JPH06189770A - Expression promoter and its use - Google Patents

Expression promoter and its use

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JPH06189770A
JPH06189770A JP12860193A JP12860193A JPH06189770A JP H06189770 A JPH06189770 A JP H06189770A JP 12860193 A JP12860193 A JP 12860193A JP 12860193 A JP12860193 A JP 12860193A JP H06189770 A JPH06189770 A JP H06189770A
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JP
Japan
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promoter
gene
dna
cells
ngf
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Application number
JP12860193A
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Japanese (ja)
Inventor
Asae Shintani
麻江 新谷
Reiko Sasada
玲子 佐々田
Koichi Igarashi
貢一 五十嵐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
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Publication date
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Pending legal-status Critical Current

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Abstract

PURPOSE:To provide a promoter acting at specific stages in generation and differentiation. CONSTITUTION:The objective promoter is composed of a recombinant DNA containing the promoter region of a human nerve growth factor 2. The promoter is useful as a material for analyzing the expression-controlling mechanism of a nerve-specific protein for the differentiation of function, preparation of a disease model animal or setting of a drug-screening system.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【0001】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は遺伝子発現用新規プロモ
ーターおよびその用途に関する。
TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel promoter for gene expression and its use.

【0002】さらに詳しくは、本発明は、神経成長因子
−2(NGF−2)遺伝子のプロモーター領域を含有す
る組換えDNA、当該DNAを含有する組換えベクター
および形質転換体に関する。
More specifically, the present invention relates to a recombinant DNA containing a promoter region of nerve growth factor-2 (NGF-2) gene, a recombinant vector containing the DNA and a transformant.

【0003】[0003]

【従来の技術】動物、特に高等動物では、その発生の時
期より各種器官の分化、成熟がおこり生体の各種機能を
発揮せしめるようになる。この過程で種々の器官特異的
な蛋白質の一過性の、あるいは恒常的な発現がおこり、
器官に特異性を付与することとなる。発生・分化の胎児
期や成熟期に特異的に発現し、作用している蛋白質の遺
伝子にはその時期にのみ作動する転写誘導系(プロモー
ター、エンハンサー)があって、このプロモーター部分
が蛋白質合成を指令するmRNAの転写を制御してい
る。さらにプロモーターにはホルモン依存性や、増殖因
子依存性を示すものも知られており、これらを利用した
薬物スクリーニング系やトランスジェニックマウスが既
に作成されて、薬物のスクリーニングや、生体機能の解
析に利用されている。 神経栄養因子のファミリーに分
類される蛋白質は神経細胞の分化、成長および生存に必
須の栄養因子で、これ迄にNGF〔Leui-Monntalcini,
アニュアル・オブ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・
サイエンス(Anu. N. Y. Acad. Sci.) 55:330,
1952〕,ポリペプチド(I)(以下、NGF−2と称
する。)(ヨーロッパ特許出願公開第386,752号
公報)およびBDNF(J. Leibrock ら,ネイチャー
(Nature )341:149,1989)などが知られ
ている。NGF−2と同じアミノ酸配列を有するペプチ
ドは、NT−3なる名称でA. Hohn ら,Nature,34
4,339(1990)などに発表されており、また、P
CT公開公報WO91/03569号公報に示されてい
る。NGF−2/NT−3については、そのmRNAの
解析から、胎生期より合成が始まり生後1〜2週目に最
も多く合成されることが示唆されている〔Y. Kaisho
ら,バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサ
ーチ・コミュニケーション(Biochem. Biophy. Res. Co
mmun.,)174,379,1991〕。
2. Description of the Related Art In animals, especially higher animals, various organs are differentiated and matured from the time of their development, and various functions of living bodies can be exerted. During this process, transient or constitutive expression of various organ-specific proteins occurs,
It gives specificity to the organ. The gene of a protein that is specifically expressed in the fetal and maturation stages of development / differentiation has a transcription induction system (promoter, enhancer) that operates only during that period, and this promoter part is responsible for protein synthesis. It controls the transcription of directed mRNAs. Furthermore, promoters that are hormone-dependent or growth-factor-dependent are also known, and drug screening systems and transgenic mice using these promoters have already been created and used for drug screening and analysis of biological functions. Has been done. Proteins classified into the neurotrophic factor family are trophic factors essential for the differentiation, growth and survival of nerve cells.
Annual of New York Academy of
Science (Anu. NY Acad. Sci.) 55: 330,
1952], polypeptide (I) (hereinafter referred to as NGF-2) (European Patent Application Publication No. 386,752) and BDNF (J. Leibrock et al., Nature 341: 149, 1989). Are known. A peptide having the same amino acid sequence as NGF-2 has the name NT-3 and is named by A. Hohn et al., Nature, 34.
4, 339 (1990), and also P
It is shown in CT publication WO 91/03569. Regarding NGF-2 / NT-3, the analysis of its mRNA suggests that the synthesis starts from the embryonic stage and is most abundant at 1-2 weeks after birth [Y. Kaisho.
Et al., Biochemical and Biophysical Research Communication (Biochem. Biophy. Res. Co.
mmun.,) 174, 379, 1991].

【0004】[0004]

【発明が解決しようとする課題】従って、発生・分化の
胎児期や成熟期にのみ作動するプロモーター部分を使っ
て、その下流に種々の蛋白質をコードする遺伝子を連結
し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジ
ェニック動物(遺伝子移入動物)を作成すれば、発生・
分化の胎児期や成熟期にのみその蛋白質を合成させ、そ
の生体での作用を検討することも可能となる。さらに上
記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合さ
せ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、該プロ
モーターによって本来制御されている蛋白質の合成を促
進もしくは抑制する作用を持つ薬剤のスクリーニング系
として使用できる。しかし大部分の遺伝子の転写を指令
するプロモーターには明確な発現時期特異性は検出され
ず、該特異性を示すプロモーターが渇望されている。
[Problems to be Solved by the Invention] Therefore, by using a promoter portion that operates only during the fetal or maturation stage of development / differentiation, genes encoding various proteins are ligated downstream thereof, and this is linked to animal egg cells. If you create a so-called transgenic animal (transgenic animal) by injecting
It is also possible to synthesize the protein only during the fetal or maturation stage of differentiation and study its action in the living body. Further, by linking an appropriate reporter gene to the above promoter portion and establishing a cell line capable of expressing this, it can be used as a screening system for a drug having an action of promoting or suppressing the synthesis of a protein originally regulated by the promoter. it can. However, no clear expression time specificity is detected in the promoters that direct the transcription of most genes, and promoters exhibiting such specificity are craving.

【0005】中枢神経系は、神経管から分化した神経細
胞(ニューロン)および神経膠細胞(グリア細胞)より
構成され、複雑な機能を営む細胞社会と言える。この神
経系で分化の特定の時期に特異的に機能するプロモータ
ーは機能分化のための神経特異蛋白質の発現調節機構を
解析するための手段として有用である。また、種々の遺
伝子を下流に連結させて細胞あるいは動物に移入するこ
とにより、それらを神経系細胞あるいは脳で特定の時期
に特異的に発現させることが出来る。
The central nervous system is composed of nerve cells (neurons) and glial cells (glial cells) differentiated from the neural tube, and can be said to be a cellular society having complex functions. The promoter that specifically functions at a specific stage of differentiation in the nervous system is useful as a means for analyzing the regulatory mechanism of the expression of nerve-specific proteins for functional differentiation. Also, by linking various genes downstream and transferring them into cells or animals, they can be specifically expressed in neural cells or brain at a specific time.

【0006】[0006]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、発生・分
化の特定の時期に作動するプロモーターとして、NGF
−2/NT−3遺伝子のプロモーターを見い出し、取り
出すことを目標として、ヒトNGF−2/NT−3 c
DNAに対応する合成オリゴヌクレオチドをプローブと
し て、ヒトNGF−2/NT−3ゲノム遺伝子クロー
ニングした。この遺伝子を制限酵素消化してNGF−2
/NT−3 cDNAの一部を含むその上流部分4.0kb
DNAを得、その内の上流部分3.4kbp を再びプラス
ミドDNA上にクローニングした。この3.4kbp DN
Aの下流に、リポーター遺伝子としてのクロラムフェニ
コールアセチル転移酵素(CAT)遺伝子を連結したプ
ラスミドDNAを構築し、該DNAで形質転換されたグ
リア細胞あるいは他の動物細胞等の形質転換体でのCA
T活性を測定することにより、NGF−2/NT−3構
造遺伝子上流部分3.4kbp DNAに、NGF−2/N
T−3プロモーターを見出すことが出来た。
[Means for Solving the Problems] As a promoter that operates at a specific time of development / differentiation, the present inventors
-2 / NT-3 gene human NGF-2 / NT-3 c with the goal of finding and removing the promoter
Human NGF-2 / NT-3 genomic gene was cloned using a synthetic oligonucleotide corresponding to DNA as a probe. This gene was digested with a restriction enzyme to produce NGF-2.
/4.0 kb of its upstream portion containing part of the NT-3 cDNA
DNA was obtained, and the upstream portion of 3.4 kbp was cloned again on the plasmid DNA. This 3.4 kbp DN
A plasmid DNA in which a chloramphenicol acetyltransferase (CAT) gene as a reporter gene was ligated downstream of A was constructed, and a transformant such as glial cells or other animal cells transformed with the DNA was constructed. CA
By measuring the T activity, NGF-2 / N was added to the NGF-2 / N-3 structural gene upstream portion 3.4 kbp DNA.
We were able to find the T-3 promoter.

【0007】本発明者らは、これらの知見に基づきさら
に研究した結果、本発明を完成した。すなわち本発明は
(1)NGF−2/NT−3遺伝子のプロモーター領域を
含有するDNA、(2)NGF−2/NT−3遺伝子のプ
ロモーター領域を含有する組換えDNA、(3)上記(2)
記載の組換えDNAを含有する組換えベクター、(4)下
流に構造遺伝子を連結している上記(3)記載の組換えベ
クター、(5)上記(3)または(4)記載のベクターを保持
する形質転換体に関するものである。上記(1)記載のN
GF−2/NT−3遺伝子のプロモーターとしてはヒト
由来のものであることが好ましい。また該プロモーター
領域は次の塩基配列 TGAGCGCGGA GCCATCTGGC CGGGTTGGCT GGTTATAACC GCGCAGATTC TGTTCACGGG ACTC (配列番号1) で表わされるDNAあるいはその一部を含有することが
好ましく、さらに次の配列 AAGAGGGGCC AGGAGAAATG ACCCCTTCCC CGCCACGGGT CCCGAAGTGA GGGCGGGGGG GGGGCTCTGG GGCGCGGGCG CGCGCGGCGC GGCGCGGGCC GGCGGGGGAG GGCGGCGCGG CGCGGAAGGG GTTAAGGCGC TGAGCGCGGA GCCATCTGGC CGGGTTGGCT GGTTATAACC GCGCAGATTC TGTTCACGGG ACTC (配列番号2) で表わされるDNAあるいはその一部を含有するものが
好ましく、その一部としては、上記塩基配列の一部であ
って、プロモーター活性を有する部分をいう。
The present inventors have completed the present invention as a result of further research based on these findings. That is, the present invention
(1) DNA containing a promoter region of NGF-2 / NT-3 gene, (2) Recombinant DNA containing a promoter region of NGF-2 / NT-3 gene, (3) Above (2)
Recombinant vector containing the recombinant DNA described above, (4) Recombinant vector according to (3) above, in which a structural gene is linked downstream, (5) Retaining the vector according to (3) or (4) above The present invention relates to transformants. N described in (1) above
The GF-2 / NT-3 gene promoter is preferably of human origin. Further, it is preferable that the promoter region contains the DNA represented by the following nucleotide sequence TGAGCGCGGA GCCATCTGGC CGGGTTGGCT GGTTATAACC GCGCAGATTC TGTTCACGGG ACTC (SEQ ID NO: 1) or a part thereof, and further the following sequence AAGAGGGGGGGGCGCGCGCGCGCGGGCGCGCGCGCGGTGGCGCGCGCGGGGGCGCGCGCGCGGG GGCGGGGGAG GGCGGCGCGG CGCGGAAGGG GTTAAGGCGC TGAGCGCGGA GCCATCTGGC CGGGTTGGCT GGTTATAACC GCGCAGATTC TGTTCACGGG ACTC (SEQ ID NO: 2) or a part thereof is preferable, and a part of the above nucleotide sequence has promoter activity. The part that has.

【0008】本発明のNGF−2/NT−3プロモータ
ー領域を含有する組換えDNAは、たとえば次のように
して得ることができる。まずフェブス レターズ(FE
BS Lett.)266,187−191(1990)に報告
されているヒ トNGF−2/NT−3 cDNAの最上
流域に対応する合成オリゴヌクレオチドをプローブとし
て用いて、ヒト遺伝子ライブラリーをスクリーニングし
て、このプローブと反応するλファージのクローンを得
る。このファージクローンよりDNAを抽出し、組みこ
まれているヒト遺伝子部分の制限酵素地図を作成し、c
DNAの最上流域プローブと反応する、例えば制限酵素
消化によるDNA断片を、例えばプラスミドpUC11
8〔Vieira. J. andMessing J. (1987),メソッズ
・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology )
153,3−11〕に再クローニングすることが出来
る。クローニングしたDNAの塩基配列を決定し、例え
ばcDNAの塩基配列と比較検討することにより遺伝子
上の翻訳開始コドンの位 置を知ることができる。ま
た、ヒトmRNAを用いて、例えばSIマッピング法[B
erk, A. J., と Sharp, P. A., セル(Cell),12,
721,1977]を行えば、該遺伝子の転写開始点を
知ることもできる。
The recombinant DNA containing the NGF-2 / NT-3 promoter region of the present invention can be obtained, for example, as follows. First, Febs Letters (FE
BS Lett.) 266, 187-191 (1990), using a synthetic oligonucleotide corresponding to the most upstream region of human NGF-2 / NT-3 cDNA as a probe to screen a human gene library. , Obtain a clone of λ phage that reacts with this probe. DNA was extracted from this phage clone and a restriction enzyme map of the integrated human gene part was prepared.
A DNA fragment that reacts with the uppermost stream region probe of DNA, for example, by digestion with a restriction enzyme, is prepared by, for example, plasmid pUC11.
8 [Vieira. J. and Messing J. (1987), Methods in Enzymology]
153, 3-11]. The position of the translation initiation codon on the gene can be known by determining the nucleotide sequence of the cloned DNA and comparing it with the nucleotide sequence of the cDNA, for example. Further, using human mRNA, for example, SI mapping method [B
erk, AJ, and Sharp, PA, Cell, 12,
721, 1977], the transcription start point of the gene can be known.

【0009】このようにして得られたNGF−2/NT
−3のプロモーター領域を含有せしめた組換えDNAを
含有する組換えベクターにおいて、NGF−2/NT−
3プロモーターを組み込む組換え用ベクターとしては、
特に限定されないが、たとえばpCDベクター、cDM8
ベクター[Aruffo, A. と Seed, B., プロシージングス
オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエン
ス(Proc. Natl. Acad. Sic. USA),84,857
3−8577(1987)],レトロウイルスベクター
[Cone, R. D. と Mulligan, R. C., プロシージングス
オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエン
ス(Proc. Natl. Sic, USA),81,6349−6
353(1984)]など動物細胞用のもの、pUC(Vie
ira, J. and Messing J. (1987),Methods in Enzy
mology 153,3−11)などの大腸菌用のものなど
が挙げられる。
NGF-2 / NT thus obtained
In a recombinant vector containing a recombinant DNA containing a promoter region of -3, NGF-2 / NT-
As a recombination vector incorporating 3 promoters,
Although not particularly limited, for example, pCD vector, cDM8
Vector [Aruffo, A. and Seed, B., Proc. Natl. Acad. Sic. USA], 84,857
3-8577 (1987)], retrovirus vector [Cone, RD and Mulligan, RC, Procedures of the National Academy of Science (Proc. Natl. Sic, USA), 81, 6349-6.
353 (1984)] for animal cells, pUC (Vie
ira, J. and Messing J. (1987), Methods in Enzy
mology 153, 3-11) and the like for E. coli.

【0010】組換えベクターにおいてプロモーター領域
の下流に連結される構造遺伝子としては、種々の遺伝子
産物の発生・分化の胎児期や成熟期における中枢神経系
での機能を知るためのポリペプチドをコードする構造遺
伝子が挙げられる。その例としては、たとえば神経細胞
成長因子(NGF)、塩基性線維芽細胞成長因子(basi
c FGF)、酸性線維芽細胞成長因子(acidic FG
F)などの神 経栄養因子を始とする他の成長因子、リ
ンホカインなどが挙げられる。上記構造遺伝子として、
後述のレポーター遺伝子を用いてもよい。レポーター遺
伝子としてはCAT(クロラムフェニコール アセチル
トランスフェラーゼ(Chloramphenicol acetyl trans
ferase)遺伝子,アルカリフォスファターゼ遺伝子の他
に、βガラクトシダーゼ遺伝子が汎用されているが、他
のいかなる構造遺伝子であっても、その遺伝子産物の検
出法があれば使用され得る。
The structural gene linked to the downstream of the promoter region in the recombinant vector encodes a polypeptide for knowing the functions of various gene products in the central nervous system during the fetal and maturation stages of development and differentiation. Structural genes are mentioned. Examples thereof include nerve cell growth factor (NGF) and basic fibroblast growth factor (basi).
c FGF), acidic fibroblast growth factor (acidic FG)
Other growth factors such as F) and other neurotrophic factors, lymphokines and the like can be mentioned. As the structural gene,
You may use the below-mentioned reporter gene. As a reporter gene, CAT (Chloramphenicol acetyl trans
ferase) gene and alkaline phosphatase gene, β-galactosidase gene is widely used, but any other structural gene can be used if there is a method for detecting its gene product.

【0011】上記構造遺伝子をベクターに組み込むに
は、プロモーター領域の下流に存在する適当な制限酵素
切断部位に、上記構造遺伝子が正しく転写される方向に
連結すればよい。上記組換えベクターにより形質転換す
る宿主としては、動物細胞、特にグリア細胞や脳神経系
の細胞が用いられ得る。また動物個体へのDNA移入へ
の一過程としての卵細胞、あるいはES細胞[Evans,
M. J. と Kaufman, K. H., ネイチヤー(Nature),2
92,154(1981)]も使用される。これらの細胞
の形質転換の方法としては、リン酸カルシウム法[Grah
am ら、ヴィロロジー(Virology)52,456(197
3)]、エレクトロポレーション法[石崎ら、細胞工
学,5,557(1986)]、マイクロインジェクショ
ン法などが用いられる。
In order to incorporate the above structural gene into a vector, it may be ligated to an appropriate restriction enzyme cleavage site located downstream of the promoter region in such a direction that the above structural gene is correctly transcribed. Animal cells, particularly glial cells and cranial nervous system cells, can be used as the host transformed with the recombinant vector. In addition, egg cells or ES cells [Evans, as a process for DNA transfer into individual animals]
MJ and Kaufman, KH, Nature, 2
92, 154 (1981)] is also used. As a method for transforming these cells, the calcium phosphate method [Grah
am et al., Virology 52,456 (197)
3)], an electroporation method [Ishizaki et al., Cell Engineering, 5,557 (1986)], a microinjection method and the like.

【0012】本発明のプロモーターを用いることによ
り、脳神経系などの細胞に、前記のような種々のポリペ
プチドを作らせることができる。また上記構造遺伝子と
して myc, ras をはじめとした癌遺伝子を用いると、得
られたベクターを動物(例、マウス,ラット,イヌ,ネ
コなど)卵細胞に投与し、該動物の脳神経系における発
生・分化の胎児期や成熟期に癌をはじめとする特定の病
変をひき起こす疾患モデル動物を製造することができ
る。他のモデル動物も同様の形質転換法により創製する
ことができる。さらに、上記構造遺伝子が脳の遺伝的疾
患(例、アルツハイマー病,パーキンソン病など)の治
療に役立つペプチドをコードするものである場合には、
本発明のベクターを直接、哺乳動物(例、マウス,ラッ
ト,イヌ,ネコ,ヒトなど)の脳内に投与、あるいは培
養した脳由来細胞にベクターを導入した後に、脳内に移
植することにより、該疾患の治療を行なうことができ
る。また、癌抑制遺伝子を構造遺伝子としてベクターを
構築し、該ベクターを腫瘍細胞に直接導入することによ
り、脳腫瘍の治療を行なうことができる。またさらに、
本発明のプロモーターが、脳神経系の細胞において、特
定の化合物によりプロモーター活性のコントロールが行
なわれることが分かれば、特定の化合物を生体の脳に到
達するように投与した場合、該特定の化合物のプロモー
ター活性のコントロール能を知ることができるので、該
化合物が脳内におけるNGF−2/NT−3遺伝子のプ
ロモーターを活性化し脳内においてNGF−2/NT−
3の生産量を増大させ、これにより痴呆症の治療を行な
うことができる。
By using the promoter of the present invention, cells such as the cranial nervous system can be made to produce various polypeptides as described above. When an oncogene such as myc or ras is used as the structural gene, the obtained vector is administered to an egg cell of an animal (eg, mouse, rat, dog, cat, etc.) to cause development and differentiation in the cranial nervous system of the animal. It is possible to produce a disease model animal that causes specific lesions such as cancer in the fetal period and the maturity stage. Other model animals can be created by the same transformation method. Furthermore, when the above structural gene encodes a peptide useful for treatment of genetic diseases of the brain (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, etc.),
By directly administering the vector of the present invention into the brain of a mammal (eg, mouse, rat, dog, cat, human, etc.) or introducing the vector into cultured brain-derived cells, and then transplanting into the brain, Treatment of the disease can be performed. In addition, a brain tumor can be treated by constructing a vector using a tumor suppressor gene as a structural gene and directly introducing the vector into tumor cells. Furthermore,
If the promoter of the present invention is known to control the promoter activity of a specific compound in cells of the cranial nervous system, when the specific compound is administered so as to reach the brain of the living body, the promoter of the specific compound Since the ability to control the activity can be known, the compound activates the promoter of the NGF-2 / NT-3 gene in the brain and NGF-2 / NT- in the brain.
The production amount of 3 can be increased, whereby dementia can be treated.

【0013】上記形質転換体は、該特定の化合物の存在
下に培養し、培養物中の遺伝子産物の量を測定し比較す
ることにより、該化合物のプロモーター活性のコントロ
ール能を知ることができる。
The transformant can be cultured in the presence of the specific compound, and the amount of the gene product in the culture can be measured and compared to determine the ability of the compound to control the promoter activity.

【0014】該形質転換体の培養はそれ自体公知の方法
で行なう。培地としては、たとえば約5〜20%の牛血
清を含むMEM培地〔サイエンス(Science)122,
501(1952)〕,DMEM培地〔ヴィロロジー(Vi
rology)8,396(1959)〕、RPMI 1640
培地〔ザ ジャーナル オブ ジ アメリカン メディ
カル アソシエーション(The Journal of the America
n Medical Association)199,519(196
7)〕、199培地〔プロシージング オブ ザソサイ
エティ フォー ザ バイオロジカル メディスン(Pr
oceeding of theSociety for the Biological Medici
ne)73,1(1950)〕などが挙げられる。pHは約
6〜8であるのが好ましい。培養は通常約30℃〜40
℃で約15〜60時間行い、必要に応じて通気や撹拌を
加える。
Culturing of the transformant is carried out by a method known per se. Examples of the medium include MEM medium containing about 5 to 20% bovine serum [Science 122,
501 (1952)], DMEM medium [Virology (Vi
rology) 8, 396 (1959)], RPMI 1640
Medium [The Journal of the America Medical Association (The Journal of the America
n Medical Association) 199, 519 (196
7)] 199 medium [Procedure of the Society for the Biological Medicine (Pr
oceeding of the Society for the Biological Medici
ne) 73, 1 (1950)] and the like. The pH is preferably about 6-8. Culturing is usually about 30 ° C-40
It is carried out at ℃ for about 15 to 60 hours, and aeration and stirring are added if necessary.

【0015】本願明細書および図面において、塩基やア
ミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC−IUB
Commision on Biochemical Nomenclature による略号
あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。また、アミノ酸に関し光学異性
体がありうる場合は、特に明示しなければL−体を示す
ものとする。 DNA :デオキシリボ核酸 cDNA :相補的デオキシリボ核酸 A :アデニン T :チミン G :グアニン C :シトシン A,Ala :アラニン C,Cys :システイン D,Asp :アスパラギン酸 E,Glu :グルタミン酸 F,Phe :フェニルアラニン G,Gly :グリシン H,His :ヒスチジン I,Ile :イソロイシン K,Lys :リジン L,Leu :ロイシン M,Met :メチオニン N,Asn :アスパラギン P,Pro :プロリン Q,Gln :グルタミン R,Arg :アルギニン S,Ser :セリン T,Thr :スレオニン V,Val :バリン W,Trp :トリプトファン Y,Tyr :チロシン 後述の実施例2で得られた形質転換体 Escherichia col
i DH1/pTB1518および形質転換体 Escherichi
a coli DH1/pTB1534は財団法人発酵研究所
(IFO)および通商産業省工業技術院微生物工業技術
研究所(FRI)にそれぞれ寄託されている。受託日お
よび受託番号を次の表1に示す。
In the present specification and drawings, when abbreviations are used for bases, amino acids, etc., IUPAC-IUB
It is based on the abbreviations by Commision on Biochemical Nomenclature or the abbreviations commonly used in this field, and examples are given below. When amino acids may have optical isomers, the L-form is shown unless otherwise specified. DNA: Deoxyribonucleic acid cDNA: Complementary deoxyribonucleic acid A: Adenine T: Thymine G: Guanine C: Cytosine A, Ala: Alanine C, Cys: Cysteine D, Asp: Aspartic acid E, Glu: Glutamic acid F, Phe: Phenylalanine G, Gly: Glycine H, His: Histidine I, Ile: Isoleucine K, Lys: Lysine L, Leu: Leucine M, Met: Methionine N, Asn: Asparagine P, Pro: Proline Q, Gln: Glutamine R, Arg: Arginine S, Ser: Serine T, Thr: Threonine V, Val: Valine W, Trp: Tryptophan Y, Tyr: Tyrosine The transformant Escherichia col obtained in Example 2 described later.
i DH1 / pTB1518 and transformant Escherichi
a coli DH1 / pTB1534 has been deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) and the Institute for Microbial Technology (FRI), Ministry of International Trade and Industry. The deposit date and deposit number are shown in Table 1 below.

【0016】[0016]

【表1】 [Table 1]

【0017】実施例1 ヒトNGF−2/NT−3ゲノ
ムDNAのクローニング 既報のNGF−2/NT−3 cDNA(Y. Kaisho
ら,フェブス レターズ(FEBS Lett.)266,1
87−191(1990))の塩基番号1から22まで
の 5′−TGCCATGGTTACTTTTGCCA
CG−3′(配列番号3)のオリゴヌクレオチドを合成
し、これをプローブとして、ヒトゲノムDNAライブラ
リー(クロンテック ヒト胎盤ゲノム.DNA由来)
2.3×106個ファージをスクリーニングした。反応
は、5×SSPE(1×SSPE=180mM NaCl,
10mM リン酸ナトリウム,1mM EDTA;pH7.
7),5×Denhalt's solution(1×Denhalt′s solut
ion=0.02% ポリビニルピロリドン,0.02% Fic
oll, 0.02% 牛血清アルブミン),100μg/ml
熱変性サケ精子 DNA,0.1% SDS中42℃16
時間行った。反応後フィルターを6×SSC(1×SS
C=150mM NaCl,15mM sodium citrate)45
℃で30分、更に6×SSC60℃で30分洗浄しフィ
ルターのオートラジオグラムをとりプローブに対して反
応するファージを探した。
Example 1 Cloning of human NGF-2 / NT-3 genomic DNA The previously reported NGF-2 / NT-3 cDNA (Y. Kaisho
FEBS Lett., 266,1
87-191 (1990)) with base numbers 1 to 22 5'-TGCCATGGTTACTTTTTGCCA
An oligonucleotide of CG-3 '(SEQ ID NO: 3) was synthesized, and using this as a probe, a human genomic DNA library (from Clontech human placenta genome.DNA)
2.3 × 10 6 phages were screened. The reaction was 5 × SSPE (1 × SSPE = 180 mM NaCl,
10 mM sodium phosphate, 1 mM EDTA; pH 7.
7), 5 x Denhalt's solution (1 x Denhalt's solut
ion = 0.02% Polyvinylpyrrolidone, 0.02% Fic
oll, 0.02% bovine serum albumin), 100 μg / ml
Heat-denatured salmon sperm DNA, 0.1% in SDS 42 ° C 16
I went on time. After reaction, filter the filter 6 x SSC (1 x SS
C = 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate) 45
After washing at 30 ° C. for 30 minutes and 6 × SSC at 60 ° C. for 30 minutes, an autoradiogram of the filter was taken to search for a phage that reacts with the probe.

【0018】その結果、2.3×106個ファージより1
個の陽性クローンを得ることが出来、サザンブロット
ハイブリダイゼーションによりBamHI−Hind III約
3.0kbpの断片がプローブと交差することが示された。
そこで、このBamHI−HindIII3.0kbp とその上流
約1.0kbpの全塩基配列を決定し、これを〔図1−1〕
〜〔図1−2〕(配列番号4)に示す。すなわち、ここ
で得られたヒトNGF−2/NT−3遺伝子5′上流領
域を含む約4.0kbp の塩基配列を〔図1−1〕〜〔図
1−2〕に示す。〔図1−1〕〜〔図1−2〕に示すよ
うに+210〜+231までがヒトNGF−2/NT−
3 cDNAの塩基配列と完全に一致した。さらにcDN
A5′末端より上流にTATAbox様配列(−32〜−
27)が認められたことにより、この領域付近がヒトN
GF−2/NT−3遺伝子のプロモーター領域であり、
+232より下流はイントロンであることが示された。
As a result, 1 out of 2.3 × 10 6 phages
Southern blot was obtained after obtaining positive clones.
Hybridization showed that a fragment of BamHI-HindIII approximately 3.0 kbp crossed the probe.
Therefore, the entire nucleotide sequence of BamHI-HindIII 3.0 kbp and its upstream region of about 1.0 kbp was determined, and this was determined [Fig. 1-1].
~ [Fig. 1-2] (SEQ ID NO: 4). That is, the nucleotide sequence of about 4.0 kbp containing the 5'upstream region of the human NGF-2 / NT-3 gene obtained here is shown in [Fig. 1-1] to [Fig. 1-2]. As shown in [Fig. 1-1] to [Fig. 1-2], +210 to +231 are human NGF-2 / NT-.
3 It was completely in agreement with the nucleotide sequence of 3 cDNA. Furthermore, cDN
TATAbox-like sequence (-32-
27), it was confirmed that human N
A promoter region of the GF-2 / NT-3 gene,
It was shown that the region downstream from +232 is an intron.

【0019】実施例2 ヒトNGF−2/NT−3遺伝
子のプロモーター活性の検定 クローニングしたゲノムDNA断片がプロモーター活性
をもつことを確認するためにプロモーター活性検査法の
一つであるCATアッセイ法を行った。CATをリポー
ター遺伝子とするプラスミドは、pCAT−Basic plasm
id(プロメガ社製)をベクターとした。陽性コントロー
ルにはpCAT−Control plasmid(プロメガ社製)を用
いた。ヒトNGF−2/NT−3遺伝子の5′上流域お
よび3′末端はTAKARAキロシークエンス用デレー
ションキットを用いて欠失させ、ベクターのCAT遺伝
子上流のHind IIIサイトとXbaIサイトの間に導入し
た。ヒトグリオーマHs683細胞へのプラスミドの感
染は、カルシウムフォスフェイト法(M. Wigler ら、セ
ル(Cell)16,777(1979))を用いた。感染後
1 0%FCS(牛胎仔血清)を含むDMEM培地で培
養し、48時間後に細胞を集めた。その細胞抽出液につ
いてCAT酵素活性を測定した。CAT酵素活性は、細
胞抽出液を5mM アセチル CoA, 0.25μCi 14C−
クロラムフェニコール存在下37℃ 4時間反応させた
後、酢酸エチルで抽出し、酢酸エチルを蒸発乾固させた
後15μl 酢酸エチルに溶解し、その7.5μl を薄層
板(メル ク社製)にスポットした。CHCl3:メタノ
ール=95:1の展開溶媒で展開させた後オートラジオ
グラムをとった。
Example 2 Assay of Promoter Activity of Human NGF-2 / NT-3 Gene In order to confirm that the cloned genomic DNA fragment has promoter activity, a CAT assay method, which is one of the promoter activity test methods, was performed. It was The plasmid having CAT as a reporter gene is pCAT-Basic plasm.
id (manufactured by Promega) was used as a vector. PCAT-Control plasmid (manufactured by Promega) was used as a positive control. The 5'upstream region and 3'end of the human NGF-2 / NT-3 gene were deleted using a TAKARA deletion kit for kilosequencing, and introduced between the Hind III site and the XbaI site upstream of the CAT gene of the vector. . The calcium phosphite method (M. Wigler et al., Cell 16,777 (1979)) was used to infect the human glioma Hs683 cells with the plasmid. After infection, the cells were cultured in DMEM medium containing 10% FCS (fetal calf serum), and cells were collected 48 hours later. The CAT enzyme activity of the cell extract was measured. CAT enzyme activity was measured by adding 5 mM acetyl CoA, 0.25 μCi 14 C- to the cell extract.
After reacting for 4 hours at 37 ° C in the presence of chloramphenicol, the mixture was extracted with ethyl acetate, the ethyl acetate was evaporated to dryness, and the residue was dissolved in 15 µl ethyl acetate. ) Was spotted. After developing with a developing solvent of CHCl 3 : methanol = 95: 1, an autoradiogram was taken.

【0020】まず、〔図1−1〕〜〔図1−2〕におけ
る−3275〜+91までの3.4kbp DNA断片をpC
AT−Basic plasmid に挿入した発現プラスミドpTB
1518を構築した。このプラスミドpTB1518を
保存するため、これを用いて大腸菌DH1を形質転換
し、形質転換体 E. coli DH1/pTB1518(IF
O 15283,FERM BP−3849)を作製し
た。上記プラスミドpTB1518を用いてヒトグリオ
ーマHs683細胞を形質転換し、形質転換体ヒトグリ
オーマHs683/pTB1518を製造した。この形質
転換体を10%FCSを含むDMEM培地で2日間培養
した後、細胞を集め、その細胞抽出液について、Widen.
SGらの方法(ジャーナル オブ バイオロジカル ケミ
ストリー(J. Biol. Chem.),263,16992−1
6998(1988))を用いてアッセイを行なった。結
果を〔図2〕および〔図3〕のレーン1に示す。なお
〔図2〕は用いたプラスミド中に含まれるヒトNGF−
2/NT−3遺伝子の5′−上流領域の範囲を、〔図
3〕はCATアッセイの結果のオートラジオグラムの結
果を示した。〔図3〕に示したように、陽性コントロー
ル(〔図3〕においてレーンPとして示す。)として使
用したSV40初期プロモーターの支配下に発現された
CAT活性と同程度のCAT活性が観察され、このゲノ
ムDNA断片中に機能的なプロモーター活性をもつDN
A断片が存在することが確認された。次に、いわゆるサ
イレンサーエンハンサー等の存在による活性発現制御が
なされているかを知るために種々の欠失型ムテインを構
築し、同様のCATアッセイを行なった。
First, the 3.4 kbp DNA fragment from −3275 to +91 in FIGS. 1-1 to 1-2 was pC.
Expression plasmid pTB inserted into AT-Basic plasmid
1518 was constructed. In order to preserve this plasmid pTB1518, it was used to transform E. coli DH1 and transformant E. coli DH1 / pTB1518 (IF
O 15283, FERM BP-3849). Human glioma Hs683 cells were transformed with the above plasmid pTB1518 to prepare transformant human glioma Hs683 / pTB1518. After this transformant was cultured in DMEM medium containing 10% FCS for 2 days, cells were collected, and the cell extract was collected using Widen.
SG et al. (Journal of Biological Chemistry, 263, 16992-1).
6998 (1988)). The results are shown in lane 1 of FIGS. 2 and 3. Note that [Fig. 2] shows human NGF- contained in the plasmid used.
The range of the 5'-upstream region of the 2 / NT-3 gene is shown, and [Fig. 3] shows the result of the autoradiogram of the result of the CAT assay. As shown in FIG. 3, a CAT activity similar to that expressed under the control of the SV40 early promoter used as a positive control (shown as lane P in FIG. 3) was observed. DN having functional promoter activity in genomic DNA fragment
It was confirmed that the A fragment was present. Next, various deletion type muteins were constructed in order to know whether the expression of activity was controlled by the presence of so-called silencer enhancers and the like, and the same CAT assay was performed.

【0021】結果を〔図2〕および〔図3〕に示す。
〔図2〕および〔図3〕において、レーン1から10は
それぞれpTB1518,pTB1519,pTB152
0,pTB1521,pTB1522,pTB1523,p
TB1524,pTB1525,pTB1526,pTB
1527をそれぞれトランスフェクトした時の結果を示
す。なお、pTB1519は、−2218〜+91まで
の領域を、pTB1520は、−1507〜+91まで
の領域を、pTB1521は、−1312〜+91まで
の領域を、pTB1522は、−1087〜+91まで
の領域を、pTB1523は、−838〜+91までの
領域を、pTB1524は、−498〜+91までの領
域を、pTB1525は、−204〜+91までの領域
を、pTB1526は、−64〜+91までの領域を、p
TB1527は、−39+〜91までの領域を、それぞ
れpCAT−Basic plasmid に導入したベクターであ
る。〔図2〕および〔図3〕に示すように、−39〜+
91より上流側では互いに顕著な差がなくCAT活性が
観察されたのに対して、−39〜+91ではその活性は
非常に低いものであった。以上のことから、ヒトNGF
−2/NT−3遺伝子プロモーター中にははっきりとし
たサイレンサーは存在せず、プロモーターとして機能す
るためには、少なくとも−64〜+91の領域を有する
ことが必要であることが示唆された。
The results are shown in FIGS. 2 and 3.
In FIGS. 2 and 3, lanes 1 to 10 are pTB1518, pTB1519, and pTB152, respectively.
0, pTB1521, pTB1522, pTB1523, p
TB1524, pTB1525, pTB1526, pTB
The results obtained by transfecting each of 1527 are shown. In addition, pTB1519 is a region from −2218 to +91, pTB1520 is a region from −1507 to +91, pTB1521 is a region from −1312 to +91, and pTB1522 is a region from −1087 to +91. pTB1523 is a region from −838 to +91, pTB1524 is a region from −988 to +91, pTB1525 is a region from −204 to +91, and pTB1526 is a region from −64 to +91.
TB1527 is a vector in which the regions from −39+ to 91 are introduced into pCAT-Basic plasmid. As shown in FIGS. 2 and 3, -39 to +
On the upstream side of 91, CAT activities were observed without any significant difference, whereas at -39 to +91, the activity was very low. From the above, human NGF
There was no clear silencer in the -2 / NT-3 gene promoter, suggesting that it must have at least the region -64 to +91 to function as a promoter.

【0022】実施例3 ヒト血しょう由来ARH77細
胞におけるヒトNGF−2/NT−3遺伝子プロモータ
ー活性の検定 ヒトNGF−2/NT−3遺伝子プロモーターの特異性
を調べるためにNGF−2/NT−3遺伝子の発現され
ない細胞を用いて、そのプロモーター活性を測定した。
以下の実験は、ノーザンブロット ハイブリダイゼーシ
ョンにより、NGF−2/NT−3mRNAが検出され
ないことを確認したヒト血しょう由来ARH77細胞を
用いて行った。ARH77細胞へのプラスミドの感染
は、エレクトロポレーション法(石崎ら、細胞工学、
5,557(1986))を用い、0.3kV 500μFの
条件で行った。感染後10%FCSを含むRPMI−1
640培地で培養し、48時間後に細胞を集めた。その
細胞抽出液についてCAT酵素活性を測定した。CAT
をリポーター遺伝子とするプラスミドは、実施例2で用
いたものを使用し、それぞれをトランスフェクトした時
のCATアッセイの結果を〔図4〕に示す。〔図2〕お
よび〔図4〕に示すように、−65より上流側を含むN
GF−2/NT−3プロモーターでは、CAT活性は非
常に弱く、pTB1526(−64〜+91)をトラン
スフェクトした細胞の細胞抽出液のCAT活性のみが明
らかなCAT活性を示した。以上の結果より、−65よ
り上流領域には、NGF−2/NT−3遺伝子の発現を
制御する領域が含まれていることが示唆された。
Example 3 Assay of Human NGF-2 / NT-3 Gene Promoter Activity in Human Plasma-Derived ARH77 Cells To examine the specificity of the human NGF-2 / NT-3 gene promoter, NGF-2 / NT-3. The promoter activity was measured using cells in which the gene was not expressed.
The following experiments were carried out using human plasma-derived ARH77 cells in which it was confirmed that NGF-2 / NT-3 mRNA was not detected by Northern blot hybridization. Infection of ARH77 cells with the plasmid was carried out by electroporation (Ishizaki et al., Cell Engineering,
5, 557 (1986)) and 0.3 kV 500 μF. RPMI-1 containing 10% FCS after infection
The cells were cultured in 640 medium and the cells were collected after 48 hours. The CAT enzyme activity of the cell extract was measured. CAT
The plasmid used in Example 2 was used as the reporter gene, and the results of the CAT assay at the time of transfection are shown in FIG. As shown in FIG. 2 and FIG. 4, N including the upstream side from -65
With the GF-2 / NT-3 promoter, the CAT activity was very weak, and only the CAT activity of the cell extract of pTB1526 (-64 to +91) -transfected cells showed a clear CAT activity. From the above results, it was suggested that the region upstream of -65 contains a region that controls the expression of NGF-2 / NT-3 gene.

【0023】実施例4 ヒトNGF−2プロモーター−
アルカリフォスファターゼ融合プラスミドを導入したヒ
トグリオーマHs683安定株の確立 アルカリフォスファターゼをリポーター遺伝子とするプ
ラスミドの構築は〔図5−1〕および〔図5−2〕に示
した。まず、pGem−4Z/PLAP*489(SEA
P)(J. Berger ら、ジーン(Gene )66,1−10
(1988))のEcoRI−KpnI 2.0kbp断片を単
離し、T4DNAポリメラーゼにより平滑化した後、E
coRIリンカー(pGGAATTCC 宝酒造製)を付
加した断片をベクターpTB389(Y. Onoら、サイエ
ンス(Science) 236,1116−1120(198
7))のEcoRIサイトに導入したpTB1330を構
築した。pTB1330をXhoIで切断後、T4DNA
ポリメラーゼにより平滑化した後、XbaIリンカー(p
CTCTGAGA)を付加し、T4DNAライゲースに
より結合したpTB1331を構築した。次に、実施例
2で得られたpTB1519よりNGF−2プロモータ
ーHindIII−XbaI 2.3kbp断片を単離し、先に構築
したpTB1331のアルカリフォスファターゼ遺伝子
の上流HindIII−XbaIサイトに導入してpTB153
4を構築した。これをE. coli DH1に導入し、Escher
ichia coli DH1/pTB1534(IFO 153
83,FERM BP−4038)を製造した。
Example 4 Human NGF-2 promoter
Establishment of human glioma Hs683 stable strain into which alkaline phosphatase fusion plasmid was introduced Construction of a plasmid using alkaline phosphatase as a reporter gene is shown in [Fig. 5-1] and [Fig. 5-2]. First, pGem-4Z / PLAP * 489 (SEA
P) (J. Berger et al., Gene 66 , 1-10)
(1988)) EcoRI-KpnI 2.0 kbp fragment was isolated and blunted with T4 DNA polymerase.
The fragment added with the coRI linker (pGGAATTCC manufactured by Takara Shuzo) was used as a vector pTB389 (Y. Ono et al., Science 236 , 1116-1120 (198).
7)) was introduced into the EcoRI site to construct pTB1330. After cutting pTB1330 with XhoI, T4DNA
After blunting with a polymerase, XbaI linker (p
(CTCTGAGA) was added to construct pTB1331 bound by T4 DNA ligase. Next, the NGF-2 promoter HindIII-XbaI 2.3 kbp fragment was isolated from pTB1519 obtained in Example 2, and introduced into the upstream HindIII-XbaI site of the alkaline phosphatase gene of pTB1331 constructed above to introduce pTB153.
4 was built. This was introduced into E. coli DH1 and Escher
ichia coli DH1 / pTB1534 (IFO 153
83, FERM BP-4038).

【0024】薬剤耐性マーカーはneo遺伝子を持つp
TB6(R. Sasadaら、セル ストラクチャー アンド フ
ァンクション(Cell Structure and Function)12,
205−217(1987))を用いた。pTB15
34とpTB6とをヒトグリオーマHs683細胞へ同
時に感染させ感染後48 時間後より500μg/mlG
418(O-2-アミノ-2,7-ジオキシ-D-グリセロ-α-D-グ
ルコヘプトピラノシル〔1→4〕-O-3-デオキシ-4C-メチ
ル-3-〔メチルアミン〕-β-L-アラビノシル-D-ストレプ
タミン、シグマ社),10%FCSを含むDMEM培地
で培養し、ネオマイシン耐性株を取得した。取得したネ
オマイシン耐性株より、アルカリフォスファターゼを安
定に発現する1個のクローンを得た。アルカリフォスフ
ァターゼ活性は、p−ニトロフェニルフォスフェートを
基質としA405吸光度の増加として測定した。培養上清
を65℃、5分処理後12000×g 5分遠心した上
清100μlを1×SEAPアッセイバッファー(1.
0M ジエタノールアミン,pH9.8,0.5mM Mg
Cl2,10mM L-ホモアルギニン)に調整し、最終量
を200μlとした。96−穴マイクロタイタープレー
トに入れ、20μlの120mM p−ニトロフェニルフ
ォスフェート(in 1×SEAP assay Buffer)を加えA
405を測定した。アルカリフォスファターゼ1mUは、1
pmole基質を1分間に加水分解するアルカリフォスファ
ターゼの量とし、1mU=0.4△A405/minで示され
る。取得したクローン(Hs683/pTB1534)
について細胞の増殖曲線〔図6〕とアルカリフォスファ
ターゼ活性〔図7〕を示した。
The drug resistance marker is p, which has the neo gene.
TB6 (R. Sasada et al., Cell Structure and Function) 12,
205-217 (1987)). pTB15
Human glioma Hs683 cells were simultaneously infected with 34 and pTB6, and 500 μg / mlG was obtained 48 hours after the infection.
418 (O-2-amino-2,7-dioxy-D-glycero-α-D-glucoheptopyranosyl [1 → 4] -O-3-deoxy-4C-methyl-3- [methylamine]- It was cultured in DMEM medium containing β-L-arabinosyl-D-streptamine, Sigma) and 10% FCS to obtain a neomycin resistant strain. From the obtained neomycin resistant strain, one clone stably expressing alkaline phosphatase was obtained. Alkaline phosphatase activity was measured as an increase in A 405 absorbance using p-nitrophenyl phosphate as a substrate. The culture supernatant was treated at 65 ° C. for 5 minutes and then centrifuged at 12,000 × g for 5 minutes, and 100 μl of the supernatant was added to 1 × SEAP assay buffer (1.
0M diethanolamine, pH 9.8, 0.5 mM Mg
Cl 2 , 10 mM L-homoarginine) and the final volume was 200 μl. Place in a 96-well microtiter plate, add 20 μl of 120 mM p-nitrophenyl phosphate (in 1 × SEAP assay Buffer), and add A
405 was measured. 1 mU of alkaline phosphatase is 1
The amount of alkaline phosphatase that hydrolyzes the pmole substrate in 1 minute is defined as 1 mU = 0.4ΔA 405 / min. Obtained clone (Hs683 / pTB1534)
The cell growth curve [Fig. 6] and alkaline phosphatase activity [Fig. 7] are shown.

【0025】[0025]

【発明の効果】本発明のNGF−2/NT−3のプロモ
ーターは、機能分化のための神経特異的蛋白質の発現制
御機構を解析する材料として有用である。また、種々の
遺伝子をこのプロモーターの下流に連結させて細胞ある
いは動物に移入することにより、それらを細胞あるいは
動物の神経系、脳で特定の時期に特異的に発現させ、薬
剤スクリーニング系の設定、疾患モデル動物の作製、生
体の疾患の治療などができるが、その際用いられるベク
ターに組込むプロモーターとして使用できる。
INDUSTRIAL APPLICABILITY The NGF-2 / NT-3 promoter of the present invention is useful as a material for analyzing the mechanism of controlling the expression of nerve-specific proteins for functional differentiation. In addition, by linking various genes downstream of this promoter and transferring them into cells or animals, they are expressed specifically in the nervous system of the cells or animals, at a specific time in the brain, and the setting of a drug screening system, It can be used as a promoter to be incorporated into a vector used in the preparation of disease model animals and treatment of biological diseases.

【0026】[0026]

【0027】[0027]

【配列表】[Sequence list]

配列番号:1 配列の長さ:64 配列の型:核酸 配列: TGAGCGCGGA GCCATCTGGC CGGGTTGGCT GGTTATAACC GCGCAGATTC TGTTCACGGG 60 ACTC 64。 SEQ ID NO: 1 Sequence length: 64 Sequence type: Nucleic acid Sequence: TGAGCGCGGA GCCATCTGGC CGGGTTGGCT GGTTATAACC GCGCAGATTC TGTTCACGGG 60 ACTC 64.

【0028】配列番号:2 配列の長さ:204 配列の型:核酸 配列: AAGAGGGGCC AGGAGAAATG ACCCCTTCCC CGCCACGGGT CCCGAAGTGA GGGCGGGGGG 60 GGGGCTCTGG GGCGCGGGCG CGCGCGGCGC GGCGCGGGCC GGCGGGGGAG GGCGGCGCGG 120 CGCGGAAGGG GTTAAGGCGC TGAGCGCGGA GCCATCTGGC CGGGTTGGCT GGTTATAACC 180 GCGCAGATTC TGTTCACGGG ACTC 204。SEQ ID NO: 2 Sequence length: 204 Sequence type: Nucleic acid Sequence: AAGAGGGGCC AGGAGAAATG ACCCCTTCCC CGCCACGGGT CCCGAAGTGA GGGCGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCTGG GGCGCGGGCG CGCGGGCGGC GGCGCGGTCG

【0029】配列番号:3 配列の長さ:22 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列: TGCCATGGTT ACTTTTGCCA CG 22。SEQ ID NO: 3 Sequence Length: 22 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Other Nucleic Acid Synthetic DNA Sequence: TGCCATGGTT ACTTTTGCCA CG 22.

【0030】配列番号:4 配列の長さ:3821 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:ヒト 配列の特徴 特徴を示す記号:CDS 存在位置:3276..3821 特徴を決定した方法:S 特徴を示す記号:intron 存在位置:3507..3821 特徴を決定した方法:S 配列: GAGCTCAAAC ATAGGGAGAT AAGTGCTGTT TTCACAAGAT AAAGGCAAAA TTCAATCCCA 60 CGTTGCCGTT TTGTTTCTGT TCAGTGTTCC AACCACAGAG TGGTGCTATT GCAAAAGATA 120 AGGGTAACCA GAAGGCACGC TCTGGAAATT TGCTTTAGGA GAGAGTTTTA AAGGGGGTTT 180 TCAAAAACAA GATCTGATTC CTGCTCTCAG AAATCACTTC CAGGAGTCAG GGCCTTACTC 240 TCAGATGCAG CAGGGAGAAG AAGAAAGTTC AGCAACCTAA AAATACAGTC GACAGATGGG 300 CAGCCAAAGT CATGGCCACG AAGTCAACTT GGAGAGGAGC ACCTACCTAG TGAATCCTAA 360 AAGATCTCAT CCTGGATGCT TCCTTAACCA GGCCTATGTA CAGGGCACAA GCTCGCAGCC 420 AGCTTACTTT CCAGTCCTGA TCTTTGCTTT TGCTATCCAT ACCAATGGTA TTTCTATAGA 480 AAAGAAAAAT CTCTATTTAG AAACACGGAT TTACTTAGAA GTCACAATAT TCTAGTTTAA 540 AAATGGCTCT ACATAGTAGA GAATGATCTT TTTATTCTGT CTTCTTAAAA ATACACCTTT 600 CTAATTCTTT TTTTCTTCCC ACCTTCTTCA TTCAGCACCT TGCCACTCCC TTGGAAGCCA 660 CAACAGCGAG CTGGGGGGTC AGTCCCTAGT CTTAGAGGGA AGAAATCTTT AGGTCTGAAG 720 TCTAAAGAAA AACAGTAAAG GAAAAGGCAG TTGGCGGTGC TCAAGGTAGA CTGTCTGAAA 780 GAGGTCTTCT ACTCAGAAAA GGGCTAAGGC TCTCCCTTTG GGAAACCAAT CCTTCTGAGA 840 AAAAGTGCAT CTTTCACCCT CTGCTCCTGT CTGGGTCTCT CCCTCTTCCT CCCTCCTTCC 900 CTCAGTCCCT CCTCCCCTCT CTCCACAAAG ACACAGCACA TATTTGGCAA GATTAAGGTG 960 TCACCTCTCA TATTACAAGG CCTGTTGATT GCAAGCAAAG ACAGACCCAC CAGCTTAGGA 1020 CAAAACCCCT TGGAGTTGGA AATAAGACAA ACTCTGGGAT CCCCGAAAGT CCCGGCAAAA 1080 TGACGCGGCC AGCCAGTGCA AGGCATCTGC AGAACAAATC CAAGTCCTAA ACGCACTGCT 1140 TGCTGCCTTT TCTTCTCCTT CCTTTCTTCT GATTTTTCAA GTTTGTTTGC CCCCCTTCCC 1200 CTCCTCCCTC CAGACTGCCA GGGACCTGGG AGCTGCCTGC AGATCAGCCC GCACATGTAT 1260 TTAACCCCTT CCCTGCTGCA GCAGGAGCCA ACCACCTCTT TCCTTGCAAT CTTCAGGTTC 1320 CCAGAGGACC TGGAGCTTGA GAAAAGAACT CTGCCAGTGG ATCTGAAACT GGGGCCTGAA 1380 TCCCTCCTTT GACCAGGGCG AGAAGCTGGA GGAGGGGGGC AAGTGCGGGA AGTGGGGGAG 1440 GGCAGGGAGG CGGGCCAGAT GAGAGGGAGA AAAGCAGAAC CCGACAGAGC ACGCCCAATC 1500 CAAACCTTCA TGGTGCTGTG TGGCTGGGTG GAGGGAACGA CTCGGCAGCC TCTTCTGGCC 1560 CTGAGGAAGA CGTCGATATT TTGGCACGAG GGGAGCCACT GAAGGACTAC CCTACCCTTG 1620 CGAGGGACCG CAGGAGGTGA CGCCCCTGGG CCTCGGTGGG CGCTTCTGGC GGTTTTCGAT 1680 GTGGCAACCC CCATCAGCCA GGATAATGAT GAGGCAGGTA CAATCTATCT AGTACGCAGC 1740 CCCCAGACTC CCCCCTCCCT TCCCACCTCC CCATCCAACC CCCCAGCTAC TCTCTGCGGC 1800 CGGTTGGTCC TGAACTGGTG GGTGCAGTTC CGATGTTTAA CCAAATTCTC AAGCAATTTC 1860 AAGGTATTTG GATTTTTTGA ACCTGGGCCC TAACCGAAAC GCGGAACGGC TTGCTTATTA 1920 GACACCTCGA ACGACAGCGC AGGGAGGAAA CGGGATACTC GCTGCCCTTC CCAGTCGCGC 1980 GTGAGTCAAA AGGTCCTGGC AGGAGATGAT GTGAGGAGCG GCTGAAGTGG CAGGGAGCAA 2040 GGGATGAGGG GCTTGGAGCG GAGGTCCACC ACGCAAGGAC TCGGGAAGCG GGCAAGTGGG 2100 CAAAACTCTG CTTCCGGGCT CTCGATTTCT CGTTGATCAC TAAGTGGTAT TTTTCCCCCT 2160 TCTCTCGATG GCAAATGGGC GAAATCAAGA TGACTTAACT TGGTAAATTT AGAGAGAACG 2220 GCTCGGAGCA AGTGAGGTCT AACGGGCAGC TAAAATTATC TCCAAATAAG AGATTTTGAC 2280 CCCCTCCCCC TATCCTCTCC TCGAATGTAT CCACCGGTGG GGAAGTGAGC GTCATTACTT 2340 TCGGGGCGCC ACGACAGGTT TGTTTGTTGC TCGCCTTTCC TGCTTCTCGC GCTGTCCCCG 2400 CGTGCAGACT GGTGGGTGCT GGGCGAGTGA TTAGCTGCAG GGCCCCATCC TAGTTTGGAA 2460 GGAAGGGGTT TAGAAGTTGG AGGATGGGTG AAATGGGAGG CTGCGATCCA TCTCCCTCTC 2520 CCTTCCACAC TCAAGCTCCC GCAAACACGC GCGCGCACAC ACAGCCCCTC CCTAGTCCCT 2580 CGGACCACCC GCCCCCACGC CCCTCTACCT TGACCTCCCT TGACCGCCGA CACAGCGTCC 2640 TGGGTGCGGG TCCCCGGGAG CGGGGAGTTC GCCGGGGAGC GATTGTCCTT GGGCGTGTTC 2700 GTGCTGTGGG GTGGGGGGAG GAGTGGCGGG TGGGCTTGGT AGGGGGTGGG GAGAGATCTG 2760 GAGCTGGAAG GGTCTAAGGT TTGGAGGAGG AGTTTACCCC TCAGACCTGA TCCTCCTGAC 2820 CAAAAAGGCA GGAAAAGGCC CTGATGCCTT GTAAAGAAAA TCTTGAAAGA AAAAAGATCA 2880 AAAAGAAAAA TTTCAAGAAA AAGAACCACT AAGAAAGGCT GAAGACACTA ACATGTAACC 2940 TGTTACGATA CATTTAACGT TTCGTTTTTT CCTGGATCTC TAAAAGGGAA CTCAAGGGTG 3000 GGGGTTACTG AAGAATACTA CAGATTTGGA AGTTTTTGTT GCTGTTGTTG TTTGGTTTGG 3060 TTTTGTTTTT CAAGAGGGGC CAGGAGAAAT GACCCCTTCC CCGCCACGGG TCCCGAAGTG 3120 AGGGCGGGGG GGGGGCTCTG GGGCGCGGGC GCGCGCGGCG CGGCGCGGGC CGGCGGGGGA 3180 GGGCGGCGCG GCGCGGAAGG GGTTAAGGCG CTGAGCGCGG AGCCATCTGG CCGGGTTGGC 3240 TGGTTATAAC CGCGCAGATT CTGTTCACGG GACTCAGAGT TGAAGCTCCT CTCCCTTCCG 3300 AACACGTCCG CGCACCGCCC CGCGACGCAG CCCGGCGCAA CTACTTTCTT CTCTCTCCTT 3360 TCTTTCTTCC TCTCCTTTTT CCCCTGCTGG GTAGTGGCTG CGGCGGGGTG GGGGAGACTT 3420 TGAATGACCG AGCTCGCGTC CACCTTTCTC TTCATGTCGA CGTCCCTGGA AACGGCCACA 3480 CGGATGCCAT GGTTACTTTT GCCACGgtaa ggggaggcgg cgggcacctt gggtgggcag 3540 gtttggggat gggggtccac gtggggaggg attttccagt ggactggtgc ggggggcccc 3600 agatccgcat cccgccccac ccccatcgcg ccgcgctcac tcactttccc gggcttgtgt 3660 cttccccaaa gtttgcgctg ggatctgctc aggccgaagc gcaaccgcag ccaccccgct 3720 acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acagacacgg acacccttct 3780 ccacctcctc ccctcttgtc cctcggctgc ccaagaagct t 3821。SEQ ID NO: 4 Sequence length: 3821 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double-strand Topology: Linear Sequence type: Genomic DNA Origin organism name: Human Sequence features Characteristic symbol: CDS Location: 3276..3821 Characteristic determination method: S Characteristic symbol: intron Location: 3507..3821 Characteristic determination method: S Sequence: GAGCTCAAAC ATAGGGAGAT AAGTGCTGTT TTCACAAGAT AAAGGCAAAA TTCAATCCCATG 60AG AGGGTAACCA GAAGGCACGC TCTGGAAATT TGCTTTAGGA GAGAGTTTTA AAGGGGGTTT 180 TCAAAAACAA GATCTGATTC CTGCTCTCAG AAATCACTTC CAGGAGTCAG GGCCTTACTC 240 TCAGATGCAG CAGGGAGAAG AAGAAAGTTC AGCAACCTAA AAATACAGTC GACAGATGGG 300 CAGCCAAAGT CATGGCCACG AAGTCAACTT GGAGAGGAGC ACCTACCTAG TGAATCCTAA 360 AAGATCTCAT CCTGGATGCT TCCTTAACCA GGCCTATGTA CAGGGCACAA GCTCGCAGCC 420 AGCTTACTTT CCAGTCCTGA TCTTTGCTTT TGCTATCCAT ACCAATGGTA TTTCTATAGA 480 AAAGAAAAAT CTCTATTTA G AAACACGGAT TTACTTAGAA GTCACAATAT TCTAGTTTAA 540 AAATGGCTCT ACATAGTAGA GAATGATCTT TTTATTCTGT CTTCTTAAAA ATACACCTTT 600 CTAATTCTTT TTTTCTTCCC ACCTTCTTCA TTCAGCACCT TGCCACTCCC TTGGAAGCCA 660 CAACAGCGAG CTGGGGGGTC AGTCCCTAGT CTTAGAGGGA AGAAATCTTT AGGTCTGAAG 720 TCTAAAGAAA AACAGTAAAG GAAAAGGCAG TTGGCGGTGC TCAAGGTAGA CTGTCTGAAA 780 GAGGTCTTCT ACTCAGAAAA GGGCTAAGGC TCTCCCTTTG GGAAACCAAT CCTTCTGAGA 840 AAAAGTGCAT CTTTCACCCT CTGCTCCTGT CTGGGTCTCT CCCTCTTCCT CCCTCCTTCC 900 CTCAGTCCCT CCTCCCCTCT CTCCACAAAG ACACAGCACA TATTTGGCAA GATTAAGGTG 960 TCACCTCTCA TATTACAAGG CCTGTTGATT GCAAGCAAAG ACAGACCCAC CAGCTTAGGA 1020 CAAAACCCCT TGGAGTTGGA AATAAGACAA ACTCTGGGAT CCCCGAAAGT CCCGGCAAAA 1080 TGACGCGGCC AGCCAGTGCA AGGCATCTGC AGAACAAATC CAAGTCCTAA ACGCACTGCT 1140 TGCTGCCTTT TCTTCTCCTT CCTTTCTTCT GATTTTTCAA GTTTGTTTGC CCCCCTTCCC 1200 CTCCTCCCTC CAGACTGCCA GGGACCTGGG AGCTGCCTGC AGATCAGCCC GCACATGTAT 1260 TTAACCCCTT CCCTGCTGCA GCAGGAGCCA ACCACCTCTT TCCTTGCAAT CTTCAGGTTC 1320 CCAGAGGACC TGGAGCTTGA GAAAAGAACT C TGCCAGTGG ATCTGAAACT GGGGCCTGAA 1380 TCCCTCCTTT GACCAGGGCG AGAAGCTGGA GGAGGGGGGC AAGTGCGGGA AGTGGGGGAG 1440 GGCAGGGAGG CGGGCCAGAT GAGAGGGAGA AAAGCAGAAC CCGACAGAGC ACGCCCAATC 1500 CAAACCTTCA TGGTGCTGTG TGGCTGGGTG GAGGGAACGA CTCGGCAGCC TCTTCTGGCC 1560 CTGAGGAAGA CGTCGATATT TTGGCACGAG GGGAGCCACT GAAGGACTAC CCTACCCTTG 1620 CGAGGGACCG CAGGAGGTGA CGCCCCTGGG CCTCGGTGGG CGCTTCTGGC GGTTTTCGAT 1680 GTGGCAACCC CCATCAGCCA GGATAATGAT GAGGCAGGTA CAATCTATCT AGTACGCAGC 1740 CCCCAGACTC CCCCCTCCCT TCCCACCTCC CCATCCAACC CCCCAGCTAC TCTCTGCGGC 1800 CGGTTGGTCC TGAACTGGTG GGTGCAGTTC CGATGTTTAA CCAAATTCTC AAGCAATTTC 1860 AAGGTATTTG GATTTTTTGA ACCTGGGCCC TAACCGAAAC GCGGAACGGC TTGCTTATTA 1920 GACACCTCGA ACGACAGCGC AGGGAGGAAA CGGGATACTC GCTGCCCTTC CCAGTCGCGC 1980 GTGAGTCAAA AGGTCCTGGC AGGAGATGAT GTGAGGAGCG GCTGAAGTGG CAGGGAGCAA 2040 GGGATGAGGG GCTTGGAGCG GAGGTCCACC ACGCAAGGAC TCGGGAAGCG GGCAAGTGGG 2100 CAAAACTCTG CTTCCGGGCT CTCGATTTCT CGTTGATCAC TAAGTGGTAT TTTTCCCCCT 2160 TCTCTCGATG GCAAATGGGC GAAATCAAGA TGACTTA ACT TGGTAAATTT AGAGAGAACG 2220 GCTCGGAGCA AGTGAGGTCT AACGGGCAGC TAAAATTATC TCCAAATAAG AGATTTTGAC 2280 CCCCTCCCCC TATCCTCTCC TCGAATGTAT CCACCGGTGG GGAAGTGAGC GTCATTACTT 2340 TCGGGGCGCC ACGACAGGTT TGTTTGTTGC TCGCCTTTCC TGCTTCTCGC GCTGTCCCCG 2400 CGTGCAGACT GGTGGGTGCT GGGCGAGTGA TTAGCTGCAG GGCCCCATCC TAGTTTGGAA 2460 GGAAGGGGTT TAGAAGTTGG AGGATGGGTG AAATGGGAGG CTGCGATCCA TCTCCCTCTC 2520 CCTTCCACAC TCAAGCTCCC GCAAACACGC GCGCGCACAC ACAGCCCCTC CCTAGTCCCT 2580 CGGACCACCC GCCCCCACGC CCCTCTACCT TGACCTCCCT TGACCGCCGA CACAGCGTCC 2640 TGGGTGCGGG TCCCCGGGAG CGGGGAGTTC GCCGGGGAGC GATTGTCCTT GGGCGTGTTC 2700 GTGCTGTGGG GTGGGGGGAG GAGTGGCGGG TGGGCTTGGT AGGGGGTGGG GAGAGATCTG 2760 GAGCTGGAAG GGTCTAAGGT TTGGAGGAGG AGTTTACCCC TCAGACCTGA TCCTCCTGAC 2820 CAAAAAGGCA GGAAAAGGCC CTGATGCCTT GTAAAGAAAA TCTTGAAAGA AAAAAGATCA 2880 AAAAGAAAAA TTTCAAGAAA AAGAACCACT AAGAAAGGCT GAAGACACTA ACATGTAACC 2940 TGTTACGATA CATTTAACGT TTCGTTTTTT CCTGGATCTC TAAAAGGGAA CTCAAGGGTG 3000 GGGGTTACTG AAGAATACTA CAGATTTGGA AGTTTTTGTT GC TGTTGTTG TTTGGTTTGG 3060 TTTTGTTTTT CAAGAGGGGC CAGGAGAAAT GACCCCTTCC CCGCCACGGG TCCCGAAGTG 3120 AGGGCGGGGG GGGGGCTCTG GGGCGCGGGC GCGCGCGGCG CGGCGCGGGC CGGCGGGGGA 3180 GGGCGGCGCG GCGCGGAAGG GGTTAAGGCG CTGAGCGCGG AGCCATCTGG CCGGGTTGGC 3240 TGGTTATAAC CGCGCAGATT CTGTTCACGG GACTCAGAGT TGAAGCTCCT CTCCCTTCCG 3300 AACACGTCCG CGCACCGCCC CGCGACGCAG CCCGGCGCAA CTACTTTCTT CTCTCTCCTT 3360 TCTTTCTTCC TCTCCTTTTT CCCCTGCTGG GTAGTGGCTG CGGCGGGGTG GGGGAGACTT 3420 TGAATGACCG AGCTCGCGTC CACCTTTCTC TTCATGTCGA CGTCCCTGGA AACGGCCACA 3480 CGGATGCCAT GGTTACTTTT GCCACGgtaa ggggaggcgg cgggcacctt gggtgggcag 3540 gtttggggat gggggtccac gtggggaggg attttccagt ggactggtgc ggggggcccc 3600 agatccgcat cccgccccac ccccatcgcg ccgcgctcac tcactttccc gggcttgtgt 3660 cttccccaaa gtttgcgctg ggatctgctc aggccgaagc gcaaccgcag ccaccccgct 3720 acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acagacacgg acacccttct 3780 ccacctcctc ccctcttgtc cctcggctgc ccaagaagct t 3821.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図1−1】実施例1で得られたヒトNGF−2/NT
−3遺伝子5′上流領域を含む−3275〜+546ま
での塩基配列を示す。
FIG. 1-1 Human NGF-2 / NT obtained in Example 1
-3 shows the nucleotide sequence from -3275 to +546 including the 5'upstream region of gene.

【図1−2】実施例1で得られたヒトNGF−2/NT
−3遺伝子5′上流領域を含む−3275〜+546ま
での塩基配列を示す。
1-2: Human NGF-2 / NT obtained in Example 1
-3 shows the nucleotide sequence from -3275 to +546 including the 5'upstream region of gene.

【図2】実施例2で用いたプラスミド中に含まれるヒト
NGF−2/NT−3遺伝子の5′上流領域の範囲を示
す。
FIG. 2 shows the range of 5 ′ upstream region of human NGF-2 / NT-3 gene contained in the plasmid used in Example 2.

【図3】実施例2で得られた、CATアッセイの結果の
オートラジオグラムを示す。
FIG. 3 shows an autoradiogram of the CAT assay results obtained in Example 2.

【図4】実施例3で得られた、CATアッセイの結果の
オートラジオグラムを示す。
FIG. 4 shows an autoradiogram of the results of the CAT assay obtained in Example 3.

【図5−1】実施例4で得られた、プラスミドpTB1
534の構築図を示す。
FIG. 5-1: Plasmid pTB1 obtained in Example 4
A constructional diagram of 534 is shown.

【図5−2】実施例4で得られた、プラスミドpTB1
534の構築図を示す。
FIG. 5-2: Plasmid pTB1 obtained in Example 4
A constructional diagram of 534 is shown.

【図6】実施例4で得られた、細胞増殖曲線を示す。FIG. 6 shows a cell growth curve obtained in Example 4.

【図7】実施例4で得られた、アルカリフォスファター
ゼ活性を示すグラフである。
FIG. 7 is a graph showing the alkaline phosphatase activity obtained in Example 4.

Claims (10)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項1】ヒト神経成長因子2のプロモーター領域を
含有するDNA。
1. A DNA containing a human nerve growth factor 2 promoter region.
【請求項2】ヒト神経成長因子2のプロモーター領域を
含有する組換えDNA。
2. A recombinant DNA containing a human nerve growth factor 2 promoter region.
【請求項3】プロモーター領域が、塩基配列 TGAGCGCGGA GCCATCTGGC CGGGTTGGCT GGTTATAACC GCGCAGATTC TGTTCACGGG ACTC を含有あるいはその一部を含有する請求項2記載の組換
えDNA。
3. The recombinant DNA according to claim 2, wherein the promoter region contains the base sequence TGAGCGCGGA GCCATCTGGC CGGGTTGGCT GGTTATAACC GCGCAGATTC TGTTCACGGG ACTC or a part thereof.
【請求項4】プロモーター領域が、塩基配列 AAGAGGGGCC AGGAGAAATG ACCCCTTCCC CGCCACGGGT CCCGAAGTGA GGGCGGGGGG GGGGCTCTGG GGCGCGGGCG CGCGCGGCGC GGCGCGGGCC GGCGGGGGAG GGCGGCGCGG CGCGGAAGGG GTTAAGGCGC TGAGCGCGGA GCCATCTGGC CGGGTTGGCT GGTTATAACC GCGCAGATTC TGTTCACGGG ACTC を含有あるいはその一部を含有する請求項2記載の組換
えDNA。
4. A promoter region, the nucleotide sequence AAGAGGGGCC AGGAGAAATG ACCCCTTCCC CGCCACGGGT CCCGAAGTGA GGGCGGGGGG GGGGCTCTGG GGCGCGGGCG CGCGCGGCGC GGCGCGGGCC GGCGGGGGAG GGCGGCGCGG CGCGGAAGGG GTTAAGGCGC TGAGCGCGGA GCCATCTGGC CGGGTTGGCT GGTTATAACC GCGCAGATTC TGTTCACGGG ACTC the content or recombinant DNA according to claim 2, wherein the containing portion thereof.
【請求項5】請求項1または2記載のDNAを含有する
組換えベクター。
5. A recombinant vector containing the DNA according to claim 1 or 2.
【請求項6】下流に構造遺伝子を連結している請求項5
記載の組換えベクター。
6. A structural gene is linked downstream.
The recombinant vector described.
【請求項7】構造遺伝子が神経栄養因子である請求項6
記載の組換えベクター。
7. The structural gene is a neurotrophic factor.
The recombinant vector described.
【請求項8】構造遺伝子がレポーター遺伝子である請求
項6記載の組換えベクター。
8. The recombinant vector according to claim 6, wherein the structural gene is a reporter gene.
【請求項9】請求項6記載の組換えベクターを保持する
形質転換体。
9. A transformant carrying the recombinant vector according to claim 6.
【請求項10】宿主が動物細胞である請求項9記載の形
質転換体。
10. The transformant according to claim 9, wherein the host is an animal cell.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009513106A (en) * 2003-07-08 2009-04-02 アキシオジェネシス エージー Secreted proteins as markers for cell differentiation

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