JPH06135980A - New physiologically active substance a-72363 - Google Patents
New physiologically active substance a-72363Info
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- JPH06135980A JPH06135980A JP28738192A JP28738192A JPH06135980A JP H06135980 A JPH06135980 A JP H06135980A JP 28738192 A JP28738192 A JP 28738192A JP 28738192 A JP28738192 A JP 28738192A JP H06135980 A JPH06135980 A JP H06135980A
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、ヘパラナーゼおよびβ
−グルクロニダーゼに対して阻害活性を有する新規化合
物A−72363およびその製造法に関する。The present invention relates to heparanase and β
-A novel compound A-72363 having inhibitory activity against glucuronidase and a method for producing the same.
【0002】[0002]
【従来の技術】従来、微生物の代謝産物として、シアリ
ダーゼ阻害活性を有する、化学構造未解明のシアスタチ
ンA(Siastatin A) 並びにA−72363の6−エピマ
ーであるシアスタチンB(Siastatin B) (H.Umezawaら、
J.Antibiotics 、27巻、963 頁(1974年))が、報告さ
れており、抗ウイルス作用、抗菌作用を有すると報告さ
れている(特開平1−294687)。2. Description of the Related Art Conventionally, as metabolites of microorganisms, cystatin A (Siastatin A), which has a sialidase inhibitory activity and whose chemical structure is unknown, and Siastatin B (Siastatin B) (H. Umezawa) which is a 6-epimer of A-72363. ,
J. Antibiotics, Vol. 27, p. 963 (1974)), and it is reported to have antiviral and antibacterial actions (JP-A-1-294687).
【0003】しかし、ヘパラナーゼ並びにβ−グルクロ
ニダーゼ阻害活性を示す前記構造式(I)を有する化合
物は現在まで報告されていない。However, a compound having the above structural formula (I) showing heparanase and β-glucuronidase inhibitory activity has not been reported until now.
【0004】ヘパラナーゼは、基底膜の主要構成成分の
一つであるヘパラン硫酸を分解する酵素である。ヘパラ
ナーゼは癌が成育する際の血管新生、癌の浸潤および転
移に関与することが報告されている(J.Cellular Bioch
em.、36巻、157 頁(1988年))。従って、ヘパラナーゼ
阻害剤は癌転移の予防・治療に有用である。Heparanase is an enzyme that decomposes heparan sulfate, which is one of the main components of basement membrane. Heparanase has been reported to be involved in angiogenesis during cancer growth, cancer invasion and metastasis (J. Cellular Bioch
em., 36, 157 (1988)). Therefore, heparanase inhibitors are useful for the prevention and treatment of cancer metastasis.
【0005】そして、ヘパラナーゼ阻害作用を示す物質
としてはヘパリンとその誘導体( Biochemistry、25巻、5
322 頁(1986年))、 キチンの硫酸化誘導体( Cancer Re
s.、50巻、3631頁(1990年))、およびスラミン(surami
n: J.Biol.Chem.、 266 巻、9661頁(1991年))が知ら
れている。これらの化合物は、主にマウスを用いた癌転
移モデルにおいて癌細胞の浸潤あるいは転移を抑制する
ことが見い出されている。Heparin and its derivatives (Biochemistry, Vol. 25, 5
322 (1986)), a sulfated derivative of chitin (Cancer Re
s., 50, 3631 (1990)), and suramin (surami
n: J. Biol. Chem., vol. 266, p. 9661 (1991)). It has been found that these compounds suppress invasion or metastasis of cancer cells mainly in a cancer metastasis model using mice.
【0006】一方β−グルクロニダーゼは、体内での薬
物代謝に関与すると考えられており、特に、不活性型発
癌物質の活性型への変換に重要な役割を持っている(Can
cer,28巻、60頁(1971年))。また、β−グルクロニダ
ーゼ阻害物質投与によって、発癌物質により引き起こさ
れるラットの発癌が抑制されることが報告されている
(Cancer Res.,42巻、331 頁(1982年)、Carciogenesi
s 、6巻、679 頁(1985年))。したがってβ−グルク
ロニダーゼ阻害剤は抗癌剤として有用である。On the other hand, β-glucuronidase is considered to be involved in drug metabolism in the body, and particularly has an important role in converting an inactive carcinogen into an active form (Can.
cer, 28, 60 (1971)). In addition, it has been reported that administration of β-glucuronidase inhibitors suppresses carcinogenesis in rats caused by carcinogens (Cancer Res., 42, 331 (1982), Carciogenesi.
s, vol. 6, p. 679 (1985)). Therefore, β-glucuronidase inhibitors are useful as anticancer agents.
【0007】[0007]
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、沖縄県
国頭郡東村の土壌より分離したストレプトマイセス属に
属するSANK 60192株の培養物から、ヘパラナーゼ並びに
β−グルクロニダーゼ阻害活性を有する新規化合物A−
72363が生産されることを見出し、本発明を完成し
た。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present inventors have proposed a novel compound having heparanase and β-glucuronidase inhibitory activity from a culture of SANK 60192 strain belonging to the genus Streptomyces isolated from soil in Higashi-mura, Kunigami-gun, Okinawa Prefecture. A-
The present invention was completed by finding that 72363 was produced.
【0008】[0008]
【課題を解決するための手段】A−72363は下記の
構造式及び理化学的性状を有する。構造式 A-72363 has the following structural formula and physicochemical properties. Structural formula
【0009】[0009]
【化2】 [Chemical 2]
【0010】ここで、A−72363は、(3S,4
S,5R,6S)−6−アセチルアミノ−4,5−ジヒ
ドロキシ−ピペリジン−3−カルボン酸と表わされる。Here, A-72363 is (3S, 4
S, 5R, 6S) -6-Acetylamino-4,5-dihydroxy-piperidine-3-carboxylic acid.
【0011】1)物質の性状:両性水溶性白色粉末 2)分子式:C8 H14N2 O5 3)分子量:218(FABマススペクトル法により測
定) 4)高分解能質量分析:グリセリン−水をマトリックス
として測定した高分解能陰イオンFABマススペクトル
における精密質量、[M−H]- は、次に示す通りであ
る。1) Properties of substance: Amphoteric water-soluble white powder 2) Molecular formula: C 8 H 14 N 2 O 5 3) Molecular weight: 218 (measured by FAB mass spectrum method) 4) High resolution mass spectrometry: Glycerin-water The accurate mass, [MH] − , in the high resolution negative ion FAB mass spectrum measured as the matrix is as shown below.
【0012】実測値 217.0804 計算値:217.0824 5)元素分析(%):C8 H14N2 O5 ・H2 Oとして 実測値 C 41.07 ,H 6.43,N 12.28 計算値:C 40.67 ,H 6.83,N 11.86 6)比旋光度:[α]D 27 −59°(c0.66,水) 7)紫外線吸収スペクトル:水中で測定した紫外線吸収
スペクトルは、220nm以下に末端吸収を示す。Measured value 217.0804 Calculated value: 217.0824 5) Elemental analysis (%): Measured value as C 8 H 14 N 2 O 5 .H 2 O C 41.07, H 6.43, N 12.28 Calculated value: C 40.67, H 6.83, N 11.86 6) Specific rotation: [α] D 27 −59 ° (c0.66, water) 7) Ultraviolet absorption spectrum: The ultraviolet absorption spectrum measured in water shows a terminal absorption at 220 nm or less.
【0013】8)赤外線吸収スペクトル:λmax cm-1 臭化カリウム(KBr)錠剤法で測定した赤外線吸収スペク
トルは、以下に示す通りである。8) Infrared absorption spectrum: λ max cm -1 potassium bromide (KBr) The infrared absorption spectrum measured by the tablet method is as shown below.
【0014】3351,1673,1590,1525,1447,1394,1372,130
0,1283,1267,1188,1139,1115,1085,1035,1008,965,889,
850,833,750,707 。3351,1673,1590,1525,1447,1394,1372,130
0,1283,1267,1188,1139,1115,1085,1035,1008,965,889,
850,833,750,707.
【0015】9)1 H−核磁気共鳴スペクトル:(δ:
ppm ) 1規定重アンモニア水中、内部基準に水(HDO =4.75pp
m)を使用して測定した1 H−核磁気共鳴スペクトル(360
MHz)は、次に示す通りである。9) 1 H-nuclear magnetic resonance spectrum: (δ:
ppm) 1 normal deuterated ammonia water, water ( H DO = 4.75pp) as internal standard
1 H-nuclear magnetic resonance spectrum (360 m)
MHz) is as shown below.
【0016】2.05(s),2.55(dt,J=4.4,9.9Hz),2.76(dd,J
=4.4,13.0Hz),3.06(dd,J=9.9,13.0Hz),3.79(t,J=4.1H
z),4.27(br.t),4.80(d,J=4.1Hz) 。2.05 (s), 2.55 (dt, J = 4.4, 9.9 Hz), 2.76 (dd, J
= 4.4,13.0Hz), 3.06 (dd, J = 9.9,13.0Hz), 3.79 (t, J = 4.1H
z), 4.27 (br.t), 4.80 (d, J = 4.1Hz).
【0017】10)13C−核磁気共鳴スペクトル:(δ:
ppm ) 1規定重アンモニア水中、内部基準に1,4−ジオキサ
ン(67.4ppm) を使用して測定した13C−核磁気共鳴スペ
クトル(90MHz) は、次に示す通りである。10) 13 C-nuclear magnetic resonance spectrum: (δ:
ppm) 13 C-nuclear magnetic resonance spectrum (90 MHz) measured using 1,4-dioxane (67.4 ppm) as an internal standard in 1N deuterated ammonia water is as shown below.
【0018】23.2(q),38.0(t),48.3(d),62.9(d),68.9
(d),70.6(d),175.2(s),180.6(s) 。23.2 (q), 38.0 (t), 48.3 (d), 62.9 (d), 68.9
(d), 70.6 (d), 175.2 (s), 180.6 (s).
【0019】11)溶解性:水に可溶。酢酸、ピリジン、
メタノール、エタノール、アセトン、クロロホルム、酢
酸エチル、ベンゼン、エーテル、ヘキサン、石油エーテ
ル等の有機溶剤には難溶または不溶。11) Solubility: Soluble in water. Acetic acid, pyridine,
Insoluble or insoluble in organic solvents such as methanol, ethanol, acetone, chloroform, ethyl acetate, benzene, ether, hexane and petroleum ether.
【0020】12)呈色反応:ニンヒドリン試薬に陽性。12) Color reaction: Positive with ninhydrin reagent.
【0021】13)高速液体クロマトグラフィー: カラム;アサヒパックES502N(7.6 φ×100mm 、
旭化成工業(株)製) 溶媒;1mMリン酸緩衝液(pH6.5) 流速;1.0 ml/分 検出波長;210nm 保持時間 ;11.5分。13) High Performance Liquid Chromatography: Column; Asahi Pack ES502N (7.6 φ × 100 mm,
Asahi Kasei Co., Ltd. Solvent: 1 mM phosphate buffer (pH 6.5) Flow rate: 1.0 ml / min Detection wavelength: 210 nm Retention time: 11.5 minutes.
【0022】A−72363はシアスタチンBと立体構
造が1ヶ所異なることによって全く新規な生物活性を示
す。A-72363 has a completely different biological activity from that of cystatin B in one position.
【0023】すなわちA−72363はヘパラナーゼを
阻害するが(IC50;2.7 μg/ml) 、シアスタチンBは50μ
g/mlまでの濃度でヘパラナーゼを全く阻害しない。逆に
A−72363は50μg/mlまでの濃度でシアリダーゼを
全く阻害しないが、シアスタチンBはシアリダーゼを強
く阻害する(IC50;3.6 μg/ml) 。That is, A-72363 inhibits heparanase (IC 50 ; 2.7 μg / ml), but cystatin B has 50 μm.
It does not inhibit heparanase at concentrations up to g / ml. Conversely, A-72363 does not inhibit sialidase at all at concentrations up to 50 μg / ml, whereas cystatin B strongly inhibits sialidase (IC 50 ; 3.6 μg / ml).
【0024】またA−72363はシアスタチンBより
も300倍強力なβ−グルクロニダーゼ阻害作用を有す
る。A-72363 has a β-glucuronidase inhibitory action 300 times stronger than that of cystatin B.
【0025】シアスタチンAはその理化学的性状が不明
で化学構造は未決定であるが、この物質はシアスタチン
Bより約10倍強いシアリダーゼ阻害活性を有し、β−
グルクロニダーゼは阻害しないことが報告されている
(J. Antibiotics, 27巻, 963頁 (1974))。Although the physicochemical properties of cystatin A are unknown and the chemical structure is undetermined, this substance has a sialidase inhibitory activity about 10 times stronger than that of cystatin B, and β-
It has been reported that glucuronidase does not inhibit (J. Antibiotics, 27, 963 (1974)).
【0026】このような酵素阻害活性の特異性の相異か
ら、A−72363がシアスタチンAと別物質であるこ
とは明らかである。From such a difference in specificity of the enzyme inhibitory activity, it is clear that A-72363 is a different substance from siastatin A.
【0027】本発明の前記構造式(I)を有するA−7
2363は、常法に従って塩とすることが出来る。その
ような塩としては、例えばリチウム、ナトリウム、カリ
ウムのようなアルカリ金属の塩;カルシウム、バリウム
のようなアルカリ土類金属の塩;アルミニウム塩;リジ
ン、アルギニンのような塩基性アミノ酸の塩;アンモニ
ア、メチルアミン、ジメチルアミンのようなアミン塩;
フッ化水素酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、塩酸、硝
酸、過塩素酸、炭酸、硫酸、燐酸のような無機酸の塩;
メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、エ
タンスルホン酸のような低級アルキルスルホン酸;ベン
ゼンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸のようなアリ
ルスルホン酸;酢酸、フマル酸、酒石酸、シュウ酸、マ
レイン酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸のような有機
カルボン酸の塩;グルタミン酸、アスパラギン酸のよう
な酸性アミノ酸の塩;等をあげることができる。好適に
は、薬理上許容されうる塩である。A-7 having the above structural formula (I) of the present invention
2363 can be converted into a salt according to a conventional method. Examples of such salts include alkali metal salts such as lithium, sodium and potassium; alkaline earth metal salts such as calcium and barium; aluminum salts; basic amino acid salts such as lysine and arginine; ammonia. Amine salts such as, methylamine, dimethylamine;
Salts of inorganic acids such as hydrofluoric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, hydrochloric acid, nitric acid, perchloric acid, carbonic acid, sulfuric acid, phosphoric acid;
Lower alkyl sulfonic acids such as methane sulfonic acid, trifluoromethane sulfonic acid, ethane sulfonic acid; benzene sulfonic acid, allyl sulfonic acid such as p -toluene sulfonic acid; acetic acid, fumaric acid, tartaric acid, oxalic acid, maleic acid, apple Examples thereof include salts of organic carboxylic acids such as acid, succinic acid and citric acid; salts of acidic amino acids such as glutamic acid and aspartic acid. Preferably, it is a pharmacologically acceptable salt.
【0028】本発明のA−72363を生産する上記SA
NK 60192株は、沖縄県国頭郡東村の土壌から常法に従っ
て採集し、グリセリン−アスパラギン寒天平板上から分
離したものである。The above SA for producing A-72363 of the present invention
The NK 60192 strain was collected from soil in Higashi-mura, Kunigami-gun, Okinawa, according to a conventional method and separated from a glycerin-asparagine agar plate.
【0029】A−72363の生産菌であるSANK 60192
株の菌学的性状は次の通りである。 1.形態学的特徴 ISP[インターナショナル・ストレプトマイセス・プ
ロジェクト(International Streptomyces Project)]規
定の寒天培地上28℃、14日間培養後、顕微鏡下観察
では、本菌株の基生菌糸は良好に伸長、分岐し赤味橙な
いし橙色を示すが、ノカルディア(Nocardia)属菌株様の
断裂やジグザグ伸長は観察されない。気菌糸は車軸状に
分岐する。胞子鎖の形態は直線ないし曲線状を示し、お
よそ10ないし50個の胞子の連鎖を形成する。走査型
電子顕微鏡による観察では、胞子は楕円形で、その表面
構造は平滑(smooth)状を示す。胞子は気菌糸上のみに形
成される。また菌核、菌糸の断裂、胞子のうなどの特殊
器官は観察されない。2.各種培養基上での諸性質 各種培養基上で28℃、14日間培養後の性状は表1に
示すとおりである。色調の表示は日本色彩研究所版、
“標準色票”のカラーチップ・ナンバー(彩度−明度−
色相)を表す。SANK 60192, a bacterium producing A-72363
The mycological properties of the strain are as follows. 1. Morphological characteristics After culturing on an agar medium specified by ISP [International Streptomyces Project] at 28 ° C for 14 days, the basal hyphae of this strain are well elongated and diverged by observation under a microscope. It shows a reddish orange or orange, but the rupture or zigzag extension of Nocardia (Nocardia) strain belonging to the genus like is not observed. The aerial mycelium branches in the shape of an axle. The spore chain morphology is linear or curved and forms a chain of approximately 10 to 50 spores. When observed by a scanning electron microscope, the spores have an elliptical shape and their surface structure shows a smooth shape. Spores are formed only on the aerial mycelium. No special organs such as sclerotia, hyphal tears, sporangia were observed. 2. Properties on various culture media Properties after culturing on various culture media at 28 ° C. for 14 days are shown in Table 1. The color tone is displayed by the Japan Color Research Institute version,
"Standard color chip" color chip number (saturation-brightness-
Hue).
【0030】[0030]
【表1】 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 培地の種類 項目 性状 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− シュクロース・ G: 良好、平坦、明るい赤味橙(12-7-5) 硝酸塩寒天 AM: 余り良くない、ビロ−ド状、白 R: 明るい赤味橙(10-7-5) SP: 産生せず −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− グルコース・ G: 良好、平坦、赤味橙(12-5-4) アスパラギン寒天 AM: 良好に形成、綿毛状、ピンク(6-8-2 ) R: 明るい黄味赤(12-6-3) SP: 産生せず −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− グリセリン・ G: 余り良くない、平坦、橙(8-7-5 ) アスパラギン寒天 AM: 僅かに形成、白 (ISP 5 ) R: 鈍橙(6-7-6 ) SP: 産生せず −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 澱粉・無機塩寒天 G: 非常に良好、平坦、赤味橙(12-5-4) (ISP 4 ) AM: 良好に形成、綿毛状、薄橙(3-9-4 ) R: 黄味赤(12-5-3) SP: 産生せず −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− チロシン寒天 G: 良好、平坦、橙(14-7-6) (ISP 7 ) AM: 僅かに形成、白 R: 橙(12-7-6) SP: 産生せず −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 栄養寒天 G: 非常に良好、隆起状、薄黄味茶(6-8-8 ) (DIFCO ) AM: 余り良くない、ビロード状、白 R: 明るい茶(10-6-6) SP: 産生せず −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− イーストエキス・ G: 非常に良好、隆起状、明るい赤味橙 麦芽エキス寒天 (12-7-5) (ISP 2 ) AM: 余り良くない、ビロード状、白 R: 鈍赤味橙(10-6-5) SP: 産生せず −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− オートミール寒天 G: 非常に良好、平坦、赤味橙(12-5-4) (ISP 3 ) AM: 余り良くない、ビロード状、薄橙 (2-9-5 ) R: 黄味赤(12-5-3) SP: 産生せず −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 水寒天 G: 余り良くない、平坦、薄黄味橙(2-9-9 ) AM: 僅かに形成、白 R: 薄黄味橙(2-9-9 ) SP: 産生せず −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ポテトエキス・ G: 余り良くない、平坦、薄黄(4-9-9 ) 人参エキス寒天 AM: 僅かに形成、白 R: 薄黄(4-9-9 ) SP: 産生せず −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− G:生育、AM:気菌糸、R:裏面、SP:可溶性色素 また、本菌株の基生菌糸に0.05規定塩酸および0.05規定
水酸化ナトリウムを添加したが、これらによる色調の変
化は認められなかった。[Table 1] ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Type of medium Item Properties ----- −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Sucrose ・ G: Good, flat, bright reddish orange (12-7-5 ) Nitrate agar AM: not very good, velvety, white R: bright reddish orange (10-7-5) SP: not produced ---------- Glucose G: Good, flat, reddish orange (12-5-4) Asparagine agar AM: Well formed, fluffy, pink ( 6-8-2) R: Bright yellow red (12-6-3) SP: Not produced ----------------------------------------- −−−−−−−−−− Glycerin ・ G: Not so good, flat, orange (8-7-5) Asparagine agar M: Slightly formed, white (ISP 5) R: Dull orange (6-7-6) SP: Not produced −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− −−−−−−−−−−−−−− Starch / inorganic salt agar G: Very good, flat, reddish orange (12-5-4) (ISP 4) AM: Well formed, fluffy, thin Orange (3-9-4) R: Yellowish red (12-5-3) SP: Not produced −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− −−−−−−−−−−− Tyrosine agar G: Good, flat, orange (14-7-6) (ISP 7) AM: Slightly formed, white R: Orange (12-7-6) SP: Not produced -------------------------------------- Nutrient agar G: Very good, raised, Light yellowish tea (6-8-8) (DIFCO) AM: Not very good, velvety, white R: Bright tea (10-6-6) SP: Not produced ------------- −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Yeast extract ・ G: Very good, bumpy, bright reddish orange malt extract agar (12-7- 5) (ISP 2) AM: not very good, velvety, white R: dull reddish orange (10-6-5) SP: not produced −−−−−−−−−−−−−−−−−− −−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Oatmeal agar G: Very good, flat, reddish orange (12-5-4) (ISP 3) AM: Not very good, Velvety, light orange (2-9-5) R: Yellowish red (12-5-3) SP: Not produced ------------------------------- −−−−−−−−−−−−−−−− Water agar G: Not very good, flat, light yellowish orange (2-9-9) AM: Slightly formed, white R: Light yellowish orange ( 2-9-9) SP: Not produced −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− −−−−− Potato extract G: Not very good, flat, light yellow (4-9-9) Ginseng extract agar AM: Slightly formed, white R: Light yellow (4-9-9) SP: Produced No ------------------------------------------ G: growth, AM: aerial mycelium, R: back surface, SP: Soluble pigment Further, 0.05N hydrochloric acid and 0.05N sodium hydroxide were added to the basal hyphae of this strain, but no change in color tone due to these was observed.
【0031】3.生理学的性質 28℃で培養後、2ないし21日間に観察した本菌株の
生理学的性質は表2に示したとおりである。3. Physiological Properties The physiological properties of this strain observed for 2 to 21 days after culturing at 28 ° C. are shown in Table 2.
【0032】[0032]
【表2】 [Table 2]
【0033】また、プリドハム・ゴトリーブ寒天培地
(ISP 9)を使用して、28℃、14日間培養後に
観察した本菌株の炭素源の資化性は表3に示すとおりで
ある。Further, as shown in Table 3, the carbon source assimilation of this strain was observed after culturing at 28 ° C. for 14 days using Prideham-Gotrieve agar medium (ISP 9).
【0034】[0034]
【表3】 [Table 3]
【0035】4.菌体成分について 本菌株の細胞壁はビー・ベッカーらの方法[B.Becker et
al.,Applied Microbiology、12巻、1984 年] に従い検討
した結果、LL−ジアミノピメリン酸が検出されたこと
から細胞壁タイプIであることが確認された。また、本
菌株の全細胞中の糖成分をエム・ピー・レシェバリエの
方法[M.P.Lechevalier,Journal of Laboratory Clinica
l Medicine、71 巻、934頁 (1968)]に従い検討した結果、
特徴的なパターンは認められなかった。4. Regarding the cell components, the cell wall of this strain is the method of B. Becker et al.
al., Applied Microbiology, Vol. 12, 1984], and as a result, LL-diaminopimelic acid was detected, and it was confirmed to be cell wall type I. In addition, the sugar components in the whole cells of this strain can be analyzed by the method of MP Rechevalier [MP Lechevalier, Journal of Laboratory Clinica
l Medicine, 71, 934 (1968)],
No characteristic pattern was observed.
【0036】以上の菌学的性質から、本菌株は放線菌の
中でもストレプトマイセス(Streptomyces)属に属するこ
とが明らかにされた。シャーリングとゴトリーブによる
ISP菌株記載[(E.B.Shirling and D.Gottlieb)、イン
ターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック
・バクテリオロジー(International Journal of System
atic Bacteriology)、 第18巻、68-189 頁(1968 年)、第18
巻、279-392頁(1968 年)、第19巻、391-512頁(1969 年)、第
22巻、265-394頁(1972 年)]、 ワックスマン著、ジ・アク
チノミセテス(S.A.Waksman;The Actinomycetes) 第2
巻、 ブキャナンとギボンズ編バージーズ・マニュアル
(R.E.Buchanan and N.E.Gibbons、Bergey's Manual of D
eterminative Bacteriology)第8 版(1974 年)、ウイリア
ムズ、シャープおよびホルト編バージーズ・マニュアル
(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology)第4 巻
(1989 年)、およびストレプトマイセス(Streptomyces)属
放線菌に関する最近の文献に記載されている菌種と比較
したところ、ストレプトマイセス・ノビリス(Streptomy
ces nobilis)に極めて近縁であることが判明した。しか
しながら、ストレプトマイセス・ノビリス(Streptomyce
s nobilis)は硝酸塩還元性が陽性である点、食塩耐性が
7%である点およびL−アラビノース資化性が陽性であ
る点において差異が認められた。このような菌学的特徴
を有する本菌株は明らかにストレプトマイセス・ノビリ
ス(Streptomyces nobilis)とは異なる新菌株であると思
われるが、これらの差異をもって種を区別することは出
来ないため本菌株をストレプトマイセス・ノビリス(Str
eptomyces nobilis)と同定し、保存番号としてSANK 601
92(寄託機関、工業技術院微生物工業技術研究所:寄託
番号、微工研条寄第4000号(FERM BP 4000): 原寄託日、1
992 年9 月2 日)を付与した。From the above-mentioned mycological properties, it was revealed that this strain belongs to the genus Streptomyces among actinomycetes. Description of ISP strain by Shirring and Gottlieb [(EB Shirling and D. Gottlieb), International Journal of System Bacteriology
atic Bacteriology), Vol. 18, pp. 68-189 (1968), Vol. 18
Volume, Pages 279-392 (1968), Volume 19, Pages 391-512 (1969), Vol.
22: 265-394 (1972)], Waxman, The Actinomycetes, SAWaksman; The 2nd
Volume, Buchanan and Gibbons, Vergise Manual
(REBuchanan and NEGibbons, Bergey's Manual of D
eterminative Bacteriology) 8th Edition (1974), Williams, Sharp and Holt, Vergise Manual
(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology) Volume 4
(1989) and the strains described in the recent literature on Streptomyces actinomycetes, Streptomyces nobilis ( Streptomyces nobilis
ces nobilis ). However, Streptomyces Nobilis (Streptomyce
s nobilis) points nitrate reduction resistance is positive, the point salt resistance is of 7% and L- arabinose assimilation was observed difference in that it is positive. This strain having such bacteriological characteristics is apparently a new strain different from Streptomyces nobilis ( Streptomyces nobilis ), but it is not possible to distinguish the species with these differences, so this strain Streptomyces nobilis ( Str
eptomyces nobilis ) and SANK 601 as a preservation number
92 (Deposit institution, Institute of Microbial Science and Technology, Agency of Industrial Science and Technology: Deposit number, Microtechnology Research Institute Article 4000 (FERM BP 4000): Original deposit date, 1
(September 2, 992).
【0037】以上、SANK 60192株について説明したが、
放線菌の諸性質は一定したものではなく、自然的、人工
的に容易に変化することは周知の通りであり、本発明で
使用しうる菌株は、ストレプトマイセス属に属するA−
72363を生産する全ての菌株を包含するものであ
る。The SANK 60192 strain has been described above,
It is well known that the properties of actinomycetes are not constant and easily change naturally and artificially, and the strain that can be used in the present invention is A- which belongs to the genus Streptomyces.
It includes all strains producing 72363.
【0038】本発明の新規化合物A−72363を得る
ため、これらの微生物の培養は他の醗酵生成物を生産す
るために通常用いられるような培地中で行われる。この
ような培地中には、微生物が資化出来る炭素源、窒素源
および無機塩を含有する。In order to obtain the novel compound A-72363 of the present invention, the cultivation of these microorganisms is carried out in a medium as is usually used for producing other fermentation products. Such a medium contains a carbon source, a nitrogen source and an inorganic salt that can be assimilated by the microorganism.
【0039】一般に、炭素源として、グルコース、フラ
クトース、マルトース、シュークロース、マンニトー
ル、グリセロール、デキストリン、オート麦、ライ麦、
トウモロコシデンプン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、
大豆粉、綿実油、糖蜜、クエン酸、酒石酸などを単一
に、あるいは併用して用いる事が出来る。一般には、培
地量の1−10重量%で変量する。Generally, as carbon sources, glucose, fructose, maltose, sucrose, mannitol, glycerol, dextrin, oats, rye,
Corn starch, potato, corn flour,
Soybean powder, cottonseed oil, molasses, citric acid, tartaric acid, etc. can be used alone or in combination. Generally, the amount is variable at 1-10% by weight of the medium amount.
【0040】窒素源としては、一般に蛋白質を含有する
物質を醗酵工程に用いる。適当な窒素源としては、大豆
粉、フスマ、落花生粉、綿実油、綿実粉、カゼイン加水
分解物、ファーマミン、魚粉、コーンスチープリカー、
ペプトン、肉エキス、イースト、イーストエキス、マル
トエキス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム等である。窒素源は、単一または併用して培
地量の0.2 −6重量%の範囲で用いる。As the nitrogen source, a substance containing a protein is generally used in the fermentation process. Suitable nitrogen sources include soybean flour, bran, peanut flour, cottonseed oil, cottonseed flour, casein hydrolyzate, pharmamine, fish meal, corn steep liquor,
Peptone, meat extract, yeast, yeast extract, malt extract, sodium nitrate, ammonium nitrate, ammonium sulfate and the like. The nitrogen sources are used alone or in combination in the range of 0.2-6% by weight of the medium amount.
【0041】培地中に取り入れる栄養無機塩は、ナトリ
ウム、アンモニウム、カルシウム、フォスフェート、サ
ルフェート、クロライド、カーボネート等のイオンを得
ることの出来る通常の塩類である。また、カリウム、カ
ルシウム、コバルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の
微量の金属も含む。The nutrient inorganic salts to be incorporated in the medium are usual salts capable of obtaining ions such as sodium, ammonium, calcium, phosphate, sulfate, chloride and carbonate. It also contains trace amounts of metals such as potassium, calcium, cobalt, manganese, iron and magnesium.
【0042】液体培養に際しては消泡剤としてシリコン
油、植物油、界面活性剤等が使用される。In liquid culture, defoaming agents such as silicone oil, vegetable oil, and surfactant are used.
【0043】ストレプトマイセス・ノビリス(Streptomy
ces nobilis) SANK 60192 株を培養しA−72363を
生産する培地のpHは、5.0 −8.0 に変化させることが出
来る。 Streptomyces nobilis
ces nobilis ) SANK 60192 strain and the pH of the medium for producing A-72363 can be changed to 5.0-8.0.
【0044】菌の生育温度は12℃から35℃までであ
るが23℃から30℃の範囲が良好である。The growth temperature of the bacterium is 12 ° C. to 35 ° C., but the range of 23 ° C. to 30 ° C. is preferable.
【0045】A−72363はこの温度範囲において生
産されるが、好適なのは26℃から30℃である。A-72363 is produced in this temperature range, with 26 to 30 ° C being preferred.
【0046】A−72363は、好気的に培養して得ら
れるが、通常用いられる好気的培養法、例えば固体培養
法、振とう培養法、通気撹拌培養法等が用いられる。A-72363 can be obtained by aerobically culturing, and a commonly used aerobic culturing method, for example, a solid culturing method, a shaking culturing method, an aeration and stirring culturing method or the like is used.
【0047】小規模な培養においては、28℃で数日間
振とう培養を行うのが良好である。培養は、バッフル
(水流調節壁)のついた三角フラスコ中で、1−2段階
の種の発育工程により開始する。種発育段階の培地は、
炭素源および窒素源を併用出来る。種フラスコは定温イ
ンキュベーター中で28℃、5日間振とうするか、また
は充分に成長するまで振とうする。成長した種は第二の
種培地、または生産培地に接種するのに用いる。中間の
発育工程を用いる場合には、本質的に同様の方法で成長
させ、生産培地に接種するためにそれを部分的に用い
る。接種したフラスコを一定温度で数日間振とうし、イ
ンキュベーションが終わったらフラスコの含有物を遠心
分離またはろ過する。For small-scale culture, it is preferable to carry out shaking culture at 28 ° C. for several days. The cultivation is started in a Erlenmeyer flask equipped with a baffle (water flow control wall) by 1-2 stages of seed development process. The medium at the seed development stage is
A carbon source and a nitrogen source can be used together. The seed flask is shaken in a constant temperature incubator at 28 ° C. for 5 days, or until it grows sufficiently. The grown seed is used to inoculate a second seed medium, or production medium. If an intermediate development step is used, it is grown in essentially the same way and partially used to inoculate the production medium. The inoculated flask is shaken at constant temperature for several days, and after the incubation is complete, the contents of the flask are centrifuged or filtered.
【0048】大量培養の場合には、撹拌機、通気装置を
付けた適当なジャーファーメンターあるいはタンクで培
養するのが好ましい。この方法によれば、栄養培地をジ
ャーファーメンターあるいはタンクの中で作成出来る。
栄養培地を125℃まで加熱して滅菌し、冷却後滅菌培
地にあらかじめ成長させてあった種を接種する。培養は
28℃で通気撹拌して行う。この方法は、多量の化合物
を得るのに適している。In the case of large-scale culture, it is preferable to culture in a suitable jar fermenter or tank equipped with a stirrer and an aerator. According to this method, the nutrient medium can be prepared in a jar fermenter or a tank.
The nutrient medium is sterilized by heating to 125 ° C., after cooling, the sterile medium is inoculated with the pre-grown seeds. The culture is performed by aeration and stirring at 28 ° C. This method is suitable for obtaining large amounts of compounds.
【0049】培養の経過に伴って生産されるA−723
63の量の経時変化は、ヘパラナーゼに対する阻害活性
により測定出来る。通常は、72時間から120時間の
培養でA−72363の生産量は最高値に達する。A-723 produced with the progress of culture
The change with time of the amount of 63 can be measured by the inhibitory activity against heparanase. Usually, the maximum production of A-72363 is reached after 72 to 120 hours of culture.
【0050】培養終了後、培養液中の液体成分に存在す
るA−72363は、菌体その他の固形部分を珪藻土を
ろ過助剤とするろ過操作または遠心分離によって分別
し、そのろ液または上清中に存在するA−72363
を、その物理化学的性状を利用し抽出精製することによ
り得られる。なお、A−72363は、不安定な化合物
であり、精製は低温条件下、好ましくは4℃にて行うこ
とにより良好な精製収率を得ることが出来る。例えば、
ろ液または上清中に含まれるA−72363は、塩基性
条件下、活性炭による脱色の後、酸性条件下、強酸性陽
イオン交換樹脂に吸着させ、1〜3規定のアンモニア水
によって溶出させる抽出精製操作を行うことにより得ら
れる。After the completion of the culture, A-72363 present in the liquid component in the culture medium was separated from the bacterial cells and other solid parts by a filtration operation using diatomaceous earth as a filter aid or centrifugation, and the filtrate or supernatant thereof. A-72363 present in
Is obtained by utilizing its physicochemical properties to extract and purify. A-72363 is an unstable compound, and a good purification yield can be obtained by carrying out purification under low temperature conditions, preferably at 4 ° C. For example,
Extraction of A-72363 contained in the filtrate or supernatant after decolorization with activated carbon under basic conditions, adsorption on a strongly acidic cation exchange resin under acidic conditions, and elution with 1 to 3 normal ammonia water It is obtained by performing a purification operation.
【0051】このようにして得られたA−72363
は、さらに、低温条件下、強塩基性および弱塩基性陰イ
オン交換樹脂、陽イオンあるいは陰イオン交換型カラム
を用いた高速液体クロマトグラフィーおよび強酸性陽イ
オン交換樹脂等により精製することが出来る。A-72363 thus obtained
Further, it can be further purified under a low temperature condition by strong basic and weak basic anion exchange resins, high performance liquid chromatography using a cation or anion exchange type column, strong acidic cation exchange resin and the like.
【0052】以上の分離、精製の手段を単独または、適
宜組み合わせ反復して用いることによりA−72363
を分離精製することが出来る。A-72363 can be obtained by repeating the above-mentioned separation and purification means alone or in appropriate combination.
Can be separated and purified.
【0053】[0053]
【作用】本発明のA−72363は、文献未載の新規化
合物であり、動物(例、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ等)
において、ヘパラナーゼおよびβ−グルクロニダーゼに
対し阻害活性を示し、癌転移抑制剤または抗癌剤として
有用である。The A-72363 of the present invention is a novel compound which has not been published in the literature, and is used in animals (eg, humans, dogs, cats, rabbits, etc.).
In, it shows inhibitory activity against heparanase and β-glucuronidase, and is useful as a cancer metastasis suppressor or anticancer agent.
【0054】ペパラナーゼ活性はヘパラン硫酸を 3Hラ
ベルし、その分解物の放射活性により測定するが、基質
と反応産物を効率よく分離するためにNakajimaらの固相
化基質法(Anal.Biochem.、157巻、162頁(1986 年))を改変
して用い、この反応液にA−72363を添加してその
阻害をみることができる。[0054] Peparanaze activity is 3 H labeled heparan sulfate, but is measured by radioactivity of the degradation product, the Nakajima et al in order to separate the substrate and the reaction products effectively immobilized substrate method (Anal. Biochem., 157, 162 (1986)) is modified and used, and its inhibition can be observed by adding A-72363 to this reaction solution.
【0055】β−グルクロニダーゼ活性は、基質フェノ
ールフタレイン−グルクロン酸を分解し、フェノールフ
タレインを遊離せしめる活性をUV550 nm で測定す
ることにより決定しうる。また、反応液に阻害物質を添
加することにより、該酵素活性の阻害をみることができ
る。The β-glucuronidase activity can be determined by measuring the activity of degrading the substrate phenolphthalein-glucuronic acid and releasing phenolphthalein at UV550 nm. In addition, inhibition of the enzyme activity can be observed by adding an inhibitor to the reaction solution.
【0056】本発明のA−72363を医薬として用い
る場合、常法に従ってそれ自体または適宜の薬学的に許
容される担体、賦形剤、希釈剤と混合し、粉末、顆粒、
錠剤、カプセル剤、注射剤などの形態で経口的または非
経口的に安全に投与することが出来る。投与量は対象疾
患、投与経路および投与回数などにより異なるが、例え
ば成人に対しては1日10mgから2000mgを、症状に応じて
1回または数回にわけて投与することが好ましい。When A-72363 of the present invention is used as a medicine, it is mixed with itself or an appropriate pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent according to a conventional method, and powder, granules,
It can be safely administered orally or parenterally in the form of tablets, capsules, injections and the like. Although the dose varies depending on the disease to be treated, the route of administration, the number of administrations, etc., for example, for adults, it is preferable to administer 10 mg to 2000 mg daily in one or several divided doses depending on the symptoms.
【0057】[0057]
【実施例】次に実施例および試験例をあげて、本発明を
さらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定され
るものではない。EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to Examples and Test Examples, but the present invention is not limited thereto.
【0058】実施例1.A−72363 A)培養 ストレプトマイセス・ノビリス(Streptomyces nobilis)
SANK 60192株を、無菌的に、滅菌した後述の組成の培地
500mlを含むバッフル付き2リットル容三角フラスコ
に一白金耳接種し、28℃で、200rpm (7cmの回転
半径)のロータリー振とう培養機で5日間培養した。Example 1. A-72363 A) Culture Streptomyces nobilis
SANK 60192 strain was aseptically inoculated into a 2-liter Erlenmeyer flask with baffle containing 500 ml of medium having the following composition sterilized, one platinum loop was inoculated, and at 28 ° C, a rotary shaking culture machine at 200 rpm (rotation radius of 7 cm). The cells were cultured for 5 days.
【0059】2基の30リットル容ステンレス製ジャー
ファーメンター中に、各々15リットルずつの種培養と
同一の培地を入れ、これを120℃で30分加熱殺菌し
た。次いで、これに上述の種培養液を450ml入れ、2
8℃で5日間、15リットル/分の空気流量で溶存酸素
濃度を5ppm に保つため撹拌速度を100−300rpm
の範囲で自動的にコントロールし撹拌培養した。培地組
成を表4に示す。15 liters of the same medium as in the seed culture was placed in each of two 30 liter stainless steel jar fermenters, and this was sterilized by heating at 120 ° C. for 30 minutes. Then, add 450 ml of the above-mentioned seed culture to this, 2
Agitating speed of 100-300 rpm to maintain the dissolved oxygen concentration at 5 ppm at an air flow rate of 15 l / min for 5 days at 8 ° C.
The content was automatically controlled within the range of, and the culture was performed with stirring. The medium composition is shown in Table 4.
【0060】[0060]
【表4】 [Table 4]
【0061】B)単離 得られた培養液30リットルに純水6リットル、ろ過助
剤としてセライト545(米国ジョーンズ・マンビル・
プロジェクト・コーポレーション製)1.8kg を添加後ろ
過し、ろ液30リットルを得た。ろ液を6規定の水酸化
ナトリウムでpH9に調整した後、活性炭(精製白鷺、武
田薬品工業(株)製)3リットルを加え、1時間撹拌し
た。セライト545を1.5 リットル添加し、ろ過、水洗
することにより、32リットルのろ液を得た。このろ液
のpHを、6規定の塩酸を用いて2に調整し、4℃にて1
時間放置、生じた沈澱物を連続遠心分離により除去し
た。この分離液を強酸性陽イオン交換樹脂ダイヤイオン
PK216(H+ )(三菱化成(株)製)10リットル
のカラムにかけ、このカラムを30リットルの純水で洗
浄した。1規定のアンモニア水60リットルで、カラム
に吸着された活性物質を溶出し、この溶液を減圧濃縮、
凍結乾燥して褐色粗粉末43.5gを得た。B) Isolation 6 liters of pure water was added to 30 liters of the obtained culture solution, and Celite 545 (Jones Manville, USA) as a filter aid.
1.8 kg (manufactured by Project Corporation) was added and filtered to obtain 30 liters of filtrate. The filtrate was adjusted to pH 9 with 6 N sodium hydroxide, and then 3 liters of activated carbon (purified Shirasagi, Takeda Pharmaceutical Co., Ltd.) was added and stirred for 1 hour. By adding 1.5 liters of Celite 545, filtering and washing with water, 32 liters of a filtrate was obtained. The pH of this filtrate was adjusted to 2 with 6N hydrochloric acid and adjusted to 1 at 4 ° C.
After standing for a period of time, the resulting precipitate was removed by continuous centrifugation. This separated liquid was applied to a 10-liter column of strongly acidic cation exchange resin Diaion PK216 (H + ) (manufactured by Mitsubishi Kasei Co., Ltd.), and this column was washed with 30 liters of pure water. The active substance adsorbed on the column was eluted with 60 liters of 1N ammonia water, and the solution was concentrated under reduced pressure.
Lyophilization gave 43.5 g of brown crude powder.
【0062】得られた褐色粗粉末43.1gを1mMの燐酸緩
衝液(pH6.5) 600mlに溶解し、予め燐酸型に調製し1
mMの燐酸緩衝液(pH6.5) で平衡化した弱塩基性陰イオン
交換セルロースDE53(ワットマン社製)カラム2.7
リットルにかけ、同一の緩衝液を用いて展開し、活性画
分を集めて濃縮、凍結乾燥して淡黄色粉末394mgを得
た。43.1 g of the obtained brown crude powder was dissolved in 600 ml of 1 mM phosphate buffer (pH 6.5) to prepare a phosphate type in advance.
Weakly basic anion exchange cellulose DE53 (manufactured by Whatman) column 2.7 equilibrated with mM phosphate buffer (pH 6.5)
The mixture was poured into liters, developed using the same buffer, and the active fractions were collected, concentrated and freeze-dried to obtain 394 mg of a pale yellow powder.
【0063】得られた淡黄色粉末394mgを1mMの燐酸
緩衝液(pH6.5) 4mlに溶解し、予め燐酸型に調製し1mM
の燐酸緩衝液(pH6.5) で平衡化した弱塩基性陰イオン交
換セルロースDE52(ワットマン社製)カラム160
mlにかけ、同一の緩衝液を用いて展開し、活性画分を集
めて濃縮、凍結乾燥し、淡黄色粉末55mgを得た。394 mg of the obtained pale yellow powder was dissolved in 4 ml of 1 mM phosphate buffer solution (pH 6.5), and the solution was prepared in advance in phosphate form to 1 mM.
Weakly basic anion exchange cellulose DE52 (manufactured by Whatman) column 160 equilibrated with phosphate buffer (pH 6.5)
The mixture was applied to ml and developed using the same buffer, and the active fractions were collected, concentrated and freeze-dried to obtain 55 mg of a pale yellow powder.
【0064】得られた粉末は、さらに高速液体クロマト
グラフィーを用いて分取を行った。以下の分取条件で分
取を行い、18〜24分の間に溶出されるピークを集め
た。The obtained powder was further fractionated by high performance liquid chromatography. Fractionation was performed under the following fractionation conditions, and peaks eluted during 18 to 24 minutes were collected.
【0065】カラム:アサヒパックES502NP(21.
5 φ×100mm、旭化成工業( 株) 製) 展開液:1mM 燐酸緩衝液(pH6.5) 流速: 5ml/分 検出波長:210nm 得られた溶液を、最終的に、強酸性陽イオン交換樹脂A
G50WX8(H+ )(バイオ・ラド社製)カラム4ml
にかけ、カラムを20mlの蒸留水で洗浄後、吸着された
活性物質を1規定のアンモニア水60mlで溶出させた。
この溶出液を凍結乾燥することにより、A−72363
の白色粉末5.4mg が純品として得られた。Column: Asahi Pack ES502NP (21.
5 φ × 100 mm, manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.) Developing solution: 1 mM Phosphate buffer solution (pH 6.5) Flow rate: 5 ml / min Detection wavelength: 210 nm The solution finally obtained is a strongly acidic cation exchange resin A.
G50WX8 (H + ) (Bio-Rad) column 4 ml
After washing the column with 20 ml of distilled water, the adsorbed active substance was eluted with 60 ml of 1N aqueous ammonia.
By freeze-drying this eluate, A-72363
White powder of 5.4 mg was obtained as a pure product.
【0066】[0066]
試験例1.ヘパラナーゼ阻害活性 ヘパラナーゼ阻害活性は、Nakajimaらの方法(Anal.Bioc
hem.、157巻、162頁(1986 年))を改変して行った。すなわ
ちヘパラナーゼはマウスメラノーマ細胞の細胞抽出液よ
り調製した。また、ヘパラン硫酸(生化学工業(株)
製)を3H−無水酢酸で標識し、適当なビーズに固定し基
質として用いた。なおここで適当なビーズとは、通常ア
フィニティクロマトに用いられる各種担体をさす。Test Example 1. Heparanase inhibitory activity The heparanase inhibitory activity was determined by the method of Nakajima et al. (Anal.
hem., 157, 162 (1986)). That is, heparanase was prepared from a cell extract of mouse melanoma cells. In addition, heparan sulfate (Seikagaku Corporation)
Was prepared by labeling with 3 H-acetic anhydride, fixed on appropriate beads and used as a substrate. The appropriate beads here refer to various carriers that are usually used in affinity chromatography.
【0067】この酵素液、基質液およびA−72363
を20mM D−糖酸(saccharic acid)−1,4−ラクト
ン(シグマ社製)および0.1 M酢酸ナトリウム緩衝液(p
H5.0) の混合液に添加し、最終液量を400μlとして
37℃で3時間反応させた。トリクロロ酢酸を終濃度5
%となるよう加えて反応を停止させ、4℃、12,000rpm
で5分間遠心した。この上清の一定量にピコフロー(パ
ッカード社製)5mlを加えて放射活性を測定した。This enzyme solution, substrate solution and A-72363
Was added to 20 mM D-saccharic acid-1,4-lactone (manufactured by Sigma) and 0.1 M sodium acetate buffer (p
H5.0) was added to the mixture, the final volume was 400 μl, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 3 hours. Trichloroacetic acid to a final concentration of 5
% To stop the reaction, 4 ℃, 12,000 rpm
It was centrifuged for 5 minutes. Radioactivity was measured by adding 5 ml of Picoflow (manufactured by Packard) to a fixed amount of this supernatant.
【0068】その結果、A−72363のヘパラナーゼ
阻害のIC50は2.7 μg/mlであった。一方シアスタチン
Bは、50μg/mlまでの濃度で阻害を示さなかった。As a result, the IC 50 of heparanase inhibition of A-72363 was 2.7 μg / ml. Cyastatin B, on the other hand, showed no inhibition at concentrations up to 50 μg / ml.
【0069】試験例2 シアリダーゼ阻害活性 シアリダーゼ阻害活性はUmezawa らの方法(J.Antibioti
cs、 27巻、 963頁 (1974年))に基づいて測定した。すな
わち、0.32mMの基質N−アセチルノイラミンラクトース
(シグマ社製)とA−72363を含む50mMリン酸緩
衝液(pH6.0) 450μl にクロストリデウム・パーフレ
ンジンより得たシアリダーゼ(シグマ社製)を含む溶液
50μl を加え、37℃で30分間反応させた後、0.02
5 M過ヨウ素酸ナトリウム、0.125 N硫酸250μl を
加えて反応を停止した。Test Example 2 Sialidase Inhibitory Activity The sialidase inhibitory activity was determined by the method of Umezawa et al. (J. Antibioti
cs, 27, 963 (1974)). That is, sialidase (manufactured by Sigma) obtained from Clostridium perfrendin was added to 450 μl of 50 mM phosphate buffer (pH 6.0) containing 0.32 mM of substrate N-acetylneuramine lactose (manufactured by Sigma) and A-72363. Add 50 μl of the solution containing the mixture and incubate at 37 ℃ for 30 minutes, then add 0.02
The reaction was stopped by adding 250 µl of 5 M sodium periodate and 0.125 N sulfuric acid.
【0070】反応終了後遊離したN−アセチルノイラミ
ン酸をチオバルビツール試薬法(J.Biol.Chem.、234 巻、1
971 頁(1959 年))により定量した。After completion of the reaction, N-acetylneuraminic acid liberated was reacted with the thiobarbitur reagent method (J. Biol. Chem., Volume 234, 1).
Page 971 (1959)).
【0071】その結果シアスタチンBのIC50は3.6 μ
g/mlであるのに対し、A−72363は50μg/mlまで
の濃度でシアリダーゼを全く阻害しなかった。As a result, the IC 50 of cystatin B was 3.6 μ.
Whereas g-ml, A-72363 did not inhibit sialidase at all at concentrations up to 50 μg / ml.
【0072】試験例3 β−グルクロニダーゼ阻害活性 β−グルクロニダーゼ阻害活性は、Umezawa らの方法
(J.Antibiotics、 27巻、963頁 (1974年))に基づいて行っ
た。すなわち、0.5mM の基質フェノールフタレイン−グ
ルクロン酸とA−72363を含む0.1 M酢酸ナトリウ
ム緩衝液(pH5.0) 180μl に、牛肝臓β−グルクロニ
ダーゼ(シグマ社製)を含む溶液20μl を加え、37
℃で1時間反応後、0.5ml の0.5 Mグリシン−KOH 緩衝
液(pH10.5)を加えて5分間3000rpm で遠心した。遠心
後、上清の550nmにおける吸光度を測定し、遊離した
フェノールフタレインを定量した。Test Example 3 β-Glucuronidase Inhibitory Activity β-Glucuronidase inhibitory activity was determined by the method of Umezawa et al.
(J. Antibiotics, 27, 963 (1974)). That is, to 180 μl of 0.1 M sodium acetate buffer (pH 5.0) containing 0.5 mM substrate phenolphthalein-glucuronic acid and A-72363, 20 μl of a solution containing bovine liver β-glucuronidase (manufactured by Sigma) was added, and 37
After reacting at 0 ° C for 1 hour, 0.5 ml of 0.5 M glycine-KOH buffer (pH 10.5) was added and the mixture was centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes. After centrifugation, the absorbance of the supernatant at 550 nm was measured to quantify the released phenolphthalein.
【0073】その結果A−72363、シアスタチンB
のIC50はそれぞれ、0.15μg/ml,48.0μg/mlであっ
た。As a result, A-72363 and cystatin B
The IC 50 of each was 0.15 μg / ml and 48.0 μg / ml, respectively.
【0074】以上から、本発明の新規化合物A−723
63は、癌転移抑制剤または抗癌剤として有用である。From the above, the novel compound A-723 of the present invention
63 is useful as a cancer metastasis inhibitor or an anticancer agent.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小川 佳年生 福島県いわき市泉町下川字大剱389−4 三共株式会社内 (72)発明者 榎田 竜三 茨城県つくば市御幸が丘33 三共株式会社 内 (72)発明者 岡崎 尚夫 茨城県つくば市御幸が丘33 三共株式会社 内 (72)発明者 木下 武 東京都品川区広町1丁目2番58号 三共株 式会社内 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (72) Inventor Yoshinori Ogawa, 389-4 Oigata, Shimokawa, Izumi-cho, Iwaki, Fukushima Prefecture Sankyo Co., Ltd. (72) Ryuzo Enokida 33 Miyukigaoka, Tsukuba City, Ibaraki Sankyo Co., Ltd. (72) Inventor Naoo Okazaki 33 Miyukigaoka, Tsukuba, Ibaraki Sankyo Co., Ltd. (72) Takeshi Kinoshita 1-25-2 Hiromachi, Shinagawa-ku, Tokyo Sankyo Co., Ltd.
Claims (4)
63またはその塩。 【化1】 1. A-723 having the following structural formula (I):
63 or salt thereof. [Chemical 1]
63またはその塩: 1)物質の性状:両性水溶性白色粉末 2)分子式:C8 H14N2 O5 3)分子量:218(FABマススペクトル法により測
定) 4)高分解能質量分析:グリセリン−水をマトリックス
として測定した高分解能陰イオンFABマススペクトル
における精密質量、[M−H]- は、次に示す通りであ
る。 実測値 217.0804 計算値:217.0824 5)元素分析(%):C8 H14N2 O5 ・H2 Oとして 実測値 C 41.07 ,H 6.43,N 12.28 計算値:C 40.67 ,H 6.83,N 11.86 6)比旋光度:[α]D 27 −59°(c0.66,水) 7)紫外線吸収スペクトル:水中で測定した紫外線吸収
スペクトルは、220nm以下に末端吸収を示す。 8)赤外線吸収スペクトル:λmax cm-1 臭化カリウム(KBr)錠剤法で測定した赤外線吸収スペク
トルは、以下に示す通りである。3351,1673,1590,1525,
1447,1394,1372,1300,1283,1267,1188,1139,1115,1085,
1035,1008,965,889,850,833,750,707 。 9)1 H−核磁気共鳴スペクトル:(δ:ppm ) 1規定重アンモニア水中、内部基準に水(HDO =4.75pp
m)を使用して測定した1 H−核磁気共鳴スペクトル(360
MHz)は、次に示す通りである。2.05(s),2.55(dt,J=4.4,
9.9Hz),2.76(dd,J=4.4,13.0Hz),3.06(dd,J=9.9,13.0H
z),3.79(t,J=4.1Hz),4.27(br.t),4.80(d,J=4.1Hz) 。 10)13C−核磁気共鳴スペクトル:(δ:ppm ) 1規定重アンモニア水中、内部基準に1,4−ジオキサ
ン(67.4ppm) を使用して測定した13C−核磁気共鳴スペ
クトル(90MHz) は、次に示す通りである。23.2(q),38.0
(t),48.3(d),62.9(d),68.9(d),70.6(d),175.2(s),180.6
(s) 。 11)溶解性:水に可溶。酢酸、ピリジン、メタノール、
エタノール、アセトン、クロロホルム、酢酸エチル、ベ
ンゼン、エーテル、ヘキサン、石油エーテル等の有機溶
剤には難溶または不溶。 12)呈色反応:ニンヒドリン試薬に陽性。 13)高速液体クロマトグラフィー: カラム;アサヒパックES502N(7.6 φ×100mm,旭
化成工業(株)製) 溶媒;1mMリン酸緩衝液(pH6.5) 流速;1.0 ml/分 検出波長;210nm 保持時間 ; 11.5 分。2. A-723 having the following physicochemical properties:
63 or salt thereof: 1) Property of substance: amphoteric water-soluble white powder 2) Molecular formula: C 8 H 14 N 2 O 5 3) Molecular weight: 218 (measured by FAB mass spectrum method) 4) High resolution mass spectrometry: glycerin- The precise mass [MH] − in the high resolution negative ion FAB mass spectrum measured using water as a matrix is as shown below. Measured value 217.0804 Calculated value: 217.0824 5) Elemental analysis (%): Measured value as C 8 H 14 N 2 O 5 .H 2 O C 41.07, H 6.43, N 12.28 Calculated value: C 40.67, H 6.83, N 11.86 6 ) Specific rotation: [α] D 27 −59 ° (c0.66, water) 7) Ultraviolet absorption spectrum: The ultraviolet absorption spectrum measured in water shows a terminal absorption at 220 nm or less. 8) Infrared absorption spectrum: λ max cm -1 potassium bromide (KBr) The infrared absorption spectrum measured by the tablet method is as shown below. 3351,1673,1590,1525,
1447,1394,1372,1300,1283,1267,1188,1139,1115,1085,
1035,1008,965,889,850,833,750,707. 9) 1 H-nuclear magnetic resonance spectrum: (δ: ppm) 1 normal deuterated ammonia water, water ( H DO = 4.75 pp) as internal standard
1 H-nuclear magnetic resonance spectrum (360 m)
MHz) is as shown below. 2.05 (s), 2.55 (dt, J = 4.4,
9.9Hz), 2.76 (dd, J = 4.4,13.0Hz), 3.06 (dd, J = 9.9,13.0H
z), 3.79 (t, J = 4.1Hz), 4.27 (br.t), 4.80 (d, J = 4.1Hz). 10) 13 C-nuclear magnetic resonance spectrum: (δ: ppm) 13 C-nuclear magnetic resonance spectrum (90 MHz) measured using 1,4-dioxane (67.4 ppm) as an internal standard in 1N deuterated ammonia water is , As shown below. 23.2 (q), 38.0
(t), 48.3 (d), 62.9 (d), 68.9 (d), 70.6 (d), 175.2 (s), 180.6
(s). 11) Solubility: Soluble in water. Acetic acid, pyridine, methanol,
Insoluble or insoluble in organic solvents such as ethanol, acetone, chloroform, ethyl acetate, benzene, ether, hexane, and petroleum ether. 12) Color reaction: Positive for ninhydrin reagent. 13) High Performance Liquid Chromatography: Column; Asahi Pack ES502N (7.6 φ x 100 mm, manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.) Solvent: 1 mM phosphate buffer (pH 6.5) Flow rate: 1.0 ml / min Detection wavelength; 210 nm retention time; 11.5 minutes.
363生産菌を培養し、その培養物よりA−72363
を採取することを特徴とするA−72363の製造法。3. A-72 belonging to the genus Streptomyces
A 363-producing bacterium was cultivated, and from the culture,
The method for producing A-72363, which comprises:
属に属するA−72363生産菌がストレプトマイセス
・ノビリス(Streptomyces nobilis) SANK 60192(微工
研条寄第4000号:BP-4000)であるA−72363の製造
法。4. The A-72363-producing bacterium belonging to the genus Streptomyces according to claim 3, which is Streptomyces nobilis SANK 60192 (Microtechnical Research Institute No. 4000: BP-4000). Manufacturing method of -72363.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP28738192A JPH06135980A (en) | 1992-10-26 | 1992-10-26 | New physiologically active substance a-72363 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP28738192A JPH06135980A (en) | 1992-10-26 | 1992-10-26 | New physiologically active substance a-72363 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH06135980A true JPH06135980A (en) | 1994-05-17 |
Family
ID=17716618
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP28738192A Pending JPH06135980A (en) | 1992-10-26 | 1992-10-26 | New physiologically active substance a-72363 |
Country Status (1)
Country | Link |
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JP (1) | JPH06135980A (en) |
-
1992
- 1992-10-26 JP JP28738192A patent/JPH06135980A/en active Pending
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