JPH06141868A - 熱帯熱マラリア原虫の血液段階における抗原、その製造および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 マラリアに対するヒトの防御免疫を生じさせ
る抗原を提供する。 【構成】 ＧＢＰ１３０グリコホリン結合タンパク質の
ＤＮＡ配列と相同性が高いＧＢＰ１３０ｈタンパク質を
コードするＤＮＡ配列またはその部分。上記のＤＮＡ配
列とハイブリッド形成し且つタンパク質ＧＢＰ１３０ｈ
をコードするＤＮＡ配列。これらのＤＮＡ配列によって
コードされるタンパク質ＧＢＰ１３０ｈまたはタンパク
質。上記のＤＮＡ配列で宿主生物を形質転換し、宿主生
物を培養し発現させた後にタンパク質を単離することを
特徴とする、ＧＢＰ１３０ｈの製造法。上記のＤＮＡ配
列によってコードされるタンパク質ＧＢＰ１３０ｈまた
はタンパク質を含む医薬品、好ましくはワクチン。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ＧＢＰ１３０と呼ばれるグリコ
ホリン結合タンパク質のＤＮＡ配列と相同性が高くそれ
故ＧＢＰ１３０ｈと命名されているタンパク質のＤＮＡ
配列に関する。本発明は、Plasmodium falciparum （熱
帯熱マラリア原虫）自身に由来するタンパク質ＧＢＰ１
３０ｈおよび組換えＤＮＡ技術によるその製造法にも関
する。最後に、本発明は、Plasmodium falciparum 由来
するタンパク質ＧＢＰ１３０ｈのマラリアワクチンの製
造のための使用に関する。

【０００２】ヒトのマラリアの原因である原生動物Plas
modium falciparum は、胞子虫(Sporozoa)門に属する血
液寄生虫である。ヒトからヒトへの伝染は、もっぱらハ
マダラカ(Anopheles) 属の蚊（実際には雌のみ）によっ
て行われ、刺したときに血液と共に寄生虫を放出または
取り入れるのである。蚊に刺されて感染した後２週間ま
では、寄生虫は赤血球中に住みついている。赤血球中
で、寄生虫はアメーバ様形態を呈し、速やかに成長し、
多核性になった後、対応する数の（メロゾイトと呼ばれ
る）娘個体に分割し、これが血球の崩壊によって放出さ
れて、直ちに新たな血球を攻撃する。この再生工程は
「シゾゴニー」と呼ばれ、約２４〜４８時間を要する。
これは、寄生虫（シゾント）の数が大きくなって、宿主
の本体が赤血球およびシゾント体の残りの有毒な代謝お
よび崩壊生成物に対する熱病の攻撃と反応するほどにな
るまで反復し、常に新しく開始する。

【０００３】一定の時間の後、性的形態（配偶子生殖）
の形成が最初に赤血球の内部で始まるが、蚊の腸でのみ
完了することができる。最後に、蚊で形成する性的形態
の受精の後に、性的形態は「スポロゾイト」と呼ばれる
ものに成長し、これが体腔から蚊の唾液腺に移動して、
蚊の抗凝固性唾液と共に刺されたヒトの血液循環中に注
入される。これによってPlasmodium falciparum の世代
サイクルが完結する。

【０００４】Plasmodium falciparum によって引き起こ
される熱帯性マラリアの潜伏期間は７〜１５日であり、
平均して１２日である。熱帯性マラリアは、極めて重篤
で且つ極めて危険な形態のマラリアである。更に、それ
は他の形態に比較して変則的な形態の病気であってそれ
故直ちにマラリアであるとは判らないものとなることが
多い。前駆症状は三日熱および四日熱マラリアよりも一
層顕著であり且つ互いに一層速やかに現れる。体温の上
昇が突然起こり、熱の経過は不規則である。熱帯性マラ
リアでの総ての全身性症状は、他の形態でのものよりか
なり重い。寄生虫血症は、この病気の経過中に急速に増
加する。極端な場合には、赤血球の２０〜３０％が冒さ
れる。治療を行わなければ、臨床的状況は生命の危険の
あるものにまで急速に進展し、肝腫、意識障害、溶血性
貧血および白血球増加をもたらす。

【０００５】１９５６年以来、国際連合の世界保険機構
は世界的なマラリア抑制運動を組織し、この運動はある
程度大きな成功を納めているが、大きな失敗もあった。
世界保険機構の努力によって、世界の人口についてはマ
ラリアの発生に関する問題がいかに重要であるかが明ら
かになっている。マラリアの抑制は、大部分が２つの方
法、すなわちPlasmodium falciparum （ハマダラカ）の
ベクターおよび宿主の抑制およびもう一方ではマラリア
に感染した人々または高い感染の危険性へ自身を暴露し
なければならない人々を治療するための薬品の開発であ
る。ＤＤＴのような化学薬品によるハマダラカの抑制
は、蚊が比較的短期間のうちに化学的抑制剤に対して耐
性を獲得してしまうので部分的な成功を納めたにすぎな
かった。

【０００６】Plasmodium falciparum および他のプラス
モディウム(Plasmodium)属の予防および抑制のために様
々な種類の薬品が開発されたときにも、同様な耐性の問
題が持ち上がった。人体に存在するプラスモディウムの
総ての成長段階が、同一の薬品に感応するとは限らな
い。それ故、薬品をその機構作用に基づいて各種の群に
分割する必要がある。 プラスモディウムの各種の成長段階に対する抗マラリア剤の作用 薬品 無性血液 組織形成 生殖母細胞 スポロゾイト 段階 キニン ＋＋ − ＋ − (P. vivax, P. malariae) ４−アミノキノリン ＋＋ − （＋） − 葉酸拮抗薬 ＋ ＋ ＋ − ８−アミノキノリン ± ＋＋ ＋ − スルホンアミド ＋ ？ ＋ − ９−キノリンメタノ ＋＋ ？ ＋ − ール（メフロキン） ラリアム^Ｒ

【０００７】予防法も同様に、一方では蚊の抑制から成
り、他方では化学的予防から成っている。治療に用いら
れる総ての薬品は、化学的予防に用いることができる。

【０００８】しかしながら、時間が経過すると、プラス
モディウムによる総ての試用したおよび試験した薬品に
対する耐性の徴候が現れてきた。薬品による治療または
予防のもう一つの不利な点は、用いられる化合物によっ
て人体に生じる相当な程度の副作用である。マラリアか
らかなり良好に保護するようにするには、プラスモディ
ウムに感染した蚊と接触する前後数週間程度は予防を行
わなければならないということも同様に不利な点であ
る。

【０００９】これが、マラリアを抑制するためのもう一
つの可能性について世界的に論議されるようになってい
る理由である。これが、マラリア病原体に対するワクチ
ンのアイディアである。それ故、Plasmodium falciparu
m の無性血液段階に対するワクチンの開発に好適な抗原
の同定を目指して、かなりの研究が行われてきた。メロ
ゾイトまたは感染した赤血球の表面における抗原の位置
は一つの可能性と考えられる。キャリヤーまたはレセプ
ターとして働くことができ（「細胞粘着(cytoadherenc
e) 」「ロゼッティング(rosetting) 」）、感染した宿
主細胞の表面に配置された寄生虫によってコードされる
抗原に対する遺伝子情報は、今日までのところ見出され
ていない。これとは対照的に、メロゾイト表面に配置さ
れた抗原（ＭＳＡ Ｉ，ＭＳＡ ＩＩ）は、既に単離さ
れ、詳細に記載されている(1) 。

【００１０】メロゾイト表面に配置されたもう一つの抗
原は、グリコホリンに結合する(2）。グリコホリンは、
赤血球の表面にある唾液糖タンパク質である。メロゾイ
トの表面に配置されているグリコホリン結合タンパク質
（ＧＢＰ１３０）によって、部分的にはメロゾイトによ
り赤血球が認識され、未だ未知のままの方法で赤血球中
へのメロゾイトの侵襲を抑制するものと思われる(2) 。
ＧＢＰ１３０は熱に安定で且つ可溶性のタンパク質であ
り、栄養型およびシゾント段階で合成される。これは赤
血球の細胞質中に輸送される(3, 4, 5) 。ＧＢＰ１３０
は、インビトロではシゾントが放出される時点で培養上
澄液に放出される。尚、ＧＢＰ１３０の極めて僅かの画
分のみがメロゾイトと弱く結合したままでいることが示
されている(3, 5)。この代わりに、ＧＢＰ１３０は、放
出の後に赤血球膜、具体的にはグリコホリンに結合する
と思われる(2) 。

【００１１】ＧＢＰ１３０に特異性を有する抗体は、イ
ンビトロで赤血球中でのメロゾイトの侵襲を抑制するこ
とができる(6) 。ＧＢＰ１３０は、耐熱性を有する９６
ｋＤａ抗原として、別のグループ(5) によっても記載さ
れている。ＧＢＰ１３０は、薬品によって抑制された感
染によって免疫されたサイミリサル(saimiri monkeys)
から得られた抗血清によって認識される。これらの血清
は、サルからサルへの受動的転移の後の保護を促進する
(7, 8)。ＧＢＰ１３０を含むタンパク質画分を有するサ
イミリサルに予防接種すると、防御免疫を生じた。この
方法で保護されたサルからの血清は、更に９６ｋＤａバ
ンドと強力な反応を示した(9) 。また、ＧＢＰ１３０に
対する抗体は免疫を有する成人からの血清にもっぱら存
在し、子供や既に免疫を失ってしまった成人からの血清
には存在しないことを示すことも可能である(9) 。

【００１２】Ａｇ７８または９６ｔＲとも呼ばれるＧＢ
Ｐ１３０をコードする遺伝子は、３種の異なるPlasmodi
um falciparum 株から単離されている(4, 5, 6) 。これ
は、高度に保存された抗原をコードする。

【００１３】ＤＮＡ配列に由来するアミノ酸配列は、２
２５個のアミノ酸の荷電したＮ−末端領域と、続く５０
個のアミノ酸の１１個の高度に保存された繰返しを含ん
でいる。遺伝子は、可能なシグナル配列をコードする配
列を遮断する小さなイントロンを含んでいる(10)。

【００１４】前記の先行技術から現れる目的は、最も広
い意味においてプラスモディウムとヒト細胞との宿主−
寄生生物相互作用に含まれることがある別の構造または
抗原を見出すことである。この種類の抗原は、Plasmodi
um falciparum に対する、したがってマラリアに対する
人々の防御免疫を生じさせることができる。

【００１５】この目的は、配列番号１（表３〜５）と呼
ばれる配列を有するＤＮＡであってＧＢＰ１３０と相同
性のあるタンパク質ＧＢＰ１３０ｈをコードするＤＮＡ
を見出すことによって達成された。

【００１６】ＧＢＰ１３０ｈと呼ばれる抗原は、既に知
られているＧＢＰ１３０と相同の大きな領域を有する。
これらの抗原は、本発明者らによって、遺伝子構造、遺
伝子の位置確認(localization)および各種の寄生生物の
株における保存された構造に関して検討されている。

【００１７】本発明は、配列番号１で示されるＤＮＡ配
列とハイブリッド形成し、同時にタンパク質ＧＢＰ１３
０ｈをコードする総てのＤＮＡ配列を包含する。

【００１８】本発明は、タンパク質ＧＢＰ１３０ｈおよ
び組換えＤＮＡ技術によるその製造法にも関する。

【００１９】最後に、本発明は、Plasmodium falciparu
m に対する医薬品を製造するためのタンパク質ＧＢＰ１
３０ｈであって、この医薬品が好ましくはワクチンであ
るものの使用を包含する。

【００２０】ＧＢＰ１３０ｈをコードするラムダ−ｇｔ
１１クローンの同定 ゲノムPlasmodium falciparum ＥｃｏＲＩ^＊ライブラリ
ーを³²Ｐで標識した非過剰(non-redundant) ３９マー(m
er) オリゴヌクレオチドであって、可能な５５ｋＤａ表
面抗原のＮ末端タンパク質配列に対応する合成ペプチド
から誘導されたものでスクリーニングした。オートゥス
サル(aotus monkeys) にこの合成ペプチドを他のタンパ
ク質と共に予防接種したところ、Plasmodium falciparu
m の感染に対して防御免疫を生じた(11)。試験に用いた
オリゴヌクレオチドは、(12)によるPlasmodium falcipa
rum のコドン使用に従っている。８個の異なるファージ
クローンを単離した。それらの組み込まれたＤＮＡの配
列決定は、いずれも(11)において決定される５５ｋＤａ
抗原のＮ末端配列をコードしないことを示していた。し
かしながら、ＵＷＧＣＧ（ウィスコンシン大学、遺伝子
コンピューターグループ）からの最適なプログラムを用
いるコンピューター解析では、ファージクローンのひと
つ、すなわちＰｆａ５５−１は１４３３ｂｐの長さのＤ
ＮＡセグメントを含み、これはグリコホリン結合タンパ
ク質ＧＢＰ１３０のＣ末端領域をコードする配列と相同
性を示すことを示した(6) 。それ故、このセグメント
（挿入物）によってコードされるタンパク質を、ＧＢＰ
１３０相同性タンパク質すなわちＧＢＰ１３０ｈと呼ん
だ。

【００２１】完全なＧＢＰ１３０ｈ遺伝子の単離 プラスミドｐ５５−１／ＲＩ^＊の挿入されたＤＮＡフラ
グメントは、イントロンの部分と続くＴＡＡ停止コドン
および３′非コード領域の２６１ｂｐを有するエキソン
とを表わす（配列番号１）。逆ポリメラーゼ連鎖反応法
(13)を用いて、５′重複サブクローンを単離した。ＧＢ
Ｐ１３０ｈに特異的なゲノム１．２５ｋｂのＳａｕ３Ａ
Ｉフラグメントから始めて、プラスミドｐ５５−１／Ｒ
Ｉ^＊のＤＮＡフラグメントの５′領域を９８５ｂｐだけ
伸長するＤＮＡ配列を増幅した（配列番号１）。２個の
ＤＮＡフラグメントは、ＧＢＰ１３０ｈ遺伝子の完全な
コード領域および５′および３′非コード配列を表わ
す。

【００２２】配列番号１に挙げた配列は、Plasmodium f
alciparum ＦＣＢＲ株の完全なＧＢＰ１３０ｈ遺伝子の
ヌクレオチド配列の外にＤＮＡ配列からのＧＢＰ１３０
ｈのアミノ酸配列を示している。

【００２３】図１は、ＧＢＰ１３０ｈ遺伝子の制限地図
および構造を示す。コード領域（囲み）は、イントロン
配列によって互いに離して描かれている。黒い部分は、
提案したシグナル配列に相当する。８個の繰返し単位の
位置を示している。

【００２４】表１は、ＧＢＰ１３０ｈのアミノ酸配列と
ＧＢＰ１３０のアミノ酸配列との比較を示している。こ
の比較はＵＷＧＣＧからのＧＡＰプログラムを用いて行
った。同一性は対応するアミノ酸の間の線によって表わ
され、保存されたアミノ酸置換はコロンによって示され
ている。

【００２５】図２は、制限酵素ＲｓａＩ、ＨｉｎｆＩ、
ＤｒａＩ及びＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで消化され且つＧＢ
Ｐ１３０ｈ遺伝子の反復領域を含む³²Ｐ標識ＸｈｏＩＩ
−ＴａｇＩフラグメントでハイブリッド形成したP. fal
ciparum ＤＮＡのサザン・ブロット分析を示している。
フィルターは、穏やかな（Ａ）およびストリンジェント
な（Ｂ）条件下で洗浄した。この方法では、ＧＢＰ１３
０−（三角形）およびＧＢＰ１３０ｈ−特異的ＤＮＡフ
ラグメントおよび第三の遺伝子（矢印）のＤＮＡフラグ
メントであってＧＢＰ１３０よりもＧＢＰ１３０ｈとの
相同性が大きいものを検出した。

【００２６】ＧＢＰ１３０ｈ遺伝子の５′（ヌクレオチ
ド１〜７６６）および３′（ヌクレオチド２２０２〜２
４１８）非コーティング領域は、極めてＡ＋Ｔに富んで
いる（それぞれ８９％および８０．５％）。これは既に
他のPlasmodium falciparum 遺伝子の非コーティング領
域について記載されている(14)。１５５ｂｐの長さのイ
ントロン（ヌクレオチド９５６〜１１１０）も、同様に
８８％という高いＡ＋Ｔ含量を示す。

【００２７】可能性のあるシグナル配列の領域を遮断す
る１７９ｂｐの介在配列は、ＧＢＰ１３０遺伝子につい
て対応する位置で記載されている(10)。いずれのイント
ロンもＧＴで始まりＡＧで終わっているので、他の真核
生物のイントロンと一致する(15)。２つのイントロンの
ヌクレオチド配列の相同性は、８１％を示してる。これ
は、２つの遺伝子が極めて緊密に関係しており、したが
って共通の前駆体遺伝子に由来することを示している。

【００２８】ＧＢＰ１３０ｈ遺伝子の２つのエキソン
は、理論分子量が４８２６０Ｄａを有する４２７のアミ
ノ酸をコードする。ＡＴＧ開始コドンは位置７６７に配
置され、４個のアデニン残基が上流に並んでいる。これ
は、同様に他のPlasmodium falciparum遺伝子の開始コン
センサス配列と一致している(16)。ＧＢＰ１３０ｈのＮ
末端は、リジン、セリンおよびアスパラギンが極めて多
く存在する５０アミノ酸の極めて親水性の領域で開始す
る。この構造も同様にＧＢＰ１３０に見出されている
(5, 6)。この領域のあとには、第一のエキソンの３′末
端によってコードされる１３個のアミノ酸の疎水性配列
が続く。ＧＢＰ１３０とＧＢＰ１３０ｈとの間で高度に
保存されているこの領域は、第二のエキソンによってコ
ードされる続く６個のアミノ酸と共にシグナル配列とし
て働くものと思われる。ＧＢＰ１３０の予想されるシグ
ナルペプチダーゼ開裂部位は、グリシン６９である
(6）。アラニン残基は、この部位に対応するＧＢＰ１３
０ｈの位置に見出される。

【００２９】ＧＢＰ１３０ｈのＣ末端は、全タンパク質
の７４．５％を表わす伸長した繰返し領域を含む。この
領域は４０アミノ酸を有する８個の繰返し単位を含み、
この構造はＧＢＰ１３０ｈに極めて特徴的である。この
繰返しはごくわずかな変化を示し、これらの繰返しの２
個、すなわちＩＶおよびＶが３９個のアミノ酸のみを有
することができる。繰返しＩ、ＩＩ、ＶＩおよびＶＩＩ
の最後の４個のアミノ酸ＤＥＬＥは、スクリーニングに
用いたオリゴヌクレオチドの最後の１２個の塩基に相補
的なヌクレオチドによってコードされる。

【００３０】ＧＢＰ１３０ｈとＧＢＰ１３０のアミノ酸
配列の比較によって示されたように、２つの配列の間に
は６９％の同一性がある。これは、極めて高度の相同性
に相当する。主な差異はＧＢＰ１３０の位置１１０から
２２５までの１１６個のアミノ酸の高度に荷電したセグ
メントに関係するが、このセグメントはＧＢＰ１３０ｈ
には存在しない。第二のエキソンによってコードされる
最初の４６個のアミノ酸は２つのタンパク質の間の同一
性はたった５４％であり、これは、このセグメントがＧ
ＢＰ１３０とＧＢＰ１３０ｈとの間の最も相異した領域
であることを意味する。更に、タンパク質は繰返しの数
および長さが異なる。ＧＢＰ１３０は５０個のアミノ酸
の１１個の繰返しを含むが、ＧＢＰ１３０ｈはＧＢＰ１
３０の繰返しのアミノ酸２〜４１に対応する４０個のア
ミノ酸残基を有する８個だけの繰返しを示している。

【００３１】ＧＢＰ１３０ｈ遺伝子の保存 ヌクレオチド位置７６７〜１２３２に対応し、繰返し領
域の上流にエキソン１とエキソン２およびＧＢＰ１３０
ｈ遺伝子の介在配列を含むＤＮＡフラグメントを増幅し
た後配列決定した。この場合のＤＮＡはPlasmodium fal
ciparum ＦＣＢＲ、ＦＣＲ−３、ＳＧＥ２、ＩｔＧ_２Ｇ
_１、ＦＶＯＲ、ＦＵ１および＃１３株由来のものであっ
た。ＧＢＰ１３０ｈ遺伝子のこの４６５ｂｐ領域は、今
日まで分析された総ての寄生虫の単離物に対する配列に
同じである。これはＧＢＰ１３０ｈ遺伝子が高度に保存
されていることを示している。

【００３２】ＧＢＰ１３０ｈとＧＢＰ１３０は異なる遺
伝子によってコードされる Plasmodium falciparum ＦＣＢＲ株のゲノムＤＮＡ上
で、オリゴヌクレオチドｐ５およびｐ６（表１）を用い
てＰＣＲによって、ＧＢＰ１３０に特異的な高度に荷電
した領域をコードする３６０ｂｐの長さのフラグメント
を単離することが可能であった。ＦＣＲ−３株のＧＢＰ
１３０配列と比較すると（６）、このフラグメントは２
つの塩基対の交換を示しており、これによってアミノ酸
の置換を生じ、ＡはＧＢＰ１３０の位置７１３における
Ｃによって置換され、Ａは位置７５８におけるＧによっ
て置換される。ＧＢＰ１３０の位置７１３におけるこの
塩基の置換は、パロ・アルト(Palo Alto) 単離物につい
ても報告されている(10)。

【００３３】このＧＢＰ１３０に特異的なプローブとＧ
ＢＰ１０３ｈからの１０８ｂｐのＰｓｔＩ−ＸｈｏＩＩ
ＤＮＡフラグメント（図１を参照）を用いて、各種の制
限酵素で切断したPlasmodium falciparum ＤＮＡのサザ
ンブロット分析を行った。２つのプローブは、Plasmodi
um falciparum 株からの異なるＤＮＡフラグメントとハ
イブリッド形成した。これは、Plasmodium falciparum
のゲノムが、ＧＢＰ１３０およびＧＢＰ１３０ｈに対す
る２個の異なる遺伝子を含むことを明確に示している。

【００３４】ＧＢＰ１３０遺伝子は３つの異なる遺伝子
の遺伝子群を指定する ＧＢＰ１３０ｈ遺伝子の繰返し領域を単離し、制限酵素
ＲｓａＩ、ＨｉｎｆＩ、ＤｒａＩおよびＥｃｏＲＩ／Ｘ
ｂａＩで消化したゲノムP. falciparum のサザンブロッ
ト分析のプローブとして用いた。３種類の異なる遺伝子
を、穏やかな洗浄条件下（５５℃、２ＸＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳ）で検出することができる。ＧＢＰ１３０遺伝
子（４、５、６）およびＧＢＰ１３０ｈ遺伝子（図１）
の既知の制限酸素地図に基づいて、ＧＢＰ１３０および
ＧＢＰ１３０ｈに特異的なＤＮＡフラグメント（ＧＢＰ
１３０については３５１ｂｐのＸｂａＩ−ＳｐｅＩフラ
グメント、ＧＢＰ１３０ｈについては１０８ｂｐのＰｓ
ｔＩ−ＸｈｏＩＩフラグメント）を用いて、ストリンジ
ェントな条件下で行われたサザンブロット分析によっ
て、ＧＢＰ１３０およびＧＢＰ１３０ｈに特異的なハイ
ブリッド形成フラグメントを明確に特定することが可能
であった（図２Ａ）。更に、第三の遺伝子である約２２
ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩフラグメント、１．７ｋｂ
のＤｒａＩフラグメント、０．８ｋｂのＲｓａＩフラグ
メントおよび２．２ｋｂのＨｉｎｆＩフラグメントで交
差ハイブリッド形成(cross-hybridizing) するＧＢＰ１
３０ｈプローブを検出することも可能であった。フィル
ターを更にストリンジェントな条件（６５℃、０．５Ｘ
ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）下で洗浄すると、ＧＢＰ１３
０ｈプローブとＧＢＰ１３０遺伝子との検出可能なハイ
ブリッド形成は生じないが、未知のものとしての第三の
遺伝子と決定されるＤＮＡフラグメントが検出される
（図２Ｂ）。これは、この遺伝子がＧＢＰ１３０遺伝子
とよりはＧＢＰ１３０ｈ遺伝子と一層相同性であること
を示している。

【００３５】ＧＢＰ１３０ｈ遺伝子はP. falciparum の
血液段階で極めて弱くのみ発現する シゾント由来のポリ（Ａ）^＋ＲＮＡから開始して、ノザ
ンブロット分析を、１０８ｂｐのＰｓｔＩ−ＸｈｏＩＩ
フラグメント（特異的ＧＢＰ１３０ｈ遺伝子フラグメン
ト）と３５１ｂｐのＸｂａＩ−ＳｐｅＩフラグメント
（特異的ＧＢＰ１３０遺伝子フラグメント）で行った。
ハイブリッド形成に用いた２つのフラグメントは、ほぼ
同じ特異的な放射能を有する。ＧＢＰ１３０プローブ
は、一晩暴露した後に有力なバンドとして約６．５ｋｂ
の特異的ｍＲＮＡを検出した。類似の結果がＧＢＰ１３
０について文献にすでに記載されている（４、５、
６）。これとは対照的に、ＧＢＰ１３０ｈプローブは８
日の極めて長い暴露時間の後にのみ検出可能な約２．５
ｋｂおよび約２．８ｋｂの２種類のｍＲＮＡバンドとハ
イブリッド形成した。この場合には、ｍＲＮＡの一方は
ＧＢＰ１３０ｈ遺伝子に指定され、第二のバンドはＧＢ
Ｐ１３０ｈ遺伝子と高い相同性を明らかに示すＧＢＰ遺
伝子群の第三の遺伝子のｍＲＮＡを表わすことができる
（図２）。ＧＢＰ１３０遺伝子の発現率とタンパク質Ｇ
ＢＰ１３０ｈをコードする遺伝子の発現率との間には顕
著な相違があり、ＧＢＰ１３０遺伝子は極めて高い効率
で転写されるが、ＧＢＰ１３０ｈ遺伝子、したがってこ
の遺伝子群の第三の遺伝子の転写率は極めて弱い。これ
らのｍＲＮＡによって翻訳されるタンパク質がほぼ同様
な頻度率を有するものとすると、ＧＢＰ１３０はP. fal
ciparum シゾントにおいて極めて頻繁に起こり、ＧＢＰ
１３０ｈは不十分に表示される傾向になる。これらの相
同性タンパク質の異なる分布を用いて、いわゆる煙幕効
果を利用することができ、これは、シゾントからメロゾ
イトが放出された後に多量に放出されるＧＢＰ１３０を
伴い、これは免疫系をそらす仕事を有することがあり、
この場合には不十分に表示されるＧＢＰ１３０ｈは同時
にその本質的機能を行うことができる。

【００３６】表２は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
について構成されたオリゴヌクレオチドの配列を示す。

【００３７】

【実施例】

例ＤＮＡおよびｍＲＮＡの調製 標準的方法(17)を用いて、Plasmodium palciparum 株Ｆ
ＣＢＲ（コロンビア）ＦＣＲ−３（コロンビア）、ＦＶ
ＯＲ（ヴェトナム）、ＳＧＥ２（ザイール）、ＩｔＧ_２
Ｇ_１（ブラジル）、ＦＵ１（ウガンダ）および＃１３
（セネガル）の培養、シゾントの富化およびＤＮＡおよ
びポリ（Ａ）^＋ＲＮＡの調製を行った。ＦＣＢＲ株のサ
ザンおよびノザンブロット法によるＤＮＡおよびｍＲＮ
Ａの分析も、同様に先行技術に記載されている(18)。

【００３８】ゲノムＥｃｏＲＩ^＊ライブラリーの構成 Plasmodium palciparum ＦＣＢＲ株のＤＮＡ２μｇを１
０ミリモルのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ミリ
モルのＭｇＣｌ_２、１ミリモルのジチオスレイトールお
よび４０％（容積／容積）グリセリン中制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩの１４単位を用いて、３７℃で一晩インキュベーシ
ョンした。これらの条件下で、ＥｃｏＲＩはスター活性
(star activity) を示す。これは、ＤＮＡがテトラヌク
レオチドＡＡＴＴで消化されることを意味している。こ
れから生じる大きさが１０ｋｂまでのＤＮＡフラグメン
トを、０．８％アガロースゲルを用いて分画した。５０
０ｂｐ〜７ｋｂのフラグメントを電気溶出した後、(19)
に記載の方法によってベクターラムダｇｔ１１に挿入し
た。この方法で、５×１０^５の組換えファージクローン
のゲノムＥｃｏＲＩ^＊ライブラリーを得て、これらのフ
ァージを次に標準的方法(20)によって増幅した。 ＥｃｏＲＩ^＊ライブラリーのスクリーニング このライブラリーからの１．５×１０^５個のファージク
ローンを、可能な５５ｋＤａのPlasmodium falciparum
表面抗原(11)のＮ−末端タンパク質配列に由来する５′
−³²Ｐ−標識オリゴヌクレオチドを用いて標準的方法(2
0)によってスクリーニングした。オリゴヌクレオチドの
塩基配列は、５′−ＴＧＣ ＴＧＣＡＴＡ ＴＡＣ Ａ
ＴＴ ＴＴＧ ＴＧＴ ＴＴＣ ＴＧＣ ＴＴＣ ＴＡ
ＡＴＴＣ ＡＴＣ−３′であった。

【００４０】このオリゴヌクレオチドは、Plasmodium f
alciparum によって極めて一般的に用いられるコドンに
基づいて構成された(16)。８個のファージクローンが単
離され、Ｐｆａ５５−１と呼ばれるそれらのひとつを用
いて次の検討を行った。ファージクローンＰｆａ５５−
１のＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消
化した。これにより、２．４ｋｂのフラグメントが生
じ、これはマラリアに特異的なフラグメントの外に、１
ｋｂのラムダｇｔ１１領域であって部分ＰｖｕＩＩ制限
によって欠失されるものを有していた。この方法で得ら
れる１．４ｋｂのフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＳ
ｍａＩで消化可能なｐＫＳ（＋）ブルースクリプトベク
ターにクローニングしたところ、プラスミドｐ５５−１
／ＲＩ^＊を生じた。

【００４１】逆ＰＣＲによる５′−重複遺伝子フラグメ
ントの単離 完全な遺伝子を単離するために、ファージクローンＰｆ
ａ５５−１に含まれるそのフラグメントである遺伝子の
５′領域を逆ＰＣＲによって伸長した(13)。ファージク
ローンＰｆａ５５−１の挿入ＤＮＡの５′領域を９８５
ｂｐだけ伸長したゲノム１．２５ｋｂのＳａｕ３ＡＩフ
ラグメントを、³²Ｐを標識した１０８ｂｐのフラグメン
ト（ｐ５５−１／ＲＩ^＊のＰｓｔＩ／ＸｈｏＩＩ消化）
をプローブとして用いてサザンブロット分析(20)によっ
て同定した。Ｓａｕ３ＡＩで消化したP. falciparum Ｄ
ＮＡ９０μｇを０．８％アガロースゲル上で分画し、
１．２〜１．３ｋｂの大きさのＤＮＡフラグメントを電
気溶出した。Ｓａｕ３ＡＩ開裂部位を自己連結し、酵素
ＰｓｔＩで制限した後、既知のＤＮＡ配列を５′および
３′末端に転換した。このゲノムＤＮＡ５０ｎｇおよび
オリゴヌクレオチドｐ１およびｐ２（表２）５００ｎｇ
をＰＣＲに用いて、パーキン・エルマー・セトゥス(Per
kin Elmer Cetus)製のジーン−アンプ(Gene-Amp^R ) キ
ットを用いて標準的条件下で行った。この後に得られる
１．２５ｋｂのフラグメントを、５′末端をホスホリル
化した。この後に、クレノウ酵素で補充反応(fill-in r
eaction)を行った。このＤＮＡフラグメントを、次にＳ
ｍａＩで消化したｐＫＳベクター中に挿入した。この方
法で形成されたプラスミドをｐ５５−１／ＰＣＲと呼ん
だ。

【００４２】ＤＮＡ配列決定 プラスミドｐ５５−１／ＲＩ^＊およびｐ５５−１／ＰＣ
Ｒの挿入ＤＮＡフラグメントの両方の鎖をＵＳＢ（クリ
ーブランド、ＯＨ）からのシークエナーゼ系を用いてジ
デオキシ法によって配列決定を行った。好適なサブフラ
グメントを、利用可能な制限部位でブルースクリプトベ
クターｐＫＳ中にサブクローニングすることによって得
た。配列決定データをＵＷＧＣＧプログラムを用いて解
析した(21)。

【００４３】各種のP. falcuparum 単離物の特異的遺伝
子領域の増幅および配列決定 P. falcuparum 株ＦＣＢＲ、ＦＣＲ−３、ＳＧＥ２、Ｉ
ｔＧ_２Ｇ_１、ＦＶＯＲ、ＦＵ１および＃１３からのＤＮ
Ａ０．５μｇを、それぞれの場合にオリゴヌクレオチド
ｐ３およびｐ４（表２）３００ｎｇと組み合わせて用い
て、ゲノムフラグメントを増幅した。パーキン・エルマ
ー・セトゥス(Perkin Elmer Cetus)製のジーン−アンプ
(Gene-Amp^R ) キットをこれに用いた。７個の異なる寄
生虫単離物のゲノムフラグメントをホスホリル化した
後、標準的方法(20)によりクレノウ酵素を用いて補充反
応を施し、次いで配列決定のためにベクターｐＫＳのＳ
ｍａＩ開裂部位に挿入した。

【００４４】ＧＢＰ１３０特異的プローブの構成 ＧＢＰ１３０ｈとＧＢＰ１３０(6) のコード配列の比較
により、ＧＢＰ１３０遺伝子にのみ存在する３５１ｂｐ
の長さのフラグメントを見出した。このＧＢＰ１３０特
異的フラグメントをP. falciparum ＦＣＢＲ株、のゲノ
ムＤＮＡによって、具体的にはオリゴヌクレオチドｐ５
およびｐ６（表２）を用いて増幅した。これから生じる
３６０ｂｐのフラグメントをＸｂａＩおよびＳｐｅＩで
消化した後、ベクターｐＫＳに連結して、プラスミドｐ
ＫＳ／ＧＢＰを生じた。ＧＢＰ１３０特異的フラグメン
トの同一性はＤＮＡ配列決定によって確かめた。

【００４５】ＧＢＰ１３０およびＧＢＰ１３０ｈ遺伝子
のサザンブロット分析 ＧＢＰ１３０特異性フラグメントを、制限酵素ＸｂａＩ
およびＳｐｅＩを用いてプラスミドｐＫＳ／ＧＢＰから
単離して、ニックトランスレーションによって³²Ｐで標
識した。１０８ｂｐの長さのＧＢＰ１３０ｈ特異的ＤＮ
Ａフラグメントを同様に制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｈｏ
ＩＩを用いてプラスミドｐ５５−１／ＲＩ^＊から単離
し、ニックトランスレーションによって³²Ｐで標識し
た。これらのプローブを用いて、制限酵素ＤｄｅＩ、Ｔ
ａｑＩ、ＡｌｕＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＲｓａＩ、Ｈｉｎｆ
Ｉ、ＤｒａＩおよびＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで消化したP.
falciparum ＤＮＡの標準的方法によるサザンブロット
分析を行った。

【００４６】反復ＧＢＰ１３０ｈプローブを用いるゲノ
ムP. falciparum ＤＮＡのサザンブロット分析 プラスミドｐ５５−１／ＲＩ^＊を制限酵素ＸｈｏＩＩお
よびＴａｑＩで消化し、ＧＢＰ１３０ｈ遺伝子の８個の
繰返し単位を含む９６５ｂｐのＤＮＡフラグメントを単
離することが可能であった。このＤＮＡフラグメントを
ニックトランスレーション（２０）によって³²Ｐで放射
能標識し、制限酵素ＲｓａＩ、ＨｉｎｆＩ、ＤｒａＩお
よびＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで消化したP. falciparum の
ＤＮＡのサザンブロット分析を行った。標準的条件(20)
を用いて行ったハイブリッド形成の後、膜を最初に２Ｘ
ＳＳＣ（２ＸＳＳＣは３００ミリモルＮａＣｌ、３０ミ
リモルクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ（ドデシ
ル硫酸ナトリウム）で５５℃で２回それぞれ１５分間ず
つ洗浄した後、３時間オートラジオグラフィーにかけ
た。オートラジオグラフィーの展開の後、膜を０．５Ｘ
ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で更にストリンジェントな条
件下で６５℃でそれぞれ１５分間ずつ２回洗浄し、次い
で一晩暴露させた。

【００４７】ノザンブロット分析 P. falciparum ＦＣＢＲ株のシゾントから単離したポリ
（Ａ）^＋ＲＮＡの１０μｇ試料を０．８％アガロース／
ホルムアルデヒドゲルを用いて分画した後、供給業者の
プロトコールを用いてジーン−スクリーン膜(Gene-Scre
en membrane)（デュポン(Du Pont) ）に移して、プラス
ミドｐ５５−１／ＲＩ^＊から得たＧＢＰ１３０ｈのニッ
クトランスレーションした１０８ｂｐの長さのＰｓｔＩ
−ＸｈｏＩＩフラグメントおよびプラスミドｐＫＳ／Ｇ
ＢＰから得られたＧＢＰ１３０遺伝子の３５１ｂｐのＸ
ｂａＩ−ＳｐｅＩフラグメントとハイブリッド形成し
た。フィルターを５５℃で０．５ＸＳＳＣ、０．１％Ｓ
ＤＳ中で１５分間２回洗浄して、オートラジオグラフィ
ーにかけた。

【００４８】部分ＧＢＰ１３０ｈ配列の発現 ベクターｐＳＥＭ（バイオテクニクス(Biotechniques)
8、280 〜281 頁(22)）を用い、プラスミドｐ５５−１
／ＲＩ^＊であるβ−ガラクトシダーゼの３７５個のＮ末
端アミノ酸を有する融合タンパク質の部分配列を発現さ
せた。オリゴヌクレオチドｐ７とｐ８（表２）およびｐ
５５−１／ＲＩ^＊からのプラスミドＤＮＡ１００ｎｇを
用いて、ＰＣＲによって６８０ｂｐのフラグメントを増
幅した。増幅したフラグメントをＳａｃＩおよびＰｓｔ
Ｉで消化した後、同じ制限酵素で線状化したｐＳＥＭ１
ベクターに連結した。大腸菌ＤＨ５アルファ株を、連結
したプラスミドで形質転換した。この後、正確な大きさ
の挿入ＤＮＡフラグメントを含むコロニーを単離した。
単一コロニーを一晩培養した後、１ミリモルのＩＰＴＧ
（イソプロピルチオガラクトシド）で２時間誘導した。
発現生成物を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
によって分析した。この場合には、７０ｋＤａの融合タ
ンパク質を高率で発現させることが可能であった。

【００４９】文献 （下記１〜２２は表６〜９に対応） 1. ケンプ・ディージェイ(Kemp, D.J.)、カウマン・エ
イエフ(Cowman, A.F.)及びウォーライカー・ディー(Wal
liker, D.)(1990)Plasmodium falciparum における遺伝
学的多様性。Advances in Parasitology, 29, 75-149. 2. パーキンス・エムイー(Perkins, M.E.) (1984)Plas
modium falciparum の表面タンパク質。赤血球レセプタ
ー、グリコホリンに結合するメロゾイト。J.Exp.Med.,
160, 788-798. 3. パーキンス・エムイー(Perkins, M.E.) (1988)分子
量が１３０，０００のPlasmodium falciparum タンパク
質の段階に依存するプロセシング及び位置確認。Exper.
Parasitol., 65, 61-68. 4. ビアンコ・エイイー(Bianco, A.E.)、カルヴェナー
・ジェイジー(Culvenor,J.G.)コッペル・アールエル(Co
ppel, R.L.)クリューター・ピーイー(Crewther,P.E.)、
マッキンタイア・ピー(McIntyre, P.)、ファヴァロロ・
ジェイエム(Favaloro, J.M.)、ブラウン・ジーヴィ(Bro
wn, G.V.) 、ケンプ・ディージェイ(Kemp, D.J.)および
アンダース・アールエフ(Anders, R.F.) (1987) 推定上
のグリコホリン結合タンパク質はPlasmodium falciparu
m のシゾントから分泌される。Mol. Biochem. Parasito
logy, 23, 91-102. 5. ボンフォイ・エス(Bonnefoy, S.)、マテイ・ディー
(Mattei, D.)、デュブレメツ・ジェイエフ(Dubremetz,
J.F.) ギロッテ・エム(Guillotte, M.) 、ジォイン・エ
イチ(Jouin, H.) 、オザキ・エルエス(Ozaki, L.S.) 、
シビリ・エル(Sibilli, L.) 及びメルセリュー−ピュア
ロン・オー(Mercereau-Puijalon, O.)(1988)Plasmodium
falciparum ：推定上の防御抗原である熱に安定な９６
ｋＤａタンパク質の分子分析。Exper. Parasitology 6
5, 69-83. 6. コーチャン・ジェイ(Kochan, J.)、パーキンス・エ
ムイー(Perkins, M.E.）およびラヴェッチ・ジェイヴィ
(Ravetch, J.V.) (1986)タンデムの繰返し配列はPlasmo
dium falciparum の赤血球レセプター結合タンパク質に
対する結合ドメインを決定する。Cell 44, 689-696. 7. ギシン・ジェイ(Gysin, J.) 、ドゥボイス・ピー(D
ubois, P.)およびペレイラ・ダ・シルヴァ・エル(Perei
ra da Silva, L.) (1982) リスサルサイミリ(Saimirisc
iureus) の実験的感染におけるPlasmodium falciparum
の赤血球段階に対する感染防御抗体。Parasite Immunol
ogy 4, 421-430. 8. ジォイン・エイチ(Jouin, H.) 、ドゥボイス・ピー
(Dubois, P.)、ギシン・ジェイ(Gysin, J.) 、ファンデ
ュール・ティー(Fandeur, T.) 、メルセリュー−ピュア
ロン・オー(Mercereau-Puijalon, O.)及びペレイラ・ダ
・シルヴァ・エル(Pereira da Silva, L.) (1987) 防御
免疫に関するPlasmodium falciparum の９６ｋＤａの熱
に安定なポリペプチド抗原の特性決定。Infect. and
Immunity55, 1287-1392. 9. ドゥボイス・ピー(Dubois, P.)、ドルーレ・ピー(D
ruilhe, P.) 、アリアート・ディー(Arriat, D.)、ジェ
ンドウビ・エム(Jendoubi, M.)およびジォイン・エイチ
(Jouin, H.) (1987)予めマラリアに暴露することによる
ヒト血清によるPlasmodium falciparum 抗原の認識の変
化。Ann. l'Institut Pasteur,Immunologie (Paris)13
8, 383-396. 10. ボンフォイ・エス(Bonnefoy, S.)およびメルセリュ
ー−ピュアロン・オー(Mercereau-Puijalon, O.) (198
9) Plasmodium falciparum ：ＧＢＰ１３０／９６ｔＲ
遺伝子における介在配列 Exp. Parasitol. 69, 37-43. 11. パタロヨ・エムイー(Patarroyo, M.E.) 、ロメロ・
ピー(Romero,P.) 、トレス・エムエル(Torres, M.L.)ク
ラヴィジョ・ピー(Clavijo, P.) 、モレノ・エイ(Moren
o, A.)マルチネツ・エイ(Martinez, A.)、ロドリゲツ・
アール(Rodoriguez, R.)グツマン・エフ(Guzman, F.)お
よびカベザス・イー(Cabezas, E.) (1987)合成ペプチド
を用いるマラリアでの実験的感染に対する防御免疫の誘
導。Nature 328, 629-632. 12. ハイド・ジェイイー(Hyde, J.E.)、ケリー・エスエ
ル(Kelly, S.L.) 、ホロウエイ・エスピー(Holloway,
S.P.)スネウィン・ヴィエイ(Snewin, V.A.)およびシム
ス・ピーエフジー(Sims, P.F.G.) (1989) 他の生物のタ
ンパク質配列から推測される非過剰オリゴヌクレオチド
を用いるPlasmodium falciparum 遺伝子を単離するため
の一般的方法。Mol. Biochem. Parasitol. 82, 247-26
2. 13. トリグリア・ティー(Triglia, T.) 、ピーターソン
・エムジー(Peterson, M.G.)およびケンプ・ディージェ
イ(Kemp, D.J.) (1988) 既知の配列の境界の外側にある
ＤＮＡセグメントのインビトロの増幅法。Nucl. Acids
Res. 16, 8186. 14. ウェバー・ジェイエル(Weber, J.L.) (1987)Plasmo
dium falciparum の著しくＡ＋Ｔに富んだゲノムからの
配列の分析。Gene 52, 103-109. 15. マウント・エスエム(Mount, S.M.) (1982)スプライ
ス部位の配列のカタログ。Nucl. Acids Res. 10, 459-4
72. 16. ソウル・エイ(Saul, A.)およびバチスタッタ・ディ
ー(Battistutta, D.)(1990) Plasmodium falciparum
の翻訳開始部位の側面にある配列の分析。Mol.Biochem.
Parasitol. 42, 55-62. 17. クナップ・ビー(Knapp, B.) 、シャウ・エイ(Shaw,
A.)、ハント・イー(Hundt, E.) 、エンダース・ビー(E
nders, B.)およびキュッパー・エイチエイ(Kuepper, H.
A.) (1988) ヒスチジン−アラニンに富む組換え抗原は
Plasmodiumfalciparum感染からアオトスサル(Aotus mon
keys) を保護する。Behring Res.Commun. 82, 349-359.
18. クナップ・ビー(Knapp, B.) 、ハント・イー(Hund
t, E.) 、ナウ・ユー(Nau, U.) 、およびキュッパー・
エイチエイ(Kuepper, H.A.) (1989) セリンのストレッ
チによって特徴付けられるPlasmodium falciparum の血
液段階抗原の分子クローニング、ゲノム構造および位置
確認。Mol. Biochem. Parasitol. 32,73-84. 19. ハイン・ティーヴイー(Huynh,T.V.)、ヤング・アー
ルエイ(Young, R.A.) およびディヴィス・アールダブリ
ュ(Davis, R.W.) (1985) ラムダｇｔ１０およびラムダ
ｇｔ１１におけるｃＤＮＡライブラリーの構成およびス
クリーニング（グローヴァー・ディーエム(Glover, D.
M.)著、ＤＮＡクローニング、第１巻、49- 78頁）。 20. サムブルック・ジェイ(Sambrook, J.)フリッシュ・
イーエフ(Fritsch, E.F.) およびマニアチス・ティー(M
aniatis, T.) (1989) 分子クローニング：実験室マニュ
アル、第２版。コールド・スプリンガー・ハーバー・ラ
ボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory),コールド
・スプリンガー・ハーバー、ニューヨーク。 21. デヴェリュー・ジェイ(Devereux, J.)、ヘーバーリ
・ピー(Haeberli, P.)およびスミシース・オウ(Smithie
s, O.) (1984) ＶＡＸの配列分析プログラムの包括的セ
ット。Nucl. Acids Res. 12, 387-395. 22. クナップ・エス(Knapp, S.) ブレーカー・エム(Bro
eker M.)およびアマン・イー(Amann E.) (1990) ｐＳＥ
Ｍベクター。抗原決定因子およびタンパク質ドメインの
高水準での発現。Biotechniques 8.280-281 。

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＧＢＰ１３０ｈ遺伝子の制限地図および構造を
示す説明図。コード領域（囲み）は、イントロン配列に
よって互いに離して描かれている。黒い部分は、提案し
たシグナル配列に相当する。８個の繰返し単位の位置を
示している。

【図２】制限酵素ＲｓａＩ、ＨｉｎｆＩ、ＤｒａＩ及び
ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで消化され且つＧＢＰ１３０ｈ遺
伝子の反復領域を含む³²Ｐ標識ＸｈｏＩＩ−ＴａｇＩフ
ラグメントでハイブリッド形成したP. falciparum ＤＮ
Ａのサザン・ブロット分析を示す説明図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エリカ、フント ドイツ連邦共和国マールブルク、ツーム、 ヒルツボルン、８ (72)発明者 ハンス、キューパー ドイツ連邦共和国マールブルク、バンコプ シュトラーセ、12

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号１に示されるタンパク質ＧＢＰ１
   ３０ｈをコードするＤＮＡ。
2. 【請求項２】配列番号１に示される配列またはその部分
   を有する請求項１に記載のＤＮＡ配列。
3. 【請求項３】請求項１または２のいずれかのＤＮＡ配列
   とハイブリッド形成し且つタンパク質ＧＢＰ１３０ｈを
   コードするＤＮＡ配列。
4. 【請求項４】請求項１または２のいずれかのＤＮＡ配列
   と交差ハイブリッド形成し且つタンパク質ＧＢＰ１３０
   またはＧＢＰ１３０ｈをコードしないＤＮＡ配列。
5. 【請求項５】配列番号１に示されるアミノ酸配列を有す
   るタンパク質ＧＢＰ１３０ｈ。
6. 【請求項６】組換えＤＮＡ技術によって製造された、請
   求項５に記載のタンパク質ＧＢＰ１３０ｈ。
7. 【請求項７】請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮ
   Ａ配列によってコードされるタンパク質ＧＢＰ１３０
   ｈ。
8. 【請求項８】ＧＢＰ１３０よりもＧＢＰ１３０ｈとの相
   同性が高いタンパク質。
9. 【請求項９】宿主生物を請求項１〜３のいずれか１項に
   記載のＤＮＡ配列で宿主生物を形質転換し、宿主生物を
   培養し発現させた後にタンパク質を単離することを特徴
   とする、ＧＢＰ１３０ｈの製造法。
10. 【請求項１０】医薬品としての請求項５〜７のいずれか
    １項に記載のＧＢＰ１３０ｈ。
11. 【請求項１１】医薬品としての請求項８に記載のタンパ
    ク質。
12. 【請求項１２】請求項５〜７のいずれか１項に記載のＧ
    ＢＰ１３０ｈまたは請求項８に記載のタンパク質を含む
    ワクチン。
13. 【請求項１３】請求項５〜７のいずれか１項に記載のＧ
    ＢＰ１３０ｈまたは請求項８に記載のタンパク質の、熱
    帯熱マラリア原虫に対する医薬品の製造のための使用。