JPH061273B2 - Hyaluronic acid measurement method - Google Patents
Hyaluronic acid measurement methodInfo
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- JPH061273B2 JPH061273B2 JP63167631A JP16763188A JPH061273B2 JP H061273 B2 JPH061273 B2 JP H061273B2 JP 63167631 A JP63167631 A JP 63167631A JP 16763188 A JP16763188 A JP 16763188A JP H061273 B2 JPH061273 B2 JP H061273B2
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- hyaluronic acid
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本願発明は生物体液中のヒアルロン酸の測定方法に関す
る。更に特定的には、本願発明は軟骨性プロテオグリカ
ンおよびケラタン硫酸と反応性のある抗体を使用した生
物体液中のヒアルロン酸の測定方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for measuring hyaluronic acid in biological fluid. More specifically, the present invention relates to a method for measuring hyaluronic acid in biological fluids using an antibody reactive with cartilage proteoglycan and keratan sulfate.
（従来の技術） 血清ヒアルロン酸（以後ヒアルロナートとも呼ぶ）の変
化がある種の病気と相関関係にあることが知られてい
る。例えば、血清ヒアルロン酸の増加が肝硬変などの肝
機能不全患者に見られる。更に、血清ヒアルロン酸の増
加とガンおよび慢性関節リウマチに相関関係がある。従
って、血清および他の生物体液中のヒアルロン酸の検出
および量の測定方法が必要となる。(Prior Art) It is known that changes in serum hyaluronic acid (hereinafter also referred to as hyaluronate) are correlated with certain diseases. For example, increased serum hyaluronic acid is found in patients with liver dysfunction, such as cirrhosis. Furthermore, there is a correlation between increased serum hyaluronan and cancer and rheumatoid arthritis. Therefore, there is a need for a method of detecting and measuring hyaluronic acid in serum and other biological fluids.
軟骨性プロテオグリカンコアタンパク質は特異的にそし
て可逆的にヒアルロン酸と結合するヒアルロン酸結合領
域を有する。ケラタン硫酸は複数の部分で軟骨性プロテ
オグリカンコアタンパク質と共有結合しているグリコサ
ミノグリカンであり、ヒアルロン酸結合領域付近のケラ
タン硫酸濃厚領域で濃縮している。Cartilage proteoglycan core protein has a hyaluronan-binding domain that specifically and reversibly binds hyaluronan. Keratan sulfate is a glycosaminoglycan that is covalently bound to the cartilage proteoglycan core protein in multiple parts, and is concentrated in the concentrated keratan sulfate region near the hyaluronic acid binding region.
生物試料中のヒアルロナートの量を測定するためのいく
つかのラジオアッセイ（radioassays）が開示されてい
る。例えば、ファーマシアHAテスト50（Pharmacia HA T
est 50）［ファーマシア ダイアグノスティックスAB
（Pharmacia Diagnostics AB）］は、ウシ軟骨から得ら
れる125Ｉ標識ヒアルロン酸結合タンパク質を使用した
ヒアルロン酸測定のためのラジオメトリックアッセイで
ある。A.Tengbladによる“クアンティタティブ アナリ
シス オブ ヒアルロナート イン ナノグラム アマ
ウンツ（Quantitative Analysis of Hyaluronate in Na
nogram Amounts）”，Biochem 185巻，101-105ページも
参照のこと。Several radioassays have been disclosed for determining the amount of hyaluronate in biological samples. For example, Pharmacia HA Test 50 (Pharmacia HA T
est 50) [Pharmacia Diagnostics AB
(Pharmacia Diagnostics AB)] is a radiometric assay for hyaluronan determination using 125 I-labeled hyaluronan binding protein obtained from bovine cartilage. A. Tengblad's “Quantitative Analysis of Hyaluronate in Na
Nogram Amounts) ”, Biochem Volume 185, pages 101-105.
Thonar等の“クアンティフィケーション オブ ケラタ
ン スルフェート イン ブロッド アズ ア マーカ
ー オブ カーティレージ カタボリズム（Quantifica
tion of Keratan Sulfate in Blood as a Marker of Ca
rtilage Catabolism）”，Arthritis and Rheumatism,1
985年28巻，1367-1376ページには、成人ヒト血清中に単
連鎖として存在するケラタン硫酸の量を測定するため、
ケラタン硫酸に特異的なモノクローナル抗体を使用した
酵素結合イムノソルベント インヒビション アッセイ
［enzyme-linked immunosorbent-inhibition assay（EL
ISA）が記載されている。“Quantification of Keratan Sulfate In Brood as a Marker of Cartage Rage Catabolism (Quantifica
tion of Keratan Sulfate in Blood as a Marker of Ca
rtilage Catabolism) ”, Arthritis and Rheumatism, 1
985 Vol. 28, pp. 1367-1376, to measure the amount of keratan sulfate present as a single chain in adult human serum,
Enzyme-linked immunosorbent-inhibition assay using a monoclonal antibody specific for keratan sulfate
ISA) is described.
Delpech等の“イムノエンザイムアッセイ オブ ザ
ヒアルロニック−ヒアルロネクチン インタラクショ
ン：アプリケーション トゥ ザ ディテクション オ
ブ ヒアルロニック アシッド イン セラム オブ
ノーマル サブジェクツ アンド キャンサーペーシャ
ンツ（Immunoenzymeassay of the Hyaluronic-Hyaluron
ectin Interaction:Application to the Detection of
Hyaluronic Acid in Serum of Normal Subjects and Ca
ncer Patients）”，Ａnal．Biochem．1985年149巻555-
565ページには、酵素結合イムノソルベントアッセイ技
術を用いたヒトの脳から抽出したヒアルロン酸結合糖タ
ンパク質、ヒアルロンネクチンのヒアルロン酸との結合
を調査する方法が記載されている。それによると、ヒア
ルロネクチンは試験管内で（in vitro）ヒアルロン酸と
結合するが他のグリコサミノグリカンとは結合しない、
ヒトの脳から得たタンパク質成分である。“Immunoenzyme assay of the
Hyaluronic-Hyaluronectin Interaction: Application to the Detection of Hyaluronic Acid Inserum of
Normal Subjects and Cancer Peaches (Immunoenzyme assay of the Hyaluronic-Hyaluron
ectin Interaction: Application to the Detection of
Hyaluronic Acid in Serum of Normal Subjects and Ca
ncer Patients) ”, Anal. Biochem. 1985, 149, 555-
Page 565 describes a method of investigating the binding of hyaluronic acid, a hyaluronan-binding glycoprotein extracted from human brain, to hyaluronan using an enzyme-linked immunosorbent assay technique. It shows that hyaluronectin binds hyaluronan in vitro but not other glycosaminoglycans,
It is a protein component obtained from the human brain.
従来技術におては、軟骨性プロテオグリカンを使用した
生物試料中のヒアルロナートの量を測定する非同位体法
はなかった。In the prior art, there was no non-isotopic method to measure the amount of hyaluronate in biological samples using cartilage proteoglycans.
（発明の構成） 本願発明は生物試料中のヒアルロン酸の測定方法に関
し、以下の各工程から構成される。(Structure of the Invention) The present invention relates to a method for measuring hyaluronic acid in a biological sample, which comprises the following steps.
a)ヒアルロン酸を固体支持体に結合させて被覆固体支持
体を形成し、 b)試料を軟骨性プロテオグリカンで培養し、 c)工程b)の培養試料を工程a)の被覆固体支持体に暴露し
て、自由プロテオグリカンを前記被覆固体支持体上の結
合ヒアルロン酸に結合させ、 d)工程c)の生成物をケラタン硫酸反応性抗体に暴露し
て、該抗体を、前記被覆固体支持体上の結合ヒアルロン
酸と結合しているプロテオグリカンのケラタン硫酸と結
合させ、 e)前記ケラタン硫酸と結合した抗体の量を測定し、 f)前記ケラタン硫酸と結合した抗体の量を試料中のヒア
ルロン酸の量と相関づける。a) binding hyaluronic acid to a solid support to form a coated solid support, b) culturing the sample with cartilage proteoglycans, and c) exposing the culture sample from step b) to the coated solid support from step a). Free proteoglycans are bound to the bound hyaluronic acid on said coated solid support and d) the product of step c) is exposed to a keratan sulphate-reactive antibody, said antibody on said coated solid support. The amount of the antibody bound to the keratan sulfate was measured by binding it to the keratan sulfate of the proteoglycan bound to the bound hyaluronic acid. Correlate with.
（実施例） 本願発明を、以下の実施例に基づいて詳細に説明する。
マイクロタイタプレート（microtiter plates）をヒア
ルロン酸で被覆した。インヒビション工程において、別
々の“ダミー”（すなわち非結合ヒアルロナート）プレ
ート中、軟骨性プロテオグリカン含有溶液の既知小量
で、ヒアルロン酸の種々の既知の濃度および血漿または
血清の未知の試量をプロテオグリカンとヒアルロン酸の
反応が実質的に完了するのに十分な時間培養した。次
に、同量の培養混合物をヒアルロナート被覆プレートに
施し、溶液中にヒアルロナートと予備反応（インヒビシ
ョン）しなかった自由プロテオグリカンがプレート中に
被覆されたヒアルロナートと反応するのに十分な時間培
養した。次にプレートを十分洗浄して全てのプロテオグ
リカン、ヒアルロナートおよびプレートに結合していな
いプロテオグリカン−ヒアルロナート錯体を除去した。
次に、ケラタン硫酸反応性抗体（好ましくはモノクロー
ナル抗体）含有溶液の既知小量をプレートに施し、プレ
ート上のヒアルロナートと結合したプロテオグリカンに
結合したケラタン硫酸と前記抗体の反応が実質的に完了
するに十分な時間培養した。ケラタン硫酸と特異的に反
応するモノクローナル抗体は当業者にとって公知であ
る。例えば、Bruce CatessonのJ.Biol.Chem.1983年258
巻、8848-8854ページ参照。(Example) The present invention will be described in detail based on the following examples.
Microtiter plates were coated with hyaluronic acid. In the inhibition step, different known concentrations of hyaluronic acid and unknown test doses of plasma or serum were administered in separate “dummy” (ie unbound hyaluronate) plates with known small amounts of cartilage proteoglycan-containing solutions. The culture was incubated for a time sufficient to substantially complete the reaction of proteoglycan and hyaluronic acid. Next, an equal volume of the culture mixture was applied to the hyaluronate-coated plates, and enough free proteoglycan that did not preinhibit hyaluronate in solution to react with the hyaluronate coated in the plates. Incubated for hours. The plate was then washed extensively to remove all proteoglycan, hyaluronate and non-plate bound proteoglycan-hyaluronate complex.
Next, a known small amount of a solution containing a keratan sulfate-reactive antibody (preferably a monoclonal antibody) is applied to the plate, and the reaction of the keratan sulfate bound to the hyaluronate-bound proteoglycan on the plate with the antibody is substantially completed. For a sufficient time. Monoclonal antibodies that specifically react with keratan sulfate are known to those of skill in the art. Bruce Catesson, J. Biol. Chem. 1983 258
Volume, pages 8848-8854.
プレートに結合した抗体の量を明視下する方法として、
プレートを、抗ケラタン硫酸抗体（antikeratan sulfat
e antibody）と反応し、酵素または他の非同位体マーカ
ーで適切に標準下した過剰の第２抗体に暴露した。例え
ば、第１の抗体が抗ケラタン硫酸モノクローナルマウス
抗体ならば、酵素標識は、抗マウス免疫グロブリンと結
合する。第２の抗体を標準化する好ましい方法は、それ
によって第２の抗体の存在をリポートする比色反応を触
媒するペルオキシダーゼのような酵素に結合させること
である。適したペルオキシダーゼ触媒リポーター反応の
例がJournal of Biological Chemistry,1982年257巻，1
4173-14180ページに記載されている。他の酵素リポータ
ー系がケラタン硫酸結合抗体を明視化する方法としてペ
ルオキシダーゼリポーター系に代替できる。As a method to visualize the amount of antibody bound to the plate,
Plate the plate with antikeratan sulfat
e antibody) and exposed to excess second antibody appropriately standardized with an enzyme or other non-isotopic marker. For example, if the first antibody is an anti-keratan sulfate monoclonal mouse antibody, the enzyme label will bind anti-mouse immunoglobulin. A preferred way to standardize the second antibody is to attach it to an enzyme such as peroxidase that catalyzes a colorimetric reaction thereby reporting the presence of the second antibody. An example of a suitable peroxidase-catalyzed reporter reaction is in the Journal of Biological Chemistry, 1982, 257, 1
See pages 4173-14180. Other enzyme reporter systems can replace the peroxidase reporter system as a method of visualizing keratan sulfate binding antibodies.
次に、プレートの吸光度を、MR600マイクロプレートリ
ーダー（ダイナテック社）を用いて例えば直接に、また
はコンピューター支援で測定した。The absorbance of the plates was then measured, for example directly using the MR600 microplate reader (Dynatech) or computer assisted.
この好ましい検定系において、試料中に存在するヒアル
ロン酸が多い程、発色は少ない。発色の程度は試料中の
ヒアルロン酸濃度の関数であるが、これは対数による直
線関係である。従って、標準曲線は、未知の試料中の発
色を比較できる既知のヒアルロン酸標準濃度から作製す
る必要がある。この検定法の標準曲線は限られたヒアル
ロン酸濃度範囲においてのみ一般的に対数による直線と
なり、未知の試料中のヒアルロン酸量を標準曲線から正
確に読み取るために、それぞれの検定試料の１種類以上
の段階希釈物が標準曲線の対数による直線内に入るよう
にしてその段階希釈物について検定を行うことが好まし
い。In this preferred assay system, the more hyaluronic acid present in the sample, the less color developed. The degree of color development is a function of the hyaluronic acid concentration in the sample, which is a linear logarithmic relationship. Therefore, a standard curve needs to be generated from known hyaluronic acid standard concentrations that allow for comparison of color development in unknown samples. The standard curve of this assay is generally a logarithmic straight line only in the limited hyaluronic acid concentration range. In order to accurately read the amount of hyaluronic acid in an unknown sample from the standard curve, one or more of each assay sample should be used. It is preferred to perform the assay on the serial dilutions so that they fall within the logarithmic straight line of the standard curve.
本願発明をいくつかの好ましい実施例に基づいて述べて
きたが、当業者にとって明らかな変更は、本願発明の範
囲を逸脱せずに行なうことができる。例えば、第２の抗
体またはケラタン硫酸反応性抗体に同位体標識を用い
て、被覆固体支持体に結合したヒアルロン酸に結合した
プロテオグリカンのケラタン硫酸に結合したケラタン硫
酸反応性抗体の量を測定することができる。本願発明の
方法は、ヒトおよびより下等な動物の生物体液中のヒア
ルロン酸を測定するために使用できる。Although the present invention has been described based on some preferred embodiments, modifications apparent to those skilled in the art can be made without departing from the scope of the present invention. For example, using an isotopic label on a second antibody or a keratan sulfate reactive antibody to measure the amount of keratan sulfate reactive antibody bound to the keratan sulfate of proteoglycans bound to hyaluronic acid bound to a coated solid support. You can The method of the present invention can be used to measure hyaluronic acid in biological fluids of humans and lower animals.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭60−224065（ＪＰ，Ａ) Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ ｒｈｅｕ ｍａｔｉｓｍ，Ｖｏｌ．28（1985）Ｐ. 1367−1376 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａ ｌ，Ｖｏｌ．228（１）（1985）Ｐ．77− 86 Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．149（1985）Ｐ．555 −565 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａ ｌ，Ｖｏｌ．185（1980）Ｐ．101−105 Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉ ｃｓ，Ｖｏｌ．252（２）（1987）Ｐ．574 −590 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (56) References JP-A-60-224065 (JP, A) Arthritis and rheu matism, Vol. 28 (1985) P. 1367-1376 Biochemical Journal, Vol. 228 (1) (1985) P. 77-86 Analytical Biochem istry, Vol. 149 (1985) P. 555-565 Biochemical Journal, Vol. 185 (1980) P. 101-105 Archives of Bioche chemistry and Biophysics, Vol. 252 (2) (1987) P. 574 −590
Claims (5)
被覆固体支持体を形成し、 b)試料を軟骨性プロテオグリカンで培養し、 c)工程b)の培養された試料を工程a)の被覆固体支持体に
暴露して、遊離プロテオグリカンを前記被覆固体支持体
上の結合ヒアルロン酸に結合させ、 d)工程c)の生成物をケラタン硫酸反応性抗体に暴露し
て、該抗体を、前記被覆固体支持体上の結合ヒアルロン
酸と結合しているプロテオグリカンのケラタン硫酸と結
合させ、 e)前記ケラタン硫酸と結合した抗体の量を測定し、 f)前記ケラタン硫酸と結合した抗体の量を試料中のヒア
ルロン酸の量と相関づける 各工程からなる生物試料中のヒアルロン酸の測定方法。1. A) binding hyaluronic acid to a solid support to form a coated solid support, b) culturing the sample with cartilage proteoglycans, and c) culturing the sample from step b) to step a). Exposure of the free proteoglycan to the bound hyaluronic acid on said coated solid support and d) exposing the product of step c) to a keratan sulfate reactive antibody, The proteoglycan bound to the coated solid support is bound to the proteoglycan keratan sulfate, e) the amount of the antibody bound to the keratan sulfate is measured, and f) the amount of the antibody bound to the keratan sulfate is measured. Correlation with the amount of hyaluronic acid in a sample A method for measuring hyaluronic acid in a biological sample, which comprises each step.
徴とする請求項１記載のヒアルロン酸の測定方法。2. The method for measuring hyaluronic acid according to claim 1, wherein the antibody is a monoclonal antibody.
定し、標準曲線を決定し、試料中のヒアルロン酸濃度を
標準曲線に参照させて決定することを特徴とする請求項
１記載のヒアルロン酸の測定方法。3. The hyaluronic acid according to claim 1, wherein the known concentration of hyaluronic acid is measured in the same manner to determine a standard curve, and the concentration of hyaluronic acid in the sample is determined by referring to the standard curve. Method of measuring acid.
る第２の抗体を暴露して第２の抗体をケラタン硫酸と結
合した抗体に結合させ、該結合した第２の抗体を明視化
することにより、ケラタン硫酸に結合した抗体の量を測
定することを特徴とする請求項１記載のヒアルロン酸の
測定方法。4. A second antibody reactive with an antibody bound to keratan sulfate is exposed to allow the second antibody to bind to the antibody bound to keratan sulfate, and the bound second antibody is visualized. The method for measuring hyaluronic acid according to claim 1, wherein the amount of the antibody bound to the keratan sulfate is measured by the method.
れた第２の抗体の明視化が、前記支持体を前記酵素の存
在下で色を発現させる基質系に暴露し、定まった時間内
に発現する色の量を測定することによって達成されるこ
とを特徴とする請求項４記載のヒアルロン酸の測定方
法。5. A second antibody carries an enzyme bound thereto and visualization of the bound second antibody is determined by exposing said support to a substrate system that develops color in the presence of said enzyme. The method for measuring hyaluronic acid according to claim 4, which is achieved by measuring the amount of color developed within a predetermined period of time.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US7047687A | 1987-07-07 | 1987-07-07 | |
| US70476 | 1998-04-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6429767A JPS6429767A (en) | 1989-01-31 |
| JPH061273B2 true JPH061273B2 (en) | 1994-01-05 |
Family
ID=22095524
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63167631A Expired - Lifetime JPH061273B2 (en) | 1987-07-07 | 1988-07-05 | Hyaluronic acid measurement method |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH061273B2 (en) |
| CA (1) | CA1303984C (en) |
Families Citing this family (1)
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|---|---|---|---|---|
| CA2005795A1 (en) * | 1988-12-19 | 1990-06-19 | Peter Ghosh | Sandwich-elisa method for the detection and/or quantification of keratan sulphate peptides in biological fluids |
-
1988
- 1988-06-20 CA CA000569875A patent/CA1303984C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-07-05 JP JP63167631A patent/JPH061273B2/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１４９（１９８５）Ｐ．５５５−５６５ |
| ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，Ｖｏｌ．２５２（２）（１９８７）Ｐ．５７４−５９０ |
| Ａｒｔｈｒｉｔｉｓａｎｄｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，Ｖｏｌ．２８（１９８５）Ｐ．１３６７−１３７６ |
| ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．１８５（１９８０）Ｐ．１０１−１０５ |
| ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．２２８（１）（１９８５）Ｐ．７７−８６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1303984C (en) | 1992-06-23 |
| JPS6429767A (en) | 1989-01-31 |
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