addition (hereinafter, also in Experimental Examples 2 to 9. the same).
【0028】実験例2 4−[4'−(2'−メチル)チ
アゾリル]フェノール存在下の化学発光反応における種
々の非イオン性界面活性剤の添加効果 非イオン性界面活性剤として第2級アルコールポリエト
キシレート(アデカトール SO-135)のほか、種々の
ものを用い、実験例1と同様に試験した。結果を表2に
示す。 Experimental Example 2 Effect of addition of various nonionic surfactants on chemiluminescence reaction in the presence of 4- [4 '-(2'-methyl) thiazolyl] phenol Secondary alcohols as nonionic surfactants In addition to polyethoxylate (Adecatol SO-135), various compounds were used and tested in the same manner as in Experimental Example 1. The results are shown in Table 2.
【表2】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 添加物 ノイズ(N) シグナル(S) S/N比 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 無添加 2,442 2,713 1.11 アデカトール SO-135 1,105 3,043 2.75 アデカトール LO-9 2,091 3,454 1.65 アデカトール NP-695 1,700 3,417 2.01 アデカトール NP-700 2,060 3,991 1.94 アデカトール PC-10 2,598 4,153 1.60 ツィーン20 2,674 4,039 1.51 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━[Table 2] ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ Additive Noise (N) Signal (S) S / N ratio ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ Additive-free 2,442 2,713 1. 11 Adecatol SO-135 1,105 3,043 2.75 Adecatol LO-9 2,091 3,454 1.65 Adecatol NP-695 1,700 3,417 2.01 Adecatol NP-700 2,060 3,991 1.94 Adecatol PC-10 2,598 4,153 1.60 Tween 20 2,674 4,039 1.51 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ━━━━━━━━━━━━━
【0029】S/Nを改善する効果の高い順は、アデカ
トール SO-135>アデカトール NP-695>アデカトー
ル NP-700>アデカトール LO-9>アデカトール P
C-10>ツィーン20であった(表2)。The order in which the effect of improving S / N is high is ADECATOL SO-135> ADECATOL NP-695> ADECATOL NP-700> ADECATOL LO-9> ADECATOL P.
C-10> Tween 20 (Table 2).
【0030】実験例3 4−[2'−(4'−メチル)チ
アゾリル]フェノール存在下の化学発光反応における第
2級アルコールポリエトキシレートの添加効果 増感剤としての2mMの4−[4'−(2'−メチル)チ
アゾリル]フェノールの代わりに20mMの4−[2'
−(4'−メチル)チアゾリル]フェノールを用いたほ
かは、実験例1と同様に行った。結果を表4に示した。 Experimental Example 3 Effect of Addition of Secondary Alcohol Polyethoxylate on Chemiluminescence Reaction in the Presence of 4- [2 '-(4'-methyl) thiazolyl] phenol 2 mM 4- [4' as a sensitizer 20 mM 4- [2 'instead of-(2'-methyl) thiazolyl] phenol
The same procedure as in Experimental Example 1 was performed except that-(4'-methyl) thiazolyl] phenol was used. The results are shown in Table 4.
【表3】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 添加物 ノイズ(N) シグナル(S) S/N比 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 無添加 1,164 1,478 1.27 アデカトール SO-135 948 3,580 3.77 ツィーン20(比較) 1,260 3,371 2.68 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━[Table 3] ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ Additive Noise (N) Signal (S) S / N ratio ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ No additive 1,164 1,478 1. 27 Adecatol SO-135 948 3,580 3.77 Tween 20 (Comparison) 1,260 3,371 2.68 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ━━━━━━━━━━━━
【0031】実験例4 4−(2'−チエニル)フェノ
ール存在下の化学発光反応における第2級アルコールポ
リエトキシレートの添加効果 増感剤としての2mMの4−[4'−(2'−メチル)チ
アゾリル]フェノールの代わりに1mMの4−(2'−
チエニル)フェノールを用いたほかは、実験例1と同様
に行った。結果を表4に示した。 Experimental Example 4 Effect of addition of secondary alcohol polyethoxylate in chemiluminescence reaction in the presence of 4- (2'-thienyl) phenol 2 mM 4- [4 '-(2'-methyl) as a sensitizer ) Thiazolyl] phenol instead of 1 mM 4- (2'-
The same procedure as in Experimental Example 1 was performed except that thienyl) phenol was used. The results are shown in Table 4.
【0032】[0032]
【表4】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 添加物 ノイズ(N) シグナル(S) S/N比 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 無添加 732 827 1.13 アデカトール SO-135 570 1,922 3.37 ツィーン20(比較) 723 1,226 1.75 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━[Table 4] ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ Additive Noise (N) Signal (S) S / N ratio ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ No additive 732 827 1.13 ADECATOL SO- 135 570 1,922 3.37 Tween 20 (Comparison) 723 1,226 1.75 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ━━━━━━
【0033】実験例5 3−(10−フェノチアジル)
−n−プロピル−スルホン酸塩存在下の化学発光反応に
おける第2級アルコールポリエトキシレートの添加効果 増感剤としての2mMの4−[4'−(2'−メチル)チ
アゾリル]フェノールの代わりに20mMの3−(10
−フェノチアジル)−n−プロピル−スルホン酸塩を用
いたほかは、実験例1と同様に行った。結果を表5に示
す。 Experimental Example 5 3- (10-phenothiazyl)
Addition Effect of Secondary Alcohol Polyethoxylate on Chemiluminescence Reaction in the Presence of -n-Propyl-Sulfonate Instead of 2 mM 4- [4 '-(2'-methyl) thiazolyl] phenol as a sensitizer 20 mM 3- (10
-Phenothiazyl) -n-propyl-sulfonate was used, and the same procedure as in Experimental Example 1 was performed. The results are shown in Table 5.
【表5】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 添加物 ノイズ(N) シグナル(S) S/N比 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 無添加 1,371 1,493 1.09 アデカトール SO-135 942 3,162 3.36 ツィーン20(比較) 1,370 1,662 1.21 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━[Table 5] ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ Additive Noise (N) Signal (S) S / N ratio ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ Additive-free 1,371 1,493 1. 09 Adecator SO-135 942 3,162 3.36 Tween 20 (comparative) 1,370 1,662 1.21 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ━━━━━━━━━━━━
【0034】実験例6 4−[4'−(2'−メチル)チ
アゾリル]フェノール存在下の化学発光反応における、
第2級アルコールポリエトキシレート及び脱脂乳の共存
効果 添加剤無添加の試験(無添加対照)は以下のように操作
した。ブラックモジュールプレートに、ペルオキシダー
ゼ(POD)標識化抗エンドセリン抗体の1/105希
釈液〔希釈用緩衝液として50mMホウ酸ナトリウム緩
衝液(pH10.0)を使用〕100μlを注入し、次
いで2mM 4−[4'−(2'−メチル)チアゾリル]
フェノールのジメチルスルフォキシド溶液8μl、4m
M過酸化水素含有の50mMホウ酸ナトリウム緩衝液
(pH10)50μl及び20mMルミノール50μlを
添加し、ルミノメータで10分後の発光量を測光し、シ
グナル(S)とした。ノイズ(N)の測定は、POD標
識化抗エンドセリン抗体の1/105希釈液の代わり
に、50mMホウ酸ナトリウム緩衝液(pH10.0)
を使用した。 Experimental Example 6 In a chemiluminescence reaction in the presence of 4- [4 '-(2'-methyl) thiazolyl] phenol,
Coexistence Effect of Secondary Alcohol Polyethoxylate and Skim Milk A test without additives (control without addition) was carried out as follows. To a black module plate, 100 μl of a 1/10 5 diluted solution of peroxidase (POD) -labeled anti-endothelin antibody [using 50 mM sodium borate buffer (pH 10.0) as a buffer for dilution] was injected, and then 2 mM 4- [4 '-(2'-methyl) thiazolyl]
Phenol dimethyl sulfoxide solution 8μl, 4m
50 µl of 50 mM sodium borate buffer (pH 10) containing M hydrogen peroxide and 50 µl of 20 mM luminol were added, and the amount of luminescence after 10 minutes was measured with a luminometer to obtain a signal (S). Noise (N) was measured by using 50 mM sodium borate buffer (pH 10.0) instead of the 1/10 5 dilution of POD-labeled anti-endothelin antibody.
It was used.
【0035】第2級アルコールポリエトキシレート(ア
デカトール SO-135)、脱脂乳及びその両者の添加試
験は、使用するPOD標識化抗エンドセリン抗体希釈用
50mMホウ酸ナトリウム緩衝液(pH10.0)中
に、予めそれぞれ0.1重量%含有させたほかは、上記
と同様にして行った。結果を表6に示す。なお、脱脂乳
は「MILK DILUENT/BLOCKING SOLUTION」(KPL社製、
コード番号:50-82-01)を使用した(以下の実験例7〜
9及び実施例1〜3において用いた脱脂乳も同じ)。The secondary alcohol polyethoxylate (Adecatol SO-135), skim milk, and both of them were added to the test solution in a 50 mM sodium borate buffer (pH 10.0) for diluting the POD-labeled anti-endothelin antibody used. , Except that each of them was previously contained in an amount of 0.1% by weight. The results are shown in Table 6. The skim milk is "MILK DILUENT / BLOCKING SOLUTION" (made by KPL,
Code number: 50-82-01) was used (Experimental example 7-
9 and the skim milk used in Examples 1 to 3).
【表6】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 添加物 ノイズ(N) シグナル(S) S/N比 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 無添加(無添加対照) 1,581 1,968 1.24 アデカトール SO-135 1,105 3,043 2.75 脱脂乳 135 1,655 12.2 アデカトール SO-135 ┐ 131 2,082 15.9 +脱脂乳 ┘ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━[Table 6] ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ Additive Noise (N) Signal (S) S / N ratio ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ No additive (no additive control) 1,581 1,968 1.24 ADECATOL SO-135 1,105 3,043 2.75 Skim milk 135 1,655 12.2 ADECATOL SO-135 ┐ 131 2,082 15.9 + skim milk ┘ ━━━━━━━ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【0036】アデカトール SO-135及び脱脂乳の両者の
添加では、S/N比は15.9となり、アデカトール S
O-135の単独添加の場合(S/N比=2.75)又は脱
脂乳の単独添加の場合(S/N比=12.2)よりも更
に改善された(表6)。With the addition of both ADECATOL SO-135 and skim milk, the S / N ratio was 15.9.
It was further improved as compared with the case of adding O-135 alone (S / N ratio = 2.75) or the case of adding skim milk alone (S / N ratio = 12.2) (Table 6).
【0037】実験例7 4−[2'−(4'−メチル)チ
アゾリル]フェノール存在下の化学発光反応における、
第2級アルコールポリエトキシレート及び脱脂乳の共存
効果 増感剤としての2mMの4−[4'−(2'−メチル)チ
アゾリル]フェノールの代わりに20mMの4−[2'
−(4'−メチル)チアゾリル]フェノールを用い、実
験例6と同様にして行った。結果を表7に示す。 Experimental Example 7 In a chemiluminescence reaction in the presence of 4- [2 '-(4'-methyl) thiazolyl] phenol,
Coexistence effect of secondary alcohol polyethoxylate and skim milk Instead of 2 mM 4- [4 '-(2'-methyl) thiazolyl] phenol as a sensitizer, 20 mM 4- [2'
The same procedure as in Experimental Example 6 was performed using-(4'-methyl) thiazolyl] phenol. The results are shown in Table 7.
【表7】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 添加物 ノイズ(N) シグナル(S) S/N比 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 無添加(無添加対照) 1,164 1,478 1.27 アデカトール SO-135 948 3,580 3.77 脱脂乳 85 493 5.80 アデカトール SO-135 ┐ 94 1,114 11.9 +脱脂粉乳 ┘ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━[Table 7] ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ Additive Noise (N) Signal (S) S / N ratio ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ No addition (no addition control) 1,164 1,478 1.27 ADECATOL SO-135 948 3,580 3.77 nonfat milk 85 493 580 ADECATOL SO-135 ┐ 94 1,114 11.9 + nonfat dry powder ┘ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【0038】実験例8 3−(10−フェノチアジル)
−n−プロピル−スルホン酸塩存在下の化学発光反応に
おける、第2級アルコールポリエトキシレート及び脱脂
乳の共存効果 増感剤としての2mMの4−[4'−(2'−メチル)チ
アゾリル]フェノールの代わりに20mMの3−(10
−フェノチアジル)−n−プロピル−スルホン酸塩を用
いたほかは、実験例6と同様にして行った。結果を表8
に示す。 Experimental Example 8 3- (10-phenothiazyl)
-Coexistence effect of secondary alcohol polyethoxylate and skim milk in chemiluminescence reaction in the presence of n-propyl-sulfonate 2 mM 4- [4 '-(2'-methyl) thiazolyl] as sensitizer 20 mM 3- (10 instead of phenol
-Phenothiazyl) -n-propyl-sulfonate was used, and the same procedure as in Experimental Example 6 was performed. The results are shown in Table 8
Shown in.
【0039】[0039]
【表8】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 添加物 ノイズ(N) シグナル(S) S/N比 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 無添加(無添加対照) 1,371 1,493 1.09 アデカトール SO-135 942 3,162 3.36 脱脂乳 164 1,510 9.21 アデカトール SO-135 ┐ 130 1,569 12.1 +脱脂乳 ┘ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━[Table 8] ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ Additive Noise (N) Signal (S) S / N ratio ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ No additives (no additives control) 1,371 1,493 1.09 ADECATOL SO-135 942 3,162 3.36 Skim milk 164 1,510 9.2 1 ADECATOL SO-135 ┐ 130 1,569 12.1 + skim milk ┘ ━━━━━━━━━━ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【0040】実験例9 p−ヨードフェノール存在下の
化学発光反応における、第2級アルコールポリエトキシ
レート及び脱脂乳の共存効果 増感剤としてp−ヨードフェノールを用いたほかは、実
験例6と同様にして行った。結果を表9に示す。 Experimental Example 9 Effect of coexistence of secondary alcohol polyethoxylate and skim milk in chemiluminescent reaction in the presence of p-iodophenol Same as Experimental Example 6 except that p-iodophenol was used as a sensitizer. I went to. The results are shown in Table 9.
【表9】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 添加物 ノイズ(N) シグナル(S) S/N比 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 無添加(無添加対照) 4,154 4,117 0.99 アデカトール SO-135 1,015 1,997 1.97 脱脂粉乳 149 501 3.36 アデカトール SO-135 ┐ 119 420 3.52 +脱脂乳 ┘ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━[Table 9] ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ Additive Noise (N) Signal (S) S / N ratio ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ No additive (no additive control) 4,154 4,117 0.99 Adecatol SO-135 1,015 1,997 1.97 Skim milk powder 149 501 3.36 Adecatol SO-135 ┐ 119 420 3.52 + skim milk ┘ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【0041】[0041]
実施例1 エンドセリン−1の検量線(その1) 標準となるエンドセリン−1(ET−1と略す。ヒト由
来、ペプチド研究所製、コード番号4198−s)を
0.1%ツィーン20及び0.1%脱脂乳含有ダルベッ
コリン酸緩衝生理食塩液(以下、希釈用緩衝液とい
う。)で希釈し、それぞれ2、5、10、20及び40
pg/mlの濃度のエンドセリン−1標準溶液を作成し
た。Example 1 Standard curve of endothelin-1 (No. 1) Endothelin-1 (abbreviated as ET-1. Human origin, manufactured by Peptide Institute, Code No. 4198-s) was used as 0.1% Tween 20 and 0. Diluted with Dulbecco's phosphate buffered saline containing 1% skim milk (hereinafter, referred to as a diluting buffer), and diluted with 2, 5, 10, 20, and 40, respectively.
An endothelin-1 standard solution with a concentration of pg / ml was prepared.
【0042】予め、抗エンドセリン抗体(免疫生物研究
所社製、抗エンドセリン15-21特異的抗体、コード番号:
16155)を50mM燐酸ナトリウム(pH7.0)
で希釈して5μg/mlとし、ブラックモジュールプレ
ート(ヌンク社製、コード番号475515)の各ウェ
ルに200μlずつ分注し、4℃で一晩放置して、抗体
をプレートのウェルに吸着させた。イオン交換蒸留水で
2回洗浄後、ウェルに0.5%脱脂乳400μlを加
え、37℃で6時間保温し(ブロッキング処理)、その
後0.1%ツイーン20含有カルシウムフリーダルベッ
コ燐酸緩衝生理食塩液で3回洗浄して、抗体固定化プレ
ートとした。In advance, anti-endothelin antibody (manufactured by Immune Biology Institute, anti-endothelin 15-21 specific antibody, code number:
16155) to 50 mM sodium phosphate (pH 7.0)
200 μl was dispensed into each well of a black module plate (Nunc Co., code No. 475515), and the mixture was allowed to stand overnight at 4 ° C. to adsorb the antibody to the wells of the plate. After washing twice with ion-exchange distilled water, 400 μl of 0.5% skim milk was added to the well, and the mixture was kept at 37 ° C. for 6 hours (blocking treatment), and then 0.1% Tween 20-containing calcium-free Dulbecco's phosphate buffered saline. The plate was washed 3 times with to obtain an antibody-immobilized plate.
【0043】先に準備したエンドセリン−1の標準溶液
それぞれ200μlずつをプレートのウェルにとり、室
温で一晩放置した。その後、0.1%ツィーン20含有
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液(以下、洗浄用緩衝液
という。)で10回洗浄し、希釈用緩衝液で2μg/m
lに調整したパーオキシダーゼ(POD)標識化抗エン
ドセリン−1抗体(免疫生物研究所社製、コード番号1
6165)200μlずつを各ウェルに加え、37℃で
2時間インキュベートした。洗浄用緩衝液で10回洗浄
後、各ウェルに順次、アデカトールSO−135を0.
1%含む2mM過酸化水素含有50mM(pH10)ホ
ウ酸ナトリウム緩衝液(以下、発光基質液Aという。)
100μl、次いで20mMルミノールと0.32mM
4−[4'−(2'−メチル)チアゾリル]フェノール含
有50mM(pH10)ホウ酸ナトリウム緩衝液との
1:1(容量比)混合液(以下、発光基質液Bとい
う。)100μlを加えた。その10分後に、ルミノメ
ータで発光量を測光した。なお試薬ブランクは、エンド
セリン−1の標準溶液の代わりに希釈用緩衝液を同じ容
量とり、同様に操作したものとした。横軸にエンドセリ
ン−1の濃度をとり、縦軸に発光量(ルミカウント)を
とり、グラフにプロットしてエンドセリン−1の検量線
とした(図1中の1)。200 μl of each standard solution of endothelin-1 prepared above was placed in a well of the plate and left overnight at room temperature. Then, it was washed 10 times with 0.1% Tween-20-containing Dulbecco's phosphate buffered saline (hereinafter referred to as a washing buffer), and diluted with a diluting buffer at 2 μg / m 2.
Peroxidase (POD) -labeled anti-endothelin-1 antibody adjusted to 1 (manufactured by Immune Biology Institute, code number 1)
6165) 200 μl each was added to each well and incubated at 37 ° C. for 2 hours. After washing 10 times with a washing buffer, ADECATOL SO-135 was added to each well in order of 0.1.
50 mM (pH 10) sodium borate buffer containing 2 mM hydrogen peroxide containing 1% (hereinafter referred to as luminescent substrate solution A).
100 μl, then 20 mM Luminol and 0.32 mM
4- [4 '-(2'-methyl) thiazolyl] phenol-containing 50 mM (pH 10) sodium borate buffer 1: 1 (volume ratio) mixed solution (hereinafter referred to as luminescent substrate solution B) 100 μl was added. . Ten minutes later, the amount of luminescence was measured with a luminometer. The reagent blank had the same volume of the buffer for dilution instead of the standard solution of endothelin-1 and was operated in the same manner. The concentration of endothelin-1 was plotted on the horizontal axis, and the amount of luminescence (lumi count) was plotted on the vertical axis, which was plotted on a graph to give a calibration curve for endothelin-1 (1 in FIG. 1).
【0044】また、発光基質液Aとして2mM過酸化水
素含有50mM(pH10)ホウ酸ナトリウム緩衝液
(アデカトールSO−135及び脱脂乳のいずれもに不
含)を用い、同様に操作して、これを比較対照とした。As the luminescent substrate solution A, a 50 mM sodium borate buffer solution containing 2 mM hydrogen peroxide (pH 10) (neither ADECATOL SO-135 nor skim milk) was used. It was used as a comparative control.
【0045】実施例2 エンドセリン−1の検量線(そ
の2) 発光基質液Aとして、0.1%アデカトールSO−13
5及び0.1%脱脂乳を含む2mM過酸化水素含有50
mM(pH10)ホウ酸ナトリウム緩衝液を用いたほか
は、実施例1と同様にしてエンドセリン−1の検量線を
作成した(図1中の2)。実施例1及び実施例2の結果
(図1)から、発光反応時にアデカトールSO−135
が存在するとき、特にアデカトールSO−135及び脱
脂乳の両者が共存するとき、エンドセリン−1の検量線
の傾斜が大きく、測定感度が高いことが分かる。Example 2 Calibration curve of endothelin-1 (No. 2) As a luminescent substrate solution A, 0.1% ADECATOL SO-13
5 and 0.1% skim milk containing 2 mM hydrogen peroxide 50
A calibration curve for endothelin-1 was prepared in the same manner as in Example 1 except that a mM (pH 10) sodium borate buffer was used (2 in FIG. 1). From the results of Example 1 and Example 2 (FIG. 1), ADECATOL SO-135 was observed during the luminescence reaction.
It can be seen that in the presence of the above, particularly when both ADECATOL SO-135 and skim milk coexist, the slope of the calibration curve for endothelin-1 is large and the measurement sensitivity is high.
【0046】実施例3 健常人の血漿中のエンドセリン
−1の測定 標準となるエンドセリン−1(ペプチド研究所製、コー
ド番号4198−s)をエンドセリン−1不含血漿で希
釈し、それぞれ2、5、10、20及び40pg/ml
の濃度のエンドセリン−1標準溶液を作成した。上記エ
ンドセリン−1標準溶液並びに検体(健常人の血漿:6
体)について、実施例2と同様にして操作し、発光量を
求めた。エンドセリン−1標準溶液の発光量(検量線)
から、検体のエンドセリン−1の濃度を求めた。Example 3 Measurement of Endothelin-1 in Plasma of Healthy Individuals Endothelin-1 (Peptide Institute, Code No. 4198-s), which serves as a standard, was diluted with endothelin-1-free plasma to give 2, 5 respectively. 10, 20 and 40 pg / ml
An endothelin-1 standard solution having a concentration of was prepared. Endothelin-1 standard solution and specimen (plasma of healthy subjects: 6
(Body) was operated in the same manner as in Example 2 to determine the amount of light emission. Luminescence intensity of endothelin-1 standard solution (calibration curve)
Then, the concentration of endothelin-1 in the sample was obtained.
【表10】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 検体番号 ET−1(pg/ml) 検体番号 ET−1(pg/ml) ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 1 1.47 4 3.00 2 2.12 5 2.79 3 1.87 6 1.55 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━[Table 10] ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ Specimen number ET-1 (pg / ml) Specimen number ET-1 (pg / ml) ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 1 1.47 4 3.00 2 2.12 5 2.79 3 1.87 6 1.55 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【0047】[0047]
【発明の効果】本発明は、パーオキシダーゼを標識物に
用いる化学発光分析における、非特異的発光反応すなわ
ち試薬ブランク(ノイズ)を低下させ、特異的発光反応
すなわちシグナル量を増強させ、S/N比(シグナル/
ノイズの比)を向上させる。したがって、測定値の信頼
性は向上する。また、本発明をエンドセリン−1の測定
に利用すると、血漿(又は血清)の濃縮等の前処理な
く、直接、定量できる。INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention reduces non-specific luminescence reaction, that is, reagent blank (noise) in chemiluminescence analysis using peroxidase as a label, and enhances specific luminescence reaction, that is, signal amount, S / N. Ratio (signal /
Noise ratio). Therefore, the reliability of the measured value is improved. Further, when the present invention is used for the measurement of endothelin-1, it can be directly quantified without pretreatment such as concentration of plasma (or serum).
【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]
【図1】エンドセリン−1の検量線を示すグラフであ
る。FIG. 1 is a graph showing a calibration curve for endothelin-1.
1…0.1%アデカトールSO−135を含む発光基質
液Aを用いた場合の検量線(実施例1)。 2…0.1%アデカトールSO−135及び0.1%脱
脂乳を含む発光基質液Aを用いた場合の検量線(実施例
2)。1 ... Calibration curve when the luminescent substrate solution A containing 0.1% ADECATOL SO-135 was used (Example 1). 2 ... Calibration curve using luminescent substrate solution A containing 0.1% ADECATOL SO-135 and 0.1% skim milk (Example 2).
Claims (2)
識した分析対象物質と、ルミノール及び過酸化水素を反
応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析方
法において、 反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に第2級
アルコールポリエトキシレートを存在させる、化学発光
分析方法。1. A chemiluminescence analysis method in which a substance to be analyzed labeled with peroxidase is allowed to react with luminol and hydrogen peroxide in the presence of a sensitizer to detect and measure the amount of luminescence produced in the reaction solution. Chemiluminescence analysis method in which a secondary alcohol polyethoxylate is present in the reaction solution when detecting and measuring the luminescence amount of.
識した分析対象物質と、ルミノール及び過酸化水素を反
応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析方
法において、 反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に第2級
アルコールポリエトキシレートとともに脱脂乳及び/又
は卵白アルブミンを存存させる、化学発光分析方法。2. A chemiluminescence analysis method in which a substance to be analyzed labeled with peroxidase is allowed to react with luminol and hydrogen peroxide in the presence of a sensitizer to detect and measure the amount of luminescence produced in the reaction solution. Chemiluminescence analysis method, wherein skimmed milk and / or ovalbumin are present together with the secondary alcohol polyethoxylate in the reaction solution when detecting / measuring the luminescence amount of.
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2096110A1 (en) | 2001-12-20 | 2009-09-02 | Lumigen, Inc. | Acridane-9-dithiocarboxylate derivatives for generating chemiluminescence with a peroxidase |
-
1993
- 1993-09-22 JP JP23639693A patent/JP3315775B2/en not_active Expired - Lifetime
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EP2096110A1 (en) | 2001-12-20 | 2009-09-02 | Lumigen, Inc. | Acridane-9-dithiocarboxylate derivatives for generating chemiluminescence with a peroxidase |
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