JPH0623760B2 - Anti-D blood typing reagent - Google Patents
Anti-D blood typing reagentInfo
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Description
ための抗Ｄ血液型判定用試薬。【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＲｈ式血液型のＲｈｏ（Ｄ）因子の検出を行う
ための抗Ｄ血液型判定用試薬に関する。Anti-D blood typing reagent for. TECHNICAL FIELD The present invention relates to an anti-D blood group determination reagent for detecting Rho (D) factor of Rh blood group.
Ｒｈ式血液型はLandsteiner とWienerにより発見されて
以来、不適合輸血や不適合妊娠の検査としてＡＢＯ式血
液型と並び重要視されてきた。現在Ｒｈ因子（抗原）は
４０数種類が見けられているが、通常Ｒｈ（＋）または
（−）の表現がＤ因子の陽性、陰性を意味するように、
日常検査においてこのＲｈｏ（Ｄ）因子の検出が最も多
く行われている。Since the Rh blood group was discovered by Landsteiner and Wiener, it has been regarded as important as the ABO blood group as a test for incompatible transfusion and incompatible pregnancy. Currently, more than 40 kinds of Rh factor (antigen) are found, but as the expression of Rh (+) or (-) usually means positive or negative of D factor,
The detection of this Rho (D) factor is most often carried out in daily tests.
Ｒｈｏ（Ｄ）因子の検出には抗Ｄ血液型判定用試薬を用
いて行うことができる。ところがＲｈ式血液型の検査で
はＡＢＯ式血液型の検査のようにオモテ検査とウラ検査
という確認の手段がない。従って、Ｒｈ式血液型の検査
を行うにあたっては操作に留意すると共に、用いる試薬
は特に力価や特異性について十分に保証されていること
が必要である。Detection of Rho (D) factor can be performed using an anti-D blood group determination reagent. However, unlike the ABO blood type test, the Rh blood type test does not have a means of confirmation such as a front and back test. Therefore, it is necessary to pay attention to the operation when performing the Rh blood group test, and the reagent to be used must be sufficiently assured especially in its titer and specificity.
従来より抗Ｄ血液型判定用試薬としては、ヒトまたはそ
の他の動物を免疫して得られた抗血清である抗Ｄポリク
ローナル抗体を用いた抗Ｄ血液型判定用血清がある。Conventionally, anti-D blood group determination reagents include anti-D blood group determination serum using an anti-D polyclonal antibody that is an antiserum obtained by immunizing humans or other animals.
一方、最近では１９７５年にＫｈｌｅｒとMilsteinら
の研究に始まるモノクローン抗体産生ハイブリドーマの
作成技術、所謂細胞融合の技術による抗Ｄモノクローナ
ル抗体も作成されている（例えば、特開昭５９−１３２
８８８、特開昭６０−１３６５９９）。このモノクロー
ナル抗体は、従来のポリクロナール抗体に比べて、単ク
ーロンより産生されるため高い特異性を有し、均質なも
のが永続的に得られるので、これを使用した抗Ｄ血液型
判定用試薬の製造供給が大いに期待されているところで
ある。On the other hand, recently, a technique for producing a hybridoma producing a monoclonal antibody, which was started in 1975 by Khler and Milstein et al., A so-called cell fusion technique has also been used to produce an anti-D monoclonal antibody (for example, JP-A-59-132).
888, JP-A-60-136599). Compared with conventional polyclonal antibodies, this monoclonal antibody has a high specificity because it is produced by a single coulomb, and a homogeneous one can be obtained permanently. Therefore, this monoclonal antibody can be used as an anti-D blood group determination reagent. The manufacturing supply is highly anticipated.
しかし、抗Ｄモノクローナル抗体は特異性は優れている
が、これをそのまま用いてＲｈｏ（Ｄ）因子の検出を肉
眼で凝集として観察する場合、実用上力価の点に問題が
残っていた。However, although the anti-D monoclonal antibody is excellent in specificity, when the Rho (D) factor detection is visually observed as agglutination by using the anti-D monoclonal antibody as it is, there remains a problem in practical potency.
通常、生理食塩水中の血球浮遊液（抗原）はマイナス側
に荷電しているたため、血球間で互いに反発しあってい
る。従って血球間は一定の距離を保っていて、それ以上
近づくことはない。一方抗体であるＩｇＧの抗原結合部
位の長さは血球間を架橋させるには至らず、ＩｇＧ抗体
と血球は反応していてもＩｇＧ抗体のみでは肉眼的に血
球を凝集させることはできない。このため抗Ｄポリクロ
ーナル抗体を用いた場合には、この凝集反応を補うのに
普通アルブミンを添加している。その結果血球間の反発
エネルギーが押さえられ、Ｒｈｏ（Ｄ）因子との凝集反
応が増強されて実用上力価が上がり、肉眼で充分に凝集
を観察することができる。Usually, the blood cell suspension (antigen) in physiological saline is negatively charged, and therefore the blood cells repel each other. Therefore, the blood cells maintain a certain distance and do not come closer. On the other hand, the length of the antigen-binding site of IgG, which is an antibody, does not lead to cross-linking between blood cells, and even if IgG antibody and blood cells react, the IgG antibody alone cannot macroscopically aggregate blood cells. Therefore, when an anti-D polyclonal antibody is used, albumin is usually added to supplement this agglutination reaction. As a result, the repulsive energy between the blood cells is suppressed, the agglutination reaction with the Rho (D) factor is enhanced, the potency is increased in practical use, and the agglutination can be sufficiently observed with the naked eye.
しかし、抗Ｄモノクローナル抗体を用いた場合には、こ
のような蛋白質の添加だけではＲｈｏ（Ｄ）因子との凝
集反応が十分には増強されず、肉眼での凝集の観察は困
難であり、厚生省で定める抗Ｄ血液型判定用血清の製造
基準に達することが出来ない。従って、抗Ｄモノクロー
ナル抗体を用いた抗Ｄ血液型判定用試薬は未だ実用化さ
れていないのが実情である。However, when the anti-D monoclonal antibody is used, the agglutination reaction with the Rho (D) factor is not sufficiently enhanced only by adding such a protein, and it is difficult to visually observe the agglutination. The manufacturing standards for anti-D blood group sera specified in 1. cannot be reached. Therefore, the actual situation is that an anti-D blood group determination reagent using an anti-D monoclonal antibody has not yet been put into practical use.
本発明の目的は、Ｒｈｏ（Ｄ）因子の検出にあたり抗Ｄ
モノクローナル抗体を用いても、その凝集反応が充分に
増強され、実用上力価の高い抗Ｄ血液型判定用試薬を提
供することにある。An object of the present invention is to detect anti-D in detecting Rho (D) factor.
Even if a monoclonal antibody is used, its agglutination reaction is sufficiently enhanced, and it is intended to provide an anti-D blood group determination reagent having a high practical potency.
本発明者らは、このような課題を解決し上述の目的を達
成するため鋭意研究を進めた結果、蛋白質の存在下に、
抗Ｄモノクローナル抗体としてイムノグロブリンサブク
ラスがＩｇＧタイプのものとイムノグロブリンサブクラ
スがＩｇＭタイプのものを併用させると、Ｒｈｏ（Ｄ）
因子との凝集反応が顕著に増強され、肉眼で十分に凝集
を観察することができることを見い出し、さらに研究を
重ねて本発明を完成するに至った。The present inventors, as a result of intensive research to solve such problems and achieve the above-mentioned object, in the presence of protein,
When anti-D monoclonal antibodies having an immunoglobulin subclass of IgG type and an immunoglobulin subclass of IgM type are used together, Rho (D)
It was found that the agglutination reaction with a factor was remarkably enhanced and the agglutination could be sufficiently observed with the naked eye, and further studies were conducted to complete the present invention.
すなわち、本発明はイムノグロブリンサブクラスがＩｇ
Ｇタイプの抗Ｄモノクローナル抗体、イムノグロブリン
サブクラスがＩｇＭタイプの抗Ｄモノクローナル抗体お
よび蛋白質よりなることを特徴とするＲｈｏ（Ｄ）因子
検出のための抗Ｄ血液型判定用試薬に関するものであ
る。That is, in the present invention, the immunoglobulin subclass is Ig
The present invention relates to an anti-D blood group determination reagent for detecting Rho (D) factor, which comprises a G-type anti-D monoclonal antibody, an immunoglobulin subclass consisting of an IgM type anti-D monoclonal antibody and a protein.
本発明の抗Ｄ血液型判定用試薬に用いる抗Ｄモノクロー
ナル抗体としては、イムノグロブリンサブクラスがＩｇ
Ｇタイプの抗Ｄモノクローナル抗体とイムノグロブリン
サブクラスがＩｇＭタイプの抗Ｄモノクローナル抗体が
併用して使用される。とりわけ、そのうちでも特異性が
安定している点から、ヒト−ヒトハイブリドーマから産
生されたヒト型抗Ｄモノクローナル抗体が好ましい。As the anti-D monoclonal antibody used in the anti-D blood group determination reagent of the present invention, the immunoglobulin subclass is Ig.
An anti-D monoclonal antibody of G type and an anti-D monoclonal antibody of immunoglobulin subclass IgM type are used in combination. Among them, the human anti-D monoclonal antibody produced from a human-human hybridoma is preferable because of its stable specificity.
ＩｇＧタイプとＩｇＭタイプとの配合割合は、本発明の
目的を達成しうるものであれば特に限定はないが、通常
それぞれの力価として１：４から４：１、好ましくは
１：２から２：１の割合となるように配合される。The mixing ratio of the IgG type and the IgM type is not particularly limited as long as the object of the present invention can be achieved, but the titer is usually 1: 4 to 4: 1, preferably 1: 2 to 2 It is compounded so that it may become a ratio of 1: 1.
本発明の抗Ｄ血液型判定用試薬に用いる蛋白質として
は、本発明の目的を満足するものはすべて用いることが
できる。具体的な蛋白質の例としては、アルブミンがあ
げられる。As the protein used in the anti-D blood group determination reagent of the present invention, any protein that satisfies the object of the present invention can be used. An example of a specific protein is albumin.
その添加量は、一概に限定されないが、通常５〜３０
％、好ましくは１０〜２５％の濃度になるように添加さ
れる。The amount added is not particularly limited, but is usually 5 to 30.
%, Preferably 10 to 25%.
本発明の抗Ｄ血液型判定用試薬は上述のように構成され
ているが、当該試薬は厚生省の定める抗Ｄ血液型判定用
血清の製造基準に適合するものである。この製造基準の
うち凝集反応に関しては、凝集力試験と凝集価試験があ
り、凝集力試験は定められた条件のともで陽性検体を用
い、凝集開始までの時間（秒）および凝集塊の大きさが
１mm2に達するまでの時間（秒）を測定する。また凝集
価試験は定められた条件のもとで２倍連続希釈し、陽性
を示す最高希釈倍数から凝集価を求める。The anti-D blood group determination reagent of the present invention is configured as described above, but the reagent complies with the manufacturing standards of the anti-D blood group determination serum defined by the Ministry of Health and Welfare. Regarding the agglutination reaction in these manufacturing standards, there are an agglutination test and an agglutination value test, and the agglutination test uses a positive sample under the specified conditions. Measure the time (seconds) to reach 1 mm 2 . In the agglutination value test, two-fold serial dilution is performed under defined conditions, and the agglutination value is determined from the highest dilution factor showing positiveness.
この際、アルブミン液抗体血清では凝集力試験と凝集価
試験に規定があるが、食塩液抗体血清では凝集価試験の
みである。従来のポリクローナル抗体を使用した抗Ｄ血
液型判定用血清は、単独でアルブミン液抗体血清および
食塩液抗体血清の両者の特性を満足することができない
が、本発明の抗Ｄ血液型判定用試薬では、この両者の特
性が満足され、どちらの方法でも使用することできる。At this time, the albumin solution antibody serum is prescribed in the agglutination test and the agglutination value test, but the saline antibody serum is only in the agglutination value test. The conventional anti-D blood group sera using a polyclonal antibody cannot satisfy the characteristics of both the albumin antibody serum and the saline antibody serum by itself, but the anti-D blood group reagent of the present invention cannot be used. Both of these characteristics are satisfied, and both methods can be used.
さらに、本発明の抗Ｄ血液型判定用試薬は、ＤＵ因子の
検出のための間接クームス試験を行うことができる。一
般にＤＵ因子は抗Ｄ抗体との反応が弱いものの総称とさ
れ、明瞭な凝集反応が認められなかった場合、Ｒｈｏ
（Ｄ）因子が陰性かどうかの確認が必要となる。このよ
うな場合、本発明の抗Ｄ血液型判定用試薬では、間接ク
ームス試験を行い、その凝集の有無から真のＲｈｏ
（Ｄ）陰性について判定することができる。Furthermore, the anti-D blood grouping reagent of the present invention, it is possible to perform indirect Coombs test for the detection of D U Factor. Generally, DU factor is a generic name for the one that has a weak reaction with anti-D antibody, and if no clear agglutination reaction is observed, Rho
(D) It is necessary to confirm whether the factor is negative. In such a case, an indirect Coombs test is performed with the anti-D blood group determination reagent of the present invention, and the true Rho
(D) Negative can be determined.
本発明の抗Ｄ血液型判定用試薬は、モノクローナル抗体
を用いることにより、ポリクローナル抗体に比べて高い
特異性のものが永続的に産生できる。従って、本発明の
抗Ｄ血液型判定用試薬は優れた均質な特性のものとして
ロット間差なく製造することができるという効果を有す
る。By using a monoclonal antibody, the anti-D blood group determination reagent of the present invention can be permanently produced with a specificity higher than that of a polyclonal antibody. Therefore, the anti-D blood group determination reagent of the present invention has an advantageous effect that it can be produced as a product having excellent homogeneous characteristics without difference between lots.
特に、抗Ｄモノクローナル抗体としてイムノグロブリン
サブクラスＩｇＧタイプの抗Ｄモノクローナル抗体とイ
ムノグロブリンサブクラスがＩｇＭタイプの抗Ｄモノク
ローナル抗体とを併用することによって、Ｒｈｏ（Ｄ）
因子に対する凝集反応が増強されて実用上力価が上が
り、かつアルブミン液抗体血清および食塩液抗体血清の
両者の特性を満足することができ、とちらの方法も使用
することができるという効果を有する。In particular, by combining an anti-D monoclonal antibody of immunoglobulin subclass IgG type and an anti-D monoclonal antibody of immunoglobulin subclass IgM type as an anti-D monoclonal antibody, Rho (D)
It has the effect that the agglutination reaction to the factor is enhanced and the potency is increased practically, and the characteristics of both the albumin solution antibody serum and the saline antibody serum can be satisfied, and that this method can also be used. .
また、本発明の抗Ｄ血液型判定用試薬は、ＤＵ因子の検
出のための間接クームス試験を行うことができるという
効果をも有する。これはＩｇＭタイプのモノクローナル
抗体では行うことができない。Moreover, anti-D blood grouping reagent of the present invention also has an effect that it is possible to perform indirect Coombs test for the detection of D U Factor. This cannot be done with IgM type monoclonal antibodies.
以上のことから明らかなように、本発明の抗Ｄ血液型判
定用試薬は臨床検査の分野に有用なものとして供するこ
とができる。As is clear from the above, the anti-D blood group determination reagent of the present invention can be provided as being useful in the field of clinical examination.
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例
に限定されるものではない。Examples of the present invention are shown below, but the present invention is not limited to these examples.
実施例１ 本発明の抗Ｄ血液型判定用試薬は次のようにして作製す
ることができる。ます抗Ｄモノクローナル抗体のイムノ
グロブリンサブクラスがＩｇＧタイプのバルクをとり、
それと同じ力価の抗Ｄモノクローナル抗体のイムノグロ
ブリンサブクラスがＩｇＭタイプのバルクを加える。こ
れにウシアルブミンを２０％の濃度になるように加え、
さらに防腐剤としてアジ化ナトリウムを０．１％の濃度
になるように加えたあと、除菌し無菌的にバイアルに小
分けして作製する。Example 1 The reagent for anti-D blood group determination of the present invention can be prepared as follows. The immunoglobulin subclass of anti-D monoclonal antibody is taking the bulk of IgG type,
The immunoglobulin subclass of anti-D monoclonal antibody of the same titer adds bulk of IgM type. Add bovine albumin to this to a concentration of 20%,
Further, sodium azide is added as a preservative to a concentration of 0.1%, the bacteria are sterilized, and aseptically divided into vials to prepare.
試験例１ 本発明の抗Ｄ血液型判定用試薬の凝集力試験については
次のように実施した。まずＤ陽性血球の４０ｖ／ｖ％浮
遊液をウシアルブミン溶液を用いて作製し、載せガラス
上でのこの２滴に実施例１で製作した抗Ｄ血液型判定用
試薬の１滴を混合し、凝集が開始するまでの時間を測定
した（測定１）。更にその凝集塊の大きさが１mm2に達
した時間も測定した（測定２）。このとき対照として抗
Ｄ血液型判定用試薬の代わりに、抗Ｄモノクローナル抗
体のイムノグロブリンサブクラスがＩｇＧタイプのもの
および抗Ｄモノクローナル抗体からなる市販のDade社製
造品も同様に試験した。Test Example 1 The agglutination test of the anti-D blood group determination reagent of the present invention was carried out as follows. First, a 40 v / v% suspension of D-positive blood cells was prepared using a bovine albumin solution, and 1 drop of the anti-D blood group determination reagent prepared in Example 1 was mixed with these 2 drops on a mounting glass. The time until aggregation started was measured (measurement 1). Further, the time for the size of the aggregate to reach 1 mm 2 was also measured (measurement 2). At this time, as a control, instead of the anti-D blood typing reagent, a commercially available product manufactured by Dade made of an anti-D monoclonal antibody having an immunoglobulin subclass of IgG type and an anti-D monoclonal antibody was also tested.
その結果は表１のようになり、本発明の抗Ｄ血液型判定
用試薬は凝集力試験において満足できる成績を示した。The results are shown in Table 1, and the anti-D blood group determination reagent of the present invention showed satisfactory results in the agglutination test.
試験例２ 本発明の抗Ｄ血液型判定用試薬のアルブミン液抗体血清
としての凝集価試験については次のように実施した。ま
ず陽性血球の２ｖ／ｖ％浮遊液をウシアルブミン溶液を
用いて作製する。次に実施例１で作製した抗Ｄ血液型判
定用試薬をＡＢ型血清で２０連続希釈し、それぞれ０．
１mlを試験管にとり、これに上記の血球浮遊液０．１ml
を加え混割する。これを遠心沈澱し凝集を観察する。こ
の凝集を示す最高希釈倍数から凝集価を求める。このと
き対照として抗Ｄモノクローナル抗体のイムノグロブリ
ンサブクラスがＩｇＧタイプのものおよび抗Ｄポリクロ
ーナル抗体からなる市販のDade社製造品も同様に試験し
た。 Test Example 2 The agglutination test of the anti-D blood typing reagent of the present invention as an albumin liquid antibody serum was carried out as follows. First, a 2 v / v% suspension of positive blood cells is prepared using a bovine albumin solution. Next, the anti-D blood grouping reagent prepared in Example 1 was serially diluted 20 times with AB type serum, and each was diluted to 0.
Take 1 ml in a test tube and add 0.1 ml of the above hemocyte suspension.
Add and mix. This is subjected to centrifugal precipitation to observe aggregation. The aggregation value is calculated from the highest dilution factor showing this aggregation. At this time, as a control, a commercially available product manufactured by Dade made of an anti-D monoclonal antibody having an immunoglobulin subclass of IgG type and an anti-D polyclonal antibody was also tested.
その結果は表２のようになり、本発明の抗Ｄ血液型判定
用試薬はアルブミン液抗体血清としての凝集価試験にお
いても満足できる成績を示した。The results are shown in Table 2, and the anti-D blood group determination reagent of the present invention showed satisfactory results even in the agglutination test as an albumin solution antibody serum.
試験例３ 本発明の抗Ｄ血液型判定用試薬の食塩液抗体血清として
の凝集価試験については次のように実施した。まず陽性
血球の２ｖ／ｖ％浮遊液を生理食塩液浮遊液を用いて作
製する。次に実施例１で作製した抗Ｄ血液型判定用試薬
を生理食塩液で２倍連続希釈し、それぞれ０．１mlを試
験管にとり、これに上記の血球浮遊液０．１mlを加え混
和する これを遠心沈澱し凝集を観察する。この凝集を示す最高
希釈倍数から凝集価を求める。このとき対照として抗Ｄ
モノクローナル抗体のイムノグロブリンサブクラスがＩ
ｇＧタイプのものも同様に試験した。 Test Example 3 The agglutination value test of the anti-D blood typing reagent of the present invention as a saline antibody serum was carried out as follows. First, a 2 v / v% suspension of positive blood cells is prepared using a physiological saline suspension. Next, the anti-D blood grouping reagent prepared in Example 1 was serially diluted 2-fold with physiological saline, and 0.1 ml of each was placed in a test tube, to which 0.1 ml of the blood cell suspension was added and mixed. Are subjected to centrifugal precipitation and the aggregation is observed. The aggregation value is calculated from the highest dilution factor showing this aggregation. At this time, anti-D as a control
The immunoglobulin subclass of a monoclonal antibody is I
The gG type was also tested.
その結果は表３のようになり、本発明の抗Ｄ血液型判定
用試薬は食塩液抗体血清としての凝集価試験においても
満足できる成績を示した。The results are shown in Table 3, and the anti-D blood group determination reagent of the present invention showed satisfactory results in the agglutination test as a saline antibody serum.
なお、この際、対象として用いた抗Ｄモノクローナル抗
体（ＩｇＧタイプ）は厚生省の製造基準に適合すること
が出来なかった。At this time, the anti-D monoclonal antibody (IgG type) used as a target could not meet the manufacturing standards of the Ministry of Health and Welfare.
Claims (1)
プの抗Ｄモノクローナル抗体、イムノグロブリンサブク
ラスがＩｇＭタイプの抗Ｄモノクローナル抗体および蛋
白質よりなることを特徴とするＲｈｏ（Ｄ）因子検出の1. A method for detecting Rho (D) factor, characterized in that the immunoglobulin subclass is an IgG type anti-D monoclonal antibody, and the immunoglobulin subclass is an IgM type anti-D monoclonal antibody, and a protein.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63050710A JPH0623760B2 (en) | 1988-03-03 | 1988-03-03 | Anti-D blood typing reagent |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63050710A JPH0623760B2 (en) | 1988-03-03 | 1988-03-03 | Anti-D blood typing reagent |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01223349A JPH01223349A (en) | 1989-09-06 |
| JPH0623760B2 true JPH0623760B2 (en) | 1994-03-30 |
Family
ID=12866451
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63050710A Expired - Lifetime JPH0623760B2 (en) | 1988-03-03 | 1988-03-03 | Anti-D blood typing reagent |
Country Status (1)
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Family Cites Families (4)
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|---|---|---|---|---|
| EP0115062A3 (en) * | 1982-12-30 | 1986-08-27 | Biotest Aktiengesellschaft | Monoclonal antibody specific for human blood group antigen d (rh0), and reactive in a direct agglutination test, and hybridoma cell lines procuding these monoclonal antibodies |
| JPS60136599A (en) * | 1983-12-26 | 1985-07-20 | Isao Ono | Monoclonal antibody |
| GB8610106D0 (en) * | 1986-04-25 | 1986-05-29 | Central Blood Lab Authority | Human igm-producing heterohybridoma |
| JPH0690206B2 (en) * | 1986-06-16 | 1994-11-14 | 日本赤十字社 | Antigen-antibody complex and method of using the same |
-
1988
- 1988-03-03 JP JP63050710A patent/JPH0623760B2/en not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Publication date |
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| JPH01223349A (en) | 1989-09-06 |
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